Комплексное решение проблем пробоподготовки при разработке методик ВЭЖХ анализа объектов со сложной матрицей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

ЗАХАРОВА АННА МИХАИЛОВНА

КОМПЛЕКСНОЕ РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МЕТОДИК ВЭЖХ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ СО СЛОЖНОЙ

МАТРИЦЕЙ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

з 1 ■ :г т

Санкт-Петербург 2013

005536403

005536403

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Карцова

Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: Воронцов Александр Михайлович, доктор

технических наук, профессор, директор Центра экологической безопасности Балтийского института экологии, политики и права

Яшин Яков Иванович, доктор химических наук, профессор, директор НТЦ «Хроматография» НПО «Химавтоматика»

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное

предприятие "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева (ФГУП "ВНИИМ им. Д. И. Менделеева)

Защита состоится 21 ноября 2013 г. в 17 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Средний проспект, дом 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат диссертации разослан_октября 2013 г.

Ученый секретарь

кандидат химических наук, доцент

Панчук В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Пробоподготовка является важнейшей стадией химического анализа, лимитирующей реализацию возможностей современных приборов, а следовательно, и качество результатов анализа. Надежность способа пробоподготовки может оказать решающее влияние и на выбор аналитического метода. Это особенно принципиально при анализе объектов со сложной матрицей, при низком содержании определяемых соединений и значительном количестве сопутствующих. Выбор грамотной стратегии подготовки проб при создании методик ВЭЖХ-анализа является определяющим.

Работа посвящена выявлению простых и надежных подходов к пробоподготовке при ВЭЖХ-анализе пищевых продуктов, БАДов, фармацевтических препаратов и биологических объектов, сточной и природной вод, нефти, промышленных выбросов.

Цель: Разработка методик анализа сложных матриц (пищевых продуктов, биологически активных добавок, фармацевтических препаратов, сточной воды, нефти, промышленных выбросов, почвы, биологических объектов и растительных экстрактов) с применением простой и надежной процедуры пробоподготовки для каждого типа аналмтов при ВЭЖХ определении углеводов, карбоновых и аминокислот, полиароматических углеводородов, неорганических анионов, этилендиаминтетрауксусной кислоты.

В связи с поставленной целью решались задачи:

1. Оптимизация условий пробоподготовки при анализе нефти и пищевых продуктов, основанной на методах сорбционного выделения сопутствующих примесей.

2. Разработка общей схемы пробоподготовки жидкофазных и твердофазных объектов при ВЭЖХ-определении углеводов и карбоновых кислот в продуктах питания.

3. Определение углевода апиоза в БАД «Зостерин-ультра» с использованием гидролитического расщепления пектина и получением флуоресцирующего производного.

4. Выявление возможностей сочетания мембранной фильтрации и сорбции в процессе пробоподготовки при определении ПЛУ в промышленных выбросах, атмосферном воздухе и почве методом ОФ ВЭЖХ и получение оценочных характеристик эффективности использования различных сорбционных материалов: сверхсшитого полистирола Рштеер 200 и сополимера стирол-дивннилбензол 8ире1рак 20.

5. Выбор условий гидролитического расщепления компонентов матрицы в сочетании с получением производных при определении свободных и связанных аминокислот в различных объектах.

6. Поиск условий пробоподготовки селективного ВЭЖХ определения ЭДТА в майонезе.

7. Разработки ВЭЖХ методик анализа объектов со сложной матрицей (пищевые продукты, растительные экстракты, атмосферный воздух, промышленные выбросы, нефть) на основе предлагаемых способов пробоподготовки.

Научная новизна

Предложены общие подходы к подготовке проб при ВЭЖХ определении с УФ-детектированием свободных н связанных аминокислот в пищевых продуктах, биологических матрицах и растительных экстрактах, включающие гидролитическое расщепление (6М НС1) компонентов матрицы в сочетании с получением фенилизотиоцианатных производных аналитов. Для определения серосодержащих аминокислот адаптирован вариант кислотного гидролиза с предварительным окислением этих аналитов надмуравьиной кислотой с последующей дериватизацией, а для определения триптофана, неустойчивого в кислой среде, - щелочной гидролиз насыщенным раствором гидроксида бария.

Предложена схема пробоподготовки при ВЭЖХ определении анионов (F, СГ, Вг", NO3", NO2", РО43", SO42") в водных вытяжках из нефти (3 последовательные экстракции горячей водой при температуре 80-90 "С с последующим добавлением бензола) в сочетании с очисткой на сорбенте С18 от сопутствующих органических примесей методом ионной хроматографии с косвенным спекфофотометричсским детектированием.

Предложен способ определения этилендиаминтетрауксусной кислоты в майонезе методом ион-парной ВЭЖХ в форме комплексов с ионами Fe3+ или Си2', извлекаемых из матрицы фосфатным буферным раствором.

Предложен способ определения углевода апиоза в БДД «Зостерип-Ультра», включающий гидролитическое расщепление компонентов матрицы с использованием 2М раствора трнфторуксусиой кислоты в сочетании с получением флуоресцирующего производного с антраниловой кислотой.

Предложена комбинированная схема выделения и концентрирования всех 16 приоритетных загрязнителей группы ПАУ, включающая фильтрацию воздушной пробы через пористый тетрафторэтилен и концентрирование на полимерном сорбенте с их последующей десорбцией органическими растворителями (гексан и диэтиловый эфир) и очисткой экстрактов на сверхсшитом полистироле Purosep 200.

Практическая значимость работы

По результатам исследований разработано и аттестовано во ВНИИМ им. Менделеева, Санкт-Петербург, пять методик: определения углеводов в напитках, пищевых продуктах, биологически активных добавках; неорганических анионов (И", СГ, Вг\ КО/, N02", РО43", 5042") в питьевой, природной, сточной водах и в нефти; полицнклнческих ароматических углеводородов в атмосферном воздухе и промышленных выбросах; бепз(а)пирена в воздухе рабочей зоны.

Две методики определения органических кислот в напитках, винах, соках и жидких БАД, а также в пищевых продуктах и твердых биологически активных добавках находятся в настоящий момент на аттестации во ВНИИМ им. Менделеева.

Положения, выносимые на защиту: 1. Обоснования общих схем пробоподготовки для ВЭЖХ определения:

- углеводов и органических кислот в жидкофазных и твердофазных пищевых продуктах с сорбиноштой очисткой экстрактов;

- ПАУ в атмосферном воздухе и промышленных выбросах с использованием мембранной фильтрации и сорбции на свсрхсшитом полистироле Ршчкер 200 или сополимере стирол-дивинилбензол Яирс1рак 20;

- свободных аминокислот (АК) и их суммарного содержания в объектах растительного и животного происхождения с гидролитическим расщеплением компонентов матрицы, предварительным окислением надмуравышой кислотой в случае серосодержащих АК и получением фенилизотиоциаиатных производных;

- неорганических анионов (нитрит, нитрат, хлорид, фторид, бромид, сульфат и фосфат) в природных сточных водах и горячих водных вытяжках из нефти в сочетании с сорбционной очисткой;

- ЭДТА в майонезе в форме комплексов с попами Ре3+ или Си2+-

- апиозы в БАД с использованием гидролитического расщепления компонентов матрицы и получением флуоресцирующего производного с антраниловой кислотой.

2. Методики анализа различных объектов со сложной матрицей, основанные на разработанных способах пробоподготовки.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, глав обсуждения результатов эксперимента, сопоставления особенностей разработанных методик с ближайшими аналогами, выводов, списка публикаций по теме диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах

машинописного текста, содержит 55 таблиц, 91 рисунок, список использованных источников из 177 наименований.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях в журналах, входящих в перечень ВАК, в 7 тезисах конференций; аттестовано 5 методик. Результаты работы докладывались на конференциях: VIII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА 2011» и школа молодых ученых, посвященные 300-летию со дня рождения М. В. Ломоносова, Архангельск, 26 июня - 2 июля 2011 г; VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012», Санкт-Петербург, 3-7 апреля

2012 г; IV Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Санкт-Петербург, 2630 июня 2012 г; Всероссийский симпозиум «Кинетика и динамика обменных процессов», Краснодарский край 25 ноября-2 декабря 2012 г; 1-ая Зимняя молодежная школа-конференция с международным участием «Новые методы аналитической химии», Санкт-Петербург 17-22 февраля 2013 года; VII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием но химии и наноматериапам «Менделеев-2013», Санкт-Петербург, 2-5 апреля 2013 г; II Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар 26-31 мая

2013 г.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.

В Главе 1 (обзор литературных данных) представлена информация о способах пробоподготовки к ВЭЖХ-анализу пищевых продуктов и БАД при определении углеводов, органических кислот; неорганических апиопов в водах различного типа и нефти; полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в атмосферном воздухе и промышленных выбросах; свободных и связанных аминокислот в объектах растительного и животного происхождения; ЭДТА в воде и фармацевтических препаратах.

Глава 2 включает описание использованной аппаратуры, объектов и методов исследования, реагентов, построения градуировочных зависимостей, способов пробоотбора, определения коэффициентов извлечения и метрологическую обработку результатов. ВЭЖХ-анализ выполнялся на жидкостном и ионном хроматографах Shimadzu с использованием флуориметрического, кондуктометрического,

спектрофотометрического, рефрактометрического детекторов и детектора на диодной матрице.

В 3-й главе описана схема пробонодготовки при исследовании образцов нефти месторождений Западной Сибири до очистки от солей и после. Контроль процессов обессоливання нефти подразумевает определение концентрации солей на различных ступенях се очистки. Вместе с водой в нефть попадают минеральные соли, вызывающие коррозию нефтеперегонной аппаратуры. При определении массовой концентрации анионов (хлорида, бромида, фторида, нитрата, фосфата, сульфата) методом ВЭЖХ со спектрофотометричсским детектированием реализован вариант пробонодготовки, сочетающий жидкостную экстракцию и сорбционную очистку (рис. 1). Установлено, что при температуре 80-100 °С извлекается максимальное количество анионов (рис.2). Для удаления органических примесей применяли сорбент С18. Достигнутый диапазон определяемых концентраций 1 - 40 мг/л.

Извлечение анионов из нефти тремя последовательными экстракциями горячей водой, добавление бензола

7Г

Экстракция гексаном остаточной нефти

Д

Удаление ТФЭ экстракцией остаточных органических примесей сорбент С18

iL

Упаривание раствора в 5 раз

Я

ВЭЖХ анализ УФ детектор (254 им), колонка Anion I (Macherey Nagel), элюент: 4 мМ раствор салициловой кислоты и салицилата Na (рН=7.8)

-хлорид - сульфат

О 50 100 150

температура экстрагента, °С

Рис. 1. Схема пробоподготовки при определении неорганических анионов в водных вытяжках из нефти

Рис. 2. Влияние температуры воды на интенсивность сигналов хлорида и сульфата при экстракции анионов из нефти__

При определении массовой концентрации анионов в пробах сточных вод нефтеперерабатывающего предприятия методом ионной хроматографии использовалась процедура очистки проб на сорбенте С18 от мешающих компонентов в сочетании с суппрсссионным вариантом ионной хроматографии. Применение двух режимов усиления сигнала кондуктометрического детектора обеспечило регистрацию высоких (5-2000мг/л) и низких( 0,01-5 мг/л) концентраций анионов (рис. За,б, табл. 1).

MB x 100

i ■р^фторид ? а. о 5 ь ! Ir S О. Z й » i » л 1 (В» М» \ в-i. J I.

V

U U Г] «1 П1 в! «73 Ж» Ш МИ H J U U 11 АЛ Ш «Я 1IJ ЖМ S3 МИН

Рис. За. Хроматограмма пробы сточной воды, усиление детектора 0,01 Рис. 36. Хроматограмма пробы сточной воды, усиление детектора 0,1

Условия: ионный хроматограф НЫт^Л/и, кондуктомегрический детектор, колонка для суппрессорного метода определения анионов (250 х 4.0 тш Ю) 1С 51-904Е с прсдколонкой 1С 900 (Shodex), подвижная фаза раствор 1,0 ммоль/л Ыа:СО, + 1,4 ммоль/л ЫаНСО, в денонизованной воде, У11ОТОКа 1 мл/мин; 1т1011К„ 40°С, температура ячейки детектора 43°С

Таблица 1. Результаты определения массовой концентрации анионов в пробах сточной воды нефтеперерабатывающего предприятия, п=3.

Лниоп Проба I Массовая концентрация, мг/л Проба 2 Массовая концентрация, мг/л

фторид 0,16±0,08 -

хлорид 4,74±0,71 5,48±0,82

нитрит . 0,009±0,001

бромид 0,57±0,10 -

нитрат 11,11±1,67 0,45±0,09

фосфат 0,11±0,07 2,74±0,55

сульфат 24,03±3,60 30,07i6,01

Сорбционная очистка экстрактов от мешающих 13ЭЖХ анализу примесей потребовалось и при определении углеводов (глюкозы, лактозы, мальтозы, маннозы, сахарозы, фруктозы, ксилита, сорбита) и органических кислот (щавелевой, винной, муравьиной, яблочной, молочной, уксусной, лимонной, янтарной, фумаровой, пропионовой) в напитках, овощах, фруктах, продуктах переработки плодов, биологически активных добавках; процедура пробоподготовки включала жидкостную экстракцию, разбавление или растворение пробы, очистку экстрактов и определялась лишь агрегатным состоянием анализируемых образцов. При подготовке твердых образцов (печенье, конфеты, овощи, фрукты, твердые биологически активные добавки) пробы гомогенизировали, проводили экстракцию целевых компонентов водой в ультразвуковой ванне и центрифугировали. Примесные органические компоненты (красители, консерванты) удаляли с использованием картриджей С18; углеводы и органические кислоты этим сорбентом не удерживались. Поскольку концентрация Сахаров в пищевых

8

продуктах довольно высокая (>1%), для их регистрации использовали рефрактометрический детектор, а для органических кислот, содержание которых в пищевых продуктах заметно ниже (0,5-100 мг/кг) - снектрофогометрический (X 210 нм) (рис. 4).

Рис. 4. Схема пробоподготовки твердых проб пищевых продуктов и БАД при ВЭЖХ определении углеводов и карбоновых кислот

Жидкие пробы, содержащие углекислый газ, выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 15 мин; при анализе соков с мякотью или молочных продуктов центрифугировали со скоростью 5000-8000 об/мин в течение 10 мин, подвергали сорбционной очистке и ВЭЖХ анализу (рис. 5 и табл. 2). При определении низких концентрации углеводов потребовалась предварительная дериватизация.

Гак, при количественном определении моносахарида апиозы в биологически активной добавке «Зостсрин-ультра» (апиоза - разветвленный моносахарид, входящий в

состав галактоуроновой кислоты) получали производное с антраниловой кислотой (Рис. 6) для последующего флуориметрического детектирования.

7.5 10.0 12.5 15.0

мВ 6.0 4.0 2.0 О

5.0

10.0

15.0

20.0 мин

Рис. 5а. Хроматограмма образца красного сухого вина «Каберне Совиньон», определение органических кислот.

1 - винная кислота, 2 - яблочная кислота, 3 -молочная кислота, 4 - уксусная кислота, 5 -лимонная кислота, 6 - янтарная кислота;

жидкостный хроматограф Shimadzu, колонка Genesis AQ (150x4.6 мм, 4 мкм), градиентный режим элюирования, подвижная фаза: компонент Л - 98% (0,1% Н,Р04+10мМ КН2Р04), 2% ацетонитрил, компонент Б - ацстонитрил, УФ-детектирование (>.=210 нм).

Рис. 56. Хроматограмма образца красного сухого вина «Каберне Совиньон», определение углеводов. 1 - фруктоза, 2 - глюкоза; жидкостный хроматограф Shimadzu с рефрактометрическим детектором, колонка Zorbax Carbohydrate 250 х 4,6 мм, 5 мкм изократнческий режим подвижная фаза ацетонитрил : вода (82:18, объемн.), V„,„„,a 2 мл/мин.

Таблица 2. Результаты количественного определения органических кислот и углеводов в пробе красного сухого вина «Каберне Совиньон»

Кислота Массовая, мг/л, п=3 Углевод Массовая концентрация, г/л, п=3

Винная 1496±93 Фруктоза 1.0±0.1

Яблочная 912±31 Глюкоза 0.7±0.1

Молочная 1051±83 Сахароза <0.1

Уксусная 574±25

Лимонная 419±21 - -

Янтарная 260±12 - -

Рис. 6. Схема реакции апиозы с антраниловой кислотой

Глава 4 посвящена разработке процедуры пробоотбора и очистки образцов атмосферного воздуха, промышленных выбросов и иочвы при ВЭЖХ определении ПАУ. Проведена сравнительная оценка эффективности очистки экстрактов при определении

10

ПАУ в промышленных выбросах на сверхсшитом полистироле Рштеер 200 и сорбенте 8ирс1рак 20. Определяем!,1е ПАУ: антрацен, аценафттен, аценафтен, 6енз(а)антрацен, бенз(а)пнрен, бенз(Ь)флуорантен, бенз(к)флуорантен, бенз(%М,1)перилен,

дибез(а,И)антрацеи, 2-метнлнафтатн, нафталин, пирен, фенантрен, флуорантен, флуорен, хризен. Для эффективного отбора проб использовали комбинированный поглотитель, состоянии'! из фильтра (политетрафторэтилен) и ловушки для паров (трубка с сорбентом 8ире1рак-20).11а основании полученных данных выбрана скорость отбора проб 1,5-2,0 л/мин (Рис.7).

—нафталин ^-аченафтилен

Рис. 7. Зависимость интенсивности сигнала от скорости отбора пробы

Последующая экстракция ПАУ и других органических соединений с фильтра и трубки производилась отдельно, различными растворителями (гексаном и диэтиловым эфиром, соответственно) с объединением экстрактов. При анализе проб промышленных выбросов предприятия по производству алюминия проводилась сорбционная очистка экстракта. Разделение компонентов ПАУ методом ОФ ВЭЖХ выполнялось в режиме градиентного элюнрования с регистрацией флуоресцентным (ФЛ) и диодпо-матричным (ДДМ) детекторами. Зависимость интенсивности сигнала ПАУ от времени экстракции с фильтра в ультразвуковой ванне приведена на рис. 8.

-бенз(а}пирен -дибенэ(аИ)антрацен

- 6енз(д,Ь,1)перипен

- Сенз(Ь)флуорантен

Рис. 8. Зависимость

интенсивности сигнала ПЛУ от времени экстракции с фильтра гексаном в ультразвуковой ванне

Содержимое сорбниониой трубки переносили в вналу из темного стекла и экстрагировали (40 мин) двумя порциями диэтилового эфира по 10 мл (рис. 9).

-нафталин - метилнафталин -аценафтен -флуорен

Рис. 9. Зависимость интенсивности сигнала ПАУ от времени экстракции с сорбента диэтиловым эфиром

При анализе промышленных выбросов ацетонитрильный экстракт подвергали сорбционной очистке (рис. 10). Проведено сравнение эффективности извлечения ПАУ при очистке экстрактов с сорбентов 8ире1рак 20 (сополимер стнрол-дивинилбензол) и Ригоэер 200 (сверхсшитый полистирол) (табл. 3). Последний оказался для этой цели предпочтительней.

Экстракт ПАУ в ацетонитриле 1 мл

_1_

Раствор пропускается

_через сорбент_

_*_

Смываются ПАУ5 мл диэтилового эфира 4

Добавляется 1 мл ацетонитрила

_1_

ЬЗЖХ анализ Условия:

флуориметрический детектор (ЛвозВ= 295; Лизл=370, программирование) и детектор на

диодной матрице <Л=254), колонка виреЬдоМ 1.С-РАН, (5ире1со), градиентный режим элюирования, алюент: компонент А - вода, _компонент Б - ацетонитрил_

Предложенный подход к отбору и подготовке проб использован и при определении массовой концентрации полициклических ароматических углеводородов в промышленных выбросах металлургического предприятия для оценки эффективности очистных сооружений (рис. 11; табл. 4 ).

Таблица 3. Значения коэффициентов извлечения ПДУ, установленные при подготовке проб с очисткой экстракта, п=5

Компонент $щн'1рак Риговер Компонент 8пре1рак Риговер

Нафталин 0,76±0,03 0,85±0,04 Пнрен 0,91 ±0,04 0,95±0,03

Аценафтилен 0,78±0,03 0,87±0,03 Бенз(а)антрацен 0,94±0,02 0,96±0,02

2-метилнафталин 0,75±0,02 0,89±0,03 Хризен 0,94±0,03 0,96±0,03

Аценафтен 0,79±0,02 0,90 ±0,03 Бенз(Ь)флуорантен 0,96±0,01 0,97±0,03

Фенантрен 0,82±0,01 0,92±0,02 Бенз(к)флуорантен 0,96±0,02 0,97±0,01

Флуорен 0,85±0,03 0,94±0,02 Бенз(а)пирен 0,95±0,03 0,98±0,04

Антрацен 0,86±0,02 0,95±0,02 Дибенз(а,Ь)антрацен 0,96±0,03 0,98±0,04

Флуорантен 0,89±0,03 0,95±0,03 Бенз(рЫ)перллен 0,96±0,03 0,98±0,02

Рис. 10. Схема очистки

ацетонитрильного экстракта для ВЭЖХ анализа ПАУ в промышленных выбросах

Рис. 11а. Хромато1рам.ча пробы промышленных выбросов до очистки на очистных сооружениях. Экстракт разбавлен в 500 раз. Флуориметрический детектор. 1- аценафтен, 2 -флуорен, 3 - фенантрен 4 - антрацен, 5 - пирен, 6 - флуорантен, 7 -бенз(а)антрацен, 8 -бенз(Ь)флуорантен, 9 - бенз(к)флуорантен, 10-бенз(а)пирен, 11 - дибенз( а, 1з)антрацен, 12-бeнз(ghi)пepилeII

Рис. 116. Хроматограмма пробы промышленных выбросов до очистки на очистных сооружениях. Экстракт разбавлен в 500 раз ДДМ, 254 нм. 1- нафталин. 2-аценафтилен,3 - 2-метилнафталин, 4 -аценафтен, 5 - флуорен, 6 - фенантрен 7 -антрацен, 8- пирен, 9 - флуорантен, 10 -бенз(а)антраиен, 11 -хризен, 12-бенз(Ь)флуорантен, 13 - беш(к)флуорантен, 14- бенз(а)пирен, 15 - дибет(а,Ь)антрацен, 16 - бенз(кЫ)перилен_

Условия: жидкостный хроматограф БЫтасЬи с флуориметрическим и диодно-матричным детекторами, колонка ЯирековП ЬС-РДН (150x4 мм, 5 мкм), градиентный режим элюнрования: компонент А - вода, компонент Б - ацегонитрил, У,,,,,,», 1 мл/мин, Тк,,„„,„„, 35 °С. 254 нм

Таблица 4. Результаты определения массовой концентрации НАУ в промвыбросах металлургического предприятия, мкг/м3, п=2

Соединенне До очистки После очистки

нафталин 34561=25 142±23

аценафтилен 2891±17 118±13

2-метилнафталин 3589±29 191±11

аценафтен 201±15 125±12

флуорен 436±11 25±3

фенантрен 3938±20 73±8

антрацен 570±13 13±3

флуорантен 5136±45 150±32

пирен 462±21 11±3

беиз(а)антрацен 806±23 9±2

хризен 974±25 6±2

бенз(Ь)флуорантен 545±18 89±18

5енз(к)флуорантен 143±10 2316

бенз(а)пирен 109±8 12±2

аибенз(а,Ь)антрацен 53±5 11±3

бенз()>,М)перш1ен 11±3 0,410,1

Применение двух детекторов - на диодной матрице и флуориметрического -обеспечило высокую чувствительность определения ПАУ и возможность подтверждения правильности идентификации соединений.

В главе 5 обсуждаются решения проблем пробоподготовки с использованием гидролитического расщепления компонентов сложных матриц и проведением дериватизации при определения свободных и связанных аминокислот в объектах животного и растительного происхождения. Сложность количественного определения этих аналитов заключается в возможных потерях при разложении белков и отсутствии хромофорных групп в большинстве молекул аминокислот. Дериватизация фенилизотиоцианатом позволяет получать стабильные производные со всеми аминокислотами (Рис. 12).

-VC • сг^

Рис. 12. Получение производных аминокислот с фенилизотиоцианатом

Объектом исследования явились образцы различной природы: мяса телят, подвергнутого воздействию различной температуры (парное, охлажденное до температуры +4°С; замороженное до - 18°С и - 35°С, парное мясо кур-нссушск); экстракты луговой, лесной и болотной гераней. Определяемые аминокислоты (АК); Ala, Arg, Asn+Asp, Glu, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, His, Не, Туг, Val, Cys, Met, Тгр. Для их количественного определения, кроме серосодержащих АК и триптофана, использовали кислотный гидролиз 6М HCl с последующей дериватизацией (Рис.13).

время гидролиза, мин

-♦-Глутамин -♦-Глицин -*-Аспарагин ^-Тирозин -»-Валин -•-Лейцин —-Фенилаланин ^Лизин

Рис. 13. Зависимость интенсивности сигнала ФИТЦ-производных

аминокислот от времени гидролиза 6 М соляной кислотой

Свободные аминокислоты выделяли из образцов экстракцией этанолом (20 мин), проводили дериватизашпо и далее ВЭЖХ-аналнз (Рис.14).

время экстракции, мин

-Аргенин ^ глутамин

-Глицин

—Аспарагнн

—Тирозин

•-Валин

-Лейцин

—Фенилаланин

—Лизин

35

Рис. 14. Зависимость интенсивности сигнала ФИТЦ-производных

аминокислот от времени экстракции этиловым спиртом

Метионип, чистин, цистеин и триптофан при кислотном пиролизе разлагаются. Рекомендованное в литературе добавление фенола (3%) не предотвратило их окисления (Рис. 15). Нами использовался кислотный гидролиз с предварительным окислением этих аналитов надмуравышой кислотой. Цистин и цистеин окислялись до цистеиновой кислоты, а метионип переходил в метиониисульфон (Рис. 16; табл. 5).

Рис. 15. Хроматограмма ФИТЦ-производных цистеина н метношша.

1. - красный цвет - стандартный образец,

2. - черный цвет - после кислотного гидролиза 6 М HCl с добавлением фенола,

3. - синий цвет - после кислотного гидролиза 6 М HCl

УФ (X= 254 нм), колонка Supelco С18 (250 х 4,6 мм, 5 мкм), элюент: компонент А - ацетатный буфер рН 5,5, компонент Б - ацетонитрил + 1% изопропилового спирта, компонент С -ацетатный буфер рН 4,05; градиентный режим элюирования, VIIOI,)Ba 1,2 мл/мин, Т^.,,,,™ 55 "С

метионин

Рис. 16. Схема окисления

серосодержащих

аминокислот

Таблица 5. Степень конверсии цистина, цистеина, метионина в цистеиновую кислоту и мстионинсул ьфон

Аминокислота Концентрация в растворе, г/мл Найдено иистеииовоП кислоты пли метиопннсульфона мг/мл Степень конверсии, %

Цистин 0,020 0,026 (в пересчете на цистин 0,0184) 92,4

Цистеин 0,022 0,028 (в пересчете на цистеин 0,020) 91,0

Метионин 0,026 0,029 (в пересчете на метионин 0,024) 92,9

Для триптофана найдены условия щелочного гидролиза белков насыщенным раствором гидроксида бария (табл.6).

Таблица 6. Извлечение триптофана после гидролиза различными способами

Способ гилролиза % извлечения

Стандартный образец триптофана 40 мг/мл 100

Щелочной гидролиз насыщенным раствором гидроксида бария 99,6

Кислотный гидролиз 6 М HCl с фенолом 35,8

Кислотный гидролиз 6 М HCl 33,8

Схема единого подхода к определению аминокислот в различных объектах представлена на рис. 17.

Рис. 17. Схема единого подхода к определению аминокислот в различных объектах

Хроматограммы подготовленных экстрактов проб охлажденной телятины после кислотного гидролиза 6 М НС1 и определения свободных аминокислот представлены на рис. 18; результаты количественного анализа - в табл. 7.

г

. а а к 1 £ 2

if" г г» • gee

400; с

350 <

зоо~

250; Гл»

200; 1501 It

100, ¿t I ¡-V F

50

0;—^ J5 UJjl

-50;

0 10

Рис. 18а Хроматограмма пробы телятины охлажденной; определение свободных аминокислот

Рис. 186 Хроматограмма пробы телятины охлажденной; определение общего содержания аминокислот_

Условия: жидкостный хроматограф Shimdzu, УФ-детсктование (Х= 254 нм), колонка Supelco С18 (250 х 4,6 мм, 5 мкм), градиентный режим элюирования: компонент А - ацетатный буфер рН 5,5, компонент Б - ацетоннтрнл + 1% изопропилового спирта, компонент С -ацетатный буфер рН 4,05; V„„T„„ 1,2 мл/мин, Т«^,,^ 55 °С

Таблица 7. Результаты определения свободных и суммарного содержания аминокислот в охлажденном (+4 °С) мясе телят (п=3)

Аминокислота Массовая доля, г/кг

Свободные ЛК Общее содержание АК

Аспаргиновая кислота + аспарагнн (Лсп) 0.49±0,04 12,8±0,8

Глутачиновая кислота + глутамин (Глу) 0,46±0,04 8,2±0,5

Гидрокенпролип (О-Про) 0,01 ±0,01 0,24±0,01

Серии (Сер) 0,07±0,01 13,5±0,8

Глицин(Гли) 0,12±0,03 10,2±0,5

Гистидин (Гис) 0,28±0,03 |9,0±1,2

Аргинин (Арг) 2,11 ±0,20 13,2±0,8

Треонин (Тре) 0,06±0,01 14,1 ±0.8

Алании (Ала) 0,21 ±0,03 10,4±0,8

Пролин (Про) 0,03±0,01 6,9±0,6

Тирозин (Тир) 0,04±0,01 8,0±0,5

Валин (Вал) 0,05±0,01 9,6±0,5

Изолейцин (Иле) 0,03±0,01 8,3±0,5

Лейцин (Лей) 0,0610,01 17,3±1,0

Фенилаланин (Фен) 0,04±0,01 8,2±0,5

Лизин (Лиз) 0,04±0,01 20,7±1,3

[(истин + цистеин (Цнс+Цист) 0,05 ±0,01 1,5±0,2

Метионин (Мет) 0,12±0,02 4,0±0,1

Триптофан(Три) 0,16±0,01 1,5±0,3

Суммарное содержание г/кг 4,43 187.7

Определение ЭДТЛ в майонезе

Предложен способ количественного определения этилендиаминтетрауксуеной кислоты в майонезе методом ион-парной ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием, включающий экстракцию целевого компонента фосфатным буферным раствором с одновременным образованием комплекса с хлоридом железа (III) или сульфатом меди (II) в присутствии хлороформа, ВЭЖХ-анализ (X = 255 нм, 261 нм соответственно), 40 °С, изократический режим элюирования). Использование двухступенчатой экстракции фосфатным буфером позволило достичь максимальной степени извлечения ЭДТЛ, а применение хелатообразования одновременно с процедурой экстракции привело к сокращению общего времени анализа (рис. 19).

Рис. 19. Зависимость степени извлечения ЭДТА из майонеза от времени экстракции в УЗ ванне

ЭДТЛ

Выявлено влияние концентрации ион-парного реагента (гадроксида тетрабутиламмония) на миграционные характеристики аиапитов. Найден состав подвижной фазы: 20 мМ раствор КН2Р04 (рН=7,5) : ацетонитрил : 40% водный раствор гидроксида тетрабутиламмония, 90 : 10: 0,2 (% объеми.). При увеличении содержания гидроксида тетрабутиламмония (свыше 1 %) время удерживания снижалось, что связано с переходом от ион-парного механизма к мицеллярному.

Предел обнаружения ЭДГЛ составил 0,005 мг/кг.

Сопоставление особенностей разработанных методик с ближайшими аналогами

Объект и определяемые аиалиты Достоинства предлагаемого в диссертации подхода пробоподготовки с последующим ВЭЖХ анализом Характеристики ближайших аналогов

Нефть Неорганические анионы Возможность определения покомпонентного анионного состава; определяемые концентрации — от I мг/л. Пределы обнаружения - 0,2 мг/л. [1]: Определение только хлоридов; концентрации от 10 мг/л

Сточная, природная и питьевая вода Неорганические анионы Концентрации анионов в питьевых, природных и сточных водах (мг/л), нижняя граница диапазона определения): Р: 0,01 ; С1: 0,02; РО„: 0,1; N0, : 0,08; БО,: 0,1; N0, : 0,05; Вг": 0,08 Пределы обнаружения, мг/л: 8-10"7 -МО"5 [2]: Определение анионов в питьевых, природных и сточных водах от (мг/л): Р: 1,0 ; С1: 2,0; Р04: 3,0; N0,: 5,0; Б04 : 10

Пищевые продукты (соки, вина, джемы, конфеты, печенье, молочные продукты); БЛДы Органические кислоты, углеводы Широкий круг объектов, единая для углеводов и карбоновых кислот процедура пробоподготовки (зависит только от агрегатного состояния анализируемой пробы). Пределы обнаружения (мг/л): органических кислот 0,5 - 20; углеводов 100-300. Предложен способ определения апиозы в БАД после кислотного гидролиза и дериватизации аитраииловой кислотой. Предел обнаружения 0,3 нг/мл. [3]: Определение фруктозы, глюкозы, сахарозы в напитках. Диапазон определяемых концентраций 500 - 80000 мг/л. [4] Соки. ВЭЖХ-определение органических кислот. Диапазон определяемых концентраций 0,1 - 50 мг/л.

Атмосферный воздух. Промышленные выбросы. ПАУ Идентичные подходы к ВЭЖХ определению ПАУ в атмосферном воздухе и промышленных выбросах. Очистка от примесей на сорбенте 5ире1рак 20 или Риговер 200 (сверхсшитый полистирол). Последний обеспечивает лучшую эффективность. [5]: Воздух атмосферный. Определение ПАУ методом хромато-масс-спектрометрии.

Пределы обнаружения, мкг/мл: М0"-3-10'5

Мясо Растительные экстракты (герань) Витаминный комплекс для спортсменов СаоСнн)ные и связанные аминокислоты Единая пробоподготовка при определении свободных и общего содержания аминокислот в объектах различного типа (биологические пробы, фармацевтические препараты, спортивное питание) Пределы обнаружения (1,5-10)-10"4 мг/л. [6] ВЭЖХ-определение лизина, триптофана, метнонина, суммы цистина и цистеина в комбикормах, премиксах. Определяемые концентрации от 1 г/кг.

Майонез ЭДТЛ Определение этиленднаминтетрауксусной кислоты в майонезе методом иок-парпой ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием, включающий экстракцию целевого компонента фосфатным буферным раствором с одновременным образованием комплекса с хлоридом железа (III) или сульфатом меди (II). Предел обнаружения 0,005 мг/кг. [7] Определение ЭДТЛ в майонезе методом капиллярного электрофореза. Предел обнаружения 3 мг/кг.

[I ]ГОСТ 21534-76 Нефть. Методы определения содержания хлористых солей; [2] ПНД Ф 14.1:2:4.169-2000. Методика выполнения измерений массовых концентраций анионов: фторидов, хлоридов, фосфатов, нитратов, сульфатов в поверхностных, питьевых и сточных водах методом ионной хроматографии. [3]Методика выполнения измерений массовой концентрации углеводов в напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Аквилон. ФР. 1.31.2004.01035. [4] ГОСТ Р 54684-2011 Соки. Определение органических кислот методом ВЭЖХ; [5] ГОСТ Р ИСО 12884-2007 Воздух атмосферный. Определение общего содержания полициклических ароматических углеводородов методом хромато-масс-снектрометрии; [6]Аквилон - Методика выполнения измерений массовой доли лизина, триптофана, метионина, суммы цистина и цистсина в комбикормах, премиксах и комбикормовом сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии; [7] Kvasnicka F., Mikova К. Détermination of EDTA in Mayonnaise by On-Line Coupled Capillary Isotachophoresis-Capillary Zone Electrophoresis with UV Détection// J. of Food Composition and Analysis. 1996. V. 9. N 3. P. 231-242.

ВЫВОДЫ

1. Предложены общие подходы к подготовке проб при ВЭЖХ определении свободных и связанных аминокислот в пищевых продуктах, биологических матрицах и растительных экстрактах, включающие гидролитическое расщепление (6М НС1) компонентов матрицы в сочетании с получением фенилизотиоцианатных (ФИТЦ) производных аналитов. Для определения серосодержащих аминокислот адаптирован вариант кислотного гидролиза с предварительным окислением надмуравьиной кислотой и последующей ФИТЦ-дериватизацией; для определения триптофана - щелочной гидролиз насыщенным раствором гидроксида бария.

2. Предложена комбинированная схема выделения и концентрирования всех 16 приоритетных загрязнителей группы Г1ЛУ, включающая фильтрацию воздушной пробы через пористый тетрафторэтилеи с их последующей десорбцией органическими

19

растворителями (гексан - с фильтра и диэтиловый эфир - с сорбента) и очисткой экстрактов на сверхсшитом полистироле Purosep 200.

3. Предложен способ ВЭЖХ определения углевода апиозы в биологической активной добавке «Зостерин-Ультра», включающий гидролитическое расщепление трифторуксусной кислотой и получения флуоресцирующего производного с антраниловой кислотой.

4. Предложен способ количественного определения этнлендиаминтетрауксусиой кислоты в майонезе методом ион-парной ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием, включающий экстракцию целевого компонента фосфатным буферным раствором с одновременным образованием комплекса с хлоридом железа (III) или сульфатом меди (II).

5. Разработаны и аттестованы методики определения углеводов в напитках, пищевых продуктах, биологически активных добавках; неорганических анионов (F, СГ, Br, N03\ NOi", Р043", SO42') в питьевой, природной, сточной водах и в нефти; полициклических ароматических углеводородов в атмосферном воздухе и промышленных выбросах; бенз(а)пирена в воздухе рабочей зоны.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Захарова A.M., Гринштейн И.Л., Карпова JI.A. Определение аминокислот в экстракте мозга коров, пробах мяса телят и кур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии// Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Том 12. Выпуск 6. С. 845-853.

2. Разаренова К.Н., Захарова А. М., Протасова И. Д., Жохова Е.В. Аминокислотный состав надземной части Geranium pratense L.,Geranium sylvaticum L., Geranium palustre L. // Бутлеровские сообщения. 2012. Том 31. № 8. C.73-78.

3. Захарова A.M., Карцова JI.A., Гринштейн И.Л. Определение органических кислот, углеводов и подсластителей в пищевых продуктах и биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии// Аналитика и контроль 2013. Т. 17.№ 2. Стр. 196-205.

4. И.Л. Гринштейн, Т.Э. Елтышева, A.M. Захарова, Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА 2011» и школы молодых ученых, посвященных 300-летию со дня рождения М. В. Ломоносова, Архангельск, 26 июня - 2 июля 2011 г. Определение полициклических ароматических соединений в атмосферном воздухе и промышленных выбросах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. С. 102.

5. Захарова A.M., Гринштейн И.Л., Карцова Л.А. Тезисы докладов VI Всероссийской конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием«Менделеев-2012» Санкт-Петербург, 3-7 апреля 2012 г, Секция 1. Аналитическая химия. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии при определениии полициклических ароматических соединений в атмосферном воздухе и промышленных выбросах. С 182.

6. Захарова А. М.,Гринштейн И.Л., Карцова Л.А.Тезисы докладов 4 Всероссийской конференции «Аналитические приборы» Санкт-Петербург, 26 - 30 июня 2012 г. Метод

высокоэффективной жидкостной хроматографии при комплексной оценке содержаши аминокислот, водо- и жирорастворимых витаминов в комбикормах, премиксах и биологически активных добавках. С. 212.

7. Захарова А.М., Гринштенн И.Л., Карцова Л.А. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Кинетика и динамика обменных процессов» Краснодарский край 25 ноября - 2 декабря 2012 г. Определение аминокислот в комбикормах, сухом экстракте мозга коров, мясе телятины и кур-несушек методом ВЭЖХ. С. 225.

8. Захарова А.М., Карцова Л.А., Гринштенн И.Л. Тезисы докладов 1-ой Зимней молодежной школы-конференции с международным участием «Новые методы аналитической химии» Санкт-Петербург 17-22 февраля 2013 года Применение высокоэффективной ионной хроматографии для определения концентраций анионов (МО2", 1Ч03', СГ, Р, Вг", 5042", Р043') в природной, питьевой и сточных водах, с. 56.

9. Захарова А. М., Гринштсйн И.Л., Карцова Л.А. Тезисы докладов VII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматсриалам «Менделеев-2013» Санкт-Петербург, 2-5 апреля 2013 г. Определение концентрации ионов МО2", КО3', СГ, Р", Вг", 8042', Р045' в природной, питьевой и сточной воде методом ионной хроматографии, стр. 119-120.

10. Захарова А.М., Карцова Л.А., Гринштсйн И.Л. Тезисы докладов И Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» Краснодар 26-31 мая 2013 г. Особенности пробоподготовки сложных матриц к ВЭЖХ анализу при определении свободных и связанных аминокислот, углеводов, полициклических ароматических углеводородов, органических кислот и неорганических анионов. С. 161.

Методики

1. Методика выполнения измерений массовой концентрации полициклических ароматических углеводородов в атмосферном воздухе и промышленных выбросах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии М-02-902-150-07. 2007. ООО "ВНЕДРЕНЧЕНСКАЯ ФИРМА "АНАЛИТ' (ООО "АНАЛИТ").

2. Методика выполнения измерений массовой концентрации анионов в нефти методом высокоэффективной жидкостной хроматографии М-02-505-104-02. 2002 г. ООО "ВНЕДРЕНЧЕСКАЯ ФИРМА "АНАЛИТ" (ООО "АНАЛИТ").

3. Методика определения бенз(а)иирна в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии М-02-2107-08. 2008. ООО "ВНЕДРЕНЧЕНСКАЯ ФИРМА "АНАЛИТ" (ООО "АНАЛИТ").

4. Методика выполнения измерений массовой концентрации ионов N02", N03", СГ, Г", Вг", Я042', Р043" в пробах природной, питьевой и сточной воды методом ионной хроматографии М-02-1805-09. 2009 г. ООО «АНАЛИТ ПРОДАКТС» (ООО "АНАЛИТ') - генеральный дистрибьютор Шимадзу.

5. Методика выполнения измерений массовой доли углеводов и подсластителей в пробах пищевых продуктов и биологически активных добавок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии М-02-2107-09 ООО 2009 г «АНАЛИТ ПРОДАКТС» (ООО "АНАЛИТ') - генеральный дистрибьютор Шимадзу.

6. Методика измерений массовой концентрации органических кислот в напитках, винах, жидких биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 2012 г - на аттестации.

7. Методика измерений массовой доли органических кислот в пищевых продуктах, твердых биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 2012 г - на аттестации.

Подписано в печать 16.10.2013г. Формат А5, цифровая печать Тираж 90 экз.

Отпечатано в ЦОП «Копировальный Центр Василеостровский» Россия, Санкт-Петербург, В.О., 6-линия, д.29. тел. 702-80-90, факс: 328-61-84 e-mail: vs@copy.spb.ru

Санкт-Петербургский государственный университет

О4201

451373

ЗАХАРОВА АННА МИХАИЛОВНА

КОМПЛЕКСНОЕ РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МЕТОДИК ВЭЖХ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ СО СЛОЖНОЙ МАТРИЦЕЙ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна

Санкт-Петербург 2013

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 6

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................7

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

Физико-химические методы определения важнейших аналитов......................12

1.1. Определение углеводов различными физико-химическими методами..........................................................................................................................................13

1.2. Хроматографическое определение органических

кислот............................................................................................................................................................^

1.3. Методы ВЭЖХ определения неорганических анионов..................17

1.3.1. Количественный анализ неорганических анионов в

питьевой, природной и сточной водах........................................................................^

1.3.2 Количественный анализ анионов в нефти................................................21

1.4. Определение полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в воздухе............................................................................................23

1.5. Способы определения этилендиаминтетрауксусной кислоты 26

1.6. Способы определения аминокислот в сложных матрицах.... 27

1.6.1. Предколоночная дериватизация в ВЭЖХ..........................................31

1.6.2. Постколоночная дериватизация в ВЭЖХ..........................................34

Глава II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................................................................................37

П.1. Аппаратура..............................................................................................................................37

П.2. Вспомогательные устройства............................................................................38

11.3. Реагенты......................................................................................................................................41

Ш.3.1. Подготовка посуды при определении анионов..........................44

П.4. Приготовление градуировочных растворов определяемых

веществ, отбор и подготовка проб....................................................................................44

П.4.1. Градуировочные растворы углеводов..................................................................44

П.4.2. Стандартные растворы, кислотный гидролиз проб и дериватизация апиозы антраниловой кислотой..................

45

11.4.3. Приготовление градуировочных растворов органических

кислот........................................................................................................................................................................................46

И.4.4. Градуировочные растворы анионов для определения их в

сточной воде........................................................................ 48

П.4.5. Градуировочные растворы анионов для определения их в

нефти................................................................................. 49

И.4.6. Приготовление градуировочных растворов

полициклических ароматических углеводородов..................... 49

И.4.7. Подготовка трубок для отбора проб ПАУ.................... 52

П.4.8. Отбор проб промышленных выбросов для определения

ПАУ............................................................................. 53

П.4.9. Экстракция ПАУ с фильтра и сорбционной трубки без

очистки экстракта........................................................... 54

П.4.10. Экстракция ПАУ и очистка экстракта на сорбенте

8ире1рак 20................................................................... 55

11.4.11. Экстракция ПАУ и очистка экстракта на сверхсшитом

полистироле РигоБер 200................................................. 55

Н.4.12. Определение коэффициентов извлечения ПАУ............ 55

П.4.13. Экстракция ПАУ и очистка экстракта на сверхсшитом 56

полистироле РигоБер 200...................................................

П.4.14. Подготовка пробы и экстракция при определении 57

полиароматических углеводородов в почве............................

Н.4.15. Градуировочные растворы для определения аминокислот 57

П.4.16. Гидролиз проб...................................................... 60

И.4.16. Модификация аминокислот фенилизотиоцианатом......... 60

11.4.17. Подготовка образца для определения триптофана....... 61

И.4.17. Определение степени извлечения свободных

аминокислот из мяса........................................................ 61

П.4.20. Приготовление градуировочных растворов

ТрилонаБ....................................................................... 61

П.4.21. Экстракция из майонеза буфером (20 мМ раствор КН2РО4 (рН=7,5) с одновременным комплексообразованием..... 62

П.5. Метрологическая обработка полученных результатов....... 62

Ш.5.1. Построение градуировочной характеристики................. 62

11.6. Приготовление подвижной фазы, условия анализа............. 63

П.6.1. Приготовление подвижной фазы, условия анализа при

определении анионов в нефти............................................ 63

П.6.2. Определение анионов в сточной воде........................... 64

И.6.3. Условия ВЭЖХ определения углеводов и органических

кислот........................................................................... 65

И.6.4. Хроматографические условия при ВЭЖХ-определении

ПАУ............................................................................ 68

П.6.5.0бработка результатов определения ПАУ в атмосферном

воздухе и промышленных выбросах................................... 69

II.7 Контроль правильности измерений................................... 70

11.7.1. Контроль правильности измерений анионов в сточной воде ............................................................................ 70

11.7.2. Проверка правильности при определении неорганических анионов в нефти, углеводов, органических кислот, аминокислот ЭДТА и апиозы........................................................... 71

ГЛАВА III. СОЧЕТАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ИЗВЛЕЧЕНИЯ АНАЛИТОВ ИЗ СЛОЖНЫХ МАТРИЦ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ОЧИСТКОЙ ЭКСТРАКТОВ........................ 72

III.1. Определение анионов в водных вытяжках из нефти и сточных водах нефтеперерабатывающего предприятия............ 73

111.2. Определение углеводов и карбоновых кислот в пищевых продуктах, напитках, биологически активных добавках.......... 83

111.2.1. Выбор процедуры пробоподготовки....................... 83

111.2.2. Подготовка твердых проб к хроматографическому

анализу.......................................................................... 86

111.2.3. Подготовка жидких проб к анализу............................ 88

111.3. Определение углевода апиозы в биологически активной добавке «Зостерин-ультра» после кислотного гидролиза и дериватизации антраниловой кислотой................................ 94

ГЛАВА IV. РАЗРАБОТКА ПРОЦЕДУРЫ ПРОБООТБОРА И ОЧИСТКИ ОБРАЗЦОВ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА, ПРОМЫШЛЕННЫХ ВЫБРОСОВ И ПОЧВЫ ПРИ ВЭЖХ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПАУ............................................................. 97

IV. 1. Характеристика аналитов..........................................................................................97

IV.2. Подготовка проб воздуха к анализу..............................................................99

IV.3. Отбор проб атмосферного воздуха................................................................102

IV.4. Отбор проб для анализа газовых выбросов промышленных

предприятий....................................................................................................................................104

IV.5. Экстракция целевых компонентов..................................................................105

IV.6. Хроматографический анализ экстрактов..............................................108

IV.7. Определение полиароматических углеводородов в почве «Красны Бор» (Ленинградская обл.)............................................ 111

IV.8. Использование сверхсшитого полистирола Purosep 200 для

очистки экстрактов при определении ПАУ............................. 113

ГЛАВА V. ГИДРОЛИТИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ СЛОЖНЫХ МАТРИЦ (БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ, МАЙОНЕЗА) С ПРОВЕДЕНИЕМ ДЕРИВАТИЗАЦИИ...... 117

V.l. Групповое и покомпонентное определение аминокислот.... 117 V.l.l. Определение аминокислот в биологических матрицах и

экстрактах растительного и животного происхождения.......... 117

У.1.2.0пределение общего содержания аминокислот в объектах

животного происхождения.................................................. 126

V.I.2. Определение свободных аминокислот в пробах мяса, сухих растительных экстрактов, спортивного питания............. 128

V.I.3. Результаты определения аминокислотного состава объектов животного происхождения (пробы мяса и сухого

экстракта мозга коров).................................................... 129

V.l.4. Определение содержания аминокислот в витаминном

комплексе для спортсменов.............................................. 134

V.l. 5. Определение свободных аминокислот в экстрактах

герани......................................................................... 135

V.2. Пробоподготовка с использованием процессов комплексообразования при определении

этилендиаминтетрауксусной кислоты в майонезе.................... 139

ВЫВОДЫ.............................................................................. 147

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................... 149

ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................... 168

Приложение 1. СОПОСТАВЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИК С БЛИЖАЙШИМИ АНАЛОГАМИ....................................................................... 168

Приложение 2. Определение анионов в нефти, определение анионов в 170

сточной воде............................................................................

Приложение 3. Определение органических кислот и углеводов........... 172

Приложение 4. Определение ЭДТА............................................. 174

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная

хроматография

Б АД - биологически активные добавки

ISO - International Organization for Standardization (Интернациональный стандарт)

EC - European Commission (Европейская комиссия)

УФ -ультрафиолетовое детектирование

ГХ - газовая хроматография

КЭ - капиллярный электрофорез

ГОСТ - государственный стандарт

САНПиН - санитарные правила и нормы

ASTM - American Society for Testing and Materials - стандарт от

американской международной добровольной организации, разрабатывающей

и издающей стандарты материалов, продуктов, систем и услуг

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

MC - масс-спектрометрия

ПДК - предельно-допустимая концентрация

ОБУВ - ориентировочно-безопасный уровень воздействия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

СО - стандартный образец

ГСО - государственный стандартный образец

ФЛ детектор — флуориметрический детектор

ДДМ - детектор на диодной матрице

ФИТЦ - фенилизотиоцианат

ДАБС - дабсилхлорид

НБД - нитробензоксадиазол

FMOC-C1 - 9-флуоренилметилхлорформиат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность Пробоподготовка является важнейшей стадией химического анализа, лимитирующей реализацию возможностей современных приборов, а, следовательно, и качество результатов анализа. Надежность способа пробоподготовки может оказать решающее влияние на выбор аналитического метода. Это особенно принципиально при анализе сложных матриц, таких как пищевые продукты, биологические объекты, сточные воды, промышленные выбросы, нефть и т.д. Основные проблемы анализа таких объектов заключаются в их непредсказуемом составе, низком содержании определяемых аналитов и значительном количестве сопутствующих. Решение достигается грамотной стратегией при подготовке проб сложного состав, обеспечивающей селективное выделение целевых компонентов с требуемыми пределами обнаружения.

Работа посвящена поиску максимально простых, надежных и дешевых подходов к пробоподготовке при ВЭЖХ анализе пищевых продуктов, биологически активных добавок, фармацевтических препаратов, нефти, сточных вод нефтяных перерабатывающих предприятий, промышленных выбросов, биологических матриц.

Изучению способов определения важнейших компонентов в перечисленных образцах посвящено немало работ. Однако в рекомендуемых методиках имеется и ряд ограничений: содержание солей в нефти определяют по хлоридам или рассчитывают по суммарной электропроводности; при анализе сточной воды методом ионной хроматографии фосфат и нитрит-ионы не определяются на уровне ПДК вод рыбохозяйственного назначения. Методики анализа углеводов и органических кислот в пищевых продуктах регламентируют определение конкретных компонентов в узком круге продуктов. Определение апиозы в

биологически активных добавках и этилендиаминтетрауксусной кислоты в майонезе методом ВЭЖХ не описано вообще.

Сочетание оптимизированной пробоподготовки, включающей гидролиз, экстракцию (жидкостную и твердофазную), дериватизацию с очисткой экстрактов и последующим разделением компонентов методом ВЭЖХ с использованием селективных, высокочувствительных детекторов обеспечивает надежность и высокую воспроизводимость получаемых результатов.

В работе выявлены особенности процедуры пробоподготовки при ВЭЖХ определении:

- углеводов и карбоновых кислот - в напитках алкогольных и безалкогольных, соках, мёде, молочных продуктах, продуктах переработки плодов (варенье, джем), печенье, кондитерских изделиях (конфеты, мармелад, пастила); апиозы в биологически активной добавке «Зостерин-Ультра».

? "У

- неорганических анионов (Т7", СГ, N02, N03', Вг~, РО4 ', 304 ') в сточной воде и нефти;

- полицикличеких органических углеводородов (ПАУ) в атмосферном воздухе, промышленных выбросах и почвах;

- свободных и общих аминокислот в биологических матрицах, спортивном питании и сухих растительных экстрактах;

- этилендиаминтетрауксусной кислоты в майонезе/

Цель работы: Разработка методик анализа сложных матриц {пищевых продуктов, биологически активных добавок, фармацевтических препаратов, сточной воды, нефти, промышленных выбросов, почвы, биологических объектов и растительных экстрактов) с применением простой и надежной процедуры пробоподготовки для каждого типа аналитов при ВЭЖХ определении углеводов, карбоновых и аминокислот, полиароматических

углеводородов, неорганических анионов, этилендиаминтетрауксусной кислоты.

В связи с поставленной целью решались задачи:

1. Оптимизация условий пробоподготовки при анализе нефти и пищевых продуктов, основанной на методах сорбционного выделения сопутствующих примесей.

2. Разработка общей схемы пробоподготовки жидкофазных и твердофазных объектов при ВЭЖХ-определении углеводов и карбоновых кислот в продуктах питания.

3. Определение углевода апиоза в БАД «Зостерин-ультра» с использованием гидролитического расщепления пектина и получением флуоресцирующего производного.

4. Выявление возможностей сочетания мембранной фильтрации и сорбции в процессе пробоподготовки при определении ПАУ в промышленных выбросах, атмосферном воздухе и почве методом ОФ ВЭЖХ и получение оценочных характеристик эффективности использования различных собционных материалов: сверхсшитого полистирола и сополимера стирол-дивенилбензол 8ире1рак 20.

5. Выбор условий гидролитического расщепления компонентов матрицы в сочетании с получением производных при определении свободных и связанных аминокислот в различных объектах.

Поиск условий пробоподготовки селективного ВЭЖХ определения ЭДТА в майонезе.

7. Разработки ВЭЖХ методик анализа объектов со сложной матрицей (пищевые продукты, растительные экстракты, атмосферный воздух, промышленные выбросы, нефть) на основе предлагаемых способов пробоподготовки.

Научная новизна

Предложены общие подходы к подготовке проб при ВЭЖХ определении с УФ-детектированием свободных и связанных аминокислот в пищевых продуктах, биологических матрицах и растительных экстрактах, включающие гидролитическое расщепление (6М HCl) компонентов матрицы в сочетании с получением фенилизотиоцианатных производных аналитов. Для определения серосодержащих аминокислот адаптирован вариант кислотного гидролиза с предварительным окислением этих аналитов надмуравьиной кислотой с последующей дериватизацией, а для определения триптофана, неустойчивого в кислой среде, - щелочной гидролиз насыщенным раствором гидроксида бария.

Предложена схема пробоподготовки при ВЭЖХ определении анионов (F", СГ, Br, N03", NO2', РО43", SO42") в водных вытяжках из нефти (3 последовательные экстракции горячей водой при температуре 80-90 °С с последующим добавлением бензола) в сочетании с очисткой на сорбенте С18 от сопутствующих органических примесей методом ионной хроматографии с косвенным спектрофотометрическим детектированием.

Предложена единая схема пробоподготовки для ВЭЖХ определения углеводов (глюкозы, лактозы, мальтозы, маннозы, сахарозы, фруктозы, ксилита и сорбита) и карбоновых кислот {щавелевой, винной, муравьиной, яблочной, молочной, уксусной, лимонной, янтарной, фумаровой, пропионовой) в жидкофазных и твердофазных пищевых продуктах, включающая гомогенизацию, водную вытяжку при 40-50 °С с её очисткой от неполярных примесей на обращенно-фазовом сорбенте и концентрирование в случае карбоновых кислот на анионите.

Предложен способ определения этилендиаминтетрауксусной кислоты в майонезе методом ион-парной ВЭЖХ в форме комплексов с ионами Fe3+ или Си2+, извлекаемых из матрицы фосфатным буферным раствором.

Предложен способ определения углевода апиоза в БАД «Зостерин-Ультра», включающий гидролитическое расщепление компонентов матрицы с использованием 2М раствора трифторуксусной кислоты в сочетании с получением флуоресцирующего производного (Кюгп =360 нм, Хизл =435 нм) с антраниловой кислотой.

Предложена комбинированная схема выделения и концентрирования всех 16 приоритетных загрязнителей группы ПАУ, включающая фильтрацию воздушной пробы через пористый тетрафторэтилен и концентрирование на обращенно-фазовом сорбенте с их последующей десорбцией �