Моделирование механизмов ферментативных реакций гидролиза комбинированными методами квантовой и молекулярной механики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.17 ВАК РФ

На правах рукописи

РОГОВ Александр Владимирович

МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ГИДРОЛИЗА КОМБИНИРОВАННЫМИ МЕТОДАМИ КВАНТОВОЙ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕХАНИКИ

02.00.17 — математическая и квантовая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии Химического факультета Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель

доктор физико-математических наук Григоренко Белла Людвиговна

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук Тихонов Александр Николаевич

кандидат химических наук Авакян Виталий Гайкович

Ведущая организация

Институт проблем химической физики РАН

Защита состоится «21» декабря 2006 года в 16:15 в 337 аудитории Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501.001.50 при МГУ им. М. В. Ломоносова (119992, Москва, ГСП-2 Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ им. М. В. Ломоносова, Химический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан «20» ноября 2006 года. Учёный секретарь

диссертационного совета Д 501.001.50, кандидат химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Возрастающий интерес к моделированию реакций, происходящих в живых системах, обусловливается потребностями био- и нанотехнологий. Наиболее перспективной группой методов моделирования реакций ферментативного катализа на данный момент можно считать гибридные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Анализ энергетических профилей химических реакций, построенных с использованием методов КМ/ММ, позволяет детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения или молекул растворителя. Согласно основной идее приближения КМ/ММ центральная реакционная часть системы описывается квантовохимическими методами, а оставшаяся часть — в рамках подходов молекулярной механики.

Данная работа посвящена изучению важнейших химических реакций гидролиза, происходящих в биологических системах, с помощью комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. Для детального анализа выбраны: гидролиз пептидной связи трипсином, гидролиз аденозинтрифосфата (АТФ) белком миозином, а также гидролиз гуанозинтрифосфата (ГТФ), происходящий в белке р21газ.

Работа является актуальной, что обусловлено интересом к расчетам сечений поверхности потенциальной энергии для биохимических реакций, протекающих в сложном молекулярном окружении. В настоящее время становится возможным детально изучать важнейшие реакции гидролиза субстрата, проходящие в активном центре фермента, анализировать элементарные стадии этих реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые по результатам экспериментальных исследований. Понимание процессов, происходящих внутри клетки на молекулярном уровне, позволит, в частности, усовершенствовать критерии поиска активных компонентов новых лекарственных веществ.

Цель работы

Работа носит преимущественно методический характер: демонстрируется применение оригинального комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов подвижных эффективных фрагментов.

Целью работы являлось изучение механизмов важнейших биохимических реакций с помощью данного варианта метода КМ/ММ на основе рассчитанных энергетических профилей реакций гидролиза рассматриваемых молекулярных систем.

В рамках заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать реакции гидролиза пептидной связи трипсином. Построить энергетическую диаграмму химической реакции.

2. Изучить реакцию гидролиза трифосфатов в водной среде, включая исследование влияния катиона М§2+ на протекание реакции.

3. Моделирование реакции гидролиза аденозинтрифосфата в миозине. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить полученные результаты с результатами гидролиза метилтрифосфата в водной среде.

4. Изучить реакцию гидролиза гуанозинтрифосфата в белке р21газ. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить результаты с ранее полученными данными для реакции гидролиза ГТФ в белке р21газ-ОАР.

Научная новизна результатов

1. Моделирование механизмов химических реакций с помощью метода КМ/ММ позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза субстратов. С помощью использованной методики возможно

" отслеживать пути перемещения протонов, локализовать стационарные точки на поверхности потенциальной энергии, определять энергетические характеристики на отдельных стадиях реакций гидролиза.

2. Показано, что реакция гидролиза пептидной связи трипсином протекает по однопротонному механизму. Использование расширенной модели субстрата, при учете взаимодействия между аминокислотными остатками субстрата ТЬг11-С 1у 12-Рго 13-Суб 14-ЬуБ 15-А1а 16-А^ 17-Ие 18-11е 19 и аминокислотными остатками белка №840-РЬе41 -Сув92, 8ег190-Суз191-01п192-01и193-А8р194-8ег195, Бег214-ТЪр215-01у216, позволило точно описать активный центр фермента. Рассчитанная энергия активации на первой стадии реакции не превысила 10 ккал/моль.

3. Впервые с помощью комбинированного метода квантовой и молекулярной механики проведено моделирование эффекта индуцированного соответствия. Показано, что только за счет сжатия активного центра при встраивании в него

модельного субстрата может происходить снижение актив анионного барьера до 3 ккал/моль.

4. Впервые определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении протекает по механизму нуклеофильного замещения второго порядка Бм2 в присутствии катиона М£2+. В отсутствие М§2+ реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму Энергетические барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.

5. Результаты данной работы позволяют представить общую картину протекания реакций фосфорилирования в водном растворе и в присутствии белковой матрицы. Выявлена общая закономерность при рассмотрении реакций гидролиза АТФ и ГТФ в белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи Ру-Ор, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

6. Продемонстрирована практическая значимость комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов эффективных фрагментов: на примере различных биохимических реакций гидролиза, включая хорошо изученную экспериментально реакцию гидролиза пептидной связи трипсином и сложную реакцию гидролиза ГТФ белком р21гаэ. Эффективность метода подтверждается сравнением полученных результатов моделирования с результатами других теоретических исследований и с экспериментальными данными, накопленными по рассматриваемым системам. Это дает основание полагать, что метод может быть использован для определения механизмов других возможных реакций, протекающих в живых системах, и служить важнейшим источником данных о неизученных в настоящее время биохимических реакциях.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты данного исследования помогают детализировать механизм химической реакции и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза субстрата

трипсином облегчает создание новых ингибиторов и активаторов, а понимание механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке р21гав дает возможность влиять на процессы деления клеток. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых биологически активных соединений и лекарственных препаратов.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на V Ежегодной международной молодежной конференции, Институт Биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля (Москва, 2005), II Российской школе-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), Английской секции международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), Ш Международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006), 8-й Школе-конференции по квантовой и вычислительной химии им. В.А. Фока (Великий Новгород, 2004).

Результаты работы опубликованы в 12 печатных изданиях, в том числе в 6 тезисах докладов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 128 наименований. Работы изложена на 135 страницах и включает 99 рисунков и 17 таблиц.

Содержание работы

Первая глава посвящена описанию методик моделирования, включая методы квантовой химии, оригинального комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), а также методов классической механики -молекулярного докинга и молекулярной динамики, которые необходимы на начальных стадиях моделирования.

Методы квантовой химии (метод Хартри-Фока, метод теории возмущений второго порядка в варианте Меллера-Плессе) были использованы для обоснования

б

выбора базиса LANL2DZdp ЕСР для моделирования реакций гидролиза трифосфатов в воде и в белковом окружении.

Согласно общей идеи комбинированных КМ/ММ подходов [ Warshel A., Levitt М, 1976] в основе используемого метода лежит разделение рассматриваемой системы на две части, одна из которых рассматривается на квантовом уровне (КМ часть), а другая - в рамках методов молекулярной механики (ММ часть). В используемом в данной работе подходе, взаимодействие между КМ и ММ подсистемами описывается с помощью неэмпирического метода потенциалов эффективных фрагментов (ПЭФ). Метод потенциалов эффективных фрагментов [Gordon M.S. и др., 2001] был разработан для моделирования влияния сольватации в рамках дискретных моделей описания растворителя. Основная идея метода заключается в замене молекул растворителя эффективными фрагментами, потенциалы которых входят в одноэлектронную часть оператора Гамильтона молекулы растворенного вещества.

После обобщения теории ПЭФ [Grigorenko B.L. и др., 2002] данный вариант комбинированного метода КМ/ММ может быть представлен в виде следующей схемы: -

1. Молекулярно-механическая подсистема разбивается на фрагменты, типичные для белковых систем, геометрические параметры которых с определенной точностью можно считать фиксированными. Построенные эффективные фрагменты используются в рамках метода ПЭФ при описании влияния окружения па квантово-механическую подсистему.

2. Для каждого фрагмента неэмпирическими методами квантовой химии предварительно рассчитываются параметры электростатического и отталкивательного потенциалов. Электростатический потенциал представляется в виде мультипольного разложения вплоть до октупольных вкладов, а отталкивательный потенциал представляется в виде линейной комбинации гауссовых функций.

3. Взаимодействие между эффективными фрагментами описывается в рамках молекулярной механики. В ходе оптимизации геометрических параметров всей системы геометрия эффективных фрагментов остается фиксированной.

4. Конформационная нежесткость ММ подсистемы обеспечивается подвижными пептидными цепями.

Предложенный КМ/ММ метод реализован с использованием двух пакетов компьютерных программ: PC GAMES S [Грановский A.A.] и TINKER [Ponder J.W.].

На предварительных стадиях моделирования для оценки параметров фермент-субстратных комплексов были использованы методы молекулярного докинга и молекулярной динамики. Расчеты по молекулярному докингу были выполнены с программой Autodock3.0, позволяющей изучать связывание лиганда с белком, оценивать комплементарность (структурную и химическую) белка и лиганда, находить энергию связывания лиганда в комплексе с белком.

В нашей работе [1] были проведены оценки сродства ряда производных гуанозиннуклеотидов к активным центрам ГТФ-связывающих белков. Рассчитанные геометрические конфигурации комплексов служили источником информации об исходных координатах реагентов в ферментативных реакциях гидролиза гуанозинтрифосфата. В работе были проанализированы 48 структур фермент-субстратных комплексов.

Для исследования подвижности петли белка p21ras, содержащей один из ключевых аминокислотных остатков Glnól, который принимает непосредственное участие в реакции, был использован метод молекулярной динамики. Моделирование проводилось с помощью программы HyperChem7 с силовым полем AMBER99.

Во второй главе описано моделирование реакции гидролиза пептидной связи субстрата трипсином, относящегося к сериновым протеазам. Этот класс ферментов традиционно выделяется консервативной группой остатков аспарагиновой кислоты (Asp), гистидина (His) и серина (Ser), названной каталитической триадой. В главе приводятся литературные экспериментальные и теоретические сведения об этой реакции. В качестве результата моделирования приводится анализ реакции гидролиза с участием двух различным моделей, построенных на базе трипсинового панкреатического ингибитора.

Начальная геометрическая конфигурация атомов для первой и второй модели (соответственно, модели I и II) выбиралась на основе структуры трипсина с панкреатическим трипсиновым ингибитором, полученной методом рентгеноструктурного анализа (РСА, разрешение 1.9 A) [Marquart М. и др., 1983] из Брукхэвеновского банка данных белков (код структуры 2РТС) [Protein Data Bank, URL http://www.rcsb.org/pdb/].

Модель I представляла собой пептидную цепь CH3(NHCO-CH2)2-HN-CO-(CH2-NHCO)CH3 (соответствует остаткам CysI14-LysI15-AlaI16-ArgI17-IleI18 в структуре с кодом 2РТС) в качестве субстрата (жирным шрифтом показан фрагмент с разрываемой ферментом связью C-N), и все аминокислотные остатки фермента в радиусе примерно 15 Á от Оу Ser 195. На рис. 1 приведена часть молекулярной системы в рамках модели I, состоящая из остатков каталитической триады Asp 102, His57 и Ser 195, центральной части субстрата и одной молекулы воды, отнесенная к квантовой подсистеме. 40 атомов относились к КМ части, включая 5 замыкающих атомов водорода. ММ часть состояла из 621 атома, объединенных в 191 эффективный фрагмент. Граница КМ/ММ проходила через Са-Ср ковалентные связи Asp, His и Ser, С-С и C-N связи центральной части субстрата (см. рис. 1).

В качестве субстрата для модели II брали фрагмент панкреатического ингибитора (представляется последовательностью аминокислотных остатков ТЪг11-01у12-Рго13-Суз14-Ьу815-А1а16-А^17-11е18-11е19), более точно соответствующий структуре активного центра в отличие от субстрата модели I. В этом случае модельный субстрат образует дополнительные водородные связи с ферментом, что способствует его лучшей фиксации в белке. Модель II включала 812 атомов. На рисунке 2 представлена квантовая подсистема, состоящая из остатков каталитической триады Шз57 и 8ег195, пептидной цепи СНз-СОКН-СН(СНз)-СО-ГШ-СН(СНз)-ССЖН-СНз (жирным шрифтом выделен участок с разрываемой связью). Всего 56 атомов относились к КМ части, включая 5 замыкающих атомов водорода. ММ часть состояла из 756 атомов, обьединенных в 221 эффективный фрагмент.

н

Рис. 1. Квантовая часть модели I при расчетах реакции гидролиза субстрата трипсином.

Рис. 2. Квантовая подсистема модели II при расчетах реакции гидролиза субстрата трипсином.

Геометрическая оптимизация выполнялась ограниченным методом Хартри-Фока с базисом 6-31G (HF/6-31G) для КМ части, ММ взаимодействия описывались силовым полем OPLSAA (для модели I) и AMBER (для модели И). Оценка энергий в стационарных точках проводилась с учетом электронной корреляции методом теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка с базисом 6-31+G* (МР2/6-3I+G*//RHF/6-3IG). В рамках второй модели, для отдельной части системы, состоящей из 183 атомов, проводили дополнительный расчет методом МР2 в трех точках на ППЭ с базисом 6-31G* (с добавлением диффузных функций на атомы N, О) - МР2/6-3 l+G*//RHF/6-31G.

Реакция гидролиза пептидной связи начинается со стадии ацилирования. Кислород Serl95 атакует карбонильный атом углерода пептидной связи субстрата, что приводит к образованию тетраэдрического интермедиата (ТИ1). His57 выступает в качестве основания и принимает протон от Serl95. Образовавшийся ион His57-H+ стабилизируется водородной связью с Asp 102. Оксианион тетраэдрического интермедиата стабилизируется взаимодействием с NH группами главной цепи (оксианионовой дыры). Далее, тетраэдрический интермедиат разрушается, при этом His57-H* реагирует как кислота, амин уходит из сферы реакции, образуется ацил-ферментный комплекс. Следующий этап реакции - деацилирование, повторяет описанную выше последовательность стадий: вода атакует ацилферментный

комплекс, и с участием Шз57 образуется второй тетраэдрический интермедиат. При разрушении интермедиата образуется Бег195 и продукт реакции - карбоновая кислота.

Результаты расчета энергий методом МР2/6-314<3* для найденных стационарных точек для модели I приведены в таблице 1 в первой строке. Разница энергий в 38 ккал/моль между ТИ1 и фермент-субстратным слишком велика, учитывая, что экспериментальная энергия активации на стадии ацилирования оценивается около 15 ккал/моль [Б^а/ЫМ. и др., 2000].

Таблица 1. Относительные энергии (в ккал/моль) для найденных стационарных точек, рассчитанные методом КМ(МР2/6-31 ^*)/ММ(ОРЬ8АА)._______

¡«ШшюШШШШШ;« Till шш

Весь цикл 0 38.0 26.2 34.0 40.7 36.0 15.9

Стадия ацилирования без включения молекулы воды в КМ части, оптимизация НБ/б-ЗЮ 0 28.5 (25.9)* 20.4 - - - -

* - Оптимизация с базисом 6-31+G*

Большое отличие в энергии, полученной методом КМ/ММ, от экспериментальной величины, по всей видимости, связано с несоответствием модельного субстрата и активного центра фермента. Поэтому, мы использовали другую модель (модель II) для проверки данной гипотезы.

Для второй модели серия расчетов включала только стадию ацилирования. Полученные энергии, соответствующие стационарным точкам на поверхности потенциальной энергии представлены в таблице 2.

Таблица 2. Энергии (в ккал/моль) переходного состояния (ПС) и интермедиата (ТИ1)

„ - - » - ч» . -'Система " >" 4 ' "" \ • ", Ч«ЙС?Ц ГИ1

56 атомов KM(HF/3-21 G)/221 ЭФ ММ(AMBER) 9.6 -6.4

183 атома МР2/6-31G++//HF/3-21G 8.2 -18.0

56 атомов KM(HF/6-31 G)/221 ЭФ MM(AMBER) 6.6 -6.6

56 атомов КМ(МР2/'6-31 +G*//HF/6-31 G)/221 ЭФ MM(AMBER) 7.9 -11.1

В таблице 3 приведены значения некоторых межъядерных расстояний для первой и второй модели для структуры фермент-субстратного комплекса, а также, в последнем столбце,1 значения этих параметров, полученные методом РСА. Сжатие активного Центра трипсина в случае модельного субстрата II приводит к снижению энергетического барьера.

Таблица 3. Геометрические параметры в А для модельных систем I и II при описании

реакции гидролиза субстрата трипсином.

йШЩШё "i «*>•» л...-; .„*. . . ^ттж-* iffill iwsKm-'i

R(051 Asp 102 - N5 His57) 2.85 2.85 2.86 2.62

R(Oy Serl95 -Ns His57) 2.86 2.60 2.64 2.62

R(Oy Ser 195 - СкаРбонильн.) 2.95 2.28 2.42 2.68

R(Ne HÍS57 - Nnennw. cv6ct) 4.38 3.92 4.12 4.02

Результаты моделирования показывают, что стадия ацилирования требует больше энергетических затрат, нежели стадия деацилирования. Наиболее энергозатратной стадией является переход от фермент-субстратного комплекса к тетраэдрическому интермедиату. Присутствие молекулы воды вблизи реакционного центра на стадии ацилирования приводит к некоторой дестабилизации тетраэдрического интермедиата (модель I) по сравнению с реакцией без участия воды. Полученная энергия активация на стадии ацилирования для второй модели, не превышающая 10 ккал/моль, хорошо согласуется с экспериментальными данными.

В этой главе также приведена оценка влияния субстрата на активный центр фермента. Если рассмотреть многообразие структур сериновых протеаз, то можно определить следующую закономерность: расстояние NE.H¡s-Oser Для «свободных» ферментов, как правило, на 0,1-0,2 Á больше, чем в комплексах фермента с ингибитором. То есть, связывание с субстратом приводит к заметному сжатию активного центра, тем самым подтверждается принцип индуцированного соответствия.

Мы оценили насколько важны могут быть эффекты сжатия фермента при связывании с субстратом. Расстояние Ns.HiS-Oser было принято равным наиболее характерному для системы без субстрата - 2.7 Á. Фиксируя это расстояние, мы оптимизировали все геометрические параметры фермент-субстратного комплекса (KM: RHF/6-31G, MM: OPLSAA). Расстояние N£.H¡s-HSer оказалось равным 1,76 А. Далее, расстояние N6.H¡s-Oser было принято равным 2.6 Á для сжатой модели фермент-субстратного комплекса, как результат связывания фермента и субстрата. Проведена оптимизация геометрических параметров структуры методом КМ/ММ. В полученной структуре расстояние между NS.H¡S и HSer оказалось равным 1,65 А. Перенос протона от Ser к His, который приводит к образованию тетраэдрического интермедиата,

отвечает за лимитирующую стадию всего каталитического цикла сериновых протеаз \Hedstrom Ь., 2002]. Поэтому, разница в энергии между точкой на ППЭ с растянутой водородной связью (1,76 А) и стационарной точкой со связью N5.^ и Н5ег равной 1,65 А, может оценивать ту долю энергии активации, на которую может произойти уменьшение энергетического барьера на стадии ацилирования в результате связывания субстрата ферментом. Расчеты методом КМ/ММ показывают снижение энергетического барьера на 3 ккал/моль за счет подобного сжатия. Принимая во внимание, что общая энергия активации на первой стадии оценивается в 9,6 ккал/моль [2], наш анализ показывает, что разница в 3 ккал/моль в энергии активации может приводить к изменению константы скорости реакции на 3 порядка.

В третьей главе описано моделирование реакции гидролиза метилтрифосфата (МТФ) в водной среде. Моделирование реакции гидролиза метилтрифосфата позволяет установить реперную точку для оценки каталитического эффекта ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) и аденозинтрифосфата (АТФ). Сравнение результатов моделирования реакции гидролиза в белковом окружении с похожей реакцией в водном окружении позволяет прояснить специфическую функцию белковой матрицы.

При моделировании реакций с участием трифосатов (МТФ, АТФ и ГТФ) был выбран определенный базис, отвечающий требованиям по точности и времени расчета. Рассмотрев несколько базисов на примере моделирования простой реакции образования Н2РО4" из РО3" с НгО, мы остановили свой выбор на базисе ЬАКЬ2В2ёр ЕСР [Нау Р. 3., \Vadt IV. Я., 1985] с соответствующим псевдопотенциалом для атома фосфора. Использование базиса ЬАКЬ2Б2с!р ЕСР позволило обеспечить точность, сопоставимую с точностью, полученной с использованием базиса б-ЗП-н-С"*, при существенно меньших временных затратах.

Для моделирования реакции гидролиза метилтрифосфата рассматривали две основные модели:

1. Модель с участием иона метилтрифосфата, пяти молекул воды, и 75 эффективных фрагментов - молекул воды в молекулярно-механической части - модель I (рис. 3).

2. Модель с участием иона метилтрифосфата, иона магния, семи молекул воды, и 73 эффективных фрагмента — молекул воды в молекулярно-механической части -модель П (рис. 4).

Все расчеты проведены с использованием функционала плотности ВЗЬУР. Кроме того, были выполнены расчеты с использованием методов теории возмущений второго порядка в варианте Меллера-Плессе.

Для модели без присутствия иона в системе реакция протекает в две стадии. На первой стадии реакции вода на рис. 3), выступая в роли нуклеофила, атакует атом фосфора. Такая реакции становится возможной при раскрытии «зонта» из атомов кислорода на у-фосфатной группе (происходит растягивание связи Ор - Рт до 2.21 А в первом переходном состоянии). Далее, происходит окончательный разрыв связи Ор - Ру, и образование новой связи между кислородом каталитической воды Он» и Ру. Эта стационарная точка соответствует структуре интермедиата в данной реакции. На заключительной стадии реакции протон от каталитической молекулы воды переходит на соседнюю молекулу воды и по цепочке водородных связей передается на кислород у-фосфатной группы, образуя неорганический фосфат Н2РО4" в качестве продукта реакции.

Рис. 3. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для модели I реакции гидролиза метилтрифосфата в воде. Расстояния приведены в А. Тонкими линиями показаны молекулы

воды из ММ-части.

Для модели с участием катиона М§2+ в реакции механизм несколько отличается. На первой стадии также происходит увеличение расстояния Ор - Рг и предоставляется возможность каталитической молекуле воды на рис. 4)

нуклеофильно атаковать у-фосфор. При расстоянии Ор - Рг равном 2.51 А фиксируется переходное состояние. Интермедиат в реакции на последующей стадии зафиксировать не удалось, минимизация геометрии приводила к продукту реакции. Присутствие катиона приводит к изменению электронной плотности на у-

фосфоре в ходе реакции, способствуя образованию ковалентной связи с кислородом каталитической воды.

Рис. 4. Геометрическая конфигурация реагентов для модели II реакции гидролиза метшприфосфата в воде. Показана только КМ-часть. Расстояния приведены в А. Расстояния от иона до координационной воды составляет 2.07,2.09, 2.09 и 2.13 А, соответственно.

На энергетической диаграмме на рис. 5 приведено сравнение результатов расчетов, выполненных различными методами для моделей I и И.

Стадия отщепления у-фосфатной группы и нуклеофильная атака воды является лимитирующей. Энергетический барьер в случае реакции в присутствии катиона М§2+ снижается и составляет 11.1 ккал/моль (метод ВЗЬУР). Расчет энергии методом теории возмущений второго порядка в варианте Меллера-Плессе в стационарных точках, найденных методом ВЗЬУР дает оценку энергетического барьера - 15.9

ккал/моль. Суммарный энергетический эффект реакции составляет -8.6 ккал/мольгв случае реакции в присутствии катиона Г^2+ и -16.4 ккал/моль в случае его отсутствия в приближении теории функционала плотности, и -3.9 ккал/моль и -13.3 ккал/моль, соответственно, в приближении теории возмущений второго порядка.

Рис. 5. Энергетическая диаграмма для реакции гидролиза метилтрифосфата в присутствии иона Mg2+ и в его отсутствие.

В четвертой главе описано моделирование реакции гидролиза аденозинтрифосфата и гуанозинтрифосфата в белках. Реакция гидролиза АТФ рассматривается на примере моторного белка миозина. Гидролиз протекает в активном центре, образованном молекулой АТФ, катионом магния Mg2+ и аминокислотными остатками, связанными с АТФ, магнием и реакционными молекулами воды водородными связями: Glu470, Phe469, Gly469, Gly468, Ala467, Ile466, Asp465, Thrl84, Arg247, Ser245, Asn244. Необходимую для протекания реакции конфигурацию реакционного центра обеспечивают два фактора: катион магния Mg2+, который координирует атомы кислорода трифосфата, а также т.н. «солевой мостик», образованный водородными связями между аминокислотными остатками двух полипептидных цепей Glu470 и Arg247 [Onishi Н. и др., 2004]. Реакцию гидролиза ГТФ рассматривали на примере двух различных белков: p21ras и p21ras-GAP. Белок p21ras является центральным регулятором процессов передачи клеточных сигналов внутрь клетки, относится к классу мембранных G-белков (GTP-binding protein - ГТФ-связывающие белки), основная функция которых заключается в передаче сигнала от внешних рецепторов на эффекторные системы плазматической

мембраны. Второй белок представляет собой комплекс белка p21ras и активирующего белка GAP (GTP-activating protein - ГТФ-активирующий белок), который помогает белку p21ras принять конформацию, удобную для гидролиза ГТФ, но непосредственно не участвует в реакции гидролиза.

Для моделирования реакции гидролиза АТФ в данной работе использована структура молекулы миозина из Брукхэвеновского банка данных белков с кодом 1VOM [Smith С.А., Rayment /., 1996]. Выбор обусловлен значительным количеством теоретических и экспериментальных данных, относящихся к этой структуре. В модель включены атомы белка (115 аминокислотных остатков) и молекулы воды, находящиеся на расстоянии не более 16 А от Рг В местах разрывов химических связей добавлены концевые СНз-группы для насыщения свободной валентности граничных атомов. Квантовая часть состояла из 47 атомов, молекулярно-механическая часть включала 550 эффективных фрагментов. Расчеты выполнены комбинированным методом квантовой и молекулярной механики. Расчеты для квантовой части выполнялись с использованием метода Хартри-Фока с базисом LANL2DZdp ЕСР.

Для структуры, соответствующей фермент-субстратному комплексу (рис. 6), расстояние Р7 - Ор составило 1.78 А, а расстояние между Рт и кислородом каталитической воды Watl - 2.70 А. Отметим, что расстояние PY - Op для системы АТФ/миозин такое же, что и для системы ГТФ/Ras-GAP [Topol I.A. и др., 2004], тогда как соответствующее расстояние для системы метилтрифосфата в воде составляет 1.69 А. То есть, в системе АТФ/миозин, также как и в системе ГТФ/Ras-GAP, связывание субстрата с белком приводит к ослаблению связи Ру - Ор по сравнению с похожей реакцией в водном растворе. Данные анализа натуральных связевых орбиталей подтверждают это предположение: число заселенности несвязывающей орбитали o*(PY-Op) почти в два раза выше (0.24 а.е.), чем числа заселенности других связывающих орбиталей о*(Р-0) АТФ, что приводит к ослаблению именно Рг-Ор связи.

Согласно расчетам, реакция протекает следующим образом (жирными стрелками на рис. 4 обозначены направления переносов частиц): вода Watl нуклеофильно атакует у-фосфатную группу АТФ (начальное расстояние 2.70 А), и протон переходит на молекулу воду Wat2 вдоль водородной связи. Геометрическая

конфигурация переходного состояния характеризуется почти плоским углом РОз, группа РО3 находится на достаточном расстоянии от АДФ (2.24 А по сравнению с 1.78 А в фермент-субстратном комплексе). В стационарной точке, соответствующей продуктам реакции, образуются АДФ + НР042", а протон переходит на аминокислотный остаток С1и459. Можно предположить, что полученная структура является промежуточной во всем процессе гидролиза. Вероятно, что временное протонирование группы С1и459 должно привести к раскрытию солевого мостика А^238-С1и459, что приведет к выходу неорганического фосфата (предположительно в форме Н2РО4") из активного центра.

Рис. 6. Геометрическая конфигурация фермент-субстратного комплекса АТФ/миозин. В расчетах, фосфатные группы АТФ, катион магния, боковые цепи Glu459 и Arg238, а также две

молекулы воды Watl и Wat2 включены в КМ часть.Расстояния приведены в ангстремах. Значения, приведенные в скобках, относятся к кристаллической структуре с PDB-кодом 1VOM.

Энергетический барьер при образовании переходного состояния составляет 4 ккал/моль, а продукты реакции (АДФ + НР042") лежат на 3.5 ккал/моль ниже стационарной точки, соответствующей структуре фермент-субстратного комплекса.

Отметим, что теоретически полученные результаты находятся в соответствии с экспериментальными наблюдениями, включая эксперименты по кислородному обмену и эксперименты, подтверждающие роль солевого мостика А^238-С1и459. Также отметим, что данная работа является первым теоретическим моделированием реакции гидролиза АТФ в миозине, в результате которой получены приемлемые значения для энергетических барьеров.

Для реакции гидролиза ГТФ в белке р21гав начальная геометрическая конфигурация атомов структуры белка р21газ и ГТФ выбиралась, используя координаты структуры белкового комплекса р21газ-ОррЫр, полученного методом рентгеноструктурного анализа (РСА, разрешение 1.35 А) [Рш Е.Г. и др., 1990] из Брукхэвеновского банка данных белков (код структуры 5р21).

С помощь метода молекулярного докинга проводили сравнение стабильностей комплекса белок р21газ - ГТФ с разными конформациями цепи аминокислотных остатков 59-70 в белке р21газ. Сравнительными критериями, определяющими однозначность найденного положения, служили вероятность связывания и стандартное отклонение. Показано, что вероятность связывания для конформации, соответствующей положению цепи аминокислотных остатков, аналогичным для структуры с кодом 5р21, и конформации с развернутой петлей Ь4, равна 99 и 97%, соответственно. При этом, стандартное отклонение от данных РСА в обоих случаях равно О.ЗбА. Таким образом, мы показали равноценность связывания молекулы ГТФ в активном центре белка р21газ при различных конформациях цепи аминокислотных остатков 59-70.

Для расчетов методом КМ/ММ использовали модель, включающую ГТФ, две молекулы воды, катиона магния и аминокислотные остатки белка р21газ в радиусе примерно 20 А от атома фосфора у-фосфатной группы ГТФ. В КМ часть было включено 33 атома, включая 2 замыкающих атома углерода и 6 замыкающих атомов водорода. ММ часть состояла из 1464 атомов, объединенных в 443 эффективных фрагментов. На рисунке 7 приведена оптимизированная структура реагентов для реакции гидролиза ГТФ белком р21газ.

Рис. 7. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для системы ГТФ/р21газ.

Расстояния приведены в ангстремах.

Было найдено, что реакция протекает в две стадии. На первой стадии происходит отщепление у-фосфатной группы ГТФ под действием окружения активного центра белка. Действие аминокислотных остатков Gln61 и Lysl6 и молекулы воды приводит к перераспределению зарядов на у- и Р-фосфатных группах ГТФ. Увеличивается расстояние между фосфором у-фосфатной группы и мостиковым кислородом. Одновременно с отщеплением фосфатной группы наблюдается «разворачивание» торсионного угла фосфата. Расстояние PY - Ор изменяется с 1.73 Á в структуре реагентов до 2.4 А в структуре первого переходного состояния и составляет 3.16 А для геометрической конфигурации интермедиата.

На следующих стадиях реакции вода нуклеофильно атакует у-фосфор, при этом происходит перенос двух протонов: с реакционной воды на соседнюю молекулу воды и с соседней молекулы на аминокислотный остаток Gln61. В промежуточной стадии образуется НРО42". В завершение реакции, протон от аминокислотного остатка Glnól по цепочке водородных связей переходит на НР042", образуя продукт реакции Н2Р042"

На рис. 8 сопоставлены энергетический профиль пути реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras с профилем пути реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras-GAP [Grigorenko B.L. и др., 2005]. В обеих системах, реакция гидролиза протекает по сходному механизму.

20 п

15 1050-5-10-

16.0

Реагенты ПС1 Интермедиат ПС2 Продукты

Координата реакции

Рис. 8. Сравнение профилей потенциальной энергии реакции гидролиза ГТФ в белках р21гав (показано черным цветом) и р21газ-ОАР (показано серым цветом).

Реакция гидролиза в белке р21газ-САР протекает похожим образом. На первой стадии происходит отщепление у-фосфатной группы ГТФ под действием окружения активного центра белка. При расстоянии Ру-Ор равном 2.3А была найдена ссдловая точка на потенциальной поверхности, соответствующая структуре переходного состояния. Далее на ППЭ найдена структура интермедиата, состоящая из молекулы воды, аминокислотного остатка С1п61, заряженной частицы РОз" и молекулы ГДФ.

На второй стадии реакции вода нуклеофильно атакует у-фосфор, при этом происходит перенос двух протонов: протона от реакционной воды на атом кислорода аминокислотного остатка С1п61 и, одновременно, протона от атома азота остатка С1п61 на кислород у-фосфатной группы. В ходе второй стадии образуется второе переходное состояние, которое представляет собой восьмичленное кольцо. По завершению реакции протон с остатка С1п61 переходит на ближайший кислород заряженной частицы РОз'. Протон от молекулы воды переходит на карбонильный кислород остатка С1п61. В результате образуются продукты реакции, состоящие из неорганического фосфата Н2РО4", молекулы ГДФ и аминокислотного остатка С1п61 в таутомерной форме. Несмотря на то, что таутомерная форма остатка 01п61 является

неустойчивой, в данном окружении ее образование энергетически выгодно. Катион магния в ходе реакции не меняет своего положение. Это свидетельствует о том, что основная роль магния заключается в координировании двух кислородов у- и р-фосфатных групп ГТФ. ■

Основное отличие между этими белками заключается в наличии аминокислотного остатка Ащ789 в комплексе р21газ-САР (рис. 9). Основанная роль остатка А^789 заключается в координировании остатка С1п61 в оптимальном положении для реакции гидролиза. Поэтому в отсутствие остатка А^789 перенос протонов осуществляется с большим барьером. Энергетический эффект реакции гидролиза ГТФ в белке р21гаэ меньше, чем в белке р21газ-ОАР. Это свидетельствует о том, что аминокислотное окружение белка р21газ-ОАР лучше компенсирует перераспределение зарядов в активном центре при образовании продуктов гидролиза.

, Рис. 9. Положение аминокислотного остатка А^789 в структуре реагентов для системы ГТФ/р21 гаэ-ОАР. Показана КМ-часть без замыкающих атомов водорода. Овалом обозначен ■: • аминокислотный остаток ТЬг35, связывающий молекулу воды водородной связью.

Основные результаты и выводы

1. Комбинированным методом квантовой и молекулярной механики с подвижными эффективными фрагментами построен энергетический профиль пути реакции гидролиза модельного субстрата в активном центре сериновых протеаз. Аминокислотные остатки субстрата ТИг 11 -С1у 12-Рго 13-Суэ 14-ЬуБ 15-А1а 16-А^ 17-11е18-11е19 и аминокислотные остатки белка Н1з40-РЬе41 -Суз92, 8ег190-Суз191-01п192-С1и193-Азр194-8ег195, 8ег214-ТЬр215-С1у216 вносят основной вклад во взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Методом КМ/ММ получена оценка энергии активации 9.6 ккал/моль для стадии ацилирования.

2. В соответствии с феноменологическим принципом индуцированного соответствия показано, что сжатие активного центра фермента трипсина при встраивании субстрата может способствовать снижению активационного барьера примерно на 3 ккал/моль.

3. По результатам КМ/ММ моделирования определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении в присутствии катиона М§2+ протекает по механизму нуклеофильного замещения второго порядка В отсутствие М§2+ реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму Бц!. Энергетические барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.

4. Методом КМ/ММ построен профиль пути реакции гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) в миозине. Предложен механизм каталитического действия миозина в реакции гидролиза АТФ с непосредственным участием солевого мостика Аг§-С1и.

5. Построен энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в белке р21газ. Сопоставлены результаты, полученные для реакции гидролиза ГТФ, протекающей в белках р21т и р21газ-ОАР.

6. Отмечены общие черты для реакций гидролиза АТФ и ГТФ в соответствующих белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи Р-О, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

Основные публикации по теме диссертации

1. Шадрина М.С., Рогов А.В., Бравая КБ., Немухин А.В. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №6, с. 363-369.

2. Nemukhin А. V., Grigorenko B.L., Rogov А. К, Topol I.A., Burt S.K. Modeling of serine protease: prototype ■ reactions with the flexible effective fragment potential quantum mechanical/molecular mechanical method // Theor.Chem.Accounts, 2004, V.l 11, pp. 36-48.

3. Григоренко Б.Л., Рогов A.B., Князева M.A., Исаева Е.В., Немухин А.В. Моделирование механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата белковым комплексом RAS-GAP // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №1, с. 19-23

4. Grigorenko В. L., Rogov А. V.,.Nemukhin А. К Mechanism of Triphosphate Hydrolysis in Aqueous Solution: QM/MM Simulations in Water Clusters // J. Phys. Chem. В., 2006, V. 110(9), pp. 4407-4412.

5. Немухин A.B., Григоренко Б.Л., Епифановский E.M., Рогов А.В. Моделирование механизмов ферментативных реакций комбинированными методами квантовой и молекулярной механики II Биомедицинская химия, 2004, том 50, Прил. №1, с. 49-55.

6. Рогов А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С., Бравая КБ., Доброгорская Я.И., Немухин . А.В. Моделирование ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата // II Российская школа-конференция "Молекулярное моделирование ,в xjumuu, биологии и медицине", Саратов, 13-16 октября, 2004. -Сборник тезисов докладов, с, 19.

<t

7. Рогов А.В., Аносова Е.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Моделирование механизмов реакций гидролиза трифосфатов II V Ежегодная международная молодежная конференция Института Биохимической физики РАН им. Н.М. Эмануэля, Москва, 14-16 декабря, 2005. - Сборник тезисов докладов, с. 96-97.

8. Rogov A. V. Quantum mechanical/molecular mechanical modeling of hydrolysis reaction of peptide bonds by trypsin // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (английская секция) «Ломоносов-2004», Москва, апрель, 2004. - Сборник тезисов докладов, с. 14.

9. Рогов А.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Моделирование реакции гидролиза пептизной связи трипсином методами квантовой и молекулярной механики // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», Москва, апрель, 2004. - Сборник тезисов докладов, с. 149.

10. Grigorenko B.L., Rogov A.V., Shadrina M.S., Anosova E.V. The role of hydrogen bonding in triphosphate hydrolysis in proteins and solutions // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, Kyiv, Ukraine, May 15-21, 2006.- Book of abstracts, p.47.

11. Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Rogov A.V., Epifanovsky E.M. Modeling chemical reactions in proteins by the flexible effective fragment quantum mechanical - molecular mechanical (QM/MM) method // 8th session of the V.A. Fock school on quantum and computational chemistry, Novgorod the Great, April, 2004. - Book of abstracts, # 879.

12. Nemukhin A.V., Gariev LA., Rogov A.V., Varfolomeev S.D. Serine hydrolases catalytic site: geometry invariants and modeling catalytic activity // Mendeleev Communications, 2006. - принята к печати.

Принято к исполнению 16/11/2006 Исполнено 17/11/2006

Заказ №912 Тираж: 200 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Введение.

Глава 1. Используемые методы молекулярного моделирования

1.1.Методы квантовой химии.

1.2.Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики.

1.2.1. Метод потенциалов эффективных фрагментов.

1.2.2. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики на основе потенциалов эффективных фрагментов.

1.3.Метод молекулярного докинга.

Ы.Метод молекулярной динамики.

Глава 2. Моделирование реакции гидролиза пептидной связи трипсином

2.1.Экспериментальные сведения о реакциях с участием сериновых протеаз.

2.1.1. Строение активного центра сериновых протеаз.

2.1.2. Механизм реакции с участием сериновых протеаз.

2.1.3. Кинетика реакций с участием сериновых протеаз.

2.1.4. Инактивация и ингибирование фермента.

2.1.5. Оценки энергии активации в реакциях с участием сериновых протеаз.

2.2. Моделирование реакций гидролиза пептидной связи сериновыми протеазами.

2.3. Моделирование реакции методом КМ/ММ.

2.4. Результаты расчетов.

2.4.1. Моделирование реакции гидролиза с участием модели 1.

2.4.2. Моделирование реакции гидролиза с участием модели II.

2.4.3. Оценка влияния субстрата на активный центр фермента.

Глава 3. Моделирование реакции гидролиза метилтрифосфата в воде

3.1. Предпосылки к изучению реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

3.2. Выбор базиса для моделирования химических реакций с участием фосфатных групп.

3.3. Построение моделей.

3.4. Результаты расчетов.

3.4.1. Моделирование реакции с участием модели 1.

3.4.2. Моделирование реакции с участием модели II.

Глава 4. Моделирование реакций гидролиза трифосфатов в биологических системах

4.1. Особенности протекания реакции гидролиза АТФ в миозине.

4.1.1. Структура и свойства миозина.

4.1.2. Гидролиз аденозинтрифосфата.

4.2. Описание движения миозина вдоль актина с помощью кинетической модели.

4.3. Обзор теоретических и экспериментальных работ, посвященных реакции гидролиза АТФ.

4.4. Выбор модельной системы для реакции гидролиза АТФ.

4.5. Результаты расчетов.

4.6. Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке р21 ras.

4.6.1. Строение белка р21 ras.

4.6.2. Исследование механизмов гидролиза ГТФ в белках р21 ras и p21ras-GAP.

4.7. Методики моделирования реакции гидролиза ГТФ.

4.7.1. Методика молекулярного докинга.

4.7.2. Методика молекулярной динамики.

4.7.3. Построение КМ/ММ модели.

4.8. Результаты моделирования реакции гидролиза ГТФ.

4.8.1. Сравнение положения Gln61 в белках p21ras и p21ras-GAP.

4.8.2. Молекулярный докинг.

4.8.3. Молекулярная динамика.

4.8.4. Расчеты КМ/ММ.

4.8.5. Сравнение механизмов гидролиза ГТФ в белках р21 ras и p21ras-GAP.

Выводы.

Возрастающий интерес к моделированию реакций, происходящих в живых системах, обусловливается потребностями био- и нанотехнологий. Наиболее перспективной группой методов моделирования реакций ферментативного катализа на данный момент можно считать гибридные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Анализ энергетических профилей химических реакций, построенных с использованием методов КМ/ММ, позволяет детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения или молекул растворителя. Согласно основной идее приближения КМ/ММ центральная реакционная часть системы описывается квантовохимическими методами, а оставшаяся часть - в рамках подходов молекулярной механики.

Данная работа посвящена изучению важнейших химических реакций гидролиза, происходящих в биологических системах, с помощью комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. Для детального анализа выбраны: гидролиз пептидной связи трипсином, гидролиз аденозинтрифосфата (АТФ) белком миозином, а также гидролиз гуанозинтрифосфата (ГТФ), происходящий в белке p21ras.

Работа является актуальной, что обусловлено интересом к расчетам сечений поверхности потенциальной энергии для биохимических реакций, протекающих в сложном молекулярном окружении. В настоящее время становится возможным детально изучать важнейшие реакции гидролиза субстрата, проходящие в активном центре фермента, анализировать элементарные стадии этих реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые по результатам экспериментальных исследований. Понимание процессов, происходящих внутри клетки на молекулярном уровне, позволит, в частности, усовершенствовать критерии поиска активных компонентов новых лекарственных веществ.

Цель работы

Целью работы являлось изучение механизмов важнейших биохимических реакций с помощью комбинированного метода квантовой и молекулярной механики на основе рассчитанных энергетических профилей реакций гидролиза рассматриваемых молекулярных систем.

В рамках заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать реакции гидролиза пептидной связи трипсином. Построить энергетическую диаграмму химической реакции.

2. Изучить реакцию гидролиза трифосфатов в водной среде, включая исследование влияния катиона Mg2+ на протекание реакции.

3. Моделирование реакции гидролиза аденозинтрифосфата в миозине. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить полученные результаты с результатами гидролиза метилтрифосфата в водной среде.

4. Изучить реакцию гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21ras. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить результаты с ранее полученными данными для реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras-GAP.

Научная новизна результатов

1. Моделирование механизмов химических реакций с помощью метода КМ/ММ позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза субстратов. С помощью использованной методики возможно отслеживать пути перемещения протонов, локализовать стационарные точки на поверхности потенциальной энергии, определять энергетические характеристики на отдельных стадиях реакций гидролиза.

2. Показано, что реакция гидролиза пептидной связи трипсином протекает по однопротонному механизму. Использование расширенной модели субстрата, при учете взаимодействия между аминокислотными остатками субстрата Thrl l-GIyl2-Prol3-Cysl4-Lysl5-AIal6-Argl7-IIel8-IIel9 и аминокислотными остатками белка His40-Phe41-Cys92, Serl90-Cysl91-Glnl92-Glul93-Aspl94-Serl95, Ser214-Thp215-Gly216, позволило точно описать активный центр фермента. Рассчитанная энергия активации на первой стадии реакции не превысила 10 ккал/моль.

3. Впервые с помощью комбинированного метода квантовой и молекулярной механики проведено моделирование эффекта индуцированного соответствия. Показано, что только за счет сжатия активного центра при встраивании в него модельного субстрата может происходить снижение активационного барьера до 3 ккал/моль.

4. Впервые определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении протекает по механизму нуклеофильного замещения второго порядка Sn2 в присутствии катиона Mg . В отсутствие Mg реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму SnI. Энергетические барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.

5. Результаты данной работы позволяют представить общую картину протекания реакций фосфорилирования в водном растворе и в присутствии белковой матрицы. Выявлена общая закономерность при рассмотрении реакций гидролиза АТФ и ГТФ в белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи PY-Op, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

6. Продемонстрирована практическая значимость комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов эффективных фрагментов: на примере различных биохимических реакций гидролиза, включая хорошо изученную экспериментально реакцию гидролиза пептидной связи трипсином и сложную реакцию гидролиза ГТФ белком p21ras. Эффективность метода подтверждается сравнением полученных результатов моделирования с результатами других теоретических исследований и с экспериментальными данными, накопленными по рассматриваемым системам. Это дает основание полагать, что метод может быть использован для определения механизмов других возможных реакций, протекающих в живых системах, и служить важнейшим источником данных о неизученных в настоящее время биохимических реакциях.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты данного исследования помогают детализировать механизм химической реакции и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза субстрата трипсином облегчает создание новых ингибиторов и активаторов, а понимание механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21ras дает возможность влиять на процессы деления клеток. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых биологически активных соединений и лекарственных препаратов.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на V Ежегодной международной молодежной конференции, Институт Биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля (Москва, 2005), II Российской школе-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), Английской секции международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), III Международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006), 8-й Школе-конференции по квантовой и вычислительной химии им. В.А. Фока (Великий Новгород, 2004).

Результаты работы опубликованы в 12 печатных изданиях, в том числе в 6 тезисах докладов.

Выводы

1. Комбинированным методом квантовой и молекулярной механики с подвижными эффективными фрагментами построен энергетический профиль пути реакции гидролиза модельного субстрата в активном центре сериновых протеаз. Аминокислотные остатки субстрата Thrl 1-Glyl2-Prol3-Cysl4-Lysl5-Alal6-Argl7-Ilel8-Ilel9 и аминокислотные остатки белка His40-Phe41-Cys92, Serl90-Cysl91-Gln 192-Glu 193-Asp 194-Ser 195, Ser214-Thp215-Gly216 вносят основной вклад во взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Методом КМ/ММ получена оценка энергии активации 9.6 ккал/моль для стадии ацилирования.

2. В соответствии с феноменологическим принципом индуцированного соответствия показано, что сжатие активного центра фермента трипсина при встраивании субстрата может способствовать снижению активационного барьера примерно на 3 ккал/моль.

3. По результатам КМ/ММ моделирования определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении в присутствии катиона Mg протекает по

•у, механизму нуклеофильного замещения второго порядка Sn2. В отсутствие Mg реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму SnI. Энергетические барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.

4. Методом КМ/ММ построен профиль пути реакции гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) в миозине. Предложен механизм каталитического действия миозина в реакции гидролиза АТФ с непосредственным участием солевого мостика Arg-Glu.

5. Построен энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в белке р21 ras. Сопоставлены результаты, полученные для реакции гидролиза ГТФ, протекающей в белках р21 ras и p21ras-GAP.

6. Отмечены общие черты для реакций гидролиза АТФ и ГТФ в соответствующих белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи Р-О, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

1. GranovskyA. URL: httpV/lcc chem.msu ru/gran/gamess/index.html.

2. Day P.N.; Jensen J.H.; Gordon MS; Webb SP.; Stevens W J.; Krauss M.; Gamer D.; Basch H.; Cohen D. An effective fragment method for modeling solvent effects in quantum mechanical calculations // J.Chem.Phys., 1996, V. 105(5), pp. 1968-1986.

3. Gordon MS; Freitag MA.; Bandyopadhyay P.; Jensen J.H.; Kairys V.; Stevens W J. The Effective Fragment Potential Method: A QM-Based MM Approach to Modeling Environmental Effects in Chemistry // JPhys.Chem A, 2001, V. 105(2), pp. 293-307.

4. Singh U.C.; Kollman P.A. An Approach to Computing Electrostatic Charges for Molecules // J.Comput.Chem, 1984, V. 5, pp. 129-145.

5. Bakowies D.; Thiel W. Hybrid models for combined quantum mechanical and molecular mechanical approaches II J.Chem.Phys., 1996, V. 100, pp. 10580-10594.

6. Lavery R.; Etchebest C.; Pullman A. Calculation of the molecular electrostatic potential from a multipole expansion based on localized orbitals // Chem. Phys Lett., 1982, V. 85, pp. 266-270.

7. Stone A J.; Alderton M. Distributed Polarizabilities // Mol.Phys, 1985, V. 56, pp. 1065-1082.A

8. Warshel A., Levitt M. Theoretical Studies of Enzymic Reactions: Dielectric, Electrostatic and Steric Stabilization of the Carbonium Ion in the Reaction of Lysozyme // J. Mol. Biol, 1976, V. 103, pp. 227-249.

9. Боченкова A.B. Развитее комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. дисс. на соиск. уч. ст. канд. физ.-мат. наук. - 2004.

10. Nemukhin A.V.; Grigorenko BL; Bochenokova A.V.; Topol I A.; Burt S K. A QM/MM approach with effective fragment potentials applied to the dipeptide-water structures // J.Mol Structure (Theochem), 2002, V. 581, pp. 167-175.

11. Chen W.; Gordon M.S. The effective fragment model for solvation: Internal rotation in form amide // J. Chem Phys., 1996, V. 105, pp. 11081-11089.1.?

12. Krauss M Effective fragment potentials and spectroscopy at enzyme active sites // Computers & Chemistry, 1995, V. 19, pp. 33-38.

13. Stevens W. REPGEN for Optimizing Effective Fragment Repulsive Potentials // CARB, 1991.

14. Ponder J.W., Richards FM An efficient Newton-Like method for molecular mechanics energy minimization of large molecules IIJ Comput.Chem, 1987, V. 8, pp. 1016-1023.

15. Brian KS; McGovernSL.; Binqing W.; Irwin J J. Lead discovery using molecular docking // Current Opinion in Chemical Biology, 2002, V. 6, pp. 439-446.

16. Hanessian S; MacKay В; Moitessier N. Design and synthesis of matrix metalloproteinase inhibitors guided by molecular modeling II J. Medicinal Chemistry, 2001, V. 44, pp. 3074-3082.

17. Contance J. J.; Koshland D.E. Three-dimensional structure of the serine receptor ligand-binding domain // Proteine Science, 1993, V. 2, pp. 559-566.

18. Беленикин M.C.; Маккиаруло А.; Константина Г.; Палюлин В А.; Пелличари Р.; Зефиров КС. Молекулярный докинг лигандов глутаматных рецепторов // Вестн. Моск. Ун-та, Сер.2. Химия, 2002, том 43, с. 221-230.

19. Шадрина М.С.; Рогов А.В.; Бравая КБ; Немухин А.В. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестн. Моск. Ун-та, Химия, 2005, том 46, №6, с. 363-369.

20. Henetyi С.; Spoel D Efficient docking of peptides to proteins without prior knowledge of the binding site // Protein Science, 2002, V. 11, pp. 1729-1737.

21. Duggleby HJ.; Tolley S P.; Hill C.P.; Dodson EJ. et al. Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre// Nature, 1995, V. 373, pp. 264-268.

22. Brannigan G; Dodson HJ.; Duggleby P.C.E.; Moody J.L. et al. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation // Nature, 1995, V. 378, pp. 416-419.

23. Hedstrom L Serine Protease Mechanism and Specificity. // Chem. Rev., 2002, V. 102, pp. 4501-4523.1. J f\

24. QiuX; Padmanabhan K. P.; Carperos V. E.; TulinskyA. et al. Structure of the Hurolog 3-Thrombin Complex and Nature of the S' Subsites of Substrates and Inhibitors // Biochemistry, 1992, V.31,pp. 11689-111697.

25. Zerner В.; BondR.P.M.; Bender ML Kinetic Evidence for the Formation of Acyl-Enzyme Intermediates in the a-Chymotrypsin-Catalyzed Hydrolyses of Specific Substrates //

26. J Am. С hem Soc., 1964, V. 86, pp. 3674-3679.

27. Kraut J. Serine Proteases: Structure and Mechanism of Catalysis II Ann Rev Biochem ,1977, V. 46, pp. 331-358.

28. DutlerH; Bizzozero SA Mechanism of the Serine Protease Reaction. Stereoelectronic, Structural, and Kinetic Considerations as Guidelines to Deduce Reaction Paths // Acc Chem to., 1992, V. 22, pp. 322-327.

29. Птицын О. Б; Финкелыитейн А.В. Физика белка. Курс лекций (2-е издание), кн. дом "Университет ", 2002.

30. Warshel A.; Naray-Szabo G.; Sussman F.; Hwang J.-К How Do Serine Proteases Really Work? II Biochemistry, 1989, V. 28, pp. 3629-3637.

31. Robillard G.; Schulman R.G. High resolution nuclear magnetic resonance studies of the active site of chymotrypsin : II. Polarization of histidine 57 by substrate analogues and competitive inhibitors // J.Mol.Biol., 1974, V. 86, pp. 541-558.

32. Liang Т.; Abeles R.H Complex of .alpha.-chymotrypsin and N-acetyl-L-leucyl-L-phenylalanyl trifluoromethyl ketone: structural studies with NMR spectroscopy // Biochemistry, 1987, V. 26, pp. 7603-7608.

33. Bender M.L.; Clement G.E.; Gunter C.R.; Kezdy F.K The Kinetics of a-Chymotrypsin Reactions in the Presence of Added Nucleophiles // J Am Chem Soc, 1964, V. 86, pp. 36973703.

34. ParkH; Chi Y.M. The enhancement of electrostriction caused by lowering the solvent dielectric constant leads to the decrease of activation energy in trypsin catalysis // Biochimica et Biophysica Acta, 2001, V. 1568, pp. 53-59.

35. Ziding Zhang; Zhimin He; Guoqiang Guan Thermal stability and thermodynamic analysis of native and methoxypolyethylene glycol modified trypsin // Biotechnology Techniques, 1999, V. 13, pp. 781-786.

36. Warshel A.; Russell S Theoretical correlation of structure and energetics in the catalytic reaction of trypsin IIJ Am.Chem Soc., 1986, V. 108, pp. 6569-6579.

37. Daggett V.; Schroder S; Kollman P. Catalytic Pathway of Serine Proteases: Classical and Quantum Mechanical Calculations IIJ Am. Chem Soc, 1991, V. 113, pp. 8926-8935.

38. Stanton R. V.; Perakyla M.; Bakowies D.; Kollman P.A. Combined ab initio and Free Energy Calculations To Study Reactions in Enzymes and Solution: Amide Hydrolysis in Trypsin and Aqueous Solution l/J.Am.Chem Soc., 1998, V. 120, pp. 3448-3457.

39. Chcmdrasekhar J.; Jorgensen W.L. Energy profile for a nonconcerted SN2 reaction in solution HJ.Am Chem.Soc., 1985, V. 107, pp. 2974-2975.

40. Chcmdrasekhar J.; Smith S.F.; Jorgensen W.L Theoretical examination of the SN2 reaction involving chloride ion and methyl chloride in the gas phase and aqueous solution //

41. J.Am Chem Soc., 1985, V. 107, pp. 154-162.

42. Sun Y.; Kollman P. Determination of solvation free energy using molecular dynamics with solute Cartesian mapping: An application to the solvation of 18-crown-6 II J.Chem Phys, 1992, V. 97, pp. 5108-5112.

43. Perakyla M.; Kollman Р.Л. Why Does Trypsin Cleave BPTI so Slowly? IIJ Am Chem Soc, 2000, V. 122, pp. 3436-3444.

44. StrajblM; Florian J.; Warshel A. Ab Initio Evaluation of the Potential Surface for General Base- Catalyzed Methanolysis of Formamide: A Reference Solution Reaction for Studies of Serine Proteases HJ.Am.Chem Soc., 2000, V. 122, pp. 5354-5366.

45. TopfM; Varnai P.; Richards W.G. Quantum mechanical/molecular mechanical study of three stationary points along the deacylation step of the catalytic mechanism of elastase // Theor.Chem.Acc., 2001, V. 106, pp. 146-151.

46. TopfM.; Varnai P.; Richards W.G. Ab Initio QM/MM Dynamics Simulation of the Tetrahedral Intermediate of Serine Proteases: Insights into the Active Site Hydrogen-Bonding Network HJ.Am.Chem Soc, 2002, V. 124, pp. 14780-14788.

47. Schroder S; Daggett V.; Kollman P A Comparison of the AMI and PM3 Semiempirical Models for Evaluating Model Compounds Relevant to Catalysis by Serine Proteases II J. Am Chem. Soc, 1991, V. 113, pp. 8922-8925.

48. Nemukhin A. V.; Topol LA.; Burt S К Energy Profiles for the Rate-Limiting Stage of the Serine Protease Prototype Reaction // Int. J. Quant. Chem., 2002, V. 88, pp. 34-40.

49. Marquart M.; Walter J.; Deisenhofer J.; Bode W.; Huber R. The geometry of the reactive site and of the peptide groups in trypsin, tripsinogen and its complexes with inhibitors // Acta Crystallogr., 1983, V. B39, pp. 480-490.

50. Jorgensen W.L; Maxwell D.S; Tirado-Rives J. Development and Testing of the OPLS All-Atom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids // JAm.ChemSoc, 1996, V. 118, pp. 11225-11236.

51. KoshlandDE Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis I I Proc. Natl Acad Sci USA, 1958, V. 44, pp. 98-104.

52. Блюменфельд JI.A. Проблемы биологической физики // Наука, 1974, Москва.

53. Blumenfeld L А ; Tikhonov A.N. Biophysical Thermodynamics of Intracellular Process, Molecular Machines of the Living Cell I I Spinger-Verlag, 1994, New York.

54. Ching-Han Ни; Tore Brinck Theoretical Studies of the Hydrolysis of the Methyl Phosphate Anion HJ. Phys. Chem A, 1999, V. 103, pp. 5379-5386.

55. Bunton C. A.; Llewellyn D. R.; Oldham K. G; Vernon C. A. The reactions of organic phosphates. Part I. The hydrolysis of methyl dihydrogen phosphate // J. Chem Soc, 1958, pp. 3574-3587.

56. Butcher W. W.; Westheimer F. H. The Lanthanum Hydroxide Gel Promoted Hydrolysis of Phosphate Esters II J. Am. Chem. Soc., 1955, V. 77, pp. 2420-2424.

57. Jencks W. P. When is an intermediate not an intermediate? Enforced mechanisms of general acid-base, catalyzed, carbocation, carbanion, and ligand exchange reaction //Acc. Chem. Res, 1980, V. 13, pp. 161-169.

58. Herschlag D.; Jencks W. P. Nucleophiles of high reactivity in phosphoryl transfer reactions: .alpha.-effect compounds and fluoride ion//J. Am Chem. Soc., 1990, V. 112, pp. 1951-1956.

59. Keesee R G.; Castleman A. W. J. Hydration of monomelic metaphosphate anion in the gas phase //J. Am. Chem. Soc, 1989, V. Ill, pp. 9015-9018.

60. Westheimer F. H Monomelic metaphosphates // Chem. Rev, 1981, V. 81, pp. 313-326.

61. FlorianJ.; Warshel A Phosphate Ester Hydrolysis in Aqueous Solution: Associative versus Dissociative Mechanisms //J. Phys. Chem. B, 1998, V. 102, pp. 719-734.

62. Ma B.Y.; Xie Y. M; Shen M. Z; Schleyer P. V.; Schaefer H. F. //J. Am. Chem. Soc, 1993, V. 115, pp. 11169-11176.

63. Akola J.; Jones R. O. Density Functional Calculations of ATP Systems. 2. ATP Hydrolysis at the Active Site of Actin IIJ Phys. Chem. B, 2006, V. 110, pp. 8121-8129.

64. Ни С. H.; Т. Brinck Т. J. Theoretical Studies of the Hydrolysis of the Methyl Phosphate Anion //Phys. Chem. A, 1999, V. 103, pp. 5379-5388.

65. Wang Y. N.; Topol I. A ; Collins J. R; Burt S K. Theoretical Studies on the Hydrolysis of Mono-Phosphate and Tri-Phosphate in Gas Phase and Aqueous Solution // J. Am. Chem. Soc, 2003, V. 125, pp. 13265-13274.

66. Grigorenko B. L; RogovA. V.; NemukhinA. V. Mechanism of Triphosphate Hydrolysis in Aqueous Solution: QM/MM Simulations in Water Clusters II J. Phys Chem В., 2006, V. 110(9), pp. 4407-4412.

67. Библиотека базисов URL: http7/www.emsl.pnl.gov/forms/basisform html

68. Hay P. J.; Wadt W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements Na to Bi II J. Chem. Phys., 1985, V. 82, pp. 284-298.1. T)

69. Hay P. J.; Wadt W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for К to Au including the outermost core orbitals II J. Chem Phys., 1985, V. 82, pp. 299-310.

70. Pacios LF.; Christiansen P. A. Ab initio relativistic effective potentials with spin-orbit operators. I. Li through ArIIJ. Chem Phys, 1985, V. 82, pp. 2664-2671.

71. Hodge Т.; Cope MJ. A myosin family tree II J. CellSci., 2000, V. 113, pp. 3353-3354.

72. Гусев Н.Б. Молекулярные механизмы мышечного сокращения // Соросовский образовательный журнал, 2000, том 6, №8, с. 24-32.

73. Левицкий Д.И.; Хайтлина С.Ю.; Гусев Н.Б. Белки и пептиды, Т.1 // Наука, 1995, Москва (под ред. Иванова В.Т., Липкина В.М.), с. 249-293.

74. Rayment /.; Rypniewski W.R.; Schmidt-Base К.; Smith R.; Tomchick D R.; Benning MM.; Winkelmann D.A.; Wesenberg G.; Holden H.M Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: A molecular motor // Science, 1993, V. 261, pp. 50-58.7R

75. Поглазов Б Ф.; Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность // Наука, 1982, Москва, 162 с.

76. Тихонов А Н. Молекулярные основы биологической подвижности И Соросовский Образовательный Журнал, 1999, №6, с. 17-24.

77. Alberty R A. Thermodynamics of biochemical reactions I I John Wiley and Sons, 2003, Hoboken, NJ.1. A I

78. Alberty R A. Thermodynamics of the hydrolysis of adenosine triphosphate as a function oftemperature, pH, pMg, and ionic strength// J. Phys Chem. B, 2003, V. 107, pp. 12324-12330.ft?

79. Кольман Я.; Рем К.-Г. Наглядная биохимия // Мир, 2004, Москва.1. JJ1

80. Wei J.; Leyh Т. Conformational change rate-limits GTP hydrolysis: the mechanism of the ATP Sulfurylase-GTPase II Biochemistry, 1998, V. 37, pp. 17163-17169.

81. Yang M.; Leyh T.S. Altering the reaction coordinate of the ATP Sulfurylase-GTPase reaction // Biochemistry, 1997, V. 36, pp. 3270-3277.85

82. Сырцова Л А.; Тимофеева E А. Перенос электрона, сопряженный с гидролизом АТФ в нитрогеназе // Известия Академии наук, серия химическая, 2001, №10, с. 1706-1711.о/

83. Onishi Н; Mochizuki N.; Morales М. F. On the myosin catalysis of ATP hydrolysis // Biochemistry, 2004, V. 43, pp. 3757-3763.

84. Smith C.A.; Rayment I. X-ray structure of the magnesium(II).ADP.vanadate complex of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution // Biochemistry, 1996, V. 35, pp. 5404-5417.

85. Bauer C.B.; Holden H. M.; Thoden J В.; Smith R.; Rayment I. X-ray structures of the apo and Mg-ATP-bound states of Dictyostelium discoideum myosin motor domain II J. Biol. Chem, 2000, V. 275, pp. 38494-38499.

86. Fisher A J.; Smith C.A.; Thoden J.B.; Smith R; Sutoh K; Holden H.M; Rayment I. X-ray structures of the myosin motor domain of Dictyostelium discoideum complexed with MgADP.BeFx and MgADP.AlF4- // Biochemistry, 1995, V. 34, pp. 8960-8972.

87. Smith C.A.; Rayment I. X-ray structure of the magnesium (II)ADP'vanadate complex of the Dyctyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution // Biochemistry, 1996, V. 35, pp. 5404-5417.

88. Ali M. Y.; Homma K; Iwane A.H.; Adachi K; Itoh H; Kinosita K. Jr.; Yanagida Т.; Ikebe M Unconstrained steps of myosin VI appear longest among known molecular motors // Biophys J., 2004, V. 86, pp. 3804-3810.

89. Wells A.L; Lin A. W.; Chen L Q; Safer D; Cain S M.; Hasson Т.; Carragher В О; Milligan R A.; Sweeney H.L Myosin VI is an actin-based motor that moves backwards // Nature, 1999, V. 401, pp. 505-508.

90. Rock R S; Rice S E.; Wells A.L.; Purcell TJ.; Spudich J.A.; Sweeney H.L Myosin VI is a processive motor with a large step size // PNAS, 2001, V. 98(24), pp. 13655-13659.

91. Altman D.; Sweeney H L; Spudich J.A. The mechanism of myosin VI translocation and its load-induced anchoring // Cell, 2004, V. 116, pp. 737-749.

92. KolomeiskyA В.; Fisher M.E. A simple kinetic model describes the processivity of myosin-V // Biophys. J., 2003, V. 84(3), pp. 1642-1650.

93. KolomeiskyA В; Widow B. A simplified ratchet model of molecular motors II J. Stat Phys, 1998, V. 93, pp. 633-645.

94. Fisher M.E.; Kolomeisky A.B. The force exerted by a molecular motor // Proc. Natl. Acad Sci., 1999, V. 96, pp. 6597-6602.

95. KolomeiskyA В; Stukalin E.B.; Popov A A. Understanding mechanochemical coupling in kinesins using first-time processes // Phys. Rev. E., 1999, V. 71(3), Art. No. 031902.

96. Robblee J P.; Olivares A.O.; De La Cruz E M. Mechanism of Nucleotide Binding to actomyosin VIII J. of Biol. Chem., 2004, V. 279(37), pp. 38608-38617.

97. De La Cruz E M.; Ostap E M.; Sweeney H.L. Kinetic mechanism and regulation of myosin VI II J. of Biol. Chem., 2001, V. 276(34), pp. 32373-32381.

98. Houdusse A.; Kalabokis V.N.; Himmel D; Szent-Gyorgyi A.G.; Cohen C. Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head // Cell (Cambridge, Mass.), 1999, V. 97, pp. 459-470.

99. Li G.; Cui Q. Mechanochemical coupling in myosin: a theoretical analysis with molecular dynamics and combined QM/MM reaction path calculations // J. Phys. Chem. B, 2004, V. 108, pp. 3342-3357.

100. A kola J.; Jones R. O. ATP hydrolysis in water a density functional study 11 J. Phys. Chem B, 2003, V. 107, pp. 11774-11781.

101. Schwarzl S M.; Smith J.C.; Fischer S Insight into the chemomechanical coupling of the myosin motor from simulation of its ATP hydrolysis mechanism // Biochemistry, 2006,1. V. 45(18), pp. 5830-5847.

102. Miller D. L.; Westheimer F. H. The hydrolysis of y-phenylpropyl di- and triphosphates // JAm.Chem Soc., 1996, V. 88, pp. 1507-1511.

103. Bags haw C.R.; Trent ham D R.; Wolcott R; Boyer P. Oxygen exchange in the gamma-phosphoryl group of protein-bound ATP during Mg2+-dependent adenosine triphosphatase activity of myosin // Proc Natl Acad Set USA, 1975, V. 72(7), pp. 2592-2596.

104. Admiraal S J.; Herschlag D. Mapping the transition state for ATP hydrolysis: Implications for enzymatic catalysis // Chem. Biol, 1995, V. 2, pp. 729-739.

105. Houdusse A.; Kalabokis V.N; Himmel D.; Szent-Gyorgyi A.G; Cohen С Atomic structure of scallop myosin subfragment S1 complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head // Cell (Cambridge,Mass.), 1999, V. 97, pp. 459-470.

106. TopolIA.; Cachau R E.; Nemukhin A.V; Grigorenko B.L.; Burt SК Quantum chemical modeling of the GTP hydrolysis by the RAS-GAP protein complex // Biochimica et Biophysica Acta, 2004, V. 1700, pp. 125- 136.

107. Bagshaw C.R; Trenthan D.R.; Wolcott R.G.; Boyer P D Oxygen exchange in the yл ,phosphoryl group of protein-bound ATP during Mg -dependent adenosine triphosphatase activity of myosin // Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1975, V. 72, pp. 2592-2596.

108. Ditmar Furch M.S; Fujita-Becker S.; Greeves MA ; Holmes K.C; Manstein DJ. Role of the salt-bridge between switch-1 and switch-2 of Dictyostelium myosin // J Mol Biol., 1999, V. 290, pp. 797-809.

109. Lehninger A.L; Nelson D.L.; Cox MM. Principles of Biochemistry // Worth Publishers, 1993.

110. Scheffzek K.; Ahmadian M.R.; Kabsch W.; Wiesmuller L.; Lautwein A.; Schmitz F.; Wittinghofer A. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic ras mutations // Science, 1997, V. 277, pp. 333-338.

111. Resat H.; Straatsma T.P.; Dixon DA ; Miller J.H. The argentine finger of RasGAP helps

112. Gln-61 align the nucleophilic water in GAP-stimulated hydrolysis of GTP // PNAS, 2001,

113. V. 98(11), pp. 6033-6038. 110

114. Ma J.; Karplus M. Molecular switch in signal transduction: Reaction paths of the conformational changes in rasp21 // Biophysics, 1997, V. 94, pp. 11905-11910.

115. Protein Data Bank, URL http://www.rcsb org/pdb/

116. Chung H.-H.; Benson D.R.; Schultz P.G. Probing the structure and mechanism of Ras protein with an expanded genetic code II Science, 1993, V. 259, pp. 806-809.

117. Schweins Т.; Langen R; Warshel A. Why have mutagenesis studies not located the general base in ras p21? II Nat. Struct. Biol., 1994, V. 1, pp. 476-484.

118. SondekJ.; Lambright D G.; Noel J P.; Hamm H.E; Sigler P.B GTPase mechanism of G proteins from the 1.7 A crystal structure of transducin a-GDP-AlF/ // Nature, 1994, V. 372, pp. 276-279.

119. Schweins Т.; Warshel A. Mechanistic Analysis of the Observed Linear Free Energy Relationships in p21ras and Related Systems // Biochemistry, 1996, V. 35, pp. 14232-14243.

120. Mildvan A S Mechanisms of signaling and related enzymes // Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1997, V. 29, pp. 401-416.

121. ScheidigA J; Burmester C.; Goody R S The pre-hydrolysis state of p21ras in complex with GTP: new insights into the role of water molecules in the GTP hydrolysis reaction of ras-like proteins II Structure, 1999, V. 7, pp. 1311-1324.

122. Futatsugi N.; HataM; Hoshino Т.; Tsuda M Ab initio study of the role of Lysine 16 for the molecular switching mechanism of Ras protein p21 // Biophysical Journal, 1999, V. 77,pp.3287-3292.

123. Glennon T.M.; Villa J.; Warshel A. How does GAP catalyze the GTPase reaction of Ras?: A computer simulation study // Biochemistry, 2000, V. 39, pp. 9641-9651.

124. Cheng H; Sukal S; Deng H.; Leyh T.S; Callender R. Vibrational structure of GDP and GTP bound to RAS: an isotope-edited FTIR study // Biochemistry, 2001, V. 40, pp. 4035-4043.

125. Allin C.; Gerwert K. Ras catalyzes GTP hydrolysis by shifting negative charges from y- to P-phosphate as revealed by time-resolved FTIR difference spectroscopy // Biochemistry, 2001,1. V. 40, pp. 3037-3046.

126. Mori K; Hata M.; Neya S; Hoshino T. A study on the role Mg2+ in a Ras protein by MD simulation // Chem-Bio Informatics Journal, 2002, V. 2(4), pp. 147-155.

127. Katagiri D.; Hata M.; Itoh Т.; Neya S; Hoshino T. Atomic-scale mechanism of the GTP □ GDP hydrolysis reaction by the Gial protein // J. Phys. Chem. B, 2003, V. 107, pp. 3278-3283.

128. ShurkiA.; Warshel A. Why does the Ras switch "break" by oncogenic mutations? // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004, V. 55, pp. 1-10.

129. Григоренко Б JI.; Рогов А В.; Князева М.А.; Исаева Е В.; Немухин А.В. Моделирование механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфага белковым комплексом RAS-GAP // Вестник Московского Университета Химия, 2005, том 46, №1, с. 19-23.

130. Morris G.; Goodsell £>.; Halliday R; Huey R.; Hart W; Belew R; Olson A. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function // J.Computational Chemistry, 1998, V. 19, pp. 1639-1662.

131. Основные публикации по теме диссертации

132. Шадрина М.С.; Рогов А.В.; Бравая КБ; Немухин А В. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №6, с. 363-369.

133. Nemukhin A.V.; Grigorenko BL; Rogov A.V.; Topol I.A ; Burt SK. Modeling of serine protease prototype reactions with the flexible effective fragment potential quantum mechanical/molecular mechanical method // Theor.Chem Accounts, 2004, V.l 11, pp. 36-48.

134. Григоренко Б JI.; Рогов А.В.; Князева М А.; Исаева Е.В.; Немухин А В. Моделирование механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата белковым комплексом RAS-GAP // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №1, с. 19-23.

135. Grigorenko В. L.; Rogov А. V.; Nemukhin А. V. Mechanism of Triphosphate Hydrolysis in Aqueous Solution: QM/MM Simulations in Water Clusters II J. Phys Chem. В, 2006, V. 110(9), pp. 4407-4412.

136. Немухин A.B.; Григоренко БJl; Епифановский ЕМ.; Рогов А.В. Моделирование механизмов ферментативных реакций комбинированными методами квантовой и молекулярной механики // Биомедицинская химия, 2004, том 50, Прил. №1, с. 49-55.

137. Nemukhin A. V; Gariev I A.; Rogov A. V.; Varfolomeev S D Serine hydrolases catalytic site: geometry invariants and modeling catalytic activity // Mendeleev Communications, 2006. -принята к печати.