Методологии синтеза антимитотических противоопухолевых агентов колхицинового ряда

Ситников, Николай Сергеевич

Методологии синтеза антимитотических противоопухолевых агентов колхицинового ряда тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Ситников, Николай Сергеевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Нижний Новгород МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Методологии синтеза антимитотических противоопухолевых агентов колхицинового ряда»

Автореферат диссертации на тему "Методологии синтеза антимитотических противоопухолевых агентов колхицинового ряда"

005047162

На правахрукописи

СИТНИКОВ НИКОЛАЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТОДОЛОГИИ СИНТЕЗА АНТИМИТОТИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ КОЛХИЦИНОВОГО РЯДА

02.00.03 - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 з СЕН 2012

Нижний Новгород - 2012

005047162

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, доцент Фёдоров Алексей Юрьевич

Учреждение Российской академии наук Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева РАН зав. лаборатории органических производных непереходных металлов, член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Федюшкин Игорь Леонидович

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации зав. кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии, доктор химических наук, профессор Мельникова Нина Борисовна

Учреждение Российской академии наук Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН

Ведущая организация:

Защита диссертации состоитегода в /£> часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.05 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, ГСП-20, пр. Гагарина, 23, корп. 2, Конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Автореферат разослан « » 2012 года

О.Г. Замышляева

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из наиболее острых проблем современной медицины не только в нашей стране, но и во всем мире. Прогноз 50% увеличения числа онкологических заболеваний к 2020 г. создает потребность в развитии новых противоопухолевых препаратов (Материалы 42-nd International Meeting on Medicinal Chemistry, 5-7 July, 2006, Marseille, France). Ключевая роль митотического веретена в клеточном делении сделала его перспективной мишенью для противоопухолевой химиотерапии. Антимитотические агенты таксол и таксотер относятся к наиболее успешным препаратам, используемым в современной клинической практике. Ряд антимитотических противоопухолевых агентов в настоящее время проходит клинические испытания (СА4Р, омбрабулин, подофиллотоксин, а также несколько соединений колхицинового и аллоколхицинового ряда).

Несмотря на существенный прогресс, достигнутый за последние два десятилетия в разработке новых противоопухолевых химиотерапевтических средств, подавляющее большинство лекарств, применяемых в медицинской практике, а также находящихся на стадии клинических тестов, обладает общими недостатками. К ним относятся низкая селективность биологического действия и, как следствие, высокая системная токсичность, а также снижение терапевтической активности ввиду множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Труднодоступность природных источников и отсутствие промышленно реализуемых путей синтеза (например, в случае таксанов) ограничивает клинические исследования и практическое внедрение многих противоопухолевых препаратов. В связи с этим, актуален поиск новых синтетически доступных антимитотических агентов, имеющих высокий терапевтический индекс (отношение минимальной токсичной дозы к эффективной терапевтической дозе), и улучшение их фармакокинетических параметров (биодоступность, распределение по органам и тканям) путем синтеза пролекарственных форм и создания адресных противоопухолевых препаратов на их основе.

Данная работа посвящена разработке методологий синтеза новых антимитотических противоопухолевых агентов - гетероциклических аналогов природных алкалоидов колхицина и аллоколхицина. Полученные соединения наряду с известным противоопухолевым агентом колхицинового сайта комбретастатином А-4 были использованы для получения липофильных пролекарственных форм и создания липосомных систем адресной доставки лекарств на их основе.

Цель работы. Получение новых антимитотических противоопухолевых агентов колхицинового сайта клеточного белка тубулина. В работе решались следующие задачи:

1) Синтез индолсодержащих структурных аналогов природного алкалоида аллоколхицина с целью исследования их противоопухолевых свойств;

2) Синтез липофильных производных природных противоопухолевых агентов колхицина, аллоколхицина и комбретастатина А-4 с целью их включения в состав липосомных систем адресной доставки лекарств и исследоваия противооухлевых свойств.

Объекты исследования. Структурные аналоги аллоколхицина, содержащие 1Я-индольный фрагмент; (1,2,3-триазол)содержащие структурные аналоги колхицина, аллоколхицина, а также их липофильные производные на основе олеиновой и пальмитиновой кислот; липофильные производные комбретастатина А-4, содержащие остатки жирных кислот.

Методы исследования. В работе использованы современные методы тонкого органического синтеза и металлокомплексного катализа. Состав и строение соединений подтверждали физико-химическими методами (ЯМР-, ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия, РСА). Для разделения соединений использовали хроматографические методы (ВЭЖХ, ТСХ, флэш-хроматография на силикагеле).

Научная новизна и практическая значимость работы. Предложены и реализованы методологии синтеза четырех структурных типов индолсодержащих аналогов алкалоида аллоколхицина исходя из коммерчески доступных реагентов - 3-(3',4',5'-триметоксифенил)пропионовой кислоты и производных индола. Методом 'Н ЯМР спектроскопии выявлено наличие атропизомеризационного равновесия некоторых аллоколхициноидов в растворе при комнатной температуре.

Установлено, что некоторые из полученных соединений проявляют антимитотическую и апоптоз-индуцирующую активность по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB в нано/субнаномолярных концентрациях наряду с низкой неспецифической токсичностью.

Показано, что аллоколхициноид Г,2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]1//-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-е]1Я-1"-метилиндол ингибирует фазу G2/M клеточного цикла и индуцирует апоптоз нескольких штаммов клеток хронического лимфолейкоза в наномолярном интервале концентраций. Установлено, что данное соединение по цитотоксичности превосходит клинический препарат винкристин, используемый в терапии лимфолейкозов.

Синтезированы новые 7-триазолилзамещенные аналоги колхицина и аллоколхицина, а также их липофильные формы. Предложен механизм перегруппировки колхицинового молекулярного скелета в аллоколхициновый. Получены липофильные пролекарственные формы природного противоопухолевого агента комбретастатина А-4.

Липофильные производные колхицина и комбретастатина А-4 использованы для создания противоопухолевых липосом. Установлено, что производные колхицина и их липосомные формы проявляют цитотоксическую активностью по отношению к пяти штаммам опухолевых клеток человека в наномолярном интервале концентраций. Липосомный препарат на основе олеоильного производного комбретастатина А-4, содержащий адресные углеводные векторы SiaLex, продемонстрировал способность подавлять развитие опухоли у мышей линии BLRB/BYRB со спонтанно возникающим раком молочной железы.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Синтез индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина, липофильных производных колхицина, аллоколхицина, комбретастатина А-4 выполнен в полном объеме лично диссертантом. Соискатель принимал активное участие в постановке цели и задач исследования, разработке структур целевых биологически активных молекул и методологий их получения, анализе результатов биологических исследований синтезированных соединений.

На защиту выносятся следующие положения:

- экспериментальные данные о синтезе индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина;

- экспериментальные данные о синтезе липофильных производных колхицина, аллоколхицина, комбретастатина А-4;

- результаты исследования структуры полученных соединений физико-химическими методами;

- результаты исследования биологической активности полученных соединений.

Степень достоверности полученных результатов. Структуры всех синтезированных в работе соединений подтверждены с применением современных физико-химических методов анализа - ИК-, ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, рентгеноструктурного анализа.

15- и 16-ой Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучная секция, г. Н.Новгород, 2010, 2011), 13- и 14-ой Конференции молодых ученых-химиков г. Н.Новгорода (2010, 2011), молодежной конференции «Topical problems of Organic Chemistry» (Казань, 2010), Международной конференции «Topical problems of organometallic and coordination chemistry. V Razuvaev lectures» (Нижний Новгород, 2010), Всероссийской конференции по органической химии (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 5 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.

машинописного текста, включает схем, ^^Грисунков, ^ таблиц. Литературный обзор посвящен обсуждению известных методологий синтеза аллоколхицина и его структурных аналогов. В разделе «Обоснование диссертационных исследований» приводится информация о корреляции структура - физиологическая активность для противоопухолевых агентов колхицинового сайта клеточного белка тубулина, на основании которой предложены структуры целевых биологически активных молекул. В данном разделе также обосновывается перспективность применения липофильных форм противоопухолевых антимитотических агентов в составе липосомных систем адресной доставки лекарств.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Германской службы академических обменов (DAAD А0879551), Совета по грантам при Президенте РФ (МД_5606.2010.3), РФФИ (09-03-00647а), ФЦП (16.740.11.0476 и 14.740.12.1382).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез индолсодержащнх структурных аналогов аллоколхнцнна

В работе предложены и реализованы методологии синтеза соединений ЫУ -структурных аналогов природного антимитотического агента аллоколхицина (рис. 1).

Ме(Х

МеО

тип II

( Х=0,

ОН, № ЫНАс

Рис. 1 Аллоколхицин и его гетероциклические структурные аналоги 1-1У

Целевые производные ЫУ сочетают в своей структуре циклы А и В алкалоида 1 и аннелированный 1#-индольный фрагмент, который, в свою очередь, является фармакофорной группой 4-гетероарилкумаринов, гетерокомбретастатинов и индолобензазепинонов (рис. 2) - известных противоопухолевых агентов, общей биологической мишенью которых, подобно аллоколхицину 1, является клеточный белок тубулин.

N=N1

МеО

Ме

Я1, В2, Я3 = Н, ОМе 4-гетероарилкумарины

^М-Ме ОМе >=(

гетерокомбретастатины

Я4 = алкил индолобензазепиноны

Рис. 2 Антимитотические противоопухолевые агенты, содержащие 1//-индольный фармакофорный фрагмент

1.1. Синтез аллоколхициноидов I, II

Структурной особенностью соединений I, II (рис. 1) является расположение атома азота в пара-положении по отношению к связи арил-арил'. Поэтому оба типа производных было решено синтезировать исходя из общего синтетического интермедиата 2 по реакции ацилирования Фриделя-Крафтса (схема 1). Атом брома в соединении 2 выполняет роль защитной группы, предотвращающей электрофильную атаку в электрононасыщенный триметоксифенильный фрагмент.

Вг ^С02Н ____________ _ 9<Э2Ме

МеСкХ^

^ мво-^тЧ"

0М8 ^-Ме

кросс-сочетание Вт

ацилирование Фриделя-Крафтса

Ме

7? = БпВиз ВРт, Вг

Схема 1

Исследована применимость различных реагентов с общими формулами 3 и 4 для получения ключевого синтетического интермедиата 2. Показано, что реакция галоген-селективного кросс-сочетания Сузуки-Мияура между борорганическим производным индола 6 и арилиодидом 7 в присутствии каталитической системы Рс1(ОАс)2 - РРЬ3 - СвгСОз позволяет получить биарил 8 с высоким выходом (схема 2). С использованием данной реакции, соединение 2 было синтезировано из коммерчески доступной кислоты 5 в 5 стадий с суммарным выходом 62% (схема 2).

Схема 2

На следующей стадии кислоту 2 по реакции с 1 -хлоро-Л^,/У,2-триметил-1 -пропениламином превращали в хлорангидрид 9, который в присутствии двукратного избытка хлорида цинка претерпевал внутримолекулярное ацилирование Фриделя-Крафтса (схема 3). Применение данного подхода позволило получить региоизомеры 10 и 11 в соотношении 4:1 с суммарным выходом 40%. Другие кислоты Льюиса (А1С13, гпВт2, ВРуЕьО, 5с(СЩ)3, "П(0»Рг)4, ЕШСЬ, Е12А1С1) оказались менее эффективны.

Ме. ММе2 С, ^

Ме С1

МеО

С1 40% (10:11 4:1)

гпС12 (2 экв) СН2С12(0,02М) Ме0

М-Ме

МеО'

Схема 3

Удаление брома в соединениях 10, 11 проводили по реакции восстановительного дегалогенирования трибутилстаннаном в присутствии ДАК (схема 4). Выход продуктов 12,13 составил 92% и 90% соответственно. Зг

МеО

МеО.

МеО 2 тр^ МеО 10, 11

01Ай = ¡-РгОоС-М=М-СО?Ри

1) №ВН4 Ме0-

2)2п(М3)2*2Ру РРП3 01А0

3) иА1Н4

4) Ас20, Ру

!\1НАс

МеО

92%

МеО-

МеО

гас-18 87% из 16

МеО.

МеО'

ЖАс

93% из 13

68% из 15

гас-19 Ме

89% из 17

Последующие реакции взаимопревращения функциональных групп, включающие восстановление карбонильной группы боргидридом натрия, замещение гидроксильной группы на азидную по реакции Митсунобу, восстановление азида алюмогидридом лития и ацилирование полученного амина уксусным ангидридом в пиридине позволили с хорошими-высокими выходами синтезировать ряд аллоколхициноидов 14-19, содержащих различные С-7 функциональные группы (схема 4).

Методом 'Н ЯМР спектроскопии показано, что продукты 14-19 претерпевают атропоизомеризацию в растворе при комнатной температуре (схема 5).

Схема 5

Соотношение стереоизомеров изменяется в зависимости от полярности растворителя, что может быть обусловлено различной энергией сольватации С-7 функциональной группы в диастереомерных молекулах.

1.2. Синтез аллоколхициноидов III

Соединения III были получены с применением описанного выше синтетического подхода. Реакция кросс-сочетания Сузуки-Мияура между арилгалогенидом 6 и борорганическим производным индола 20 приводила к биарилу 21, сложноэфирную группу которого подвергали основному гидролизу (схема 6). Выход производного 22 после двух стадий составил 48%. Кислоту 22 превращали в хлорангидрид 23, который при действии двукратного избытка диизобутилалюминийхлорида претерпевал внутримолекулярное ацилирование Фриделя-Крафтса и in situ восстановление карбонильное группы*. Выход тетрациклического спирта 24 составил 68%. Удаление брома в соединении 24 по реакции с от/ге/я-бутиллитием в тетрагидрофуране позволило получить продукт 25 с выходом 96%.

Насколько нам известно, возможность применения диизобутилалюминийхлорида для проведения реакции Фриделя-Крафтса с последующим in situ восстановлением карбонильной группы показана нами впервые.

Ме Схема 6

Производное 25 является субстратом для получении аллоколхициноидов с различными С-7 функциональными группами (схема 7). Так, окисление соединения 25 М-метилморфолин-1Ч-оксидом в присутствии каталитического количества перрутената тетрапропиламмония (реакция Лея) приводило к кетону 26 с выходом 90%. Превращение спирта 25 в ацетат 27 было осуществлено с выходом 98% по реакции переэтерификации с этилацетатом. Взаимодействие соединения 25 с азидом цинка в условиях реакции Митсунобу завершалось образованием продукта 28 (выход 93%), который был восстановлен алюмогидридом лития до амина 29 (выход 93%). Ацилирование последнего уксусным ангидридом в пиридине приводило к ацетамиду 30 с выходом 94%.

2п(М3)2'2Ру РР|13, 01А0, То1Н

гас-28 Ме'

■

Т Т у— он

МеСУ^Т5

МеО г(

гас-25 Ме

90%

ММО, МЭ 4А Рг4МЯи04 (0,05 экв) СН2С12/СН3СМ

26 Ме

93%

□А1Н4,ТГФ

98%

ЕЮЦ ЕЮАс, 40°С, 50 мм.

I- рт. ст. |

сас-29 Ме

Схема 7

гас-27 Ме

1.3. Синтез аллоколхициноидов 1Уа

Для формирования семичленного цикла аллоколхициноидов 1Уа нами предложено использовать реакцию внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования арилиодида 31, который, в свою очередь, может быть получен по методу синтеза кетонов Вайнреба (схема 8).

?Ме

МеСХ МеО'

■ОМе

МеО .

тип IVa /

каталитическое С-Н арилирование

реакция AdN (синтез кетонов Вайнреба)

•ОМе

33 М = м етапл

Схема 8

Амид Вайнреба 32 был синтезирован из коммерчески доступной кислоты 5 в 2 стадии с выходом 91% (схема 9). 1-Метилиндол 34 превращали в церийорганический реагент 36 с помощью реакции металлирования тяреот-бутиллитием и трансметаллирования хлоридом церия(Ш). Металлорганический реагент 36 использовали in situ в реакции с электрофилом 32. Оптимизация условий проведения трех one pot стадий позволила получить кетон 31 с выходом 78% при использовании мультиграммовых количеств исходных субстратов. Показано, что реакция литийорганического соединения 35 с амидом 32 приводит к целевому продукту 30 с выходом не более 8%. Следует отметить, что гетероароматические соединения церия (III) к настоящему моменту практически не изучены.

Оз —- 0>и

^^N t-Buü (1,05экв) ^^N

i (1,05 экв) Me ТГФ, -5 - 0CC

10 мин

CeCI3 (1,05 экв) -5 - 0°C, -30 сек

Ov-

MeOv.,.Me N

MeO-

MeO

XT'

CO,H

91%

MeO

1) (COCIfe, ТГФ

OMe 5

2) HN(OMe)Me*HCI, Py 3) Ag0C(0)CF3, l2, CH2CI2

MeO'

Af1-,

OMe 32

NH4CI водн

OMe 31 78%

0-CeCI2 Me 37

Схема 9

Превращение производного 31 в тетрациклический кетон 38 было осуществлено с выходом 71% по реакции внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования в присутствии каталитической системы Рс1(ОАс)2 - СэгСОз - г-ВиСООН - ДМФ (схема 10). Показано, что энантиоселективное восстановление кетона 38 боран-тетрагидрофурановым комплексом в присутствии (8)-метилоксазаборолидина 39 (восстановление Кори-Бакши-Шибата) приводит к образованию спирта 40 с выходом 90% и 89% ее (схема 10).

Схема 10

Соединение 40 подвержено легкой дегидратации, в связи с этим превращение кетона 31 в целевой ацетамид 42 было осуществлено через промежуточное образование оксима 41, который восстанавливали системой боргидрид натрия -хлорид никеля(П) и ацилировали уксусным ангидридом в пиридине (схема 11). Выход продукта 42 после трех стадий составил 43%.

Схема 11

Установлено, что реакция восстановления оксима 41 алюмогидридом лития в тетрагидрофуране протекает иным образом и приводит к азиридину 43, который при хроматографиовании на силикагеле системой растворителей дихлорметан - метанол претерпевает раскрытие цикла с образованием а-метоксиамина 44 (схема 12). Ацилирование производного 44 уксусным ангидридом в присутствии пиридина завершается образованием продукта 45. Ацетамид 45 получен в виде смеси диастереомеров в соотношении ~5:1 с выходом 42% относительно исходного оксима 41. Структура соединения 45 подтверждена методом ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения и РСА (транс-диастереомер).

ТГФ, 66°С

42% (3 стадии)

М-Ме АСгО, СН2С12 пиридин

Схема 12

1.4. Синтез аллоколхициноидов 1УЬ

По аналогии с соединениями 1Уа, для формирования семичленного цикла аллоколхициноидов 1УЬ нами предложено использовать реакцию внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования производного 46 (схема 13). Применение описанного выше метода синтеза кетонов Вайнреба позволило получить соединение 46 с выходом не более 20%. Поэтому был использован альтернативный подход, включающий реакцию конденсации индолилкетона 47 и бензальдегида 48 и гидрирование двойной связи полученного енона.

ом

тип 1УЬ

каталитическое С-Н арилирование

кротоновая конденсация и восст-е енона

МеО 48 ОМе

Схема 13

Синтез начинали с превращения 1#-индол-2-карбоновой кислоты 49 в кетон 47 с помощью реакций нуклеофильного присоединения метиллития и Ы-алкилирования 2-(хлорометокси)этилтриметилсиланом (схема 14). Выход производного 47 составил 86%. Арилиодид 48 был получен из коммерческого реагента 51 с выходом 92% по реакции с //-йодосукцинимидом в присутствии каталитического количества трифторуксусной кислоты. Кротоновая конденсация соединений 47 и 48 в условиях основного катализа приводила к образованию сопряженного енона 52 с выходом 93%.

Схема 14

Проведен скрининг методов восстановления халконовых систем с целью превращения продукта 52 в синтетический интермедиат 46 (схема 15). Показано, что реакция енона 52 с гидридным комплексом меди (РРЬ3СиН)6 (реагент Страйкера) в бензоле в присутствии стехиометрического количества воды приводит к образованию продукта восстановления 46 с высоким выходом. Реакция внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования соединения 46 в присутствии каталитической системы Рс12(с1Ьа)з - ЬВиСООСв - ДМФ протекала с образованием тетрациклического продукта 53 (выход 68%). Удаление защитного БЕМ-фрагмента в производном 53 кислотным гидролизом в этаноле и восстановление карбонильной группы боргидридом натрия позволили получить аллоколхициноиды 54, 55 с высокими выходами (схема 15).

Схема 15

1.5. Результаты исследования противоопухолевой активности аллоколхициноидов I-IV

Определена цитотокснческая активность аллоколхициноидов I-IV по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB (Таблица 1).* Выявлен ряд соединений (12-15, 18, 19, 25-27), ингибирующих клеточное деление и вызывающих апоптоз в наномолярном/субнаномолярном интервале концентраций. С помощью LDH-теста показана низкая неспецифическая токсичность указанных производных в концентрациях 0,001 -100 мкМ.

Таблица 1 Цитотокснческая активность аллоколхициноидов I-IV по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB

структурн. X № 1С501 ас502 Ингибир-е пролифе- Некроз при

тип (рис.1) соед [мкМ] [мкМ] рации при АС50 [%] ас5О[%]3

колхицин 0,02 0,03 - -

о 12 0,001-0,005 0,005 84 0

ОН 14 0,01-0,05 0,1 83 1

N3 16 0,1-0,5 0,1-0,5 32-93 0

NHAc 18 0,05-0,1 0,1-0,5 76-99 0

О 13 " <0,001 <0,001 83 (при 0,001 М) 0 ]

II ОН 15 0,005-0,01 0,01 85 0

NHAc 19 0,01-0,05 0,01-0,05 24-84 4

ОН 25 0,001 0,001 52 7

О 26 0,01-0,05 0,05 98 4

III ОАс 27 0,01-0,05 0,05 89 0

N3 28 -50 >100 30 1

nh2 29 0,5-1 5 90 29

NHAc 30 >100 >100 - -

IV NHAc 42 0,1-0,5 0,5 70 20

О 54 >100 >100 - -

ОН 55 >100 >100 - -

' - концентрация вещества, ингибирующая деление клеток на 50%; параметр определен методом CASY cell counting после 48 часов инкубации

2 - концентрация вещества, вызывающая апоптоз 50% клеток; параметр определен по фрагментации ДНК после 72 часов инкубации

3 - параметр определен с помощью LDH-теста после 1 часа инкубации

Наиболее активными среди исследованных структурных изомеров являются аллоколхициноиды II, содержащие 4,5-аннелированный 1-метилиндольный фрагмент. С-7 функциональная группа оказывает существенное влияние на цитотоксические

* Исследования проведены в группе Dr. А. Prokop, Отделение педиатрической гематологии/онкологии, Детский госпиталь г. Кельн, Германия.

свойства. Общей тенденцией является более высокая активность производных, содержащих С(7)-0 связь (рис.1, X = О, ОН, ОАс) по сравнению с соответствующими С(7)-Ы аналогами (X = N3, ЫН2,1МНАс).

Исследовано влияние аллоколхициноидов I, II в концентрации 50 нМ на метаболическую активность клеток хронического лимфолейкоза Мес-1 (Таблица 2).* Наибольшее снижение метаболической активности вызвало соединение 15.

Таблица 2 Цитотоксическая активность аллоколхициноидов 1,11 по отношению к штамму хронического лимфолейкоза Мес-1 по результатам ХТТ-теста

колхицин 12 13 14 15 16 18 19

метаболическая активность [%]1 10 100 32 35 26 98 77 82

Проведен сравнительный анализ апоптоз-индуцирующей активности аллоколхициноида 15, колхицина и клинического препарата винкристина по отношению к нескольким штаммам хронического лимфолейкоза, в том числе к первичным клеткам (СПЛ-СЬЬ4), полученным после проведения биопсии у четырех пациентов. На основании полученных данных рассчитаны параметры 1С50 (таблица 3). В случае первичных клеток СIX1-4 цитотоксичность аллоколхициноида 15 превысила активность винкристина и уступила активности колхицина.

Таблица 3 Цитотоксическая активность аллоколхициноида 15, колхицина и винкристина по отношению к различным штаммам хронического лимфолейкоза по результатам проточной цитометрии БАСБ

IC50 [НМ]

Мес-1 SU-DHL-5 CLL1 CLL2 CLL3 CLL4

колхицин 13 10 20 14 11 22

15 11 11 60 76 33 57

винкристин 45 - 0,4 172 90 119 126

Показано, что механизм биологического действия аллоколхициноида 15 аналогичен таковому для колхицина и винкристина и заключается в нарушении формирования веретена деления клетки, ведущем к остановке клеточного цикла в фазе 02/М, и, впоследствии, к апоптозу.

* Исследования проведены в группе Dr. G. Krause, Department of Internal Medicine, Center for Integrated Oncology Köln Bonn, Кёльнский университет, Германия.

2. Синтез лнпофильных производных колхнцнна, аллоколхицина и комбретастатнна А-4

2.1. Синтез лииофильных производных колхицина и аллоколхицина

В работе синтезированы новые 7*-(Г,2',3'-триазолил)замещенные аналоги природных противоопухолевых агентов колхицина и аллоколхицина, а также их липофильные формы на основе олеиновой и пальмитиновой кислот.

Целевые соединения были получены в 5-6 стадий из природного колхицина 56 (схема 16). Трехстадийное удаление ацетильной группы алкалоида 56 проводили в соответствии с известной методикой [J. Org. Chem. 2004, 69, 8987]. Дезацетилколхицин 59 превращали в азид 60 по реакции диазотрансфера с трифлилазидом в присутствии карбоната калия и каталитического количества сульфата меди(Н). Применение данного подхода позволило получить продукт 60 с суммарным выходом 4 стадий 48%.

Схема 16

Превращение колхициноида 60 в алло-аналог 63 было осуществлено с применением классической методики, описанной Фернхольцем в 1950 году для аналогичной трансформации (нагревание с избытком метилата натрия в метаноле, схема 17) [Liebigs Ann. Chem. 1950, 568, 63]. Возможный механизм данной основно-катализируемой перегруппировки с сокращением цикла представлен на схеме 17. Мы предполагаем, что на первом этапе происходит обратимое нуклеофильное присоединение метокси-аниона к карбонильной группе трополонового фрагмента, приводящее к неароматическому интермедиату 61, который далее претерпевает термическую дисротаторную бтс-электроциклизацию с образованием норкарадиена

* Использована нумерация колхицина, схема 15

62. Фрагментация циклопропанового кольца интермедиата 62 сопровождается перераспределением кратных связей и элиминированием метокси-аниона, приводя к ароматическому аллоколхициноиду 63.

54%

МеО№ (2 экв) МеОН, 75°С

Схема 16

6Л 013

^ г,ОМе ОМе

МеО

Азиды 60 и 63 использовали в реакции медь(1)-катализируемого диполярного [3+2]-циклоприсоединения с пропаргиловым спиртом и пропаргиловыми эфирами олеиновой и пальмитиновой кислот (схема 18). МеО»

МеО.

64 94% ОМе МеО.

66 96% ОМе МеО,

67 89%

МеО п ^,ОН МеО /=\

68 90% С02Ме

МеО.

69 92%

Проведение взаимодействия в микроволновом реакторе в присутствии каталитической системы Си304 - аскорбат натрия - г-ВиОН - 1120 позволило получить целевые триазолсодержащие соединения 64, 65 и их липофильные пролекарственные формы 66-69 с выходами 89-96%.

Следует отметить, что производные 66-69 содержат биодеградируемую сложноэфирную связь, способную претерпевать внутриклеточный гидролиз под действием ферментов (эстераз) с высвобождением исходного терапевтического агента

(64 либо 65). Эти соединения были использованы для включения в состав липосомных частиц-носителей лекарств.

2.2. Результаты исследования противоопухолевой активности соединений 58-63 и липосомных препаратов на их основе

С помощью ОАР1-тсста изучена способность соединений 64-69 ингибировать полимеризацию белка тубулина, который является биологической мишенью колхицина.* Показано, что производные 64 и 65 ингибируют полимеризацию белка (3 мг/мл) в концентрации 40 мкМ. Колхициноиды 66, 67 проявляют умеренную ингибирующую активность в данной концентрации, в то время как аллоколхициноиды 68, 69 не оказывают воздействия на полимеризационный процесс. Известно, что колхицин ингибирует полимеризацию тубулина (3 мг/мл) в концентрации 3 мкМ \ChemMedChem 2010, 5, 661].

Исследована антимитотическая и апоптоз-индуцирующая активность соединений 64-69 по отношению к штамму лимфомы В.ГАВ (таблица 4)

Таблица 4 Цитотоксическая активность соединений 64-69 по отношению к штамму лимфомы Беркитта В.ГАВ

Колхицин 64 66 67 65 68 69

1С50 [нМ]1 20 25 4 6 300 15000 20000

ACso [нМ]1 30 25 8 8,5 800 10000 18000

1 - параметр определен методом CASY cell counting после 48 часов инкубации

2 - параметр определен по фрагментации ДНК после 72 часов инкубации

Показано, что цитотоксичность колхициноида 64 примерно равна активности колхицина, в то время как липофильные пролекарства 66, 67 являются более эффективными ингибиторами клеточного деления. Поскольку способность производных 66, 67 нарушать полимеризацию тубулина ниже таковой для соединения 64, повышение их противоопухолевой активности in vitro может быть обусловлено вторичными эффектами, такими как улучшенный транспорт липофильных форм сквозь плазматическую мембрану клетки. С помощью LDH-теста показана низкая неспецифическая токсичность соединений 66, 67 в интервале концентраций 1 нМ -100 мкМ (после инкубации в течение 1ч некроз клеток BJAB составил не более 3%).

Исследования проведены в группе Prof. Н. Oschkinat, Институт молекулярной фармакологии, Берлин

* Исследования проведены в группе Dr. A. Prokop, Отделение педиатрической гематологии/онкологии, Детский госпиталь г. Кельн, Германия.

В отличие от производных колхицина, алло-аналог 65, и, в особенности, его липофильные производные 68, 69 продемонстрировали на несколько порядков меньшую цитотоксичность.

Методом экструзии получены моноламеллярные липосомы (85±36 нм), состоящие из природных фосфолипидов (фосфатидилхолин /фосфатидилинозит, 8:1, 90 мольн%) и липофильного производного 66 либо 67 (10 мольн%)* (рис. 3).

Рис. 3 Состав терапевтических липосом

Исследована in vitro противоопухолевая активность колхициноида 64, соединений 66, 67, а также их липосомных форм L66 и L67 по отношению к нескольким типам опухолевых клеток человека (таблица 5). Данные препараты проявляют цитотоксические свойства в наномолярных концентрациях (2,5 - 100 нМ) и оказывают дозозависимый ингибирующий эффект на клеточную пролиферацию. Все линии опухолевых клеток, за исключением Т-лимфомы Jurkat, показали более высокую чувствительность к липофильным производным 66, 67 по сравнению с колхициноидом 64. Включение олеоильного эфира 66 в состав липосом привело к увеличению цитотоксичности (1,5-3 раза).

Таблица 5 Цитотоксическая активность колхициноида 64, липофильных производных 66, 67 и их липосомных форм L66 и L67 по результатам МТТ-теста

линия клеток 64 66 67 L66 L67

HBL-100 9 3,5 3,5 2,5 4,5

К562 40 20 16 8,5 14

НаСаТ 35 27 15 9 40

Jurkat 10 15 30 100 80

Исследовано влияние соединений 64, 66, 67 на протекание клеточного цикла и апоптоз штаммов НВЬ-100, НаСаТ, 1игка1 (рис. 4). Показано, что высокая

Исследования проведены в группе проф. Е. Л. Водовозовой, Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Москва.

восприимчивость клеток HBL-100 к действию колхициноидов обусловлена блокированием клеточного цикла в фазе G2/M в сочетании с повышением количества апоптотических клеток. Основным механизмом воздействия колхициноидов на клетки линий НаСаТ и Jurkat является индуцирование апоптоза.

apoptosis

аро ptosis

100 80 60 ° 40 20 0

НаСаТ

■ дмсо

а 64 66 8 67 к L66 ■f L67

Ни

apoptosis G1

Рис. 4 Влияние колхициноидов 64, 66, 67 и липосомных форм L66, L67 в концентрации 1 мМ на протекание клеточного цикла штаммов HBL-100, НаСаТ, Jurkat после 48 часов инкубации

2.3. Синтез липофильных производных комбретастатина А-4 (СА-4)

Комбретастатин А-4 синтезировали по известной методике [Tetrahedron Lett. 2007, 48, 7007] исходя из коммерчески доступного 3,4,5-триметоксибензальдегида 51 в 5 стадий с суммарным выходом 26% (схема 19). Противоопухолевый агент 70 далее переводили в липофильные производные 71, 72 с хорошими выходами по реакции ацилирования хлорангидридами олеиновой и пальмитиновой кислот.

Q 26%

(5 стадий)

МеО'

ОМе 51

МеО

МеО ОМе ОМе комбретастатин А-4 70

1) NaH ТГФ 2) RCOCI

71: R - 017 Hg; 72: R - C1sHt

67% 72%

Схема 19

активности

2.4. Результаты исследования ш vivo противоопухолевой липофильных производных СА-4 в составе адресных липосом*

Методом экструзии получены моноламеллярные липосомы (85±36 нм), состоящие из природных фосфолипидов (фосфатидилхолин 75 мольн% и фосфатидилинозитол 10 мольн%), липофильного производного 71 (13 мольн%) и олигосахаридного лиганда SiaLex (2 мольн%), обладающего сродством к белкам селектинам, экспрессируемым на мембранах эндотелиальных клеток опухолевых тканей (рис. 4).

Фосфатидилхолин

un un

Фосфатидилннозит

он I он

ocr Фосфплипилы Пролекарства ■^Д/— SiaLe*-KoirbroraT

но он соо „„' ] о={

,ОН_ í NH

Nou5Act;2-3Gal!l1 -4

GlcNAc|¡1-

Сиалил-Lewis X, SiaLex

Рис. 4 Состав адресных терапевтических липосом

Противоопухолевый эффект полученного липосомного препарата исследован in vivo на линии мышей BLRB/BYRB, характеризующейся высокой частотой спонтанного возникновения рака молочной железы. Препараты SiaLex-nnnocoM с пролекарством 71 (0,2 мл дисперсии в фосфатном буферном растворе, 22 мг/кг в эквивалентной дозе по СА-4 70) вводили экспериментальным животным (п = 4) внутривенно 3 раза с интервалом в одну неделю после достижения опухолями диаметра ~ 10 мм (объема ~ 0.5 см3). У трех из четырех исследованных животных трехкратная инъекция липосомного препарата (4, 5 и 6 недели) вызвала остановку развития опухоли. Противоопухолевый эффект отсутствовал в одном из исследованных случаев.

'Исследования проведены в группе проф. Е. Л. Водовозовой, Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Москва.

выводы

1. Впервые разработаны методологии получения и осуществлен синтез структурных аналогов природного антимитотического агента аллоколхицина — 1-замещенных Г,2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]Ш-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е или 2,34 или 3,2-Г] 1Н-1 "-метилиндолов 1-Ш и Г,2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]1Я-6,7-дигидроциклогепта[2,3-Ь] 1//-индолов IV.

2. Установлено, что некоторые гетероциклические аллоколхициноиды проявляют антимитотическую и апоптоз-индуцирующую активность по отношению к штамму лимфомы Беркитта ВМВ в нано/субнаномолярных концентрациях и обладают низкой неспецифической токсичностью. Показано, что Г,2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]1Н-6,7-дигидро-1 -гидроксициклогепта[2,3-е] 1Н-1 "-метилиндол ингибирует фазу С2/М клеточного цикла и индуцирует апоптоз нескольких штаммов клеток хронического лимфолейкоза в наномолярном интервале концентраций. Данное соединение по цитотоксичности превосходит клинический препарат винкристин, используемый в терапии лимфолейкозов.

3. Впервые синтезированы 7-триазолилзамещенные производные колхицина и аллоколхицина по реакции каталитического диполярного [3+2]-циклоприсоединения 7-азидоколхицина и 7-азидоаллоколхицина с пропаргиловым спиртом и пропаргиловыми эфирами олеиновой и пальмитиновой кислот.

4. Установлено, что липофильные триазолзамещенные производные колхицина, а также липосомные препараты на их основе обладают цитотоксической активностью по отношению к пяти штаммам опухолевых клеток человека в наномолярном интервале концентраций.

5. Впервые получены липофильные пролекарственные формы комбретастатина А-4, содержащие остатки олеиновой и пальмитиновой кислот. Установлено, что фосфолипидные липосомы, несущие олеоильное производное комбретастатина А-4 и углеводный лиганд селектинов 81аЬеХ, обладают способностью подавлять развитие опухоли у мышей линии ВЬЯВ/ВУЯВ со спонтанно возникающим раком молочной железы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Nicolaus N., Reball J., Sitnikov N.. Velder J., Termath A., Fedorov A.Yu., Schmalz H.-G. A Convenient Entry to New C-7-Modified Colehicinoids through Azide Alkyne [3+2] Cycloaddition: Application of Ring-Contractive Rearrangements // Heterocycles-2011. - V. 82.-P. 1585-1600.

2. Moiseeva E.V., Kuznetsova N.R., Svirshchevskaya E.V., Bovin N.V., Sitnikov N.S.. Shavyrin A.S., Beletskaya I.P., Combes S., Fedorov A.Yu., Vodovozova E.L. Liposome Formulations of Combretastatin A-4 and Its 4-Arylcoumarin Analogue Prodrugs: the Antitumor Effect in the Mouse Model of Breast Cancer // Biochemistry (Moscow) Suppl. Ser. B: Biomed. Chem. - 2011. V. 5 - P. 276-283.

3. Ситников H.C.. Болдырев И.А., Моисеева E.B., Шавырин А.С., Белецкая И.П., Комб С., Бовин Н.В., Федоров А.Ю., Водовозова Е.Л. Противоопухолевые липосомы с пролекарством комбретастатина А-4 и тетрасахаридным лигандом селектинов // Изв. АН Сер. Хим. - 2010. - Вып. 12. - С. 2234-2240.

4. Sitnikov N.S. Velder J., Prokop A., Fedorov A.Yu., Schmalz H.-G. Synthesis and biological evaluation of indole-containing allocolchicinoids // Abstracts of the International Butlerov Congress on Organic Chemistry. - Kazan, Russia. - 2011. - P. 187-188.

5. Ситников H.C.. Федоров А.Ю., Вельдер Я., Шмальц Г.-Г. Синтез индолсодержащих аллоколхициноидов // Материалы XIV Молодежной конференции по органической химии. - Екатеринбург. - 2011. - С. 221-223.

6. Ситников Н.С.. Вельдер Я., Шмальц Г.-Г., Федоров А.Ю. Синтез и исследование противоопухолевой активности индолсодержащих аналогов аллоколхицина // Материалы XVI Нижегородской сессии молодых ученых. Естественные науки. - Нижний Новгород. - 2011. - С. 157-158.

7. Ситников Н.С.. Федоров А.Ю., Вельдер Я., Шмальц Г.-Г. Синтез индолсодержащих аллоколхициноидов // Материалы всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии». - Казань. - 2010. - С. 65.

8. Fedorov A.Yu., Sitnikov N.S.. Vodovozova E.L., Schmalz H.-G., Velder J., Beletskaya I.P. Development of liposomic drug delivery systems for the selective transport of colchicines site antitumour agents // Abstracts of the International conference «Topical Problems of Organometallic and Coordination Chemistry». -Nizhny Novgorod. - 2010. - P21.

9. Ситников Н.С.. Федоров А.Ю., Водовозова E.JL, Моисеева Е.В. Создание липосомных систем селективной доставки антимитотических агентов к опухолевым тканям // Материалы XV Нижегородской сессии молодых ученых. Естественные науки. - Нижний Новгород. - 2010. - С. 141-142.

10. Ситников Н.С.. Моисеева Е.В., Болдырев И.А., Кузнецова Н.Р., Водовозова E.JL, Белецкая И.П., Федоров А.Ю. Создание липосомных систем селективной

■ доставки антимитотических агентов к опухолевым тканям // Материалы Всероссийской конференции по органической химии. - Москваю - 2009. - С. 387.

Благодарности

Автор выражает благодарность за ценные научные консультации и помощь академику РАН Белецкой И.П. (МГУ им. М.В. Ломоносова), проф. Шмальцу Г.-Г. (Кёльнский университет, Германия), д.х.н. Водовозовой E.JI. (ИБХ РАН), д.х.н. Фукину Г.К. (ИМХ РАН), к.х.н. Вельдер Я. (Кёльнский университет, Германия), к.х.н. Малышевой Ю.Б. (ННГУ им. Н.И. Лобачевского), к.х.н. Дрэгичу А.И. и фирме ДАЛХИМ, аспиранту Нючеву A.B. (ННГУ им. Н.И. Лобачевского).

Подписано в печать 02.07.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Уел. печ. л. 1,5. Заказ № 441. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в РИУ ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ситников, Николай Сергеевич, Нижний Новгород

61 12-2/656

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный

университет им. Н.И. Лобачевского»

СИТНИКОВ НИКОЛАЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТОДОЛОГИИ СИНТЕЗА АНТИМИТОТИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ КОЛХИЦИНОВОГО РЯДА

02.00.03 - органическая химия

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н., доцент А. Ю. Фёдоров

Нижний Новгород - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений......................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................3

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...........................................................................................................8

МЕТОДОЛОГИИ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ АЛЛОКОЛХИЦИНОВОГО РЯДА............10

1. Получение соединений аллоколхицинового ряда из природного колхицина..................10

2. Синтетические методы получения соединений аллоколхицинового ряда........................13

2.1. Методы синтеза N-ацетилколхинола (NAC)................................................................13

2.1.1. Синтез NAC с использованием реакции биарильного окислительного сочетания.........................................................................................................................13

2.1.2. Синтез NAC с использованием реакций биарильного восстановительного сочетания.........................................................................................................................18

2.2. Методы синтеза О-метилового эфира N-ацетилколхинола (NCME).........................22

2.2.1. Синтез NCME с использованием реакции циклопропанирования -расширения цикла замещенного фенантрола...............................................................22

2.2.2. Синтез NCME с использованием реакции Николаса........................................24

2.3. Методы синтеза аллоколхицина....................................................................................28

2.3.1. Синтез аллоколхицина из 7,8,9-триметоксибензосуберона-1 с использованием реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера...........................................................28

2.3.2. Синтез аллоколхициноидов с использованием реакций метатезиса и циклоприсоединения Дильса-Альдера..........................................................................32

2.3.3. Синтез аллоколхицина с использованием реакции прямого каталитического С-Н арилирования...........................................................................................................35

ОБОСНОВАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................45

1. Поиск новых антимитотических агентов колхицинового сайта........................................45

2. Исследование противоопухолевых свойств липофильных производных комбретастатина

А-4 и колхицина в составе липосомных систем доставки лекарств......................................53

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................................................................................58

1. Синтез индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина....................................58

1.1. Синтез аллоколхициноидов I-II.....................................................................................59

1.2. Синтез аллоколхициноидов III.......................................................................................73

1.3. Синтез аллоколхициноидов IVa.....................................................................................79

1.4. Синтез аллоколхициноидов IVb....................................................................................94

2. Синтез липофильных производных колхицина, аллоколхицина и комбретастатина А-4. .....................................................................................................................................................100

2.1. Синтез липофильных производных колхицина и аллоколхицина...........................100

2.2. Синтез липофильных производных комбретастатина А-4.......................................104

3. Результаты исследования биологической активности полученных соединений...........107

3.1. In vitro противоопухолевая активность индолсодержащих аналогов аллоколхицина. ................................................................................................................................................107

3.2. In vitro противоопухолевая активность триазолсодержащих аналогов колхицина и аллоколхицина и их липосомных форм.............................................................................116

3.3. In vivo противоопухолевая активность липофильных производных комбретастатина А-4 и их липосомных форм.................................................................................................124

ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................................128

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................174

ЛИТЕРАТУРА...........................................................................................................................175

БЛАГОДАРНОСТИ..................................................................................................................199

Приложение 1 Методики проведения биологических исследований..................................200

Список сокращений

Су - циклогексил

СА-4 - комбретастатин А-4

DDQ - 2,3-Дихлоро-5,6-дицианобензохинон

NAC - N-ацетилколхинол

NBS - N-бромосукцинимид

NCME - метиловый эфир N-ацетидколхинола

NMO - N-метилморфолиноксид

РСС - пиридина хлорохромат

PDC - пиридина дихромат

SET - single-electron transfer, одноэлектронный перенос TBS - треш-бутилдиметилсилил Ts - и-толуолсульфонил

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДАК - динитрил азоизомасляной кислоты

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФ - диметилформамид

РСА - рентгеноструктурный анализ

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТГФ - тетрагидрофуран

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Несмотря на существенный прогресс, достигнутый за последние два десятилетия в разработке новых противоопухолевых химиотерапевтических средств, подавляющее большинство лекарств, применяемых в медицинской практике, а также находящихся на стадии клинических тестов, обладает общими недостатками. К ним относятся низкая селективность биологического действия и, как следствие, высокая системная токсичность, а также снижение терапевтической активности ввиду множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Труднодоступность природных источников и отсутствие промышленно реализуемых путей синтеза (например, в случае таксанов) ограничивает клинические исследования и практическое внедрение многих эффективных противоопухолевых препаратов. В связи с этим, актуален поиск новых синтетически доступных антимитотических агентов, имеющих высокий терапевтический индекс (отношение минимальной токсичной дозы к эффективной терапевтической дозе), и улучшение их фармакокинетических параметров (биодоступность, распределение по органам и тканям) путем синтеза пролекарственных форм и создания адресных противоопухолевых препаратов на их основе.

Данная работа посвящена разработке методологий синтеза новых антимитотических противоопухолевых агентов - гетероциклических аналогов

природных алкалоидов колхицина и аллоколхицина. Полученные соединения наряду с известным противоопухолевым агентом колхицинового сайта комбретастатином А-4 были использованы для получения липофильных пролекарственных форм и создания липосомных систем адресной доставки лекарств на их основе.

1) Синтез индолсо держащих структурных аналогов природного алкалоида аллоколхицина с целью исследования их противоопухолевых свойств;

Научная новизна и практическая значимость работы. Предложены и реализованы методологии синтеза четырех структурных типов индолсодержащих аналогов алкалоида аллоколхицина исходя из коммерчески доступных реагентов - 3-(3',4',5'-триметоксифенил)пропионовой кислоты и производных индола. Методом ]Н ЯМР спектроскопии выявлено наличие атропизомеризационного равновесия некоторых аллоколхициноидов в растворе при комнатной температуре.

Установлено, что некоторые из полученных соединений проявляют антимитотическую и апоптоз-индуцирующую активность по отношению к штамму

лимфомы Беркитта BJAB в нано/субнаномолярных концентрациях наряду с низкой неспецифической токсичностью.

Показано, что аллоколхициноид Г,2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]1#-6,7-дигидро-1 -гидроксициклогепта[2,3-е] 1 Я-1 "-метил индол ингибирует фазу G2/M клеточного цикла и индуцирует апоптоз нескольких штаммов клеток хронического лимфолейкоза в наномолярном интервале концентраций. Установлено, что данное соединение по цитотоксичности in vitro превосходит клинический препарат винкристин, используемый в терапии лимфолейкозов.

Липофильные производные колхицина и комбретастатина А-4 использованы для создания противоопухолевых липосом. Установлено, что производные колхицина и их липосомные формы проявляют цитотоксическую активностью по отношению к пяти штаммам опухолевых клеток человека в наномолярном интервале концентраций. Липосомный препарат на основе олеоильного производного комбретастатина А-4, содержащий адресные углеводные векторы SiaLe , продемонстрировал способность подавлять развитие опухоли у мышей линии BLRB/BYRB со спонтанно возникающим раком молочной железы.

На защиту выносятся следующие положения:

- экспериментальные данные о синтезе индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина;

- экспериментальные данные о синтезе липофильных производных колхицина, аллоколхицина, комбретастатина А-4;

- результаты исследования структуры полученных соединений физико-химическими методами;

- результаты исследования биологической активности полученных соединений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции «International congress on Organic Chemistry» (Казань, 2011), XIV Молодежной конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011), 15- и 16-ой Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучная секция, г. Н.Новгород, 2010, 2011), 13- и 14-ой Конференции молодых ученых-химиков г. Н.Новгорода (2010, 2011), молодежной конференции «Topical problems of Organic Chemistry» (Казань, 2010), Международной конференции «Topical problems of organometallic and coordination chemistry. V Razuvaev lectures» (Нижний Новгород, 2010), Всероссийской конференции по органической химии (Москва, 2009).

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обоснования диссертационных исследований, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы (268 наименований) и одного приложения. Работа изложена на 205 страницах машинописного текста, включает 80 схем, 37 рисунков, 18 таблиц. Литературный обзор посвящен обсуждению известных методологий синтеза аллоколхицина и его структурных аналогов. В разделе «Обоснование диссертационных исследований» приводится информация о корреляции структура - физиологическая активность для

противоопухолевых агентов колхицинового сайта клеточного белка тубулина, на основании которой предложены структуры целевых биологически активных молекул. В данном разделе также обосновывается перспективность применения липофильных форм противоопухолевых антимитотических агентов в составе липосомных систем адресной доставки лекарств.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Германской службы академических обменов (DAAD А0879551), Совета по грантам при Президенте РФ (МД^5606.2010.3), РФФИ (09-03-00647а), ФЦП (16.740.11.0476 и 14.740.12.1382).

Колхицин 1 (Рис. 1) [1-3] - основной алкалоид безвременника осеннего Colchicum autumnale - впервые выделен в чистом виде Пеллетье (Pelletier) и Кавенту (Caventou) в 1821 году [4], а его правильная молекулярная структура предложена Дьюаром (Dewar) лишь в 1945 году [5]. С начала 16 века колхицин 1 в малых дозах используется в качестве противовоспалительного агента при лечении подагры [6] и Средиземноморской лихорадки [7]. Однако опубликованные Литсом (Lits, 1934) [8], Дастином (Dustin, 1934) [9] и Аморозо (Amoroso, 1935) [10] данные о способности колхицина 1 ингибировать деление раковых клеток мышей и вызывать регресс опухоли вызвали повышенный интерес к этому алкалоиду.

ОМе

(-)-(аЯ, 78) колхицин 1

Рис. 1 Молекулярная структура колхицина Колхицин 1 имеет уникальную химическую структуру и стереохимические

свойства - трициклический молекулярный скелет, включающий трополоновый цикл,

сочлененный с циклогептановым фрагментом, и ось аксиальной хиральности,

конфигурация которой "запрограммированна'" С-7 стереоцентром (рис. 1). Этот

алкалоид с середины 20 века представляет одно из наиболее сложных для синтеза

природных соединений. Первый тотальный синтез колхицина 1 был осуществлен

Эшенмозером (ЕзсИептоБе^с сотрудниками в 1959 году исходя из пурпурогаллина с

суммарным выходом 22 стадий 0,00006% [11]. Впоследствии было предложено около

15 других синтетических стратегий, отражавших развитие искусства органического

синтеза на протяжении пяти десятилетий [12].

Биологические свойства колхицина 1 обусловлены прежде всего его

способностью связываться с внутриклеточным белком тубулином, формирующим

микротрубочки веретена деления клеток [13]. Каталитическая ниша четвертичной

структуры белка, с которой взаимодействует алкалоид, получила название

колхицинового сайта тубулина [14, 15]. Связываясь с тубулином, колхицин 1

нарушает формирование митотического веретена клетки, что приводит к остановке клеточного цикла в фазе 02/М и, в конечном итоге, к апоптозу (запрограммированной клеточной гибели) [16-18]. Поскольку ключевой характеристикой злокачественных клеток является интенсивное и неконтролируемое клеточное деление, колхицин 1 способен эффективно индуцировать апоптоз опухолевых клеток путем блокирования митотического процесса. Фактором, препятствующим клиническому применению колхицина 1 в качестве противоопухолевого агента является его низкий терапевтический индекс (высокая нейротоксичность в эффективных химиотерапевтических дозах) [19-21]. Тем не менее, благодаря высокой антимитотической активности, молекулярная структура колхицина стала ориентиром в поиске более селективных структурных аналогов. К числу наиболее перспективных аналогов колхицина относятся аллоколхициноиды, в которых трополоновый цикл замещен на ароматический фрагмент - природный алкалоид аллоколхицин 2 (рис. 2) [2], а также синтетически полученный И-ацетилколхинол 3 [22, 23], водорастворимая форма которого ЪТ)6126 4 достигла фазы II клинических испытаний (исследования были прекращены ввиду выявленной ка�