Липосомная модель в исследовании различных биологически активных веществ

Лукьянов, Павел Александрович

Липосомная модель в исследовании различных биологически активных веществ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Лукьянов, Павел Александрович АВТОР

доктора химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2000 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Липосомная модель в исследовании различных биологически активных веществ»

Автореферат диссертации на тему "Липосомная модель в исследовании различных биологически активных веществ"

На правах рукописи

Лукьянов Павел Александрович

ЛИПОСОМНАЯ МОДЕЛЬ В ИССЛЕДОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

02.00.10 - бноорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток, 2000 г.

Работа выполнена в государственном учреждении - Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Каплун А.П... доктор биологических наук, профессор Островский Д.Н. доктор биологических наук, Апнсимов М.М. Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ведущая организация:

Защита состоится 28 июня 2000 г. в 9 часов на заседании Диссертационного Совета Д.ООЗ.99.01 по защите диссертаций в государственном учреждении -Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ГУ-ТИБОХ ДВО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН (690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ГУ-ДВГИ)

Автореферат разослан 25 мая 2000 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Более 30 лет прошло с момента открытия спонтанной агрегации фосфолипидов в полностью гидратированном состоянии в замкнутые мембранные оболочки. Дальнейшие исследования показали, что мембрана этих везикул состоит из липидного бислоя, обладающего свойствами полупроницаемого барьера, и замкнутого водного пространства, способного захватывать в момент образования растворенные в водной фазе низко- и высокомолекулярные соединения. Эти везикулы, получившие название липосомы, оказались максимально упрощенной моделью клеточных мембран, и очень скоро стали объектом исследования многих ученых, занимавшихся изучением биологических мембран. С помощью липосом были установлены основные закономерности транспорта веществ через мембрану, показана важная роль фазовых переходов в функционировании мембран, определены молекулярные параметры липидного бислоя и его динамические характеристики, изучены процессы слияния мембран, в реконструированных системах были охарактеризованы индивидуальные мембранные белки и целые белковые ансамбли.

Новый стимул в развитии теоретических и практических исследований вызвало открытие так называемых "невидимых" липосом, несущих на себе нейтральные гидрофильные цепи полиэтиленгликоля и напоминающих гликокаликс клетки без углеводной специфичности. С другой стороны, использование положительно заряженных липосом для переноса высокомолекулярных соединений внутрь клетки позволило открыть новые горизонты по трансфекции клеток, что представляет для биотехнологии особый интерес.

Включение фармакологических препаратов в липидный бислой или во внутреннюю водную фазу липосом может значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат защищен липидным бислоем от действия неблагоприятных факторов, а с другой - липосома служит в качестве депо для токсичного препарата с контролируемой скоростью выхода в окружающее биологическое окружение. Сейчас эффективно разрабатываются новые виды терапии с использованием липосом для переноса ферментов, генетического материала, цитокинов внутрь клетки для коррекции специфического дефицита.

мишеням, позволяет проводить целенаправленную доставку противораковых, противоинфекционных и противовоспалительных препаратов.

Целью настоящей работы является исследование биологически активных соединений различной природы, как низкомолекулярных амфифильных соединений, так и высокомолекулярных - белков, с использованием липосом, уточнение механизма их действия, моделирование процессов иммунного узнавания.

Научная новизна. Впервые были получены серологически активные липосомные антигены и иммуногены на основе тетра- и пентаацильных производных D-глюкозамина 6-фосфата со специфичностью липида А грамотрицательных бактерий. Впервые были синтезированы флуоресцентные зонды со специфичностью липида А и с их помощью исследована ориентация главного интегрального белка порина бактерии Yersinia pseudotuberculosis - иерсинина - в липидном бислое.

С помощью флуоресцентных зондов исследована рН-зависимая конформационная пластичность иерсинина и выяснены оптимальные условия для функционирования этого порообразующего белка.

Выяснена роль физико-химического состояния липодепсипептидов (бацирцинов) в липидной мембране в их рН-зависимом мембранотропном действии. Показано, что в условиях максимальной гемолитической активности бацирцин 5 в липидном бислое находится в моноионизированном состоянии.

Разработана липосомная форма широко применяемого для снятии бронхоспазма р2-агониста - фенотерола - и исследована ее терапевтическая эффективность на экспериментальной модели бронхообструкции у крыс. Найдено, что его токсичность в составе липосом снижена, по крайней мере, в 15 раз по сравнению с его свободной формой.

Исследована роль главного белка легочного сурфактанта (SP-A) в векторной доставке липосом клеткам-мишеням в экспериментах in vitro; в его присутствии терапевтический эффект усиливается в 1.5-2 раза.

Практическая ценность работы. В результате исследования разработаны композиции липосомных иммуногенов и антигенов, полезных для получения антител, реагирующих с природным липидом А, с одной стороны, и способные потенциально блокировать патофизиологические последствия эндотоксического шока, с другой стороны. Полученные флуоресцентные зонды на основе моносахаридных аналогов липида А обладают полезными свойствами для исследования взаимодействия иерсинина с липидами мембраны, для описания его микроокружения.

Водорастворимые иммуностимуляторы на основе 4-ацилоксибутилфосфатов могут быть использованы как адъюванты лабораторного применения, они способны вызывать как специфическую стимуляцию иммунного ответа, так и неспецифическую, в дозах сравнимых

с природным липидом А. При этом эти соединения не обладают нежелательными эндотоксическими свойствами.

Разработанная липосомная форма фенотерола обладает пониженной токсичностью как минимум в 15 раз по сравнению со свободной его формой. При этом полностью сохраняется его эффективность в снятии бронхоспазма, в подавлении воспалительного процесса.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзной конференции "Липиды биологических мембран" (Ташкент, 1980), XII Менделеевском съезде (Баку, 1981), VII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1982), 16-ой Конференции ФЕБО (Москва, 1984), IV International Conference on Chemistry of Biologically Active Products (Budapest, 1987), International Symposium on Endotoxin (Tokyo, 1988), 10 World Congress on Animal Plant and Microbial Toxin (Singapore, 1991), VI Симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), Conference of International Endotoxin Society (Helsinki, 1994), 3-ем Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), XV Word Congress of Astmology (Montpellier, France, 1996), VII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997), Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), Symposium "EuroCarb 9" (Utrecht, 1997), 2-ом Биофизическом съезде (Москва, 1999)

Публикации результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы 22 статях в таких научных журналах как European J. Biochemistry, Биоорганическая химия, Carbohydrate Res., Experientia, Известия АН СССР, Сер. Хим., Химико-фармакологический ж., Biochimica et Biophysica Acta, Toxicon, а также в трех патентах в патентной литературе России. Кроме того в виде тезисов отдельные части работы опубликованы в материалах Всесоюзных, Российских и международных симпозиумов и конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в котором представлены основные направления использования липосом, 8 глав, посвященных результатам исследования, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает^Упубликации. Диссертация изложена на ¿</¿ стр. машинописного текста, содержит i f-таблиц и IS рисунков. Используемые в работе сокращения: АС4, АС7, АС12 и АС12:1 - ш-2-антрил-бутановая, гептановая, додекановая и додецен-11-овая кислоты; ANS - 8-анилин-1-нафтилсульфо-кислота, Chol - холестерин, CL -кардиолипин, DCP - дицетилфосфат, ЕРС - яичный фосфатидилхолин, LPL

- фосфолипиды легкого свиньи, NOS - NO-синтаза, NPN - 1-фениламинонафталин, OG - Р-октил-О-глюкопиранозид, РА - фосфатидная кислота, PC - фосфатидилхолин, PC 10 - 10-(1-пирен)-декановая кислота, РЕ

- фосфатидилэтаноламин, ROS - реактивные формы кислорода, SA -стериламин, SP-A - сурфактантный протеин А, АОК - антителообразующие клетки, БАС - бронхоальвеолярный смыв, БО - бронхообструкция, ДАНС -

5-диметиламино-1-нафтилсульфокислота, ДМХ - р-диметиламинохалкон, ЖК - жирные кислоты, ККМ - критическая концентрация мицеллообразования, КФ - 5(6)-карбоксифлуоресцеин, ЛПС липополисахарид, ЛФФ - липосомная форма фенотерола, МДА -малоновый диальдегид, ММК - 3-миристоилоксимиристиновая, ОМК - 3-гидроксимиристиновая, ПОЛ - перекисное окисление липидов, ПЭФ -передача энергии флуоресценции, РИЛЛ - реакция иммунного лизиса липосом, РПГ - реакция пассивного гемолиза, СОМ - специфическое освобождение маркера, ТНФ - тринитрофенил, ЭБ - эритроциты барана, ЭБО - экспериментальная БО.

1. Иммунобиологические свойства моносахаридных аналогов липида А.

1.1. Исследование иммунохимнческой активности.

Липид А ответственен за проявление эндотоксических свойств липополисахаридов, с которыми связывают весь спектр патофизиологических последствий инфекции грамотрицательными бактериями. Серологические исследования образцов липида А из различных бактерий показали наличие у них общей иммунодетерминантной группы. Было показано, что иммунохимические свойства липида А в основном связаны с остатком 3-гидроксимиристиновой кислоты (ОМК), ацилирующей аминогруппу глюкозамина.

Нами синтезированы простые моносахаридные аналоги липида (110), несущие фосфатную группу по первичной гидроксильной группе D-глюкозамина и варьирующие О- и N-ацильными заместители. Для выяснения влияния роли ЖК, ацилирующих гидроксигруппы в молекуле липида А, на его иммуностимулирующую активность нами синтезированы 4-ацилоксибутилфосфаты (11-14). Из ЖК выбраны миристиновая, ОМК, 3-миристоилоксимиристиновая (ММК) и 3-ацетилоксимиристиновая, как менее гидрофобный аналог ММК. Для сравнения было синтезировано соединение с этиленгликолевой основой (15). При исследовании иммунохимических свойств моносахаридных аналогов при взаимодействии с антителами к природному липиду А из Y. pseudotuberculosis в ингибировании реакции пассивного гемолиза (РПГ) оказалось, что соединение (1) ингибирует взаимодействие липида А со специфической сывороткой в концентрации большей, чем природный липид А (рис.1). Ингибирование не достигает 100%, так как это соединение вызывает неспецифический лизис эритроцитов в концентрациях выше 100 мкг/мл.

N-миристоильное производное (2) также взаимодействует с антителами к липиду А, хотя вызывает 50% ингибирование в большей концентрации, чем ОМК производное (1). Ранее на дисахаридных аналогах

липида А также была показана одинаковая серологическая активность для соединений с миристиновой кислотой и ОМК по аминогруппе.

нЯо

11 12

ОН

1.(С6Н5)2РОС1

2.С1ПН23СОС1

3.Н+

он

Ы=СНС6Н4(ОСН3)

ОРО(С6Н5)2

0 OR -ЫН2х НС1

1.Ю<

2.Н2/Р1

ОРО(ОН)

оя мня' (1-10)

он

ОСОСНз ОСОС13Н27

он

С„Н23СНКСН2СООСН2СН2СН2СН2ОРО(ОН)2

(11-15)

1 Н СОСН2СН(ОН)С„Н23

2 Н сос13н27

3 СОСНз СОСН2СН(ОН)СпН23

4 СОС„Н2, СОСНз

5 СОС„Н23 сос„н23

6 СОС„Н23 сос13н27

7 сос„н2, СОСН2СН(ОН)СпН23

8 СОС„Н23 СОСН2СН(ОСОС13Н27)С„Н23

9 СОСНз СОСН2СН(ОАС4)С„Н23

10 СОСиН23 СОСН2СН(ОАС4)СпН23

п 4 4 4 4 2

Было найдено также, что моносахаридный аналог липида, отличающийся от синтезированного нами (1) положением фосфатной группы, 1-фосфат Ы-З-гидроксимиристоил-О-глюкозамина

взаимодействует с антителами к липиду А. Этот факт подтверждает несущественную роль положения фосфата в молекуле для взаимодействия с поликлональными антителами. По-видимому, иммунодоминантной группой липида А при иммунизации животных природным гетерогенным липидом А является ОМК, ацилирующая аминогруппу глюкозамина.

0.1 1 10 100 1000 Концентрация, мкг/мл

Рис.1. Ингибирование гаптенами взаимодействия липида А из Y. pseudotuberculosis со специфической антисывороткой в РПГ.

в водных растворах отличалась от таковой в липосомной мембране. Одно из наиболее активных в липосомах аналогов (7) оказался слабым ингибитором реакции липида А со специфическими антителами в водном растворе. Его выраженный гидрофобный характер предполагает способность к агрегации в водных растворах, на это указывает уширение сигналов в его 13С-ЯМР-спектре. Поэтому было необходимо уточнить физико-химическое состояние этих соединений в условиях проведения биотестов.

Одной характеристик гидрофобно-гидрофильного баланса молекулы является критическая концентрация мицеллообразования (ККМ). Нами были определены эти значения с помощью флуоресцентного зонда 1-N-фениламинонафталина (NPN), данные приведены в таблице 1. Из приведенных данных можно сделать следующие выводы. Для соединений (1)и(12) с соотношением ЖК и фосфата = 1:1 производное глюкозамина имеет более низкое значение ККМ. Это, видимо, связано с большим сродством углеводных молекул друг к другу, по сравнению с производным бутиленгликоля. Замещение гидроксильных групп глюкозамина в соединении (1) остатками уксусной (3) и лауриновой (7) кислот на порядок и более снижает значение ККМ.

Таблица 1.

Значения ККМ для полученных соединений в 0,15 М КаС1, 0,01 М трис-НС1, рН 7,2 при температуре 25°С (в мкг/мл).

Соединение ККМ Соединение ККМ

1 3,6 И 41,0

2 0,9 12 570,0

3 0,36 13 440,0

6 0,088 14 77,0

7 0,025 15 59,0

Большую роль играет присутствие гидроксигруппы в жирнокислотной части: удаление её или замещение снижает ККМ для производных глюкозамина в 4 раза. Для производных бугиленгликоля этот эффект еще больше. Замена в ацилоксибутилфосфатах миристиновой кислоты в (11) на ОМК в (12) повышает ККМ более чем в 12 раз, ацетшшрование остатка ОМК незначительно влияет на физическое состояние, при ацшгаровании остатка ОМК миристиновой кислотой в (14) пороговая концентрация приближаются к таковой у (11). В этих соединениях различное соотношение ЖК/фосфат, но наличие ацилоксигруппы не сильно изменяет гидрофобность молекулы. По-видимому, в этом случае присутствие сложноэфирной группы в ЖК цепи сбалансировано длинной цепью бокового заместителя.

Подводя итог, можно сказать, что ККМ синтезированных соединений сильно зависит от наличия гидроксильной или ацилоксигруппы в ЖК части молекулы. Производные ОМК обычно имеют ККМ на порядок выше, чем соответствующие производные миристиновой кислоты. Для 6-фосфатов 1Ч-ацил-0-глюкозамина важно замещение гидроксильных групп углеводного кольца, что резко снижает значение ККМ. Поскольку эффективные концентрации гаптенов в иммунохимических тестах лежат в области 5-200 мкг/мл, то эти соединения взаимодействуют с антителами в мицеллярном состоянии.

Как описано выше, ККМ (1) и (2) составляет 3,6 и 0,9 мкг/мл, соответственно, и в эффективных концентрациях, используемых в биотестах, эти соединения находятся в мицеллярном состоянии. Следовательно, взаимодействие антител с иммунодетерминантной группой этих соединений происходит на поверхности раздела фаз. В мицеллярном состоянии область гидроксигруппы возможно не доступна для антител, и определяющей становится только амидная группа. Но присутствие ЖК является также важным, поскольку ацетамидный вариант 6-фосфата Ы-ацил-О-глюкозамина в этой тест-системе неактивен.

Замещение гидроксильных групп глюкозамина ацетатами резко повышает его гидрофобность. И хотя растворимость соединения (3) ниже,

его ингибирующая активность в РПГ возрастает (рис.1). Учитывая эту тенденцию, можно предположить, что трилаурат (7) должен быть еще более активным. Однако ингибирующая активность этого соединения проявляется при очень высоких концентрациях, и 50%-ое ингибирование достигается только при концентрации 200 мкг/мл. Это высокое значение эффективной концентрации, по сравнению с триацетатом позволяет предположить, что организация и упаковка агрегатов соединения (7) такова, что доступность иммунодетерминантной группы для антител значительно ниже, чем для соответствующего триацетата.

Для изучения иммунохимических свойств липидов широко используются липосомы, в которых амфифильные соединения ориентированы в мембране строго определенным образом. Для исследования более гидрофобных аналогов нами были использованы липосомы из яичного лецитина и холестерина в соотношении 2:1,5 для включения в них синтетических аналогов. Для придания отрицательного заряда мембране и предотвращения спонтанного слияния липосом использовали дицетилфосфат в количестве 10% от используемого лецитина. Ранее было найдено, что такая композиция обладает при комнатной температуре достаточной подвижностью компонентов. Соединения (2) и (1) не включали в липосомы из-за их высокой ККМ, и, как следствие, их высоких лизирующей свойств. Липосомы, содержащие синтетические гаптены, получали "активным" встраиванием синтетических аналогов, т.е. необходимое соотношение гаптен/фосфолипид получали смешением компонентов до получения липосом. Оптимальное соотношение гаптена к фосфолипидам составляло 0.3 моль/моль фосфолипида. Как видно из рисунка 2, более высокая концентрация гаптена снижает ингибирующую активность липосомных препаратов, по-видимому в следствие стерических затруднений взаимодействия антител с этим типом антигенов. При более низкой эпитопной концентрации ингибирующая активность не только не повышалась, но и снижалась, что, по-видимому, связано с относительно большим количеством липосом, вводимых в реакцию, или с несоответствием латеральной концентрации гаптена на поверхности липосом дистанции связывающих центров иммуноглобулинов. Оба соединения (3) и (7) в липосомах с одинаковой эпитопной плотностью в различной степени взаимодействуют с антителами к липиду А в РПГ. Липосомы с другими трилауратами, содержащими по аминогруппе ацетил- (4), лауроил- (5) и миристоилгруппу (6), не проявляли ингибирующей активности в этом тесте. Если для проявления иммунохимической активности моноацильным производным в водных растворах природа ЖК неважна, то для липофильных гаптенов присутствие гидроксильной группы в амидном заместителе обязательно. Ингибирующая активность триацетата (3) в липосомах ниже, чем в водных растворах. Это, по-видимому, связано, с одной стороны, с недоступностью всех молекул гаптена для антител на внутренней стороне бислоя липосом,

а, с другой стороны, меньшей выраженностью иммунодетерминантной группы на поверхности липосом, так как амидная ЖК является основным гидрофобным якорем для молекулы.

100

Я п> Я

О &

я 5

50 -

0.3 моль/моль РС 0.2 моль/моль РС 0.1 моль/моль РС 0.4 моль/моль РС

6 8 10 12 14 16 18 20 Концентрация, мкг/мл

Рис.2. Ингибирование РПГ липосомами, сенсибилизированными

тетраацильным аналогом (7).

Активность трилаурата (7) в липосомном бислое резко возрастает, и его концентрация 50%-ного ингибирования достигает 9 мкг/мл. По-видимому, это соединение в липосомном бислое имеет такую ориентацию, что его иммунодетерминантная группа экспонирована над плоскостью мембраны и доступна для взаимодействия с антителами в большей степени, чем его соответствующий триацетат, т.е. три остатка лауриновой кислоты и один остаток ОМК так организованы в бислое, что область гидроксильной группы ОМК не входит в тесно упакованные полиметиленовые цепи общих фосфолипидов.

Природный липид А проявляет более высокую активность. Наличие дисахаридной основы и различных заместителей, в том числе, эфиров ОМК, ММК фосфатных групп обеспечивает большее сродство для специфических антител. В исследуемой поликлональной антисыворотке к липиду А возможно присутствуют антитела с различной аффинностью и авидностью. Поскольку синтетические аналоги на 100% ингибируют взаимодействие этих антител с липидом А в тест-системе, все эти антитела перекрестно реагируют с общей иммунодетерминантной группой синтетических аналогов. Из рассмотренных данных можно сделать следующие выводы. Во-первых, для взаимодействия с антителами к липиду А в молекулах гаптенов важное значение имеете липофильное окружение иммунодетерминантной группы. Ацилирование гидроксильных групп

глюкозамина усиливает взаимодействие (3) с антителами к липиду А в водных растворах. Во-вторых, взаимодействие становится более специфичным, поскольку в липосомах не активны соединения без остатка ОМК, связанной с аминогруппой.

Ингибирование РПГ связано с конкуренцией исследуемых гаптенов и липида А, нанесенного на клеточную поверхность эритроцитов, за взаимодействие со специфическими антителами к липиду А. Для исследования реакции синтетических гаптенов с антителами к липиду А был предложен прямой метод изучения связывания липидных антигенов с антителами - лизис сенсибилизированных липосом в присутствии специфических антител и комплемента. Количественной характеристикой реакции является выход включенного во внутреннюю водную фазу липосом гидрофильной метки - 5(6)-карбоксифлуоресцеин (КФ), который не обладает мембранотропным действием, не мешает прохождению иммунной реакции и не взаимодействует с компонентами сыворотки

Для проведения реакции иммунного лизиса липосом (РИЛЛ), использовали смесь лецитин-холестерин-дицетилфосфат (2:1.5:0.22, в молях). Большие моноламеллярные липосомы получали методом обращения фаз в 0.125 М КФ. Источником комплемента служила сыворотка морских свинок, сохраняемая при -20°С в течение месяца. Результаты РИЛЛ в оптимизированных условиях приведены на рис. 3.

Антисыворотка, мкл

Рис.3. Взаимодействие липосомных антигенов с антителами к липиду А в оптимизированных условиях проведения РИЛЛ. Реакционная смесь состоит из 40 мкл специфической антисыворотки, 20 мкл липосом (0.4 мкг РС/ мл), сенсибилизированных липидом А (20 мкг/мкмоль лецитина) и 50 мкл комплемента (1:60).

В таблице 2 приведены результаты РИЛЛ в зависимости от эпитопной плотности липида А в липосомном антигене. Следует отметить, что при эпитопной плотности липида А 5 мкг на мкмоль фосфатидилхолина и меньше специфическое освобождение маркера (СОМ) снижается, и не вся популяция липосом лизируется в избытке антисыворотки.

Таблица 2.

СОМ (%) в РИЛЛ с различной эпитопной плотностью липида А в

липосомной мембране_

Количество АТ к Эпитопная плотность липида А (мкг/мкмоль РС)_

липиду А(мкл) 1,3 2,5 5 10 20 40

0,02 - - - - 19 23

0,08 3 3 3 5 40 41

0,32 7 6 14 16 48 46

1,25 12 15 24 26 56 49

5,0 22 23 31 46 57 49

20.0 22 24 37 58 58 50

При эпитопной плотности выше 20 мкг/мкмоль эффективность РИЛЛ также снижается вследствие повышенной текучести липосом при высоких концентрациях липида А. Оптимальное значение эпитопной плотности достигается при содержании 20 мкг гаптена на мкмоль лецитина. Реакция достоверно отмечается в присутствии 0,02 мкл антисыворотки, что в пересчете на объем реакционной среды 250 мкл составляет разведение 1:12500. Для сравнения в РПГ титры сыворотки составляют 1:1250, т.е. чувствительность РИЛЛ на порядок выше.

Таблица 3.

Взаимодействие синтетических аналогов в липосомном бислое с антителами к липиду А (в % СОМ)_

Гаптен

Количество антисыворотки (мкл) (3) (7) (8) (6)

0,08 2 1 3 1

0,32 12 8 10 3

1,3 17 25 22 7

5,0 28 43 45 12

20,0 32 54 52 12

40,0 35 56 55 12

Аналоги (3) и (7) были проверены в этой тест-системе. Они

взаимодействуют с антисывороткой к липиду А, но проявляют меньшею активность, чем липид А. В таблице 3 приведены данные по иммунохимической активности гаптенов в липосомном бислое, О-ацетильное производное (3) проявляет меньшую активность в РИЛЛ, как и в ингибирование РПГ. Это еще раз подтверждает, что организация этого

соединения в бислое иная, чем у более липофильного (7). Почти аналогично взаимодействуют аналоги с ОМК и ММК по аминогруппам (7,8) у них одинаковое максимальное СОМ. Их сходная реактивность говорит о широкой специфичности антител к липиду А и, возможно, о наличии в сыворотке антител с различной аффинностью. Как и в торможении РПГ соединение с миристиновой кислотой по аминогруппе (6) практически не активно в РИЛЛ (рис. 3). Неспецифическое лизис, вызываемый дезактивированным комплементом или нормальной сывороткой не превышал 5-12%.

Из изложенного выше видно, что синтетические трилаураты (7,8) с остатком ОМК или ММК по аминогруппе перекрестно реагируют с антисывороткой к липиду А в прямой РИЛЛ и, косвенно, - в торможении РПГ. Соединение (3) с О-ацетильными заместителями менее активно, а без остатка ОМК по аминогруппе - не активно в липосомной модели. Таким образом, соединения (7,8) обладают иммунохимической активностью липида А и могут быть использованы для тестирования возникающих к нему антител при определенных патологиях. С другой стороны, они могут быть использованы для создания иммуногенов с целью получения специфических антител к токсической липидной части липополисахаридов для использования их в качестве агентов, снижающих эндотоксический шок при сепсисе и других аналогичных патологиях.

1.2. Иммуногенные свойства синтетических аналогов.

Следующим этапом наших исследований было получение иммуногена на основе гаптенов (7) и (8) и антисыворотки к ним. Поскольку эти соединения проявляют высокую иммунохимическую активность в липосомном бислое, мы использовали эту конструкцию для иммунизации животных. Сами липосомы являются адъювантами, но при использовании липида А в липосомном иммуногене была получена антисыворотка с высокими титрами антител к компонентам липосом. Это связано с сильным адъювантным эффектом липида А. В липосомном иммуногене он одновременно играет роль и гаптена, и адъюванта. Обычно для усиления иммунного ответа к липидным антигенам последние комплексируют с метилированным бычьим сывороточным альбумином (мБСА), являющийся поликатионом, т.е. противоионом для большинства фосфолипидов. Этот же прием мы использовали при иммунизации искусственным иммуногеном на основе синтезированных моносахаридных аналогов липида А.

Для иммунизации кроликов получали препараты следующего состава: лецитин - холестерин - дицетилфосфат - гаптен (7) (120:90:1,3:2,5, мкмоль/мкмоль) для А и Б, в соотношении (12:9:1,3:2,5, мкмоль/мкмоль) для иммуногенов В и Г. Иммуногены А и В суспендировали в 4 мл физиологического раствора, а Б и Г - в 4 ил 0,5% мБСА. Иммуноген (Д) на

основе (8) был получен аналогично препарату Б. Результаты иммунного ответа к этим иммуногенам приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Кинетика иммунного ответа кроликов, иммунизированных иммунногенами А-Д в реакции с липидом А. Данные РИЛЛ в %СОМ для 20 мкл сыворотки День забора_Иммуногены

крови А Б В Г Д

3 3 8 5 3 9

6 5 19 8 13 26

11 8 33 13 21 40

15 13 68 18 29 46

20 13 55 16 25 40

80 11 25 12 15 37

Иммунизация липосомами с эпитопной плотностью 20 мкг/мкмоль лецитина дает наиболее активную сыворотку. Максимальный ответ наблюдается на 15 день, уровень антител сохраняется еще на 80-й день, хотя активность антисывороток падает. Комллексирование липосом с мБСА повышает иммунный ответ к антигену. Кинетика иммунного ответа к иммуногенам Б и Д имеет несущественные различия.

Таблица 5.

РИЛЛ, сенсибилизированных (7) и (8) и липидом А с антисывороткой к иммунногенам Б и Д (в %СОМ)_

Количество (мкл) Липосомы, сенсибилизированные_

_(7)_(8)_липидом А

антисыворотка к (7)

0,02 2 3 3

0,08 13 в 9

0,32 25 12 27

1,3 40 26 36

5,0 59 38 43

20,0_63_45_44

антисыворотка к (8)

0,02 3 4 5

0,08 3 8 10

0,32 10 30 29

1,3 21 49 51

5,0 44 60 60

20.0 44 61 62

Далее в работе использовали антисыворотки, полученные на 15 день после иммунизации. Данные по специфичности и перекрестной реактивности полученных сывороток приведены в таблице 5.

Антисыворотки, полученные к иммуногенам Б и Д, способны реагировать с синтетическими аналогами (7), (8) и липидом А, но не взаимодействуют с липосомами без гаптена или с липосомами, сенсибилизированными (6). Это говорит о том, что при иммунизации липосомными иммуногенами на основе синтетических моносахаридных аналогов липида развивается ответ только к остаткам ЖК, связанными с аминогруппой, при этом ответ к липосомной основе не отмечается. Перспективной представляется антисыворотка к (8), которая обладает сравнимой активностью как к своему гаптену, так и к природному липиду А. Даже в разведении 1:280 она реагирует с липосомным липидом А, и ее можно использовать не только для обнаружения липида А, но и для его нейтрализации при эндотоксическом шоке.

1.3. Иммуномодулирующне свойства синтезированных соединений.

Липид А является мощным адъювантом. Его адъювантные свойства во многом связаны с наличием остатков ЖК в его молекуле, при омылении которых активность липида А резко падает. Синтезированные нами производные глюкозамина, содержащие ОМК по аминогруппе со свободными гидроксильными группами (1) или О-ацилированные -триацетат (3) или трилаурат (7), в свою очередь было интересно сравнить по их иммуностимулирующей активности. В качестве метода тестирования был выбран метод локального гемолиза Ерне с модификациями Каннингхема для определения специфических антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей после иммунизации антигеном с и без адъюванта. Липосомы сенсибилизировали е-тринитрофенил-аминокапроил-РЕ (ТНФ-РЕ). Тринитрофенилированные липосомы состава лецитин-холестерин-дицетилфосфат (2:1,5:0,22 моль/моль) с ТНФ-РЕ и синтетическим адъювантом из расчета по 20 мкг/мкмоль ФХ получали по Хуангу. Животным внутрибрюшинно вводили дозу липосом, содержащих по 10 мкг ТНФ-РЕ и адъюванта. Как видно из таблицы 6, количество АОК к ТНФ-сенсибилизированным

Таблица 6.

Стимулирующее действие липида А и его аналогов на иммунный ответ к ТНФ-липосомам

Соединение Количество АОК

На 106 клеток К* На селезенку (х10"э) К*

Без адъюванта 136±45 1.00 16.113.1 1.00

Липид А 438±65 3.17 75.218.0 4.67

(7) 221±54 1.60 26.112.6 1.62

(8) 249166 1.80 31.612.8 1.96

К* - коэффициент усиления.

эритроцитам барана (ЭБ) у животных, иммунизированных в присутствии липида А увеличивалось в 3,2-4,6 раза относительно контроля. В то же время О-лауроильные производные (7) и (8) усиливают имунный ответ к ТНФ-липосомам в 1,6-2 раза, т.е. эти соединения являются более слабыми адъювантами, чем липид А. В этих условиях активность триацетата (3) была минимальна и количество АОК не превышало контрольного. Дез-О-ацилированный вариант (1) в этих условиях трудно исследовать из-за его лизирующего действия на липосомы. Для исследования активности (1) мы использовали традиционный метод, т.е. внутрибрюшинное введение отдельно адъюванта и эритроцитов барана (ЭБ) в качестве антигена. Из рисунка 4 видно, что соединение (1) показывает максимальную активность в дозе 200 мкг/мкмоль, при которой оно усиливает иммунный ответ к ЭБ более чем в 3 раза. В дозах менее, чем 20 мкг/мкмоль, это соединение не проявляет адъювантной активности. Если сравнить

иммуностимулирующую активность его трилауроильного аналога (7), то видно, что уже в дозе 10 мкг/мкмоль оно усиливает ответ к липосомном антигену в 1,6 раза. При этой дозе (1) не проявляет активности.

"липид А

100

Доза, мкг/мышь

1000

Рис.4. Зависимость количества АОК к ЭБ в селезенках мышей линии СВА от введенного адъюванта

Сравнивая эти данные с предыдущими экспериментами, можно сказать, что для проявления адъювантной активности необходимы кроме Ы-ацильных заместителей, другие элементы структуры липида А. Хотя полученные соединения и проявляют иммуностимулирующие свойства, их адъювантность значительно меньше, чем липида А. И при иммунизации этими соединениями, включенными в липосомы, иммунный ответ к липосомному носителю незначителен.

Минимальной структурной единицей липида А, еще проявляющей иммуностимулирующую активность, является фосфорилированный остаток Ы-гидроксимиристоил-О-глюкозамина. О-Ацилирование его ЖК усиливает адъювантную активность. Для выяснения влияния ЖК, ацилирующих гидроксигруппы в молекуле липида А, на его иммуностимулирующую активность мы исследовали синтезированные 4-ацилоксибутилфосфаты (11-14). Из ЖК выбраны миристиновая, ОМК, ММК и 3-ацетилоксимиристиновая, как менее гидрофобный аналог ММК. В качестве антигена использовали ЭБ. Данные приведены в таблице 7. Все исследованные соединения стимулируют иммунный ответ, хотя и не достигают активности липида А. ОМК-производное (12) обладает наибольшим адъювантным действием и приближается по активности к липиду А. Это соединение можно использовать как перспективный иммуностимулятор лабораторного применения. Ацетилирование гидроксильной группы в соединении (13) резко снижает активность, что проявляется как в уменьшении коэффициента усиления, так и в увеличении оптимальной дозы. ММК-производное (14) имеет наименьшую оптимальную дозу и в этом сравнимо с природным липидом А. Самое простое из данной серии соединение (11) имеет коэффициент усиления 3 -3,3 в дозе 10 мкг/мышь, а его аналог на основе этиленгликоля (15) - гораздо меньший. По-видимому, это связано с большей сближенностью амфипатических заместителей в молекуле последнего. Таким образом, производные, содержащие эфиры ОМК и ММК, оказались наиболее активными, что, подтверждает исключительную роль остатков этих кислот в иммуностимулирующей активности липида А.

Сравнение ККМ 4-ацилоксибутилфосфатов (11-14) не обнаруживает какой-либо корреляции между адъювантной активностью и их физико-химическим состоянием. Соединения с близкими значениями ККМ (11) и (15) имеют различные коэффициенты иммуностимуляции, также как и соединения (12) и (13), имеющие различные эффективные дозы.

Одновременно со стимуляцией специфических АОК липид А способен вызывать поликлональную активацию В-клеток в отсутствие антигена. Эта активность также исчезает при удалении эфиров жирных кислот из молекулы липида А. Наиболее активные адъюванты были проверены на способность их вызывать поликлональную активацию В-лимфоцитов. Как видно из таблицы 8, при введении их мышам достоверно возрастает количество фоновых АОК, специфичных и к ЭБ и к ТНФ-гаптену. Исключение составляет дез-О-ацилированный аналог (1) (коэффициент увеличения которого не более 1.16).

Для трилауратов (7) и (8) были взяты две дозы, поскольку иммуностимулирующая активность их исследовали на липосомной модели. Оказалось, что они активнее при дозе 200 мкг/ мышь, чем 20 мкг/мышь.

Таблица 7

Стимулирующая активность липида А И ацилоксибутилфосфатов на имунный ответ мышей линии СВА к эритроцитам барана.

Соединение Доза, Количество АОК

мкг/мышь На 106 клеток К* На селезенку(х10";!) К*

Без 31.3±4.2 1.00 5.5+3.5 1.00

адъюванта

Липид А 4 84.1+13.2 2.69 18.7±4.7 3.40

10 128.0+12.6 4.08 22.6+5.1 4.00

20 145±43.1 4.60 22.3±3.2 4.40

11 4 79.7+4.1 2.55 14.3+1.2 2.63

10 92.0±3.0 2.94 17.6±2.3 3.23

20 104.4+5.1 3.34 16.8±4.6 3.08

50 84.0±5.3 2.69 16.9±3.0 3.09

100 33.212.2 1.06 5.7+2.2 1.05

12 4 73.3+7.4 2.34 11.2+5.3 2.05

10 113.0±12.6 3.61 21.2±5.2 3.89

20 102.5±16.9 3.28 15.5+3.0 3.19

50 41.3±6.7 1.32 8.5±1.5 1.56

100 37.6±5.9 1.20 8.5±1.3 1.50

13 10 37.7+5.4 1.21 12.3±1.2 2.26

20 60.5+4.4 1.99 12.4±4.0 2.28

50 71.2+5.3 2.28 15.6±0.6 2.87

100 19.5+9.2 0.69 5.3+0.8 0.98

14 2 46.4+7.8 1.49 9.1±2.1 1.60

4 102.5+1.2 3.20 17.4+1.0 3.19

10 54.9+8.1 1.75 10.3±4.5 1.88

20 44.8+5.6 1.44 8.8+1.2 1.60

50 39.6±1.3 1.27 8.3±0.7 1.51

15 4 44.4+7.8 1.42 7.2+0.9 1.31

10 57.9+3.8 1.85 9.1+2.1 1.66

20 65.7+2.1 2.10 10.711.8 1.95

50 54.5+4.2 1.74 9.411.9 1.71

100 37.9+6.9 1.21 6.212.1 1.13

К* - коэффициент усиления

Соединение с остатком ММК по аминогруппе (8) более активно, по сравнению с ОМК-аналогом (7), особенно в низких дозах. Сравнение аналогов со сложноэфирной связью этих ЖК: (12) и (14), показывает большую активность ММК производного. Последнее соединение по

активности приближается к природному липиду А, коэффициент усиления его достигает 2,8-3,1.Таким образом подтверждается ключевая роль О-ацильных заместителей в ОМК в проявлении способности активировать В-лимфоциты. Производные бутиленгликоля с ОМК (12) и ММК (14) оказались способны стимулировать В-клетки. Как видно из таблицы 9, заметным митогенным

Таблица 8

Стимуляция неспецифического иммунитета мышей линии СВА к ЭБ и к ТНФ-ЭБ синтетическими аналогами и липидом А

Соединение Доза АОК к ЭБ

мкг/мл На 106 клеток К* На селезенку (хЮ"3) К*

Контроль - 953173 1,00 183110 1,0(

липид А 20 30401137 3,19 590129 3,2?

1 200 1021194 1.07 202117 1.1:

7 200 23251151 2.44 387131 2.1^

20 1496163 1.57 293122 1.6:

8 200 24301129 2.55 488132 2.71

20 20111117 2.11 418135 2.з:

12 20 2155153 2.24 416131 2.з:

14 20 27921201 2,93 562123 зл:

АОК к тринитрофенилированным ЭБ

Контроль — 9.410.9 1.00 1.79+0.41 1 .ОС

Липид А 20 27.011.4 2.84 5.4010.81 3.0(

1 200 11.511.2 1.21 2.1011.22 1.1<

7 200 22.311.1 2.35 4.3111.75 2.3е.

20 16.312.1 1.72 2.8911.34 1.6]

8 200 22.711.8 2.39 4.4211.61 2.4^

20 18.911.1 1.99 3.6011.68 2.0(

12 20 17.212.1 1.81 3.7011.31 2.0(

14 20 26.111.6 2.75 5.1211.17 2.8:

К* - индекс увеличения

действием обладает только (14). По-видимому, в проявлении этой активности липидом А определенное значение имеют остатки ацилоксимиристиновых кислот, замещающие С-З-гидроксильные группы в глюкозаминобиозной основе природного липида.

Подводя итог, можно сказать, что фосфат Ы-ацил-О-глюкозамина является минимальной структурной единицей, способной взаимодействовать с поликлональными антителами к липиду А. Присутствие ацильных заместителей, с одной стороны, повышает специфичность их взаимодействия в липидном бислое с антителами, а с другой стороны,

усиливают иммуностимулирующую активность и способность вызывать поликлональную активацию В-лимфоцитов.

Таблица 9

Митогенное действие синтетических аналогов и липида А на В-лимфоциты._

Соединение Доза мкг/мышь Количество включенного 3Н-тимидина (имп/мин) Коэффициент увеличения

Контроль 540+28 1.00

Липид А 50 3585+131 6.88

10 3317+112 5.40

1 2196179 4.07

14 10 3795±83 7.03

1 2220±73 4.11

0.1 1466±101 2.73

12 100 930+210 1.73

10 701192 1.30

1 500187 0.93

2. Ориентация синтетических аналогов (3) и (7) в липосомной

мембране.

Как уже обсуждалось выше, иммунохимическая активность синтетических аналогов зависит от их физико-химического состояния. ККМ соединений подтверждает, что в воде они взаимодействуют с антителами в мицеллярном состоянии. Особенный интерес представляют трилаураты (7) и (8), показавшие хорошие результаты при иммунизации животных липосомным антигеном. По сравнению с ними триацетат (3), имеющий общую иммунодетерминантную группу (остаток ОМК по аминогруппе) проявляет меньшую активность. Его гидрофобно-гидрофильный баланс и, как следствие, физико-химическое состояние в липосомной мембране отличаются от трилаурата (7).

В полностью гидратированном состоянии в супермицелярных концентрациях соединение (7) организовано в плоские бислои. Разрыв бислоя в замороженном состоянии проходит по гидрофобной области и на фотографии (рис.5) видны ступени плоско упакованных бислойных структур.

При температуре проведения иммунохимических экспериментов (25°С) молекулы (7) упорядочены в бислои, которые находятся в гелевом состоянии. Это видно из термограммы, приведенной на рис.6. Резко выраженный перелом в области 42-56°С говорит о структурной перестройке бислоя с точкой фазового перехода при 48°С. При температурах ниже точки фазового перехода подвижность ацильных цепей очень ограничена, латеральная диффузия молекул ограничена, что препятствует их взаимодействию с антителами.

Рис.5. Электронная микрофотография суспензии (7) (40 мкг/мл) в физиологическом растворе.

Температура, С

Рис.6. Зависимость флуоресценции ФНА (10"6 М) в суспензии соединения (7) (4x104 М) от температуры. Скорость нагрева: 3°С/мин.

Это, видимо, является одной из причин пониженной активности этого гаптена в ингибировании РПГ (см. рис.2). При встраивании его в бислой яичного лецитина, который при комнатной температуре находится в жидкокристаллическом состоянии, подвижность молекул повышается и облегчается образование специфического комплекса с иммуноглобулинами.

Чтобы сравнить положение двух гаптенов (3) и (7) в липидном бислое, мы использовали тот факт, что яичный лецитин при 20 -25°С находится в жидкокристаллическом состоянии, в отличие от соединений с насыщенными ЖК, которые находятся в гелевом состоянии в этих условиях. При встраивании гаптенов (3) и (7) в липосомы из яичного лецитина микровязкость бислоя будет увеличиваться, и глубину этого

эффекта можно исследовать по увеличению поляризации набора флуоресцентных зондов. Для исследования глубины погружения синтетических гаптенов

в липосомную мембрану мы использовали ю-2-антрил-ЖК (АС4, АС7 и АС12), как маркеры микровязкости смешанных бислоев, содержащих до 25% гаптенов.

Как видно из рисунка 7, оба гаптена вызывают возмущение бислоя, но в разной степени. Это говорит, во-первых, о том, что они встраиваются регулярно в

3 7 11

Глубина погружения

Рис. 7. Зависимость поляризации зондов АС4, АС7 и АС12 (10"6 М) от состава липосом (2x10"4 М): яичный лецитин-гаптен (3:1, по весу).

бислой, во-вторых, что трилаурат (7), подобно липиду А, возмущает бислой на большей глубине, а триацетат (3) располагается ближе к поверхности.

Такой эффект не объясняет повышенную иммунохимическую активность трилаурата (7) в липосомах. Если учесть, что в триацетате (3) "липидным якорем" является единственная ЖК, одновременно определяющая его иммунохимическую активность, то можно предположить, что область гидроксигруппы ОМК в соединении (3) экранирована полярной областью бислоя в большей степени, чем в соединении (7). Три остатка лауриновой кислоты рядом с иммунодетерминальной группой в (7) обеспечивают такую специфическую упаковку, что область амидной и гидроксигруппы ОМК становится более доступна для взаимодействия со специфическими иммуноглобулинами, чем в триацетате (3).

Более детальное исследование экспанированности иммунодетерминантной группы относительно поверхности мембраны в липосомных антигенах было проведено с синтезированными флуоресцентными аналогами (9) и (10). Известно, что введение флуоресцентной метки может вносить возмущение в структурную организацию исследуемого липида, которое может привести к артефактным выводам. Сравнимая иммунохимическая активность трилаурата с ОМК (7) и с ММК (8) по аминогруппе позволяет предположить, что ацилирование флуоресцентномеченной кислотой гидроксигруппы ОМК в (4,7) не внесет существенных изменений в физико-химические характеристики. АС4 была выбрана из соображений сближенности флуорофора и иммунодетерминантной группы. При включении в мембрану флуоресценция соединений (9) и (10) по разному тушится "поверхностным" зондом - р-диметиламинохалконом (ДМХ). Из графиков Штерна-Фольмера рассчитаны кажущиеся константы тушения (К). Для трилаурата (10) она максимальна и соответствует 526±11 мкМ"1, для антрилбутановой кислоты минимальна - 156+12 мкМ"1, для триацетата (9) оказалась равной 345±17 мкМ'1. Таким образом, скорость тушения флуоресценции падает в ряду: (10) > (9) > АС4, т.е. флуорофор трилаурата (10) располагается в липидном бислое ближе к границе раздела фаз, чем триацетата (9), и, тем более, чем АС4.

Именно этим объясняется стерическая затрудненность взаимодействия иммунодетерминантной группы (3) с антителами. Трилаурат (7) ориентирован в бислое так, что его гидроксигруппа при С-3 атоме ОМК располагается выше относительно области полярных групп фосфолипидов, чем для (3) и карбоксигруппа для АС4.

Таким образом, из экспериментов по тушению флуоресценции производных (9) и (10) можно объяснить повышенную иммунохимическую активность трилаурата (7) в липосомах, по сравнению с соответствующим триацетатом (3), поскольку антраценовое ядро в трилаурате (10) располагается ближе к поверхности липосомного бислоя, и, как следствие, иммунодетерминантная группа его в большей степени экспонирована на поверхности мембраны и доступна для взаимодействия со специфическими антителами.

3. Взаимодействие иерсинина с флуоресцентными аналогами липида А

Перекрестная реакция аналогов (7) и (8) с антителами к липиду А предполагает структурное подобие этих соединений молекуле липида А, этими свойствами должно обладать и антрилпроизводное (10). Последнее, таким образом, можно считать флуоресцентным зондом со специфичностью липида А.

Липид А в бактериальной мембране тесно ассоциирован с иерсинином, основным белком-порином внешней мембраны У.

pseudotuberculosis, и полученный флуорозонд (10) можно использовать для описания липид-белкового взаимодействия в биомембранах или протеолипосомах. Повышенное сродство этого зонда к иерсинину по сравнению с АС4 и триацетатом (9) было доказано экспериментами по передаче энергии флуоресценции (ПЭФ) с остатков триптофана белка на 2-антрилгруппу.

Иерсинин - поробразующий белок мембраны Y. pseudotuberculosis является интегральным и во внешней мембране тесно ассоциирован с липополисахаридом. Водонаполненная пора собрана из трех субъедениц по 40 kDa каждая. Выделенный в чистом виде этот белок спонтанно встраивается в мембрану, вызывая увеличение ее проводимости. Такой гидрофобный белок в водных растворах стремится к агрегации и его исследование обычно проводится в мицеллах детергентов или в гидрофобном окружении липидного бислоя.

В качестве фосфолипида был выбран яичный лецитин, который дает устойчивые липосомы с высокодинамичным бислоем при комнатной температуре. Хотя, возможно, другие отрицательнозаряженные липиды, входящие в состав внешней мембраны грамотрицательных бактерий (например фосфатидилглицерин) могут быть более специфичны для интегрального белка. Протеолипосомы получали удалением неионного детергента - Р-октил-О-глюкопиранозида (OG) - из мицеллярных растворов белок-липид-детергент контролируемой гельфильтрацией на сефадексе G-50, так как предварительные эксперименты показали, что этим методом получаются более стабильные липосомы с удовлетворительными свойствами. Липосомы, полученные при диализе, были большего размера и оседали во время проведения эксперимента. Протеолипосомы дополнительно очищали хроматографией на сефарозе CL-4B для отделения невключенных в липосомы компонентов, соотношение белка к липиду в конечном препарате не отличалось от исходного.

Для получения протеолипосом с иерсинином, выделенным экстракцией OG из пептидогликан-белкового комплекса К pseudotuberculosis, использовали два соотношения белок-липид (моль мономера иерсинина/моль фосфолипида 1:40 - протеолипосомы А и 1:400 -протеолипосомы Б). В протеолипосомах А из-за высокого содержания белка липидный бислой должен иметь повышенную микровязкость. Для доказательства встраивания иерсинина в бислой была исследована поляризация зондов с различной глубиной погружения флуорофора. Как видно из таблицы 10, в протеолипосомах А присутствие белка тормозит свободную вращательную диффузию всех зондов, по сравнению с бислоем чистого лецитина. Из этого можно сделать вывод, что иерсинин встраивается в бислой трансмембранно.

В исследованиях по встраиванию иерсинина в мембрану было необходимо установить положение собственных хромофоров белка - двух остатков триптофана, входящих в состав молекулы мономера иерсинина. В

водных растворах, в мицеллах детергента и в протеолипосомах максимумы флуоресценции белка находятся в районе 330-350 нм, что говорит о достаточно гидрофильном окружении остатков триптофана. Это же подтверждают эксперименты по тушению собственной флуоресценции белка "поверхностным" зондом - ДМХ. Данные приведены на рисунке 8.

Надо отметить, во-первых, что оба остатка триптофана одинаково доступны для ДМХ, что следует из линейности графиков Штерна-Фольмера. Во-вторых, что флуорофоры белка не сильно меняют свое окружение в протеолипосомах, по сравнению с водными растворами. Вследствие большей вязкости бислоя кажущаяся константа

Таблица 10.

Поляризация зондов АС4, АС7 и АС12 в липосомах и протеолипосомах.

Препарат АС4 АС7 АС12

Липосомы 0.073±0.012 0.046±0.016 0.064+0.015

Протеолипосомы А 0.228±0.019 0.231±0.022 0.187±0.023-

Протеолипосомы Б 0.085+0.020 0.113+0.021 0.096±0.021

« 0.15 М НаС1

Д.ЧХ, мкМ

Рис. 8. Зависимость флуоресценции препаратов иерсинина (100 мкг/мл) от концентрации ДМХ в координатах Штерна-Фольмера

тушения в протеолипосомах А меньше, чем в протеолипосомах Б. Ширина полосы флуоресценции белка в протеолипосомах и растворе детергента меньше, чем в водном растворе, что говорит о большей однородности распределения флуорофоров иерсинина в присутствии амфифильных соединений. Как отмечалось выше, в протеолипосомах иерсинин пронизывает бислой трансмембранно, и, в то же время, остатки триптофана находятся вблизи границы раздела фаз, попадая в сферу тушения ДМХ.

Одним из способов подтверждения этого факта является установление дистанции безизлучательной синглет - синглетной передачи энергии флуоресценции (ПЭФ) между парой донор-акцептор. Остатки триптофана в иерсинине могут служить донором энергии флуоресценции антраценового ядра зондов. Поскольку оба остатка триптофана в мономере иерсинина одинаково доступны для ДМХ, можно рассчитать усредненную дистанцию ПЭФ между ними и антрил-зондами.

Эксперименты по ПЭФ проводились с различным соотношением донора к акцептору с вычислением предельных значений эффективности ПЭФ (Е). Из графиков зависимости обратных величин Е и концентрации зонда определяли максимально достижимое значение Е. С помощью набора зондов АС4,АС7 и АС12 в экспериментах по ПЭФ мы определили, что остатки триптофана иерсинина в липосомной мембране ближе всего располагаются к АС4, данные приведены в таблице 11.

Таблица 11.

ПЭФ остатков триптофана иерсинина (10"6 М) на антрил-зонды (АС4, АС7, АС12, 9,10)

Донор Акцептор Е

Белок АС4 0.377±0.032

АС7 0.400±0.051

АС12 0.435±0.048

9 0.625±0.043

10 0.588±10041

Протеолипосомы А АС4 0.588±0.064

АС7 0.417±0.037

АС12 0.270±0.035

9 0.606±0.042

10 0.769±0.038

Протеолипосомы Б АС4 0.555±0.072

АС7 0.377±0.028

АС12 0.236±0.035

9 0.645±0.036

10 0.833±0.026

Следует отметить, что Е для каждого зонда близка в протеолипосомах с различной концентрацией белка, наибольшие значения принимая во всех случаях для моносахаридных аналогов, чем для антрил-ЖК. Если для раствора иерсинина ПЭФ равновелика для зондов АС4, АС7 и АС 12, то в бислое липосом с увеличением глубины погружения остатка антрацене она падает. Это еще одно подтверждение расположения остатков триптофана вблизи границы раздела фаз.

Для всех препаратов белка эффективность ПЭФ для моносахаридных зондов выше, чем для неспецифических антрил-ЖК. При сравнении триацетата (9) и трилаурата (10) видно, что последний в большей степени приближен к флуорофорам белка. С одной стороны, возможно сказывается меньшая погруженность флуорофора соединения (10) в липидный бислой.

Хорошим зондом с флуорофором, расположенным в полярной области фосфолипидного бислоя, считается Ы-дансил-фосфатидилэтаноламин (ДАНС-РЕ). Для подтверждения сделанного выше вывода о локализации остатков триптофана иерсинина мы использовали этот зонд, полученный прямой модификацией свободной аминогруппы РЕ дансилхлоридом (соотношение ДАНС/фосфат равно 0.92). Расчет значения Е в протеолипосомах Б показал, что она достаточно велика и равна 0.798±0.033. Близкие значения Е для ДАНС-РЕ и зонда (10) подтверждают высказанное ранее предположение, что остатки триптофана иерсинина в протеолипосомах ориентированы вблизи полярных групп фосфолипидов бислоя.

Подводя итог, можно сказать, что наиболее специфичным к иерсинину из исследованных антрилпроизводных является трилаурат (10). Собственные флуорофоры белка располагаются вблизи поверхности липосомного бислоя. Для белка в водных растворах специфичность этого зонда падает, по-видимому, вследствие высокой степени агрегации иерсинина и затрудненного доступа остатков триптофана для флуорозондов.

Полученные тетра- и пентаацильные аналоги липида А на основе О-глюкозамина 6-фосфата оказались перспективными соединениями. С одной стороны, они обладают общими иммунохимическими эпитопами с природным липидом А и могут быть использованы для определения антител к липиду А сыворотке крови и для создания вакцин и антисывороток к ним. В отличие от природного липида А, полученные соединения высоко стандартизованы, легко доступны, нетоксичны и достаточно устойчивы. С другой стороны, эти аналоги могут быть использованы для получения флуоресцентных мембранных зондов со специфичностью липида А. Эти зонды могут быть полезны в исследовании мембран грамотрицательных бактерий и взаимодействия эндотоксинов с клетками и макромолекулами. Производные бутиленгликоля, содержащие специфические для липида А ЖК, проявляют высокие иммуностимулирующие свойства, сравнимые с природным препаратом. Они, возможно, могут найти применение как водорастворимые адъюванты, легко выводимые из организма. Таким образом, синтетический подход позволил получить соединения, лишенные токсичных свойств, но обладающих некоторыми полезными иммунобиологическими свойствами липида А.

4. Конформационные рН-зависимые переходы иерсинина.

В последнее время для характеристики изменения упаковки полипептидной цепи белковой глобулы в процессе конформационных превращений и фиксирования промежуточного конформационного состояния "расплавленной глобулы" широкое применение находят флуоресцентные зонды. Этот подход был использован для изучения конформационных изменений различных молекулярных форм порина (тример и мономер) в растворе при различных рН. Как известно, тонкая структура спектра флуоресценции пирена зависит от полярности его окружения. Соотношение интенсивностей колебательных полос при 393 и 372 нм увеличивается с уменьшением полярности окружения. Зависимость этого параметра от рН в диапазоне 2,5-8.5 в растворе тримера порина из Y. pseudotuberculosis приведена на Рис. 9. Согласно полученным результатам, упаковка бета-структур, как специфическая область проникновения молекул пирена, в тримере порина наиболее плотная при значениях рН около 3 и 7. При рН 4,5 происходит нарушение плотности упаковки и окружение пирена становится более гидрофильным. Сравнительный анализ упаковки бета-структур молекулярных форм иерсинина при рН 4.3 показывает, что ее плотность уменьшается в ряду: тример, мономер и денатурированный мономер, не обладающий порообразующей активностью (см. рис. 11, А).

2 4 6 8

РН

Рис. 9. Влияние рН среды на микроокружение пирена в тримере иерсинина

Конформационные переходы белковой молекулы вызывают изменение состояния собственных флуорофоров - ароматических аминокислот. В мономере иерсинина присутствует 2 остатка триптофана, используя тушители различной природы можно картировать их микроокружение при рН-зависимых конформационных перестройках в белковой молекуле. Кривые, выражающие зависимость констант тушения триптофановой флуоресценции порина от рН раствора проходят через минимум (максимум) при значении рН около 4.5, что подтверждает существование переходного конформационного состояния в этой области (Рис. 10). При низких и высоких значениях рН остатки триптофана в белке более доступны для ионных тушителей: ионов цезия и иодида, о чем свидетельствует их низкие значения констант тушения Штерна-Фольмера. В то время как по сравнению с их значениями в области рН 4.5 для гидрофобных положительно заряженных акцепторов флуоресценции: и ДМХ, константы максимальны. Это можно интерпретировать как выдвижение остатков триптофана в более гидрофобные области при конформационном переходе в области рН 4.5. Следует отметить, что константа для ионов цезия на порядок ниже, чем для иодид ионов, что позволяет предполагать увеличение положительного заряда в микроокружении остатков триптофана в переходном состоянии белка.

Одно из характеристик упаковки белкой глобулы является устойчивость к денатурирующему действию мочевины. Для сравнительной характеристики рН-индуцированных интермедиатов порина было исследовано разворачивание молекулы тримера и мономера порина в процессе титрования их мочевиной при двух значениях рН: 4.3 и 8.0. За конформационными превращениями следили по изменению гидрофобности микроокружения молекул пирена, ассоциированных с белковой глобулой. При рН 4.3 с повышением концентрации мочевины гидрофобность микроокружения пирена в тримере вначале увеличивается, а затем падает, проходя через максимум при концентрации мочевины равной 1.6 М (Рис. 11, Б). Иная картина наблюдается, когда титрование проводится при рН 8.0. В этом случае при увеличении концентрации мочевины гидрофобность поверхности белка плавно понижается (Рис. 11,Г). Для мономерной формы порина при рН 4.3 также характерно постепенное падение гидрофобности поверхности белка по мере добавления мочевины (Рис. 11,В). Таким образом, при рН 4.3 состояние тримера такое, что при разворачивании мочевиной в области концентрации мочевины 1.6 М происходит конформационный переход, вызывающий продвижение молекул пирена в более гидрофобное пространство. Можно предположить, что тример иерсинина претерпевает переупаковку бета-структур перед окончательным разворачиванием глобулы в полностью гидратированное состояние. Мономер, уже перенесший некоторую процедуру денатурации при его выделении с использованием различных, более жестких, чем октилглюкозид, детергентов, претерпевает

Рис. 10. Зависимость скорости тушения собственной флуоресценции тримера от рН среды, заряда и гидрофобности тушителя

рН 4.3

Тример

Мономер

Денатурированный мономер'«

Тример

рН 4.3 Б

Мономер рН 4.3

Тример рН 8.0

ч,

Я 0 75

Рис. 11. Изменение гидрофобности окружения связанного с иерсинином пирена в присутствии мочевины

только разворачивание цепи, вызываемое денатурирующими концентрациями мочевины.

Таким образом, конформационный интермедиат тримера при рН 4.3-4.5 имеет менее плотную упаковку бета-структур по сравнению с интермедиатами при более низких и высоких значениях рН, при этом он сохраняет некий потенциал устойчивости к денатурирующему действию мочевины.

5. Спонтанное встраивание иерсинина в липосомный бнслой.

Спонтанное встраивание гидрофобных белков в липидный бислой используется для получения протеолипосом, для изучения архитектоники молекулы в момент встраивания, для выяснения векторной роли различных мембранных компонентов. Выявленный выше конформационный переход иерсинина в области рН 4.3-5.0 представляет интерес для описания встраивания иерсинина в липидный бислой.

рН 3.0

о4

о.

о и

- ! - •

' сь

1 1-ГО А ' РС

' РА |.РЗ РЕ/РС БА

Время, мин

рН 5.0

Время, мин

рН 8.0

сЗ О.

, » I ! !

РС

"I РА Бит -1С1 ц^

Ьр А ~"РЕ/РС

$А

Время, мин

Рис. 12. Взаимодействие мономера порина с липосомами

Были получены малые моноламеллярные липосомы из яичного лецитина с 5 моль% различных векторов: липополисахарида, липида А, суммы бактериальных фосфолипидов, CL, PA, DCP, C18NH2 (SA), и 50 моль% РЕ. На рис. 12 приведены данные по изменению светорассеяния липосом в зависимости от рН среды при добавлении иерсинина в концентрации 10 мкг/мл. При спонтанном встраивании белка в липидный бислой при всех исследованных значениях рН отмечается увеличение светорассеяния для липосом, несущих отрицательный заряд, в отличие от положительно заряженных (SA). Бактериальная мембрана всегда заряжена отрицательно, дополнительно отмечается и асимметрия бислоя, которая выражается в экспанированности молекул липополисахарида на внешней стороне мембраны, тогда как, специфические для грамотрицательных бактерий фосфолипиды выстилают внутреннюю часть внешней стенки. При взаимодействии иерсинина с липосомным бислоем при рН 5.0 главными векторами встраивания являются ЛПС, липид A, CL, РА и сумма фосфолипидов. При рН 3.0 и 8.0 главным вектором встраивания является DCP, особенно при более высоком рН.

Ранее было показано, что иерсинин из Y. pseudotuberculosis, растворенный в буферном растворе с рН 7.5-8.0, эффективно встраивается с образованием пор в модельные плоские мембраны из нейтрального по заряду моноолеилглицерина. Однако попытка реконструировать иерсинин при этом значением рН в мембрану, состоящую из суммы бактериальных липидов, оказалась безуспешной. Только изменение рН буфера до 4.5-5.0 привело к положительному результату.

Таким образом, только при рН 5.0 конформационный интермедиат иерсинина сохраняет аффинность к специфическим компонентам бактериальной мембраны, в то время как, в других состояниях он теряет способность взаимодействовать с ЛПС и липидом А, но сохраняет способность контактировать с отрицательнозаряженными фосфолипидами.

6. Мембранотропные свойства ацилдепсипептидов - бацирцинов.

0=C-NH-Glu-Leu-Leu-Val

-CO-Leu-Leu-Asp

Бацирцин 2, R=(CH2)6-CH(CH3)-CH2-CH3 Бацирцин 3, R=(CH2)g-CH-(CH3)2 Бацирцин 4, R=(CH2)10-CH3 Бацирцин 5, R=(CH2)8-CH(CH3)-CH2-CH3 Бацирцин 5 A, R=(CH2)8-CH-(CH3)2

Некоторые бактерии рода Bacillus способны продуцировать биологически активные липопептиды. Один из них - сурфактин - обладает противоопухолевой активностью против карциномы Эрлиха, против вируса СПИДа, способен ингибировать свертываемость крови. Аналогичные соединения, как недавно было обнаружено, продуцирует штамм морской бактерии Bacillus pumilus, выделенный из морской губки Ircinia sp.. Эти ацилдепсипептиды были названы бацирцинами (BI-2, 3, 4, 5 и 5 А).

Амфифильный характер бацирцинов определяется гидрофобной частью, состоящей из жирнокислотной цепи и липофильных аминокислот, и гидрофильной пептидной частью с двумя остатками анионных аминокислот Asp и Glu. Они обладают гемолитической активностью и цитотоксическим эффектом для оплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius и клеток карциномы Эрлиха.

6.1. Влияние pH на мембранотропные свойства.

Сравнительное изучение мембранотропного действия бацирцинов выявило решающую роль жирнокислотной цепи на гемолитическая активность. В таблице 12 приведены кинетические параметры гемолиза эритроцитов мыши, вызываемого бацирцинами при различных значениях pH, из которой видно, что соединения с различной алифатической боковой цепью имеют различный гемолитический потенциал. Гемолитическая активность бацирцинов падает в ряду: BI-4 (normal-C14) > BI-3(iso-C14) > BI-2 (anteiso-C13) и BI-4 (normal-C14) > BI-5 (iso-C15) > BI-5A (anteiso-C15). Эти результаты совпадают с данными, приведенными для лихенизинов, содержащих в своей молекуле остаток 3-гидроксижирных кислот. Производное с нормальной 3-гидрокситетрадекановой (п-С14) кислоты проявляет самую высокую поверхностную активность по сравнению с гомологами, имеющих разветвление в алифатической части. Из Таблицы 12 видно, что гемолитическая активность бацирцинов является pH-зависимой, задержка времени гемолиза, вызванного бацирцинами меняется при изменении pH окружающей среды. Бацирцины 2, 3 и 4 проявляют более высокую активность при pH 5.6, в то время как, BI-4 и 5 - при pH 6.5. Продолжительность задержки времени гемолиза для бацирцина 5 почти не меняется в диапазоне pH от 5.75 до 6.5 (рис. 13). Существенная потеря активности наблюдается при pH ниже 5.75 и выше 6.5, что выражается значительным увеличением времени задержки гемолиза. Ранее было показано, что увеличение алифатической цепи в молекуле усиливает цитотоксический эффект бацирцинов для клеток эмбрионов морского ежа. Пептиды 5 и 5А, которые отличаются от бацирцинов 2 и 3 дополнительными двумя или одной метиленовой группой, соответственно, имеют более высокую гемолитическую активность при pH 7.4 и 6.5. Однако количественные параметры гемолиза бацирцинов 5 и 5А при pH 5.6 не укладываются в эту закономерность.

Скорость и время задержки гемолиза, вызываемого

Таблица 12 бацирцинами (5

Соеди- ЖК часть Время задержки * Скорость (s'1) **

нение бацирцинов

pH 7.4 6.5 5.6 7.4 6.5 5.6

BI2 anteiso-Cu >240 >240 15 (-) (-) 0.020

BI3 iso-Ci4 >240 15 15 (-) 0.013 0.033

BI4 normal-C14 30 5 12 0.028 0.050 0.026

BI 5 anteiso-C15 124 16 32 0.006 0.024 0.013

BI 5 А iso-Cis 102 7 21 0.012 0.050 0.022

(-) Отсутствие гемолиза до 4 мин

Время задержки гемолиза рассчитывалось как точка пересечения нулевой линии с касательной кривой гемолиза в точке 50% гемолиза. **Скорость гемолиза определялась как изменение оптической плотности в единицу времени в вблизи точки 50% гемолиза.

Рис.13. Зависимость гемолиза от концентрации BI-5 при pH от 6.5 до 9.0.

Оптическая плотность записывалась через 2 мин после добавления бацирцинов к эритроцитам.

Известно, что биосурфактант, секретируемый штаммом Bacillus licheniformis JF-2, показывает оптимальную поверхностную активность при pH 6.0 активность сурфактина также сильно зависит от pH среды с максимумом активности между pH 5.5 и 6.0.

Мажорное соединение BI-5 обладает интересной рН-зависимостью. Добавление BI-5 (5 мкМ) к эритроцитам при pH 9.0 не вызывает заметного гемолиза в течении 2 мин, но при подкислении среды до pH 6.5 его гемолитическая активность резко возрастает. Обратимое торможение гемолиза наблюдается при быстром доведении pH среды до 8.0, которое снимается повторным подкислением (Рис.14).

На рис.15 приведены данные о глубине погружения бацирцина 5 при рН 7.4 в липосомный бислой, подтверждающие, что он удерживается в мембране и не диффундирует из нее при этом значении рН. Присутствие его алкильной цепи в бислое вызывает повышение поляризации А4 и АС7, но практически не влияет на физические параметры РС10 и АС12.

Н 9.0

100 ■

80'

60'

40"

эН 6.5

эН 8.0

Н 6.5

0 1 2 3 4 5

Время, мин

Рис.14. Зависимость гемолиза от времени и смены рН среды. BI-5 (5 мкМ) добавляли к эритроцитам при рН 9.0. После инкубации в течение 2 мин суспензию подкисляли до рН 6,5 и регистрировали начало гемолиза. После добавления PBS до рН 8.0 снова регистрировали отмену гемолиза при рН 8.0. Дальнейшее подкисление среды приводило к началу гемолиза. Стрелками указаны точки смены рН. Пунктирной линией показан эксперимент только при смене рН от 9.0 до 6.5.

Таким образом BI-5 при рН 7.4 погружается в мембрану на глубину по крайней мере 7-го атома углерода насыщенной жирнокислотной цепи и не достигает 10-го.

Из приведенных выше данных видно, что молекулы бацирцина 5 остаются в мембране при нейтральных значениях рН в концентрации, достаточной для гемолиза при подкислении среды (рис. 14 и 15). При анализе кинетики гемолиза под действием бацирцинов выявляется быстрая переходная стадия (t!/2 < 1 мин). Эта стадия, возможно, объясняется начальной быстрой ассоциацией бацирцинов с мембранами, как это описывается для сурфактиноподобных соединений и других мембранотропных соединений.

При исследовании влияния бацирцина 5 на микровязкость и упорядоченность мембраны мышиных эритроцитов при рН 6.5 и 7.4 с помощью флуоресцентной спекторофотометрии было показано, что при рН 6.5 анизотропия АС12:1 уменьшается при концентрациях BI-5,

меньших, чем 5 мкМ (рис. 16,А). При увеличении концентрации в диапазоне 5-20 мМ, анизотропия АС12:1 увеличивается монотонно. Другое поведение В1-5 в липосомах наблюдается при рН 7.4. В этом случае кривая зависимости анизотропии от концентрации В1-5 не имела минимума, отмечается только увеличение микровязкости бислоя как результат насыщения мембраны алифатической цепью бацирцина 5.

о.зо

§ 0.25]

та [0

*0.20| «

ч о

с 0.15

0.Ю

6 8 10

Атом углерода бислоя

Рис.15. Влияние В1-5 на поляризацию АС4, АС7, АС12 и РС10 в ЕРС-БНУ

при рН 7.4.

Результат действия В1-5 на эксимеризациюРСЮ в эритроцитарной мембране показано рис. 16,Б. При рН 6.5 присутствие В1-5 в мембране увеличивает количество эксимеров при концентрации бацирцина 4-5 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации В1-5 снижает эксимеризацию пирендекановой кислоты за счет увеличения отрицательного заряда мембраны. При рН 7.4 наблюдалось только уменьшение эксимеризации РС10.

Таким образом, повышенная мембранотропная активность В1-5 при рН 6.5, по-видимому, объясняется механизмом, подобным описанному для сурфактина через формирование димеров и высших олигомеров в процессе порообразования. Олигомеризация бацирцина 5 при рН 6.5 косвенно подтверждается увеличением сегрегацией липидных доменов и уменьшением микровязкости эритроцитарной мембране, на что указывает увеличение эксимеризации РС10 и снижение анизотропии АС12:1 (Рис. 16 А и Б) при эффективной концентрации В1-5.

10 15

BI-5, мкМ

Рис. 16. Влияние BI-5 на анизотропию АС12:1 (А) и эксимеризацию РС10 (В) в мембране теней эритроцитов.

6.2. Определение констант ионизации бацирцина 5 в липосомном бислое.

Как говорилось выше, бацирцины содержат в пептидной части остатки Asp и Glu. Для определения констант ионизации их карбоксильных групп в фосфолипидном бислое были получены SUV, содержащие ANS и неионизированный BI-5. При увеличении рН ионизация молекул BI-5 в мембране увеличатся и молекулы ANS диффундируют из липосомной мембраны в результате электроотрицательных взаимодействий. Как видно из рис. 17 скорость уменьшения флуоресценции ANS была различна при различных рН, и кривая титрования имела две характерные точки перегиба. Как указывалось ранее, такие изменения интерпретируются как степени ионизации ионных групп, в этом случае рКа равна рН 1/2 изменения флюоресценции ANS. Таким образом, значения рК двух карбоксильных групп бацирцина равны 4.7 и 6.6.

Влияние рН на гемолитическую активность бацирцинов также как и влияние рН на поверхностную активность биосурфактанта из JF-2 и сурфактина нельзя объяснять литературными данными о рК карбоксильных групп Glu и Asp, которые входят в пептидную часть. Микроокружение карбоксильных групп изменяет их рК, так рК сурфактина на границе воздух-вода равна 6.0, и это значение выше приблизительно на две единицы рН, чем рК сурфактина в водном окружении. Аналогичное увеличение рК наблюдалось для жирных кислот в липосомной мембране, где гексадекановая и олеиновая кислоты имеют рК 6.4 и 7.5, соответственно, что на две-три единицы выше по сравнению с полностью гидратированными однозамещенными кислотами (обычно рК 3.8-4.5). Определенные константы ионизации остатков Asp и Glu в молекуле BI-5, включенном в липидный бислой, были равны 4.7 и 6.6, и поэтому в молекуле BI-5 в интервале рН 5.6-6.5 присутствует в

ионизированной форме остаток Glu и в протонированной - Asp. Возможно, что моноионизированная форма бацирцинов определяет самоассоциацию этих липодепсипептидов в слабокислой среде, в то время как в нейтральной и слабощелочной среде бацирцины в мембране присутствуют как двузаряженные анионные молекулы, которые из-за высокого заряда не имеют возможности к самоассоциации, и как следствие не могут вызывать драматических изменений упорядоченности бислоя, которые приводили бы к гемолизу.

Критическая концентрация бацирцинов, необходимая для порообразования, является рН-зависимой (см. рис. 13 и 14). Концентрация бацирцинов при слабокислых значениях рН достигала критического уровня с большей скоростью следствие снижения отрицательного заряда молекулы депсипептидов, и, как следствие, увеличение ее гидрофобности. Увеличение концентрации BI-5 в моноионизированной форме в мембране создают критические условия стабильности бислоя, снижая микровязкость мембраны и увеличивая нарушения симметрии упаковки липидных молекул.

1.0 п

о-о

0.4------

2 4 6 8 10

рН

Рис.17 Зависимость скорости изменения флуоресценции ANS в SUV с BI-5 при различных рН.

Следовательно, гемолитическая активность бацирцинов, также как и цитотоксичность для развивающихся оплодотворенных яиц морского ежа S. intermedins и антиопухолевое действие бацирцина 5 in vitro связана не только с амфифильностью молекулы, но также и со степенью ионизации двух карбоксильных групп, присутствующих в молекуле.

0.8

о с»

0.6

элементов молекулы можно значительно менять биологические свойства многих пептидов и липопептидов. Знание особенностей механизма мембранотропного действия бацирцинов может быть использовано в изучении биологической активности не только бацирцинов, но и других подобных соединений.

стабильности бислоя, снижая микровязкость мембраны и увеличивая нарушения симметрии упаковки липидных молекул.

Следовательно, гемолитическая активность бацирцинов, также как и цитотоксичность для развивающихся оплодотворенных яиц морского ежа S. intermedius и антиопухолевое действие бацирцина 5 in vitro связана не только с амфифильностью молекулы, но также и со степенью ионизации двух карбоксильных групп, присутствующих в молекуле.

Состояние поверхности раздела фаз на границе мембрана-вода чрезвычайно важно для взаимодействия амфифильных соединений с фосфолипидным бислоем. Изменением амфифильности структурно важных элементов молекулы можно значительно менять биологические свойства многих пептидов и липопептидов. Знание особенностей механизма мембранотропного действия бацирцинов может быть использовано в изучении биологической активности не только бацирцинов, но и других подобных соединений.

7. Эффективность липосомной формы фенотерола (ЛФФ) в терапии бронхообструкцни

В условиях ухудшения экологической обстановки хронические обструктивные болезни легких все чаще встречаются среди большого разнообразия легочных патологий. В последнее время коррекция терапии бронхиальной астмы, как хронического воспалительного процесса дыхательных путей, привлекает внимание в связи с участившимися случаями привыкания к терапевтическим средствам и, как следствие, к передозировке их больными. Фенотерол, относящийся к эффективным р2-агонистам, широко применяется для снятия бронхообструкцни. В связи с кардиотоксичностью фенотерола его передозировка в некоторых случаях может приводить к летальным исходам.

Активный поиск лекарственных средств, способных контролировать проходимость бронхов и воздействовать на процессы воспаления в дыхательных путях показал эффективность использования

липосом для транспорта лекарств к органам-мишеням. Известно, что липосомы как носители лекарственных средств обладают более высокой терапевтической эффективностью по сравнению со свободным препаратом. Одним из перспективных направлений использования липосом является применение их в виде аэрозолей в терапии заболеваний дыхательных путей. Действие липосомных препаратов во многом зависит от состава липидной мембраны, с одной стороны с клетками лучше связываются липосомы с жидкокристаллической мембраной, с другой стороны немаловажное значение имеет поверхностный заряд везикул. Как установлено ранее, заключение некоторых бронхолитических средств в липосомную форму позволяет значительно уменьшить фармакологически обусловленные системные эффекты (32-агонистов с одновременным пролонгированием их действия.

Нами были впервые предприняты исследования по использованию включенного в липосомы фенотерола для терапии экспериментальной бронхообструкции (ЭБО) у крыс, было изучено действие липосомных форм фенотерола (ЛФФ) на состояние биохимических процессов в дыхательных путях при бронхообструкции, их взаимосвязи с биофизическими параметрами мембраны ЛФФ

Модель бронхообструкции в эксперименте получали у нелинейных половозрелых самцов крыс, вызывая гиперчувствительность немедленного типа сенсибилизацией к овальбумину. Препараты вводили в дыхательные пути животных с ЭБО с помощью ультразвукового ингалятора "ТЬошех Ь2" в строго контролируемых условиях, подобранных предварительно. Животные получали 0.06 мкг фенотерола на крысу в день (эффективная доза для человека) в течение 5 дней. На шестые сутки крыс декапитировали для биохимических исследований бронхоальвеолярного смыва (БАС).

7.1. Влияние ЛФФ на биомаркеры бронхообструкции.

Предварительные эксперименты показали, что благодаря своим амфифильным свойствам фенотерол, легко удерживается липосомами, особенно сформированными из суммы фосфолипидов легкого свиньи (ФЛС). Введение эффективной дозы ЛФФ экспериментальным животным проводили с использованием ультразвукового ингалятора в строго контролируемых условиях, подобранных предварительно.

На первом этапе были проведены исследования острой токсичности ЛФФ на основе ФЛС при внутрибрюшинной инъекции препарата (данные

х НВг

Структура фенотерола

НО

представлены в табл. 14). В группе мышей, которым ввели ЛФФ в дозе 450 мг фенотерола на кг массы тела через сутки из 6 животных в живых осталось 4. В то время как в группе мышей, которым вводили неинкапсулированный фенотерол дозе 30 мг/кг вызывает гибель половины животных, доза 45 мг фенотерола на кг вызывает 100%-ную гибель. Таким образом, липосомная форма фенотерола, по меньшей мере, в 15 раз менее токсична по сравнению со свободным препаратом.

Непосредственным прямым медиатором, вызывающим бронхообструкцию является гистамин. По данным биохимического анализа БАС у крыс с ЭБО концентрация гистамина значительно превышала норму. Незначительное ее снижение наблюдалось при введении свободной формой фенотерола. ЛФФ оказались более эффективными в снижении уровня гистамина по сравнению с ненагруженными липосомами, при чем максимальное действие отмечено для ЛФФ на основе фосфолипидов легкого свиньи (ЬРЬ) (Таблица 15).

Различного рода воспалительные процессы сопровождаются активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ), конечным продуктом которого является малоновый диальдегид (МДА). При БО происходит увеличение содержания МДА в лаважной жидкости, однако после ингаляции свободной формы препарата содержание МДА достоверно возрастало, что видимо связано с побочным действием фенотерола (Таблица 15). При ингаляции всех типов липосом наблюдалось снижение уровня МДА, при чем максимальный эффект достигался при использовании ненагруженных липосом из ЬРЬ, а влияние липосомных форм фенотерола было примерно одинаковым.

Таблица 14.

Исследование острой токсичности липосомной и свободной форм фенотерола.

Доза, мг/кг Погибло/выжило животных

липосомная форма свободная форма

5 0/6

15 - 1/5

30 0/6 3/3

45 0/6 6/0

60 0/6 -

120 0/6 -

240 1/5 -

300 1/5 -

450 2/4 -

* - не определяли

Таблица 15.

Биохимические показатели БАС крыс с ЭБО (нмоль/мл)

Группы животных Гистамин МДА NOn"

Здоровые 0.05410.008 0.03810.004 1.7910.10

с ЭБО 0.128±0.017* 0.08510.005* 2.7910.17*

Получавшие:

фенотерол 0.099+0.010* 0.23210.030* 2.87+0.15*

ЛФФ на основе ЕРС 0.08710.009* 0.07410.002* 1.9410.11

ЛФФ на основе ЬРЬ 0.06410.008 0.10410.009* 1.96Ю.07

ЛФФ на основе

ЕРС/СИоШСР** 0.07510.009 0.11510.007* 1.83Ю.02

ЕРС 0.10610.011* 0.05910.010 2.55+0.18*

ЬРЬ 0.08610.009* 0.060+0.005 3.05Ю.24*

* - различия достоверны по сравнению с группой здоровых животных (п=5, Р<0,05)

** - (1:0.85:0.50:0.05. в молях)

Активизация ПОЛ приводит к включению целого каскада ответных реакций, в том числе и экспрессию индуктивной NO-синтазы, которая образует в 1000 раз большие количества окиси азота, чем конституционная форма. В настоящее время NO признана биомаркером воспалительного процесса, в том числе и аллергического при БД, таким образом, по активности NOS воспалительных и иммунокомпетентных клеток можно судить о противовоспалительном действии лекарственных препаратов. При определении активности NO-синтазы отмечено резкое увеличение уровня метаболитов окиси азота (N02" и N03") в БАС у крыс с ЭБО. Отмечается некоторое снижение NO-синтазной активности при ингаляции ненагруженных липосом, а максимальный эффект достигается при применении фенотерола, включенного в липосомы из LPL (Таблица 15).

Таким образом, проведенные биохимические исследования подтвердили, что липосомная форма фенотерола в экспериментах in vivo обладает большим противовоспалительным и бронхолитическим действием по сравнению со свободной его формой.

В ответ на действие различных цитокинов, эндо- или экзотоксинов одной из реакций клеток-мишеней является активация индуктивной NO-синтазы. Известно, что липополисахариды грамотрицательных бактерий в невысоких дозах оказывают стимулирующее действие на макрофаги и моноциты. В эксперименте in vitro на мышиной миеломоноцитарной линии клеток «Wehi-3», которые являются удобной моделью - аналогом моноцитов, исследовалось влияние фенотерола и его липосомных форм на NO-синтазную активность.

Как видно из таблицы 16 при обработке липополисахаридом Escherichia coli в течение 24 ч клетки усиливали синтез нитрит-иона в 3 раза. Инкубация клеток в течение 24 ч со" свободным фенотеролом, его липосомными формами, а также с ненагруженными липосомами достоверно снижала уровень синтеза NO. Наибольшим эффектом подавления активности NOS обладали обе липосомные формы фенотерола, концентрация N02~ при этом составляла 11% от контрольного значения.

При длительной инкубации (120 ч) липосомная форма фенотерола на основе LPL в большей степени сохраняла подавление синтеза N02~ по сравнению с другой липосомной формой, ненагруженными липосомами и самим фенотеролом. В клетках, обработанных фенотеролом в липосомах из LPL уровень N02~ сохранялся на уровне 56% от исходной, в то время как при инкубации с остальными препаратами этот показатель возрастал более значительно.

Таблица 16.

Влияние фенотерола и его липосомных форм (ЛФФ) на NO-синтазную активность клеток "Wehi-З", стимулированных липополисахаридом Е. coli 055:В5.

Препарат Уровень нитрит-иона, % к контролю

24 ч 120 ч

Контроль 100+7 100±9

Фенотерол 54±2* 74±4

ЕРС 51+5* 84+5

ЛФФ на основе ЕРС 11±2* 130±11

LPL 28±3* 85±12

ЛФФ на основе LPL 11±1* 56±8*

* - различия достоверны в сравнении с контролем (п=3,р<0,05)

Таким образом, в отношении подавления NO-cинтaзнoй активности клеток липосомная форма фенотерола на основе ЬРЬ обладает более продолжительным действием, чем на основе ЕРС.

7.2. Роль физико-химических параметров ЛФФ.

Липидный состав липосом в значительной степени определяет эффективность их связывания с клетками-мишенями. Сходство по фазовому состоянию липидного бислоя везикул и клеток-мишеней способствует их слиянию. Как было показано выше липосомы из фосфолипидов легких свиньи являются наиболее эффективным носителем фенотерола для лечения обструктивных заболеваний легких. Особенностью фосфолипидов легкого теплокровных является повышенное содержание в них насыщенных жирных кислот, что определяет высокую точку фазового перехода (Тс) липидного бислоя ЛФФ на основе ЬРЬ.

Как видно из таблицы 17 для липосом из LPL Тс составляет 30.6°С, что ближе к интервалу физиологических температур, в то время как для препаратов на основе только ЕРС Тс ниже 10°С. С другой стороны, достаточно высокое содержание фосфатидилсерина и фосфатидилинозита в препарате LPL определяет значительный отрицательный заряд липосомной поверхности. Для определения изменений поверхностного заряда липосом использовали флуоресцентный зонд ANS. Константа связывания ANS (Кс) рассчитывалась по методу Чипмана, с липосомами из LPL она составляет 62.5 мМ"1. В присутствии фенотерола этот показатель меняются незначительно. Для липосом из ЕРС с фенотеролом Кс увеличивается до 132.6 мМ*1, что, по-видимому, связано с частичным положительным зарядом фенотерола при физиологических значениях pH. Для выяснения роли Тс и заряда мембраны на терапевтическую эффективность липосомного фенотерола нами были получены липосомные препараты, варьирующие микровязкость бислоя и заряд мембраны. На основе ЕРС с использованием холестерина и дицетилфосфата (DCP) нами был получен препарат с биофизическими показателями (Тс и Кс) близкими для ЛФФ на основе LPL. По результатам проведенного биохимического анализа БАС крыс с ЭБО, получавших ЛФФ на основе ЕРС в сочетании с холестерином и DCP, оказалось, что эта липосомная форма не уступает по терапевтической эффективности препарату на основе LPL (Таблица 15).

Состав и биофизические параметры липосомных форм Таблица 17. фенотерола

Препарат Состав, в молях Тс,°С Кс, мМ"'

1. ЕРС - < 10 98,4

2. EPC/DCP 1 0.05 < 10 22,4

3. ЕРС/фенотерол 1 0.05 < 10 132,6

4. EPC/Chol 1 0.85 28,3

5. EPC/DCP/фенотерол 1 0.05:0.05 < 10 56,5

6. EPC/Chol/DCP 1 0.85:0.05 29,4

7. ЕРС/СЬо1/фенотерол 1 0.85:0.05 27,5 112,6

8. EPC/Chol/DCP/фенотерол 1 0.85:0.05:0.05 29,7 52,4

9. LPL - 30,6 62,5

10. LPL/фенотерол 1 0.05 29,8 63,5

* - параметры не определяли

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что в обеспечении повышенного терапевтического действия ЛФФ лежат определенные биофизические показатели состояния липосомного бислоя, такие как, оптимальные значения температуры фазового перехода и заряда мембраны.

7.3. Участие сурфактантного белка А в транспорте ЛФФ.

Одной из морфофункциональных особенностей респираторного тракта является наличие сурфактанта легких, главной белковой составляющей которого является сурфактантный белок А (БР-А), относящийся к семейству коллагеновых лектинов. Уникальные свойства этой молекулы привлекают к ней большой интерес исследователей в последние годы. С одной стороны, БР-А активно участвует в таких процессах организации сурфактантных мембранных структур, как связывание, транспорт и сортировка легочных фосфолипидов. С другой стороны, БР-А, относящийся к молекулам первой защиты, вовлекается в иммунные механизмы, взаимодействуя через специфические рецепторы с макрофагами и другими клетками эпителия легких. Стратегия направленного транспорта липосом может основывается на использовании эндогенного БР-А, способного служить вектором в доставке липосом к клеткам-мишеням дыхательных путей. Исследования в этом направлении могут оказаться полезными в понимании механизмов взаимодействия липосом с клетками респираторного тракта.

Из БАС крыс с экспериментальным силикозом (для стимуляции синтеза сурфактанта) аффинной хроматографией на маннозил-агарозе и гель-проникающей хроматографией был выделен гомогенный БР-А. С помощью экспериментов по светорассеянию и тушению собственной флуоресценции белка было показано, что в присутствии ионов кальция, БРА, агрегируя липосомы из ЬРЬ, образует с ними стабильный комплекс, в отличие от липосом из ЕРС. При обработке ЭДТК, являющейся хелатором двухвалентных металлов, специфический комплекс распадался.

Полученные нами кинетические кривые светорассеяния липосомной суспензии в присутствии БР-А в зависимости от его концентрации свидетельствовали о том, что БР-А взаимодействует с липосомами из ЕРС и агрегирует их, вызывая увеличение светорассеяния. Однако, время жизни этого комплекса составляет менее 1 мин, о чем свидетельствует дальнейшее падение светорассеяния липосомной суспензии. Добавление новых порций БР-А практически картину не изменяло. Напротив, комплекс БР-А с липосомами из ЬРЬ был стабильным и распадался только в присутствии хелатора ионов кальция - ЭДТА. Возможно, высоко динамичный бислой ЕРС приводит к большой подвижности полярных головок, неустойчивому образованию липидных доменов в момент связывания, что и обусловливает нестабильное связывание БР-А с липосомами. Более жесткое положение холиновых групп в бислое ЬРЬ, Тс которого гораздо выше по сравнению с ЕРС, очевидно, способствует стабильному взаимодействию БР-А с липосомами из этих фосфолипидов.

Помимо агрегации, связывание БР-А с липосомами оценивали по степени тушения флуоресценции остатков триптофана белка ДМХ,

связанным с мембраной липосом. Были определены константы тушения Штерна-Фольмера собственной флуоресценции белка самим ДМХ (8.4±0.6 нМ"1) и липосомами, несущими мембраносвязанный ДМХ (98.1±0.3 мкМ"1). То есть при инкубации SP-A с липосомами скорость тушения увеличивалась на порядок. При инкубации SP-A с липосомами из ЕРС, меченными ДМХ, стабильного тушения флюоресценции белка не наблюдалось. Таким образом, проведенные исследования показали, что SP-А взаимодействует с липосомами из LPL и образует с ними стабильный комплекс, в отличие от липосом из ЕРС.

В настоящее время накоплено большое количество доказательств о важной роли клеток моноцито-макрофагального происхождения в патогенезе БА. Альвеолярные макрофаги в силу своей локализации в легких первыми контактируют с аллергенами, антигенами и экзогенными клетками, попадающими в легкие. В последние годы установлено, что активированные альвеолярные макрофаги способны продуцировать большие количества NO в результате активации индуктивной NOS. В экспериментах in vitro с использованием мышиной миеломоноцитарной клеточной линии «Wehi-3» было исследовано влияние SP-A на эффективность липосомного фенотерола.

В данном эксперименте исследовали дезактивирующий эффект липосомного фенотерола на основе LPL в присутствии различных концентраций SP-A. Клетки после стимуляции ЛПС Е. coli в течение 24 часов усиливали генерацию реактивных форм кислорода (ROS). Об этом свидетельствовало увеличение концентрации флуоресцеина, образующегося при внутриклеточном окислении дигидрофлуоресцеина под действием ROS, в 3,8 раза. Вместе с этим возрастала NO-синтазная активность клеток, что подтверждалось увеличением концентрации нитрит-иона в супернатанте клеточной культуры в 2,7 раза. Присутствие SP-A в диапазоне концентраций 0,01-0,1 мкг/мл существенно не сказывается на эффективности липосомного фенотерола. При инкубации клеток с липосомами в присутствии 1мкг SP-A/мл наблюдалось одновременное снижение активности NO-синтазы и генерации ROS на 14% и 17%, соответственно, по сравнению с экспериментом без белка. Еще больший эффект наблюдался в присутствии 10 мкг/мл SP-A, в этом случае активность NOS снизилась на 35%, a ROS на 45%. Результаты исследования представлены на рис. 18. Как показано нами липосомный фенотерол способен подавлять активность NOS миеломоноцитарных клеток — предшественников макрофагов. Наши исследования показали, что SP-A, очевидно способен усиливать контакт липосом с клетками, что проявлялось в увеличении дезактивации активности NOS липосомами.

Итак, БР-А можно рассматривать как эндогенный вектор доставки липосом к клеткам-мишеням дыхательных путей. При ингаляционном введении липосом из ЬРЬ БР-А, находящийся в бронхиальном секрете, специфически захватывает липосомы и облегчает контакт с клетками-мишенями.

SP-A, мкг/мл

Рис. 18. Влияние SP-A на NOS и генерацию ROS в клетках "Wehi-3" в присутствии ЛФФ на основе LPL (2 мкг фенотерола/мл).

Итак, SP-A можно рассматривать как эндогенный вектор липосомной доставки к клеткам-мишеням дыхательных путей, так как в респираторном тракте достаточно высокая концентрация этого белка. Среднее содержание SP-A в БАС практически здоровых людей составляет 2,5 мкг/мл. Истинная концентрация SP-A в альвеолярной гипофазе, вероятно, гораздо выше, поскольку процедура лаважа вызывает 10-100 кратное разбавление действительного содержания компонентов бронхоальвеолярного секрета.

ВЫВОДЫ

1. Впервые были получены иммунохимически активные липосомные антигены и иммуногены на основе тетра- и пентаацильных производных 6-фосфата D-глюкозамина с остатками 3-гидроки- или 3-миристоилоксимристиновой кислот по аминогруппе. Полученные при поликлональном ответе антитела способны взаимодействовать с природным липидом А грамотрицательных бактерий в липосомном антигене. Поликлональные антитела к липиду А в свою очередь выявляют специфические эпитопы в липосомных антигенах на основе синтетических аналогов. На основании этой перекрестной реактивности можно сделать вывод об общей иммунодоминантной группе липида А и полученных аналогов - остатке 3-гидрокимиристиновой кислоты по аминогруппе глюкозамина.

2. Впервые были синтезированы флуоресцентные зонды со специфичностью липида А и показано их специфическое взаимодействие в липидном бислое с интегральным белком порином иерсинином бактерии Y. pseudotuberculosis. С помощью различных флуоресцентных зондов показано, что в липидном бислое остатки триптофана иерсинина локализованы вблизи границы мембрана-вода.

3. С помощью различных флуоресцентных зондов исследована рН-зависимая конформационная пластичность иерсинина и показано, что в конформационный интермедиат порина в области значений рН 4.55.0 находится в оптимальном для взаимодействия со специфическими компонентами бактериальной мембраны. В этом состоянии плотность упаковки бета-структур белка понижена, а остатки триптофана более доступны для гидрофильных акцепторов флуоресценции, в отличие от гидрофобных. В этом состоянии иерсинина векторами спонтанного встраивания в липидный бислой являются липополисахарид и липид

А. При других значениях pH основными векторами встраивания являются любые отрицательно заряженные фосфолипиды.

4. Выяснена роль физико-химического состояния бацирцина 5, липодепсипептида из бактерии Bacillus pumilis, в его pH-зависимом мембранотропном действии. На основании экспериментов по определению скорости выхода анионного флуоресцентного зонда (ANS) из липосомного бислоя в присутствии BI-5 были определены константы ионизации остатков Glu и Asp, входящих в состав пептидного звена, равные 4.7 и 6.7, соответственно. Показано, что в условиях максимальной гемолитической активности при pH 6.5 бацирцин 5 находится в моноионизированном состоянии, в виде двузарядного аниона при pH 7.4 он удерживается в мембране, но не проявляет гемолитической активности. Взаимопереходы бацирцина 5 между моноанионным и дианионным состояниями обратимы и определяют его мембранотропное действие.

5. Разработана липосомная форма широко применяемого для снятия бронхоспазма р2-агониста - фенотерола (ЛФФ), и исследована ее терапевтическая эффективность на экспериментальной модели бронхообструкции у крыс. Найдено, что токсичность фенотерола в составе липосом снижена, по крайней мере, в 15 раз по сравнению с его свободной формой. Липосомная форма при ингаляции в легкие эффективно снижает уровень гистамина в бронхоальвеолярном секрете, эффективно снижает NO-синтазную активность. Липидная основа ЛФФ эффективно подавляет процессы перекисного окисления липидов, связанные с сопутствующим хроническим воспалением, с другой стороны - восполняет потерянный при длительном воспалении пул фосфолипидов сурфактанта.

фосфолипидов легкого с точкой фазового перехода 30°С является более эффективной, чем на основе яичного фосфатидилхолина. Включение холестерина для повышения микровязкости бислоя и синтетического дицетилфосфата для увеличения заряда мембраны в ЛФФ на основе яичного лецитина приводит к повышению терапевтической эффективности до таковой для ЛФФ на основе фосфолипидов легкого.

7. Основной белок сурфактанта легких (SP-A) является эндогенной

векторной молекулой в эффективной доставке липосом клеткам-мишеням при ингаляции ЛФФ. В экспериментах in-vitro ЛФФ эффективно снижает NO-синтазную активность и генерацию реактивных форм кислорода в миеломоноцитарных клетках, стимулированных липополисахаридом. В присутствии SP-A эффект липосомной формы усиливается в 1.5-2 раза.

Основные публикации по теме диссертации

1. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Luk'yanov P.A., Razmakhnina J.Y., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Structural studies of the immunodeterminant group of lipid A of lipopolysacharide of Yersinia pseudotuberculosis. //Eur. J. Biochem., 1979, V.98, P.83-86.

2. Горбач В.И., Лукьянов П.А., Исаков В.В., Кулеш Ю.Г., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез и исследование методом спектроскопии 13С и 31Р-ЯМР фосфатов 2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкозы. //Биоорганичсская химия, 1980, Т.6, С.81-85.

3. Gorbach V.I., Luk'yanov P.A., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Synthesis of some 2-acylamino-2-deoxy-1,3,4-tri-O-dodecanoyl-P-D-glucopyranose 6-phosphates. //Carbohydrate Res., 1982, V 101, P.335-339.

4. Горбач В.И., Лукьянов П.А., Иванчина Е.В., Исаков В.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез аналогов липида А. Получение производных б'-фосфата (Р1 —>6)-дисахарида 2-ациламино-2-дезокси-D-глюкозы. //Биоорганическая химия, 1982, Т.8, С.1870-1676.

5. Krasikova I.N., Luk'yanov Р.А., Gorbach V.I., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. D-3-Dodecanoyloxytetradecanoic acid as a constituion of lipid A from LPS of Y. pseudotuberculosis. //Experientia, 1984, V.40, P.709-710.

6. Горбач В.И., Лукьянов П.А., Иванчина Е.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Адъювантные свойства фосфорилированных производных N-ацил-О-глюкозамина - аналогов липида А. //Депонировано в ВИНИТИ 16.07.84, N5113-84, 18 с.

7. Горбач В.И., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез аналогов липида А. Получение конъюгатов 6-фосфатов 2-дезокси-2-(З-оксимиристоил)амино-О-глюкозы с полимерными носителями. // Биоорганическая химия, 1985, Т. 11, N 5, С.677-682.

8. Красикова И.Н., Горбач В.И., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Структура иммунодетерминантной группы липипида А из У pseudotuberculosis. //Сборник "Вопросы микробиологии, патологии и диагностики иерсиниозов", Новосибирск, 1985, С.21-25.

9. Горбач В.И., Красикова И.Н., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез аналогов липида А. Получение серологически активных гликолипидов на основе Р(1-»4)-глюкозаминобиозы. //Биоорганическая химия, 1987, Т.13, С.1409-1415.

10. Горбач В.И., Красикова И.Н., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Оволов Ю.С. Миграция ацетильной группы в производных глюкозамина и глюкозы под действием BuLi //Изв. АН СССР, Сер. Хим., 1987, С. 2106-2109.

11. Лукьянов П.А., Горбач В.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез и иммуностимулирующая активность 4-ацилоксибутил-1 -фосфатов. //Хим.-фарм. ж., 1992, Т. 26, С.55-58.

12. Gorbach V.l., Krasikova I.N., Luk'yanov P.A., Loenko Yu.N., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S., Deev V.V., Pimenov A.A. New glycolipids (chito-oligosaccharide derivatives) possessing immuno-stimulating and antitumor activities. //Carbohydrate Res., 1994, v.260, p.73-82.

13. Прокофьева H.Г., Калиновская H.И., Лукьянов П.А., Кузнецова Т.А. Цитотоксическое действие циклических липопопетидов, выделенных из бактерии Bacillus pumilis - ассоциатов морской губки Ircinia sp. //Биология моря, 1995, Т.21, С.419-420.

14. Luk'yanov P. A., Belogortseva N.I., Bulgakov A.A., Kurika A.V., Novikova O.D. Lectins and glycosidases from marine macro- and microorganisms of Japan and Ohotski seas. //PICES Sei. Reports, 1996, No.6, 348-352.

15. Невзорова В.А., Лукьянов П.А., Протопопова М.Ю., Гельцер Б.И. Ингаляционное введение липосом для транспорта бронхолитических препаратов при бронхиальной астме. //Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры, 1990, С. 12-14.

16. Pivkin M.V., Luk'yanov P.A., Mikheyskaya L.V., Bakunina I.Yu., Mikhailov V.V., Elyakov G.B. Biologically active agents of marine fungi.

//Proc Conf. Oceanology, Int. 97 Pacific Rim, Singapore, 1997, V.2, P.67-76.

17. Belogortseva N., Molchanova V., Glazunov V., Evtushenko E., Luk'yanov P. N-Acetyl-D-glucosamine-specific lectin from the ascidian Didemrtum tematanum. //Biochim. et Biophys. Acta, 1998, V. 1380, P. 249-256.

18. Одинцова H.A., Белогорцева Н.И., Ермак A.B., Лукьянов П.А. Новый адгезивный и ростовой фактор для клеток морских беспозвоночных. //ДАН, 1999, С. 271-273.

19. Prokofeva N.G., Kalinovskaya N.I., Luk'yanov P.A., Shentsova E.B, Kuznetsova T.A. The membranotropic activity of cyclic acyldepsipeptides from bacterium Bacillus pumilus, associated with the marine sponge Ircinia sp. //Toxicon, 1999, V.37, P.801-813

20. Arkhipenko I., Koryakova A., Luk'yanov P., Geltser B. Surfactant protein A as the vector in the liposomal cellular interaction. //Eur. Respiratory J.,V.12, P.175-175.

21. Odintsova N.A., Belogortseva N.I., Ermak A.V., Molchanova V.I., Luk'yanov P. A. Adhesive and growth properties of lectin from ascidian Didemmm tematanum on cultivated marine invertebrate cells //Biochim. et Biophys. Acta, 1999, V. 1380, P. 240-256.

22. Корякова А.Г., Кулакова H.B., Кобелев С.С., Нежевая Е.К., Хоменко А.В., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П.А. Некоторые аспекты терапевтической эффективности липосомных форм фенотерола //Тихоокеан. мед. ж., 1999, С. 78-81.

23. Гельцер Б.И., Кривенко Л.Е., Невзорова В.А., Лукьянов П.А. Респираторное влаговыделение и значение его исследования в пульманологии. //Тер. архив, 2000, Т.77, С. 46-50.

24. Корякова А.Г., Кулакова Н.В., Кобелев С.С., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П.А. Биохимическая оценка эффектиности липосомных форм фенотерола//Хим.-фарм. ж., 2000, в печати.

25. Горбач В.И., Красикова И.Н., Лукьянов П.А., Лоенко Ю.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Производные хитоолигосахаридов, обладающих иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью // А.с. № 1652319 (БИ№ 20, 1991 г.)

26. Гельцер Б.И., Невзорова В.А., Лукьянов П.А. Способ коррекции бронхообструктивного синдрома. //Решение о выдаче патента от 1999

27. Гельцер Б.И., Невзорова В.А., Лукьянов П.А, Корякова А.Р., Кулакова Н.В. Способ определения активности и характеристики воспалительных процессов в дыхательных путях. //Решение о выдаче патента от 1999 %

Содержание диссертации автор исследовательской работы: доктора химических наук, Лукьянов, Павел Александрович

1. Введение.

2. Литературный обзор. Иммунобиологические свойства и терапевтическая эффективность липосом.

2.1. Введение

2.2. Структура, физические и физико-химические свойства.

2.3. Стабильность липосомных препаратов.

2.4. Методы получения липосом.

2.5. Иммунохимические и иммуногенные свойства фосфолипидов.

2.5.1. Кардиолипин.

2.5.2. Фосфатидилинозит.

2.5.3. Фосфатидилглицерин.

2.5.4. Фосфатидная кислота.

2.5.5. Фосфатидилсерин. 33 2.5.6 фосфатидилэтаноламин.

2.5.7. Фосфатидилхолин.

2.5.8. 1-Алкил-2-ацетил-глицерофосфохолин.

2.5.9. Ы-Модифицированный РЕ.

2.6. Использование липосом в медицине.

2.7. Особенности использования липосом в пульмонологии.

2.7.1. Взаимодействие липосом с альвеолярными макрофагами.

2.7.2. Взаимодействие липосом с нефагоцитирующими клетками.

2.7.3. Взаимодействие липосом с сурфактантной системой

Введение диссертация по химии, на тему "Липосомная модель в исследовании различных биологически активных веществ"

Более 30 лет прошло с момента открытия спонтанной агрегации фосфолипидов в полностью гидратированном состоянии в замкнутые мембранные оболочки [1]. Дальнейшие исследования показали, что мембрана этих везикул состоит из липидного бислоя, обладающего свойствами полупроницаемого барьера, и замкнутого водного пространства, способного захватывать в момент образования растворенные в водной фазе низко- и высокомолекулярные соединения [2]. Эти везикулы, получившие название липосомы, оказались максимально упрощенной моделью клеточных мембран, и очень скоро стали объектом исследования многих ученых, занимавшихся изучением биологических мембран. С помощью липосом были установлены основные закономерности транспорта веществ через мембрану, показана важная роль фазовых переходов в функционировании мембран, определены молекулярные параметры липидного бислоя и его динамические характеристики, изучены процессы слияния мембран, в реконструированных системах были охарактеризованы индивидуальные мембранные белки и целые белковые ансамбли [3-6].

Новый стимул в развитии теоретических и практических исследований вызвало открытие так называемых "невидимых" стабилизированных липосом, несущих на себе ковалентно привязанные нейтральные гидрофильные цепи полиэтиленгликоля, которые напоминают глитссгкаликс клетки без углеводной специфичности [7-13]. Это позволило расширить области применения липосом, поскольку гидрофильное покрытие предохраняет липосомы от дестабилизирующего взаимодействия липидного бислоя с гидрофобными компонентами окружения. Полиэтиленгликолевые цепи также предохраняют липосомы от взаимодействия их со специфическими фосфолипидными рецепторами на клетках различных органов и тканей, которые участвуют в естественном метаболизме фосфолипидов.

С другой стороны, открытие эффекта слияния положительно заряженных липосом с отрицательнозаряженной мембраной клетки с последующим объединением их водного содержимого, открывает новые перспективы для переноса различных водорастворимых соединений различной природы, неспособных к проникновению через специфические клеточные каналы [14-24]. Таким образом могут быть внедрены в цитозоль клетки различные препараты, такие как водорастворимые низко- и высокомолекулярные соединения внутрь клетки, что открывает новые горизонты по трансфекции клеток, представляющей для биотехнологии особый интерес.

Липосомы были впервые использованы как носители лекарственных препаратов более 25 лет назад. Включение фармакологических препаратов в липидный бислой или во внутреннюю водную фазу липосом может значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат защищен липидным бислоем от действия неблагоприятных факторов, а с другой - липосома служит в качестве депо для токсичного препарата с контролируемой скоростью выхода в окружающее биологическое окружение. Сейчас эффективно разрабатываются новые виды терапии с использованием липосом для переноса ферментов, генетического материала, цитокинов и других соединений внутрь клетки для терапии и профилактики различных заболеваний [14-17,25-27].

Тот факт, что липосомы не задерживаются такими органами, как сердце, почки, мозг, а также клетками нервной системы, позволяет за счет использования липосомных лекарственных форм значительно снизить кардиотоксичность, нефротоксичность и нейротоксичность терапевтических препаратов. Появление новой технологии "невидимых" липосом открывает еще более широкие перспективы использования липосом как универсальных носителей лекарственных препаратов. Кроме того, использование векторных молекул на поверхности липосом, специфичных по отношению к клеткам-мишеням, позволяет проводить целенаправленную доставку противораковых, противоинфекционных и противовоспалительных препаратов [28-35].

Таким образом, липосомы являются не только универсальной клеточной моделью для проведения фундаментальных исследований механизма действия биологически активных соединений, но и прекрасным носителем для лекарственных препаратов, используемых в терапии и профилактике разнообразных патологий.

Расстройства, вызываемые грамотрицательными инфекциями, в основном связаны с патофизиологическим воздействием бактериального эндотоксина - липополисахарида. Он локализован на внешней стенке бактерии и тесно ассоциирован с интегральными белками мембраны [36-40]. Иерсиниозы, к которым относится и чума, относятся к одним из самых серьезных инфекций.

Особенностью дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки, вызываемый бактерией Yersinia pseudotuberculosis, являются обширные постинфекционные осложнения [41-39] . В Тихоокеанском институте биоорганической химии начаты исследования по выяснению структурно-функциональных особенностей главных компонентов мембраны этой бактерии - липополисахарида и белка-порина (иерсинина) открывающие перспективы для создания не только эффективных методов диагностики этого заболевания, но для разработки новых методов терапии.

Широко проводимый скрининг продуцентов биологически активных веществ среди представителей морской микрофлоры, коллекция штаммов которых поддерживается в нашем Институте, приводит к открытию интересных соединений [40]. В частности, бактерии штамма Bacillus pumilis способны секретировать поверхностноактивные соединения - бацирцины, обладающие любопытной рН-зависимой мембранотропной активностью [41-43] . Детальное исследование механизма этой активности позволит не только объяснить его поведение при смене рН-среды, но и, в перспективе, прогнозирование и разработку новых лекарственных средств.

В условиях осложнения экологической обстановки все больше наблюдается случаев тяжелой бронхообструкции у населения с переходом в хронические формы. Применяемые для снятия приступа препараты не обладают в полной мере эффективностью и, одновременно, безопасностью применения. Разработка новых препаратов и лекарственных форм постоянно продолжается.

Фенотерол, являясь эффективным" Рг~агонистом, обладает выраженной кардиотропностью, что при передозировке может приводить к летальным исходам [4 4-4 6]. Получение новой его лекарственной формы является актуальной задачей на сегодняшний день.

Целью настоящей работы является попытка решения перечисленных выше проблем с использованием липосом как клеточной модели, и как носителя в новой липосомной форме фенотерола.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Иммунобиологические свойства и терапевтическая эффективность липосом и

2.1. Введение

Более 30 лет прошло с момента открытия спонтанной агрегации фосфолипидов в полностью гидратированном состоянии в замкнутые мембранные оболочки [1-2]. Дальнейшие исследования показали, что мембрана этих везикул состоит из липидного бислоя, обладающего свойствами полупроницаемого барьера, и замкнутого водного пространства, способного захватывать в момент образования растворенные в водной фазе низко- и высокомолекулярные соединения. Эти везикулы, получившие название липосом, оказались максимально упрощенной моделью клеточных мембран, и очень скоро стали объектом исследования многих ученых, занимавшихся изучением биологических мембран. С помощью липосом были установлены основные закономерности транспорта веществ через мембрану, показана важная роль фазовых переходов в функционировании мембран, определены молекулярные параметры липидного бислоя и его динамические характеристики, изучены процессы слияния мембран, в реконструированных системах были охарактеризованы индивидуальные мембранные белки и целые белковые ансамбли [4-6].

Новый стимул в развитии теоретических и практических исследований вызвало открытие так называемых "невидимых" липосом, несущих на себе нейтральные гидрофильные цепи полиэтиленгликоля и напоминающих гликокаликс клетки без углеводной специфичности [47,48]. С другой стороны, использование положительно заряженных липосом для переноса высокомолекулярных соединений внутрь клетки позволило открыть новые горизонты по трансфекции клеток, что представляет для биотехнологии особый интерес [4 9-50].

Включение фармакологических препаратов в липидный бислой или во внутреннюю водную фазу липосом может значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат защищен липидным бислоем от действия неблагоприятных факторов, а с другой - липосома служит в качестве депо для токсичного препарата с контролируемой скоростью выхода в окружающее биологическое окружение [4-5]. Сейчас эффективно разрабатываются новые виды терапии с использованием липосом для переноса ферментов, генетического материала, цитокинов внутрь клетки для коррекции специфического дефицита [51-54].

Тот факт, что липосомы незначительно задерживаются такими органами, как сердце, почки, мозг, а также клетками нервной системы, позволяет за счет использования липосомных лекарственных форм значительно снизить кардиотоксичность, нефротоксичность и нейротоксичность терапевтических препаратов. Кроме того, использование векторных молекул на поверхности липосом, специфичных по'отношению к клеткам-мишеням, позволяет проводить целенаправленную доставку противораковых, противоинфекционных и противовоспалительных препаратов [55-58]. В зависимости от композиции, размера и заряда липосомы по разному взаимодействуют с ретикулоэндотелиальной системой

РЭС), особенно с локализованными в печени и селезенке макрофагами [59, 60].

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

1. Впервые были получены иммунохимически активные липосомные антигены и иммуногены на основе тетра- и пентаацильных производных б-фосфата D-глюкозамина с остатками 3-гидроки-или 3-миристоилоксимристиновой кислот по аминогруппе. Полученные при поликлональном ответе антитела способны взаимодействовать с природным липидом А грамотрицательных бактерий в липосомном антигене. Поликлональные антитела к липиду А в свою очередь выявляют специфические эпитопы в липосомных антигенах на основе синтетических аналогов. На основании этой перекрестной реактивности можно сделать вывод об общей иммунодоминантной группе липида А и полученных аналогов - остатке 3-гидрокимиристиновой кислоты по аминогруппе глюкозамина.

3. С помощью различных флуоресцентных зондов исследована рН-зависимая конформационная пластичность иерсинина и показано, что в конформационный интермедиат порина в области значений рН 4.5-5.0 находится в оптимальном для взаимодействия со специфическими компонентами бактериальной мембраны. В этом состоянии плотность упаковки бета-структур белка понижена, а остатки триптофана более доступны для гидрофильных акцепторов флуоресценции, в отличие от гидрофобных. В этом состоянии иерсинина векторами спонтанного встраивания являются липополисахарид и липид А. При других значениях pH основными векторами встраивания являются любые отрицательно заряженные фосфолипиды.

4. Выяснена роль физико-химического состояния бацирцина 5, липодепсипептида из бактерии Bacillus pumilis, в его рН-зависимом мембранотропном действии. На основании экспериментов по определению скорости выхода анионного флуоресцентного зонда (ANS) из липосомного бислоя в присутствии BI-5 были определены константы ионизации остатков Glu и Asp, входящих в состав пептидного звена, равные 4.7 и 6.7, соответственно. Показано, что в условиях максимальной гемолитической активности при pH 6.5 бацирцин 5 находится в моноионизированном состоянии, в виде двузарядного аниона при pH 7.4 он удерживается в мембране, но не проявляет гемолитической активности. Взаимопереходы бацирцина 5 между моноанионным и дианионным состояниями обратимы и определяют его мембранотропное действие.

5. Разработана липосомная форма широко применяемого для снятия бронхоспазма р2-агониста - фенотерола (ЛФФ), и исследована ее терапевтическая эффективность на экспериментальной модели бронхообструкции у крыс. Найдено, что токсичность фенотерола в составе липосом снижена, по крайней мере, в 15 раз по сравнению с его свободной формой. Липосомная форма при ингаляции в легкие эффективно снижает уровень гистамина в бронхоальвеолярном секрете, эффективно снижает Ш-синтазную активность. Липидная основа ЛФФ эффективно подавляет процессы перекисного окисления липидов, связанные с сопутствующим хроническим воспалением, с другой стороны - восполняет потерянный при длительном воспалении пул фосфолипидов сурфактанта.

6. Максимальная эффективность липосомной формы фенотерола определяется такими параметрами липидного бислоя как оптимальная микровязкость и заряд бислоя. ЛФФ на основе суммарных фосфолипидов легкого с точкой фазового перехода 30°С является более эффективной, чем на основе яичного фосфатидилхолина. Включение холестерина для повышения микровязкости бислоя и синтетического дицетилфосфата для увеличения заряда мембраны в ЛФФ на основе яичного лецитина приводит к повышению терапевтической эффективности до таковой для ЛФФ на основе фосфолипидов легкого.

7. Основной белок сурфактанта легких (БР-А) является эндогенной векторной молекулой в эффективной доставке липосом клеткам-мишеням при ингаляции ЛФФ. В экспериментах л.п^л.'Ьго ЛФФ эффективно снижает ТО-синтазную активность и генерацию реактивных форм кислорода в миеломоноцитарных клетках, стимулированнь1х липополисахаридом. В присутствии БР-А эффект липосомной формы усиливается в 1.5-2 раза.

2.8. Заключение.

Из выше приведенных данных следует, что липосомы находят все большее и большее применение в различных областях науки и практики. Липосомная модель является универсальной в решении различного рода задач, как фундаментального исследования, так и технологического. Тщательно контролируемая композиция липосом позволяет придавать необходимые свойства липосомным препаратам при использовании их в медицине, косметологии и пищевой промышленности. Такое широкое применение липосом переводит их из лабораторной модели в разряд продуктов крупномасштабного производства. Природные фосфолипиды, являясь пищевыми продуктами, не могут быть широко использованы в этих целях. Поиск новых заменителей природных фосфолипидов, столь же универсальных, постоянно продолжается. Оказывается, что принцип амфифильности молекулы, позволяющий фосфолипидам самоорганизовы.ваться в искусственные бислои, универсален для разнообразных соединений нелипидной природы. Везикулы, получаемые из большого числа синтетических амфифильных веществ, во многом повторяют пластические свойства липосом и во многих случаях могут прекрасно заменять липосомы, сделанные из природных материалов.

0о

Результаты и обсуждение

3.1. Иммунобиологические свойства моносахаридных аналогов липида А

Исследования липида А из липополисахарида псевдотуберкулезного микроба требовали выявления его важнейших структурных элементов, ответственных за проявление биологической активности. В частности, для изучения иммунохимических свойств были необходимы простые синтетические соединения, моделирующих иммунодетерминантную группу липида А и ее окружения. Синтетический подход позволяет, разнести токсические элементы структуры и группы, ответственные за его полезные иммунобиологические свойства. Это путь к созданию иммуногенов без нежелательных эндотоксических свойств и выход к иммуномодуляторам клинического применения.

Основной задачей нашей работы стало выяснение роли остатков ЖК, ацилирующих гидроксильные группы в молекуле липида А. Для этого был предпринят синтез, с одной стороны, 4-ацилоксибутил-1-фосфатов как амфифильных соединений с эфирами ЖК, специфичных для липида А, а с другой стороны, получение производных глюкозамина как моносахаридных аналогов липида А с различными О-ацильными заместителями. Дополнительно нас интересовало влияние физического состояния исследуемых веществ на проявляемую активность.

3.1.1. Исследование иммунохимической активности.

Липид А - необычный фосфолипид, содержащий в основе своей молекулы р (1—>6)-глюкозаминобиозу или в некоторых случаях 2,3-диамино-2,3-дидезокси-0-глюкопиранозу[365-367]. Гидроксильные и аминогруппы в молекуле липида А ацилированы специфическими для него гидрокси- и ацилокси- ЖК. Фосфатные, фосфодиэфирные или пирофосфатные группы замещают гидроксильные группы при С-1 и С-41 атомах глюкозаминобиозы.

Липид А входит в состав липополисахаридов, которые локализованы на внешней поверхности грамотрицательных бактерий и отвечают за основные структурно-функциональные аспекты их жизнедеятельности. По последним данным [366,368,370] полисахаридная часть в молекуле липополисахаридов связана с липидом А кислотолабильной связью с первичной гидроксильной группой невосстанавливающего конца дисахаридного остова молекулы. Липид А ответственен за проявление эндотоксических свойств липополисахаридов, с которыми связывают весь спектр патофизиологических последствий инфекции грамотрицательными бактериями. Серологические исследования образцов липида А из различных бактерий показали наличие у них общей иммунодетерминантной группы [367,371]. Было показано, что иммунохимические свойства липида А в основном связаны с остатком 3-гидроксимиристиновой кислоты (ОМК), ацилирующей аминогруппу глюкозамина [367,371,372]. Липид А из псевдотуберкулезного микроба после удаления эфиров ЖК с помощью гидроксиламина также сохраняет ингибирующую активность [349]. В последнее 15 лет наметился особый прогресс в синтезе полной структуры липида А, его аналогов и биосинтетических предшественников. Были получены многочисленные соединения, моделирующие отдельные элементы молекулы липида А, в частности, моносахаридные аналоги [96,99,100,373,374], соответствующие восстанавливающему и невосстанавливающему концам, и дисахаридные, варьирующие положения и количество ацильных заместителей и фосфатных групп [375-377].

Нами синтезированы простые моносахаридные аналоги липида (1-10) , несущие фосфатную группу по первичной гидроксильной группе D-глюкозамина и варьирующие О- и N-ацильными заместители. Для выяснения влияния роли ЖК, ацилирующих гидроксигруппы в молекуле липида А, на его иммуностимулирующую активность нами синтезированы 4-ацилоксибутилфосфаты (11-14). Из ЖК выбраны миристиновая, ОМК, 3-миристоилоксимиристиновая (ММК) и 3-ацетилоксимиристиновая, как менее гидрофобный аналог ММК. Для сравнения было синтезировано соединение с этиленгликолевой основой (15).

При исследовании иммунохимических свойств моносахаридных аналогов при взаимодействии с антителами к природному липиду А из Y. pseudotuberculosis в ингибировании реакции пассивного гемолиза (РПГ) оказалось, что соединение (1) ингибирует взаимодействие липида А со специфической сывороткой в концентрации большей, чем природный липид А (рис.1). Ингибирование не достигает 100%, так как это соединение вызывает неспецифический лизис эритроцитов в концентрациях выше 100 мкг/мл.

1.(С6Н5)2РОС1 г.СцНгзСОС! З.Н+

ОРО(С6Н5)2 о

1.R-X

2.H2/Pt

N=CHC6H4(OCH3)

ОРО(ОН)2 о

1 2 3 4 5 6 7 8 9

11 12

NH2 X HCl

NHR

1-Ю)

C11H23CHRCH2COOCH2CH2CH2CH2OPO (ОН) 2

11-15)

R Н Н

СОСНз

СОСцНгз

СОСНз

СОСцНгз Н

ОН

ОСОСНз

ОСОС13Н27

ОН

СОСНгСН (ОН) СцНгз СОС13Н27

СОСНгСН (ОН) СцН2з

СОСНз

СОСцНгз

СОС13Н27

СОСНгСН (ОН) СцНгз СОСНгСН (ОСОС13Н27) СцНгз СОСНгСН (ОАС4) СцН2з СОСНгСН (ОАС4) СцНгз п 4 4 4 4 2

М-миристоильное производное (2) также взаимодействует с антителами к липиду А, хотя вызывает 50% ингибирование в большей концентрации, чем ОМК производное (1) . Ранее на дисахаридных аналогах липида А также была показана одинаковая серологическая активность для соединений с миристиновой кислотой и ОМК по аминогруппе.

Концентрация, мкг/мл

Рис.1. Ингибирование гаптенами взаимодействия липида А из Y. pseudotuberculosis со специфической антисывороткой в РПГ.

Было найдено также, что моносахаридный аналог липида отличающийся от синтезированного нами (1) положением фосфатно группы, 1-фосфат N-3-гидроксимиристоил-О-глюкозамин взаимодействует с антителами к липиду А [378]. Этот фак подтверждает несущественную роль положения фосфата в молекуле дл взаимодействия с поликлональными антителами. По-видимому иммунодоминантной группой липида А при иммунизации животны природным гетерогенным липидом А является ОМК, ацилирующа аминогруппу глюкозамина.

Таким образом, для проявления серологической активности аналогами липида, ацилированными только по аминогруппе, гидроксигруппа при С-3 атоме ОМК не играет определяющей роли. В предварительных экспериментах было показано, что иммунохимическая активность синтетических аналогов липида А (1,3,7,8) в водных растворах отличалась от таковой в липосомной мембране. Одно из наиболее активных в липосомах аналогов (7) оказался слабым ингибитором реакции липида А со специфическими антителами в водном растворе. Его выраженный гидрофобный характер предполагает способность к агрегации в водных растворах, на это указывает уширение сигналов в его 13С-ЯМР-спектре. Поэтому было необходимо уточнить физико-химическое состояние этих соединений в условиях проведения биотестов.

Список источников диссертации и автореферата по химии, доктора химических наук, Лукьянов, Павел Александрович, Владивосток

1.D., Ноте R.W. Negative Staining of Phospholipids and their Structured Modification by Surface Agents as Observed in the Electron Microscope //J. Mol. Biol., 1964. Vol. 8. P. 660-668.

2. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins I. C. Diffusion of Univalent Ions Across the Lamelae of Swollen Phospholi-pids //J. Mol. Biol., 1965. Vol. 13. P. 238-252.

3. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. M.: Просвещение, 1987 .

4. Driessen, A. J. М. , and Konings, W. N. Insertion of Lipids and Proteins into Bacterial-Membranes by Fusion with Liposomes. //Meth.Enz., 1993, V. 221, P. 394-408.

5. Липосомы в биологических системах /Под ред. Г. Грегориадиса, А. Аллисона. М.: Медицина, 1983.

6. Lasic D.D. Liposomes: From Physics to Applications. Amsterdam: Elsevier, 1993.

7. Woodle M.C., Newman M.S., Collins L.R., Martin F.J. Efficient Evaluation of Long Circulating or Stealth Liposomes by Studies of In vivo Blood-Circulation Kinetics and Final Organ Distribution in Rats. //Biophys. J., 1990, V.57, N 2, P.A261-A261.

8. Allen T.M., Hansen C. Pharmacokinetics of Stealth Versus Conventional Liposomes Effect of Dose. //Biochim. Biophys. Acta, 1991, V.1068, N 2, P.133-141

9. Yuan F., Leunig M., Huang S.K., Berk D.A., Papahadjopoulos D., Jain R.K. Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (Stealth) liposomes in a human tumor xenograft. //Cancer Res. 1994, V. 54, N 13, P. 3352-3356.

10. Trubetskoy V.S., Torchilin V.P. Use of Polyoxyethylene-Lipid Conjugates as Long-Circulating Carriers for Delivery of Therapeutic and Diagnostic Agents. //Advance Drug Deliv. Rev., 1995, V. 16, N 2-3, P.311-320.

11. Winterhalter M., Frederik P.M., Vallner J.J., Lasic D.D. Stealth(R) Liposomes From Theory to Product. //Advanced Drug Del. Rev., 1997, V.24, N 2-3, P.165-177.

12. Marietherien H., Gruda J., Lieu H., Dion F. Suppression of the Lymphoproliferative Response by Positively Charged Liposomes. //Immunopharacology, 1987, V. 14, N 3, P. 127-133.

13. Leserman L., Langlet C., Schmittverhulst A.M., Machy P. Positive and Negative Liposome-Based Immunoselection Techniques. //Methods Cell Biol., 1989, V. 32, P.447-471.

14. Holmberg E.G., Reuer Q.R., Geisert E.E., Owens J.L. Delivery of plasmid DNA to glial cells using pH-sensitive immunoliposomes. //Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, V. 201, N 2, P.888-893.

15. Alino S.F., Bobadilla M., Crespo J., Lejarreta M. Human Alpha-1- Antitrypsin Gene-Transfer to in-Vivo Mouse Hepatocytes.//Human Gene Therapy, 1996, V. 7, N 4, P.531-536.

16. Boulikas T. Cancer Gene-Therapy and Immunotherapy. //Int. J. Oncol., 1996, V.9, N 5, P.941-954.

17. Dzau V.J., Mann M.J., Morishita R. , Kaneda Y. Fusigenic Viral Liposome for Gene-Therapy in Cardiovascular-Diseases. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, V.93, N 21, P.1142111425.

18. Ishii N., Fukushima J., Kaneko Т., Okada E., Tani K., Tanaka S.I. Cationic Liposomes Are a Strong Adjuvant for a DNA Vaccine of Human-Immunodeficiency-Virus Type-1. //Aids Res. Human Retrovir., 1997, V. 13, N 16, P.1421-1428.

19. Konopka K. , Stamatatos L., Larsen C.E., Davis B.R., Duzgunes N. Enhancement of Human-Immunodeficiency-Virus Type-1 Infection by Cationic Liposomes The Role of CD4, Serum and Liposome Cell- Interactions. //J. Gen. Virology, 1991, V. 72, P.2685-2696.

20. Gregoriadis G. Engineering Liposomes for Drug-Delivery -Progress and Problems. //Trends in Biotech., 1995, V. 13, N 12, P.527- 537.

21. Кашкин К.П., Дмитриева И.Н., Голованова Г.А., Куликов В.И., Шершелевич И. В. Липосомы как носитель полифункциональных иммуногенов. //Укр. биохим. ж., 1987, Т. 57, № 4, С.100-107.

22. Ringden 0., Tollemar J. Liposomal Amphotericin-B (Ambisome(R)) Treatment of Invasive Fungal-Infections in Immunocompromised Children. //Mycoses, 1993, V. 36, N 5-6, P.187-192.

23. Rios A., Rosenblum M. , Crofoot G., Lenk R.P., Hayman A.,1.pezberestein G. Pharmacokinetics of Liposomal Nystatin in Patients with Human-Immunodeficiency-Virus Infection. //J. Infect. Disseases, 1993, V. 168, N 1, P.253-254.

24. Allen T.M., Ahmad I., Demenezes D.E.L., Moase E.H. Immunoliposome- Mediated Targeting of Anticancer Drugs in-Vivo. //Biochem. Soc. Transactions, 1995, V. 23, N 4, P.1073-1079.

25. Avrilionis K., Boggs J.M. Specific Targeting of Phototoxic Haptenated Liposomes to a Hapten-Specific B-Cell Lymphoma. //Cell. Immun., 1996, V. 168, N 1, P.13-23.

26. Emanuel N., Kedar E., Bolotin E.M., Smorodinsky N.I., Barenholz Y. Targeted Delivery of Doxorubicin via Sterically Stabilized Immunoliposomes Pharmacokinetics and Biodistribution in Tumor- Bearing Mice. //Pharm. Res., 1996, V. 13, N 6, P.861-868.

27. Francis G.E., Delgado C., Fisher D., Malik F., Agrawal A.K. Polyethylene-Glycol Modification Relevance of Improved Methodology to Tumor Targeting. //J. Drug Targeting, 1996, V. 3, N 5, P.321-324.

28. Huwyler J., Wu D.F., Pardridge W.M. Brain Drug-Delivery of Small Molecules Using Immunoliposomes. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, V. 93, N 2, P.14164-14169.

29. Kakinuma K., Tanaka R., Takahashi H., Watanabe M., Nakagawa T., Kuroki M. Targeting Chemotherapy for Malignant Brain-Tumor Using Thermosensitive Liposome and Localized Hyperthermia. //J. Neurosugery, 1996, V. 84, N 2, P.180-184.

30. Vingerhoeds M.H., Steerenberg P.A., Hendriks J.J.G.W.,

31. Dekker L.C., Vanhoesel Q.G.C.M., Crommelin D.J.A. Immunoliposome-Mediated Targeting of Doxorubicin to Human Ovarian-Carcinoma in-Vitro and in-Vivo. //British J. Cancer, 1996, V. 74, N 7, P.1023-1029.

32. Konisky J.// Bacterial outer membranes: Biogenesis and functions/ Ed. Inouye M. . New York: John Wiley and sons. Inc., 1979.

33. Hitchcock P.J., Morrison D.C. // Handbook of endotoxin: Chemistry of endotoxin. Ed. Rietschel E.T. New York: Elsevier Inc., 1984. V. 1. P. 339-375.

34. Федореева Jl.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. //Биоорган, химия, 1984, Т. 10, № 1., С. 93-99.

35. Соловьева Т.Ф., Бахолдина С.И., Ермак И.М., Хоменко В.А., Федореева Л.И., Новикова О.Д., Фролова Г.М., Лихацкая Г.Н., Оводов Ю.С. //Биоорган, химия, 1990, Т. 16, № 10, С. 1301-1309.

36. Михайлов В.В., Кузнецова Т.А., Еляков Г. Б. Морские микроорганизмы и их вторичные биологически активные метаболиты /Под ред. Калинина В.И., Владивосток: Дальнаука, 1999.

37. Прокофьева Н.Г., Калиновская Н.И., Лукьянов П.А., Кузнецова Т.А. Цитотоксическое действие циклических липопопетидов, выделенных из бактерии Bacillus pumilis ассоциатов морской губки lrcinia sp. //Биология моря, 1995, Т.21, С.419-420.

38. Prokofeva N.G., Kalinovskaya N.I., Luk'yanov P.А., Shentsova E.B, Kuznetsova T.A. The membranotropic activity of cyclic acyldepsipeptides from bacterium Bacilluspumilus, associated with the marine sponge Ircinia sp. //Toxicon, 1999, V. 37, P.801-813

39. Clarke P.S., Ratowsky D. A. Effects of fenoterol hydrobromide and sodium cromoglycate individually and in combination on postecercise asthma //Ann. Allergy, 1990, V. 64, N 2, P. 187-190.

40. Coleman A., Leary W., Asmal A. Cardiovascular effects of fenoterol //S. Afr. Med. J., 1973 Vol. 47, № 14, P. 618-620.

41. Cochrane G.V. Bronchial asthma and the role of B2-agonists //Lung. 1990, Vol. 168, P. 66-70.

42. Ostro M.J. Introduction. In: Liposomes: from biophysics to therapeutics. /Ed. Ostro M.J. New York: Marcel Dekker. Inc., 1987.

43. New R.R.C. Introduction. In: Liposomes a practical approach. 1. /Ed. New R.R.C. Oxford, New York, Tokyo: Irl Press, 1990.

44. Gregoriadis G. Immunological adjuvants: a role for liposomes. //Immunology Today, 1990, V. 11, P. 89-97.

45. Papahadjopoulos D. A new perspective on liposomes. //J. Liposome Res., 1992, V. 2, P. iii-xviii.

46. Romanova E.B., Gevashvih D.B., Koslikina N.V., Torchilin V.P. Toxicity and immunogernc properties of liposomal form of Vipera libetina venom- //J. Liposome Res., 1992, V. 2, P. 205-216.

47. Laing G. Theakston R.D.G. Immunization against Ecfiis ocellatus (Carpet viper) venom using liposomes incorporating immunostimulants: role oflipopoivsaccharide in conferring protection in a mouse model. //Toxicon, V. 31, 1993, P.615-626,.

48. Gruner S.M. Material propeties of liposomal bilayers. In: Liposomes: from biophysics to therapeutics /Ed. Ostro M.J., I, New York: Marcel Dekker, Inc., 1987.

49. Crowe L.M., Crowe J.H., Rodolph A., Womersley C., Appel L.

50. Preservation of freeze-dried liposomes by trehalose. //Arch. Bioch. Biophys., 1985, V. 242, P. 240-247.

51. Frezard F., Santaella C., Vierling P., Riess J.G. Permeability and stability in buffer and in human serum of fluorinated phospholipid-based liposomes. //Biochim. Biophys. Acta, 1994, V. 1192, P.61-70.

52. Kirby C., Gregoriadis G. Dehydration-rehydration vesicles: a simple method for high yield drug entrapment in liposomes. //Biotechnology, 1984, V. 2, P. 979-984.

53. Friede M, van Regenmortel MHV & Schuber F. Liophilized liposomes and shelf items for the preparation of immunogenic liposome-peptide conjugates. //Analytical Biochemistry, V. 211, 1993, P. 117-122.

54. Crowe L.M. & Crowe J.H. Freeze-dried liposomes. In: Liposomes, new systems and new1 trends in their applications. /Eds. Puisieux F. , Couvreur P., Delattre J., Devissaguet J.P., Paris: Editions de Sante, 1995.

55. Szoka F. & Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. //Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1978, V. 75, P. 4194-4198.

56. Shew R.L. & Deamer D.W. A novel method for encapsulation of macromolecules in liposomes. //Biochim.Biophys.Acta, 1985, V. 816, P. 1-8.

57. Tan L., Loyter A. & Gregoriadis G. Incorporation of reconstituted influenza virus envelopes into liposomes: studies of the immune response in mice. //Biochem.Soc. Transactions, 1989, V. 17, P. 129-130.

58. Gregoriadis G. The carrier potential of liposomes in biology and medicine. //New England J. Med., 1976, V. 295, P. 704-710.

59. Fattal E., Ramaldes G.A., Oilivon M. Oral delivery of vaccines by means of liposomes. In: Liposomes, new systems and new trends in their applcations /Eds. Puisieux F.,

60. Couvreur P., Delattre J. & Devissaguet J. P. , New York: John Wiley and sons. Inc.,1995.

61. Lasic D.D. & Papahadjopoulos D. Liposomes revisited. //Science, 1995, V. 267, P. 1275-1276.

62. Santaella C., Frezard F., Vierling P. & Riess J.G. Extended in vivo blood circulation time of fluorinated liposomes. //Fed. Eur. Biochem. Soc. Letters, 1993, V. 336, P. 481-484.

63. Gregoriadis G., Garcon N., Senior J. & Davis D. The immunoadjuvant action of hposomes: nature of immune response and influence of liposomal characteristics. In: Liposomes as drug carriers. /Ed. Gregoriadis G., New York: John Wiley and Sons, 1988.

64. Buiting A.M.J., van Rooijen N. & Claassen E. Liposomes as antigen carriers and adjuvant in vivo. //Res. Imm., 1992, V. 143, P. 541-548.

65. Antimisiaris S.G., Jayasekera P. & Gregoriadis G. Liposomes as vaccine cairiers: incorporation of soluble and particulate antigens in giant vesicles. //J. Imm. Meth., 1993, V. 166, P. 271-280.

66. Barratt G. & Morin C. Liposomal immunomodulators. In:1.posomes, new systems and new trends in their applcatlons /Eds Puisieux F. , Courteur P., Delattre J. & Devissaguet J.P., Paris: Editions de Sante, 1995.

67. Gregoriadis G., Florence A.T. Liposomes in drug delivery. Clinical, diagnostic and ophthalmic. //Drugs, 1993, V. 45, P. 15-28.

68. Alving C.R. Lipopolysaccharide, lipid A and liposome contaming lipid A as immunological adjuvants. //Immunbiol., 1993, V. 187, P.430-446.

69. Grasset E. Anavenoms and their use in the preparation of antivenoms sera. //Trans. Royal Soc. Trop. Med. Hyg., 1985, V. 38, P. 463-488.

70. Vosika G.J., Barr C., Gilbertson.D. Phase-1 study of intravenous modified lipid A. //Cancer Immunother., 1984, V. 18, N 2, P. 107-110.

71. Kern M. Selective binding of lipid A to responder and nonresponder limphocyte-B subpopulations. //Rev. Infect. Dis., 1984, V. 60, N 4, P. 506-510.

72. Goodman S.A., Vukajlovich S.W., Munkenbeck P., Morrison D.C. Selective interaction between lymphocytes and lipid A subunits in lipopolysacchride macromolecular aggregates. // Rev. Infect. Dis., 1984, V. 6, N 4, P.511-518.

73. Бергельсон Л.Д. Некоторые современные тенденции в развитии науки о липидах. ,//Укр. биохим. ж., 1984, Т. 96, № 3, С. 243-244.

74. Крепе Е.Т. Липиды клеточных мембран. /Л.: Наука, 1981.8 3 Скатов Т.С. Роль липидных компонентов биологических мембранв рецепции гормонов и функционирования аденилатциклазной системы. //Укр. биохим. ж. 1981, Т. 53, № 2, С. 44-51.

75. Hanahan D.J., Nelson D.R. Phospholipids as dynamic participants in biological process.-//J. Lipid Res., 1984, V. 25, N 13, P. 1528-1535.

76. Das N.D., Yoshioka T., Samuelson D., Shichi H. Immunocytochemical localization of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate in Dark-adopted and Light-adopted Rat Retinas. //Cell Structure, 1986, V. 11, N 3, P. 53-63.

77. Hanahan D.J., Kumar R. Platelet activating factor, chemical and biochemical characterization. //Prog. Lipid Res., 1987, V. 26, P. 1-28.

78. Braguet P., Rola-Pleszczynsky M. Platelet activating factor and cellular immune responses. //Immun. Today, 1987, V. 8, N 11, P. 343-332.

79. Banerji В., Alving C.R. Antiliposome antibodies induced by lipid A.I. Influence of Ceramid, Glycosphingolipids, and Phosphocholine on Complement Damage. //J. Immunol., 1981, V. 126, N 3, P. 1080-1084.

80. Alving C.R. Antibodies to liposomes, phospholipids and phosphate-esters. //Chem. Phys. Lipids, 1986, V. 40, N 2-4, P. 303-314.

81. Janoff A.S., Rauch J. The structural specificity of antiphospholipid antybodies in autoimmune disease. // Chem. Phys. Lipids, 1986, V. 40, N 2-4, P. 315-332.

82. McHugh N.J., Maymo J., Sinner P.P., James 1., MaddisonP. J. Anticardiolipin antibodies, Viredo Heticalaris and Mayor Cerebrovascular and Renal-Disease in bystemic Lupus Erythematosus. //Ann. Rheum. Dis., 1988, V. 47, N 2, P.110.115.

83. Asero R., Vismara A., Brucato A., Riboldi P., Meroni P.L. Anticardiolipin Antibodies in progressive systemic-sclerosis. //Clin. Exp. Ph., 1987, V. 5, N 4, P. 387-380.

84. Canoso R.T., Zon L.I., Groopman J.E. Anticardiolipin antibodies associated with HTLV-III. //Brit. J. Haem., 1988, V. 68. N 3, P. 270-271.

85. Horris E.N., Gharavi A.JE., Hugnes G.R.V. Antiphospholipid antibodies. //Clin. Reum., 1985, V. 11, N 3, P. 591-609.

86. Costello P.В., Green' F.A. Reactivity Patterns of Human Anticardiolipin antibodies in syphilitic sera. //Infect. Immun., 1986, V. 51, N 3, P. 771-775.

87. Urbaneja M.A., Gerardo D., Fidelio J.A., Lucy J.A., Chapman D. The interaction of an antilipid antibody (TEPC 15) with a model biomembrane system (monolayer). //Biochim. Biophys. Acta, 1987, V. 898, N 2, P. 253-256.

88. Lafer E.M., Rauch J., Andrzejewski C., Mudd D., Furie В., Furie В., Schwartz R.S., Steller B.S. Polyspecific monoclonal Lupus autoantibodies reactive with both polynucleotides and phospholipids. //J. Exp. Med., 1981, V. 153.,N 3, P. 897-909.

89. Galanos C. Biological properties of lipopolysaccharides (LPS) and lipid A. //Toxicon, 1979, V. 17, N 1, P. 53-54.

90. Orata S., Mashimo J., Kosai N., Okuda K., Aihara U., Kotani S., Takada H., Shiba Т., Kusumoto S., Shimamoto J. Characterization of monoclonal lipid A antibodies with synthetic lipid A analogs. //FEMS Microb. Letters, 1988, V. 49, N 3, P. 479-482.

91. Краснопольский Ю.М., Гольбец И.И., Сенникова Г.А., Швец

92. B.И. Иммунохимия липидов. //Хим. Фарм. Ж., 1981, Т. 15, N 7, С. 13-25.

93. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Основные направления иммунохимии липидов. //Укр. Биохим. Ж., 1984, Т. 56, N 3,1. C. 254-263.

94. Kinsky S.C. Factors Affecting Liposomal Model Membrane Immunogenecity. Liposomes and Immunobiology /Tom B.H., Six H.R. (eds.), London: Elsevier, 1960.

95. Alving C.R. Immune reactions of lipids and lipid model membranes .- The Antigens, V. 4. /Sela M. (ed. ) , New York: Acad. Press, 1977.

96. Asherson R.A., Harris E.N. Anticardiolipin antibodies clinical associations. //Postg. Med. J., 1986, V. 62, N 734, P. 1081-1087.

97. Pangborn M.C. Futher studies of cardiolipin. //N.Y. State Dept. Helth, Ann. Rept. Div. Labs and Research, 1942, P. 18-20.

98. Macfarlane M.G. Phosphatodyiglycerols and lipoaminoacids. //Adv. Lipid. Res., 1964, V. 2, P. 91-125.

99. Inoue K., Nojima S. Immunochemical studies of Phospholipids

100. I. Production of antibody to cardiolipin. //Biochim. Biophys. Acta, 1967, V. 144, P. 409-414.

101. Inoue K. Nojima S. Immunochemical studies of phospholipids.1.. The reactivities of antisera against natural cardiolipin and synthetic cardiolipin analogues containing antigens. //Chem. Phys. Lipids, 1969, V. 3, N 1, P. 70-77.

102. Inoue K., Nojima S., Tomizawa T. Specificity of cardiolipin in serological reaction. //J. Biochem., 1965, V. 57, N 6, P. 824-826.

103. Takashi T., Inoue K., Nojima S. Immune Reaction of Liposomes Containing Cardiolipin and Their Relation to Membrane Fluity. //J. Biochem., 1980, V. 87, N 3, P. 679-635.

104. Green F.A., Costello P.B. Divalent cation effect on the binding of human antiphospholipid antibodies. //Biochim. Biophys. Acta, 1987, V. 896, N 1, P. 47-51.

105. Markus D.M., Schwarting G.Q. Immunochemical properties of glycolipids and phospholipids. /Kunkel H.G., Dixon F.J. (eds.) London: Acad.Press, 1976.

106. Guarnieri M., Stechmiller B., Lehninger A.L. Use of an antibody to study the localization of cardiolipin in mitochondrial membranes. //J. Biol. Chem., 1971, V. 246, N 11, P. 7526-7532.

107. Schiefer H.G. The orientation of serologically active phospholipids in mitochondrial membranes. //Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem., 1973, B. 354, S. 722-724.

108. Alving C.R., Ricuards R.L. Immune reactivities of antibodies against glycolipids. I. Properties of antigalactocerebroside antibodies purified by a novel technique of affinity binding to liposomes. //Immunochem., 1970, V. 14, N 5, P. 373-381.

109. Rasin S., Prescott B., Caldes G., James N.D., Chanock R.Ai. Role of glycolipids and phosphatidyiglycerol in serological activity of Mycoplasma pneumonia. //Infect. Immun., 1974, V. 1, N 4, P. 408-416.

110. Costello P.B., Green F.A. Cholesterol effects on the interaction of cardiolipin with anticardiolipin antibody. //Bichim. Biophys. Acta, 1987, V. 896, N 1, P. 52-56.

111. Intrator L., Oksenhendler E., Desforges L. , Bierling P. Anti-cardiolipin antibodies in hiv infection patients with or without immune trombocytopenic purpura. //Br. J. Haem., 1988, V. 68, N 2, P. 269-270.

112. Mizutani W.M., Doods V.L., Zvaifler N.J. Anti-cardiolipin antibodies in Human Immunodeficiency virus (HIV) Infected Gay Males may be associated with defectorating clinical course. //Clin. Res., 1988, V. 36, N 1, P. A188-A193.

113. Unander A.M., Norberg G., Hahn L., Arfors L. Anti-cardiolipin antibodies and Complement in 99 women with habitual abortion. //Amer.J. Ohst. G., 1987, V. 156, N 1, P. 114-119.

114. Koskela P., Vaarala 0., Makitalo 0., Palasno Т., Abo K. Significance of false-positive syphilis reactions and anti-cardiolipin antibodies in a nationwide series of pregnant-women. //J. Rheumatol., 1988, V. 15, N 1, P. 70-73.

115. Aho K., Rostedt I., Saris N.E. Reactivity of various anti-cardiolipin antibodies with intact mitochondria. //Clin. Exp. Immunol., 1973, V. 14, N 4, P. 573-579.

116. Konemasa J. Electron-microscopie observations of lipid antigens special reference to Wassermann antigen. //Jap. J. Microbiol., 1974, V. 18, N 3, P. 193-202.

117. Василенко И.А., Евстигнеева Р.П. Полиморфизм фосфолипидов в модельных и биологических мембранах. //Известия АН СССР,

118. Сер. Биол., 1986, № 4, С. 550-560.

119. Alaronaegovia D. Pathogenetic potential of anti-phospholipids antibodies. //J. Rhumatol.,1988, V. 15, N 6, P. 890 -893.

120. Costello P.В., Green F.A. Binding affinity of serum immunoglobuline G to cardiolipin and other phoapholipida in patient with systemic erytromatosia and syphilis. //Infect. Immun., 1936, V. 56, N 7, P. 1738-1742.

121. Kataoka Т., Nojima S. Immunoelectrophoresis of rabbit antisera against phospholipid haptens. /Jap. J. Exp. Med.,1969, V. 39, N 2, P. 129-132.

122. Guarniery M. Reaction of cardiolipin and phosphatidylinositol antisera with phopholipids antigens. //Lipids, 1974, V. 9, N 9, P. 692-695.

123. Takahashi Y. Development de la reaction de kaolino-agglutination par tuberculophosphatide etsa mise en practique. //Poumonetcocur., 1963, V. 19, N 4, P. 307-326.

124. Якименко Е.Ф., Рудинская Т.Д., Куприна Н.И., Ситковский М.В. Фосфолипидные гаптены: перекрестная реактивность кардиолипина и фосфоинозита. //Бюлл. Экспер. Биол., 1978, Т. 86, № 7, С. 46-49.

125. Kataoka Т., Nojima S. Immunochemical Studies of Phospholipids. 5. Haptenic Activity of Phosphoinositol and Role of Lecitine as an auxiliary lipid. //J. Immunol.,1970, V. 105, N 2, P. 502-505.

126. Radunz A. Binding of antibodies on to the thylakoid membrane. 4. Phosphatides and xanthophylls in the outer surface of the thylakoid membrane. //Z. Naturforsh.,1978, B. 33, N 11, S. 941-947.

127. Greenberg A.J., Trevor .J., Jonhnson D.A., Loh H. H. Immunochemical Study of Phospholipids: Antibodies preparation to triphosphoinosite. //Molec. Immunol., 1979, V. 16, N 3, P. 193-196.

128. Koch F., Thiele H.G., Low M.G. Phosphatidylinositol is themembrane anchoring domain of the rat T-cell differentiation antigen RT-6.2. //Immunobiol., 1988, V. 173, N 2-5, P. 363-364.

129. Schiefer H.G., Gerhardt U., Brunner H. Immunological studies of localization of phosphatidylglycerol on membranes of Mycoplaama bominia. //Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem., 1975, B. 355, S. 559-565.

130. Краснопольский Ю.М., Гольбец Н.И., Сонников Г.А., Швец В.И. Липидный состав гоннокока Нейссера. //Вестн. дерматологии и венерологии, 1982, № 12, С. 36-38.

131. Later Е.М., RauchJ., Andrzejiewaki С., Mudd D., Furie В., Schwartz R.S., Stollar B.V. Polyspecific monoclonal Lupua antibodies reactive with both polynucleotides and phospholipids. //J. Exp. Med., 1981, V. 153, N 4, P. 897-909.

132. Eibl H. Synthesis of glycerophospholipids. //Chem. Phys. Lipids, 1980, V. 26, P.405-429.

133. Степанов A.E., Макарова И.М., Швец В.И. Исследования в области липидов. Синтез фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина. //Ж. Орган. Хим., 1984, Т. 20, N 5, С. 986-988.

134. Loizon S., Walport M.J. Antiphospholipid antibodies from patients with SLE and Syphilia react homogeneously with different population of phospholipids. //Br. J. Rheum., 1986, V. 25, N 52, P. 9-12.

135. Harris E.N., Charavi A.E., Tincani A., Chen J.K.H., Englert H., Mantelli P., Allegro F., Ballestrieri G., Hughes G.R.V. Affinity purified anticardiolipin and anti-DNA antibodies. //J. Lab. Clin. Immunol., 1985, V. 17, N 4, P. 155-163.

136. Colaco C.B., Male D.K. Antiphospholipid antibodis in syphilis and trombotic subset of SLE-distinct profiles of epitope specificity. //Clin. Exp. Immunol., 1985, V. 59, N 2, P. 449-456.

137. Freddo L., Hays A.P., Nickerson K.G., Spats L., McGinnis

138. P., Scott L.R., Vedeler C.A., Shy M.E., Antillo-Gabetti L. Monoclonal anti-DNA lg MK in neuropathy binds to myelin and to a conformational epitope formed by phosphatidic acid and gangliosides. //J. Immunol., 1986, V. 137, N 12, P. 3821-3825.

139. Boggs J.M., Chia L.S., Rangaraj.G., Moscarello M. A. Interaction of myelin basic-protein with different ionization states of Phosphatidic acid and Phosphatidylserine. //Chem. Phys. Lipids, 1986, V. 39, N 1-2, P. 165-184.

140. Alving B.M., Baldwin P.E., Richards R.L., Jackson B.J. The delute phospholipid APTT-Asensitive assay for verification of lupus anticoagulants. //Thromb. Haemostasis, 1985, V. 54, N 3, P. 709-712.

141. Branch D.N., Rote N.S., Dostal D.A., Scott J.R. Association of lupus anticoagulant with antibody against phosphatidylserine. //Clin. Immunol., 1987, V. 42, N 1, P. 63-75.

142. Niedieck B., Kuck U., Gardemin H. On the immune precipitation of phosphorylcholine lipids with TEPC15 mouse myeloma protein and with antilecitin sera from guinea pigs. //Immunochemistry, 1978, V. 15, N 5, P. 471-474.

143. Banerji B., Kenny J.J., Scher I., Alving C.R. Antibodies against liposomes in normal and immunodefective mice. //J. Immunol., 1982, V. 128, N 4, P. 1603-1607.

144. Fogler W.E., Swartz G.M., Alving C.R. Antibodies to phospholipids and liposomes binding of an antibodies to cells. //Biochim. Biophys. Acta., 1987, V. 903, N 1, P. 265-272.

145. Alving C.R., Banerji B., Clements J.D., Richards R.L. Adjuvanticity of lipid A and lipid A fraction in liposomes. In: Liposomes and Immunology /Tom B.H., Six H.R (eds) , London: Elsiver, 1980.

146. Banerji B., Lyon J.A., Alving C.R. Membrane lipidcomposition modulates the binding specificity of a monoclonal antibody against liposomes. //Biochim. Biophys. Acta, 1982, V. 689, N 2, P. 319-326.

147. Shichijo S., Alving C.R. Liposomes as targets for cell mediated immune attack. //Biochim. Biophys. Acta, 1985, V. 820, N 2, P. 284-294.

148. William E.F., Gleun M. , Swartz J., Alving C.R. Antibodies to phospholipids and liposomes: binding of antibodies to cells. //Biochim. Biophys. Acta, 1987, V. 903, N 1, P. 265-272.

149. Clafin J.L., Hudak S., Maddalena A., Bender T. Antigen-specific antiphosphocholine antibodies: binding site studies. //J. Immunol., 1985, V. 134, N 4, P. 2536-2543.

150. Rifai A., Wong S.S. Preparation of phosphorylcholine conjugated antigens. //J. Immunol. Meth., 1986, V. 94, P. 25-30.

151. Soerenson S., Uffe B. Monoclonal phosphocholine AB binds to beta-lipoprotein from different animal species. //Infect. Immunol., 1986, V .53, N 2, P. 264-266.

152. Scott M.G., Briles D.E., Shackelford P.G., Smith D.S., Nahm M.H. Human antibodies to phosphocholine lgG anti-PC antibodies express restricted humbers of V and С regions. //J. Immunol., 1987, V. 138, N 10, P. 3325-3331.

153. Casuls-Stenzel J. Protective effect of WEB2086, a novel antagonist of Platelet Activating Factor in endotoxic shock. //Eur. J. Pharmacology, 1988, V. 135, N 2, P. 117-122.

154. Hayashi H., Kudo 1., Inoue K., Nomura H., Nojima S. Macrophage Activation by PAF Incorporated into Dipolmitoylphosphatidylcholine Cholesterol Liposomes. //J. Biochim., 1965, V. 97, N 4, P. 1255-1258.

155. Beldo B.A., Smal M.A., Redmond J.W. Development of a Quantitative Immunoassay for PAP The Role of Platelet Activating Factor in Immune Disorders. In: New Trands Lipid Mediators Research. V.2. /Braquet P. (ed.) New York: Korger, 1988.

156. Karasawa K., Fujita K., Satoh N., Hongo T., Setako M., Ohno M., Nojima S. Antibody to Platelet Activating Factor (1-0-alkyl-2-0-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine:PAF).

157. J.Biochem., 1987, V. 102, N 3, P. 451-453.

158. Nicilotti R.A., Kochibe N., Kinsky S.C. Comparative immunogenic properties of N-substituted phosphatidylethanolamine derivatives and liposomal model membrane. //J. Immunol., 1975, V. 117, N 12, P. 1898-1899.

159. Uemura K., Nicolotti R.A., Six H.R., Kinsky S.C. Antibody formation to liposomal model membrane sensitized with N-substituted phosphatidylethanolamine derivatives. //Biochemistry, 1974, V. 13, N 8, P. 1572-1573.

160. Brulet P. McConnel H.M. Lateral hapten mobility and immunochemistry of model membranes. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, V. 73, N 9, P. 2977-2981.

161. Tyrrell D.A., Heath T.D., Colley C.M., Ryman B.E. New aspects of liposomes. //Biochim. Biophys. Acta, 1976, V. 457, P. 259-302.

162. Okada N., Yasuda T., Tsumita T., Okada H. Differing reactivities of human and guinea-pig complement on haptenized liposomes via the alternative pathway. //Molec. Immunol., 1983, V. 20, P. 857-864.

163. Yasuda T., Dancey T., Kinsky S.C. Immunogenic properties of liposomal model membranes in mice. //J. Immunol., 1977, V. 119, N 6, P. 1863-1867.

164. Van Houte A.J., Shippe H., Willers J.M.N. Characterization of immunogenic properties of haptenated liposomal modelmembranes in mice. I. Thymus independence of antigen. //Immunology, 1979, V. 37, N 2, P. 505-514.

165. Dancey G.F., lsakson P.O., Kinsky S.C. Immunogenicity of liposomal model membranes sensitized with dinitrophenylated phosphatidylethanolamine derivatives containing different length of spaurs. //J. Immunol., 1979, V. 122, N 2, P. 636-642.

166. Asherson R.A., Khamasht M.A., Hughea G.R.V. Antiphospholipid antibodies and thrombosis. //Lancet, 1988, V. 2, N 8605, P. 272.

167. Hashimoto K. , Inoue K. , Nojima S., Tadakuma Т., Yasuda T. Immunogenicity of liposomal model membranes sensitized with spinlabeled haptens and its topographical describution of haptens on the membranes. //J. Biochem.', 1982, V. 92, N 7, P. 1813-1821.

168. Грегориадис Г., Аллисон А. Липосомы в биологических системах. /М.: Медицина, 1983.

169. Березовская JI.H, Грязнова Н.С., Баирашвили Д.И., Яроцкий С.В. Проблема создания липосомальных лекарственных форм антибиотиков //Антибиотики и химиотерапия, 1990, Т. 10, С. 31-35.

170. Сыновец О.А., Лапшин Д.Е., Руденко Ю.В. О перспективах использования липосом в медицинской практике //Врачебное дело, 1991, № 6, С. 16-18.

171. Несытова Н.Ю., Палева Н.С., Ильина Е.В. и др. Тенденции в развитии исследований в области липосом (обзор патентной литературы) //Вестн. АМН СССР, 1990, № 6, С. 8-19.

172. Kellaway I.W., Farr S.J. Liposomes as drug delivery systems to the lung //Adv. Drug. Deliv. Rev., 1990, V. 5, P. 149

173. Голубчикова Н.А., Сидоров В.М., Крейнес'Т.И. Взаимодействие липосом различного состава с компонентами сыворотки крови //Вестн. АМН СССР, 1990, № 6, С. 36-44.

174. Blume G., Cevc G. Molecular mehanisn of the lipid vesicle longevity in vivo //Biochim. Biophys. Acta, 1993, V. 1146, P. 157-168.

175. Kronberg В., Dahman A., Carlfors J. et. al. //J. Pharm. Sci., 1990, V. 79, N 8, P. 667-671.

176. Шевченко E.B., Смирнова Е.Ю., Какушкина M.A. Фазовый переход липидов как способ регулирования проницаемости липосом //Фармация, 1993, № 3, С. 7-13.

177. Szoka F., Papahadjopoulos D. Comparative properties and metod of preraration of liposomes //Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 1980, V. 9, P. 467-508.

178. Посте Дж. Взаимодействие липосом с клетками в культуре и их использование как переносчиков лекарств и макромолекул. В кн.: Липосомы в биологических мембранах /Пол Ред. Г. Грегориадис, А. Аллисон. М.: Медицина, 1983.

179. Kim S., Martin G. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution //Biochim. Biophys. Acta, 1981, V. 646, P. 1-9.

180. Schreier H., McNicol K.J., Ausborn M. Pulmonary delivery of amikacin liposomes and acute liposome toxicity in the sheep //Int. J. Farmaceut., 1992. V. 87, P. 183-193.

181. Кобринский Г.Д. Липосомы транспортеры лекарств (Новое в жизни, науке, технике). Сер. "Медицина". №2. /М. : Знание,1989.

182. Ahmad I., Sarkar A.K., Bachhawat B.K. Effect of cholesterol in varios liposomal composition on the in vivo toxicity, therapeutic efficasy and tissue distribution of amfotericin В //Biotechnol. Appl. Biochem., 1990, V. 12. № 5, P. 550-556.

183. Deol P.,Khuller G.K. Lung specific stealth liposomes: stability, biodistribution and toxicity of liposomal anitubercular drugs in mice //Biochim. Biophys. Acta, 1997, V. 1334, P. 161-172.

184. Ninio S., Yamboliev I., Kovacheva S. High lung uptake of Tc-99m multilamellar liposomes after intravenous administration in rats and rabbits //Pharma-zie, 1994, V. 49, № 5, P. 353-356.

185. Goins В., Phillips W.T., Klipper R. Blood-pool imaging using Tc-99m-labeled liposomes //J. Nuclear Medcine, 1996, V. 37, № 8, P. 1374-1379.

186. Gabison A., Papahadjiopoulos D. The role of surface charge and hydrophilic groups on liposome clearance //Biochim. Biophys. Acta, 1992, V. 1130, P. 94-100.

187. Schwartz L.A., Johnson J.H., Black M. et.al. Delivery of

188. DNA-cationic liposome complexes by small-particle aerosol

189. Human Gene Therapy, 1996, V. 7, № 6, P. 731-741.

190. Gao X., HuangL. Cationic liposome-mediated gene-transfer

191. Gene Therap,. 1995, V. 2, № 10, P. 710-722.

192. Schreirer H., Gonzales-Rothi R.J., Stecenko A.A. Pulmonarydelivery о liposomes //J. Controlled Release, 1993, V. 24,1. P. 209-223.

193. Myers M. A., Thomas D.A., Straub L. et al. Pulmonary effects of chronic exposure to liposome aerosols in mice // Exp. Lung Res., 1993, V. 19, № , P. 1-19.

194. Taylor K.M.G., Farr S.J. Liposomes for drug delivery to the respiratory tract //Drug Dev. Ind. Pharm., 1993, V. 19, P. 123-142.

195. Gonzalez-Rothi R.J., Suarez S., Hochhaus G., Schreir H. Pulmonary targeting of liposomal triamcinolone acetonide phospate //Pharmaceut. Research, 1996, V. 13, № 11, P. 1699-1703.

196. Higham М.А., Sharara A.M., Wilson P. et al. Dose-equivalence of salmeterol and salbutamol in protection against methacholine challence in asthma //Eur. Resp. J., 1995, V. 8, P. 260S.

197. Niven R.W., Schreier H. Nebulization of liposomes. 1. Effect of lipid composition //Pharm. Res., 1990, V. 7, P. 1127-1133.

198. Niven R.W., Speer M.,Schreier H. Nebulization of liposomes. 2. The effect of solute release profiles //Pharm. Res.,1991, V. 8, P. 217-221.

199. Niven R.W., Carvajal M.T.,Schreier H. Nebulization of liposomes. 3. Effect of operating conditions //Pharm. Res.,1992, V. 9, P. 515-520.

200. Taylor K.M.G., Taylor G.,Kellaway .W. The stability of liposomes to nebulization //Int. J. Pharmaceut., 1990, V. 58, P. 57-61.

201. Gilbert В. E., Six H.R., Wilson S.Z. et. al. Small particle aerosols of enviroxime-containing liposomes //Antiviral Res., 1988, № 9, P. 355-365.

202. Golbach P., Brochart H., Stamm A. Spray-drying of liposomes for a pulmonary administration //Drug Develop. Industr. Pharmacy,1993, V. 19, P. 2611-2636.

203. Ausborn M., Nuhn P., Schreier -H. Stabilization of liposomes by freeze-thaw and lyophilization techniques: problems and opportunities //Eur. J. Pharmaceut., 1992, V. 38, P. 133-139.

204. Moller J.V., LeMaire M., Andersen J.P. Uses of nonionic and bile salt detergent in the study of membrane proteins. -Progress in protein-lipid interaction. V.2. /Watts A., DePont J.J. (eds) London: Elsevier, 1986.

205. Лишко B.K., Шевченко М.И. Мембраны и жизнь клетки. /К.: Наук, думка, 1987.

206. Johansson J., Curstedt Т., Robertson В. The protein of surfactant system //Eur. Respir. J.,1994, № 7, P. 372-391.

207. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С. А. Аутологичныелипосомы //Вестн. АМН СССР, 1990, № 8, С. 47-49.

208. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственныхпрепаратах //Вестн. АМН СССР, 1990, № 6, С. 19-28.

209. Юхимец В. А. Когосова Л. С. Клинико-иммунологические аспектыприменения липина у больных неспецифическими заболеваниямилегких //Пульмонология, 1993, № 4, С. 56-59.

210. Holgate S.T. Asthma: past, present and future //Eur. Respir. J., 1993, № 6, P. 1507-1520.

211. Брыгинский С.А., Зубаренко A.B., Лишко B.K. и др. Применение липосом для коррекции респираторной гипоксии при экспериментальной пневмонии //Бюлл. эксперим. биол. мед., 1988, Т. 106, № 10, С. 421-423.

212. Rogers, J. A., and Anderson, К. E. The Potential of Liposomes in Oral-Drug Delivery. //Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys., 1998, V. 15, N 5, P. 421-480.

213. Watwe, R. M., and Bellare, J. R. Manufacture of Liposomes -A Review. //Current Sci., 1995, V. 68, N 7, P. 715-724.

214. Крейнес B.M., Мельникова B.M., Марголин Я.М. Противовоспалительные эффекты липосом //Вестн. АМН СССР, 1990. №6. С. 44-47.

215. Thomas D.A., Myers М.А., Wichert В. Acute effects of liposome aerosol inhalation on pulmonary-function in liposome aerosol inhalation on pulmonary-function in healthy-human volunteers //Chest, 1991, V. 99, № 5, P. 1268-1270.

216. Farr S.J.,. Kellaway I W., Parry-Jones D.R. Technetium as a marker of liposomal deposition and clearance in the human lung. //Int. J. Pharm., 1985, V. 26, P. 303-316.

217. Gonzalez-Rothi R.J., Straub L., Cacace J.L. et al. Liposomes and pulmonary alveolar macrophages: functional and macrophagic interaction //Exp. Lung, 1991, V. 17, P. 687-705.

218. Абросимов B.H., Порядин Г.В. Воспаление и гиперреактивность дыхательных путей при бронхиальной астме //Тер. арх., 1994, № 11, С. 60-64.24 6 Скипский И.М., Скипская Л.Г. Клинические эффекты в2-адреномиметиков //Клин. Фарм. Тер., 1995, № 4, С. 83-88.

219. Johnson М. Pharmacology of long-acting в-agonists //Ann. allergy, asthma, immun., 1995, V. 74, №8. P. 368-372.

220. Pearlman D.S., Liddle R. Controlling asthma symptoms: salmeterol compared with salbutamol in large-scale multicentre studies //Eur. Respir. Rev., 1994, Vol. 4, № 21, P. 301-305.

221. Sears M.R., Taylor D.R., Print C.G. et al. Regular inhaled beta-agonist treatment in bronchial asthma //Lancet, 1990, V. 336, P. 1391-1396.

222. Sterk P.J. Are there risks associated with B2-agonists? A physiological perspective //Int. Resp. Forum, 1994, V. 1, P. 21-26.

223. Pauwels R. The international consensus report on the diagnosis and management of asthma //Eur. Respir. Rev., 1993, V. 3, № 15, P. 483-489.

224. Crane J., Burgess C., Pearce N., Beasley R. The B2-agonist controversy: a perspective //Eur. Respir. Rev., 1993, V. 3, № 15, P. 475-482.

225. Burnett I., Donnell D., Oliver S.D. Effects of single doses of a new long-acting B2-agonist, TA-2005, in healthy, male subjects //Eur. Resp. J., 1995, V. 8, P. 258S-259S.

226. Dahl R. Comparative studies of inhaled salmeterol with other bronchodilators //Eur. Respir. Rev., 1995, V. 27, № 5, P. 138-141.

227. Donnell D., Burnett I., Oliver' S.D. Bronchodilator activity of single doses of a new long-acting B2-agonist, TA-2005, in male asthmatics //Eur. Resp. J., 1995, V. 8, P. 264S-268S.

228. Kiely D.G., Cargill R.I., Grove A. and Lipworth B.J. Abnomal myocardial repolarisation during hipoxaemia and b-agonist therapy //Eur. Res. J., 1995, V. 8, P. 288S-292S.

229. Stolley P.G., Schinnar R. Association between asthma mortality and isoproterenol: a review //Prev. Med., 1978, V. 7, P. 519-538.

230. McFadden E.R. Are there risks associated with B2-agonists? 2: The data reviewed //In. Resp. Forum, 1994, V. 1, P. 27-33.

231. Grainger. J., Woodman K., Pearce N. Prescribed fenoterol and death from asthma in New Zealand, 1981-1987: a furter case control study //Thorax, 1991, V. 46, P. 105-111.

232. Sacket D.L., Shannon H.S., Browman E.W. Fenoterol and fatal asthma //Lancet, 1990, V. 45, p. 45-46.

233. Brusasco V. , Ringdal N., Ekstrom T. Effect of fenoterol 6mg В.I.D.via turbuhaler for 3 mouths in asthma: comparison with terbutaline and placebo //Eur. Resp. J., 1995, V. 8, P. 241S-244S.

234. Иоников Д. От беротека до беродуала //Мед. газ., № 41, С. 18.

235. Горячкина JT.A., Ненашева Н.М., Пужко С.Г. Опыт применения дитека в клинике аллергических заболеваний //Тер. арх., 1994, № 3, С. 19-23.

236. Waldrep J.С., Schrerer P.W., Hess G.D. Nebulized glucocorticoidds in liposomes: aerosol characteristic and human dose estimates //J. aerosol med., 1994, V. 7, № 2. P. 135-145.

237. Waldrep J.C., Keyhani K.M.S., Black M.B.S. Operating characteristics of 18 different continuous-flow jet nebulizers .with beclomethasone dipropionate liposome aerosol //Chest, 1994, V. 105, P. 106-110.

238. Fielding R.F. Delivery of drags to the lungs and systemic circulation via inhaled liposome formulation //Proc. Western Pharmacol. Soc., 1989, V. 32, P. 103-106.

239. McCalden T.A., Radhakrishnan R. A comparative study of the bronchodilator effect and duration of action of liposomal encapsulated beta-2-adrenergic agonists in the guinea-pig //Pulmonary pharmacol., 1991, № 4, P. 140-145.

240. McCalden T.A., Abra В., Mihalko P. Efficacy of a liposome formulation of the bronodilator metaproterenol in guinea-pig // . Liposome Res., 1989, № 1, P. 211-222.

241. Barker S.A., Taylor K.M., Short M.D. The deposition and clearance of liposome entrapped Tc-dtPA in the human respiratory tract //Int. J. Pharm., 1994, V. 102, p. 159-165.

242. New R.R., Chance M.L., Thomas S.C. et.al. //Nature, 1978, V. 272. P. 55-56.

243. Weaver Т., Hall C.L., Kachel D.L. Ass-esment of in-vivo attachment/phagocytosis by alveolar macrophages //J. Immunol., 1996, V. 193, № 2, P. 149-156.

244. Golbach P., Dumont S., Kessler R. In-situ activation of mouse alveolar macrophages by aerosolized liposomal INF-Gamma and muramil tripeptide //Am. J. Physiol., 1996, V. 14, № 3, P. L429-L434.

245. Goren D. , Horowitz А.Т., Zalipsky S. et. al.Targeting of steals liposomes to erbB-2 (Her/2) receptor in-vitro and in-vivo studies. //British J. Cancer, 1996, V. 244, P. 675-693.

246. Лахтин B.M. Лектины в исследовании углеводной части гликопротеинов и других природных гликоконъюгатов //Биохимия, 1995, Т. 60, вып. 2, С. 187-217.

247. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. М.: Наука, 1981.

248. Розенберг O.A., Бекренева В.Ю., Лошакова Л. В. и др. Специфичность захвата липосом из липидов клеток-мишеней //Бюлл. Эксп. биол. мед., 1984, № 6, С. 670-672.

249. Gupta A., Majumdar S.,Sanyal S.N. Effect of lung surfactant liposomes on the rabbit fetal lung type-II cell antioxidant enzymes following prenatal dexametasone treatment //Res. Exp. Med., 1996, V. 196, № 1, P. 67-76.

250. Болезни органов дыхания. Под ред. Палеева Н.Р. /М. Медицина, 1989.

251. Holm В.A., Wang Z.D., Egan Е. A. Content of dipalmitoilphosphatidilcholine in lung surfactant-ramification for surface activity //Pediatr. Res., 1996, V. 39, P. 805-811.

252. Ross G.F., Sawyer J., Oconnor Т., Whitsett, J. A. Intermolecular cross-links mediate aggregation of phospholipid-vesicles by pulmonary surfactant protein Sp-A //Biochemystry, 1991, V. 30, № 3, P.858-865

253. Ogasawara Y., McCormac F.X., Mason R.J. Chimeras of surfactant protein A and D identify the carbohydrate recognition domain as essential for phospholipid interaction //J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 29785-29792.

254. Haagsman H.P., White R.T., Schilling J. Studies of the structure of lung surfactant protein Sp-A. //Am. J. Physiol., 1989, V. 257, № 6, P. L421-L429

255. Lu J., Willis A.C., Reid K.B.M. Purification, characterization and cDNA cloning of human pulmonary surfactant protein D //Biochem. J., 1992, V. 284, P. 795-802.

256. Weis W.I. Drickamer K. Trimeric structure of a C-type mannose-binding protein //Structure, 1994, V. 2, P. 1227-1240.

257. Kuroki Y., McCormac F.X., OgasawaraY et. al. Epitope mapping for monoclonal antibodies identifies functionaldomains of pulmonary surfactant protein A that interact with lipids //J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 29793-29800.

258. Johansson J., Curstedt T. Molecular structures and ijteractions of pulmonary surfactant component //Eur. J. Biochem., 1997, V. 74, № 11, P. 1749-1756.

259. Nogee L.M., DeMello D.E., Dehner L.P. Deficiency of pulmonary surfactant protein B in congenital pulmonary alveolar proteinosis //N. Engl. J. Med., 1993, V.328. P. 406-410.

260. Clark J.C., Wert S.E., Bachurski C.J. Targeted disruption of the surfactant protein B gene disrupts surfactant homeostasis, causing respiratory failure in newborn mice //Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995, V. 92, P. 7794-7798.

261. Vandenbussche G., Clerex A., Clerex M. Secondare structure and orientation of the surfactant protein SP-B in a lipid enviroment //Biochemistry, 1992, V. 31, P. 9169-9176.

262. Taneva S.G., Keough K.M.W. Dinamic surface properties of pulmonary surfactant protein SP-B and SP-C and their mixtures with dipalmitoilphosphatidilcholine // Biochemistry, 1994, V. 33, P. 14660-14670.

263. Cochrane C.G., Revak S.D. Pulmonary surfactant protein B: structure-functional relationships //Science, 1991, V. 254, P. 566-568.

264. Wang Z., Gurel 0., Baatz J.E., Notter R.H. Acylation of pulmonary surfactant protein-C is required for its optimal surface active interactions with phospholipids //J. Biol. Chem., 1996, V. 271, P. 19104-19109.

265. Clerex A., Vandenbussche G., Curstedt T. Structural and functional importance of the C-terminal part of the pulmonary surfactant protein SP-C //Eur. J. Biochem., 1995, V. 229, P. 566-568.

266. Poulain F.R., Allen L., Williams M.C., Hamilton R.L. //Effect of surfactant apoliproteins for tubular myelin formation //Am. J. Physiol., 1992, V. 262, № 6, P. L7301.39.

267. Tsuzuki A., Kuroki Y., Akino, T. Pulmonary surfactant protein A-mediated uptake of phosphatidylcholine by alveolar type-II cells //Am. J. Physiol., 1993, V. 265, P. L193-L199.

268. Walther F.D., Davidcu R. , Supnet M.C. Uptake of antioxidants in surfactant liposomes by cultured alveolar type-II cells is enhanced by surfactant protein A //Am. J. Physiol., 1993, V. 265, № 4. P. L330-L339.

269. Kuroki Y., Shiratori M., OgasawaraY., Hattori. A. Interaction of phospholipid liposomes with plasmamembrane isolated from alveolar type-II cells effect of pulmonary surfactant protein A //Biochim. Biophys. Acta, 1996, V. 1281, № 1, P. 53-59.

270. Kuroki Y.,Akino T. Pulmonary surfactant protein-A (Sp-A) specifically binds dipalmitoylphosphatidylcholine //J. Biol. Chem., 1991, V. 266, P. 3068-3073

271. Kuroki Y., Tsutahara S., Shijubo N. Elevated Levels of Lung Surfactant Protein-A in Sera from Patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis and Pulmonary Alveolar Proteinosis //Am. Rev. Resp. Desease, 1993, V. 147, N 3, P. 723-729

272. Holmskov U., Malhorta R. , Sim R.B. Collectins: collagenous C-type lectins of the innate immune defense system //Immunol. Today. 1994. Vol. 15. P. 67-74.

273. Malhorta R., Haurum J. S., Thiel S. Binding of human collectins (SP-A and MBP) to influenze virus // Biochem. J., 1994, V. 304, P. 455-461.

274. Broun-Augsburgen P., Hartshorn K. , Chang D. Site-direct mutagenesis of Cys-15 and Cys-20 of pulmonary surfactant protein D //J. Biol. Chem., 1996, V. 271, P. 13724-13730.

275. Agostini C., Chilosi M., Zambello R. Pulmonary immune cells in health and disease: lymphocytes //Eur. Respir. J., 1993, V. 6, P. 1378-1401.

276. Weissbach S., Neuendank A., Pettersson M. Surfactant protein A modulates release of reactive oxygen species from alveolar macrorfages //Am. J. Physiol., 1994, V. 267, № 11, P. L660-L666.

277. Gaynor C.D., McCormac F.X., Voelker D.R. Pulmonary surfactant protein' A mediated enhanced phagocytosis of mycobacterium tuberculosis by a direct interaction with human macrophages //J. Immunology, 1995, V. 155, P. 5343-5351.

278. Gonda I. Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract //Therap. Drug

279. Carrier Syst., 1990, № 6, P. 273-313.

280. Emanuel N., Kedar E., Bolotin E.M., Smorodinsky N.I., Barenholz Y. Preparation and Characterization of Doxorubicin-Loaded Sterically Stabilized Immunoliposomes. //Pharm. Res., 1996, V. 13, N 3, P. 352-359.

281. Lambros M.P., Schafer F., Blackstock R., Murphy J.W. Liposomes, a Potential Immunoadjuvant and Carrier for a Cryptococcal Vaccine. //J. Pharm. Sci., 1998, V. 87, N 9, P. 1144-1148.

282. Ranson M., Howell A., Carmichael J., Obyrne K., Stewart S., Smith D. Stealth Liposomal Dixorubicin in the Treatment of Advanced Breast-Cancer, //Ann. Oncology, 1998, V. 9, N S3, P. 47-49.

283. Петрова И.Г., Слепушкин В.А., Буркинская А.Г. Стимулирующий эффект липосом на экспериментальную грипозную инфекцию. //Вопр. Вирусол., 1998, № 6, С.662-663.

284. Манухин В.В., Бродинова Н.С., Циганенко А.Ю., Ткаченко

285. В.JI., Иванова Н.Н., Васильченко В.Н. Иммуногенные свойства липосомной формы токсоида Pseudomonas aeruginosa в облученных мышах. //ЖМЭИ, 1993, N б, С. 69-71.

286. Huang S.K., Stauffer P.R., Hong K.L., Guo J.W.H., Phillips T.L., Huang A. Liposomes and Hyperthermia in Mice Increased Tumor Uptake and Therapeutic Efficacy of Doxorubicin in Sterically Stabilized Liposomes. //Cancer Res., 1994, V. 54, P.2186-2191.

287. Koganty R.R., Reddish M.A., Longenecker B.M. Glycopeptide-Based and Carbohydrate-Based Synthetic Vaccines for the Immunotherapy of Cancer. //Drug Discovery Today, 1996, V. 1, N 5, P.190-198.

288. Ярков С.П., Скопинская С.Н., Рубцов И.В., Львова О.М., Милютина Л.М. Количественный анализ липопополисахарида как антигена в сыворотке крови пациентов с сальмонелезом используя комплемент-зависимый лизис липосом. //ЖМЭИ, 1990, N 5, С.65-69.

289. Манухин В.В., Бродинова Н.С., Михайлова Н.А., Иванова Н.Н., Циганенко А.Ю., Васильченко В.Н. Исследование протективных свойств липосомной формы токсоида Pseudomonas aeruginosa в активной защите животных. //ЖМЭИ, 1993, N 4, С.69-72.

290. Lee M.Y., Durst R.A., Wong R.B. Comparison of Liposome Amplification and Fluorophor Detection in Flow-Injection1.munoanalyses. //Anal. Chimica Acta, 1997, V. 354, N 1-3, P.23-28.

291. Lee M.Y., Durst R.A., Wong R.B. Development of Flow-Injection Liposome Immunoanalysis (Filia) for Imazethapyr. //Talanta, 1998, V. 46, N 5, P.851-859.

292. Rongen H.A.H., Bult A., Vanbennekom W.P. Liposomes and Immunoassays. //J. Immun. Mfeth., 1997, V. 204, N 2, P.105-133.

293. Rongen H.A.H., Vannierop Т., Vanderhorst H.M., Rombouts R.F.M., Vandermeide P.H., Bult A. Biotinylated and Streptavidinylated Liposomes as Labels in Cytokine Immunoassays. //Anal. Chimica Acta, 1995, V. 306, N 2-3, P.333-341.

294. Wink Т., Vanzuilen S.J., Bult A., Vanbennekom W.P. Liposome- Mediated Enhancement of the Sensitivity in Immunoassays of Proteins and Peptides in Surface-Plasmon Resonance Spectrometry. //Anal. Chem., 1998, V. 70, N 5, P.827-832

295. Frost S.J., Chakraborty J., Firth G.B. Novel Homogeneous Liposomal Immunoassay for Colorimetric Estimation of Serum IgG Anticardiolipin Antibodies. //Clin. Chem., 1996, V. 42, N 6, P.874- 879.

296. Jones M.A., Kilpatrick P.K., Carbonell R.G. Competitive Immunosorbent Assays Using Ligand-Enzyme Conjugates and Bifunctional Liposomes Theory and Experiment. //Biotech. Progress, 1996, V. 12, N 4, P.519-526.

297. Скопинская C.H., Тамулевич Ю.А., Ярков С.П., Злобин В.Н., Калинин Ю.Н. Высокочувствительный и гомогенный метод для определения антител и антигенов с использованием липосом, моноклональных антител и комплемента. //ЖМЭИ, 1993, N 1, С.77-82.

298. Скопинская С.Н., Ярков С.П., Рубцов И. В. Определение антител к салмонеллам группы Б и их О-соматическим антигенам комплемент-зависимым лизисом липосом. //ЖМЭИ,1990, N 4, С.84-88.

299. Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И., Закревский

300. B. И. Создание диагностических тест-систем на основе магнитных сорбентов и липосом. //ЖМЭИ, 1990, N 10, С.103-106.

301. Власов Г.С., Иванов Н.Н., Гремякова Т.А., Торчилин В.П., Коростелева М.Д., Лиходед В.Г. Определение антител, нейтрализующих эндотоксины грам-отрицательных бактерий липосомным потенциометрическим методом. //ЖМЭИ, 1982, N 8,1. C.87-90.

302. Власов Г.С., Бердичевский В.Г., Салов В.Ф., Торчилин В.П. Липосомы и перспективы их использования в прикладной иммунологии. //ЖМЭИ, 1993, №. 8, С. 12-19.

303. Asai, Y.; Sano, У.; Kikuchi, К.; Iwamoto, К.; Watanabe, S. Control of the dispersing process and pharmacokinetics in rats for lipid A analogue, e5531. //J. Pharm. Pharmacol., 1999, V. 51, N 5, P. 577-584.

304. Matsuzaki, K.; Sugishita, K. ; Miyajima, K. Interactions of an antimicrobial peptide, magainin 2, with lipopolysaccharide-containing liposomes as a model for outer membranes of Gram-negative bacteria. //FEBS Letters, 1999, V. 449, N. 2- 3, P. 221-224.

305. Rao, M.; Matyas, G. R.; Grieder, F.; Anderson, K.; Jahrling, P. В.; Alving, C. R. Cytotoxic T lymphocytes to Ebola Zaire virus are induced in mice by immunization with liposomes containing lipid A. //Vaccine, 1999, V. 17, N 23-24, P. 2991-2998.

306. Nowotny A. Basic exercisis in immunochemistry. A laboratory manual. /Springer-Verlag, 1979.

307. Gorbach V.I., Krasikova I.N., Luk'yanov P.A., Razmakhnina O.Yu., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Structural studies of immunodominant group of lipid A of lipopolysaccharide of Y.pseudotuberculosis. //Eur. J. Biochem., 1979, V. 98, P. 63-86.

308. Лукьянов П.А., Горбач ,В.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез и иммуностимулирующая активность 4-ацилоксибутил-1-фосфатов. //Хим.-фарм. ж., 1992, Т. 26, С.55-58.

309. Каплун А.П., Башарули В.А., Щукина Л.Г., Швец В.И. Синтез флуоресцентно-меченных жирных кислот с антроильной и антрильной группами. //Биоорган. Химия, 1979, Т. 5, N 12, С. 1826-1830.

310. Ralston Е. Characterization of liposomes prepared using a microemulsifier.- //Biochim. Biophys. Acta, 1981, V. 641, N 1, P. 133-137.

311. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Luk'yanov P.A., Razmakhnina J.Y., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Structural studies of the immunodeterminant group of lipid A of lipopolysacharide of Yersinia pseudotuberculosis. //Eur. J. Biochem., 1979, V.98, P.83-86.

312. Szoka F.,Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. //Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1978, V. 75, N 11, P. 4194-4198.

313. Корякова А.Г., Кулакова H.В., Кобелев С.С., Нежевая Е.К., Хоменко А.В., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П.А. Некоторые аспекты терапевтической эффективности липосомных форм фенотерола //Тихоокеан. мед. ж., 1999, С. 57-61

314. Корякова А.Г., Кулакова Н.В., Кобелев С.С., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П. А. Биохимическая оценка эффектиности липосомных. форм фенотерола //Хим.-фарм. ж., 2000, в печати.

315. Arkhipenko I., Koryakova A., Luk'yanov P., Geltser В. Surfactant protein A as the vector in the liposomal cellular interaction. /-/Eur. Respiratory J., 1998, V. 12, P. 175-175.

316. Horowitz P.M. A comporison between 8-anilinonaphtalen-l-sulfonate as fluorescent indicator of critical micell concentration of sodium dodecyl sulfate. //J. Coil.1.terface Sci., 1977, V. 61, N 2, P. 197-198

317. Watwe, R. M., and Bellare, J. R. Manufacture of Liposomes -A Review. //Current Sci., 1995, V. 68, N 7, P. 715-724.

318. Добрецов Г.E., Владимиров В.А. Флуооресцентные зонды в исследовании биологических мембран./М: Мир, 1980.

319. Methods in ■ immunology / Eds. Garvey J.S., Sussdorf D. H. London, Amsterdam: Benjamin W. A. Inc. 1977. P. 218-230.

320. Westphal 0., Jann K. Methods in carbohydrate chemistry. V. 5. / Ed. Whistler N.Y., New York, Acad. Press, 1965.

321. Oberfelder R.W., Lee J.C. //Meth. Enzymol., 1985, V. 117, P. 385-388.

322. Dalla Venezia N., Minka S., Bruneteau M. , Mayer H., Michel G. Lipopolysacchrides from Yersinia pestis. Studies on lipid A of lipopolysaccharides I and II. //Eur.J.Biochem., 1985, V. 151, N. 2, P. 399-404.

323. Wicken A.J.,Knox K.W. Bacterial cell surface amphiphilis.

324. Biochim. Biophys. Acta, 1980, V. 604, N 1, P. 1-26.

325. Strain S.-M., Fesik S.W., Armitage I.M. Characterization of lipopolysaccharide from a heptoseless mutant of Escherichia coli by carbon 13 nuclear magnetic resonance. //J. Biol. Chem., 1983, V. 258, N 5, P.2906-2910.

326. Ukei S., lida J., Shiba Т., Kusumoto S., Azurna I. Adjuvant and antitumor activities of synthetic lipid A analogs. //Vaccine, 1986, V. 4, N1 , P. 21-24.

327. Lugowaki C., Romanowska E. Bioloical properties of lipid A from Shigella sonnei. //Eur. J. Biochem., 1974, V. 48, N 1, P. 81-87.

328. Urbaneja M.A., Gerardo D., Fidelio J.A., Lucy J.A., Chapman D. The interaction of an antilipid antibody (TEPC 15) with a model biomembrane system (monolayer) . //Biochim. Biophys. Acta, 1987, V. 898, N 2, P. 253-256.

329. Lafer E.M., Rauch J., Andrzejewski C., .Mudd D. , Furie В., Furie В., Schwartz R.S., Steller B.S. Polyspecific monoclonal Lupus autoantibodies reactive with both polynucleotides and phospholipids. //J. Exp. Med., 1981, V. 153, N 3, P. 897-909.

330. Brade L., Rietschel E.T., Kusumoto S., Shiba Т., Brade H. // Immunogenicity and antigenicity of natural and synthetic Escherichia coli lipid A.- Prog. Clin. Biol. Res. 1987. V.231. N1. P.75-97.

331. Luderitz 0., Galanos C., Lehmann V., Mayer H., Rietschel E. Th., Weckesser J. Chemical structure and biological activities of lipid A from various bacterial families. //Naturwissenschatten, 1978, B. 65, N 10, B. 578-579.

332. Fogler W.E., Swartz G.M., Alving C.R. Antibodies to phospholipids and liposomes binding of an antibodies to cells. //Biochim. Biophys. Acta, 1987, V. 903, N 1, P. 265

333. Лакович Д. Основы Флуоресцентной спектроскопии. /М: Мир, 1986.

334. Новикова О.Д., Зыкова Т.А., Ядыкина Г.М., Глазунов В. П., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Изучение иерсинина основного полипептида внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. //Биол. Мембраны, 1985, Т. 2, N 7, С. 714-723.

335. Vogel Н., Jahring F. Model for the structure of outer membrane protein of Escherichia coli derived from Raman spectroscopy and prediction methods. //J. Mol. Biol., 1986, V. 190, N 1, P. 191-199.

336. Добрецов Г.Е., Спирин M.M., Чекрыгин O.B., Владимиров Ю.А., Каплун А.П., Башарули В.А., Швец В.И. Флуоресцентные зонды производные жирных кислот. Глубина погружения хромофора в липидный бислой. //Биоорган. Химия, 1981, Т. 7, № 4, С. 606-612.

337. Barrick, D. , and Baldwin, R. L. The Molten Globule Intermediate of Apomyoglobin and the Process of Protein Folding. //Protein Rci., 1993, V. 2, N 6, P. 869-876.

338. Бычкова B.E., Птицин B.E. Состояние плавленной глобулы белковых молекул становится скорее правилом, чем исключением. //Биофизика, 1993, Т. 38, № 1, С. 58-66.

339. Engelhard, М., and Evans, P. A. Kinetics of Interaction of Partially Folded Proteins with a Hydrophobic Dye Evidence That Molten Globule Character Is Maximal in Early Folding Intermediates. //Protein Rci., 1995, V. 4, N 8, P. 1553-1562.

340. Mitaku, S., Ishido, S., Hirano, Y. Hydrophobic Core of Molten-Globule State of Bovine Carbonic Anhydrase-B. //Biophys.Chem., 1991, V. 40, N 3, P. 217-222.

341. Новикова О.Д. Порины рода Yersinia. /В кн. Успехи в изучении природных соединений. /Под ред. В.А.Стоника. В.: Дальнаука, 1999.

342. Новикова О.Д. , Фролова Г.М., Вакорина Т.И., Глазунов В.П.,

343. Таранкова З.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Конформационная стабильность иерсинина основного белка внешней мембраны Yersinia pseudotuberculoses. //Биоорган, химия, 1989, Т. 15, С. 763-772.

344. Skolnick, J., Kolinski, A., and Godzik, A. From Independent Modules to Molten Globules Observations on the Nature of Protein Folding Intermediates. //Proc. Natl. Acd. Sci, USA, 1993, V. 90, N 6, P. 2099-2100.

345. Safar, J., Roller, P. P., Gajdusek, D. C. Scrapie Amyloid (Prion) Protein Has the Conformational Characteristics of an Aggregated Molten Globule Folding Intermediate. //Biochemistry, 1994, V. 33, N 27, P. 8375-8383.

346. Uversky, V. N., Kirkitadze, M. D., Narizhneva, N. V. Structural-Properties of Alpha-Fetoprotein from Human Cord Serum The Protein Molecule at Low pH Possesses All the Properties of the Molten Globule. //FEBS Letters, 1995, V. 364, N 2, P. 165-167.

347. Moll G., Parini E., Colonna R. , Burroni D. , Telford D., Rappuolo R., Montecucco C. Lipid interaction of the 37-kDa and 58-kDa fragments of the Helicobacter pylori cytotoxin. //Eur.J.Biochem., 1995, V. 234, P. 947-952.

348. Velev, 0. D. Assembly of Protein Structures on Liposomes by Nonspecific and Specific Interactions. //Adv. Biophys., 1996, V. 34, P. 139-157.

349. Hancock R.E.W. Role of porins in outer membrane permeability. //J. Bacterid., 1987, V. 169, P.929-933.

350. Trischman, J.A., Jensen, P.R., and Fenical, W. Halobacillin: a cytotoxic cyclic acylpeptide of the iturin class produced by a marine Bacillus. //Tetrahedron Lett., 1994, V. 35, N 31, P. 5571-5574.

351. Itokawa, H., Miyashita, T., Morita, H., Takeya, K., Hirano, T., Homma, M., Oka, K. Structural and conformational studies of Ile7. and [ Leu7 ] surfactins from Bacillus subtilis natto. //Chem. Pharm. Bull., 1994, V. 42, N 3, P. 604-607.

352. Прокофьева Н.Г., Калиновская Н.И., Лукьянов П.А., Кузнецова Т. А. Мембранотропнте дествие циклических липопептидов, продуцируемых морским изолятом бактерии Bacillus pumilus. //Биология моря, 1996, Т. 22, N 3, С. 179-182.

353. Dahanayake, М., Cohen, A. W. and Rosen, М. Relationship of structure to properties of surfactants. //J. Phys. Chem., 1986, V.90, P.2413-2418.

354. Lin, S. C., Minton, M. A., Sharma, M. M. and Georgiou, G. Structural and immunological characterization of a biosurfactant produced by Bacillus licheniformis JF-2. //Appl. Environ. Microbiol., 1994, V. 60, N 1, P. 31-38.

355. Maget-Dana, R., and Ptak, M. Interfacial properties of surfactin. //J. Colloid Interface Sci., 1992, V. 153, N 1, P. 285-291.

356. Kramer, S. D., Jakitsdeiser, C. and Wunderliallenspach, H. Free fatty acids cause pH-dependent changes in drug-lipid membrane interactions around physiological pH. //Pharm. Res., 1997, V. 14, P. 827-832.

357. Parenta, R. A., Nir, S. and Szoka, F. Mechanism of leakage of phospholipid visicle contents induced by the peptide GALA. //Biochemistry, 1990, V. 29, P. 8720-8728.

358. Subbarao, N.K., Parente, R.A., Szoka, F.C., Nadasdi, L.,

359. Pongracz, К. pH-Dependent bilayer destabilization by an amphipathic peptide. //Biochemistry, 1987, V. 26, P. 2964-2972.

360. Huang, P. and Loew, H. Interaction of an amphiphilic peptide with a phospholipid bilayer surface by molecular dynamics simulation study. //J. Biomol. Struct. Dyn., 1995, V. 12, P. 937-956.

361. Katsu Т., Kuroko M., Morikawa Т., Sanchika K., Yamanaka H., Shinoda S., Fujita Y. Interaction of wasp venom mastoparan with biomembranes. //Biochim. Biophis. Acta, 1990, V. 1027, P. 185-190.

362. Thimon, L., Peypoux, F., Das, В. C., Wallach, J. and Michel, G. Selective esterification of surfactin: preparation and properties of surfactin methyl esters. //Biotechnol. Appl. Biochem., 1994,. V. 20, P. 415-423.

363. Maget-Dana, R. and Peypoux, F. Iturins, a special class of pore-forming lipopeptides: biological and physicochemical properties. //Toxicology, 1994, V. 87, P. 151-174.

364. Bolard, J. How do the polyene macrolide antibiotics affect the cellular membrane properties? //Biochim. Biophys. Acta, 1986, V. 864, P. 257-304.

365. Margalit, R. Liposome-Mediated Drug Targeting in Topical and Regional Therapies. //Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys., 1995, V. 12, N 2-3, P. 233-261.42 6 Чучалин А. Г Хронический обструктивный бронхит. //Тер архив., 1997, № 3, С. 3-8.

366. Barnes B.J. New concepts in the patogénesis of bronchial hyperresponsiveness and asthma //J. Allergy. Clin. Immunol.1989, V. 83, N 6, P. 1013-1026.

367. Harvie P., Desormeax A., Gadne N. Pharmacokinetics and tissue distribution of free and liposome-encapsulated ddl in mice. //Can. J. Infect. Diseases, 1995, V. 6, P. 461-465.

368. McCalden T.A., Abra В., Mihalko P. Efficacy of a liposome formulation of the bronodilator metaproterenol in guinea-pig //J. Liposome Res., 1989, № 1, P. 211-222.

369. Коровкин Б.Ф., Государский В. И., Новиков Н.И. Липосомы и их применение в медицине //Военный Мед. Ж., 1983, № 4, С 38-41.

370. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Аутологические липосомы //Вестник АМН СССР, 1990, № 8, С. 47-49.

371. Стефанов А.В., Пожаров В.П., Миняйленко Т.Д. и др. Биологический эффект липосом при гипоксических состояниях различной этиологии //Вестник АМН СССР, 1990, № 6, С 47-51.

372. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственных препаратах //Вестник АМН СССР, 1990, № 6, с. 19-28.

373. Girod de Bentzmann S., Pierrot D., Fuchey C. Distearoyl phosphatidylglycerol liposomes improve surface and transport properties of CF mucus. //Eur. Resp. J., 1993, № 6, P. 1156-1161.

374. Andersson P. Antigen-induced bronchial anaphylaxis in actively sensitized guinea pigs //Allergy, 1980, V. 35, P. 65-71.

375. Невзорова В.А., Елисеева E.B., Зуга M.B. и др Нитрооксидергические механизмы регуляции бронхов и ихзначение в патогенезе бронхиальной астмы. //Тер архив, 1998, № 3, С. 13-18

376. Holgate S.T., Church М.К. Asthma. The mast cell //Br. Med. Bull., 1992, V. 48, № 1, P. 40-50.

377. Marom Z.M. The role of mast cells in bronchial asthma: mechanisms and possible therapeutic implications //Scinai J. Med., 1991, V. 58, № 6, P. 472-482.

378. Даниляк И.Г., Коган А.Х., Болевич С. О влиянии тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами крови, перекисное окисление липидов и антиперекисную активность у больных бронхиальной астмой //Пульмонология, 1994, № 2, С. 43-47.

379. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении. //Успехи Совр. Биол., 1997, Вып. 2, Т. 117, С. 155-165.

380. Хышиктуев Б.С., Иванов В.Н., Жиц М.В. Состояние свободно-радикальных процессов в системе легочного сурфактанта у больных хроническим брохитом //Вопр. Мед. Химии, 1991, Т. 37, № 1, С. 79-82.

381. Kharitonov S.F., Robbins R.A., Yates D., Keatings V. , Barnes P.I. Acute and chronic effects of cigarette smoking on exhaled nitric oxide. //Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995, V. 152, P. 609-612.

382. Андреева В. А., Кожемякин JI. А., Кишкун А. А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой. //Лаб. Дело, 1988, № 11, С. 41-43

383. Barnes P.J., Beirnsi M.G. Nitric oxide and lung disease // Thorax, 1993, V. 48, P. 1034-1043.

384. Barnes P.L, Liew F.Y. Nitric oxide and asthmatic inflammation //Immunol. Today, 1995, V. 16, P. 128-130.

385. Kobzik L., Bredt D.S., Lowenstein C.S. Nitric oxide synthase in human and rat lung: immunocytochemical and histochemical localization //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1993, V. 9, P.3 71-377.

386. Stainton M.P. Simple,efficient reduction column for use in automated determination of nitrate in water. //Anal. Chem., 1974, V.46, N 11. P. 1616-1619.

387. Stobaugh J.F.-, Givens R.G. Naphthalene-2,3-dicarbox-aldehyde/cyanidilation: a rationally designed fluorogenic reagent for primary amines. //Anal. Chem., 1987, V. 59, P. 1096-1101.

388. Gustafsson L.E., Leone AM., Persson M., Wthiund N.P., Mon-cada S. Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air oi rabbits, guinea-pigs and humans //Biochem. Biophys. Res. Comm., 1991, V. 181, P. 852-857.

389. Gorbach V.l., Luk'yanov P.A., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Synthesis of some 2-acylamino-2-deoxy-l,3,4-tri-O-dodecanoyl-ß-D-glucopyranose 6-phosphates. //Carbohydr. Res., 1982, V 101, P.335-339.

390. Ralston E. Characterization of liposomes prepared using a microemulsifier. //Biochim. Biophys. Acta, 1981, V. 641, N 1, P. 133-137.

391. Krasikova I.N., Gorbach V.l., Luk'yanov P.A., Razmakhnina J.Y., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Structural studies of the immunodeterminant group of lipid A of lipopolysacharide of Yersinia pseudotuberculosis. //Eur. J. Biochem., 1979, V. 98, P. 83-86.

392. Westphal 0., Jann K. Methods in carbohydrate chemistry. /Ed. Whistler N.Y., New York: Acad, Press, 1965, V. 5, P. 82-91.