Лазерная микроскопия комбинационного рассеяния и микрофлуориметрия взаимодействия фотосенсибилизаторов с живой клеткой тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

0 Д На правах рукописи

Аржанцев Сергей Юрьевич

ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ И МИКРОФЛУОРИМЕТРИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ С ЖИВОЙ КЛЕТКОЙ

01.04.21 - Лазерная физика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1997

Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители

-доктор физ.-мат. наук, профессор ЕИ. Коротеев

кандидат физ.-мат. наук, с.н.с. А. Ю. Чикишев

Официальные оппоненты

доктор физ.-мат. наук, профессор В. В. Тучин доктор физ.-мат. наук, зав. отд. А. П. Разживин

Ведущая организация

НИИ "Российский центр лазерной физики" при СПоГУ, Санкт-Петербург

Защита состоится " 5" июн.!? 1997 г. в 15- часов в аудитории

КНО _ на заседании Специализированного Совета К.053.05.21 по адресу:

119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, корпус нелинейной

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ. Автореферат разослан -г-1597 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета К. кандидат физ.-мат. наук, доцент

оптики.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Быстрое развитие лазерной техники за последние десятилетия повлекло за собой оявление множества смежных направлений в науке, в которых физика лазеров очетается с другими дисциплинами, такими как химия, физика ядра, физика олупроводников и др. К числу таковых относятся, в частности, лазерная биофизика и азерная медицина. Уже сейчас лазеры активно применяются в медицине в качестве очных и удобных операционных инструментов, а также в составе диагностических риборов. Так, в настоящих момент активно исследуются вопросы применения птической томографии, которая позволяет получать информацию о внутреннем строении тдельных частей тела человека без применения опасного рентгеновского излучения, 'азвитие метода фотодинамической терапии злокачествешгых опухолей повлекло за обой бурное развитие исследований с помощью методов оптической спектроскопии заимодействия фотосенсибилизаторов с клетками и тканями. В последнее время активно взвиваются методы диагностики различных заболеваний, основанные на myopeci (ептной спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния, причем иагностика происходит непосредствешю in vivo. В биофизике появилось множество 1абот, связанных с определением связи структуры биомолекул с их функциональными войствами.

Одним из методов исследования биомолекул является спектроскопия омбинационного рассеяния света, предоставляющая информацию о структуре олебательных подуровней электронных состояний молекулы. Известно, что структура олебательных подуровней чувствительна к изменению конформации молекулы, [зменению отдельных химических связей, а также к изменению микроокружения юлекулы.

Другим высокочувствительным и информативным методом исследования рганических молекул является флуоресцентная спектроскопия с временным азрешением, предоставляющая информацию о структуре электронных уровней и елаксации энергии электронного возбуждения. Благодаря высокой чувствительности )луоресцентной спектроскопии оказывается возможным изучение структуры рганических молекул в возбужденных электронных состояниях не только в растворах, но [ непосредственно в биологических объектах. Это открывает широкие возможности для )луоресцентной диагностики биологически важных молекул в клетках, тканях и других юдельных системах.

Существенно расширяются возможности применения спектроскопических методов ¡лагодаря интенсивному развитию в последние годы техники лазерной микроскопии, вторая позволяет фокусировать излучение в предельно малые, дифракционно >граниченные длиной волны света, размеры. Появление высокочувствительных [етекторов, таких как ПЗС-камеры, позволяет получать изображение объектов не только

"в свете" флуоресценции, но и "в свете" сигнала комбинационного рассеяния.

Несмотря на интенсивные исследования, проводимые в последние 10 лет, до сих пор не существует единого понимания процессов, происходящих при фотодинамическом воздействии на опухоли. Так, остаются открытыми вопросы о мишенях, на которые воздействуют фотосепсибилизаторы, проблемы, связанные с изменением микроокружсния при проникновении молекулы фотосенсибилизатора в клетку. Ведется также поиск новых, более эффективных фотосенсибилизаторов. Применение метода спектроскопии комбинационного рассеяния, в сочетании с флуоресцентной спектроскопией с временным разрешением, позволяет осуществить комплексный подход к изучению процессов взаимодействия молекул- фотосенсибилизаторов с живой клеткой.

Цель и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы являлось развитие методов лазерной пикосекундной микрофлуоримстрии и лазерной микроспектроскопии комбинационного рассеяния для изучения взаимодействия сложных органических молекул в растворах, клетках и модельных биологических системах и создание адекватной экспериментальной техники.

В диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. Создание многофункционального лазерного комплекса для исследования биологически важных молекул методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния.

2. Исследование влияния микроокружения на молекулу фталоцианина в одиночной живой клетке и модельных системах при помощи флуоресцентной спектроскопии с пикосекундным временным разрешением.

3. Исследование распределения нефлуоресцирующих фталоциашшов в живой клетке методом построения изображений "в свете" сигнала комбинационного рассеяния.

4. Исследование влияния микроокружения на молекулу фталоцианина в живой клетке и модельных системах при помощи спектроскопии комбинационного рассеяния.

Научная новизна

Созданный многофункциональный лазерный комплекс позволяет исследовать биомолекулы на уровне одиночной живой клетки методами флуоресцентной спектроскопии с пикосекундным временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния. Применение различных методов в исследовании одного и того же объекта делает возможным получение принципиально новых результатов.

Измерено время жизни флуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в живой клетке и показано, что отличие его от времени жизни в растворе не может быть отнесено на счет изменения кислотности микроокружения.

Измерение спектров комбинационного рассеяния молекул фталоцианинов кобальта в водных растворах, модельных средах и в живой клетке показало влияние микроокружения на структуру молекулы фталоцианина.

Использование метода построения КР-изображений в сочетании с традиционными

[етодами флуоресцентных изображений позволило определить локализацию и аспределение молекул фталоциаиииов кобальта в живой клетке. Измерение КР-зображений при различных положений клетки на оптической оси микроскопа показало, то внутриклеточные структуры, в которых накапливается фталоцианин, распределены по сему объему клетки.

Практическая ценность

Полученные в настоящей диссертации результаты носят в основном прикладной арактер и могут быть использованы в различных областях химии, биологии и медицины, 'азвитый в работе подход, основанный на сочетании методов флуоресцентной пектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния при применении икроскопической техники открывает новые методические возможности использования азериой спектроскопии для решения широкого круга задач фотохимии и фотобиологии. Ьмеряя время жизни флуоресценции и спектры комбинациошюго рассеяния можно олучать информацию о структурных изменениях органических молекул на уровне диночпой живой клетки, а также распределению молекул в клетке.

Практическая ценность выполненной работы состоит в экспериментальной еализации многофункционального лазерного комплекса, основанного на лазере на расителе, работающего в режимах синхронной накачки или в непрерывном режиме, вух системах регистрации: системе время-коррелированного счета фотонов и системе с ысоким спектральным разрешением, а также конфокального микроскопа, позволяющего роводить исследования биомолекул с высоким пространственным разрешением ге кадями флуоресцентной спектроскопии с гшкосекундным времешгым разрешением и пектроскопии комбинационного рассеяния.

Основпые положения, выносимые на защиту:

1. Созданный многофункциональный лазерный комплекс позволяет проводить сследования биомолекул, в частности фотосенсибилизаторов, применяемых в ютодинамической терапии рака, методами флуоресцентной спектроскопии с икосскундным временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния в тдельной живой клетке при сохранении жизнеспособности исследуемого объекта.

2. Числешпле оценки пространственного разрешения оптической схемы онфокального микроскопа полученные на основе теоретического расчета, оптимизация птической схемы. Результаты расчетов совпадают с экспериментальными данными.

3. Время жизни флуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина люминия в водном растворе не зависит от кислотности раствора. Время жизни ьтуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в живой клетке тличается от времени жизни флуоресценции в водном растворе и растворе с альбумином, то объясняется специфическим взаимодействием с микроокружением.

4. По спектрам комбинационного рассеяния установлено, что при проникновении >талоцианинов кобальта в клетку происходить изменение структуры молекулы

фталоцианина. Данные изменения интерпретируются нами как изменение микроокружения молекулы фталоцианина кобальта в клетке.

5. Методом построения КР-изображений определена локализация нефлуоресцирующих фталоцнашшов в одиночной живой клетке. Нефлуоресцирующие фталоцианины кобальта накапливаются в клетке в небольших структурах, распределенных по всему объему клетки, и локализуются в клетке в структурах эндоцитозного пути, таких как лизосомы, эндосомы и т.д.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях:

1. Международной конференции "Фотодинамическая терапия рака II" (Лилль, Франция, 1994)!

2. Международной конференции "Применение лазеров в науках о жизни" LALS'94 (Минск, Беларусь, 1994).

3. Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике КиНО'95 (Санкт-Петербург, 1995).

4. Международной конференции "Спектроскопия биологических молекул" (Лилль, Франция, 1995).

5. Международной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния ICORS'96 (Питтсбург, США, 1996).

6. Международной конференции "Применение лазеров в науках о жизни" LALS'96 (Йена, Германия, 1996).

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 10 научных работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Работа изложена на страницах, включающих 44 рисунков, 3 таблиц и список литературы из 180 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении сформулированы цель и задачи работы, кратко изложено содержание диссертации.

В первой главе дан аналитический обзор работ, относящихся к исследовшшю фотофизических свойств ряда фотосенсибилизаторов, применяемых в фотодинамической терашш рака, исследованию взаимодействия фотосенсибилизаторов с клетками и тканями. Показано, что при проникновении фотосенсибилизаторов в клетку их микроокружение меняется, что может сказываться на их свойствах. Так, изменение рН микроокружения может приводить к изменению фотодинамической активности фотосенсибилизаторов. Приведен обзор работ, относящихся к применению методов флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния в исследованиях объектов, важных для биологии и медицины. Обсуждается возможность применения спектроскопии комбинационного рассеяния для изучения такого объекта как живая клетка. Данный метод в ряде случаев обладает существенными преимуществами перед традиционными методами. Спектроскопия комбинационного рассеяшм в последние годы активно применяется в медицинских исследованиях. Кроме того, дан обзор работ, посвященных применению конфокальной микроскопии для исследования объектов как живой, так и неживой природы. Конфокальные микроскопы сравнительно недавно стали использовать в научных экспериментах, но на сегодняшний день можно с уверенностью говорить, что они стали одним из необходимых инструментов при проведении исследований в таких областях как биофизика и биомедицина.

Во второй главе рассмотрены основы теории построения изображений в конфокальном микроскопе. Данному вопросу посвящено множество работ, но к сожалению воспользоваться их результатами в силу ряда причин непросто. Ряд работ посвящен общей теории, которая не имеет аналитических решений. Получешпле интегралы анализируются численными методами. В этих расчетах обычно используется точечный источник возбуждения, что не соответствует реально используемым источникам. Другие авторы рассматривают конкретные схемы конфокальных микроскопов и применение их результатов к альтернативным схемам невозможно. Поэтому был сделан теоретический расчет используемой схемы конфокального микроскопа и проведены численные оценки его пространствешюго разрешения. Расчет основывался на скалярной теории дифракции, в основе которой лежит интеграл Кирхгофа. Конечные интегралы не имеют аналитического решения, как уже отмечалось выше, поэтому применялся численный расчет. В результате этих вычислений проведена оптимизация параметров оптической схемы конфокального микроскопа и оценено аксиальное разрешение. Проведенные эксперименты по измерению аксиального разрешения согласуются с полученными теоретическими оценками. При использовании объектива с числовой апертурой 1.3 и конфокальной диафрагмы диаметром 100 мкм аксиальное разрешение составляет 2.8 мкм.

Далее приведено подробное описание многофункционального лазерного комплекса.

В качестве источника возбуждающего излучения был выбран лазер на красителе. Для накачки использовался аргоновый лазер. В зависимости от метода исследования менялись режимы работы лазера на красителе и аргонового лазера. Для флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением необходимо использовать для возбуждения пикосекундные световые импульсы, поэтому лазер на красителе работал в режиме синхронной накачки с использованием оптоакустической разгрузки резонатора; лазер накачки - в режиме активной синхронизации мод. Для спектроскопии комбинационного рассеяния необходимо использовать для возбуждения излучение с узким спектром, поэтому лазер на красителе в этом случае работал в непрерывном режиме с использованием внутрирезонаторного узкополосного фильтра, аргоновый лазер - также в непрерывном режиме. Кроме того, для различных методов исследования использовались различные системы регистрации. Общая схема многофункционального лазерного комплекса приведена на рис.1.

Использовался аргоновый лазер Coherent Innova-90. Лазер на красителе собран по классической трехзеркальной схеме Когельника-Ли. Выходное зеркало при работе в режиме генерации пикосекундных импульсов заменялось на устройство оптоакустической разгрузки резонатора. Преимуществом применения устройства разгрузки резонатора является снижение частоты повторения импульсов, так как система счета фотонов не позволяет работать с частотой 78 МГц

В режиме непрерывной генерации устройство оптоакустической разгрузки резонатора было заменено на плоское зеркало. Для селекции длины волны генерации использовался фильтр Лио. В режиме непрерывной генерации использовался двойной фильтр Лио, в режиме синхронной накачки - одинарный. В качестве красителя были выбраны родамин 6Ж, для наилучшего возбуждения флуоресценции фталоцианинов алюминия и краситель DCM, для оптимального возбуждения при исследовании фталоцианинов кобальта. Выходное излучение лазера на красителе в режиме синхронной накачки представляло собой непрерывную последовательность пикосекундных импульсов длительностью 5 пс и частотой повторения 380 кГц. Спектральная ширина линии генерации лазера в режиме непрерывной генерации составляла 2 см"'. Выходная мощность лазера на красителе в режиме непрерывной генерации в максимуме полосы генерации составляла 80 мВт.

Для устранения излучения вынужденной флуоресценции красителя был использован спектральный фильтр, на основе дифракциошюй решетки. Данный фильтр использовался только при проведении экспериментов по измерению спектров КР.

Излучение лазеров направлялось либо в кюветнос отделение, либо в микроскоп. В случае измерений спектрально-кинетических параметров растворов излучение лазеров направлялось в кюветнос отделение. Линза Л1 (см. рис.1.) фокусирует излучение лазера на кювету, сигнал флуоресценции собирается линзой Л2, которая направляет параллельный пучок на линзу ЛЗ. Линза ЛЗ фокусирует излучение на входную щель

монохроматора. Мевду линзами Л2 и ЛЗ помещались поляризационный а1илизатор и фильтр из цветного стекла, для уменьшения паразитной засветки возбуждающего излучения. Анализатор был необходим для исключения влияния использования линейно поляризованного возбуждения. Анализатор был выставлен под "магическим" углом для получения полной интенсивности флуоресценции. Кроме того, использование анализатора в канале регистрации и двойного ромба Френеля в канале возбуждения (для поворота плоскости поляризации возбуждающего излучения) позволяет измерять кинетику затухания анизотропии флуоресценции. Для спектрального выделения флуоресценции использовался монохроматор МДР-12 с решеткой 1200 штр/мм, обратная дисперсия - 2.5 нм/мм. Сигнал флуоресценции регистрировался ФЭУ-165 на микроканальных пластинах, работающим в режиме счета фотонов.

В качестве метода регистрации использовался счет фотонов с временным разрешением. Данная система обеспечивала высокую чувствительность н большой динамический диапазон порядка 10\

При необходимости использования высокого пространствешюго разрешения (в случае работы с клетками) возбуждающее излучение направлялось в микроскоп. Был использован стандартный микроскоп "Гармоника-41 Г' (ЛОМО, г. Санкт-Петербург). При измерении сигнала флуоресценции возбуждающее излучение направлялось на объект при помощи селективного зеркала, коэффициент отражения на длине волны 590 - 90 %, коэффициент пропускания на длине волны 680 нм - 80 %. При измерении спектров КР в качестве дихроичного зеркала использовалась кварцевая пластинка для уменьшения спектральной зависимости данного оптического элемента. Для горизонтально поляризованного излучения коэффициент отражения составлял около 10 %. Так как в качестве объектов исследования предполагалось использовать биологические объекты, в частности живые клетки, то такие "потери" даже полезны. В этом случае уменьшается вероятность разрушения объекта. Кроме того, использование в качестве дихроичного зеркала — кварцевой пластинки позволяет уменьшить потери в канале регистрации, что значительно существеннее при исследовании биообъектов.

Далее излучение фокусировалось па объект объективом микроскопа. Для совмещения плоскости изображения объектива с фокальной плоскостью лазерного пятна на пути возбуждающего излучения помещалась линза. Флуоресценция или рассеянное излучение собиралась тем же объективом и направлялись на систему регистрации. Для спектральной фильтрации в случае флуоресцентных измерений использовался встросгтый в микроскоп монохроматор с решеткой 1800 штр/мм, обратная дисперсия 10 нм/мм . Сигнал флуоресценции регистрировался ФЭУ-165 на микроканхтьных пластинах, работающим в режиме счета фотонов. Для дополнительного подавления возбуждающего излучения использовался также фильтры из цветного стекла.

При измерении спектров КР сигнал рассеяния направлялся на систему регистрации. При использовании конфокального микроскопа в плоскость изображения помещалась конфокальная диафрагма. Для согласования системы регистрации с микроскопом

использовалась система из двух линз, которая передавала изображение из плоскости изображения микроскопа в плоскость входной щели моиохроматора.

В качестве спектрально-селсктирующего элемента системы регистрации был использован двойной монохроматор ДФС-52 (Санкт-Петербург, JIOMO). В монохроматорс использовались две решетки 1200 штр/мм. Величина обратной дисперсии в данной системе - 15 см"'/мм. Сигнал рассеяния регистрировался ФЭУ — 79, работающим в режиме счета одиночных фотонов. Количество импульсов анализировалось счетчиком (модуль в стандарте КАМАК). Считывание счетчика осуществлялось каждую секунду для уменьшения вероятности переполнения. Сбор данных и управление монохроматором осуществлялось IBM PC XT через КАМАК. Управление шаговым двигателем для поворота решеток моиохроматора осуществлялось с помощью блока управления шаговым двигателем через выходной регистр КАМАКа. Для уменьшения ошибки сканирования был использован предусмотрешшй конструкцией моиохроматора репер. Герконовый выключатель замыкался при полном обороте шагового двигателя, что соответствует изменению частоты на 3 см"1. При использовании опорного канала сигнал с фотодиода обрабатывался АЦП (модуль КАМАК) и записывался в память компьютера. Программа управления и сбора данных позволяла смещаться по спектру на заданный интервал, измерять спектры с заданным шагом сканирования, с заданным временем накопления в одной точке и в заданном шпервале. После измерения программа записывала полученные дашше в файл.

Для обработки измеренных спектров комбинационного рассеяния применялась программа RAMP АС [11]. Результатом, аппроксимации спектров являются частоты, ширины и амплитуды линий КР.

Третья глава посвящена флуоресцентной спектроскопии. Обсуждается поляризационный вариант флуоресцентной спектроскопии, его возможности и трудности при использовании микроскопов. Анализ кинетики затухания анизотропии флуоресценции дает возможность получения информации о форме и размерах молекул флуорофоров, а также о характеристиках микроокружения. На примере исследования гематопорфирипа показано возможность изучения процессов агрегации гематопорфирина при проникновении в клетку. Далее приводится описание системы счета фотонов с временным разрешением, а также методика обработки экспериментальных данных. Кинетики затухания флуоресценции анализировались с помощью программы, использующей квазинепрерывное распределение экспоненциальных компонент.

Далее приводятся результаты экспериментов по изучению влияния микроокружения на кинетические характеристики молекул четырежды сульфировашюго фталоцианина алюминия в модельных системах и в живой клетке.

Нами были измерены времена жизни флуоресценции растворов четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в универсальном буфере при различных значениях рН раствора. Первоначально, при измерении в стандартной схеме, когда сигнал флуоресценции собирался под углом 90е к возбуждающему излучению в 1 см кювете

были получены кривые зависимости времени жизни флуоресценции от рН для растворов с концентрацией 1(И и 10~3 М. Для растворов с концентрацией 1СГ3 М в силу наличия агрегации молекул были получены два времени жизни флуоресценции 5,5±0.2 и 0.3+0.2 не и не наблюдалось никакой зависимости от рН раствора.

Известно, что спектр флуоресценции смещается с изменением величины рН. Для уменьшения возможного влияния перепоглощения была изменена конфигурация эксперимента. Были уменьшена толщина кюветы и изменена геометрия сбора сигнала. Кювета помещалась под углом близким к 45° к возбуждению, тем самим уменьшался объем образца. При уменьшении толщины кюветы зависимость времени жизни флуоресценции от величины рН раствора заметно уменьшается. Данное явление можно объяснить уменьшением толщины слоя вещества, из которого собирается сигнал флуоресценции, а следовательно и уменьшение перепоглощешш в этом слое. Для измерений с использованием микроскопа можно сказать, что время жизни флуоресценции не зависит от рН.

Были измерены времена жизни флуоресценции в живых клетках. Для этих экспериментов использовались клетки СПЭВ (почки эмбриона свиньи) адгезированные на стекле на третий день после пересева. Клетки представляли собой монослой. Клетки инкубировались в клеточной среде с фталоциашшом, при концентрации фталоцианина 10"4 М при температуре 37° С. Время инкубации составляло от 4 до 10 часов. После чего клетки дважды отмывались в клеточной среде без фталоцианина и помещались под микроскоп. Так как для данных фталоцианинов известна их локализация в клетке, визуально настраивались на нужные клеточные органеллы (лизосомы) и производились измерения. Были измерены времена жизни флуоресценции в 50 различных клетках в разные дни для увеличения статистики данных.

После обработки экспериментальных кинетик было получено, что время жизни фталоцианина в клетках составляет 5.2+0.15 не, что отличается от величины полученной для растворов.

Были измерены также кинетики затухания флуоресценции растворов фталоцианинов в присутствии белка альбумина. Выбор альбумина объясняется тем, что данный белок присутствует в крови человека и может участвовать в транспорте фталоцианина к опухолевым тканям. Время жизни флуоресценции в данных растворах составляет 4.8±0.15 не, что также отличается от клеток.

Полученные изменения интерпретируются нами, как адсорбция молекул фталецианина на поверхность мембран или связыванием молекул фталоцианина с макромолекулами и клеточными структурами.

Четвертая глава посвящена спектроскопии комбинационного рассеяния нефлуорссцирующих фталоцианинов (Фц) в клетках и модельных системах.

Были измерены спектры поглощения водных растворов Фц в зависимости от рН раствора, концентрации и температуры раствора. В диапазоне концентраций от 10"1 М до 10~7 М не наблюдалось каких-либо изменений в спектре поглощения. В диапазоне

температур от +10° С до +50° С также не наблюдалось изменений в спектре поглощения. На основании полученных результатов можно говорить, что данные Фц не имеют тенденцию к агрегированию в водных растворах. В зависимости от рН меняются соотношения интенсивностей (2 - полос.

Для усиления сигнала рассеяния при измерениях спектров КР использовалось резонансное возбуждение. При резонансном возбуждении минимальная концентрация раствора для которой можно измерить спектр КР была 10"5 М.

Резонансные спектры КР для растворов Фц состоят из большого набора линий в диапазоне волновых чисел от 600 до 1600 см"1, кроме этого присутствуют слабые линии в диапазоне от 0 до 400 см"1. Для всех трех Фц кобальта спектры КР имеют примерно одинаковую структуру. Различия состоят в точном положении отдельных линий и их относительной интенсивности. Интересно отметить, что линии КР, отвечающие колебаниям атомов аксиальных групп слабо выражены в спектрах.

Исходя из литературных данных и данных, полученных после обработки спектров, можно сделать приписку отдельных линий КР или групп линий к тем или иным колебаниям атомов в молекуле. В отличие от хорошо изученных молекул порфиринов, данных о расчете и приписке основных линий КР Фц немного.

Все колебания Фц можно поделить на несколько групп: колебания Ы-Со (Ы-Ме), колебания индольных и пиррольных колец, колебания внутреннего 16-членного кольца, С-Н колебания.

Колебания N-00 (Ы-Ме, в общем случае) лежат в области частот до 500 см"1. В спектрах проявляются довольно слабо.

Самая интенсивная линия в спектре КР расположена в районе 1530-1550 см"1, относится к колебаниям С=С, кроме этого присутствует небольшой вклад в эту линию колебаний С-К В работах отмечается сдвиг этой линии в зависимости от центрального атома металла. Линии КР в районе 1310-1350 см"1 соответствуют Са-Ср колебаниям пирролыюго и индольного колец, также как и линии в районе 1146 см"1. Линии на 754 см"1 отвечают деформационные колебания пирролыюго кольца. Линии в районе 640-670 см"' относятся к колебаниям внутреннего 16-членного кольца. Линии в районе 1260-1270 см"1 отвечают С-Н колебания индольного кольца, также как и линии в районе 1105-1115 см"1. Как отмечается в литературе линии в районе 700 см"1 относятся к неплоским колебаниям внутреннего кольца. Остальные линии можно отнести к слабым колебаниям С-С пиррольного и индольного колец и С-Н колебаниям.

Небольшие различия в спектрах КР для трех Фц кобальта с различными заместителями можно объяснить присутствием в спектре только тех линий, которые относятся к колебаниям кольца или отдельных групп в кольце, при этом наличие различных заместителей слабо изменяет межатомные расстояния и силы.

Измерение спектров КР растворов Фц при резонансном (647, 667, 660 нм) и нерезонансном (предрсзоаансном, 514, 488 нм) возбуждении показывает что при резонансном возбуждении происходит усиление нескольких линий КР. Так резонансно

усиливаются линии на 754 см"1 и в районе 1200 см"1.

Были измерены спектры КР растворов Фц для различных рН. Сравните этих спектров показывает, что не наблюдается сдвигов каких-либо линий, за исключением [шнии в районе 1540 см"1, для двух груш линий КР меняются относительные интенсивности внутри групп. Для дважды сульфированного Фц в спектре КР В районе 1190-1215 см"1 присутствуют три линии у которых меняется интенсивность, кроме того цве линии в районе 1350 см'1 также имеют изменение в относительной шгтенсивности. Для октакарбокси Фц такие же изменения найдены для линий в районе 1200 см"1 и 1320 см"1. Все эти линии относятся к колебаниям C-N, С-С индольных и пиррольных колец.

Были измерены спектры КР для растворов Фц в клеточной среде и растворах различных компонент этой среды. Не наблюдалось каких-либо изменений в спектре КР.

Для экспериментов по измерению КР спектров Фц в клетке были использованы клетки линий К562 и HeLa. Процедура приготовления образцов описана выше.

При измерении спектров РКР в клетках мощность лазерного пучка составляла 5-10 мВт. Можно оценить локальный нагрев, который производился лазерным пучком. Так как клетка практически не поглошает излучение на длине волны лазера (660 нм), поглощение излучения будет обусловлено только присутствием молекул Фц. Как будет показано Фц локализуется в клетке в небольших структурах диаметром 2-3 мкм. Оценим поглощенную энергию по формуле Ламберта - Буггера - Бэра:

/ = /0 • 10"°, D = ted, где D - оптическая плотность, е - коэффициент экстшпош, d- толщина, с - концентрация.

Возьмем внутриклеточную концентрацию равную 5-10"5 М, по нашим оценкам это максимальная внутриклеточная концентрация. Подставляя значения е = 105 М"1 см"1, с ^ 5-Ю"5 М, d = 2 мкм получим коэффициент ослабления в клетке 10' =10" . Таким образом, в клетке поглощается 0.1 % от падающей энергии.

Процесс распространения тепла может быть описан с помощью уравнения теплопроводности Фурье:

jyt

Q = К • 2к ■ г ■ Ах • —, dr

где К - коэффициент теплопроводности (для воды К=1.54-101 кал-с-см"'-К"'), Лх -dT

толщина образца,--градиент температуры.

dr

Используя данные формулы можно получить оценку для повышения температуры вблизи фокуса. Для приведенных выше параметров лазерного излучения и поглощения образца изменение температуры в перетяжке лазерного пятна равно Д7-+ 0.7 К.

Из приведенных выше расчетов можно видеть, что при измерении РКР спектров производимый локальный нагрев не значителен, хотя возможно, что имеет место большой градиент температуры, что может вызывать дополнительные перемещения органелл внутри клетки.

Главной проблемой при измерении спектров РКР в клетке было определение мест локализации Фц внутри клетки по изображению клетки в белом свете. Предполагается, что данные Фц локализуются в структурах эндоцитозного пути проникновения, таких как лизосомы, эндосомы, возможно аппарат Гольджи, а данные структуры имеют довольно малые размеры и трудно различимы. По соотношению интенсивности лшшй КР из клетки и раствора можно оценить внутриклеточную концентрацию Фц как 10'5 М, но данные оценки являются достаточно грубыми ввиду невозможности точной настройки пятна фокусировки лазера на область, в которой локализуется Фц.

На рис.2, приведены разностные спектры (по отношению к растворам), полученные из клеток, окрашенных октакарбокси Фц (кривая А) и дисульфо Фц (кривая Б).

Для дважды сульфированного Фц в клетках было найдены следующие различия в спектре РКР по сравнению со спектром полученным из раствора: уменьшение интенсивности линии КР на 1412 см"1 и 1262 см"1, увеличение шггепсивности линии на 1137 см"1. Можно отметить также, небольшие изменения в положении некоторых линий, но они не существенны и не выходят за рамки ошибки эксперимента.

Для октакарбокси Фц изменения в спеетре более выражены. В спектре РКР пропадает линия на 1393 см"1, смещается на 15 см"1 линия 1320 см"1 смещается на 10 см"1 линия 1461 см"1. Данные изменения нельзя отнести к влиянию изменения кислотности микроокружения.

Далее описаны эксперименты по определению локализации фталоцианинов кобальта в живой клетке методом построения "КР-изображений".

В этих экспериментах были использованы суспензии растущих клеток линии К562 (эритробласты, выделенные у пациентов с хронической лейкемией).

Для определения внутриклеточной локализации фталоцианинов были использованы флуоресцентные красители - метки: акридиновый оранжевый (АО) и ФИТЦ - декстран (ФД). Краситель АО накапливается в клеточных структурах, имеющих низкие рН (например, лизосомы), ФД проникает в клетку путем эндоцитоза и поэтому, накапливается во всех структурах эндоцитозного пути (лизосомы, эндосомы). При провсдспии экспериментов по солокализации с АО клетки предварительно инкубировались в растворе Фц, затем отмывались, после этого помещались в раствор АО с концентрацией 2 мг/мл на 10 минут. После инкубации в растворе АО клетки отмывались клеточпой средой и помещались в камеру. Для ФД процедура приготовления образцов отличалась от приведенной выше. Клетки инкубировались в растворе ФД и Фц одновременно, причем концентрация Фц была 10*4 М, а ФД - 5 мг/мл. После этого клетки отмывались дважды и помещались в камеру.

Микроскоп комбинационного рассеяния прямого зрения описан в рабоге [12]. КР-изображения клеток были записаны для отстройки 1549 см"1, что соответствует наиболее интенсивной колебательной полосе. Фон был записан для отстройки 1500 см"1. Длина волны возбуждения 660 нм соответствует регистрации КР-изображения для отстройки 1549 см"1, 662 нм - 1500 см"1. Для определения внутриклеточной концентрации

фталоцианина были измерены КР - изображения раствора фталоцианина с концентрацией 10"4 М при тех же условиях эксперимента. По нашим оценкам величина внутриклеточной концентрации фталоцианина составляет 10~5 - 5-10"5М. Данные оценки являются довольно грубыми, так как объем вещества от которого получается сигнал в клетке не равен объему вещества в растворе. В клетках этот объем равен объему органеллы, в которой находится Фц. Данные структуры имеют диаметр 2-3 мкм. В растворе объем можно ограничить размерами перетяжки лазерного пучка (Ля=1.8 мкм), при этом вклад остального раствори оценить трудно. В этом заключена основная ошибка в оценке внутриклеточной концентрации Фц. Кроме того, структуры на изображениях могут быть не точно в фокусе, а следовательно сигнал от них будет меньший, чем должен быть, а при измерении растворов перетяжка всегда находится в фокусе. Это дополнительный источник ошибки, хотя и не самый важный.

При сравнении КР-изображения клеток, инкубированных в растворах фталоцианинов с различными периферийными группами установлено, что для всех фталоцианинов кобальта распределение красителя внутри клетки одинаково. На изображениях это маленькие светлые пятна внутри клетки. Размер пятен порядка 2-3 мкм.

Известно, что фталоцианины с различной степенью гидрофобности проникают в клетку и накапливаются различным образом. Более гидрофильные молекулы проникают в клетку главным образом путем эндоцитоза, а более гидрофобные молекулы - путем свободной диффузии через мембрану. Так, первые накапливаются в лизосомах, а вторые - в мембранах и 'цитоплазме. Среди изучаемых все фталоцианины хорошо растворяются в воде и являются гидрофильными. Поэтому, яркие пятна на КР-изображениях скорее всего соответствуют лизосомам.

Для того, чтобы объяснить наличие фона ("облака" на КР- изображении) были измерены КР- изображения клетки, соответствующие разным аксиальным положениям объекта. Эти данные представлены на рис.3. На рис.3, видно, что положение светлых пятен на различных изображениях различна. Это говорит о том, что органеллы, в которых находится Фц, распределены по объему клетки и на КР-изображении всегда присутствует вклад от органелл расположенных в фокусе (светлые маленькие пятна) и вклад от органелл вне фокуса (светлое "облако").

Для определение этих органелл были проведены исследования по солокализации, для этого были измерены КР - изображения и флуоресцентное изображение одной и той же клетки на одной и той же установке. Как флуоресцентное, так и КР-изображения состоит из маленьких светлых пятен и "облака" вокруг них, но положение этих пятен совпадают только частично. Частичная «¡локализация может быть объяснена не "идеальностью" оптической системы (хроматические аберрации), а также обесцвечиванием флуоресцентных красителей.

В заключении сформулированы основные результаты работы:

1. Создан многофункциональный лазерный комплекс, позволяющий проводить

исследования структуры и динамических свойств биомолскул методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния. Сочетание методов флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния при исследовании взаимодействия больших биологических молекул с одиночной живой клеткой позволяет получать дополнительную информацию о структурных изменениях этих молекул при проникновении и накоплении в клетке.

2. На основе теоретического расчета оптической схемы конфокального микроскопа получены оценки пространственного разрешения и проведена оптимизация параметров элементов оптической схемы. Полученные теоретические оценки соответствуют экспериментально измеренным величинам.

3. Измерены кинетики затухания интенсивности флуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в водных растворах, растворах с белком и в живых клетках. Установлено, что время жизни флуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в водном растворе не зависит от его кислотности. Время жизни флуоресценции находящегося в клетке фталоцианина отличается от времен жизни, измеренных в водном растворю и раствор» с альбумином, что может быть обусловлено спецификой михрюокружения этих молекул в клетке.

4. Показано, что применение поляризационного варианта флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением позволяет получать дополнительную информацию о структуре и подвижности молекул хромофоров. На основе экспериментальных данных получена оценка степени агрегации гематопор>фирина в водных растворах, липосомах и различных компонентах одиночной живой клетки.

5. Измерены спектры комбинационного рассеяния водных ршетворов фталоциашшов кобальта при использовании различных длин волн возбуждения и при различных ююлотностях растворов. На основании полученных и литературных данных проведена приписка линий комбинационного рэассеяния. Можно отметить, что спектры поглощения и спектры комбинационного рассеяния для данных фталоцпанинов зависят от кислотности раствора. Показано, что спектры КР измеренные из живой клетки отличаются от спектров из растворов, что может быть следствием изменения микроокружения молекулы фталоцианина в клетке.

6. Показано, что возможно применение метода построения "КР-изобр>ажений" для изучения распределения молекул с низким квантовым выходом флуоресценции в живой клетке. Измерение "КР-изображений" при различных положениях объекта на оптической оси микрюскопа показало, что молекулы фталоцианина кобальта накапливаются в клетке в небольших структурах, которые распределены по всему объему. Использование метода солокализации изучаемой молекулы с известными флуоресцентными молекулами-зондами дало возможность определить клеточные органеллы, в которых локализуются фталоцианины кобальта. Фталоцианины кобальта локализуются в клетке главным образом в структурах эндоцитозного пути, таких как эндосомы, лизосомы и т.д.