Комплексообразование и конформационные превращения макромолекул сополимеров N-винилкапролактама в водном растворе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ' ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ 1Ш..М.В.ЛОМОНОСОВА

Специализированный Совет Д 063.41.05

На правах рукописи

АНИСИМОВА ТАТЬЯНА ВАЛЕНТИНОВНА

541.64:66.099.2

КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ И КОНФОШЦИОННЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ СОПОЛИМЕРОВ Ы-ВШШКАПРОЛАКТАМА В ВОДНОМ РАСВОРЕ

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

' АВ ТО Р Е С Е Р А Т . диссертации на соискание ученой степени :: кандидата химических наук- . '

' :.'.оскьп - 1ЭЭ1

Р8ботэ выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени институте тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносове.

■1 . -Научный руководитель - доктор химических наук, профессор

ЗУБОВ В.П.

Официальные оппоненты - доктор химических наук,

СТАРОДУБЦЕВ С.Г.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ИВАНОВ A.A.

Ведущая организация - НИФХИ т. Л.Я.Карпова. •

' Защита диссертации состоится "Al11 куяф**- 1991 года

в _часов в аудиторий ___ на заседании специализирозан-

ного Совета Д 063Л1.05 Московского ордена Трудового Красного Знамени института тонкой химической технологии ш. К.В.Ломоносова по адресу: П983Г, ГСП, Г-435, ул.. М.Пироговская, д.1. :

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " "___1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета дштор химических наук,профессор

vJ^U^гшЦКОВА* .ИЛ.

ОБЩАЯ ."JJ РАБОТЫ*^

Актуальность работы. Б последние -года началось интенсивное исследование близкого по свойствам аналога поливинилпирролидона -поли-Ъ1-вшшлкалролактама (ПВЮ. Кроме свойств, характерных для поливинилпирролидона (растворимость в воде и органических растворителях, способность к комплексообразованыо, биосовместимость), этот полк.'/ер обладает очень важным для многих технологических процессов свойством - способностью к термоосажцению при физиологических температурах, что позволяет в мягких условиях формировать на его основе | гидрогели. i

. Регулировать комплексообразующие свойства и способность к тер-глоосачщению сополимеров на основе Н-винилкалролактама можно с йомощьэ изменения- гидрофильно-гидрофобного баланса макромолекул. Э связ;1 с этим "синтез и исследование свойств сополимеров на основе ii-виншпсапролактама, предназначенных для применения в биотехнологии и очистке сточных вод - актуальное и практически важное направление в современной химии полимеров.

Цель работы. Синтез сополимеров винилкапролактама, исследование их комплексообразующих свойств и изучение фазового разделения в водных растворах. • ' '

Научная новизна. 'Синтезированы и охарактеризованы сополимеры основе М-винилкапролактама: вишц[капролактам-вищ1лацетат( ВК-ВА) , винилкалролахтам-'виниловый спирт (ВК-ВС) и винилкалролактам-винил-.метилацетамид (ВК-ЗМА). .'" :

Проведено - исследование комплексо'образования сополимеров винил- j . калролактама в водном растворе с фенольными соеди- "чиями, красите- i лями, стероидам. Обнаружены «информационные изменения макромолекул ¡ при комнлексообразсванки, вь^ажавщиеся в изменении вязкести и тем- ; пературы. фазового разделения водных растворов. Найдеды возможности х В руководстве работой принимал участие к;х.н..cí.H.c. Пашкин И.И. .

регулирования температуры фазового разделения растворов сополимеров винилкалролактама. '■.'.., ' '

Практическая значимость. Разработан новый одностадийный способ) иммобилизации биоматериалов в мягких условиях в гидрогели на основе] поли-Ы-виниламидов. Проведенные испытания показали, что введение '' сополимеров ВК в ферментативную-среду значительно повышает эффек- : ' тивность реекций микробиологической трансформации при получении ценных лекарственных соединений - стероидов.

На основе новых полученных термоосаздаемых сополимеров ВК могут быть созданы эффективные системы для связывания фенолов и кра--сителей.

Работа велась в соответствии с ГНШ "Новейшие методы биоинженерии" по разделу "Разработка новых способов и материалов для иску-' сстзенной иммобилизации клеток микроорганизмов".

Автор защищает: Способы синтеза сополимеров винилкалролактама и их свойства; регулирование процессов фазового,,.разделения водных растворов сополимеров винилкалролактама; способ иммобилизации биоматериалов в гидрогели на основе поли-Ы-виниламидов.

Апробация работы.Отдельные части материала, изложенного в диссертации, были лредставлены на 1У Всесоюзной конференции по водорас4 творимым полимнрам и их применению, Иркутск, 1991.

* Публикации, По материалам диссертации опублг звано 3 печатные, : работы. : ■ ".'

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного экста, состой, из введения, .литературного обзора, результатов и их обсуждения, изложенных в главах, и выводов,' а | также е.. лека литературы, включающего наименований. В диссертацию'' ' включено таблиц, рисунков. .

ЭКСПШгЛЕНТАЛЬПАЯ ЧАСТЬ

Исходные вещества. Сополимеры ВК-ВА и ВК-ВМА получены ради-

кальной сополимеризацией в н-бутаноле г ; присутствии динитрила ■ *

азо-изомасляной кислоты (ДАК). Сополимеры ВК-ВС получены щелочным алкоголизом сополимеров ВК-БА в метаноле.

Методы'исследования. Составы сополимеров определяли по данным элементного анализа, ИК-спектров и ЯМР. Константы сополимеризэ-! ции определены по методам Файнемана-Росса и Келенэ-Тюдеша.ИК-спек-тры сняты на приборе "змтобги 200-91527", ямр-спектры - на ради-| оспектрометре ЯМР "теБ1а вэ -587". Средневесолые молекулярные ■ ; массы сополимеров определены по методу светорассеяния с помощью фотоэлектрического нофеломотрз фирмы "ЗоГ1са". КомплексообрззоБа- ' нио изучали методами вискозиыетоии и УФ-спектроскопии. Электронные спектры сняты на приборах " зоесога итМпз " и"БМтабги ич-гчо ".

Испытания по применению полученных сополимеров для биотехно- | логических процессов проведены совместно с лабораторией "Кммобили-! зованныв микроорганизмы" КБФМ АН СССР.

. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .

I. Получение сополимеров ка основе Ы-винилкапролактама'.

1.1. Сополимеры ВК-ВА.

Сополимеру ВК-ВА'получали по методу радиквльной сополииериза-) ции в н-бутаноле при .70°С'с использованием в качестве инициатора ЛАК-. ■ {с"г ~ " ('*<;«

I, .О • / *~Ж

цс'^С* О

¿Ъ

I ] / , ;

"¿С - 'си2 ¿"ъ \

Состав и характеристики сополимеров ВК-ВА приведены в табл.1. На основании полученных результатов были рассчитаны константы ! сополимеризации ЗК и ВА по двум методам. Они состьлили: .1

- по методу 'гН.чеиаг.о-Роосо: ?зк>=1,33+0,10; =0,30+0,10; !

- по методу Келзнз-Тэдешэ: 06+0,37; 2^=0,36+0,19. !■

• "

Из донных табл.1 видно, что увеличение доли ВК в. маломерной смеси, а следовательно, и в сополимере, приводит к увеличению характеристической вязкости, что отражает тенденцию к росту молекулярной массы сополимеров. Понижение значений молекулярной массы при увеличении доли ВА мовно объяснить активным участием этого мономера в реакциях передачи цепи.

1.2. Сополимеры ВХ-ВС.

Сополимеры ВК-ВС были получены щелочным алкоголизоц сополимеров ВК-ВА. Реакция протекает по следующей схеме:

и/К'* Г 60 а ,■ - ¿X

2с мг КОН .метанол ¿*г

Глубина протекания реакции контролеров, лась по ИК-спектрам (по уменьшению интенсивности полосы' поглощения валентных колебаний группы С=Овинилацета'тного звена), полученные результаты подтверждав ются данными ШР-спектроскопии. Характеристики сополимеров ВК-ВС представлены в табл.1.

Было показано, что состав исходных сополимеров ВК-ВА влияет не скорость и полноту протекания реакции алкоголизв. Из расчетов видно-, что качения констант реакции омыления резко падают с возрастанием доли ВК-групп в сополимере до 50 мол.% и более плавно уменьшаются при дальнейшем увеличении доли ВК-,рупп. Это можно . . объяснить "Эффектом соседа" - замедляющим стерическим влиянием объемных капролактамных групп. Такой эффект подтверждают данные по зависимости остаточного содержания ВА-групп от состава исходного. сополимера (см. табл.1). . ■■. •

Наличие гидроксильных групп в сополимерах влияет на^характер внутримолекулярных взаимодействий вследствие образования водородныэ связей между звеньями ВК и ВС, что проявляется в.довольно сильном сдвиге максимума полосы поглощения карбонильной группы лактамного

: 5

кольца (от 1630 си"* до 15в0 см"*' при увеличении в сополимере доли ОН-групп.

Внутримолекулярные взаимодействия обуславливают экстремальный; характер зависимости вязкости водных растворов от состава сополимеров, причем эта кривая имеет минимум при соотношении ВК:ВС звеньев в макромолекуле равном 1:1. При таком соотношении в макромолекуле создается возможность образования максимального числа водородных связей. В метанольном растворе вклад внутримолекулярных водородных связей в конформационные изменения ослаблен из-за конкуренции молекул спирта и гидрэксильных групп цепи зэ взаимодействие с лактаиным звеном и, вследствие этого, характеристическая вязкость монотонно увеличивается с ростом молекулярной массы ( табл.1).

Следует отметить, что при данных условиях, согласно данным ИК-и ШР-сиектрос1Гопии гидролиз лактамных колец, не идет.

1.3. Сополимеры ВК-ВУА.

Сополимеры ВК-ВМА синтезированы по методу радикальной сопом-ыеризации з н-бутайрле и с использованием в ка зстве инициатора ДAKj

' Оба мономера обладают близкой-реакционной способность», что ! следует Яз расчета констант сополимеризации по методу Келзна-Тюдеша. Они составляют;'3^=0,46+0,09 и £'21^=0,28+0,03. Состав сополимеров! определяли по данный ШР-спектроснолвд.

Характеристики полученных сополимеров приведены в табл.1. |

. Из данных таблицы видно, что характеристическая зяакость во£- 1 нвх растворов пргктлчеснв аэ зээисаг от состава сополимеров, что I

мозно объяснить сходной природой обоих мономеров (они относятся к ;

. I

'одному и тому не классу Х-в;;ниламидов), и следовательно, сходными 1

Характеристики сополимеров ВК

Таблица I

Сополимеры ВК-ВА Сополимеры ВК-ВС Сополимеры ВК-ВМА

Содержание ВК в МО- 7,0 23,0 41,0 62,0 86,0 _ 8,0 25,0 44,0 65",0 88,0 номерной смеси,мол.%

Содержание ВК в со- •

полимере, мол.% 13,0 33,8 54,5 62,8 85,1 13,0 33,8 54,5 62,8 85,1 3,1 19,2 33,6 59,7 93,8 '

Содержание ВА в сополимере, мол.% 87,0 66,2 46,5 37,2 14,9 1,8 4,1 4,6 5,1 .4,4 - - _ . _

Характеристическая . вязкость,

- метанол, 25°С 0,23 0,3? 0,34 0,42 0,69 - 0,29 0,31 0,48 0,50 - . - - - ; -

- вода, 25°С _ . - - - - 0,26 0,26 0,22 0,29 0,39 0,51 0,51 0,52 0,52 0,52

Молекулярная масса, . ■ » ■ ..

1ГВ, тыс. : : 37 4. 59 95 215 - 67 73 158 210 135 140. 142 140 140

■'■'"'. 7

нонформационными состояниями макромолекул а растворе.

Была исследована растворимость полученных сополимеров ВК-ВА, | ВК-ВС и ВК-ВМА в различных растворителях, полученные результаты излоаены в диссертации.

2. Особенности комплексообразования и конформационных превращений макромолекул сополимеров ВК.

Макромолекулы Ы-виниламидов содержат как неполярные метиле- | новые и метинвзые группы цепи и лзктэмного кольца, так и дипольные ; виидные группы. Неполярные группы создто? возмонность гидрофобного связывания, а благодаря наличию емкдных групп сбзспочиззегся взаимодействие с низкомолекулярнъпи? соединениями, способными к образованию водородных связей, например,л гидроксильными (-ОН) или эыи- ; ногруппами (-11Н2; -Т1Нй), в такяэ с отрицательно заряженными анионами: - СОО", - О".

В данной работе ъ качестве объектов изучения комплексообрэзо-вэния выбраны фенольныэ соединения, красители и стероиды. Выбор этих типов соединения определялся,как возможностью их использования) в качестве моделей для изучения слоаных биологических процессов, например, взаимодействия лекарственных веществ с полимерами, фермен-! тативного катализа, так и практической важностью процессов связывания фенолов и красителей для очистил промышленных стоков.

2.1. Фенольные соединения.

На рис.1 представлены результаты изучения изменения приведен-; ной вязкости водных растворов ПВК и его сополимеров с В!'А (1А) и ' ЗС (16) при взаимодействии с фзнольными соединениями. Из рисунка ! видно, что добавка .фенолов к ПБК сникает вязкость его растворов, ! 1ричем тем больше, чем .бельме функциональны* гядроксильнах'групп | трисутСтвует в феноле. ^

.. . Те. не 'тенденции .наблюдаются и для сополимеров ВК-ВС и ВК-ВМА. | )^нако, 'если для сопомшёров'ВК-В'ЗК скэтие- макромолекулы в ,присучст-

. ' 8 •,л

вии фенолов монотонно увеличивается с ростом доли ВК-звзньез, то для сополимеров БК-ВС зта зависимость ответ экстремальный характер, ¡' что связано со склонностью винилопиртовых групп к образованию внутримолекулярных водородных связей.

Из данных по связыванию флороглюцина сополимерами БК-ВС видно,' что наибольшее сжатие макромолекул, отражающее силу комплексообразо-| вания, наблюдается для сополимеров с небольшим содержанием ВС-групп; (до 30 иоп.%). То есть при соотношении мономерных звеньев ВК:ВС = 1 = 70:30 в макромолекуле создаются более благоприятные условия для | комплексообразования по сравнению с гомополимером ПБК, Вероятно, этс: происходит вследствие образования водородных связей в макромолекуле и возникновения "полостей", в кторые могут;"вписываться" фекольные кольца.

.Можно полагать, что во вз8им^чействии фенолов с сополимерами ! участвуют, по крайней мере, два типа сил: гидрофобные - за счет ароматического кольца фенолов, и водородные - иежду^фенольной гидрок- 5 сильной группой и карбонильной группой лактэыного кольца. '

Из сравнения результатов для фенола и флороглюцина следует, что увеличение числя функциональных групп в малой молекуле, а значит, и количестве возможных связей, приводит к усилению взаимодействия, что отракатеся в большей сжатии клубка макромолекул! :

. Комплек.ообразование с фенольными сгздинениями приводит не только к изменению конфорыационного состояния макромолекул, но и мак следствие, к снижению растворимости сополимеров на основе ВК. При увеличении концентрации фенольных соединений свыше 0,03$ масс. х водных растворах наблюдалась опалесценция, а затем йыпадение лсвдко образовавшегося комплекса. Этот осадок растворяется при пор-) зении температуры раствора. Подробнее эти явление обсуждается в разделе 5.2. . -

Тэ^иц образом, проведанные исследования показали наличие взаимодействия ыеяду исследуемыми сополимерами и фенольными соединениями, что дпет основание рассматривать перспективность их использование для выделения фенолов при решении экологических задач.Кроме того, добавками фенольных соединений монно проводить мягкую химическую модификацию гидроголевых структур на основе сополимеров ВХ.

2.2. Красители.

Из красителей в качестве объектов исследования выбраны эхино-; хром, молекулы которого эл^ектронейтральны, и эозин, который диссо-1

Эхннохром Эозин

Изучение связывания красителей имеет большое практическое значение для создания технологий очистки сточньг- вод. В' то же время| объемные гидрофобные молекулы выбранных красителей могут служить ! моделью для исследований взаимодействия полимеров с полиядерными' молекулами слокных Органических соедине; 'Я, например, лекарственных веществ. Взаимодепствие с красителями изучали спектрофотометра-; чески по изменение полояения и интенсивности максимума полосы поглощения красителя.'

3 случае гомополинера ПВК при увеличении концентрации полимер* "оптическая плотность раствора эхинохрома растет, достигая постоян- ; ного значения. Из графика зависимости оптической плотности от концентрации ПВК' (рис.2)' по метод? мольных соотношений по излому кри- | вой было оценено количество иояоа^рных звеньев, участвующих в обрз-| зовании центра связывания. Оно составляет примерно 10 звеньев, что | согласуется с литературными данными по взаимодействию аналогз ПВК - Г

ПВП с органическими ыолекулвкр 0 полученными аетодоы равновесного

■ * ■ ■ ■ • ■

диализа. » '

Данные по изменению оптической плотности растворов эхинохрома .в присутствии сополимеров ВК-ВС свидетельствуют, что введение ВС-групп приводит к уменьшению оптической плотности растворов по сравнению с ПЕК и, следовательнос ослаблению взаимодействия красителя о полимером. Связывание молекул эхинохрома сополимерами ВК осуществляется, по всей видимости,, посредством гидрофобного взаимодействия, л образования водородных связей. |

Как следует из рис.3, при повышении температуры растворов зхи-| р.охромэ оптическая плотность возрастает, что, вероятно, связано с |< усилением гидрофобного взаимодействия, которое, как известно, является эндотермическим процессом.

В случае эозина, как можно видеть из рцс.4, гри комплексообра-) зовании с полимерами оптическая плоалость растворов уменьшается, чт( характерно для взаимодействий именно этого красителя. Как видно на писунка, увеличение доли ВК-групп в сополимере^усиливает комплексо-образоваиие. По-видимому, связывание сополимеров с анионным краса-•хелем идет как посредством гидрофобного связывания, так и алектро- , ■ статического взаимодей одвия благодаря частичному положительному •заряду на атоме зота:'' Ч / „

На основании проведенных экспериментов можно заключить, что полученные гомо- и сополимеры на основе ВК аффективно связывают кра. с .ч те ли нейтральной и анионной природы. Причем силу связывания можно регулировать количеством введенных в.сополимер звеньев второго ком-| лонента,

2.3. Стероиды. ,

Бол юЯ практический иатзрэс для выяснения физико-хиалчзских сг;нов биотехнологических процессов имеет изучение комплексообразовг йчя водорастворимых неионных полимеров во стероидными соединениями

Рис.1. Влияние добавок фенольных соединений на вязкость водных

растворов сополимеров; а) ВК-ВМА^ б) ВК-ВС.

I - растворы без добавок; 2-е добавками фзнола; 3-е добавками флороглюцина.

Концентрации: полииеров-1% лесс., фенолов-0,025% масс.,Т=20 С.

1.0

0.1

4*

03

Рис.2. Зависимость оптической плотности водногр раствора

эхинохрома от добавок сополи».~ров ВК-ВС.

Содержание Вй в сополимерах, мол.%:-1 --МО; 2 - 54,5; 3 - 33,ф и - 13; 5-0. , .

Концентрация.зхинохромв - 5,63-10 ^цоль/л, Т=22иС,А =490 ни.

Рис.3. Влияние температуры на сзя-| зкввние эхинохрома растворами сополимеров ЗК-ВС. ■•.

Содержание ВК в сополимерах,мол.:

Г - 103; 2 - 85; 3 - 2<и, 4 - 0; 5 - " краситель. 1

5*Соотношений полимер:краситель -10:1;

_Л-490 ны. !

•¿•с ■■ ;

' : 12 Л*

Л качестве объекте исследований был выбран гидрокортизон-(Щ). .

с#,-оН

I >

Согласно вискозиметрическиц данный, комплексообразование с ГК, как и в случае фенолов, приводит к скатию макромолекулы. Причем! наибольшее саатие имеет место при мольном соотношении в сополимере ! 5К:В2 = 1:1. Вероятно, в этом случае макромолекула имеет наиболее благоприятную для взаимодействия с -ГК конформацию.

Комплексообразование может приводить к повышению растворимости ГК. Так как в данном случае трудно судить об истинности раствора чо правильнее говорить о солюбилизании малораствор мого стероида. 1К связываеюя с неполярними частями макромолекул ПВК за счет гидрофобного взаимодействия, е образовавшиеся "ядра" поддергиваются в растворе гидрофильными фрагментами. Если число таких фрагментов, ¡. приходящихся на макромолекулу, недостаточно для обеспечения рзство-! р.;мости комплекса в воде, то наблюдается ассоциация макромолекул и,:-пак следствие, выпадение! комплекса в осадок.

• Растворимость ГК в воде составляет 0,35 г/л, в растворе ПВК рдеется получить конечную крнцентрацига 2 г/л. Смеси ПВК с другими ¡.олимерамй (ПВС, полиакриламид, производные целлюлозыд т.д.) не улучшают солюбилизацию стероида. Исходя из этого особой интерес ;п;едстевляло изучение солюбилизации ГК в растворах сополийеров ВК | с различным соотношением гидрофильных и гидрофобных чэотей в макро-1 > -лекуле. .

Дль сополимеров ВК-ВС с олюби ли аиру кг-з я способность возрастала ; с увеличением содержания гидроксильных групп в цепи сополимера. Тек з растворе сополимера с содержанием ОН-групп 87 мол.% растворимость

.'-■■'. 13

ГК побивается до 5 r/n. Для сополимеров ВК с еще более гидрозоль-f

нш-сскоиоаероа - ВЫА удалось получить растворы с концентрацией ГК до б г/л, причем с увеличением концентрации полимера б растворе возрастала устойчивость систем.

Таким, образом-, проведенными экспериментами показана принципиальная возмояность использования сополимеров ВК в качестве солю-билиэирующих агентов. Причем для более успешного проведения процесса солюбилизации необходимо, с одной стороны, наличие ВК-эвенье^ эффективно взаимодействуювдх с неполярными частями молекул стерои-; да, с другой - наличие гидрофильных участков в сополимере (ВС и BMA) для поддержания в растворенном состоянии образовавшегося ксмплкса.

3. Особенности информационных презращениР макромолекул и фазовое разделение водных растворов сополимеров ВК.

■ * 3.1. Влияние температуры.

Одной из наиболее важных особенностей полимеров класса Ы--зп-| ннлзмидоз является их способность к фазовому разделению при новы- ; пении температуры.. Поскольку причиной термочувствительности данных! полимеров является наличие гидрофобных областей в макромолекуле, логично было предположить, что варьированием-гидрофилько-глдрофоб-j нопо баланса макромолекул сополимеров на основе ВК.мояно регулировать температуру фазового разделения их водных растворов.

Из рис.5, где представлены кривые термоосавдекия полученных , сополимеров, видно, что введение более гидрофильного по сравнению i с ВЯ сомономерэ - BMA, к^к и следовало ожидать, приводит к повыше-)-нии температуры фазового разделения. Сополимеризация БК с более гидрофобным сомономером - ВЛ понижает температуру фазового разде- , ления. Для сополимеров ВК-ВС соответствующая кривая проходит чер^з! минимум. .

Проведенные-эксперименты показывают, что регулирование по-

О яосэ Рс&у

ГС |

ев

ч5

3о

ЛГ -

Рис Л. Зависимость оптичес

коя плотности водного раствор

эозина от добавок полныеров.

Содержание ВК в сополимерах ВК-ВВ. мол.%: I - 0-, 2 - 13; 3 - 33,8; 4 - 54 ,5; 5 - 100.

Концентрация эозина -л 3,25-10 ноль/л, Т=22°С, Л=515 ни.

Рис.5. Температура фазового раз' деления водных растворов сопслйме-

рсв ЗК.

1 - ВК-ВаА-; г - ВК-ЗС; 3 - ВК-ЗА. Концентрация полимеров - 1% ыасс*

¿3 СО /С ¿СО

сродством сополиыоркзвции гидрофильно-гидрофобного белансв макр>-молекул сополимеров на основе ВК является одним из способов деле- \ направленного изменения температуры фазового разделения. При взедв' нии л сополимер неполярных гидрофобных фрагментов (например^ ВА-авеньев) координированных не диполе лактвмной группы молекул воды ае хватает для поддержания в растворенном состоянии всей макрокоде) кулы. В связи с этим снижается нижняя критическая температура рас-' творения (НКТР) сополимеров. Введение в сополимера не взаимодействующих с лактамными звеньями гидрофильных фрагментов, которые "раз^ режают" ВК-звенья, подавляя таким образом гидрофобные взаимодейст-j вия между ними, приводит к повышению НКТР (например, сополимеры BK-BIJA). В случае ВК-ВС вводимые гидрофильные фрагменты способны взаимодействовать с ВК-звеньями с образовением внутримолекулярных связей и направление изменения КТР в системе буде® зависеть от баланса сил; . .

I) гидрофильная часть макромолекулы велика и эзаимодейетвие её с молекулами воды сальнее, чем внутримолекулярное взаимодейзтви| - НКТР сополимера повышается по сравнении о ПВК (левая ветвь криво| 2) гидрофильная часть мяла, внутримолекулярные взвимодействия| |гидрофобное взаимодействие ВК-звеньев между .собой и водородные связи между ВК и вторым сомономерои) велика - НКТР повивается ([правая ветвь кривой). •

Для выяснения механизма фазового разделения была изучена зэ-j зисимость зязкости полимеров нэ основе ВК от температуры. Проведен ные исследования показали, что для гомо- г сополимеров ВК повышение температуры раствора заметно сяикзег его вязкость. Причем зависимость -f^J от состава сополимера "мест экстремальный хэрпк. тер с минимумом при соотношении звеньев Ж;ВСг 1з1. Такой ход крк ' .вой свидеадльсаз^ет о различ: эй-сгопеяз шедгташяегпости макр'омоле кул -сополимеров -а* оодном растворе >а 4фяозсэд ¡разделению. При соде;

евнии ЕС-групп в сополимере 30-80 ыол.% макромолекулы уже'при температуре 1£°С вследствие образования внутримолекулярных водородных связей имеют конформацикц приблииающупя к глобулярной. Минимум на кривой отражает образование максимального числа водородных связей в макромолекуле, что приводит к созданию наиболее компактного клубка. I 3.2. Влияние спиртов на фазовое разделение растворов !

полимеров на основе ВК. '•

Кокформационное состояние макромолекул и температура фазового разделения могут значительно изменяться при замене (хотя бы частич- ' ной) одного растворителя другим. В рабогз это рассмотрено для бинарных ростворитглой вода-алифатический спирт и вода-ароч8тический; • гпирт. 1'зкой вкбср растворителей объясняется тем, что водно-спирто-' вые смеси используются во многих биотехнологических процессах.

Как видно из рис.б, зависимость температуры фазового разделения 1Ш от мольной доли алифатических спиртов в водных смесях ; ' ииеет резко выраженный экстремальный характер. Ранее было показано, что эти спирты являются для иоли-Н-виниланидов лучшими растворителями, чем во?а, причем их качество как растворителей улучшается с увеличением длины и разветвленности алифатического радикала в молекуле сьирта. Отсюда логично повшение температуры фагового | разделения ПЗК при содержании алифатического спирте в смеси Юмол$ так как идет засеке плохого растворителя (воды) на хороший (алифатический спирт). , '

Реькое ке снижение температуры базового разделения при со-дерааних алифатических спиртов з смеси до 10 мол.$ отранзет, по-видимому, наличие структурных изменений в исследуемой системе. Известно, что алифатические спирты усиливают структурирование; ; воды, участвуя в водородном свяс-изэнми с. образованием единого кар-' изсз с молекулами воды. Это воздействие спиртов возрастает с : ;

ув&личением длины и развехвленности алифатического-радикала .молекулы спирта. Возникновение таких структур препятствует растворг-'ию в воде цеполпрных молекул, в результате снижается температура фэзо-'. вого разделения раствора полимера. Можно полагать, что в образовании такого единого каркаса участвует определенное количество молекул воды и спирта^ Когда количество молекул спирта превышает критическое, каркас разрушается и преобладающим становится влияние алифатического спирта как более хорошего растворителя.

Совершенно другэя картина поведения макромолекулы ПВК имеет место з смешаяяоц растворителе вода-зроиа.тическия спирт. Б этом случае появляется возможность специфического взаимодействия между ВК-звеньями и молекулой второго компонента смешанного растворителя. Это взаимодействие будет определять поведение всой системы.

Было изучено влияние состава сополимеров ВК-ВС на температуру: фазового разделения ч смеси вода-флороглюцин (рис.7). Как видно из рисунка, при уменьшении содержания ВК-звеньев з сополимере добавки флороглюцина в меньшей степени снижают температуру фазового рззде- ■ ления систеш , что, очевидно, связано с ослаблением взаимодействия иекду ароматическим спиртом и лактамными звеньями, количество которых в цепи уменьшается. -"4. Возможность использования сополимеров ВК в биотехнолог* •.''•*

гических процессах. • " •

Свойства сополимеров ВК (термочувствительность, способность формировать гидроили при физиологических температурах, термообрати) мость гелей), а такке показанная ранее биоинертность гомопол"1/ера ВК, позволили предположить перспективность их использования в качестве носителей для биоматериалов.

Как уве указывалось, другой ванной особенностью водорастворимых сополимеров ВК является высокая комплексообрэзующэя способ-

Рис.7. Влияний добавок флороглю-цина на температуру фазового разделения водных растворов сополкые-ров ВК-ВО в-.зависимости от состава

I - без добьзок; 2 - при'введении флоооглюцина.

;(энцентргции: полимера -Ц^ласо.; ; флороглкшьнв - 0,0£5£мосс.

Мольное соотношение ЯВКгфлсроглюци ~ -36:1.

Вк. /ч«17. '•" ■

Ность ¿акромолекул, которая приводит, л честности, к повышению растворимости в воде гидрофобных соединений, в том число и стерои-, дов. В этой связи можно считать многообещающим применение их для повышения эффективности микробиологических методов получения ценных лекарственных стероидных препаратов (гидрокортизон, преднизо-лон и др.).

4.1. Получение полимерных носителей для иммобилизации биоматериалов.

Иммобилизиция биоматериалов в носители позволяет избежать механического повреждения клеток в процессах культивирования и не-, посредственно биосинтеза, повысить концентрацию клеток ъ среде, значительно -упростить технологию выделения целевого продукта.

Известны различные способы иммобилизации бг ■■материалов а носители-'включение в разнообразные гели, например полиакриламидный гель, каррагинан, эльгинатный гель, агар^&гар, в мембраны на основе ПВО; адсорбция на производных целлюлозы и крупнопористой керз- , мике; ковалентное связывание с активированным силикагелем. Од;-:ако каждый из этих методов имеет недостатки.

В данной работе использован новый принцип образования геля, основанный на явлении термоосаждения, причем,; как указнвалось выше} • температуру термоосаядения мокно варьировать в широком интервале изменением состава сополимеров, .

Новый способ иммобилизации предусматривает смешение клзток микроорганизмов с г леобразующим 3-10^-ным водным раствором гомо-. или сополимера ВК и получение гранул с гмыобилизованными клетками при добавлении полученной суспензии к буферному раствору, содержа-, тему сг. ^илизвтор в количестве 0,5+1 масс.щ температуре ■ 29-40°С. Стабилизатор (фенольные соединений) образует на повсрхкоо-} ти гранул нераэтворимую при хомнатной температуре .ленку ксмплексз| фенол-полимер, устраняющую сгипаемость гранул восителя. '

■ -го

Несомненный достоинством данного люсоба иммобилизации, 'отш чающим его от известных, является возможность проведения процесса в одну стадию: термоосаадание полимера и полное включение биомате-р..элов происходит одновременно в условиях, оптимальных для клеток" (рН, температура).

3 соответствии с указанным способом совместно с ИБФИ АНСССР проведена иммобилизация двух типов микроорганизмов: .

- бактерий Glucorobacter oxydane U1T3KM ВНИВй-6, ОКИСЛЯЮ- .

г

тдих Е-сорбкт 2 £ -сорбозу;

- грибов Aspergillus niger BKAi f-212, гидрокейлярухщих индолил-3-уксускую кислоту с получением 4,5 и б-оксипроизводных. ' В качестве стабилизатора использовали танин. В табл.2 приведены результаты сравнения эффективности проведения микробиологических процессов с использованием носителей на основе ПВК и широко распространенного в настоящее время полиакрилвмидного геля (ПААГ). . '

Таблица 2.

Сравнение эффективности полимерных носителей .

Ферментативная активность .' Операционная

Носители ¡jMt)ль/мл % от ПААГ °"бильность,

гранул час. " оутки

I. Оккслелие Л-сорбите в Jf-сорбозу гель на основе

ПЕК _ 63-94' . 121*167 14+15

ПААГ 56 ' ■ • 100 . 14 ?. Гидроксиларование кндолил-3-^уксусной кислоты

x-f.Jib не основе *

ПЬК 0,79-ю"5 161 . / 5

: п.'.лГ o.W'io-3 . юо 5 ;

Проведенные эксперименты показали, что использование полимеров па основе ВК в процессах иммобилизации микроорганизмов not .0-ляет повысить ферментативной активность (сорбитоддегидрогенззнуа-в 1,2*1,6 раза, гидроксилирующую - в 1,6 раза по сравнению с ПААГ) при сохранении её операционной стабильности. -

4.2. Повышение эффективности-процессов микробиологической трансформации.

В настоящее время существует проблема повышения эффективное-1 ти микробиологических методов получения ценных лекарственных стеро-j идных соединений в связи с широким их применением в ыздицине. Однако использование ферментативных реркций трансформации стерпи-' дов в препаративных целях ограничено низкой растворимостью зубсура-та в водных буферных растворах 3.связи с этим как у

нас, так и за рубеком, ведутся интенсивные исследования по поиску новых способов и ве.честв для проведения биоконверсии.

Нами, совместно с лабораторией "Иммобилизованные микроорганизмы" ИБМ АН СССР была изучена возможность применения поли-К-ви-j ниламидоз в подобных процессах. В качестве примерз использовали .дегидрирование 6{¿-метилгидрокортизона в 6 «¿-метилпреднизоган в

присутствии клеток' Artbrotacter simplex СИ,-ОН

' С.О

Ihir-OH

■ & ■

Ъу 0

6<£-метилгидрокортизон 6</-метилпреднйзолон

Результаты проведенных исследований представлены в табл.3.

' ' Таблица 3

Влияние полимеров на эффективность дегидрирования 6 .¿-метилгидрокорхизонз

ПОЛИМЕР ■ Концентрация полимера в • реэкц.смеси, масс.% Скорость •реакции, • мкМоль мин.мг кл. Превращение субстрата.^

ПВО 0 0

П 3 К 2 0,056 98

Сополимеры ВК-ВС, • содержание ЗК,мол.%:

- 71 ,Ь 2 0,062 100

- 54,5 2 0,040 ■' 85

-46,0 2 0,0068 £0

- 33,8 2 0,003 10

В отсутствие добавок полимеров 0 0,0003 5

Как видно из таблицы, гомо- и сополимеры ВК значительно повышают еьцсод целевого продукта (в случае ПВК - до 100%) а скороо^

реакции. Известно, что выход продукта снижается из-за образования смешанных кристаллов "субстрат-продукт" и протекания реакции бирования ферментативной активности микроорганизмов продуктом ц субстратом. Мокно предположить, чао введение в ферментативную : среду поли-Н-виаилэнидов подавляет протекание обеих побочных реккдай.

Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили перспекм ностъ использования сополимеров ВК для создения активных и стабип ккх хммобг«лкг ов.екиах клзточяех .систем* в также повышения аффектов» кости реакций кикиобирлогической трансформации. ~ •

ВЫВОДЫ

1. Изучена сополимеризация винилкапролактама с винклацетатом я винилкапролактама с винилметилацетамидом, определены константы сополиморизации. Найдены условвд получения сополимеров винилкапро-' лактам-вишшовый спирт по реакции щелочного алкоголи'за. По.сазано, что наличие винилкапролактамных групп уменьшает скорость и глубину протекания реакции алкоголиза.

2. Изучено комплексообразование сопол;з.:еров винилкапролактама с фенолаш и красителями. Установлено, что з связывании участвуют гидроксильные группы как малых молекул, так к сополимеров. Обнаружены конформационные измеьения макромолекул при ког.плексоосразсван нии, выражающиеся в изменении вязкости и температуры (разового разделения водных растворов. Показано, что повышен -е температуры усиливает комплексообразование. Найдено мольное соотношение звеньев винилкапролактам:виниловый спирт в сополимере, равное 70:30, при котором достигается наибольшее связывание фенолов, установлено, чтс] в образовании центра связывания участвуют 10 звеньев винилкапролактама. ' . '

3. Изучена солюбшшзация малорастворимых стероидов б водно-спиртовых растворах сополимеров винилкапролактама. Показана зази-сжюсть .солюоилизярующкх свойств сополимеров' от гидрофдльве-гидро-фобного баланса.макромолекулы.

.4.-Установлена возяогаюать регулирования температуры фазового!

.. .... I

разделения сопол] еров на основе'винилкапролактама с помощью:

- изменения природ- сомономера и зоотношеняя звеньев'з сополимере;

- изменения природы и состава бинарного -мтиорителя.

о. Показана перспективность использования сополимеров влки**-капролактама в оиотехнологячвских арбцеосйк . * ..■

. - 24 -

- для имлооклизацик меток. микрооргянизмоЕ с сохранением вдс ферментативной активности; • >. . ■

- - процессах Агробиологической трансформации при полученф! це:'¡ых лекарствешви соединений - стероиде...

Основные результаты диссертации изложены в работах:

• ■

1. Кузькина 'АЛ., Л&шкин И.И., Зубов В .П., Кирш Ю.Э...Марквичё-ва Е.А., Анисимова Т.В. Структура к свойства 1мдрогелей на основе поли-И-Бинилк2лролахтама." - Тезисы 1У Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и иг црмаенениё", Иркутск, 1991, с.172.

> 2. Донора М.В., Ктюгна И.Ф., -Марквичева Е.А., Аринбасарова А,Ц., • -Бакланова Т.Г., 'Пашкин И.И., Суходольккая Г.В., Фокина В.Н., Кирз Ю.Э., Кощеенко К.А.,' Зубов В.П., Анисшлова Т.В. Поли-Ъ1-зин!5лкапр0лакта"яш2 гель - новый носитель для иммобилизации * . микроорганизмов. ЩосЬеи.В1о1есЬпо1.Е1есгг.ЕхргеБз, 1991. 3. Пашклн И.И., Кирш Ю.Э., Анисимова Т.В., Кузькина И.Ф., ДавтянАа Зубов З.П. Компльксообразование и конфоркационные превращения махромолекул сополимеров на основе И-винилкапралактама. Зысохотлек.соед.'/в печати/.

£акая 19& тираж 100 экз.Ротапринт НИТХТ им.Ломоносова