Синтез и изучение биологической активности органических производных олова с фенольными фрагментами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

Мухатова Елена Михайловна

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛОВА С ФЕНОЛЬНЫМИ ФРАГМЕНТАМИ

02. 00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ . диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

г 8 ноя т

Астрахань-2013

005541389

005541389

Работа выполнена в Астраханском государственном техническом университете на кафедре органической, биологической и физколлоидной химии

Научные руководители: Берберова Надежда Титовиа,

доктор химических наук, профессор

Шпаковский Дмитрии Борисович,

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: Сидоров Алексей Анатольевич,

доктор химических наук, профессор (Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН, заместитель директора)

Аксенов Александр Викторович,

доктор химических наук, профессор (Северо-Кавказский федеральный университет, заведующий кафедрой химии)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный

химико-технологический университет», г. Иваново

Защита состоится «19» декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 307.001.04 при ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет» по адресу:

414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 16, учебный корпус 2, ауд. 201.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного технического университета.

Автореферат разослан «18» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, доцент

Е.В. Шинкарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Оловоорганические соединения (ООС), применяемые в сельском хозяйстве (биоциды) и промышленности (катализаторы различных производств, добавки в антиобрастающие краски), в отличие от своих неорганических предшественников являются достаточно токсичными веществами. Токсичность R„SnX4_„ обусловлена не только способностью взаимодействовать с SH-группами цистеиновых и гистидиновых аминокислотных остатков белков, но и их прооксндантной активностью, что приводит к развитию окислительного стресса и возникновению многочисленных патологий. С целью снижения побочных токсических эффектов в настоящее время активно ведутся работы по созданию новых антиокислительных ловушек для токсичных ООС, проявляющих прооксидантную активность. Недавние исследования доказали высокую цитоксическую активность производных ООС с различными N, О, С-донорными лигандами. Подавление окислительной активности ООС важпо также с точки зрения поиска лекарственных препаратов цитотоксического действия, не оказывающих нежелательного побочного действия. Известными ингибиторами свободнорадикальных окислительных процессов являются пространственно-затрудненные фенолы, имитирующие активность витамина Е. С целью снижения токсичности ООС можно провести их функционализацшо подобными редокс-активными фрагментами. В связи с этим, синтез органических производных олова, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, исследование их редокс-свойств в биохимически значимых реакциях является актуальной задачей и представляет не только научный интерес, но и практическую значимость.

Цель работы заключается в направленном синтезе новых оловоорганических соединений, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, изучении их влияния на биохимические процессы in vitro и установлении взаимосвязи структура - биоактивность. В рамках диссертационной работы решались следующие задачи:

1. Синтез новых оловоорганических соединений, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, и исследование их редокс-свойств.

2. Комплексное изучение анти/прооксидантной и антирадикальной активности полученных соединений на различных модельных системах.

3. Изучение влияния оловоорганических соединений на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови человека in vitro.

4. Оценка цитотоксической активности полученных соединений на линиях

раковых клеток и изучение их взаимодействия с белком тубулином, как одной из биохимических мишеней для потенциальных противораковых средств.

Научная новизна

Синтезированы новые оловоорганические соединения, содержащие фрагмент 2,6-ди-/я/?«и-бутилфенола.

Исследованы редокс-превращения оловоорганических соединений в растворах совокупностью физико-химических методов: циклическая вольтамперометрия (ЦВА), электронный парамагнитный резонанс (ЭПР).

Установлена антиоксидантная активность новых серосодержащих соединениий Sn(TV) и Sn(II) с фрагментами 2,6-ди-тр<?/и-бутилфенола в процессах неферментативного и ферментативного окисления жирных ненасыщенных кислот на примере цис-9-октадеценовой (олеиновой) и цис-9,цис-12-октадекадиеновой (линолевой) кислот.

Впервые показано, что оловоорганические соединения, содержащие фрагменты 2,6 - ди -/и/?ем -бути л ф е н о л а, в отличие от хлоридов, увеличивают скорость разложения Н202 под действием каталазы крови in vitro. Предложены новые детоксицирующие агенты - водорастворимый мезо-тетра(4-сульфофенил)порфирин и 3,5-ди-ш/?ет-бутил-4-гидрокситиофенол для снижения токсического действия оловоорганических соединений.

Установлено, что комплексы оловоорганических соединений с фрагментами 2,6-ди-тре/и-бугилфенола проявляют высокую антипролиферативную активность против линий раковых клеток MCF-7 и HeLa, при этом наблюдается корреляция с их высокой антиоксидантной активностью в процессах пероксидного окисления жирных ненасыщенных кислот, также обнаружено их высокое сродство к белку тубулину, рассматриваемому в качестве одной из мишеней противоопухолевых препаратов -аналогов колхицина, проявляющих антимитотическую активность.

Практическая ценность. В работе предложен способ диагностики стадий течения воспалительных заболеваний придатков матки с помощью определения активности каталазы. Данный способ позволяет повысить точность диагностики и оценить динамику процесса (Патент № 2291438).

Найдены новые детоксицирующие агенты для токсических оловоорганических соединений.

Изучение влияния оловоорганических тиолатов на биохимические мишени противораковых агентов - фермент липоксигеназу и белок тубулин, представляет значительный интерес для поиска новых противораковых агентов, обладающих менее выраженными побочными эффектами. Данные о высокой цитотоксической активности позволяют рассматривать комплексы оловоорганических соединений с фрагментами 2,6-ди-мр«я-бугилфс1юла в качестве перспективных противораковых препаратов.

Апробация работы. Основные результаты и материалы диссертационной работы представлены на Всероссийской молодежной конференции-школе, посвященной 150-летию со дня рождения А.Е. Фаворского (Санкт-Петербург, Россия, 2010), international conference «Topical problems of organometallic and coordination chemistry» V Razuvaev lectures (N. Novgorod, Russia, 2010), XI Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (ICPC-II) (Одесса, Украина, 2011); Frontiers of Organometallic Chemistry, FOC-2012. (Saint Petersburg, Russia, 2012); International Symposium «Modern Trends in organometallic chemistry and catalysis (Moscow, Russia, 2013); International conference "Organometallic and Coordination Chemistry: Fundamental and Applied Aspects" International Youth School-Conference on Organometallic and Coordination Chemistry, (N. Novgorod, Russia, 2013); V конференции "Электрохимические и электролитно-плазменные методы модификации металлических поверхностей" 2013; Первой Российской конференции по медицинской химии (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, 13 тезисов докладов, получен 1 патент.

Объем и структура работы.

Материал диссертационной работы изложен на 120 страницах, включает 8 таблиц, 22 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы из 147 наименований и полностью соответствует паспорту специальности 02.00.03.

Настоящая диссертационная работа проводилась при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты № 11-03-00389, 13-0300487), Федеральной Целевой Программы «Научные и иаучно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 г.г. (ГК №16.740.11.0771 от 31 октября 2011 г.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Литературный обзор

В обзоре представлены данные о свойствах, применении и механизме действия оловоорганических соединений; рассмотрены возможные пути снижения токсического действия органических производных олова, а также последние достижения в поиске цитотоксическнх агентов на основе производных олова.

2. Обсуждение результатов

В работе описан синтез новых соединений Sn(IV) и Sn(II), содержащих фрагменты 2,6-ди-ю/><?т-бутилфенола, а также результаты комплексного исследования редокс-свойств, антирадикальной и антиоксидантной активностей с использованием модельных процессов неферментативного пероксидного окисления цис-9-октадеценовой кислоты и ферментативного окисления цис-9,цнс-12-октадекадиеновой кислоты под действием линоксигеназы (LOX 1-В).

Установлено увеличение скорости ферментативной реакции разложения Н202 каталазой крови in vitro в присутствии оловоорганических соединений с порфириновыми и тиофенольным лигандами.

Изучено связывание оловоорганических соединений с SH-группами белка тубулина - потенциальной мишени для противоопухолевых препаратов. Обнаружена выраженная цитотоксическая активность оловоорганических соединений с тиолатными лигандами на линиях раковых клеток человека MCF-7 и HeLa in vitro.

2.1. Синтез и редокс - активность соединений Sn(lV) и Sn(II), содержащих фрагмент 2,6-ди-/н/><?яг-бу ти л фенола

В работе синтезированы новые соединения олова 1-8 взаимодействием соответствующих хлоридов олова и 3,5-ди-/ире/и-бутил-4-гидрокситиофенола (RSH) в присутствии гидроксида калия (Схема 1). Соединения Sn(IV) различаются длиной и объемом заместителей (Me, Et, Bu, Ph) и числом тиолатных лигаидов на основе 2,6-ди-т/7ет-бугил-4-меркаптофенола (RSH) (10). В качестве соединений сравнения выбраны производные олова Sn(IV) и Sn(II) (8, 9), содержащие два фенольных фрагмента. Бис-(3,5-ди-/ирети-бутил-4-гидроксифетш)оловодихлорид (9) получен по известной методике переметаллирования из соответствующего ртутьорганического производного.

BiA но

SH

Bu! RSH, (10)

RnSnCl4_n

KOIV MeOH

KOH, MeOH ---9-

n = 2, 3

R„Sn(SR)4.r (1-7)

Sn(SR)2 (8)

R' = Me; Et; Bu; Ph; R Me2Sn(SR)2(1) Et2Sn(SR)2 (2) n-Bu2Sn(SR)2 (3) Ph2Sn(SR)2 (4) R2Sn(SR)2 (5) Me3SnSR (6) Ph3SnSR (7)

HgCI

SnCI2 (9)

Bu', BiA

ho-J~% 1)Н9(ОАсЬ,Ас°нНо-t\

\=/ 2) KCl, Me2CO \=/

Bu1 Bu'

Схема 1.

Состав и строение тиолатов Sri подтверждено данными элементного анализа, ИК спектроскопии, ЯМР и рентгеыоструктурного анализа (РСА)'.

По данным РСА соединений 1, 5 структура координационного полиэдра при атоме олова представляет собой искаженный тетраэдр (Рис. 1). Длины связи Sn-S в комплексах составляют 2.40-2.42 А. Несмотря на пространственные препятствия ввиду наличия четырех фрагментов 2,6-ди-шрсте-бугилфенола молекулы 5 способны участвовать в образовании межмолекулярных водородных связей 04—Н4-S1, расстояние H4-S1 составляет 2.936 Ä.

Рис, 1. Молекулярные структуры соединений 1, 5.

В ИК-спектрах при образовании тиолатов 1-8 исчезает полоса валентных колебаний у(8Н) 2573 см"1 лиганда ИЗН. Полоса валентных колебаний неассоциированной ОН-группы наблюдается в области 3620-3640 см"1 для соединений 1-8. Сдвиги характеристичных полос у(ОН) в область более высоких частот по сравнению с Я8Н свидетельствуют о перераспределении электронной плотности в комплексах и доказывают образование связи Э-Бп.

РСА был выполнен в лаборатории структурной химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова под руководством д.х.н.. проф. Л.А. Асланова.

В спектрах ЯМР 'Н 1-8 в СОС13 отсутствует сигнал протона Й-Н группы в ИЗН при 3.5 м.д., а характеристичные сигналы эквивалентных протонов Ви' и ОН группы смещены в сильное поле в спектрах комплексов по сравнению с таковыми для Л8Н. Наличие двух эквивалентных 8-связей С-Бп в 5 приводит к проявлению спин-спинового взаимодействия ароматических протонов фенольных групп с парамагнитными изотопами П7'"98п (Б = 1 /2) с константой расщепления ^п-н) 84 Гц.

Далее было проведено исследование редокс-свойств соединений олова, содержащих фрагмент 2,6-ди-трет-бутилфенола. В биологические окислительно-восстановительные процессы ООС вовлекаются с образованием реакционноспособяых частиц и вторичных продуктов распада, в связи с этим методами ЭПР и электрохимии изучено участие тиолатов олова в данных превращениях.

Химическое окисление соединений 1-8 под действием РЮ2 в толуоле приводит к образованию радикальных частиц. Наличие в соединениях 1-8 одной, двух или четырех 2,6-ди-тр£ти-бутилфенольных групп предполагает образование на первой стадии окисления феноксильного радикала, затем возможна генерация нескольких радикальных центров с последующей деструкцией соединений (Схема 2). Спектры ЭПР радикалов представляют собой триплеты (Рис. 2), характеризующие взаимодействие спина неспаренного электрона с двумя эквивалентными .мета-протонами феноксильного кольца с константами сверхтонкого взаимодействия (СТВ) а(2Н). Введение атома Бп не оказывает значительного влияния на величину константы СТВ а(2Н) в феиоксильиых радикалах Г-8", составляющую 0.15-0.16 мТл.

8и* Ви1

Схема 2. 1-е

Н Рис. 2. Спектр ЭПР феноксильного радикала,

Д 11 А ...» регистрируемого при окислении соединения 1

_Л /I }\ ......... (толуол, РЬ02,290К).

; / > / ' \ I 1 I * ;

Радикалы, образующиеся при окислении 1-8 устойчивы в растворе в отсутствии кислорода при комнатной температуре в течение нескольких часов. Сходство общего вида и параметров спектров ЭПР радикалов, образующихся при окислении 1-8 и Ш5Н, а

также отсутствие взаимодействия с парамагнитными ядрами "7,|198п указывает на отсутствие переноса электронной плотности от радикального центра через атом Э к атому вп. Величины изотропных g-фaктopoв ^ = 2.0041 - 2.0051) для радикалов 1-8'близки g-фaктopy органического радикала и свидетельствуют о делокализации неспаренного электрона в органическом фрагменте.

Электрохимическое поведение соединений 1-9 в сравнении с 3,5-ди-»г/7е/и-бутил-4-гидрокситиофенолом в процессах переноса электрона изучено методом циклической вольтамперометрии (ЦВА).

Соединения 1-9 и 118Н окисляются необратимо в две одноэлектронные стадии при потенциалах 1.02+1.30 и 1.4-5-1.70 В (Табл. 1). Типичный вид ЦВА на 14 электроде в СН3СК представлен на рисунке 3. На обратной ветви циклической вольтамперограммы (ЦВА) всех соединений наблюдается пик восстановления протона при потенциале -0.13В, идентифицированный добавкой в систему кислот (НСЮ4, СРдСООН).

Табл. 1. Потенциалы окисления соединений 1-10.

Соединени е 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Е„.а.1, В 1,16 1,17 1,13 1,17 1,20 1,02 1,19 1,30 1,30 1,20

Ец.а.2» В 1,45 1,48 1,43 1,46 1,70 1,53 1,36 1,63 1,61 1,65

Известно, что увеличение числа органических заместителей затрудняет

восстановление оловоорганических соединений. Монозамещенные органические производные олова(1У) легче всего восстанавливаются, следовательно, являются более сильными окислителями. Установлено, что соединения 1-8 способны проявлять восстановительные свойства за счет тиофенольных фрагментов.

Рис. 3. ЦВА соединения 6 (СН3СИ, 14, 0.1 М пВи4НСЮ4, С=5мМ, Л8/А6С1, у=0.2 Вс"1).

При проведении исчерпывающего электролиза соединения 6 при Ета= 1.02 В образуется продукт, который восстанавливается обратимо при потенциале Еп)[= -0.8 В, в ИК-спектре выделенного соединения отмечена полоса поглощения, соответствующая валентным колебаниям у(С=0) 1720 см"'. Аналогичная картина наблюдается в

7

результате исчерпывающего электролиза фенола 10. Продукт восстанавливается обратимо при потенциале Епк= -0.74 В, в ИК-спектре продукта также отмечена полоса поглощения, соответствующая валентным колебаниям карбонильной группы.

Спектроскопия поглощения продуктов электролиза 6 и 10 в видимой области подтверждает образование 2,6-ди-трем-бутилбензохинона, для которого характерна полоса поглощения при 425 нм.

Использование метода ЦВА подтверждает ступенчатое окисление оловоорганического соединения 6. Наличие первого пика, обусловлено окислением фенольного фрагмента до катион-радикала, который фрагментируется с отрывом протона с образованием радикала, окисляющегося далее до хиноидной формы (Схема 3).

Схема 3.

Исследование окислительно-восстановительных свойств новых тиолатов олова свидетельствуют о высокой редокс-активности данных соединений. Введение донорных заместителей в органическую часть комплексов олова облегчает их окисление. Поскольку все полученные соединения содержат структурный фрагмент тиофенола, то их редокс-характеристики близки.

Тагам образом, окисление соединений олова, а также 3,5-ди-жре/и-бутил-4-гидрокситиофенола происходит с отрывом протона от фенольного фрагмента с образованием стабильного феноксильного радикала, что позволяет предположить проявление антирадикальной активности данными соединениями. В случае соединений олова(1У) предположительно происходит деструкция оловоорганического соединения, что согласуется с литературными данными.

2.2. Антирадикальиая и антиоксидантная активность оловоорганических соединений с фрагментами 2,6-ди-»ф«я-бутилфенола

В работе исследована взаимосвязь структура - активность соединений в

следующих модельных реакциях: 1) перенос атома водорода от изучаемых соединений к стабильному радикалу 2,2-дифенилпикрилгидразилу 2) неферментативное пероксидное окисление цис-9-октадеценовой (олеиновой) кислоты 3) ферментативное окисление цис,цис-9,12-октадекадиеновой (линолевой) кислоты под действием липоксигеназы.

2.2.1. Антирадикальная активность тиолатов 8п(1У), содержащих фрагменты

2,6-дн-»;/;е/я-бутилфенола

Одним из способов оценки антирадикальной активности органических соединений является способность таких соединений к восстановлению стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) (схема 4). Мониторинг за ходом реакции осуществляется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности раствора ДФПГ (А пшх = 517 нм) в МеОН в присутствии исследуемых соединений.

Нами исследована антирадикальная активность^ соединений 1-9 в ДФПГ-тесте, и установлена их высокая антирадикальная активность (Табл. 2). Наиболее активным восстановителем ДФПГ в данном ряду является соединение 5, содержащее четыре фенольные группы и для которого значение эффективной концентрации ЕС50, восстанавливающей 50% ДФПГ составляет (8 ± 1) цМ. Реакция восстановления эквимолярных количеств ДФПГ и 5 (0.1 мМ) завершается в течение нескольких секунд. Табл. 2. Значения ЕС50 для соединений 1-7 и RSH в ДФПГ тесте (МеОН, 20 °С).

Соединенне 1 2 3 4 5 6 7 RS 11

ЕС50, мкМ 12 ± 2 16 ± 2 14 ±2 12 ± 2 8 ± 1 24 ±3 15 ±4 55 ± 1

Кинетические кривые восстановления ДФПГ в присутствии различных концентраций 5 представлены на рисунке 4.

ДФПГ

Схема 4.

2 Эксперименты по изучению антирадикальной активности выполнены совместно с кл.н. Грачевой Ю,А.

9

Рис. 4. Изменение оптической плотности растворов ДФПГ при 517 нм в присутствии различных концентраций комплекса 5: 1- 0,01 мМ; 2- 0,02 мМ; 3- 0,04 мМ; 4- 0,06 мМ; 5- 0,08 мМ; 6-0,1 мМ, контроль - 0,1 мМ ДФПГ (МеОН, 20 °С).

о

МО

Время, с

МО

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что с введением фрагмента 2,6-ди-отрет-бутилфенола и увеличением их числа растет антирадикальная активность.

Ингибирующая активность соединений 1-9 связана с возможностью отрыва атома водорода от фенолыюй группы и образованием соответствующих стабильных феноксильных радикалов, что подтверждено ранее методом ЭПР.

Таким образом, показано, что ООС, содержащие группу меркаптофенола, в отличие от соответствующих хлоридов олова - промоторов радикальных процессов, обладают антнрадикальной активностью.

2.2.2. Антиоксидаитная активность соединений 8п(1У) и 8п(И) в процессе пероксидного окисления олеиновой кислоты

Одним из важнейших условий нормального функционирования клетки является стационарность уровня окислительных процессов в лкпидах. В этой части работы исследовано влияние тиолатов 1-9 на процесс окислительной деструкции цис-9-октадеценовой (олеиновой) (Я"П) кислоты как структурного фрагмента липидов. Данная система моделирует один из цепных радикальных биопроцессов - пероксидное окисление липидов (ПОЛ) биомембран.

Окисление проведено в течение 5 ч, при постоянном барботировании воздуха в термостатируемой установке при 65°С и 37°С. Выбор температур обусловлен тем, что 65°С моделирует состояние окислительного стресса, а 37°С является физиологической температурой. Влияние соединений 1-9 на скорость окисления олеиновой кислоты изучено в сравнении с соответствующими хлоридами 11пБпС14-п и ЗпС12 как отдельно, так и совместно с 3,5-ди-т/>е/я-бутил-4-гидрокситиофенолом.

Добавка всех оловоорганических соединений, не содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, способствует промотированию окислительного

процесса при двух температурах, что согласуется с ранее полученными данными. Концентрация первичных продуктов окисления - изомерных гидропероксидов Я"ООН через 5 ч возрастает примерно в 2 раза относительно контроля (Табл. 3) при указанных температурах. Сравнивая прооксидантиое действие хлоридов Бп(1У) и БпСЬ в процессе окисления олеиновой кислоты при 65°С можно расположить их в следующий ряд по уменьшению прооксидантных свойств:

ЕЬ8пС12 > 8пСЬ> п-Ви28пС12> Р1ь8пС1:> Ме25пСЬ> РЬ38пС1 > Ме38пС1 Все соединения олова, содержащие тиофенольиый фрагмент, ингибируют окисление олеиновой кислоты при 65°С и 37°С. Соединение 9 также проявляет ипгибирующуто активность, что можно объяснить наличием в структуре двух фрагментов пространственно-затрудненного фенола. Добавка ИЗН к соединению 9, приводит к еще большему снижению уровня накопления К"ООН.

По степени ингибирования окисления олеиновой кислоты при 65°С оловоорганические тиолаты образуют следующий ряд активности:

К^п^И)^ > Е128П(8Я)2 = РЬ28П(8К)2 > Ме38пЗЕ1> РЬ38п8К > 8п(8К)2 > Ме28п(811)2 > п-Ви28п(8К)2

Значительное снижение уровня накопления гидропероксидов Я"ООН при 65°С (на 70 - 80 %), по сравнению с аналогичными показателями при 37°С (на 15 - 57%), объясняется, по видимому, тем, что при данной температуре скорость разложения К."ООН больше, чем скорость их образования.

Табл. 3. Влияние соединений олова на уровень накопления гидропероксидов олеиновой кислоты при 65°С через 5 ч в ходе окисления.*

[К"ООН],% от контроля

Ме28пС12 188 Ме28пС12 +И8Н 28 (1) Ме28п(ЭК)2 26

Е^пСЬ 217 Е128пС12 +11811 32 (2) ЕЬ5П(8К)2 15

п-Ви28пС12 207 п-Ви28пС12 +Я8Н 36 (3) п-Ви28п(8К)2 33

РЬ28пС12 195 Р1128пС12 +Я8Н 18 (4) Р^п^Я);, 15

Л28пС12 36 Я^пСЬ +Л8Н 14 (5) Ы28п(811)2 14

Ме38пС1 174 Ме38пС1 +К8Н 18 (6) Ме38п811 16

РЬ38пС1 178 РЬ38пС1 +КБН 20 (7) Ph3SnSR 17

8пС12 210 ЗпСЬ+ИЯН 20 (8) 8п(8Я)2 23

*Абсолютная концентрация [Я"ООН] в контрольном эксперименте (без добавок) 240 мМ. В присутствии И5Н концентрации Я"ООН составляет 14 %от контроля.

Наибольшую ингибирующую активность при данных температурах проявило соединение 5, содержащее в структуре четыре фенольных фрагмента, два из которых содержат серу. Более высокое антиокислительное действие данного соединения, вероятно, связано с его способностью реагировать с несколькими радикалами, образующимися на стадии зарождения или разветвления цепи.

Известно, что серосодержащие производные пространственно-затрудненных фенолов являются полифункциональными антиоксидантами, в которых возможно проявление внутреннего синергизма антиокислительной активности: фенольный фрагмент участвует в обрыве кинетической цепи в реакции с пероксильными радикалами, а сульфидный фрагмент молекулы разрушает гидропероксиды без образования радикалов.

В результате сравнения уровня накопления гидропероксидов в присутствии индивидуальных соединений 1-8 и смеси соответствующих хлоридов и ЯБН, установлена более выраженная эффективность антиоксндантного действия комплексов 1-8.

Таким образом, введение в структуру оловоорганического соединения фрагмента 2,6-ди-/ирет-бугилфенола приводит к инверсии прооксидантных свойств исходных оловоорганических соединений. Доказано, что увеличение числа фрагментов пространственно-затрудненного фенола в серосодержащей анионной части комплексов приводит к повышению их антиоксидантной активности. Полученные результаты могут быть использованы для создания фармацевтических препаратов, не оказывающих характерного для большинства подобных препаратов нежелательного побочного влияния на здоровые ткани.

2.2.3. Влияние оловоорганических соединений на ферментативное окисление линоленовой кислоты под действием липоксигеиазы

Важными молекулярными мишенями, принимающими участие в механизмах возникновения и/или развития заболеваний, являются ферменты липоксигеиазы (ЬОХ) - негемовые железосодержащие диоксигеназы, которые катализируют окисление полиненасыщенных жирных кислот. Ингибиторы липокеигеназ рассматриваются в качестве возможных противоопухолевых препаратов, поскольку продуктами окисления полиненасыщенных жирных кислот являются биологически активные вещества, играющие важную роль в воспалительных процессах, аллергии и раковых заболеваниях.

Нами исследовано влияние соединений олова на активность липоксигеиазы (ШХ

1-В). Для этого определяли начальную скорость накопления изомерных гидропероксидов: 9-гидроперокси-транс-10,цг/с-12 и 13-гидроперокси-г/г/с-9,т/>йг/с-11-октадекадиеновых кислот (НРОО)) - продуктов ферментативного окисления линолевой кислоты. Значение начальной скорости накопления НРСШ в присутствии исследуемых соединений (у0) рассчитывали по формуле;

где с - концентрация гидропероксидов, / - время реакции, А — оптическая плотность, е - молярный коэффициент поглощения, а - угол наклона кинетической кривой.

Типичный вид кинетических кривых окисления линолевой кислоты представлен на рисунке 5. Исследования проводили в сравнения с КБ! I и соответствующими хлоридами Р.п8пС14_п и 8пС12.

Все изученные нами хлорпроизводные оловоорганических соединений ингибируют активность ЬОХ 1-В (Рис. б). Степень ингибирования липоксигеназы определяли по формуле: А С/о) = 100-((Уо / Уо')'100%).

По степени ингибирования (А) % оловоорганические хлориды располагаются в следующий ряд активности:

п-ВшвпСЬ > К28пС12 > Р1ъ8пС1 > 8пС12> Р1ъ8пС12> Вь8пС12 >Ме38пС1> Ме28пС12, а тиолаты в следующий ряд:

8п(8Я>2 > п-Ви28п(8К)2 > РЬ28п(8К)2 > Ме,8п8К > РЬ^пБК > И28п(8К)2 > Ме28п(811)2

Степень ингибирования фермента оловоорганическими тиолатами значительно ниже и лежит в интервале 54% - 11%. Наиболее эффективными ингибиторами среди них являются 8п(8К)2 8 и К28пС12 9.

у0 = АсШ - АЛ/(Д/ ■ е) = tg а / е.

[НРОП].мк:М

3 1

Рис. 5. Кинетические кривые окисления линолевой кислоты под действием ЬОХ 1-В: 1 - контроль- ДМСО без добавок; 2 - Р1128пС12 (С = 50 мкМ, ДМСО).

Рис. 6. Влияние оловоорганических тиолатов на активность ЬОХ 1-В (С =50 мкМ в ДМСО, рН 9.0).

Можно предположить, что ингибирование липоксигеназы в присутствии хлоридов обусловлено действием активных свободных радикалов, возникающих при взаимодействии ООС с образующимися при окислении линолевой кислоты пероксильными радикалами. Высокая токсичность хлоридов 8п(1У) ограничивает возможность применения данных соединений в качестве потенциальных средств для регулирования симптомов, индуцируемых эндогенными метаболитами липоксигеназы. Тиолаты 8п(1У) и 8п(И), содержащие фрагменты пространственно-затрудненного фенола, проявили себя как менее выраженные ингибиторы ШХ 1-В по сравнению с хлоридами Эп, что может быть связано с важной ролью фрагмента тиофенола в структуре ООС.

Таким образом, применение пространственно-затрудненного тиофенола в качестве детоксшшрующей антиокислительной ловушки для оловоорганических соединений открывает возможность для поиска новых типов физиологически активных комплексов металлов.

2.3. Изучение биологической активности тиолатов 8п

2.3.1. Взаимодействие новых соединений олова с вН- группами тубулина

В качестве биохимической мишени для ряда противораковых лекарственных средств выступает митотическое веретено, имеющее решающее значение в клеточном делении. Тубуяив - глобулярный димерный белок, содержащий в своей структуре более 20 свободных ЭН-групп. При полимеризации тубулина образуются микротрубочки, участвующие в формировании митотического веретена.

В работе изучено взаимодействие тиолатов 8п, содержащих фрагменты пространственно-затрудненного фенола, с вН-группами тубулина при взаимодействии с реактивом Элдмана - 5,5"-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБ). Метод основан на связывании доступных тиольных групп с ДТНБ в реакции тиол-дисульфидного обмена в слабощелочной среде. В результате реакции образуется анион

5-тио-2-нитробензойной кислоты (ТНБ), хиноидная форма которого имеет максимум поглощения 412 нм (Схема 5).

Ш2

о,м—( ^—мо2

НОСУС соон

ДТНБ

соон Схема 5.

Исследование влияния соединений олова на связывание 8Н-групп тубулина с ДТНБ показало, что большинство тиолатов Бп конкурируют с ДТНБ за связывание с ЭН-группами тубулина (Рис. 7.).

Рис. 7. Влияние соединений йл( 1V) на связывание БН-групп. тубулина с ДТНБ. Концентрация свободных БН-групп тубулина без добавок (контроль) принята за 100%. (С = 50 мкМ).

Концепт ряия ЧН группы тубтлинл,

Мк'.!

Наибольшее снижение концентрации свободных вН-групп тубулина наблюдается в присутствии соединений 5, 7 и В^пСЬ 9, что может быть обусловлено структурной комплементарностью между данными соединениями и одним из активных сайтов тубулина. В случае 9 связывание с тубулином может быть связано с комплексообразованием между 8п и 5Н- группами тубулина.

С целью определения эффективной концентрации (ЕС50) соединений 5,7 и 9, при которой наблюдается снижение реактивности тиольных групп тубулина на 50%, проведены кинетические эксперименты при различных концентрациях данных соединений (5 - 50 цМ) в сравнении с классическим ингибитором полимеризации тубулина - колхицином (Рис. 8).

Кинетические кривые связывания свободных БН-групп тубулина с ДТНБ в

присутствии исследуемых соединений олова сходны с колхицином, что свидетельствует

о взаимодействии данных соединений с колхициновым сайтом тубулина.

Рис. 8. Кинетические кривые связывания тиольных групп тубулина с ДТНБ при 25°С в присутствии соединений Эп (С= 50 рМ). 1-контроль; 2- колхицин; 3- РЬзБпЗЯ (7), 4 - К^п^Я)-, (5); 5 - Я2ЗпС12 (9).

Значения ЕС5о для серии изученных соединений (Табл. 4) вычислены графически. Антимитотический агент подофиллотоксин - лиганд колхицинового сайта тубулина, также связывается с колхициновым сайтом тубулина и оказывает аналогичное действие на полимеризацию тубулина как и колхицин. Сравнение значений ЕС50 для подофиллотоксина и тиолатов вп демонстрирует высокую эффективность связывания соединений Я38п(8Я) (5) и РЬ38п(8Е) (7) с тубулином.

Табл. 4. ЕС5о связывания соединений олова (1-7,9) с БН-группами тубулина в сравнении с колхицином (К) и подофиллотоксином (П)

Соед. 1 2 3 4 6 5 7 9 к п

ес50, цМ >100 2,9 ± 0,4 5,5 ± 0,5 21,0 ± 0,3 6,5 ± 0,6 8,6

Таким образом, установлено, что исследуемые соединения олова можно рассматривать в качестве потенциальных антимитотических агентов, связывающихся с колхициновым сайтом тубулина.

2.3.2. Влияние соединений олова, содержащих фрагмент пространственно-затрудненого фенола, на скорость разложения перокеида водорода гемолизатом эритроцитов крови человека in vitro

Одной из причин токсичности и развития окислительного стресса, промотированного OOC, может быть снижение способности эритроцитов крови разлагать пероксид водорода - наиболее стабильную активированную форму кислорода, которая способна проникать через клеточные мембраны. Разложение Н202 с участием ионов металлов приводит к образованию активного гидроксильного радикала

16

•ОН, способного взаимодействовать с биомишенями. В живых организмах разложение Н202 осуществляется с участием пероксидаз. В частности, лорфирины и их комплексы с металлами являются биомиметиками гемовых оксидоредуктаз.

В связи с этим важным представляется исследование влияния комплексов олова 19, а также водорастворимого мезо-тетра(4-сульфофенил)порфирина (H4TPPS, 11), его комплекса с триметилоловом ((CH3)3Sn)4TPPS, 12) на скорость разложения Н202 отмытыми эритроцитами крови человека in vitro. Изучена активность соответствующих оловоорганических соединений R'nSnCl4.„ и их смесей с RSFI и свободными основаниями мезо-тегра(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)порфирина (R4PH2, 13) и мезо-тетрафенилиорфирина (ТРРН2,14).

so3h

^03SnMe3 он

By' i Bu'

11-14

Показано, что скорость фоновой реакции разложения пероксида водорода при рН 7.4 и температуре 25°С составляет 10% от скорости разложения Н202.

Табл. 5. Относительные скорости разложения Н202 в присутствии ООС.

Скорость разложения (%) от контроля

Me2SnCl2 54 Me2SnCl2+ RSH 102 (1) Me2Sn(SR)2 108

EtjSnCb 55 Et2SnCl2+ RSH 111 (2) Et2Sn(SR)2 121

n-Bu2SnCl2 42 n-Bu2SnCl2+ RSH 127 (3) n-Bu2Sn(SR)2 140

Ph2SnCl2 60 Ph2SnCl2 + RSH 127 (4) Ph2Sn(SR)2 143

Me3SnCl 50 Me3SnCl + RSH 103 (6) Me3SnSR 129

n-Bu3SnCl 30

Ph3SnCI 58 Ph3SnCl + RSH 102 (7) PhjSnSR 140

SnCl2 60 SnCl2+ RSH 102 (8) Sn(SR)2 102

(9) R2SnCl2 105 R2SnCl2+ RSH 100 (5) R2Sn(SR)2 122

(10) RSH 105

(ll)EUTPPS 98 H4TPPS+Me3SnCI 89 (12) (Me3Sn)4TPPS 130

(14) TPPH2 61 (13) R4PH2 84

Добавка к гемолизату эритроцитов хлоридов олова, не содержащих фрагмента пространственно-затрудненного фенола, а также порфиринов 13 и 14 приводит к снижению способности эритроцитов разлагать Н2О2 (Табл. 5).

В соответствии со степенью снижения скорости данного процесса, соединения олова можно расположить в следующий ряд активности:

п-Ви38пС1 > п-Ви28пС12 > Ме38пС1 > Еь8пС12 = Ме^пСЬ > РЬ38пС1 > Р1128пС12 = 8пСЬ

Влияние ООС на скорость данной реакции определяется природой органической группы, а также, в случае производных с Ме и Ви группами, числом этих групп. Увеличение числа алкильных заместителей приводит к снижению скорости процесса. Снижение скорости разложения Н202 гемолизатом эритроцитов в присутствии ¡^РНг и ТРРН2 составило 16% и 40%, соответственно.

Снижение скорости разложения Н202 в присутствии оловоорганических соединений 11'п8пС14.„ можно предположительно объяснить ингибированием антиоксидантных ферментов — каталазы и пероксидазы, а также взаимодействием данных соединений с гемоглобином - основным компонентом гемолизата эритроцитов.

Добавка хлоридов дибутил- и дифенилолова в смеси с ЯЗН приводит к возрастанию скорости разложения Н202 в среднем на 27% по сравнению с контролем. Еще большее повышение скорости разложения Н202 обнаружено при добавлении в гемолизат эритроцитов соединений олова 1-8 и (Ме38п)4ТРР8. Введение оловоорганического фрагмента в структуру сульфосодержащего порфирина приводит к увеличению скорости разложения Н202.

По уменьшению скорости данной реакции тиолаты йп можно расположить в следующий ряд активности:

РЬ28п(8Л)2 > РЬ,8п8К=- п-Ви28п(8Я)2 >(Ме3)38п)4ТРР8 > Ме38п8Я > (К)28п(8Р.)г > Е^п^ЯЬ > Ме^п^Я^ > (К)28пС12 = ЯЗН > впфЯЬ

Наибольшая эффективность установлена для соединения 4, скорость разложения Н202 в присутствии которого возрастает на 42%. Указанное влияние оловоорганических соединений, вероятно, свидетельствует о пероксидазной активности данных соединений, учитывая легкость их окисления.

Сравнивая оловоорганические соединения с тиофенольным и порфириновым фрагментами можно сделать вывод о том, что в большей степени повышение скорости разложения Н202 происходит в присутствии соединений, содержащих тиофенольный

фрагмент (n-Bu2Sn(SR)2 (3), Ph2Sn(SR)2 (4), Ph3SnSR (7).

Известно, что одной из причин развития окислительного стресса, промотированного оловоорганическими соединениями, может быть снижение скорости разложения Н202 гемолизатом крови человека. Введение фрагмента 2,6-ди-трет-бутилфенола в лигандное окружение комплексов приводит не только к нивелированию их негативного влияния на способность эритроцитов разлагать Н202, но и сопровождается увеличением скорости ферментативного разложения Н202

2.3.3. Цнто- н нейротокеичность соединений олова с феиольными фрагментами

Известно, что ООС, обладают высокой липофильностью и проявляют высокую цитостатическую активность. В данной части работы исследована цитотоксическая активность оловоорганических соединений с феиольными фрагментами на клеточных линиях рака молочной железы человека (MCF-7) и шейки матки человека (HeLa)3.

Концентрация соединений, при которой наблюдается 50% гибель раковых клеток (1С50) для соединений 1-7 представлена в Таблице 6. Наибольшую активность против обеих клеточных линий проявляет производное триалкил олова 7, обладающее высокой липофильностью.

Табл. 6. Цитотоксическая активность соединений 1-7 и R2SnCl2 на раковых клеточных линиях MCF-7 и HeLa.

Соединение 1С50 (ЦМ)

MCF-7 HeLa

1 19,20± 1,70 23,90±1,30

2 6,20±0.80 4,90±0,70

3 0,40±0,06 0,40±0,07

4 6,20±0,80 5,90±0,70

5 >30 >30

6 4,90±0.50 2,90±0,30

7 0,25±0,03 0,16±0,01

9 3,12±0,38 -

цисплатин 18.5 10,5

Обнаружено, что соединения 2,3,4,6 и 7 проявляют более высокую активность, чем цисплатин, в отличие от гидрофильных соединений 1 и 5.

Таким образом, установлено, что все исследованные комплексы олова проявляют высокую цитотоксическую активность против раковых клеточных линий МСР-7 и НеЬа, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных цитостатиков.

3 Исследования проведены проф. Б.К. Нафкакои (Университет г. Иоаннины, Греция).

19

Нами исследована нейротоксичность соединений олова с фрагментами тиофенола на культуре гранулярных нейронов мозжечка крыс с помощью стандартного МТТ -теста4.

Установлено, что исследуемые соединения снижают выживаемость гранулярных нейронов мозжечка (Рис. 9.). Уменьшение цитотоксичности наблюдается в ряду:

Р^пвЯ >п-Ви25п('8Я)2> Р1128п(8К)2> Я8Н > Ме28п(8Я)2> Бг28п(8К)2> Ме38п811 >

Рис. 9. Влияние соединений олова и ЯЗН на выживаемость культуры клеток гранулярных нейронов мозжечка крыс. (С 3 мкМ; контроль - ДМ СО, экспозиция соединений в культуре 24 ч).

(Я)28п(8К)2

Действие исследуемых соединений олова на выживаемость культуры клеток гранулярных нейронов зависит как от количества тиофенольных фрагментов в структуре соединения, так и от алкильного или арильного заместителя при атоме олова.

Согласно данным настоящего исследования, введение тиофенольного фрагмента в структуру оловоорганического соединения оказывает нейропротекторное действие, в присутствии соединения Ме38п8Я выживаемость снижается на 43%. В ряду фенильных производных олова увеличение числа фенольных фрагментов приводит к снижению цитотоксичности, в ряду метальных производных - к увеличению.

Наименьшую цитотоксическую активность для данной культуры клеток проявило соединение (Я)28п(811)2, содержащее 4 фенольные группы. Следует отметить, что нейротоксичность оловоорганичееких тиолатов и ЯБН сопоставима.

Нейротоксичность может быть связана с подавлением дегидрогеназной активности митохондрий, а наличие тиофенольного фрагмента оказывает протекторное действие.

Таким образом, введение в структуру соединения пространственно-затрудненных фенольных фрагментов приводит к снижению нейротоксичности, что может найти применение в клинической практике.

Исследования проведены к.х.н. Шевцовой Е.Ф. (Институт физиологически активных веществ РАН, г. Черноголовка).

20

выводы

1. Синтезированы новые органические производные олова с фрагментами 3,5-ди-/и/>е/и-бутил-4-гидрокситиофенола.

2. С помощью ЭПР и электрохимического метода (ЦВА) исследованы редокс-свойства соединений олова (IV) и (II), содержащих фрагмент 3,5-ди-т/х?/и-бутил-4-гидрокситиофенола, окисление которых приводит к образованию феноксильных радикалов с дальнейшим гомолизом связи C-Sn.

3. Обнаружена высокая антирадикальная активность данных соединений с помощью ДФПГ-теста. Показано, что соединения олова с 2,6-ди-трет-бутилфенольными заместителями ингибируют пероксидное окисление ненасыщенных жирных кислот. При этом увеличение числа фенольных фрагментов в молекуле приводит к возрастанию ингибирующей активности.

4. Показано, что оловоорганические соединения R'nSnCU.n (R* = Me, Et, n-Bu, Ph) вызывают резкое снижение скорости ферментативной реакции разложения Н202 эритроцитами крови in vitro, в то время как введение фрагмента 2,6-ди-трет-бутилфенола (R) в молекулы R'nSn(SR)4_„ приводит к нивелированию их негативного влияния на эритроциты и увеличивает скорость разложения Н202.

5. Установлено, что соединения олова ингибируют фермент липоксигеназа и связываются с SH-группами тубулина как одной из биохимических мишеней для потенциальных цитостатнческих агентов. Показана выраженная цитотоксичность 3,5-ди-трега-бутил-4-гидрокситиофенолята трифенилолова на линиях раковых клеток человека (МСА-7 и HeLa).

6. С использованием культуры гранулярных нейронов мозжечка крыс показано, что введение 3,5-дп-л?реот-бутил-4-гидрокситиофенольного фрагмента в молекулы оловоорганических соединений оказывает нейропротекторное действие, а увеличение числа фенольных групп в их молекулах снижает токсичность.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

Статьи по перечню ВАК и патенты:

1. Е.М. Мухатова, В.П. Осипова, М.Н. Коляда, Н.О. Мовчан, Д.Б. Шпаковский, Ю.А. Грачева, С.И. Орлова, Е.Р. Мнлаева. Синтез и антирадикальная активность новых оловоорганических соединений, содержащих 2,6-ди-отрс»1-бутил фенол // Доклады АН., 2013, Т. 451, Вып. 1, с. 46-49.

2. Е.М. Мухатова, Н.Т. Лимонова, М.Н. Коляда, В.П. Осипова, Н.Т. Берберова, Ю.Т. Пименов, Е.Р. Милаева. Протекторное влияние свободных оснований порфиринов на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови человека в присутствии соединений ртути и олова // Макрогетероциклы, 2011, Вып. 4(3), с. 216221.

3. М.Н. Коляда, В.П. Осипова, Н.Т. Лимонова, Н.Т. Берберова, Е.М. Лагутина (Мухатова). Влияние соединений ртути и олова на ферменты антиоксидантной защиты гемолизата эритроцитов крови // Вестник АГТУ, 2006, Вып. 6(35), с. 62-68.

4. М.Н. Коляда, В.П. Осипова, Н.Т. Пипия, Е.М. Лагутина (Мухатова), Н.Т. Берберова, Ю.Т. Пименов, Е.Р. Милаева. Влияние соединений ртути и олова на активность каталазы гемолизата эритроцитов крови человека in vitro // Вестник АГТУ, 2005, Вып. 6(29), с. 60-65.

5. М.Н. Коляда, Е.М. Лагутина (Мухатова), H.H. Федорова, Н.С. Алтуфьева, Ю.Т. Пименов, Н.Т. Берберова. Биохимические механизмы влияния соединений олова и тетрафенилпорфирина на пищеварительные железы крыс // Вестник АГТУ, 2005, Вып. 3(26), с. 233-240.

6. Е.Г. Шварев, Н.Т. Берберова, Г.С. Добренькая, Е.М. Лагутина (Мухатова), М.Н. Коляда, Л.В. Дикарева, O.E. Зайцева. Способ диагностики стадий течения воспалительных заболеваний придатков матки // Патент РФ RU № 2291438, 10.01.2007. Бюлл. №1.

Тезисы докладов:

7. M.N. Kolyada, V.P. Osipova, Е.М. Lagutina (Mukhatova), N.T. Limonova, N.T. Berberova, Yu.T. Pimenov, E.R. Milaeva. The influence of meso-tetra(4-sulfonato-phenyl)porphine on the activity of blood "erythrocyte"s catalase in the presence of Hg and Sn compounds // Vth Conference on cluster's chemistry and Polynuclear Compounds ("CLUSTERS-2006"), Astrakhan, Russia, 2006, p. 44-45.

8. В.М. Игнатьева, Н.Т. Лимонова, Е.М. Лагутина (Мухатова), М.Н. Коляда, В.П. Оеипова, Н.Т. Берберова, Ю.Т. Пименов. Исследование влияния соединений ртути и олова на пероксидное окисление липидов в мембранах эритроцитов крови человека "in vitro" методом спектрофотометрии // I Международная конференция «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине», Туапсе, Россия, 2007, с. 65.

9. М.Н. Коляда, Е.М. Мухатова, Н.Т. Берберова. Влияние мезо-тетракис(3,5-ди-т/7сто-бутил-4-гидроксифен1ш)-порфирина на активность каталазы гемолизата эритроцитов крови в присутствии оловоорганических соединений //' Всероссийская молодежная конференция-школа, посвященная 150-летию со дня рождения А. Е. Фаворского, Санкт-Петербург, Россия, 2010, с. 198.

10. Yu.T. Pimenov, S.A. Smolyaninova, Е.М. Mukhatova, M.N. Kolyada, N.T. Limonova, V.P. Osipova, N.T. Berberova. The impact of organometallic compounds of mercury and tin at hemin // International conference «Topical problems of organometallic and coordination chemistry» (V Razuvaev lectures), N. Novgorod, Russia, 2010, P76.

11. Ю.Т. Пименов, Е.М. Мухатова, М.Н. Коляда, Н.Т. Лимонова, В.П. Оеипова, Н.Т. Берберова, Е.Р. Милаева. Влияние порфиринов на каталашую активность гемолизата эритроцитов крови человека в присутствии соединений ртути и олова // XI Международная конференция по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (ICPC-II), Одесса, Украина, 2011, с. 59.

12. Е.М. Mukhatova, V.P. Osipova, M.N. Kolyada, D.B. Shpakovsky, N.T. Berberova, E.R. Milaeva. New complexes of tin with redox fragment based on 2,6-di-fcr/-butylphnol in sulfur-containing ligand // Frontiers of Organometallic Chemistry (FOC-2012), Saint Petersburg, Russia, 2012, c. 98.

13. E.M Мухатова, М.Н. Коляда, В.П. Оеипова, Н.Т. Берберова, Е.Р. Милаева. Влияние оловоорганических соединений на активность липоксигеназы // Химия биологически активных веществ: Всероссийская школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, Саратов, Россия, 2012, с.106.

14. EJVL Мухатова, В.П. Оеипова, М.Н. Коляда, И.О. Мовчан, Н.Т. Берберова, Ю.А. Грачева, Д.Б. Шпаковский, Е.Р. Милаева. Синтез и антиоксидантная активность новых оловоорганических соединений с 2,6-ди-трети-бутилфенольными группами // Международная междисциплинарная научная конференция «Биологически активные

вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет, АР Крым, Украина, 2013, Т. 2, с. 215.

15. Грачева Ю.А., Мухатова Е.М., Шпаковский Д.Б., Милаева Е.Р. Антимитотическая активность новых оловоорганических соединений с фенольными фрагментами // Международная междисциплинарная научная конференция «Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет, АР Крым, Украина, 2013, Т. 2, с. 135.

16. Е.М. Mukhatova, V.P. Osipova, M.N. Kolyada, D.B. Shpakovsky, N.T. Berberova, E.R. Milaeva. Protective effect of 3,5-di-fcrt-butyl-4-hydroxythiophenolate ligand in organotin complexes on H202 decomposition by erythrocytes // International Symposium «Modern Trends in organometallic chemistry and catalysis, Moscow, Russia, 2013, c. 140.

17. E.M. Мухатова, В.П. Осипова, M.H. Коляда, Н.Т. Берберова Н.Т., Д.Б. Шпаковский, Е.Р. Милаева. Редокс-свойства новых оловоорганических соединений, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола // V конференция "Электрохимические и электролитно-плазменные методы модификации металлических поверхностей", Иваново, Россия, 2013, с. 141.

18. N.T. Berberova, Е.М. Mukhatova, V.P. Osipova, M.N. Kolyada, Y.A. Gracheva, D.B. Shpakovsky, E.R. Milaeva. Redox properties and antiradical activity of novel organotin compounds with hindered phenol pendants // International conference "Organometallic and Coordination Chemistry: Fundamental and Applied Aspects" & International Youth School-Conference on Organometallic and Coordination Chemistry, N. Novgorod, Russia, 2013. P.12.

19. Грачева Ю.А., Мухатова E.M., Шпаковский Д.Б., Шевцова Е.Ф., Милаева Е.Р. Цитотоксическая активность новых оловоорганических соединений с S-лигандами // Первая Российская конференция по медицинской химии, Москва, Россия, 2013, с. 46.

Автор выражает признательность и благодарность за ценные советы и рекомендации доктору химических наук, профессору Милаёвой Елене Рудольфовне, кандидату химических наук Оптовой Виктории Павловне, кандидату биологических наук Коляда Маргарите Николаевне.

Заказ № 0167/13 Подписано в печать 14.11.2013 г. Тир. 110 экз. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,4 Типография ООО « Альфа Принт » Ю.а.: 414004, г. Астрахань, ул. Б. Алексеева 30/14 e-mail; Alfager@rambler.ru тел: 89033485666

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Астраханский государственный технический университет»

МУХАТОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛОВА С ФЕНОЛЬНЫМИ ФРАГМЕНТАМИ

02.00.03 - Органическая химия

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители:

Берберова Н.Т.

доктор химических наук, профессор

Шпаковский Д.Б.

кандидат химических наук

Астрахань - 2013

На правах рукописи

04201450930

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5

1.1. Оловоорганические соединения в окружающей среде и их 5 токсичность

1.2. Физиологическая активность оловоорганических 10 соединений

1.3. Синтез и свойства серосодержащих комплексов металлов 31

Глава 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 38

2.1. Синтез и редокс-активность соединений 8п(1У) и 38 8п(П), содержащих фрагмент 2,6-}щ-трет-бутилфенола

2.1.1. Синтез соединений олова(1У) и (II), содержащих 38 фрагмент 2,6-ди-трет-бутилфенола

2.1.2. Редокс-свойства соединений олова(1У) и (II), содержащих 45 фрагмент 2,6-ди-трет-бутилфенола

2.2. Антирадикальная и антиоксидантная активность 50 оловоорганических соединений с фрагментами 2,6-ди-/и/7е/и-бутилфенола

2.2.1. Антирадикальная активность тиолатов 8п(1У), 50 содержащих фрагменты 2,6-ди-тр^/и-бутилфенола

2.2.2. Антиоксидантная активность соединений Бп(1У) и 8п(П) 54 в процессе пероксидного окисления олеиновой кислоты

2.2.3. Влияние оловоорганических соединений на 59 ферментативное окисление линолевой кислоты под действием липоксигеназы

2.3. Изучение биологической активности тиолатов вп 63

2.3.1. Взаимодействие новых соединений олова с SH- группами 63 тубулина

2.3.2. Влияние соединений олова, содержащих фрагмент 69 пространственно-затрудненого фенола на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови человека in vitro

2.3.3. Цито- и нейротоксичность соединений олова с 78 фенольными фрагментами

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 85

ВЫВОДЫ 100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102

ВВЕДЕНИЕ

Оловоорганические соединения (ООС) занимают особое место в ряду металлоорганических соединений, так как обладают целым комплексом полезных свойств, что способствует их широкому применению. Хорошо известно использование ООС в качестве реагентов, предотвращающих обрастание днищ судов, фунгицидов, бактерицидов [15], катализаторов различных производств, стабилизаторов полимеров [6-8]. Ряд оловоорганических соединений проявили себя как перспективные противоопухолевые [9], противовоспалительные [10,11] и противогрибковые агенты [12,13]. Недавние исследования доказали высокую цитоксическую активность производных ООС с различными N, О, S- донорными лигандами. Токсичность RnSnX4_n обусловлена не только способностью взаимодействовать с SH-группами цистеиновых и гистидиновых аминокислотных остатков белков, но и их прооксидантной активностью, что приводит к развитию окислительного стресса и возникновению многочисленных патологий. Подавление окислительной активности ООС важно также с точки зрения поиска лекарственных препаратов цитотоксического действия, не оказывающих нежелательного побочного действия.

Известными ингибиторами свободнорадикальных окислительных процессов являются пространственно-затрудненные фенолы, имитирующие активность витамина Е. Поэтому, синтез органических производных олова, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, исследование их редокс-свойств в биохимически значимых реакциях является актуальной задачей и представляет не только научный интерес, но и практическую значимость.

Цель работы заключается в синтезе новых оловоорганических соединений с фрагментами пространственно-затрудненного фенола, изучении их влияния на биохимические процессы in vitro.

Исследованы редокс-превращения оловоорганических соединений в растворах совокупностью физико-химических методов: циклическая вольтамперометрия (ЦВА), электронный парамагнитный резонанс (ЭПР).

Установлена антиоксидантная активность новых серосодержащих соединений Sn(IV) и Sn(II) с фрагментами 2,6-ди-гарет-бутилфенола в процессах неферментативного и ферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот на примере цис-9-октадеценовой (олеиновой) и цис-9,цис-12-октадекадиеновой (линолевой) кислот.

Впервые показано, что оловоорганические соединения, содержащие фрагменты 2,6-ди-трет-бутилфенола, в отличие от хлоридов, увеличивают скорость разложения Н2О2 под действием каталазы крови in vitro. Предложены новые детоксицирующие агенты — водорастворимый мезо-тетра(4-сульфофенил)порфирин и 3,5-ди-т^е/и-бутил-4-гидрокситиофенол для снижения токсического действия оловоорганических соединений. В работе предложен способ диагностики течения воспалительных заболеваний придатков матки с помощью определения активности каталазы (Патент РФ RU № 2291438, от 10.01.2007). Найдены новые детоксицирующие агенты (H4TPPS) для токсических оловоорганических соединений.

Обнаружено высокое сродство оловоорганических соединений к белку тубулину, рассматриваемому в качестве одной из мишеней противоопухолевых препаратов. Показано, что оловоорганические соединения с фрагментами 2,6-ди-трет-бутилфенола проявляют высокую антипролиферативную активность против линий раковых клеток MCF-7 и HeLa. Изучение влияния оловоорганических тиолатов на биохимические мишени противораковых агентов - фермент липоксигеназу и белок тубулин, представляет значительный интерес для поиска новых противораковых агентов, обладающих менее выраженными побочными эффектами.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Настоящий обзор литературы посвящен синтезу, биологической активности и механизмам действия оловоорганических соединений с физиологически активными лигандами.

1.1. Оловоорганические соединения в окружающей среде и их

токсичность

Оловоорганические соединения образуются в природе естественным путем в результате процессов выщелачивания оловоорганических минералов, касситерита и станина [14].

Наличие в молекуле ООС липофильных органических групп способствует легкому проникновению через клеточную мембрану, что приводит к быстрому преодолению гематоэнцефалического барьера этими соединениями, а также накоплению в липидах. Мигрируя по трофической цепи, эти токсиканты могут представлять реальную угрозу для здоровья человека [15].

Известно, что олово является биогенным элементом. Без него невозможно правильное развитие скелета, так как олово необходимо для процессов кальцификации. Олово входит в состав желудочного фермента гастрина, оказывает влияние на активность флавиновых ферментов. Известно, что неорганические производные нетоксичны вследствие их плохого всасывания и быстрого транспорта в тканях. Биологическая активность ООС резко отличается от действия свободного олова и его неорганических соединений. Кроме антропогенного попадания ЯзЗпХ в окружающую среду, они могут обратимо образовываться в результате биометилирования нетоксичных неорганических предшественников. Органические соединения олова (Кп8пХ4.п) обладают разнообразным токсическим действием, которое определяется числом и природой органических групп. Максимальной токсичностью обладают трехзамещенные производные олова, которые активно поражают

центральную нервную систему [16]. Диалкильные соединения олова менее токсичны, но действуют на печень и желчевыводящие пути. Моно- и тетразамещенные органические производные олова практически нетоксичны. Алкильные производные более токсичны, чем арильные, причем чем короче алкильная цепь, тем выше токсичность. Природа аниона в RnSnX4_n практически не влияет на биологическую активность, но изменяет координационные свойства атома олова и гидрофильно-липофильный баланс оловоорганического соединения [17].

Анализ литературных данных о механизме токсичности ООС свидетельствует о наличии у оловоорганических соединений как первичной токсичности, вызывающей инактивацию белков, так и вторичной, которая выражается в промотировании окислительного стресса в организме за счет образования реакционноспособных частиц. Биотрансформация оловоорганических соединений вызывает образование активных радикалов, обуславливает каскад радикальных процессов в мембранах и клетках живых организмов, приводя к окислительному стрессу организма в целом [18-20].

ООС участвуют в биологических редокс-процессах, они проявляют прооксидантную активность. Известными ингибиторами свободнорадикальных окислительных процессов являются пространственно-затрудненные фенолы, миметики витамина Е. Ранее было показано, что для предотвращения окислительного стресса при токсическом действии ООС можно использовать ацетат а-токоферола, аскорбиновую кислоту, производные фосфора, пирролидина, порфиринов, содержащие фрагменты 2,6-ди-трет-бутилфенола [21-23]. Важным фактором повышения стабильности свободнорадикальной формы антиоксидантов, ответственной за механизм антирадикальной активности, является устойчивость радикальных частиц. Установлено, что комплексы металлов с фенольными группами способны проявлять как

прооксидантную активность, так и подавлять развитие радикальных процессов. Возможность проявления данными соединениями регулируемой анти/прооксидантной активности важна с точки зрения создания противораковых препаратов цитотоксического действия, не оказывающих нежелательного побочного действия. Для создания подобных политопных соединений олова можно использовать комбинацию металла с редокс-активным фрагментом пространственно-затрудненного фенола.

Согласно общепринятой концепции механизма токсичности определяющую роль в реакционной способности ООС играет атом металла, образующий координационную связь с >1, О, Б, а органические группы рассматриваются только как липофильные части молекул Кп8пХ4.п, обеспечивающие транспорт вещества через биологические мембраны.

Токсичность бутильных производных снижается, если олово координируется с донорным заместителем [24]. Например, ВизБпХ, содержащий в качестве группы X диэтиламиноэтанол, проявляет низкую токсичность по отношению к моллюскам, что связано, возможно, с координационной насыщенностью атома 8п(1У). Токсичность диалкильных соединений олова немного ниже, под действием этих соединений поражается печень и желчевыводящие пути. Из последних литературных данных было установлено не только снижение токсичности РИгЗпСЬ или РЬз8пС1, но и повышение антиоксидантной активности кверцетина и кемпферола [25,26] при их совместном действии.

Комплексы аналогов природных порфиринов с оловом (8п4+-протопорфирин и 8п4+-мезопорфирин) являются индукторами цитохрома Р-450 и зависимых от него монооксигеназ [27-29]. Данный эффект обусловлен способностью конкурентно ингибировать активность гемоксигеназы - фермента, ответственного за деградацию гема и, следовательно, за образование токсичного для нервной и иммунной систем

организма билирубина в организме. Поскольку другие соединения олова, как органические, так и неорганические, такими свойствами не обладают, 8п4+-протопорфирин IX и 8п4+-мезопорфирин используются для снижения уровня билирубина при гемолитических анемиях у новорожденных [30,31].

Существенная активация процесса образования свободных радикалов при токсическом воздействии оловоорганических соединений приводит к усилению пероксидного окисления липидов (ПОЛ), являющегося биохимическим маркером окислительного стресса.

Ускорение окисления олеиновой кислоты в присутствии ООС может быть связано с тем, что они могут взаимодействовать как с пероксильными радикалами, так и с гидропероксидами, образуя неустойчивые оловоорганические пероксиды, фрагментирующиеся с образованием активных радикалов - промоторов радикальных цепных процессов [32]. При начальной концентрации пероксильных радикалов сопоставимой, либо превышающей концентрации 11ПМХ4_П, в реакционной среде генерируются активные радикалы Я*, различающиеся по стабильности и реакционной способности.

К + К^пХ^ОСЖ') <К'00'— ^пХ4.п К'00Н > К^пХз.^ОСЖ) + НХ

X = На1, п= 1 - 3

Молекулярные механизмы биологического действия ООС связаны с образованим в результате гомолитического разрыва связи С-М свободных органических радикалов. С помощью различных электрохимических методов возможно оценить эффективность антиоксидантов, сравнивая легкость образования и стабильность образующихся радикальных частиц, в том числе катион-радикалов.

В модельном процессе окисления цис-9-октадеценовой кислоты (олеиновой) кислоты как структурного фрагмента липидов было

установлено промотирующее действие ряда Кп8пХ4.п (Я = СН3, С2Н5, С3Н7, Н-С4Н9, СбН5; Х=С1, Вг, I; п = 0-3) [33,34]. В результате реакции образуется реакционноспособный гидроксильный радикал *ОН, который может взаимодействовать с биомишенями. Токсичность неорганических производных олова (II) незначительна по сравнению с токсичностью органических производных, что, вероятно, связано не только с незначительным поглощением дихлорида олова и быстрым оборотом в тканях, а является следствием повреждающего действия образующихся из ООС активных радикальных частиц.

ООС участвуют в окислении 1,4-дигидроникотинамидного фрагмента, входящего в состав коферментов НАД(Н) и НАДФ(Н). Обнаружено, что соединения олова могут действовать как окислители или медиаторы - переносчики электронов. В целом, соединения Кп8пХ4_п являются конкурентными окислителями 1,4-дигидроникотинамида в сравнении с природными и модельными акцепторами электронов -порфиринами Бе34" [21].

Одной из причин снижения антиоксидантной защиты организма является повреждение ферментов свободными радикалами. Имеются литературные данные о снижении активности фермента супероксиддисмутаза (СОД) при действии Ви28пС12 [35], производные триметил- и триэтилолова ингибируют глутатион Б-трансферазу, гексокиназу и N3, Са - зависимую АТФазу, а также ферменты анаэробного дыхания - лактатдегидрогеназу и каталазу [36].

При взаимодействии оловоорганических производных с БН группами ацил- и ацетилтрансфераз нарушается процесс дезацилирования и повторного ацилирования фосфолипидов мембран [37,38].

Известно, что оловоорганические соединения способны накапливаться в эритроцитах [39] и вызывать их гемолиз [40,41].

Присутствие фермента каталазы полностью предотвращает гибель нервных клеток, вызываемую добавками ВизБпО [42], что также подтверждает гипотезу о развитии окислительного стресса в присутствии ООС.

Разработка новых взглядов молекулярных механизмов токсичности органических производных 8п является основой для поиска эффективных детоксицирующих агентов, обеспечивающих снижение

токсикологического стресса.

1.2. Физиологическая активность оловоорганических соединений

Металлсодержащие соединения (Р^ Ag, Аи) исследуются в качестве потенциальных терапевтических средств, в частности, для лечения онкологических заболеваний [43,44]. Первое упоминание о биологических свойства оловоорганических соединений было сделано в 1929 году. Известно, что ООС с биологически-активными группами в составе анионов, например, трифениолова с дитио- и монокарбоматом, фталиевой кислотой, имидазолом, 2-меркаптоэтанолом, 2-аминоэтантиолом, ацетилсалициловой кислотой демонстрировали биологическую активность [45].

С момента появления цисплатина г/ис-Р^Нз^СЬ в 1969 году и его аналогов (карбоплатин, оксалиплатин) в противораковой терапии, металлоорганические соединения привлекли внимание исследователей как кандидаты для создания лекарственных препаратов, применяющихся, в частности, в онкологии [46,47]. Эффективность цисплатина ограничена существенно, так как данное соединение обладает высокой токсичностью и нежелательными побочными эффектами. Особенностью этого препарата является устойчивость в клетках после введения. В последнее время уделено поиску новых препаратов на основе соединений других металлов.

В 1980 г. М. Гилен опубликовал серию статей, посвященных синтезу оловоорганических соединений на основе салицилальдоксима, координированного с дибутилоловом, которые обладали противоопухолевой активностью [48,49]. До настоящего времени многие исследователи работают в данной области [50]. Установлена противораковая активность комплексов олова с гетероциклическими тиоамидами [51], механизм которой пока недостаточно изучен [52], что способствует интенсификации изучения физиологических свойств органических производных олова [53,54]. Интерес к серосодержащим соединениям олова возрос в связи с возможностью моделирования многих биологических систем и процессов, протекающих с участием серы. Интересно, что комплексы олова проявляют цитотоксическую активность при более низкой концентрацией, по сравнению с цисплатином