Механизм ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата по результатам молекулярного моделирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.17 ВАК РФ

На правах рукописи

ШАДРИНА Мария Сергеевна

МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ГИДРОЛИЗА ГУАНОЗИНТРИФОСФАТА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

02 00 17 — математическая и квантовая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2008

003449121

Работа выполнена в лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель доктор физико-математических наук

Григоренко Белла Людвиговна

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук

Ефремов Роман Гербертович

доктор физико-математических наук Венер Михаил Владимирович

Ведущая организация Институт биохимической физики

им. Н М Эмануэля РАН

Защита состоится «23» октября 2008 года в 16 45 в 337 аудитории Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501 001 50 при МГУ имени M В Ломоносова (119991, Москва, ГСП-2 Ленинские горы, д 1, стр 3, МГУ имени M В Ломоносова, Химический факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ Автореферат разослан «22» сентября 2008 года Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501 001 50, кандидат химических наук

Матушкина H H

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Исследование механизмов реакций ферментативного катализа, включая стадии элементарных химических превращений в активных центрах белков, необходимо для получения знаний о функционировании клеток живых организмов, для решения практических задач фармацевтики и биотехнологии Результаты экспериментальных методов, применяемых для изучения ферментативных реакций, включая традиционные кинетические исследования, часто в сочетании с приемами генной инженерии, а также исследования методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) комплексов ферментов с аналогами субстратов или ингибиторами, предоставляют важнейшую информацию о механизмах сложных превращений в белках

Результаты компьютерных расчетов на основе современных методов молекулярного моделирования, а именно, молекулярной механики (ММ), молекулярной динамики (МД), квантовой химии и комбинированных подходов квантовой механики - молекулярной механики (КМ/ММ), позволяют существенно дополнить экспериментальные исследования, добавить новую информацию и обеспечить визуализацию процессов ферментативного катализа с атомным разрешением

Диссертация посвящена изучению методами молекулярного моделирования одной из важнейших биохимических реакций - ферментативного гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в различных гуанозиннуклеотид связывающих белках (G-белках) Несмотря на большой объем накопленной экспериментальной информации по кинетическим и структурным данным для реакции

GTP + Н20 GDP + Pi где GTP и GDP обозначают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат, Pi -неорганический фосфат, и на неоднократные попытки ее теоретического осмысления, заключение о механизме этой реакции в различных средах остается предметом дискуссий в научной литературе

Цель работы

Цель работы заключалась в систематическом изучении элементарных стадий реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в различных G-белках с использованием методов КМ/ММ, молекулярной механики и молекулярной динамики и установлении общего механизма химических превращений в активных центрах ферментов

' /

В работе решались следующие задачи

1 Выделить типы активных центров G-белков и аминокислотные остатки, участвующие в связывании и гидролизе ГТФ, на основании экспериментальных структурных данных и результатов молекулярного моделирования

2 Провести детальные расчеты полных профилей энергии вдоль реакционного пути реакции гидролиза GTP + Н20 —» GDP + Pi от фермент-субстратных комплексов до продуктов для выделенных репрезентативных ферментативных систем

3 Построить структуры фермент-субстратных комплексов для различных представителей G-белков и сформулировать прогнозы о механизме гидролиза ГТФ в этих системах

Научная новизна результатов

1 Молекулярное моделирование позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза ГТФ в различных G-белках С помощью метода КМ/ММ были локализованы стационарные точки на поверхностях потенциальной энергии, определены энергетические характеристики отдельных стадий реакций, что в конечном итоге позволило предложить единый механизм химической реакции ферментативного гидролиза ГТФ

"2 Получены структуры фермент-субстратных комплексов для ряда G-белков,^ отражающие основные типы активных центров, и проведен их сравнительный анализ Выделены основные аминокислотные остатки, участвующие в связывании и гидролизе ГТФ для разных типов активных центров

3 Для сигнального белка p21Ras построен энергетический профиль реакции гидролиза GTP + Н20 -> GDP + Pi

4 Для фактора роста EF-Tu построен энергетический профиль реакции гидролиза GTP + Н20 —> GDP + Pi для двух случаев в присутствии и отсутствии рибосомы Объяснена роль аминокислотного остатка гистидина 85 в этих реакциях

5 С использованием данных о структурах реагентов и переходных состояний, полученных методом КМ/ММ, рассчитаны и сопоставлены с экспериментальными результатами кинетические изотопные эффекты 180/160 для реакций гидролиза ГТФ в системах p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu

6 Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единому диссоциативному механизму на первой стадии отщепляется гамма-фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной молекулы воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов и образованием неорганического фосфата и ГДФ

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты исследования позволяют детализировать механизм химической реакции на молекулярном уровне и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых биологически активных соединений и лекарственных препаратов

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на V международной молодежной конференции (Институт биохимической физики РАН им М Н Эмануэля, Москва, 2005), 3-й Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии» (Москва, 2005), III международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006), 5-й Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование" (Москва, 2007), 4-м международном симпозиуме «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы» (Москва, 2007), 2-й международной конференции «Biocatalysis 2008» (Москва, 2008)

Результаты работы опубтикованы в 10 печатных работах, в том числе в 5 статьях в рецензируемых научных журналах

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 112 наименований Работа изложена на 127 страницах, включает 92 рисунка и 21 таблицу

Содержание работы

Первая глава посвящена описанию методов моделирования (КМ/ММ, молекулярной динамики, молекулярной механики) и литературным данным по объектам моделирования - G-белкам

Общая идея комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) сводится к разделению рассматриваемой системы на две части В квантовую подсистему (КМ-часть) включаются наибопее важные для реакции атомы, при этом энергии и силы, действующие на атомы, рассчитываются методами квантовой химии В молекулярно-механическую подсистему (MM-часть) входят оставшиеся аминокислотные остатки и молекулы воды, при этом энергии и силы

вычисляются с использованием эмпирических силовых полей В данной реализации метода КМ/ММ взаимодействие между КМ- и ММ-подсистемами описывается с помощью теории потенциалов эффективных фрагментов [Grigorenko В L идр, 2002] В качестве эффективного фрагмента рассматривается часть молекулы, внутренние координаты которой можно считать фиксированными В этом подходе аминокислотные остатки разбиваются на фрагменты, типичные для полипептидных систем, молекулы воды представляют собой отдельные фрагменты Влияние окружения (ММ-части) на квантово-механическую часть описывается электростатическими и обменно-отгалкивательными вкладами в одноэлектронную матрицу квантового гамильтониана

Компьютерная реализация данного варинта метода КМ/ММ основана на использовании двух пакетов компьютерных программ PC GAMESS [Грановский А А] и TINKER [Ponder JIV] Геометрическая оптимизация и расчеты энергии в КМ-части выполнены методом Хартри-Фока с использованием базиса LANL2DZ(d,p)_ECP Взаимодействие между атомами, входящими в эффективные фрагменты ММ-части, рассчитано методом молекулярной механики с силовым полем AMBER

Метод молекулярной динамики преимущественно использовался для предварительной оптимизации геометрических конфигураций фермент-субстратных комплексов и для уточнения положений молекул воды и каталитических аминокислотных остатков в активных центрах ферментов Начальные координаты тяжелых атомов были взяты из структур, содержащихся в банке данных белковых структур (PDB) Расчеты проводились с использованием программных пакетов HyperChem 7 и NAMD 2 6с применением силовых полей AMBER и Charmm 27

С помощью метода молекулярного докинга изучалось положение молекулы гуанозинтрифосфата в активных сайтах некоторых G-белков Расчеты выполнялись с помощью программы AuiodocK 3 0, позволяющей изучать связывание лиганда с белком, оценивать комплементарность белка и лиганда, находить энергию связывания лиганда в комплексе с белком

В данной работе были рассмотрены три класса G-белков мономерные, гетеротримерные G-белки и белковые факторы Известно, что для всех G-белков характерен цикл гидролиза, в котором белок и молекула ГТФ, проходя через ряд изменений, возвращаются в исходное состояние При этом белок бывает в двух состояниях активном, в котором он связан с ГТФ и может передавать сигнал на эффектор, и неактивном, когда связан с ГДФ и передавать сигнал не может Переход из активного состояния в неактивное проходит при помощи белка-активатора Обратный переход осуществляется при помощи обменного фактора

Из литературных данных известно, что гидролиз ГТФ может проходить в чистом G-белке или в присутствии белка-активатора Обычно в качестве белка-активатора выступают белки GAP или RGS белки Поэтому большинство выбранных систем рассматривалось в присутствии и в отсутствии белка-активатора.

Для выбранных трех классов G-белков известно большое число экспериментальных исследований, включая данные кристаллографического анализа, кинетических и мутационных исследований

Вторая глава содержит результаты исследований механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белковых комплексах p21Ras и p21Ras*RasGAP, которые участвуют в передаче сигнала роста в клетке Из экспериментальных данных известно, что гидролиз гуанозинтрифсофата может проходить в чистом белке p21Ras (в лабораторных условиях) или в белковом комплексе p21Ras*RasGAP (в живых организмах) Присутствие субъединицы RasGAP ускоряет гидролиз ГТФ в 105 раз Из кинетических данных известно, что наиболее критичные мутации в этих белках -мутации по аминокислотным остаткам Glnól белка p21Ras и Arg789 белка RasGAP

Были рассмотрены кристаллические структуры белковых комплексов р21 Ras*GTP(Npy), где GTP(Npr) - аналог ГТФ, в котором мостиковый р,у-кислород заменен атомом азота (код PDB 5Р21), и p21Ras*RasGAP*GDP*AlF3 (код PDB 1WQ1) При моделировании в этих структурах молекулы аналогов, GTP(N¡jy) или GDP*A1F3, заменялись молекулой ГТФ Сравнение кристаллических структур белка p21Ras из структур 5Р21 и 1WQ1 показало, что основные отличия наблюдаются в цепи, состоящей из аминокислотных остатков 59-71 Из литературных данных известно, что петля L4 (аминокислотные остатки 61-67) обладает большой конформационной гибкостью, и изменение ее конформации может влиять на ГТФазную активность белка p21Ras

С помощью метода молекулярного докинга было проведено исследование комплекса p21Ras*GTP с разными конформациями цепи аминокислотных остатков 59-70 в белке p21Ras Сравнительными критериями, определяющими однозначность найденного положения, служили вероятность связывания и стандартное отклонение Найдено, что вероятности связывания для конформации с исходным положением цепи 59-70 и конформации с «развернутым» (аналогично структуре p21Ras*RasGAP) положением цепи 59-70 равны 99 и 97%, соответственно При этом стандартное отклонение от данных РСА в обоих случаях равно 0,36 Â Таким образом, мы показали, что связывание молекулы ГТФ в активном центре белка p21Ras не зависит от конформации цепи аминокислотных остатков 59-70, в том числе, и от положения Gln61

Для расчетов методом КМ/ММ была взята часть структуры белка p21Ras В КМ-часть были включены 33 атома, в MM-часть - 1464 атома, объединенных в 443 эффективных фрагмента На Рис 1 приведена оптимизированная структура активного центра фермент-субстратного комплекса p21Ras*GTP

Результаты расчетов методом КМ/ММ энергетических профилей показывают, что реакции гидролиза ГТФ в белке p21Ras проходит по диссоциативному механизму

• На первой стадии происходит отщепление у-фосфатной группы ГТФ под действием окружения активного центра белка. Одновременно с отщеплением фосфатной группы происходит стереоинверсия у-фосфатной группы Расстояние PY - Ор изменяется от 1,7 А в структуре реагентов до 2,4 А в структуре первого переходного состояния и составляет 3,2 А для геометрической конфигурации интермедиата

• На следующих стадиях реакции молекула воды нуклеофильно атакует у-фосфор, затем происходит перенос двух протонов по цепи из двух молекул воды и аминокислотного остатка Glnöl На промежуточной стадии образуется НР042 В завершение реакции протон от аминокислотного остатка Glnöl по цепи водородных связей переходит на НР042, образуя продукт реакции Н2РО42

Ранее методом КМ/ММ в рамках сходных приближений были проведены расчеты профиля реакции гидролиза ГТФ в белковом комплексе p21Ras*RasGAP и сформулированы предложения по механизму реакции [Grigorenko В L и др, 2005] Результаты нашей работы с p21Ras позволили сопоставить механизм реакции в этих двух системах и показать, что реакция гидролиза ГТФ для p21Ras и p21Ras*RasGAP проходит по аналогичному механизму На Рис 2 сопоставлены энергетические профили реакции гидролиза ГТФ для этих систем Отметим, что для белкового комплекса p21Ras*RasGAP барьер реакции ниже на 4,2 ккал/моль, чем для белка p21Ras Полученная разность энергий активации соответствует экспериментальному значению по константам скоростей гидролиза для рассматриваемых систем

Заметное снижение акгивационного барьера для системы p21Ras*RasGAP происходит за счет двух факторов

• фиксации аминокислотного остатка Gln61 в положении, удобном для проведения реакции гидролиза,

• предоставления тн «аргининового пальца» - Arg789 (RasGAP), в активный центр белка p21Ras, что способствует отщеплению гамма-фосфатной группы при гидролизе и стабилизирует переходное состояние

Рис 2. Сравнение профилей реакции гидролиза ГТФ в белках р2Шаз и р2111а5*Ка50АР

Кроме того, энергетический баланс реакции гидролиза ГТФ в белке р2Жаз меньше, чем в белке р2Шаз*К.азОАР Это свидетельствует о том, что аминокислотное окружение белка р21Яа5*Ка50АР лучше компенсирует перераспределение зарядов в активном центре при образовании продуктов гидролиза.

В структурах фермент-субстратных комплексов р2Ша$ и р2Ша$*Иа$САР прослеживается четкая сеть водородных связей Следует выделить наиболее важные из них

Магниевый центр. Катион магния координируется ТЬг35, БегП, двумя атомами кислорода фосфатных групп ГТФ и двумя молекулами воды

Координация р- и у-кислородов Аминокислотные остатки 01у13, ЬуБ16, ИубО образуют водородные связи с р- и у-кислородами фосфатных групп ГТФ, что приводит к перераспределению электронной плотности, таким образом, облегчая отщепление у-фосфатной группы

Координация реакционной молекулы воды. Водородная связь от атома кислорода основной цепи ТЬг35 удерживает реакционную молекулу воды в оптимальном для реакции положении

Также есть некоторые различия между структурами фермент-субстратных комплексов эти двух систем

Роль остатка С1п61 Боковая цепь 01пб1 в белке р2111аз позиционирует вторую молекулу воды, а в комплексе р2111а8*КазОАР - реакционную молекулу воды, и остаток 01п61 непосредственно участвует в реакции

Роль «аргининового пальца». В белке p21Ras*RasGAP появляется

«аргининовый палец», который образует водородные связи с а- и у-кислородами

гуанозинтрифосфата Таким образом, Arg789 дополнительно способствует отщеплению гамма-фосфатной группы

В третьей главе приведены результаты расчетов и анализа энергетических профилей реакции гидролиза ГТФ другим G-белком - фактором элонгации Tu (EF-Tu), который играет важную роль в процессе биосинтеза белков, катализируя присоединение тройного комплекса EF-Tu*GTP*aa-tRNA к А сайту рибосомы

Известно, что гидролиз ГТФ может проходить в самом белке EF-Tu (в лабораторных условиях) или на рибосоме (в живой клетке) Кинетические исследования показали, что на рибосоме гидролиз идет в 105 раз быстрее, чем в чистом EF-Tu Из данных мутационного анализа известно, что наиболее важными аминокислотными остатками для реакции гидролиза в присутствии рибосомы является His85 При этом в чистом белке EF-Tu мутация His85 на скорость гидролиза не влияет

Из-за экспериментальных сложностей структура комплекса EF-Tu с рибосомой до сих пор не получена В известных кристаллографических структурах EF-Tu с аналогами ГТФ остаток His85 развернут в сторону от активного центра, и между ним и активным центром располагаются боковые цепи Val20 и Ие61 (тн, «гидрофобные ворота»), которые полностью закрывают доступ His85 в активный центр (Рис 3) Согласно рабочей гипотезе [Pape Т и dp, 1998] при образовании сложной системы EF-Tu*GTP*aa-tRNA-pn6ocoMa происходят информационные изменения в факторе элонгации, в результате чего «гидрофобные ворота» открываются и боковая цепь His85 разворачивается к активному центру и принимает прямое участие в реакции гидролиза

В качестве начальной конфигурации для расчетов механизма гидролиза ГТФ в белке EF-Tu была использована кристаллическая структура белкового комплекса EF-Tu*GTP(Nßr) (код PDB 1EFT) С помощью метода молекулярной динамики мы смоделировали конформационные изменения в белке EF-Tu, те раздвинули «гидрофобные ворота» и развернули остаток His85 в сторону у-фосфатной группы В результате была получена структура фактора EF-Tu с положениями аминокислотных остатков в активном центре белка, соответствующими активному состоянию белка, или комплексу EF-Tu*GTP*aa-tRNA-pn6ocoMa

В ходе исследования были рассмотрены две модели модель «закрытой конформации» (остаток His85 внутри активного центра), которая соответствует

Рис.1. Активный центр фермент-субстратного комплекса для белка р21Ка5*ОТР.

Рис.3. Кристаллическая структура активного центра белка ЕР-Ти.

Рис.4. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для ЕР-Ти в закрытой конформации.

Н1385

ЕР-Ти*рибосома*ГТФ р21 РаБ'РакСАР'ГТФ

Рис.7. Наложение активных центров фермент-субстратных конформации (зеленый) и р21Яаз*Н.азОАР (синий).

Рис.5. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для ЕР-Ти в открытой конформации.

ЕР-Ти*рибосома*ГТФ р21 р{аз"Ка5САР"ГТФ

Рис.8. Наложение активных центров первых переходных конформации (зеленый) и р21Яа$*КазОАР (синий).

состояний ЕР-Ти в закрытой

I

ч

комплексов ЕР-Ти в закрытой

Рис.11. Конфигурация активного центра в рассчитанной структуре фермент-субстратного комплекса в белке Яап*11апОАР*К.апВР1.

1K5D: Ran* •RanBP1TT<4NfJ)

Рис.10. Кристаллическая структура белкового комплекса Ran*RanGAP*RanBPl *GTP(Npr).

Рис.12. Кристаллическая структура белкового комплекса 05а*СТР(8т) (зеленым выделено скорректированное положение остатков 01п227 и Аг§201).

Рис.13. Активный центр фермент-субстратного комплекса Бва* ОТР по результатам моделирования.

Рис.14. Наложение кристаллических структур активных центров мономерных в-белков с активирующими частицами.

комплексу ЕР-Ти*СТР*аа-11ША-рибосома, и модель «открытой конформации» (Н1б85 вне активного центра), которая соответствует комплексу ЕР-Ти*СТР

Модель «закрытой конформации» включает молекулу ГТФ, 210 молекул воды, катион магния и аминокислотные остатки белка ЕИ-Ти В КМ-часть были включены 36 атомов, в ММ-часть - 1811 атомов, объединенных в 556 эффективных фрагментов На Рис 4 приведена структура полученного фермент-субстратного комплекса для модели «закрытой конформации»

Было показано, что реакция гидролиза ГТФ в этом случае проходит в одну стадию При этом сначала, как и в случае белка р2111а8, происходит отщепление гамма-фосфатной группы, которая изменяет свою конформацию через образование плоской частицы Р03" Затем происходит нуклеофильная атака реакционной молекулы воды по у-фосфору с одновременным переносом протона на непротонированный атом азота аминокислотного остатка Н1э85

Модель «открытой конформации» включает мотекулу ГТФ, 100 молекул воды, катион магния и аминокислотные остатки белка ЕР-Ти В КМ-часть были включены 24 атомов, в ММ-часть - 448 эффективных фрагментов (1481 атомов) На Рис 5 приведена структура полученного фермент-субстратного комплекса для модели «открытой конформации»

Было найдено, что механизм реакции в модели «открытой конформации» также включает одну стадию, но в отличие от модели «закрытой конформации» гидролиз проходит без непосредственного участия аминокислотного остатка Н1б85 Начало реакции проходит аналогичным образом отщепляется у-фосфатная группа, происходит нуклеофильная атака молекулы воды Но перенос протонов осуществляется по цепи водородных связей двух молекул воды

На Рис 6 приведено сравнение энергетических профилей реакции гидролиза ГТФ в двух моделях Для модели «открытой конформации» барьер активации получен ниже на 7,2 ккал/моль Это значение соответствует известным кинетическим данным по скоростям реакции для чистого белка ЕР-Ти и комплекса ЕР-Ти*0'ГР*аа-1Ю4А-рибосома.

В структурах фермент-с) бстратныч комплексов дтя обоих случаев простеживается четкая сеть водородных связей Наиболее важные из них следующие Магниевый центр. Катион магния координируется ТЬг62, ТЬг25, двумя атомами кислорода фосфатной группы ГТФ и 2 молекулами воды

Координация 0- и у-кнслородов. Аминокислотные остатки Азр21, Ьуз24, молекулы воды образуют водородные связи с р- и у-кислородами фосфатной группы ГТФ, что приводит к перераспределению электронной плотности, таким образом, облегчая отщепление у-фосфатной группы

Координация реакционной молекулы воды. Водородная связь от атома кислорода основной цепи Thr62 удерживает реакционную молекулы водя в оптимальном положении

Различие между фермент-субстратными комплексами двух моделей Роль остатка His85. В системе, моделирующей комплекс EF-Tu*GTP*aa-tRNA-рибосома, аминокислотный остаток His85 координирует реакционную молекулу воды,

Анализ строения фермент-субстратных комплексов с белками p21Ras и EF-Tu показывает общие структурные элементы

В четвертой главе сопоставлены результаты расчетов методом КМ/ММ полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов, а также кинетических изотопных эффектов для реакции гидролиза ГТФ в белках и комплексах р21Яаз, р21Яа5* КазвАР, ЕР-Ти

Анализ полученных структур фермент-субстратных комплексов и механизмов реакции гидролиза позволяет выделить общее черты и ключевые структурные элементы активных центров О-бслков На Рис 7 и 8 приведено наложение структур фермент-субстратных комплексов и структур, отвечающих переходному состоянию стадии разрыва связи фосфор-кислород для систем ЕР-Ти и р21Яа5*Яа50АР

На Рис 7 видно, что, несмотря на некоторые отличия в аминокислотных остатках, сеть водородных связей в активных центрах белков остается без изменения Это позволяет утверждать о консервативной роли отдельных аминокислотных остатков в связывании и гидролизе гуанозинтрифосфата

Также при наложении структур первого переходного состояния (Рис 8) для систем EF-Tu и p21Ras*RasGAP обнаруживается явное сходство в расположении участников реакции, что говорит о единообразном механизме химической реакции гидролиза ГТФ Таким образом, мы считаем, что для систем с единым строением активного центра реакция гидролиза идет по одному механизму

Для всех рассмотренных методом КМ/ММ систем была проведена оценка кинетического изотопного эффекта (КИЭ) Под КИЭ понимают изменение скорости химической реакции при замене в молекуле реагирующего вещества какого-либо атома его изотопом В недавних экспериментальных работах [Du X и др, 2008] был разработан метод определения значений КИЭ, Ф(|80), при замещении изотопа кислорода 160 на |80 в различных положениях в молекуле ГТФ Для удобства представления и экспериментальных, и теоретических результатов мы используем т н «индекс замещения» При его определении мы учитывали различную значимость у- и р-атомов кислорода ГТФ для реакции гидролиза Очевидно, что Д-у мостиковый кислород играет ключевую роль в реакции, соответствующей диссоциативному механизму Следовательно, мы можем заключить, что меченный 0-у мостиковый кислород в экспериментах с 180 должен вносить наибольший вклад в кинетические изотопные эффекты, в то время как, изотопно-замещенные Р немостиковые атомы кислорода также важны, но в меньшей степени Именно поэтому мы предлагаем использовать подобную характеристику для субстратов ГТФ, меченных по разным атомам кислорода (см таблицу в левой части Рис 9) Известные результаты экспериментального определения Ф(180) для гидролиза ГТФ в Ras и Ras*RasGAP [Du X и др, 2004] показывают практически линейную зависимость Ф(|80) от индекса замещения (Рис 9)

Для теоретической оценки значений Ф(,80) мы вычислили колебательные частоты в стационарных точках на поверхностях потенциальной энергии, найденных ранее для реакций гидролиза ГТФ в белках Ras, Ras*RasGAP, EF-Tu, для экспериментально исследованных вариантов изотопного замещения в ГТФ Мы использовали простейшее приближение теории переходного состояния, в котором учитывали только разницу в энергиях нулевых колебаний реагентов и переходных состояний

7 16

ф(180) = ~ Fe-(AÜ,*s-AUf8)/RT

Здесь ДШ обозначает разницу в потенциальных энергиях между переходным состоянием и фермент-субстратным комплексом, скорректированную с учетом энергии нулевых колебаний, а предэкспоненциальный множитель F равен отношению соответствующих сумм по состояниям, которые были оценены через вклад от

реакционной колебательной моды Примечательно, что рассчитанные нами значения Ф(180), как и экспериментально измеренные, представляют практически линейную зависимость от индекса замещения (Рис 9)

Рис.9 Зависимость КИЭ от индекса замещения для белков р2Шаз и р21Яаз*Ка5СЛР В таблице в левой части звездочкой помечены атомы 180

Такая зависимость наблюдается для всех систем, рассмотренных в данной работе p21Ras, p21Ras*RasGAP и EF-Tu в закрытой и открытой конформациях Очевидно, что все три системы обладают сходным поведением при изотопном замещении в молекуле ГТФ Поскольку вычисленные значения Ф(180) были получены для теоретически установленного диссоциативного механизма реакции, у нас есть достаточные основания полагать, что экспериментальные данные также согласуются с диссоциативным механизмом для ферментативного гидролиза ГТФ

Пятая глава посвящена обобщению результатов моделирования структур фермент-субстратных комплексов, полученных методами молекулярного докинга, молекулярной динамики и КМ/ММ для ряда G-белков

Мономерный белок Ran участвует в транспорте веществ через ядерную мембрану Реакция гидролиза в белке Ran проходит в 10 раз медленнее, чем в белке p21Ras Присутствие RanGAP увеличивает скорость гидролиза на 5 порядков

На Рис 10 приведена структура активного центра белкового комплекса Ran*RanGAP*RanBPl (код PDB 1K5D) Видно, что место «аргининового пальца» занимает остаток Туг39, а боковая цепь Argl70 от активационной частицы GAP находится в стороне С помощью метода молекулярной динамики мы показали, что нет стерических препятствий для участия остатка Argl70 в качестве «аргининового пальца» при условии, что петля с Туг39 отходит в сторону (по аналогии с системой

р21Ка5*КазОАР) Однако несмотря на потенциальную возможность участия остатка /\rgl70, вероятно, его функцию выполняет Туг39, что подтверждается данными по мутационному анализу по позиции 170

Методом КМ/ММ была оптимизирована структура фермент-субстратного комплекса (Рис 11), для которого характерны указанные выше структурные элементы активного центра

Анализ строения активного центра показал сходство с активными центрами ранее рассмотренных систем наличие магниевого центра, каталитического и активационного остатков, остатков, координирующих реакционную молекулу воду и (3- и у-кислороды ГТФ Мы видим сходство с активными центрами белковых комплексов р21Яа5*Ка50АР и 01а*Р0Еу*1Ю59 Единственное отличие заключается в присутствие остатка Туг39, который образует водородную связь с у-кислородом ГТФ Таким образом, нами был проанализирован фермент-субстратный комплекс, соответствующий типу активного центра с «активационной» аминокислотой Туг

Гетеротримерный белок вв,, участвует в передаче сигнала с рецептора плазматической мембраны на аденилат циклазу Константа гидролиза ГТФ в белке Оза составляет 0,06 с 1 Из кинетических данных известно, что для данного белка мутации по остаткам 01п227 и А^201 являются критическими, но в полученной кристалтаческой структуре СК,*ОТР(87) (код РОВ \j\ZT) эти остатки находится на расстоянии примерно 5А (Рис 12) Поэтому боковые цепи 01п227 и Агц201 были развернуты к активному центру, и для этой системы бьпа рассчитана структура фермент-субстратного комплекса (Рис 13)

Анализ строения активного центра показал сходство с активными центрами ранее рассмотренных систем наличие магниевого центра, каталитического и активационного остатков, остатков, координирующих реакционною воду и (3- и у-атомы кислорода ГТФ Таким образом найденный фермент-субстратный комплекс Об^ОГР является аналогом полученных ранее фермент-субстратных комплексов р2№а5*11а50АР и 01,/Р1)Еу* КОЭУЧП'Р

Для проверки гипотезы о едином строении активных центров в-белков был проведен сравнительный анализ активных центров в-белков Мы провели наложение кристаллических структур различных О-белков В качестве примера на Рис 14 приведено сравнение активных центров мономерных белков в комплексе с активирующими белками

Сравнительный анализ большого числа кристаллических структур О-белков, а также результаты молекулярного моделирования, приведенные в данной работе, подтвердили консервативность одних аминокислотных остатков и взимозаменяемость других

В заключении нами было выделено несколько типов активных центров G-белки могут различаться по

• каталитической аминокислоте - Gin (p21Ras), Asn (Rap 1*Rap 1 GAP), His (EF-Tu, Sari), Glu (миозин, как пример аденозинтрифосфат-связывающего белка), при этом в зависимости от сродства каталитической аминокислоты к протону реакция гидролиза может проходить в одну или две стадии, в частности, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gin и Asn проходят в две стадии,

• активационной аминокислоте - Arg (p21Ras*RasGAP), Туг (Ran*RanGAP), Ser (Rab33, миозин)

Каталитическая и активационная аминокислоты могут принадлежать как самому G-белку, так и его активационной частице В роли активационной частицы может выступать или белок-активатор (для всех ГТФаз) или спиральный домен (для гетеротримерных белков)

В зависимости от типа активного центра активационная частица может

• фиксировать каталитическую аминокислоту в положении, удобном для проведения реакции гидролиза,

• предоставлять актнвацнонную аминокислоту в активный центр G-белка и таким образом способствовать отщеплению у-фосфатной группы, стабилизируя переходное состояние при реакции гидролиза

Несмотря на различия в строении G-белков, во всех рассмотренных случаях мы видим единое устройство активных центров Как было показано для детально изученных систем p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu, общее строение активных центров соответствует единой схеме прохождения реакции гидролиза

Таким образом, мы считаем, что во всех рассмотренных G-белках со сходным строением активного центра, реакция гидролиза ГТФ протекает rio единому диссоциативному механизму

Основные результаты н выводы

1 Комбинированным методом квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21Ras от фермент-субстратного комплекса до продуктов реакции гидролиза Показано, что реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму

2 Методом КМ/ММ с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке EF-Ти для двух вариантов конформации фермента, моделирующих белок в свободном состоянии и в комплексе с рибосомой Показано, что в обоих случаях реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму

3 Выделены общие характеристики реакции гидролиза ГТФ при сопоставлении результатов расчетов методом КМ/ММ полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов для химических превращений в белках и комплексах p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu Прямое сопоставление вычисленных и экспериментальных значений кинетических изотопных эффектов при замещении |60 на 180 в молекуле ГТФ предоставляет поддержку гипотезе о диссоциативном механизме реакции ферментативном гидролиза ГТФ

4 Выделены основные структурные элементы активных центров G-белков и объяснены функции важнейших аминокислотных остатков, входящих в активные центры Показано, что реакция гидролиза ГТФ для разтичных G-белков протекает по единому диссоциативному механизму на первой стадии отщепляется у-фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов с образованием неорганического фосфата и ГДФ

5. По результатам моделирования гидролиза фосфатов в различных ферментах сделан вывод, что количество стадий в реакции гидролиза зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону Таким образом, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gin и Asn - в две стадии

Публикации по теме диссертации

1 Шадрина МС, Рогов А В, Бравая КБ, Немухин А В Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки П Вестник Моек Унта, Серия 2, Химия, 2005, Т 46, №6, С 363-369

2 Немухин А В, Григоренко БЛ, Шадрина МС Механизмы реакций ферментативного гидролиза нуклеозидтрифосфатов по данным расчетов методом квантовой и молекулярной механики II Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им Д И Менделеева), 2007, Т 51, С 27-33

3 Grigorenko В, Nemukhm А , Shadrma М, Topol /, Burt S Mechanisms of guanosine triphosphate hydrolysis by Ras and Ras-GAP proteins as rationalized by ab initio QM/MM simulations II Proteins Structure, Function and Bioinformatics, 2007, V 66, P 456-466

4 Grigorenko B, Shadrma M, Topol I, Collms J, Nemukhm A Mechanism of the Chemical Step for the Guanosine Triphosphate (GTP) Hydrolysis Catalyzed by Elongation Factor Tu // Biochim et Biophys Acta Proteins and Proteomics, 2008, doi 10 1016/j bbapap 2008 08 003

5 Шадрина МС, Григоренко БЛ, Немухин А В Структура фермент-субстратного комплекса при гидролизе гуанозинтрифосфата фактором роста EF-Tu Сопоставление результатов квантовой и молекулярной механики и молекулярной динамики И Вестник Моек Ун-та, Серия 2, Химия, в печати

6 Рогов АВ, Григоренко БЛ, Шадрина МС, Бравая КБ, Доброгорская ЯИ, Немухин А В Моделирование ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата // Тезисы докладов II Российской школы-конференции "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине", Саратов, 2004, С 19

7 Grigorenko В L, Rogov А V, Shadrma МS, Anosova Е V The role of hydrogen bonding in triphosphate hydrolysis in proteins and solutions // Book of abstracts of III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, Kyiv, Ukraine, 2006, P 47

8 Немухин AB, Григоренко БЛ, Шадрина МС Моделирование механизмов ферментативных реакций гидролиза нуклеозидтрифосфатов // Тезисы докладов 5-й Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование", Москва, 2007, С 30

9 Shadrma MS, Grigorenko BL, Nemukhm A V Modeling catalytic mechanisms of hydrolysis of nucleoside triphosphates (NTP) // Book of abstracts of Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTP1-2007), Moscow, 2007, P 147

10 Shadrma MS, Grigorenko BL, Polyakov IV, Knyazeva MA, Nemukhm AV Modeling enzymatic hydrolysis of nucleoside triphosphates // Book of abstracts of 2-nd International conference "Biocatalysis in non-conventional media ", Moscow, 2008, P 21

Подписано в печать 18 09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 761 Тираж 150 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Методы молекулярного моделирования, использованные в работе.

1.1.1. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики на основе потенциалов эффективных фрагментов.

1.1.2. Метод молекулярного докинга.

1.1.3. Метод молекулярной динамики.

1.2. Объекты исследования: семейство ГТФаз.

1.2.1. Общие сведения о ГТФазах.

1.2.2. Мономерный белок р21Каз.

1.2.3. Белковый фактор ЕР-Ти.

1.2.4. Гетеротримерный белок

1.2.5. Мономерный белок Кап.

1.2.6. Гетеротримерный белок Оз.

1.2.7. Мономерные белки Яар.

1.2.8. Мономерные белки ЯаЬ.

Глава 2. Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке ргШаБ.

2.1. Сравнение конформаций пептидных цепей в белках р21 Яаэ и р21Каз*КазОАР.

2.2. Молекулярный докинг.

2.3. Молекулярная динамика.

2.4. Результаты расчетов методом КМ/ММ.

2.5. Сравнение механизмов гидролиза ГТФ в белках р2Жаэ и р21Клз*Ка$ОАР

Глава 3. Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке ЕГ-Ти.

3.1. Сравнение кристаллических структур белка ЕР-Ти.

3.2. Молекулярная динамика.

3.3. Расчеты КМ/ММ: модель «закрытой конформации».

3.4. Расчеты КМ/ММ: модель «открытой конформации».

3.5. Сравнение механизмов гидролиза ГТФ для двух моделей.

Глава 4. Сравнительный анализ деталей механизма гидролиза ГТФ для систем: p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu, ЕР-Ти*аа-тРНК*рибосома.

4.1. Сопоставление данных моделирования: структуры и энергии.

4.2. Расчет кинетического изотопного эффекта (КИЭ).

4.2.1. Экспериментальное определение КИЭ.

4.2.2. Методика расчета КИЭ.

4.2.3. Результаты расчетов.

Глава 5. Исследование активных центров различных ГТФаз.

5.1. Моделирование фермент-субстратного комплекса для белка Gt.

5.2. Моделирование фермент-субстратного комплекса для белка Ran.

5.3. Моделирование фермент-субстратного комплекса для белка Gs.

5.4. Сравнительный анализ строения активных центров ГТФаз.

5.5. Другие важные примеры ГТФаз.

5.5.1. Мономерный белок Rapl.

5.5.2. Мономерный белок Rab33.

5.5.3. Белковые факторы.

Исследование механизмов реакций ферментативного катализа, включая стадии элементарных химических превращений в активных центрах белков, необходимо для получения знаний о функционировании клеток живых организмов, для решения практических задач фармацевтики и биотехнологии. Результаты экспериментальных методов, применяемых для изучения ферментативных реакций, включая традиционные кинетические исследования, часто в сочетании с приемами генной инженерии, а также исследования методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) комплексов ферментов с аналогами субстратов или ингибиторами, предоставляют важнейшую информацию о механизмах сложных превращений в белках.

Результаты компьютерных расчетов на основе современных методов молекулярного моделирования, а именно, молекулярной механики (ММ), молекулярной динамики (МД), квантовой химии и комбинированных подходов квантовой механики - молекулярной механики (КМ/ММ), позволяют существенно дополнить экспериментальные исследования, добавить новую информацию и обеспечить визуализацию процессов ферментативного катализа с атомным разрешением.

Диссертация посвящена изучению методами молекулярного моделирования одной из важнейших биохимических реакций - ферментативного гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в различных гуанозиннуклеотид связывающих белках (G-белках). Несмотря на большой объем накопленной экспериментальной информации по кинетическим и структурным данным для реакции

GTP + Н20 GDP + Pi где GTP и GDP обозначают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат, Pi -неорганический фосфат, и на неоднократные попытки ее теоретического осмысления, заключение о механизме этой реакции в различных средах остаётся предметом дискуссий в научной литературе.

Цель работы заключалась в систематическом изучении элементарных стадий реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в различных G-белках с использованием методов КМ/ММ, молекулярной механики и молекулярной динамики и установлении общего механизма химических превращений в активных центрах ферментов.

Глава Литературный обзор

Основные результаты и выводы

1. Комбинированным методом квантовой и »молекулярной механики (КМ/ММ) с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21Ras от фермент-субстратного комплекса до продуктов реакции гидролиза. Показано, что реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.

2. Методом KiVl/MM с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке EF-Tu для двух вариантов конформации фермента, моделирующих белок в свободном состоянии и в комплексе с рибосомой. Показано, что в обоих случаях реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.

3. Выделены общие характеристики реакции гидролиза ГТФ при сопоставлении результатов расчетов методом КМ/ММ: полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов для химических превращений в белках и комплексах: p21Ras. p21Ras*RasGAP, EF-Tu. Прямое сопоставление вычисленных и экспериментальных значений кинетических изотопных эффектов

1 /Г 1 о при замещении О на О в молекуле ГТФ предоставляет поддержку гипотезе о диссоциативном механизме реакции ферментативном гидролиза ГТФ.

4. Выделены основные структурные элементы активных центров G-белков и объяснены функции важнейших аминокислотных остатков, входящих в активные центры. Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единому диссоциативному механизму: на первой стадии отщепляется у-фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов с образованием неорганического фосфата и ГДФ.

5. По результатам моделирования гидролиза фосфатов в различных ферментах сделан вывод, что количество стадий в реакции гидролиза зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону. Таким образом, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gin и Asn - в две стадии.

Заключение

Сравнительный анализ большого числа кристаллических структур ГТФаз подтвердил консервативность основных водородных связей и взаимозаменяемость ключевых аминокислотных остатков в активных центрах.

В результате анализа белков нами было рассмотрено несколько типов активных центров. Таким образом, G-белки могут различаться по:

• каталитической аминокислоте - Gin (p21Ras), His (EF-Tu, Sari), Asn (Rap 1 * Rap 1 GAP);

• активационной аминокислоте - Arg (p21Ras*RasGAP), Туг (Ran*RanGAP), Ser (Rab33).

При этом каталитическая и активационная аминокислоты могут принадлежать как самому G-белку, так и его активационной частице.

К ряду активационных аминокислот мы считаем нужным добавить остаток Ser, который так же образует водородную связь с кислородом у-фостфатной группы, например, в белке Rab33 (Рис.6.1). Хотя остаток Ser, безусловно, выполняет такие же функции, как и Туг, он ускоряет реакцию в меньшей степени.

Так же стоит добавить в ряд каталитических аминокислот остаток Glu. Хотя этот остаток и не встретился в рассматриваемых ГТФазах, он встречается в АТФазах. Например, при гидролизе АТФ в белке миозине остаток Glu непосредственно участвует в реакции, забирая лишний протон от молекулы воды [95]. На Рис.6.1 приведена структура фермент-субстратного комплекса, полученного в работе [95].

Белок миозин содержит так же остальные элементы, выделенные нами для

ГТФаз:

Магниевый центр. Катион магния координируется Ser237, Thrl86, 2 кислородами фосфатной группы ГТФ и 2 молекулами воды,

Координация ß- н у- атомы кислорода. Аминокислотные остатки Glyl82, Lysl85, Gly457 образуют водородные связи с ß- и у- атомами кислорода фосфатных групп.

Кроме того в белке миозине появляются два остатка Ser, которые образуют водородные связи с кислородом у-фосфатной группы АТФ. Но они не являются характерной чертой АТФаз, т.к. такую же ситуацию можно видеть в активном центре белка Rab5C (код PDB: 1HUQ [112]). Гидроксильные группы остатков Ser52 и ЭегЗО координируют кислород субстрата, способствуя реакции гидролиза ГТФ в белке ЯаЬ5С (Рис.6.2).

Рис.6.1. Строение фермент-субстратного комплекса миозин* ЛТФ [95].

Рис.6.2. Строение активного центра комплекса ЯаЬ5С*ГТФ(1Мрт) (код РОВ: 1НиО).

Сходство между структурами ГТФаз и миозина позволяет расширить предположение о едином строении активных центров также для реакций гидролиза ЛТФ. В работе [95] было показано, что реакция гидролиза ЛТФ в миозине проходит через одну стадию по диссоцитивному механизму: у-фосфатная группа АТФ отщепляется под действием белкового окружения, связывается с реакционной молекулой воды, которая отдает лишний протон через вторую воду на остаток Glu. Данный механизм так же подтвеждает наше предположение о едином диссоциативном механизме гидролиза для белков с одинаковым устройством активных центров.

Включение миозина в число рассматриваемых систем позволяет сделать еще одно наблюдение: в зависимости от типа каталитической аминокислоты реакция гидролиза может проходить в одну или две стадии. Если каталитическая аминокислота - Gin (p21Ras), то реакция проходит в две стадии, при этом протон от реакционной молекулы воды отрывается только на второй стадии. Если каталитическая аминокислота - His (EF-Tu) или Glu (миозин), то реакция проходит в одну стадию, и протон омывается ría первой стадии. Вероятно, ход реакции зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону. Тогда как остатки His и Glu достаточно легко принимают протон, для Gin это сделать сложнее.

Таким образом, можно обобщить данные по структурным элементам активных центров рассмотренных ферментов:

1. Каталитическая аминокислота: может принадлежать как G-белку, так и активационному белку; непосредственно участвует в реакции гидролиза, во время реакции принимает на себя протон от молекулы воды,, в конце реакции может оставаться в протонированной форме или отдавать лишний протон на отщепившуюся у-фосфатную группу; в «сжатом» активном центре образует водородную связь с кислородом у-фосфатной группы; в зависимости от сродства к протону гидролиз может проходить в одну или две стадии.

• Glu (р21 Ras-'RasGAP), Asn (Rapl *RaplGAP) - 2 стадии,

• His (EF-Tu, Sari), Glu (миозип) - 1 стадия.

2. Активацпонная аминокислота: в зависимости от типа может принадлежать как G-белку, так и акшвациопному белку («аргининовый палец» принадлежит спиральному домену для гетеротримерных G-белков и активационному белку для мономерных G-белков, заместители «аргининового пальца», Туг и Ser, принадлежат G-доменам для всех белков); образует водородные связи с атомами кислорода ß- и у-фосфатных групп, тем самым способствуя отщеплению у-фосфата; мутация по каталитическому Arg уменьшает скорость гидролиза примерно в 1000 раз, мутация по каталитическому Туг — примерно в 25 раз.

• Arg(p21Ras:;:RasGAP),

• Туг (Ran*RanGAP), Ser (Rab33).

3. Координация реакционной молекулы воды: роль реакционной молекулы воды заключается в нуклсофилыюй атаке по фосфору отщепившейся у-фосфатной группы; в момент начала реакции положение реакционной воды фиксируется тремя водородными связями: первый протон воды образует связь с атомом кислорода основной цепи остатка Thr/Ser, второй протон координируется акцепторным атомом каталитической аминокислоты (Gln/His/Asn) или кислородом второй молекулы воды в зависимости от механизма гидролиза, кислород воды направлен на фосфор у-фосфатной группы.

4. Магниевый центр: положительно заряженный катион магния так же способствует отщеплению у-фосфатной группы; координируется шестью кислородами: кислородамн боковых цепей остатков Thr/Ser и Thr/Ser, кислородами [3- и у-фосфатиых групп и кислородами двух молекул воды.

5. Координация р- п у- атомов кислорода: в координации атомов кислорода р~ и у-фосфатных групп также принимают участие водороды консервативных остатков активных центров ферментов: водороды амидных групп основных цепей Gly и Gly/Asp/Ala/Asn/Glu и водороды аминогруппы Lys; их роль заключается в связывании л и ганда, но они так же способствуют отщеплению у-фосфатной группы.

Также на нескольких примерах нами была продемонстрирована роль активационной частицы в гидролизе ГТФ. В роли активационпой частицы может выступать или белок-активатор (для всех ГТФаз) или спиральный домен (для гетеротримерных белков). В зависимости от типа активного центра активационная частица может:

• фиксировать каталитическую аминокислоту в положении, удобном для проведения реакции гидролиза, или предоставлять каталитическую аминокислоту в активный центр G-белка.

• предоставлять активацнонную аминокислоту в активный центр G-белка и таким образом способствовать отщеплению у-фосфатной группы, стабилизируя переходное состояние во время гидролиза.

Другими словами роль активационной частицы заключается в сжатии активного центра О-белка, что позволяет гидролизу ГТФ проходить с меньшим энергетическим барьером.

Несмотря на различия в строении в-белков, во всех рассмотренных случаях мы видим единое устройство активных центров. Как было показано для детально изученных систем р21Яай, р21Каз*Па50АР, ЕР-Ти, ЕБ-Ти*рибосома, общее строение активных центров соответствует единой схеме прохождения реакции гидролиза.

Таким образом, мы считаем, что во всех О-белках, имеющих рассмотренное строение активного центра, реакция гидролиза ГТФ протекает по единому диссоциативному механизму.

1. Warshel A., Levitt М. Theoretical Studies of Enzymic Reactions: Dielectric, Electrostatic and Steric Stabilization of the Carbonium Ion in the Reaction of Lysozyme // J. Mol. Biol., 1976, V. 103, pp. 227-249.

2. Ponder J. W.; Richards F.M. An efficient Newton-Like method for molecular mechanics energy minimization of large moleculcs // J.Comput.Chem., 1987, V. 8, pp. 1016-1023.

3. Granovsky A, URL: http://lcc.chem.msu.ru/gran/gamess/index.html.

4. A. V. Nemnkhin, B.L. Grigorenko, A.A. Granovsky, Molecular modeling with the PC GAMESSpackage: From diatomic molecides to enzymes, Moscow Univ. Chem. Bull. 45 (2004) 75-102.

5. Stevens W. REPGEN for Optimizing Effective Fragment Repulsive Potentials // CARB, 1991.

6. Bakowies D.; Thiel W. Hybrid models for combined quantum mechanical and molecular mechanical approaches И J.Chem.Phys., 1996, V. 100, pp. 10580-10594.

7. Lavery R.; Etchebest C.; Pullman A. Calculation of the molecular electrostatic potential from a multipole expansion based on localized orbitals // Chem. Phys. Lett., 1982, V. 85, pp. 266-270.

8. Stone A.J.; Alderton M. Distributed Polarizabilities // Mol.Phys., 1985, V. 56, pp. 10651082.

9. Боченкова A.B. Развитие комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. дисс. на соиск. уч. ст. канд. физ.-мат. наук. - 2004.

10. Nemukhin А. V.; Grigorenko B.L.; Bochenokova А. V.; Topol I.A.; Burt S.K. A QM/MM approach with effective fragment potentials applied to the dipeptide-water structures // J.Mol.Structure (Theochem), 2002, V. 581, pp. 167-175.

11. Brian K.S.; McGovern S.L.; Binqing IV.; Irwin J.J. Lead discovery using molecular docking // Current Opinion in Chemical Biology, 2002, V. 6, pp. 439-446.

12. Hanessian S.; MacKay В.; Moitessier N. Design and synthesis of matrix metalloproteinase inhibitors guided by molecular modeling // J. Medicinal Chemistry,2001, V. 44, pp. 3074-3082.

13. Беленикин М.С.; Маккиаруло А.; Константино Г.; Палюлин В.А.; Пелличари Р.; Зефиров Н.С. Молекулярный докинг лигандов глугаматных рецепторов // Вестн. Моск. Ун-та, Сер.2. Химия, 2002, том 43, с. 221-230.

14. Contance J. J.; Koshland D.E. Three-dimensional structure of the serine receptor ligand-binding domain // Proteine Science, 1993, V. 2, pp. 559-566.

15. Henetyi C.; Spoel D. Efficient docking of peptides to proteins without prior knowledge of the binding site // Protein Science. 2002, V. 11, pp. 1729-1737.

16. Шадрина M.C.; Рогов A.B.; Бравая К.Б.; Немухин A.B. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестн. Моск. Унта, Химия, 2005, том 46. №6, с. 363-369.

17. Protein Data Bank, URL htlp://ww\v.rcsb.oru/pdb/

18. Morris G.; Goodsell D.; Halliday R.; Huey R.; Hart W.; Belew R.; Olson A. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function //.¡.Computational Chemistry. 1998, V. 19, pp. 1639-1662.

19. Westmoreland P.R.; Kollman P.A.; Chaka A.M.; Cummings P.T.; Morokuma K.; Neurock M.; Stechel E.B.; Vashishta P. WTEC panel report on applications of molecular and materials modeling // 2000, URL: http.V/www. wtcc.org/lovola/molmodel/ mm final.pdf.

20. Шайтан К.В.; Терёшкина К.Б. Молекулярная динамика белков и пептидов. Методическое пособие // URL http://www.mо 1 dvn.ru/librarv/manual/p 1-1.htm.

21. Car Li.; Parrinello A4. Unified Approach for Molecular Dynamics and Density-Functional Theory //Phys. Rev. Lett., 1985, V. 55, pp. 2471-2474.

22. NAMD User's Guide Version 2.6 // URL http://wvvw.ks.uiuc.edu/Researeh/ namd/2.6/uu/.

23. Bekker H.; Dijkstra E. J.; Renardus M. K; R., Berendsen H. J. C. An efficient, box shape independent non-bonded force and virial algorithm for molecular dynamics. // Mol. Sim., 1995, V. 14, pp. 137-152.

24. HyperChem // URL http://vvwvv .hyper.com

25. Kale L., Skeel R., Bhandarkar M., Brunner R., GursoyA., KrawetzN., Phillips J., Shinozaki A., Varadarajan K, Schulten K. NAMD2: Greater scalability for parallel molecular dynamics II J. Comp. Phys. 1999, V. 151, pp. 283-312.

26. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.S., Swaminathan S., Karplas M. CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations//./. Comp. Chem., 1983, V. 4, pp. 187-217.

27. KosloffM., Selinger Z. GTPase Catalysis by Ras and Other G-proteins: Insights from Substrate Directed Supeiimposition II J. Mol. Biol, 2003, V. 331, pp. 1157-1170.

28. Sprang S.R., Chen Z, DuX. Structural basis of effector regulation and signal termination in heterotrimeric Galpha proteins // Adv Protein Chem., 2007, V. 74, pp. 1-65.

29. Sprang S.R. G proteins, effectors and GAPs: structure and mechanism II Curr Opin Struct Biol., 1997, V. 7(6). pp. 849-856.

30. Lehninger A.L.; Nelson D.L.; Cox M.M. Principles of Biochemistry// Worth Publishers, 1993.

31. Scheffzek K.; Ahmadian M.R.; Kabsch W.; Wiesmidler L.; Lautwein A.; Schmitz F.; Wittinghofer A. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutations // Science, 1997, V. 277, pp. 333-338.

32. Resat /-/./ Straatsma T.P.; Dixon D.A.; Miller J.H. The argentine finger of RasGAP helps Gln-61 align the nucleophilic water in GAP-stimulated hydrolysis of GTP // PNAS, 2001, V. 98(11), pp. 6033-6038.

33. Ma J.; Karplus M. Molecular switch in signal transduction: Reaction paths of the conformational changes in Rasp21 // Biophysics, 1997, V. 94, pp. 11905-11910.

34. Langen Ii.; Schweins T.; Warshel A. On the mechanism of guanosine triphosphate hydrolysis in Ras p21 proteinst II Biochemistry, 1992, V. 31, pp. 8691-8696.

35. Chung H.-H.; Benson D.R.; Schultz P. G. Probing the structure and mechanism of Ras protein with an expanded genetic code // Science, 1993, V. 259, pp. 806-809.

36. Schweins T.; Langen R.; Warshel A. Why have mutagenesis studies not located the general base in Ras p21? II Nat. Struct. Biol., 1994, V. 1, pp. 476-484.

37. SondekJ.; Lambright D.G.; Noel J. P. ; Hamm H.E.; Sigler P.B. GTPase mechanism of G proteins from the 1.7 À crystal structure of transducin a-GDP-AlF4- II Nature, 1994, V. 372, pp. 276-279.

38. Schweins T.; Warshel A. Mechanistic Analysis of the Observed Linear Free Energy Relationships in p21Ras and Related Systems // Biochemistry, 1996, V. 35, pp. 1423214243.

39. Mildvan A.S. Mechanisms of signaling and related enzymes // Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1997, V. 29, pp. 401-416.

40. Scheidig A.J. ; Burmester C.; Goody R.S. The pre-hydrolysis state of p21Ras in complex with GTP: new insights into the role of water molecules in the GTP hydrolysis reaction of Ras-like proteins // Structure, 1999, V. 7, pp. 1311-1324.

41. Futatsugi /V.; HataM.; Hoshino T.; Tsuda M. Ab initio study of the role of Lysine 16 for the molecular switching mechanism of Ras protein p21 // Biophysical Journal, 1999, V. 77, pp. 3287-3292.

42. Glennon T.M.; Villa J.; Warshel A. How does GAP catalyze the GTPase reaction of Ras?: A computer simulation study // Biochemistry, 2000, V. 39, pp. 9641-9651.

43. Cheng H.; Sukal S.; Deng II; Leyh T.S.; Callender R. Vibrational structure of GDP and GTP bound to RAS: an isotope-edited FTIR study // Biochemistry, 2001, V. 40, pp. 40354043.

44. Allin С.; Gerwerl К. Ras catalyzes GTP hydrolysis by shifting negative charges from y-to (3-phosphate as revealed by time-resolved FTIR difference spectroscopy // Biochemistry, 2001, V. 40, pp. 3037-3046.

45. Mori K.; Hata M.; Neyci S.; Hoshino T. A study on the role Mg2+ in a Ras protein by MD simulation // Chem-Bio Informatics Journal, 2002, V. 2(4), pp. 147-155.

46. Katagiri D.; Hata M.; Itoh Т.; Neya S.; Hoshino T. Atomic-scale mechanism of the GTP-GDP hydrolysis reaction by the Gial protein II J. Phys. Chem. B, 2003, V. 107, pp. 3278-3283.

47. Shwki A.; WarshelA. Why does the Ras switch "break" by oncogenic mutations? // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004, V. 55, pp. 1—10.

48. Григоренко Б.JI.; Рогов А.В.; Князева М.А.; Исаева Е.В.; Немухин А.В. Моделирование механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата белковым комплексом RAS-GAP // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №1, с. 19-23.

49. Topol I.A.; Cachau R.E.; Nemukhin А. V.; Grigorenko B.L.; Burt S.K. Quantum chemical modeling of the GTP hydrolysis by the RAS-GAP protein complex // Biochimica et Biophysica Acta, 2004, V. 1700. pp. 125- 136.

50. Сингер M., БергП. Гены и геномы // Мир. 1998.

51. Лыоин Б. Гены //Мир. 1987.

52. Rodnina М. V., Раре Т., Fricke R. Wintermeyer W. Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption // Biochem. Cell Biol, 1995, V. 73, pp. 1221-1227.

53. Раре Т., Wintermeyer W., Rodnina M. Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminiacyl-tRNA to the A site of the E.coli ribosome // EMBOJ., 1998, V. 17, pp. 7490-7497.

54. Scarano G., Krab I.M., Bocchini V., Parmeggiani A. Relevance of histidine-84 in the elongation factor Tu GTPase activity and in poly(Phe) synthesis: its substitution by glutamine and alanine // FEBSLetters. 1995, V. 365, pp. 214-218.

55. Cool R.H., Parmeggiani A. Substitution of Histidine-84 and the GTPase Mechanism of Elongation Factor Tu// Biochemistry. 1991, V. 30. pp. 362-366.

56. Hilgenfeld R., Mesters J.R., Hogg T. Insights into the GTPase Mechanism ofEF-Tu from Structural Studies // The Ribosome: Struct., Fund., Antibiotics, and Cellular Interactions, 2000, V. 28, pp. 347-357.

57. Kjeldgaard M., Nissen P., Thirup S., NyborgJ. The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation // Structure, 1993, v. 1, pp. 35-50.

58. Daviter Т., Wieden H.-J., Rodnina M. V. Essential role of Histidine 84 in elogation factor Tu for the chemical step of GTP hydrolysis on the ribosome //./. Mol. Biol., 2003, V. 332, pp.689-699.

59. Vogeley L., Palm G.J., Mesters J. R., Hilgenfeld R. Conformational change of elongation factor Tu (EF-Tu) induced by antibiotic binding. Crystal structure of the complex between EF-Tu*-GDP and aurodox H J. Biol. Chem2001, V. 276, pp. 17149-17155.

60. Липкий B.M. Зрительная система. Механизмы передачи и усиления зрительного сигнала в сетчатке глаза // Соросовский образовательный эюурнал, 2001, Т.7, №9, с.2-8.

61. Pages F.; Deterre P.; Pfister С. Enhancement by Phosphodiesterase Subunits of the rate of GTP hydrolysis by transducine in bovine retinal rods // J. Biol. Chem., 1993, V. 268, № 35, pp. 26358-26364.

62. Udovichenko I.P.; CunnickJ.; Gonzalez K.; Yakhnin A.; Takemoto D.J. Protein kinase С in rod outer segments: effect of phosphorylation of the phosphodiesterase inhibitory subunit // Biochem. J., 1996, V.317. pp. 291-295.

63. Nekrasova E.R.; Berman D.M.; Rustandi R.R.; Hamm Ii.E.; Gilman A.G.; Arshavsky V. Y. Activation of transducin guanosine triphosphate by two proteins of the RGS family I I Biochemisty, 1997, V.36, pp. 7638-7643.

64. Faurobert E.; Hurley J.B. The core domain of a new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V.94, pp.2945-2950.

65. He W.; Cowan С. IV.; Wensel G. IV. RGS9, a GTPase Accelerator for Phototransduction //Neuron, 1998, V. 20, pp. 95-102.

66. Skiba P.N.; Yang C.S.; Huang Т.; Iluyunsu В.; Hamm H.E. The a-Helical domain of Gat determines specific interactions with regulator of protein signaling 9 // J. Biol. Chem., 1999, V.274, №13, pp. 8870-8878.

67. Slep K.C.; Kercher MA; He W.; Cowan C. W.; Wense! T.G.; Sigler P.B. Structural determinants for regulation of phosphodiesterase by a G protein at 2.0A // Nature, 2001, V. 409, pp. 1071-1077.

68. Noel J.P.; Hamm HE.; Sigler P.B. The 2.2A crystal structure of transducin-a complexed with GTPyS II Nature, 1993, V. 366, pp. 654-663.

69. SondekJ.; Lambrighl D.G.; Noel J.P.; Hamm HE.; Sigler P.B. GTPase mechanism of Gproteins from the 1.7-A crystal structure of transducin a*GDP*AlF4~ // Nature, 1994, V. 372, pp. 276-279.

70. Seewald M.J., Körner C., Wittinghofer A, Vetter I.R. RanGAP mediates GTP hydrolysis without an arginine finger // Nature, 2002, V. 415, pp. 662-666.

71. Klebe C, BischoffFR, Ponstingl II, Wittinghofer A. Interaction of the nuclear GTP-binding protein Ran with its regulatory proteins RCC1 and RanGAP 1 II Biochemistry, 1995, V. 34(2), pp. 639-647.

72. Haberland.J., Gerkes V. Conserved charged residues in the leucine-rich repeat domain of the Ran GTPase activating protein are required for Ran binding and GTPase activation. II Biochem. J., 1999, V. 343, pp. 653-662.

73. Görlich D., Seewald M.J., Ribbeck K. Characterization of Ran-driven cargo transport and the RanGTPase system by kinetic measurements and computer simulation 11 The EMBO Journal, 2003, Vol. 22, pp. 1088-1100.

74. Graziano M.P., Oilman A.G. Synthesis in .Escherichia coli of GTPase-deficient Mutants of Gsa* // The Journal of Biological Chemistry, 1989, V. 264, No. 26, pp. 1547515482.

75. Markby, D. W., Onrusl, R., Bourne, II. R. Separate GTP-binding and GTPase-activating domains of a G-alphasubunit // Science, 1993, V. 262, pp. 1895-1901.

76. Sunahara R.K., Tesmer J. J.G., Gihnan A.G., Sprang S.R. Crystal structure of the adenylyl cyclase activator Gsa // Science, 1997, V. 278, No. 5345, pp. 1943 1947.

77. Shnerb T, Lin N, Shurki A. What is the role of the helical domain of Gsalpha in the GTPase reaction? II Biochemistry, 2007, V. 46(38), pp. 10875-10885.

78. Hart P.A., Marshall C.J. Amino acid 61 is a determinant of sensitivity of rap proteins to the ras GTPase activating protein // Oncogene, 1990, V. 5(7), pp. 1099-1101.

79. Brinkmann T., Daumke O., Herbrancl U., Kuhlmann D., Stege P., Ahmadian M.R., Wittinghofer A. Rap-specific GTPase Activating Protein follows an Alternative Mechanism HJ. Biol. Chem., 2002, V. 277, No. 15, pp. 12525-12531.

80. Scrima A., Thomas G, Deaconescu D., Wittinghofer A. The Rap-RapGAP complex: GTP hydrolysis without catalytic glulamine and arginine residues // The EMBO Journal, 2008, V. 27, pp. 1145-1153.

81. Chakrabarti P.P., Suveyzdis Y., Wittinghofer A., Gerwerl K. Fourier Transform Infrared Spectroscopy on the Rap'RapGAP Reaction, GTPase Activation without an Arginine Finger//./. Biol. Chem., 2004, V. 279. No. 44. pp. 46226-46233.

82. PanX., Eathiraj S., Munson M., I.ambright D.G. TBC-domain GAPs for Rab GTPases accelerate GTP hydrolysis by a dual-finger mechanism // Nature, 2006, V. 442, pp. 303306.

83. Cavalli A., Carloni P. Enzymatic GTP hydrolysis: insights from an ab initio molecular dynamics H J. Am. Chem. Soc, 2002. V. 124, pp. 3763-3768.

84. Heesen Te H., Gerwerl K., Schlitier J. Role of the arginine finger in Ras*RasGAP revealed by QM/MM calculations // FEBS Lett., 2007, V. 581, pp. 5677-5684.

85. Grigorenko B.L., NemukhinA. V., Topol J.A., Cachau R.E., Burt S.K. QM/MM modeling the Ras-GAP catalyzed hydrolysis of guanosine triphosphate ¡/Proteins: Struct. Fund. Bioinf, 2005. V. 60, pp. 495-503.

86. Grigorenko B.L., Rogov A. V., Topol I.A., Burl S.K., Martinez H.M., Nemukhin A.V. Mechanism of the myosin catalyzed hydrolysis of ATP as rationalized by molecular modeling // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2007, V.104, pp. 7057-7061.

87. Bourne HR., Sanders D.A., McCormick F. The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions // Nature, 1990, V. 348, pp. 125-131.

88. Sprang S.R. G protein mechanisms: Insights from structural analysis // Annu. Rev. Biochem., 1997, V. 66, pp. 639-672.

89. Wittinghofer A. Phosphoryl transfer in Ras proteins, conclusive or elusive? // Trends Biochem Sei, 2006, V. 31, pp. 20-23.

90. Cleland W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms II Arch. Biochem. Biophys., 2005, V. 433, pp. 2-12.

91. Du X., Ferguson K., Sprang S. It A Method to Determine 180 Kinetic Isotope Effects in the Hydrolysis of Nucleotide Triphosphates II Anal Biochem, 2008, V. 372(2), pp. 213— 221.

92. DuX., Black G.E., Lecchi P., Abramson F.P., SprangS.R. Kinetic isotope effects in Ras-catalyzed GTP hydrolysis: evidence for a loose transition state // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2004, V. 101, pp. 8858-8863.

93. Grigorenko B.L., Rogov A. V., Neanikhin A. V. Mechanism of triphosphate hydrolysis in aqueous solution: QM/MM simulations in water clusters II JPhys Chem B, 2006, v. 110(9), pp. 4407-4412.

94. Vetter I.R., NowakC., Nishimolo T., Kuhlmann J., Wittinghofer A. Structure of a Ran-binding domain complexed with Ran bound to a GTP analogue: implications for nuclear transport II Nature, 1999, V. 398(6722), pp. 39-46.

95. Maesaki R., Ihara K., Shimizu T., Kuroda S., Kaibuchi K., Hakoshima T. The structural basis of Rho effector recognition revealed by the crystal structure of human RhoA complexed with the effector domain of PKN/PRK1 //Mol. Cell, 1999, V. 4, pp. 793803.

96. Rittinger K., Walker P.A., Eccle.sion J.F., Smerdon S.J., Gamblin S.J. Structure at 1.65 A of RhoA and its GTPase-activating protein in complex with a transition-state analogue // Nature, 1997, V. 389, pp. 758-762.

97. Jeffrey P.D., Bajorath J., Chang C. K, Yell on D., Hellstrom I., Iiellstrom K.E., Sheriff S. The x-ray structure of an anti-tumour antibody in complex with antigen // Nat. Struct Biol., 1995, V. 2, pp. 466-471.

98. Westheimer F.H. Monomeric metuphosphates // Chem. Rev., 1981, V. 81, pp. 313-326.

99. Eathiraj S., PanX., Ritacco C., Lambright D.G. Structural basis of family-wide Rab GTPase recognition by rabenosyn-5 // Nature, 2005, V. 436, pp. 415-419.