Лигандообменное сорбционное концентрирование на сверхсшитых полистиролах при ВЭЖХ определении антибиотиков, аминокислот и витаминов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

РУДЕНКО АНДРЕЙ ОЛЕГОВИЧ

Лигандообмевное сорбционное концентрирование на сверхсшитых полистирола* при ВЭЖХ определении антибиотиков, аминокислот и витаминов

Специальность 02.00.02-аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

4856890

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 3 ОКТ 2011

Санкт-Петербург 2011

4856890

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Карпова Людмила Алексеевна

Доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович (НТЦ "Хроматография" НПО Химавтоматика)

Ведущая организация:

Доктор химических наук, профессор Калинкин Игорь Петрович (Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)

Российская Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова

Защита состоится 20 октября 2011 г.

на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 то защите докторский и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан сентября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

/В. В. Панчук/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность. Основные проблемы при анализе объектов с» сложной матрицей заключаются в низком содержаниии определяемых соединений и значительном количестве сопутствующих компонентов.

В диссертационном исследовании предпринята попытка разработки стратегии подготовки проб природного происхождения (комбикормов, премиксов комбикормов, биологических жидкостей, мяса птицы), обеспечивающей максимально полное извлечение целевых аналитов и эффективную очистку экстрактов с применением стадии ТФЭ, реализованной на сверхсшитых полистиролах и использованием принципов комплексообразования, включая лигандообменное сорбционное концентрирование, при определении различных групп важнейших биологически-активных соединений (водо- и жирорастворимых витаминов, антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина, а-аминокислот, алкалоида эрготамина) методом обращённо-фазовой ВЭЖХ^с УФ-, флуоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием. Разработка процедуры подготовки проб таких объектов и создание на их основе унифицированных методик хроматографического анализа, является актуальной задачей и имеет важное практическое значение при определении качества пищевой продукции и для клинической диагностики ряда заболеваний.

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-03-00902-а и федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Цель работы. Выбор стратегии подготовки проб сложных матриц {комбикормов, премиксов, БАД, биожидкостей, мяса) для хроматографического определения витаминов, антибиотиков, аминокислот и алкалоида эрготамина в условиях ТФЭ с применением сверхсшитых полистролов и использованием принципов лигандного обмена.

В связи с поставленной целью решались задачи:

1. Выявить стабильность аскорбиновой кислоты, рибофлавина и алкалоида эрготамина в условиях анализа в зависимости от рН и температуры.

2. Изучить возможности использования лигандообменного сорбционного концентрирования на сверхсшитых полистиролах при подготовке проб к хроматографическому определению аминокислот, антибиотиков, витаминов.

3. Получить сравнительные оценочные характеристики количественного определения аналитов на примерах модельных систем витаминов, антибиотиков и аминокислот с

использованием традиционных вариантов жидкостной и твердофазной экстракции (ТФЭ) и процессов комплексообразования, включая лигандный обмен.

4. Изучить возможности одновременного хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов, а также витаминов и антибиотиков.

5. Предложить общие схемы подготовки проб к анализу реальных объектов (комбикормов, БАД, пермиксов, биологических жидкостей, мяса.) при ВЭЖХ определении витаминов, аминокислот, антибиотиков тетрациклинового ряда.

6. Выявить возможности использования лигандообменного сорбционного концентрировния на сверхсшитых полистролах при определении алкалоида эрготамина методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием и получить сравнительные оценочные характеристики альтернативного пути с использованием метода масс-спектрометрии.

Научная новизна

Выявлены возможности использования лигандообменного сорбционного концентрирования на сверхсшитом сульфированном полистироле MN 502 на стадии подготовки проб со сложной матрицей (комбикорма, мясо, биожидкости) при определении антибиотиков, аминокислот, витаминов и алкалоида эрготамина, позволяющего провести эффективную очистку экстрактов реальных объектов и снизить пределы обнаружения аналитов в 2 - 3 раза по сравнению с традиционными вариантами подготовки проб.

Предложен способ определения эрготамина (ПО 50 нг/мл) в крови методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием с использованием лигандообменного сорбционного концентрирования (ионы Cu(II) — в качестве металла-комплексообразователя, элюент -10 %-ый водный раствор аммиака, сорбент - сульфированный сверхсшитый полистирол MN 502) на стадии подготовки проб, который может найти применение в области токсикологии при диагностировании отравлений алкалоидами спорыньи.

Разработан способ одновременного определения витаминов (водо- и жирорастворимых) и антибиотиков в комбикормах с применением сверхсшитого полистирола PuroSep 200 для очистки и коцентрирования компонентов проб. Пределы обнаружения по водорастворимым витаминам составили 10-2 нг/мл, антибиотикам 5,0 -0,7 нг/мл, жирорастворимым витаминам — 120 нг/ мл.

Практическая значимость работы

Предложен способ подготовки проб со сложной матрицей при определении витаминов, антибиотиков, аминокислот и алкалоида эрготамина, включающий ТФЭ на

сверхсшитых полистролах с применением принципа лигандного обмена и обеспечивающий более селективную очистку экстрактов реальных объектов по сравнению с традиционными вариантами.

Разработана унифицированная методика одновременного определения витаминов и антибиотиков методом ОФ ВЭЖХ с последовательным УФ- и масс-спекгрометрическим детектированием с использованием сверхсшитого полистирола Рига8ер 200 для очистки и концентрирования экстрактов. Достигнуты пределы обнаружения по водорастворимым витаминам 10-2 нг/мл, антибиотикам 5,0 - 0,7 нг/мл, по жирорастворимым витаминам 120 нг/ мл.

Предложен способ определения эрготамина (ПО 50 нг/мл) в крови методом ОФ ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием и лигандообменным сорбционным концентрированием на стадии подготовки проб.

По результатам работы ВНИИМ им. Менделеева аттестован ряд методик, используемых для контроля качества выпускаемой комбикормовой продукции.

Положения, выносимые на защиту

1. Обоснование целесообразности применения принципа лигандного обмена при подготовке проб со сложной матрицей с использованием сульфированного сверхсшитого полистирола (N£N-502) для хроматографического определения водорастворимых витаминов и антибиотиков терациклиновой группы и левомицетина.

2. Сопоставление результатов определения сс-аминокислот в комбикормах с использованием ФИТЦ-производных и при лигандообменном сорбционном концентрировании на сорбенте МЫ 502. Используемые подходы можно рассматривать референтными по отношению друг к другу.

3. Оптимизированный регламент подготовки проб комбикорма с использованием сверхсшитого полистирола Риппер 200 при совместном определении витаминов и антибиотиков, включающий очистку и концентрирование параллельно на двух колонках с коэффициентами извлечения аналитов 0,81 - 0,99.

4. Определение алкалоида эрготамина в крови методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием с использованием принципа лигандного обмена на стадии подготовки проб, позволяющем достичь пределов обнаружения ~ 50 нг/мл и с масс-спектрометрическим детектированием в качестве референтного, позволяющим снизить ПО эрготамина до 0,5 нг/мл.

Публикации и апробация работы

Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 5 тезисах. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (2008, Москва-Клязьма); Международной конференции по химии «Основные тенденции в развитии химии» (2009, СПб); 10th European Meeting on Environmental Chemistry (2009, France, Limoges); Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (2009, Самара); IV Международной конференции «ЭОС-2010» (2010, Воронеж); Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010, Краснодар); V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (2011, СПб).

По материалам работы аттестовано 2 методики.

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, двух глав с обсуждением полученных результатов, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (143 наименования). Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 70 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования. Отмечена перспективность использования метода сорбционного концентрирования в качестве стадии подготовки проб сложных матриц (комбикорма, премиксы комбикормов, Б АД, биожидкости, мясо) при анализе биологически-активных соединений - витаминов, аминокислот, антибиотиков и алкалоида эрготамина.

1-я глава (Обзор литературных данных) состоит из нескольких разделов, в которых обсуждаются свойства и применение сверхсшитых полистролов в хроматографии, принципы лигандного обмена, общие сведения о свойствах изучаемых аналитах (витаминах, аминокислотах, антибиотиках и эрготамине), методах их определения и способах пробоподготовки природных объектов.

Во 2-ой главе описываются методы исследования и варианты подготовки проб реальных объектов.

В 3-й главе (Обсуждение результатов) предметом обсуждения является поиск условий разделения аналитов и пробоподготовки объектов к анализу при определении водо- и жирорастворимых витаминов (В1, В2, В6, ВЗ, С, A, D2, D3, Е), антибиотиков

тетрациклиновой группы (iтетрациклин, оксшпетрациклин, метациклин, доксициклин) и левомицетина, а-аминокислот (асп, асн, глу, глн, г-про, сер, гли, гис, арг, тре, ала, про, тир, вал, лиз, иле, лей, фен, мет, цис, цис-цис) на модельных системах и применение выявленных закономерностей при анализе объектов со сложной матрицей: комбикорма, биожидкости (кровь, экстракты предстательной и поджелудочной желёз), биодобавки, премиксы и мясо.

Пробоподготовка таких объектов к анализу, как правило, включает выбор способа извлечения аналитов (жидкостная экстракция, щелочной или кислотный гидролиз), очистку и концентрирование полученных экстрактов.

В молекулах аминокислот, витаминов, антибиотиков имеются ионогенные функциональные группы, способные обеспечить использование процессов комплексообразования, включая лигандный обмен, на стадии подготовки проб. На модельных системах выявлены возможности такого подхода в условиях сорбционного концентрирования и проведено сопоставление с традиционными вариантами подготовки проб.

При определении водорастворимых витаминов группы В и витамина С на модельных смесях выявлены возможности различных различных сорбционных материалов (активированный уголь, сорбент XAD2 и обращённо-фазовый сорбент Sep-Pak С18) для очистки экстрактов и сорбционного концентрирования. Лучшие результаты по коэффициентам извлечения получены на обращённо-фазовом сорбенте Sep-Pak С18 (Табл. 1) с последующим разделением аналитов в условиях ион-парной хроматографии с концентрацией гептансульфоната натрия — 13.5 мМ.

Таблица 1. Значения коэффициентов извлечения витаминов (элюент- метанол, сорбент-

Sep-Pak С18)

Аналит а

Никотиновая кислота 0.83 ±0,03

Никотинамид 0.89 ±0,03

Пиридоксин 0.79 ± 0,04

Тиамин 0.91 ±0,02

Рибофлавин 0.97 ±0,03

В специальной серии экспериментов выявлена стабильность рибофлавина и аскорбиновой кислоты - в водных растворах с различными значениями рН, что оказалось важным при отработке процедуры подготовки проб реальных образцов (Рис.1).

-рН =8,50 -рН = 5,55 -рН=Ц5 -рН=*55

Рве. 1. Зависимости концентрации аскорбиновой кислоты и рибофлавина (слева направо) от времени хранения градуировочнон смеси при различных значениях рН

Оптимальными для обоих витаминов являются среды со значением рН в интервале 2,5 -3,0.

При разделении жирорастворимых витаминов, в первую очередь, витамеров эргокальциферола и холекалыдаферола, обладающих близкими хроматографическими параметрами, потребовалось использование градиентного элюирования (система метанол-вода) в режиме программирования температуры (35 —► 55 °С). Для извлечения жирорастворимых витаминов из комбикормов применяли щелочной гидролиз спиртовым раствором КОН их сложных эфиров. Для предотвращения окисления образующихся витаминов в реакционную систему добавляли гидрохинон (100 мг).

При определенияи антибиотиков тетрациклинового ряда и левомецитина в процессе подготовки проб использовали сверхсшитый полистирол РигоЗер 200, обладающий большой внутренней удельной поверхностью и способный удерживать эти полярные ароматические соединения, что, в свою очередь, обеспечило эффективное концентрирование и очистку экстрактов реальных объектов. Из испытанных элюирующих систем предпочтение отдано диметилсульфоксиду (ДМСО) (табл. 2).

н3с снз НО СН3 у

но. н

Тетрациклин

Левомнцетин

Таблица 2. Знамения коэффициентов извлечения антибиотиков на сорбентах 8ер-Рак С18 и Риговер 200 при элювровании смесью метанол - хлористый метнлен (50 : 50, объёмн.) и

Этот сорбент был выбран и для выявления возможностей очистки и концентрирования экстрактов при совместном определении гидрофильных (никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, рибофлавин) и гидрофобных (ретинола ацетат, эргокальциферол, холекальциферол и токоферола ацетат) аналитов. Использование фракционного элюирования привело к высоким коэффициентам извлечения (табл. 3). Принципиальным условием явился выбор режима градиентного элюирования и скрости потока подвижной фазы. (Рис. 2). С подобной методологией мы обратились и к анализу реальных объектов.

Таблица. 3. Значения коэффициентов извлечения витаминов (сорбент: Риговер 200, элюент: 5 мл СН3ОН и 5 мл СН2С12), N = 5, Р = 0,95

Аналит а

Никотиновая кислота (ВЗ) 0,93 ± 0,04

Пиридоксин (В6) 0,91 ±0,03

Рибофлавин (В2) 0,96 ±0,01

Тиамин (В1) 0,99 ± 0,03

Ретинола ацетат (А) 0,81 ±0,04

Эргокальциферол (02) 0,98 ±0,03

Холекальциферол (03) 0,98 ±0,02

Токоферола ацетат (Е) 0,97 ± 0,02

Рис. 2. Хроматограмма стандартной смеси водо- и жирорастворимых витаминов

Shimadzu LC-20 Prominence. I: 280 (кривая I) и 260/265/328 (кривая 2) нм, колонка ZORBAX RX С18 250x4,6 5 мкм; элюент фосфорная кислота (рН=2,0) : метанол. V„„0M: до 16 мин - 1 мл/мин, после 16 мин - 1,5 мл/мин. 1-ВЗ (к-та), 2-В1, 3-В6, 4-В2, 5-А ацетат, 6-D2, 7-D3, 8-Е ацетат.

ДМСО (N = 5, Р = 0,95)

Аналнт PuroSep 200

Элюент: смесь СНзОН-СН2С12 (50 : 50, объёмн.) Элюент: ДМСО

Левомицетин 0,99 ± 0,01 0,99 ±0,01

Тетрациклин 0,96 ±0,01 0,97 ±0,02

Метациклин 0,42 ±0,02 0,93 ±0,03

Доксициклин Не элюируегся 0,90 ± 0,03

Окситетрациклин Не элюируегся 0,90 ±0,02

Отдельный блок экспериментов посвящен решению задачи совместного определения витаминов и антибиотиков в комбикормах с использованием установленных закономерностей.

Независимо для надёжной идентификации целевых компонентов в реальных объектах, проведена оптимизация условий масс-спектрометрического детектирования на квадрупольном масс-спектрометре в режиме электро-спрей. Ионизация жирорастворимых витаминов в режиме Е81-ионизации практически не происходит (Рис. 3), поэтому для их определения в реальных объектах оправдан режим УФ-детекгарования. Анализ проводили с использованием диодно-матричного и масс-спектрометрического детекторов, соединенных последовательно. В качестве элюента выбран метанол и 0,1 %-ый водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУК), что обусловлено спецификой МС-детекгарования.

276225 gSSSSr f;jjug 1?Г" 1 ..... г--------i " -j -4...........

176160 126100 75 6025- - - 3 - -1 ; - ---

II в 4 5 [К, J

- 4 Д— 0 Jt I. ™ »2 • 13

25 ' ' ÖD ' ' J£ ' ' 10» ' ' 11.5 ' ' lä Л ' ' 17й ' ' 20 D

Рис. 3. Масс-хроматограмма смеси витаминов и антибиотиков в режиме SIM.

Shimadzu LCMS-2010 EV, колонка Supelco Discovery С18.Условия: См. Рис. 16.

1 - ВЗ (к), 2-В6, 3 -левомицегин, 4-окситетрацикпин, 5-теграциклин, 6-В2,7-В1,8-метациклин, 9 - доксициклин, 10-А (ац.), 11- D2,12-D3, 13 -Е (ац.).

Процедура ТФЭ осуществлялась параллельно на двух колонках, заполненных сорбентом PuroSep 200: на первой - проводили сорбцию антибиотиков и водорастворимых витаминов, на второй - жирорастворимых витаминов. Полученные экстракты объединяли.

Водорастворимые витамины и антибиотики содержат в составе молекул ионогенные функциональные группы, способные к комплексообразованию (схема 1) с катионами металлов, что открывает перспективы использования такого подхода на стадии подготовки проб при определении этих аналитов.

[MeL.f' + aA2- [CuL,.aAa]n"a + aL1"

Схема 1. Принцип лигандного обмена Ме"+ - металл-комплексообразователь, L1— лиганд, Аа- - аналит

Для реализации принципа лигандного обмена при сорбционном концентрировании антибиотиков (тетрациклин, окситетрациклин, метациклин, доксициклии и левомш(етина) и водорастворимых витаминов (никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин) использован сульфирований сверхсшитый полистирол MN 502 (50 - 200 мкм), в качестве металла-комплексообразователя - ионы Си2+. Элюирование водорастворимых витаминов проводилось раствором муравьиной кислоты (рН 3.3); антибиотиков - 10 %-ым водным раствором аммиака. Значения коэффициентов извлечения аналитов приведены в табл. 4.

Для рибофлавина и аскорбиновой кислоты такой подход неприемлем: в присутствии ионов Cu(II) эти аналиты подвергаются окислительному разложению.

Таблица 4. Коэффициенты извлечения водорастворимых витаминов и антибиотиков иа сорбенте 502 в условиях лигандного обмена (Си2+~ металл-комплексообразователь)

(Л?=5, Р = 0.95)

Аналит Коэффициент извлечения Аналит Коэффициент извлечения

Левомицеггин 0.79 ±0.03 Метациклин 0.94 ±0.04

Тетрациклин 0.92 ±0.05 Никотиновая кислота 0.86 ±0,05

Окситетрациклин 0.96 ±0.04 Пиридоксин 0.85 ±0,03

Доксициклин 0.94 ±0.03 Тиамин 0.93 ± 0,03

Установлено, что сульфированный сверхсшитый полистирол MN 502 в условиях лигандного обмена обладает большей емкостью, чем PuroSep 200: точка «пробоя» для тетрациклинов на сорбенте PuroSep 200 наблюдалась при 7,0 - 7,5 мл пропускаемого раствора, а для ионогенного сорбента MN 502 - при 8,8 - 9,0 мл (Рис. 4).

Рис. 4. Кривые проскока антибиотиков на сорбентах: (а) - PuroSep 200, (б) - MN 502 в режиме лигандного обмена (металл-комплексообразователь - Cu(II))

Таким образом, использование принципа лигандного обмена в условиях ТФЭ при определении водорастворимых витаминов и антибиотиков в реальных объектах может способствовать более селективной очистке экстрактов.

Важной аналитической задачей является определение аминокислот в комбикормах, мясе и биожидкостях. Отсутствие хромофорных групп в большинстве молекул аминокислот требует стадии дериватизации. Производные, получаемые с использованием фенилизотиоцианата (ФИТЦ), обладают высокой стабильностью, и реакция проходит как с первичными, так и со вторичными амино-группами (Рис. 5).

Рис. 5. Схема получения ФИТЦ-производиых аминокислот

Селективному разделению производных аминокислот способствовало изменение рН подвижной фазы в процессе хроматографического анализа (уменьшение рН элюента от 5.5 до 4.1).

Независимо для этой цели выявлены возможности применения лигандообменного сорбционного концентрирования, что позволило исключить стадию дериватизации. Аминокислоты - типичные комплексообразующие соединения, часто используемые для оценки разделяющей способности лигандообменной хроматографической системы. В качестве металла-комплексообразователя использовали ионы Cu(II), в качестве сорбента — сульфированный сверхсшитый полистирол MN 502, возможности которого изучены нами при определении антибиотиков и водорастворимых витаминов. Образование соответствующих аналитических форм подтверждено спектрами поглощения.

Выбор рН элюента для ТФЭ в существенной степени определяется значениями изоэлектрических точек (р/) каждого аналита. На примере глицина (одна амино- и одна карбоксильная группы) и гистидина (две амино- и одна карбоксильная группы) установлено влияние рН элюента для ТФЭ на интенсивность поглощения аминокислот (Рис. 6.)

I ш «

3 loo 1 |0

ï «

S 10 11

Рис. б. Влияние рН элюента для ТФЭ на интенсивность сигналов глицина н гистидина.

Максимальная интенсивность аналитического сигнала

достигается при значениях рН, близких к значениям

рН

изоэлектрических точек (рI)

аминокислот. В качестве элюента при проведении лигандообменного сорбционного

концентрирования использовался аммонийно-ацетатного буфера (11 мМ; рН 6,5)

Хроматограмма модельной смеси аминокислот после проведения сорбционного

концентрирования приведена на Рис. 7, а значения коэффициентов извлечения аналитов

приведены в табл. 5.

Рис. 7. Хроматограмма модельной смеси аминокислот.

Прибор: Shimadzu LC-20 Prominence, Колонка: Supelco С18 250 х 4,6, 5 мкм; X: 230 нм. Элюент: ацетатный буфер (рН 5,5 —► 4,1) — CH3CN

1 - гли, 2 - гис, 3 - асп, 4 -асн, 5 - сер, 6 - фен, 7 - глу, 8 -глн, 9 - о-про, 10 - арг, 11 - тре, 12 - про, 13 - лиз, 14 - ала, 15 -тир, 16 — мет, 17 — иле, 18 — вал, 19 - цис+цис-цис, 20 - лей.

Таблица 5. Коэффициенты извлечения комплексов «аминокислота-Cu» (а) при элюировании с сорбента MN 502 11 ммоль аммонийно-ацетатным буфером (рН 6,5) в условиях лигаидного обмена (N = 5, Р = 0,95)

Аналит а Аналит а

асп 0,81 ±0,04 ала 0,92 ±0,03

асн 0,87 ±0,04 про 0,93 ±0,03

глу 0,85 ±0,03 мет 0,79 ±0,05

глн 0,76 ±0,04 тир+вал 0,77 ±0,05

о-про 0,79 ±0,02 иле + лей 0,78 ±0,03

сер 0,92 ±0,03 фен 0,94 ±0,04

гли 0,82 ±0,03 цис-цис 0,84 ±0,05

гис 0,90 ±0,04 лиз 0,89 ±0,03

арг 0,79± 0,02 тре 0,75 ±0,04

Полученные результаты позволяют заключить, что лигандообменное сорбционное концентрирование и дериватизация ФИТЦ могут быть референтными по отношению друг к другу при определении аминокислот.

В заключительной части работы обсуждается решение практических задач: определение обсуждаемых аналитов в комбикормах, премиксах, Б АД, биожидкостях (кровь, экстракты предстательной и поджелудочной желёз), мясе с использованием установленных закономерностей. Наиболее сложный объект анализа - комбикорм -содержит большое количество соединений, перегружающих хроматографический профиль. Подготовка проб комбикорма к индивидуальному определению водорастворимых витаминов включала жидкостную экстракцию 0,01 М раствором соляной кислоты, центрифугирование взвеси при 8000 об/мин в течение 3-х мин и очистку и концентрирование экстракта методом ТФЭ на обращённо-фазовом сорбенте Sep-Pak С18. Использование этого сорбционного материала позволило получить приемлемые результаты по очистке и достаточно низкие пределы обнаружения аналитов (1,0 - 0,5 мкг/мл). При определении водорастворимых витаминов в биологически-активных добавках и премиксах стадия ТФЭ не потребовалась.

Щелочной гидролиз сложноэфирных форм жирорастворимых витаминов, используемый на стадии подготовки проб реальных объектов, позволил получить высокие коэффициенты извлечения (табл. 6). Пределы обнаружения жирорастворимых витаминов составили 50 - 20 нг/мл.

Таблица 6. Значения коэффициентов извлечения витаминов (объект - комбикорм)

Экстракция изопропиловым спиртом Щелочной гидролиз

витамин а витамин а

А(ацетат) 0,45 ±0,04 А 0,89 ±0,04

D3 0,89 ±0,05 D3 0,91 ±0,05

Е(ацетат) 0,59 ±0,02 Е 0,95 ±0,03

Однако при совместном определении жиро- и водорастворимых витаминов использование щелочного гидролиза неприемлемо из-за нестабильности последних; пробоподготовка включала жидкостную экстракцию изопропиловым спиртом при нагревании в течение 10 мин, центрифугирование взвеси и очистку экстрактов методом ТФЭ на сверхсшитом полистироле РигоЭер 200. Пределы обнаружения водорастворимых витаминов в кормах в этих условиях удалось снизить до 0,2 мкг/мл.

При подготовке образцов комбикорма к совместному определению витаминов и антибиотиков применили двухстадийную жидкостную экстракцию: раствором соляной кислоты (рН 2,0) с добавкой (~ 10 %) изопропилового спирта для извлечения водорастворимых витаминов и антибиотиков и изопропиловым спиртом для -жирорастворимых витаминов. Процедура ТФЭ проводилась параллельно на двух колонках с последующим объединением экстрактов.

Использование масс-спектрометрического детектирования позволило обнаружить метациклин, который не удалось зарегистрировать при УФ-детектировании (Рис. 8), и снизить пределы обнаружения водорастворимых витаминов до 10 -2,0 нг/мл, а антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетана до 5.0 - 4,1 и 0,7 нг/мл соответственно. При этом вследствие низкой способности к ионизации в режиме ESI жирорастворимые витамины определяли с использованием УФ-детектирования (Рис. 9).

Рис. 8. Масс-хроматограмма экстракта комбикорма в режиме SIM.

Хромато-масс-спектрометр Shimadzu LCMS-2010 EV, колонка Supelco Discovery С18.

Условия: См. рис. 16. 1 - ВЗ (к), 2 - В6,3 - левомицетин, 4 - окситетрациклии, 5 — тетрациклин, 6-В2.7-В1,8-метациклин.

h3c'n-ch3

Метациклин

Рис. 9. Хроматограмма экстракта комбикорма с УФ-дегектнроваинем (а) - 260 (кривая 1) и 280 (кривая 2) нм в (б) - при 328 (кривая 1) и 350 (кривая 2) им.

Хромато-масс-спектрометр Shimadzu LCMS-2010 EV. Условия: См. Рис. 16.

(а) - 1 - никотиновая к-та, 2 - пиридоксин, 3 - левомицетин, 4 -рибофлавин, 5 - тиамин, 6 -холекальциферол, 7 - токоферола ацетат.

(б) - 1 -окситетрациклии, 2 - тетрациклин, 3 - А (ац).

Проведено определение антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетана в комбикормах и мясе. Независимо выявлены возможности и лигандообменного сорбционного концентрирования на катионообменнике MN 502. Для обоих случаев определены коэффициенты извлечения аналитов (табл. 7).

Таблица 7. Коэффициенты извлечения (а) антибиотиков на сорбентах PuroSep 200 н MN 502

Антибиотик Сорбент

PuroSep 200 MN502

Левомицетин 0.97 ±0.06 0.97 ±0.04

Тетрациклин 0.89 ±0.06 0.91 ±0.05

Окситетрациклин 0.87 ±0.07 0.93 ±0.05

Доксициклин 0.90 ±0.06 0.92 ±0.04

Метациклин 0.92 ±0.04 0.96 ±0.05

Лигандообменное сорбционное концентрирование не уступает сверхсшитому полистиролу РигоБер 200 по значениям коэффициентов извлечения аналитов и превосходит его по селективности очистки (Рис. 10).

29 &Q 7.S

' ido lis i4o li s 2dd ' ids

Рис. 10. Хроматограмма экстракта мяса после очистки и концентрирования на сорбенте (А) - PuroSep 200 и (Б) - MN 502.

Жидкостной хроматограф Shimadzu LC-20 Prominence; колонка SupelcoSil С18; элюент: раствор перхлората триэтиламмония (рН 2,2) и метанола (88 : 12, обьемн.), скорость потока элюента 0,5 мл/мин; температура колонки 35 °С;

X: 285 нм (кривая 1) и 350 нм (кривая 2).

1 - окситетрациклин, 2 — тетрациклин, 3 - левомицетин

Пределы обнаружения аналитов составили для антибиотиков тетрациклиновой группы 35-30 нг/мл, а для левомицетина - 45 нг/мл.

Аминокислоты в реальных объектах (кормах, мясе, биожидкостях) присутствуют как в свободной, так и связанной форме. Стадия гидролиза определяется типом аминокислоты: при определении триптофана используют щелочной гидролиз, для остальных -кислотный. Пределы обнаружения аминокислот при модификации ФИТЦ составили 0,8 -0,4 мкг/мл, а в условиях лигандообменного сорбционного концентрирования оказались немного ниже ~ 0,3 - 0,1 мкг/мл.

Задача определения алкалоида спорыньи — эрготамина - в объектах биологического и растительного происхождения важна в клиническом анализе и для контроля качества

пищевой продукции. В работе предложен способ определения эрготамина в образцах крови крыс с применением лигандообменного сорбционного концентрирования.

Основной проблемой при хроматографическом анализе эрготамина в плазме крови - является его низкое содержание (ПДК ~ 0,1 мг/л), сложный хроматографический профиль, нестабильность эрготамина в условиях анализа.

В специальной серии экспериментов по выявлению стабильности эрготамина в составе различных матриц (жидкой крови, сухой крови, хлороформе) установлено, что эрготамин сохраняется неизменным более длительное время в замороженной и сухой крови.(Рис. 11).

Рис. 11. Результаты оценки стабильности эрготамина в составе различных матриц в зависимости от времени и условий хранения раствора

Использовали флуориметрическое детектирование и проводили очистку и концентрирование на сульфированном сверхсшитом полистироле MN 502 в режиме лигандного обмена (элюирующая система 10 %-ый водный раствор аммиака; cu(ii)-в качестве металла-комплексообразователя) (Рис. 12).

Рис. 12. Хроматограмма пробы крови после ТФЭ в прнсутсивии ионов Cu(Il)

Хроматограф Shimadzu LC-20 Prominence, флуориметрический детектор.

Колонка: Phenomenex С) 8 250 х 4,6, 5 мкм. Условия: Элюент: фосфатный буфер (рН=2,5): ацегонитрил (95 : 5, об.), ФЛ: Х(экс.) 337 нм, Х(эм.) 421 нм. ПО 50 нг/мл.

Коэффициент извлечения эрготамина в условиях лигандообменного сорбционного концентрирования на сорбенте MN 502 в присутствии ионов Си2+ составил 0,99 ± 0,02.

В качестве референтного опробован масс-спектрометрический метод определения эрготамина в режиме ESI(+) при прямом вводе образца с времяпролётным масс-анализатором, что к тому же, позволило упразднить стадию сорбционного

концентрирования при очистке анализируемого образца. Эрготамин регистрировался в

виде однозарядного иона с m/z 582.29 Да (Рис. 13). Подготовка образцов крови к МС-

анализу включала высушивание крови при комнатной температуре на фильтровальной

бумаге и жидкостную экстракцию эрготамина.

-sä---- Ряс. 13. Масс-спектр

„ образца стандарта эрготамина

в концентрации 10"5 моль/л _ (ESI), режим Scan. Условия:

объём пробы 50 мкл; скорость

— потока составляла 4 мкл/мин,

"•»IчА разность потенциалов между

— „ I подающим капилляром и соплом: -¡- I ■■ 3200 В; напряжение на сопле:

— ж" 100 В; потенциал на стержнях

jI.T.il.l..ii lt. _ ХДУ -адРУП-КР:Ю00В.

ПО: 0.5 нг/мл (10'9 моль/л).

Испытаны различные экстрагирующие системы (Рис. 14).

Г "ft

nuffit_ , т 1\ / _ - \_/

Рнс. 14. Масс-спектры проб, полученных экстракцией яз образца сухой крови. Условия: См. Рис. 13. А. экстракция 0.1% р-ромТФУК в воде; Б. экстракция смесью 30% ацетонитрила и 70% р-ра ТФУК в воде (0.1%); В. экстракция смесью 60% ацетонитрила и 40% р-ра ТФУК в воде (0.1%).

При использовании системы ацетонитрил - 0,1-%-ый водный раствор ТФУК (60 : 40, обьёмн.) примеси с массой более 500 Да практически не экстрагируются, что принципиально при определении эрготамина, поскольку он регистрируется в виде иона с массой 582.29 Да.

Массовая доля эрготамина в крови крыс при определении методом ОФ ВЭЖХ с флуоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием составила 0,09 ± 0,01 мг/л и 0,11 ± 0,04 мг/л, соответственно. Применение метода тандемной масс-спектрометрии при определении эрготамина в образцах крови оказалось оправданным для качественного анализа. Однако, для количественного — предпочтительней использование метода ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием, обеспечивающим высокую воспроизводимость результатов.

1

тз 723 2_770,3_Ю90 »17.2

6ИО 713.2 7М0 в:м 1 »783,

J

S» Ь50

юод.мго 7t3« 768 2 830.1 >78»М ^ »50 700 750 tOO KO WO 950'

В табл. 8. представлены данные по пределам обнаружения аналитов, полученные в работе.

Таблица 8. Значения пределов обнаружения аналитов

Аналит Полученные результаты Аналит Полученные результаты

ПО ПО

УФ-, мкг/мл МС-, нг/мл УФ-, мкг/мл МС-, нг/мл

Водорастворимые витамины 1,0-0,5 10-2,0 Левомицетин 0,073 (Рипгёер 200) 0,7

0,045 (ЛО)

Жирорастворимые витамины 0,05-0,02 - Аминокислоты 0,8 - 0,4 (ФИТЦ)

о,з-о,1(ло)

Тетрациклины 0,050-0,053 (РигоБер 200) 5,0-4,1 Эрготамин 0,05 (ФЛ-детекгированис) 0,5

0,030-0,035 (ЛО)

Результаты находятся в хорошем соответствии с литературными данными, а в случаях лигавдообменного сорбционного концентрирования, в частности, при определении антибиотиков и эрготамина, превосходят их в 2 - 3 раза.

На Рис. 15 представлена общая схема анализа исследованных объектов со сложной

матрицей.

Рис. 15. Стратегия пробоподготовки и анализа сложных матриц

Выводы

1. Предложен способ очистки и концентрирования экстрактов реальных объектов при определении антибиотиков и водорастворимых витаминов с использованием принципа лигандного обмена на сверхсшитом сульфированном полистироле MN 502 с применением в качестве металла-юмплексообразователя ионов Cu(II).

2. Разработаны и аттестованы методики ВЭЖХ-определения с УФ-детектированием водо- и жирорастворимых витаминов в комбикормах, премиксах и БАД с использованием очистки и концентрирования дня витаминов группы В на сорбенте С18 и щелочного гидролиза - для жирорастворимых

3. Предложен унифицированный способ одновременного определения витаминов и антибиотиков методом ОФ ВЭЖХ с последовательным УФ- и масс-спекгрометрическим детектированием, включающий очистку и концентрирование экстрактов на сверхсшитом полистироле PuroSep 200 с пределами обнаружения жирорастворимых витаминов - 50 - 20 нг/мл; водорастворимых витаминов - 10 - 2 нг/мл, антибиотиков - 5,0 - 0,7 нг/мл.

4. Получены сравнительные оценочные характеристики по пределам обнаружения при определении а-аминокислот в комбикормах, биожидко стах, мясе с использованием дериватизации ФИТЦ и ТФЭ в условиях лигандного обмена (JIO) на сульфированном сверхсшитом полистироле MN 502. Установлено, последний позволяет снизить пределы обнаружения аналитов по сравнению с применением off-line дериватизации с 0,4 до 0,1 мкг/мл;

5. Предложена методика хроматографического определения алкалоида эрготамина в крови с использованием принципа лигандного обмена в условиях ТФЭ на сорбенте MN 502 с флуориметрическим детектированием (пределы обнаружения 50 нг/мл). Проведено масс-спектрометрическое определение эрготамина с применением жидкостной экстракции из высушенной крови. Показано, что оба метода могут быть использованы как референтные по отношению друг к другу.

Работа изложена в следующих публикациях:

1. Руденко А. О., Карцова Л. А. Определение водорастворимых витаминов группы В и витамина С в комбикормах, премиксах и биологически-активных добавках методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. //Журнал аналитической химии. 2010. Т. 65. С. 73-78.

2. Руденко А. О., Карцоеа Л. А., Даеанкое В. А. Выявление возможностей сорбента Purosep-200 на основе сверхсшитого полистирола при анализе водо- и жирорастворимых витаминов. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009, Т. 9. С. 766-773.

3. Руденко А. О., Карцева Л. А., Снарский С. И. Определение важнейших аминокислот в сложных объектах биологического происхождения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ с получением фенилтиогидантоинов аминокислот. И Сорбционные и хроматографические процессы. 2010, Т. 10. С. 223-230.

4. Руденко А. О., Карцоеа Л. А., Краснов К. А. Новые возможности сверхсшитого полистирольного сорбента при определении эрготамина в крови крыс методом обращённо-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. // Вестник Санкт-Петербургского государственно университета. 20И, Т. 2. С. 148-155.

5. Руденко А. О., Карцоеа Л. А. Определение аминокислот в экстрактах предстательной железы // Международной конференции по химии «Основные тенденции в развитии химии». Тезисы докладов. СПб, 2009. С. 227-228.

6. Rudenko А.О., Kartsova L.A. New possibilities of SPE concentrating for the water- and fat-soluble vitamins determination in the complex matrixes // 10th European Meeting on Environmental Chemistry. Book of abstracts. France, Limoges, 2009. P. 49.

7. Руденко А. О., Карцоеа А. А. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина методом ОФ ВЭЖХ в объектах растительного и биологического происхождения // IV Международная конференция «ЭОС-2010». Тезисы докладов. Воронеж, 2010. С. 280.

8. Руденко А. О., Карцоеа Л. А., Даеанкое В.А. Использование твердофазной экстракции на Purosep 200 при определении витаминов и антибиотиков в сложных матрицах методом обращённо-фазовой ВЭЖХ // Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». Тезисы докладов. Краснодар, 2010. С. 84.

9. Руденко А. О., Карцоеа Л. А. Применение принципов лигандного обмена при определении эрготамина в крови крыс методом обращённо-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием // V Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире». Тезисы докладов. СПб, 2011. С. 101-102.

Подписано к печати 09.09.2011 г. Формат бумаги 60x84 /)6. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать цифровая. Объем 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 5248.

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ 198504 Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр. 26. Тел.: (812) 428 4043,428 6919

Список используемых сокращений.

Г.Введение.

II. Литературный обзор.

II. 1. Сверхсшитый полистирол как материал для твердофазной экстракции.

II. 1.1. Физико-химические свойства полистирольных сеток.

II. 1.2. Применение сверхсшитых полистиролов при подготовке проб.

П.2. Принцип лигандного обмена и его применение при подготовке проб сложных матриц к хроматографическому анализу.

П.З. Физико-химические свойства важнейших аналитов.

П.3.1. Свойства водорастворимых витаминов.

П.3.2. Свойства жирорастворимых витаминов.

П.З.З. Физико-химические методы определения витаминов.

П.З .4. Подготовка проб сложных матриц при определении витаминов.

П.3.5. Свойства аминокислот.

П.З.6. Физико-химические методы анализа аминокислот в объектах со сложной матрицей.

П.З .7. Антибиотики тетрациклиновой группы и левомицетин.

1Г.3.7.1. Физико-химические методы определения антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина.

П.З.7.2. Пробоподготовка сложных объектов природного происхождения к анализу при определении антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина.

П.З. 8. Алкалоид эрготамин и физико-химические методы его определения.

III. Экспериментальная часть.

III. 1. Аппаратура.

Ш.2. Вспомогательные устройства, материалы и реагенты.

III.3. Определение водорастворимых витаминов методом ОФ ВЭЖХ в комбикормах, премиксах комбикормов и БАД.

Ш.3.1. Условия хроматографического разделения водорастворимых витаминов.

Ш.3.2. Пробоподготовка реальных объектов (комбикорма, премиксы, БАД) при ВЭЖХ-анализе водорастворимых витаминов.

Ш.З.З. Хроматографический анализ экстрактов реальных объектов.

III. 3.3.1. Определение коэффициентов извлечения водорастворимых витаминов.

Ш.3.4. Выявление возможностей использования принципа лигандного обмена на стадии подготовки проб при определении водорастворимых витаминов.

Ш.4. Определение жирорастворимых витаминов методом ОФ ВЭЖХ в комбикормах, премиксах комбикормов и БАД.

Ш.4.1. Условия хроматографического разделения жирорастворимых витаминов.

Ш.4.1.1. Метод щелочного гидролиза сложноэфирных форм жирорастворимых витаминов.

Ш.4.2. Пробоподготовка реальных объектов (комбикорма, премиксы, БАД) при анализе жирорастворимых витаминов:.

Ш.4.2.1. Подготовка проб комбикорма, БАД и премиксов с применением жидкостной экстракции изопропиловым спиртом.

111.4.2.2. Подготовка проб комбикорма, с применением щелочного гидролиза.

Ш.5. Совместное определение водо- и жирорастворимых витаминов методом ОФ ВЭЖХ в комбикормах.

Ш.5.1. Условия хроматографического разделения смесей водо- и жирорастворимых витаминов.

111:5.1.1. ТФЭ смесей жирорастворимых витаминов на сорбенте Бер-Рак аз.:.:.

Ш.5.2. Подготовка проб и хроматографический анализ 72 комбикорма.

Ш.6. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина методом ОФ ВЭЖХ в комбикормах и мясе птицы.

Ш.6.1. Условия хроматографического разделения стандартных смесей антибиотиков.

Ш.6.2. Пробоподготовка реальных объектов (комбикорма, мясо птицы) при анализе антибиотиков.

Ш.6.2.1 Очистка и концентрирование с использованием обращённо-фазового сорбента Бер-Рак С18.

III.6.2.2. Очистка и концентрирование с использованием сверхсшитого полистирола РигоБер 200.

Ш.6.2.3. Очистка и концентрирование с помощью ионогенного сверхсшитого полистирола МЫ 502.

111.7. Хроматографический анализ аминокислот методом ОФ ВЭЖХ в мясе 78 г птицы, комбикормах и биологических жидкостях. III.7.1. Хроматографическое определение аминокислот с предварительным * получением ФИТЦ-производных. III.7.1.1. Условия хроматографического разделения ФИТЦ-производных \ аминокислот.

III. 7.1.2. Пробоподготовка и хроматографический анализ ФИТЦ-■ производных аминокислот в комбикормах, биожидкостях, мясе птицы. gg

III.7.2 Хроматографическое определение аминокислот с использованием принципа лигандного обмена в процессе ТФЭ.

III.7.2.1. Пробоподготовка и хроматографический анализ аминокислот в образцах комбикорма в условиях лигандного обмена.

111.8. Совместное определение витаминов и антибиотиков тетрациклиновой группы и леовмицетина в комбикормах методом ОФ ВЭЖХ с УФ- и масс-спектрометрическим детектированием. g

111.8.1. Условия хроматографического разделения стандартных смесей витаминов и антибиотиков.

111.8.2. Поиск условий масс-спектрометрического детектирования при совместном определении витаминов и антибиотиков.

111.8.3. Пробоподготовка и анализ комбикорма в условиях совместного определения витаминов и антибиотиков. s III.9. Определение алкалоида эрготамина в крови крыс методом ОФ ВЭЖХ с \ флуориметрическим и масс-спектрометрическим детектированием. III.9.1. Определение эрготамина методом ОФ ВЭЖХ с флуориметрическим ^ детектированием.

III.9.2. Определение эрготамина масс-спектрометрическим методом.

III.9.2.1. Пробоподготовка крови и масс-спектрометрическое определение

I эрготамина.

IV. Выбор стратегии при подготовке проб природных объектов на модельных системах.

IV. 1. Разработка способа определение водорастворимых витаминов с f использованием модельных систем.

IV.2. Разработка способа определения жирорастворимых витаминов на ( модельных системах. ЮЗ IV.3. Выбор условий совместного определения водо- и жирорастворимых ? витаминов с использованием модельных систем.

IV.4. Поиск путей определения антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина на модельных смесях.

IV.5. Определение а-аминокислот на модельных смесях с использованием offline дериватизации фенилизотиоцианатом (ФИТЦ).

IV.5.1. Использование лигандообменного сорбционного концентрирования при определении а-аминокислот на модельных системах.

IV.6. Совместное определение антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина и витаминов на примере модельных систем.

V. Практическое применение выявленных закономерностей при подготовке проб сложных природных объектов.

V.I. Определение водорастворимых витаминов в комбикормах, премиксах комбикормов и Б АД.

V.2. Определение жирорастворимых витаминов в комбикормах, премиксах комбикормов и Б АД.

V.3. Совместное определение водо- и жирорастворимых витаминов в комбикормах.

V.4. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина в комбикормах и мясе птицы.

V.5. Определение а-аминокислот в комбикормах, мясе, экстрактах поджелудочной и предстательной желёз.

V.6. Совместное определение витаминов и антибиотиков в комбикормах.

V.7. Применение принципов комплексообразования при определении алкалоида эрготамина в крови крыс.

VI. Выводы.

VI. выводы

1. Предложен способ очистки и концентрирования экстрактов реальных объектов при определении антибиотиков и водорастворимых витаминов с использованием принципа лигандного обмена на сверхсшитом сульфированном полистироле MN 502 с применением в качестве металла-комплексообразователя ионов Cu(II).

2. Разработаны и аттестованы методики ВЭЖХ-определения с УФ-детектированием водо- и жирорастворимых витаминов в комбикормах, премиксах и БАД с использованием очистки* и концентрирования для витаминов группы В на сорбенте С18 и щелочного гидролиза — для жирорастворимых.

3. Предложен унифицированный способ одновременного определения витаминов и антибиотиков методом ОФ ВЭЖХ с последовательным УФ- и масс-спектрометрическим детектированием, включающий очистку и концентрирование экстрактов на сверхсшитом полистироле PuroSep 200 с пределами обнаружения жирорастворимых витаминов — 50 — 20 нг/мл; водорастворимых витаминов — 10 — 2 нг/мл, антибиотиков - 5,0 - 0,7 нг/мл.

4. Получены сравнительные оценочные характеристики по пределам обнаружения при определении а-аминокислот в комбикормах, биожидкостях, мясе с использованием дериватизации ФИТЦ и ТФЭ в условиях лигандного обмена (JIO) на сульфированном сверхсшитом полистироле MN 502. Установлено, последний позволяет снизить пределы обнаружения аналитов по сравнению с применением off-line дериватизации с 0,4 до 0,1 мкг/мл;

5. Предложена методика хроматографическош определения алкалоида эрготамина в крови с использованием принципа лигандного обмена в условиях ТФЭ на сорбенте МЫ 502 с флуориметрическим детектированием (пределы обнаружения 50 нг/мл). Проведено масс-спектрометрическое определение эрготамина с применением жидкостной экстракции из высушенной крови. Показано, что оба метода могут быть использованы как референтные по отношению друг к другу.

1. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Ч. I. СПб. АНО НПО «Мир и Семья», 2002. с. 964.

2. Hennion М.-С. Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography // J. Chrom. 1999. V. 856. P. 3-54.

3. Sabik H., Jeannot R., Roudeau B. Multiresidue methods using solid-phase extraction techniques for monitoring priority pesticides, including triazines and degradation products, in ground and surface waters // J. Chrom. 2000. V. 885. P. 217-236.

4. Leonard M. New packing materials for protein chromatography // J. Chrom. 1997. V. 699. P. 3-27.

5. Sychov C.S., Ilyin M.M., Davankov V.A., Sochilina K.O. Elucidation of retention mechanisms on hypercrosslinked polystyrene used as column packing material for high-performance liquid chromatography // J. Chrom. A. 2004. V. 1030. P. 17-24.

6. Davankov V.A., Sychov C.S., Ilyin M.M., Sochilina K.O. Hypercrosslinked polystyrene as a novel type of high-performance liquid chromatography column packing material. Mechanisms of retention // J. Chrom. A. 2003. V. 987. P. 67-75.

7. Fontanals N., Galia M., Cormack A.G., Marce R.M., Sherrington'D.C., Borrull F. Evaluation of a new hypercrosslinked polymer as a sorbent for solidphase extraction of polar compounds // J. Chrom. A. 2005. V. 1075. P. 51-56.

8. Tsyurupa M.P., Davankov V.A. Porous structure of hypercrosslinked polystyrene: state-of-art mini-review // J. React & Funct. Polym. 2002. V. 53. P. 193-203.

9. Ii Rodriguez, M. G. Mejuto, M. N. Bollain, R. Cela. Evaluation of two solid-phase extraction procedures for the preconcentration of chlorophenols in drinking water//J. Chromatogr. A. 1997. V. 786. P. 285-292.

10. R. Schilling, P. J. Clarkson, M. Cooke, J. Fresenius. Enhanced recovery of chlorophenols from surface waters using polymer based extraction cartridges //J. Anal. Chem. 1998. V. 360. P. 90-94.

11. G. Sirvent, M. Hidalgo; V. Salvado. Evaluation of a new solid-phase cartridge for the preconcentration of phenolic compounds in water //J. Separation Science. 2004. V. 27. P. 613-618.

12. Streat M., Sweetland L.A. and F., Graduate. Removal of pesticides from water using hypercrosslinked polymer phases: part 1 physical and chemical characterization of adsorbents // J. Proc Safety & Environ. Protec. 1998 V. 76. P. 115-126.

13. A. Di Corcia, M. Marchetti. Multiresidue method for pesticides in drinking water using a graphitized carbon black cartridge extraction and liquid chromatographic analysis //J. Anal. Chem. 1991. V. 63. P. 580-585.

14. N. Masque, R. M. Marce, F. Borrull. Comparison of different sorbents for on-line solid-phase extraction of pesticides and phenolic compounds from natural water followed by liquid chromatography //J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 257-263.

15. M. Kuster, M. L. de Alda, D. Barcely. Liquid chromatography tandem mass spectrometric analysis and regulatory issues of polar pesticides in natural and treated waters //J. Chromatogr. A. 2009. V. 1216. P. 520-529.

16. Rosenberg G.I., Shabaeva A.S., Moryakov V.S., Musin T.G., Tsyurupa M.P., Davankov V.A. Sorption properties of hypercrosslinked polystyrene sorbents // J. React & Funct. Polym. 1983. V. 1. P. 175-182.

17. S. Reverte, F. Borrull, E. Poccurull, R. M. Marce. Determination of antibiotic compounds in water by solid-phase extraction -high-performance liquid chromatography (electrospray) mass spectrometry //J. Chromatogr. A. 2003. V. 1010. P. 225-232.

18. Лигандообменная хроматография. В.А.Даванков, Дж.Навратил, Х.Уолтон: М. 1989.

19. Introduction to HPLC, Shimadzu Application book. 2008. Japan.

20. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Ч. 2. СПб. АНО НПО «Мир и Семья», 2002. с. 964.

21. J. Yun, S. Shen, F. Chen, К. Yao. One-step isolation of adenosine triphosphate from crude fermentation broth saccharomyces by ligand-exchange chromatography using supermacroporous cryogel. J. Chromatogr. В. 2007, V. 860. P. 57-62.

22. M. F. M. Guadalupea, V. A. Castello Brancoa, J. C. Schmidb. Isolation of sulfides in oils. J. Organic Geochemistry. 1991, V. 17. P. 355-36.

23. I. Ali, H. Y. Aboul-Enein, P. Singh, R. Singh, B. Sharma. Separation of biological proteins by ligand-exchange chromatography. J. Pharmaceutical. 2010, V. 18. P. 59-73.

24. Химия витаминов. Березовский В.M., изд. 2-е, M., «Пищевая промышленность», 1973. с. 631.

25. Витамины. Морозкина Т.С., Мойсеёнок А.Г., Мн, ООО «Асар», 2002. с. 112.

26. Курс органической химии. Каррер П., пер. с нем. Вассерберг В.Э., JI, ГОСХИМИЗДАТ, 1960. с. 121.

27. S. Albala-Hurtago,' М.Т Veciana-Nogues, Izquierdo-Pulido, and А. Marine-Font. Determination of water-soluble vitamins in infant milk by highperformance liquid chromatography, J. Chromatogr., 1997, V. 778, P. 247-253.

28. A. O. Rudenko, L. A. Kartsova. Determination of water soluble vitamin В and vitamin С in combined feed, premixes, and' biologically active supplements by reversed phase HPLC. J. Anal. Chem. 2010; V. 65. P: 71-76.

29. M.D. Lucock, M. Green,. M. Priestnall, M.I. Levene, and R. Hartley. Optimisation of chromatographic conditions for the determination of folates in foods and biological tissues for nutritional and clinical work, J. Food Chem., 1995, V. 53, P. 329-338.

30. O. Heudi, T. Kilinç, P. Fontannaz. Separation of water-soluble vitamins by reversed-phase high performance liquid chromatography with ultra-violet detection: Application to polyvitaminated premixes. J. Chromatogr. A, 2005, V. 1070. P. 49-56.

31. ГОСТ P 50929-96 Премиксы. Методы определения витаминов группы В, М., ИПК Издательство стандартов, 1996

32. Государственная фармакопея СССР, изд. 11-е, т. 2, М., «Медицина», 397 е., 1990.

33. Хроматография в медицине и биологии. Буланова А.В., Полякова Ю.Л., изд. 2-е, Самара, 105 е., 2006.

34. Victoria Salvado and Juan M. Sanchez. Capillary electrophoresis of water-soluble vitamins: An undergraduate experiment, J. Chem. Educator, 2002, P. 2326.

35. M. Shabangi, J. A. Sutton. Separation of thiamin and its phosphate esters by capillary zone electrophoresis and its application to the analysis of water-soluble vitamins. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005, V. 38. P.66-71.

36. R. Hau Fung Cheung, J. G. Hughes, P. J. Marriott, D. M. Small. Investigation of folic acid stability in fortified instant Asian noodles by use of capillary electrophoresis. J. Food Chemistry. 2009, V. 112. P. 507-514.

37. J. Mazina, J. Gorbatsova. Sample preparation for CE-DAD analysis of the water soluble vitamins in food products. J. Procedia.Chemistry. 2010, V. 2. P. 4653.

38. Li Jia, Yaling Liu, Yanyan Du, Da Xing. Pressurized capillary electrochromatographic analysis of water-soluble vitamins by combining with online concentration technique. J. Chromatography A. 2007, V. 1154, P. 416-422.

39. C. Yin, Y. Cao, S. Ding, Yun Wang. Rapid determination of water- and fat-soluble vitamins with microemulsion electrokinetic chromatography. J. ChromatogrA. 2008, V. 1193. P. 172-177.

40. J. Arnaud, I. Fortis, S. Blachier, D. Kia, and A. Favier. Simultaneous determination^ of retinol, a-tocopherol and (3-carotene in serum by isocratic highperformance liquid chromatography, J. Chromatogr1991, V. 572, P. 103-116.

41. H. Qian and M. Sheng. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A, D and E and pro-vitamin D2 in animal feeds by one-step extraction and high-performances liquid chromatography analysis, J. Chromatogr., 1998, V. 825, P. 127-133.

42. C.M. Bell, L.C. Sander, and S.A. Wise. Temperature dependence of carotenoids on C18, C30 and C34 bonded stationary phases, J. Chromatogr., 1997, V. 757, P. 29-39.

43. R.B. van Breemen, J. Anal. Chemistry, 1995, V. 2004, P. 67.

44. M. Kamao, N. Tsugawa, Y. Suhara, A. Wada, R. Nishino, T. Ukita, K. Tanaka and T. Okano. Quantification of fat-soluble vitamins in human breast milk by liquid chromatography — tandem mass spectrometry. J. Chromatogr., 2007, V. 858, P. 192-200.

45. L.-C. Chang, H.-T. Chang, S.-W. San. Cyclodextrin-modified microemulsion electrokinetic chromatography for separation of a,P,y-tocopherol and a-tocopherol acetate, J. Chromatogr., 2006, V. 1110, P. 227-234.

46. J. M. Sánchez, V. Salvado. Comparison of micellar and microemulsion electrokinetic chromatography for the analysis of water- and fat-soluble vitamins. J. Chromatogr. A. 2002, V. 950. P: 241-247.

47. S. L. Abidi and T. L. Mounts. Separations of tocopherols and methylated tocols on cyclodextrin-bonded silica, J. Chromatography, 1994, V. 670, P. 67-75.

48. R. Ekinci, and C. Kadakal. Determination of seven-water-soluble vitamins in tarhana, a traditional turkish cereal food by high performance liquid chromatography, J. Chromatogr., 2005, P. 289-297.

49. H. Etoh, Y. Utsunorniya, A. Komori, Y. Murakami, S. Oshima; and T. Inakuma, J. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, V. 1096, P. 64.

50. ГОСТ P 50928-96»Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E, M., ИГЖ Издательство стандартов, 1997

51. Руденко А. О., Карцова JI. А., Даванков В. А. Выявление возможностей сорбента Purosep-200 на основе сверхсшитого полистирола при анализе водо- и жирорастворимых витаминов. Сорбционные и хроматографические процессы. 2009, Т. 9. С. 766-773.

52. Гринштейн Д., Винниц М. Химия аминокислот и пептидов, пер: с англ., М., 1965.

53. Шредер Э., Любке-К. Пептиды, пер. с англ., т. 1-2, М., 1967-69.

54. Химия полипептидов, пер. с англ., М., 1977.

55. Материалы сайта www.wikipedia.org.

56. Комарова Н. В., Каменцев Я. С., Соломонова А. П. Анализ аминокислотного состава кормов, комбикормов и сырья для их производства.

57. Другие области применения схемы разделения. // Хроматография на благо России. М., «Граница», 2007. С. 576-583.

58. T. Teerlink, P.A.M. van Leeuwen, A. Houdijk. //J. Clin. Chem. 1994. V. 40. P. 245.

59. K. Fujimura, S. Suzuki, K. Hayashi, S. Masuda. Retention behavior and chiral recognition mechanism of several cyclodextrin-bonded phases for dansyl amino acids //J: Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 2205-2198.

60. A. Berthod, S. C. Chang, D. W. Armstrong. Empirical procedure that used molecular structure to predict enantioselectivity of chiral stationary phases //J. Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 395-404.

61. P. A. Haynes, D. Sheumack, L. G. Greig, J. Kibby, J. W. Redmond. Applications of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate //J. Chromatogr. A. 1991. V. 588. P. 107-114.

62. D: C. Turnell, J.D.H. Cooper. Rapid assay for amino acids in serum or urine by pre-column derivatization and reversed-phase liquid chromatography //J. Clin. Chem. 1982. V. 28. P. 527-531.

63. L. Canevari, R. Vieira, M. Aldegunde, F. Dagani. High-performance liquid chromatographic separation with electrochemical detection of amino acids focusing on neurochemical application //J. Anal. Biochem. 1992. V. 205. P. 137142.

64. M. F. Maimer, L. A. Schroeder. Amino acid anslysis by high-performance liquid chromatography with methanesulfonic acid hydrolysis and 9171fluorenylmethylchloroformate derivatization.//J. Chromatogr. A. 1990. V. 514. P. 227-239.

65. П. Садек. Растворители для ВЭЖХ, пер. с англ., М., 2006.

66. P. A. Haynes, D. Sheumack, L. G. Greig, J. Kibby, J. W. Redmond. Applications of automated amino acid1 analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate //J. Chromatogr. A. 1991. V. 588. P. 107-114.

67. R. Gupta, N. Jentoft. Analysis of natural and modified amino acids and hexosamines by reversed-phase high-performance liquid chromatography //J. Chromatogr. A. 1989. V. 474. P. 411-417.

68. X. Han, T. Yao, Y. Liu, R. C. Larock, D. W. Armstrong. Separation of chiral fiiran derivatives by liquid chromatography using cyclodextrin-based chiral stationary phases //J. Chromatogr. A. 2005. V. 1063. P. 111-120.

69. В. Natalini, R. Sardella, G. Carbone, A. Macchiarulo. R. Pellicciari. The effect of the copper(II) salt anion in the chiral ligand-exchange chromatography of amino acids //J. Anal. Chimica Acta. In Press.

70. G. Giibitz, W. Jellenz, W. Santi. Separation of the optical isomers of aminoacids by ligand-exchange chromatography using chemically bonded phases //J. Ghromatogr. 1981. V. 203. P. 377-384.

71. N. Grobuschek, M.G. Schmid, G. Tuscher, M. Ivanova, G. Giibitz. Chiral separation- ofP-methyl-amino acids by ligand-exchange using capillary elecrophoresis and HPLC //J. Pharmaceuticals and Biomedical Analysis. 2002. V. 27. P. 599-605.

72. S. Zhao, Y.-M. Liu. Enantioseparation of underivatized amino acids by capillary electrophoresis using copper(II) (S)-3-aminopirrolidine L-histidine ternary complex as the chiral selector //J. Anal. Chimica Acta. 2001. V. 426. P. 6570.

73. X. Lu, Y. Chen, L. Guo, Y. Yang. Chiral separation of underivatized amino acids by ligand-exchange capillary electrophoresis using a copper(II) -— L-lysine complex as selector //J. Chromatogr. A. 2002. V.945. P. 249-255.

74. Z. Chen, K. Uchiyama, T. Hobo. Chiral.resolution of dansyl amino acids byligand exchange-capillary electrophoresis using Cu(II)-L-prolinamides as chiral selector //J. Anal. Chimica Acta. 2004. V. 523. P. 1-7.

75. Комарова H. В., Каменцев Я. С., Соломонова А. П. Анализ аминокислотного состава кормов; комбикормов и сырья для их производства. Другие области применения схемы разделения. // Хроматография на благо России. М., «Граница», 2007. С. 576-583.

76. Назашин С. М., Фомина И. П. Химия антибиотиков, 3 изд., т. 1, М., 1961, с. 180-268.

77. Есипов С. Е. Рациональная антибиотикотерапия, 4 изд., М., 1982, с. 183-208:

78. Yi Wen, Ying Wang, Yu-Qi Feng. Simultaneous residue monitoring of four tetracycline antibiotics in fish muscle by in-tube solid-phase microextractioncoupled with high-performance liquid chromatography. J. Talanta. 2006, V. 70. P. 153-159.

79. H. Jin, A. Praveen Kumar, Do-Hyeon Paik, Kwon-Chul Ha, Young-Jae Yoo, Yong Lee. Trace analysis of tetracycline antibiotics in human- urine using UPLC-QToF mass spectrometry. Microchemical Journal. 2010, V. 94. P. 139147.

80. M. J. Schneider, S. E. Braden, I. Reyes-Herrera, D. J. Donoghue. Simultaneous determination of fluoroquinolones and tetracyclines in chicken muscle using HPLC with fluorescence detection. J. Chromatogr. B. 2007, V. 846. P. 8-13.

81. M. C. Vargas Mamani, F. Guillermo Reyes, S. Rath. Multiresidue determination of tetracyclines, sulphonamides and chloramphenicol in bovine milk using HPLC-DAD. J. Food Chemistry. 2009, V. 117. P. 545-552.

82. M. C. Vargas Mamani, J. Amaya Farfán, F. G. Reyes, S. Rath. Simultaneous determination of tetracyclines in pharmaceuticals by CZE using experimental design. J. Talanta. 2006, V. 70i P. 236-243.

83. J. M. Miranda, J. A. Rodríguez, C. A. Galán-Vidal. Simultaneous determination of tetracyclines in poultry muscle by capillary zone electrophoresis. J. Chromatogr. A. 2009, V. 1216. P. 3366-3371.

84. S. M. Santos, M. Henriques, A. C. Duarte, V. I. Esteves. Development and application of a capillary electrophoresis based method for the simultaneous screening of six antibiotics in spiked milk samples. J. Talanta. 2007, V. 71. P. 731737.

85. P. Kowalski. Capillary electrophoretic method for the simultaneous determination of tetracycline residues in fish samples. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2008, V. 47. P. 487-493.

86. Yung-Chih Chen, Ching-Erh Lin. Migration behavior and separation of tetracycline antibiotics by micellar electrokinetic chromatography. J. Chromatography A. 1998, V. 802. P. 95-105.

87. E. J. Mulders, D. Van de Lagemaat. Determination of residues of tetracycline antibiotics in animal tissues by high-performance liquid chromatography. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 1989, V. 7. P. 18291835.

88. X. Sun, X. He, Y. Zhang, L. Chen. Determination of tetracyclines in food samples- by molecularly imprinted monolithic column coupling with high performance liquid chromatography. J. Talanta. 2009; V. 79. P. 926-934.

89. V. Davankov, M. Tsyurupa. Sorption* of Organic Compounds from Aqueous Solutions. Comprehensive Analytical Chemistry. 2011, V. 56. P. 411-444.

90. Berde, B. and H. 0. Schild. Ergot Alkaloids and Related Contpounds. Handbook ES- P. Pharmacology, 1978, V. 49. Springer-Verlag, New York.

91. Porter, Ji K., Bacon; C. W. Kuldau- G., Wray, E. M: and Meredith, F. I. 1998. Alkaloids and other mycotoxins associated with ergot damaged sorghum. Proceedings National Conference on Sorgltum Ergot, Corpus Christi, TX, June 2526, 1998.

92. Porter, J. K. 1994. Chemical constituents of grass endophytes. Ch. 8, p- P. 103-123. Bio- technology of Endophytic Fungi of Grasses. C. W. Bacon and J. F. White, Jr. (Eds.). CRC Press, Boca Raton, FL.

93. Waller J. A forgotten plague . making sense of dancing mania. Lancet. 2009 Feb 21.373(9664) .624-5.

94. Bacon, C. W., Lyons, P. C., Porter, J. K. and Robbins, J. D. 1986. Ergot toxicities from endophyte-infected grasses . a review. Agron. J. 78 . 106-1 16.

95. Perellino, N. C. Malyszko. J., Ballabio, M., Gioia, B. and Minghetti. A. Identification of ergobine, a new natural peptide ergot alkaloid. J. Nat. Prod. 1993. 56 .489-493.

96. Flieger, M., Wurst. M., Stuchlik, J. and Rehacek, Z. Isolation and separation of new natural lactam alkaloids of ergot by high performance liquid chromatography. J. Chronzatogr. 1981.

97. Gamer, G. B., Rottinghaus, G. E., Cornell, C. N. and Testereci, H. Chemistry of com- pounds associated with endophyte/grass interaction . ergovaline- and ergopeptine-related alkaloids. Agric. Ecosyst. Erniron. 1993. 44 .65-80.

98. Rottinghaus, G. E., Schultz. L. M., Ross, P. F. and Hill, N. S. An HPLC method for the detection of ergot in ground and pelleted feeds. J. Vet. Diagn. Intvst. 1993. 5 .242.

99. Moubarak, A. S., Piper, E. L., West, C. P. and Johnson, Z. B. Interaction of purified ergovaline from endophyte-infected tall fescue with synaptosomal ATPase enzyme system. J. Agl-ic. Food Cllenz. 1993. 41 .407-409.

100. Shelby, R. A. and Fleiger. M. 1997. Analysis of ergot alkaloids in plants and seeds of endophyte-infected tall fescue by gradient ITPLC. Ch. 50, p- P. 271177

101. I~lterrrctions. G. W. Bacon and N. S. Hill (Eds.). Proceedings of the Third International Sym- posium on AcrernoniunzlGrass Interactions, May 28-3 1, 1997, Athens, GA. Plenum Press, New York.

102. Hill, N. S., Parrott, W. A. and Pope, D. D. Ergopeptine alkaloid production by endo- phytes in a common tall fescue genotype. Cro- P. Sci. 1991. 3 1 . 1545-1547.

103. Hill, N. S., Rottinghaus, G.E., Agee, C. S. and Schultz, L. M. Simplified sample preparation for HPLC analysis of ergovaline in tall fescue. Crop Sci. 1993. 33 .331-333.

104. Zhang, Q., Spiers, D. E., Rottinghaus, Cr. E. and Garner, G. B. Thermoregulatory effects of ergovaline isolated from endophyte infected tall fescue seed on rats. J. Agric. Food Ghent. 1994. 42 .954-958.

105. Scott, P. M., Lombaert, G. A., Pellaers, - P., Bacler, S. and Lappi, J. Ergot alkaloids in grain foods sold in Canada. J. AGAC Int. 1992. 75 .7731 207 .139-144.

106. Perellino, N. G. Malyszko. J., Ballabio, Mi, Gioia, B. and Minghetti. A. Identification of ergobine, a new natural peptide ergot alkaloid. J. Nat; Prod. 1993. 56.489-493.

107. Stahl, E. Tlzirt Layer Clzrornatograplty, A Laboratory Handbook, No. 73. p- P. 127, 869. Springer-Verlag 1969., New York.

108. Sprince, H. A modified: Ehrlich benzaldehyde reagent for detection of indoles on paper chromatograms. J. Cltrontatogr. 3 .97-98. 1960.

109. Porter, J. K., Bacon, C. W. and Robbins. J. D. Ergosine, ergosinine, and chanoclavine I from Epichloe typlzina. J. Agric. Food Chem. 1979. 27 .595-598.

110. Porter, J. K. and Betowski, D. Chemical ionization mass spectrometry of the ergot cyclol alkaloids. J. Agric. Food Chent. 1981. 29 .650-653.

111. Yates, S. G., Plattner, R. D. and Garner, G. B. Detection of ergopeptine alkaloids in endophyte infected, toxic K-3 1 tall fescue by mass spectrometry/mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 1985. 33 .719-722.

112. Porter, J. K. Bacon, C. W., Plattner, R. D. and Arrendale, R. F. Ergot peptide alkaloid spectra of Claviceps-infected tall fescue, wheat, and barley. J. Agric Food Chem. 1987. 35 .359-361.

113. Yates, S. G. and R. G. Powell. Analysis of ergopeptine alkaloids in endophyte-infected tall fescue. J. Agric. Food Chem. 1988. 36 .337-340.

114. Rowan, D. D. and Shaw, G. J. Detection of ergopeptine alkaloids in endophyte-infected perennial ryegrass by tandem mass spectrometry. NZ Vet. J 1987. 35 .197-198.

115. Davies M. B. Reactions of L-ascorbic acid with transition metal complexes. // Pdyhedron. 1992. V. 11. P. 285-321.