Моделирование механизмов реакций ферментативного катализа в активном сайте холинэстераз комбинированными методами квантовой и молекулярной механики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛУЩЕКИНА Софья Владимировна

МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕАКЦИЙ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА В АКТИВНОМ САЙТЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗ КОМБИНИРОВАННЫМИ МЕТОДАМИ КВАНТОВОЙ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕХАНИКИ

02.00.15 - кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических паук

Москва 2011

4841256

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Немухин Александр Владимирович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Устышок Юрий Александрович

кандидат химических наук Махаева Галина Файвелевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт проблем химической физики РАН.

Защита состоится февраля 2011 г. в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической этимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «2*/» января 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

> И.К. Сакодынская

Общая характеристика работы Актуальность темы

Для решения задач медицины, фармацевтики и биотехнологии необходимы представления о механизмах реакций ферментативного катализа, что предполагает знание элементарных стадий химических превращений в активных центрах белков. Экспериментальные приемы включают исследования структуры белков и их комплексов с аналогами субстратов с использованием методов рснтгеноструктурного анализа и ядерно-магнитного резонанса. Закономерности протекания ферментативных реакций изучаются методами химической кинетики. Существенную поддержку этим исследованиям оказывают методы генной инженерии.

В настоящее время становится возможным проводить анализ элементарных стадий ферментативных реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые в экспериментальных исследованиях, с привлечением методов молекулярного моделирования. На данный момент наиболее перспективной группой методов можно считать комбинированные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), которые позволяют детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения и молекул растворителя. Основной принцип приближения КМ/ММ заключается в описании центральной части системы с использованием квантовомеханических методов, а окружающей части — с использованием методов молекулярной механики.

Диссертация посвящена изучению механизмов реакций гидролиза в активном центре ферментов, относящихся к семейству холинэстераз: ацетилхолинэстеразы — одного из ключевых ферментов центральной нервной системы, и фермента, выполняющего в организме защитные функции — бутирилхолинэстеразы. Детальное исследование механизмов холинэстеразного гидролиза является актуальной задачей, поскольку эта информация позволяет не только предсказать активность нативных ферментов в отношении различных субстратов, но и предложить модификации природных белков для получения более эффективных с точки зрения медицинских приложений ферментов.

з

Цель работы

Целью работы являлось изучение механизмов реакций гидролиза сложных

эфиров в активном сайте холинэстераз с использованием метода КМ/ММ.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Построить энергетический профиль реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразь!.

2. Оценить скорости гидролиза ряда незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты в активном сайте ацетилхолинэстеразы.

3. Исследовать влияние выбора квантовой подсистемы на результаты моделирования механизма реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ.

4. Построить энергетический профиль реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинзстеразы.

5. Изучить влияние полиморфной модификации АБр70С1у на механизм реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинзстеразы.

Научная новизна результатов.

1. Впервые проведено компьютерное моделирование методом КМ/ММ и построен энергетический профиль полного цикла гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы. Локализованы стационарные точки на поверхности потенциальной энергии и определены энергетические барьеры обеих стадий реакции (ацилирования и деацилирования), составляющие, соответственно, 7.2 и 8.4 ккал/моль.

2. На основании полученных методом КМ/ММ структур фермент-субстратных комплексов оценены скорости гидролиза незаряженных сложноэфирных субстратов в активном сайте ацетилхолинэстеразы.

3. Для серии незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты показано, что наиболее благоприятное положение субстрата в активном центре, обеспечивающее наименьший активационный барьер, достигается для

соединений, наиболее близких по структуре к природному субстрату ацетилхолинэстеразы — ацстилхолину.

4. Показано, что для корректного моделирования реакций гидролиза и активном сайте ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ в квантовую подсистему необходимо включать не только аминокислотные фрагменты, непосредственно участвующие в реакции (H¡s447, Ser203), но другие ключевые аминокислотные остатки активного центра (Glu202, Glu334, Glyl21, Gly 122, Ala204).

5. Показано, что полиморфная модификация Asp70Gly не оказывает существенного влияния на энергетический профиль первой стадии реакции гидролиза сукцинилхолина бутирилхолинэстеразой; активационные барьеры для нативного фермента и его полиморфной модификации близки, но тетраэдрический интермедиат для модифицированного фермента отличается большей стабильностью.

6. По результатам расчетов во всех рассмотренных примерах ферментативные реакции холинэстераз проходят по однопротонному механизму.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты исследования позволяют детализировать механизм химической реакции на молекулярном уровне и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза в активном сайте холинэстераз позволяет предсказывать активность полиморфных модификаций этого фермента, встречающихся у человека, и облегчает создание модифицированных ферментов, способных расщеплять опасные для организма соединения.

Апробация работы и публикации автора по теме диссертации.

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), Международной конференции студентов и аспирантов по

фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), 2-ой международной конференции «Biocataiysis in Non-Conventional Media» (Москва, 2008), VIII Международной молодежной конференции "Биохимическая физика", ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2008), 6-ой Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2009), Международной конференции «Biocatalysis-2009» (Архангельск, 2009), Международной конференции «10th International Meeting on Cholinesterases» (Шибекик, Хорватия, 2009), XIX Международной молодежной конференции "Биохимическая физика", ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2009).

Результаты работы опубликованы в 13 печатных работах, в том числе в 4 статьях в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 210 наименований. Работа изложена на 150 страницах и включает 49 рисунков и 7 таблиц.

Содержание работы Первая глава посвящена обзору литературы по структуре, функциям и молекулярному моделированию холинзстераз.

К семейству холинзстераз относятся ферменты ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БХЭ). АХЭ является одним из ключевых ферментов центральной нервной системы, ответственным за регуляцию передачи нервного импульса путем быстрого гидролиза нейромедиатора ацетилхолина (¿M1/A'M=1.6xl08 M'V). Существует ряд свидетельств того, что, помимо этой классической (каталитической) функции, АХЭ обладает целым рядом т.н. неклассических функций, таких как участие в работе лимфатической системы и эмбриональном развитии; является эритроцитарным антигеном. АХЭ имеет особое значение для здоровья человека: АХЭ является основной мишенью токсического действия ряда фосфорорганических отравляющих веществ

(зоман, зарин, пестициды и проч.); ингибирование АХЭ используется в терапии ряда заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, глаукома, миастения. Отличительной особенностью строения АХЭ является наличие длинного узкого канала (~20А), ведущего с поверхности фермента к каталитической триаде, типичной для ссриновых гидролаз — серии, гистидин и глутаминовая кислота. Кроме того, существенную роль в работе фермента играют аминокислотные остатки оксианионного центра и гидрофобного сайта. Схематически строение активною сайта АХЭ показано на Рис. 1. Как и у всех сериновых гидролаз, для реакции гидролиза ацетилхолина АХЭ выделяют две стадии — ацилирование и деацилирование (схема на Рис. 2).

Физиологическая роль БХЭ на данный момент до конца не ясна. БХЭ содержится • в больших количествах в плазме крови (3 мг/литр), а также практически во всех тканях — печени, сердце, и т. д. Отсутствие экспрессии или полиморфная модификация БХЭ в обычной ситуации не сказывается на здоровье человека, но оказывается существенным фактором, например, при применении миорелаксантов: клиническая практика показала, что использование сукцинилхолина у пациентов с полиморфной модификацией БХЭ А5р70С1у вызывает серьезные нарушения дыхания. По строению БХЭ отличается от АХЭ заменой целого ряда ароматических аминокислотных остатков на менее объемные, что обеспечивает заметное увеличение объема канала, ведущего к активному центру, и, как следствие, к существенному расширению спектра субстратов БХЭ по сравнению с АХЭ. БХЭ способна брать на себя функции АХЭ по поддержанию передачи нервного импульса в холинэргической нервной системе, гидролизуя ацетилхолин при недостаточной экспрессии или сниженной активности последней, например, на тяжелых стадиях болезни Альцгеймера; как и АХЭ, БХЭ является мишенью фосфорорганических веществ, ковалентно связываясь с ними, и выполняя таким образом защитную функцию. На основании этого БХЭ вводится в клиническую практику в качестве стехиометричсской ловушки для отравляющих веществ; активно ведутся работы над созданием каталитических ловушек на основе БХЭ.

Среди работ по компьютерному моделированию холинэетераз следует, прежде всего, выделить исследования, использующие метод молекулярной динамики для изучения транспорта субстратов по каналу к активному сайту и динамике этого канала, а также молекулярный докинг для поиска ингибиторов АХЭ, как потенциальных средств лечения болезни Альцгеймера. Отдельные стадии реакции гидролиза в активных сайтах как АХЭ, так и БХЭ изучались с использованием различных приближений квантовой химии, но задача описания полного цикла гидролиза с учетом всего белкового окружения до наших работ не ставилась.

Вторая глава посвящена описанию использовавшихся методов моделирования — подготовке структур ферментов и фермент-субстратных комплексов и расчетам энергетических профилей реакций с использованием метода КМ/ММ. Основным источником исходных координат тяжелых атомов белковых структур является банк данных PDB (http://pdb.rcsb.org). Известен ряд структур АХЭ различных животных, и несколько вариантов структур БХЭ человека. Для целей данной работы представляется оптимальными структура АХЭ человека (код PDB 1F8U), полученная с разрешением 2.7А и структура БХЭ человека (код PDB 1P0I), полученная с разрешением 2.0А. Атомы водорода, отсутствующие в кристаллографических структурах, были добавлены при помощи программы Reduce.

В связи с очень высокими скоростями гидролиза ацетилхолина АХЭ и сукцинилхолина БХЭ, кристаллографические структуры фермент-субстратных комплексов не известны. Поэтому для их построения были использованы методы молекулярного моделирования: молекулы субстратов были помещены в полости ферментов методом гибкого молекулярного докинга с использованием ламарковского генетического алгоритма (программа Auiodock 3.0). Для насыщения полостей в структуре ферментов молекулами воды использовалась программа Tinker 1.7. Положения добавленных атомов водорода и молекул воды были оптимизированы методом молекулярной динамики. Для проведения дорогостоящих расчетов методом КМ/ММ необходимо учесть влияние на ход реакции частей белка, непосредственно окружающих активный

центр. Периферийные участки фермента были удалены таким образом, что полученная модель приблизительно представляла собой сферу радиусом 20А, в центре которой располагается каталитическая триада фермента. В результате была получена начальная геометрическая конфигурация системы, использовавшаяся в последующих расчетах методом КМ/ММ. В качестве критериев выбора квантовой подсистемы для расчетов использовались представления об участии молекулы или аминокислотного остатка в химических превращениях и участии в формировании сетки водородных связей в сериновых гидролазах. Выбранная нами квантовая подсистема включала следующие аминокислотные остатки/молекулы:

■ молекулу ацетилхолина;

■ 3 молекулы воды, расположенные в активном центре в позициях, наиболее подходящих для участия в реакции (все молекулы воды присутствовали в исходной кристаллографической структуре);

■ боковые цепи остатков каталитической триады 8ег203, Шз447, С1и334, непосредственно участвующих в катализе;

■ остатки оксианионного центра 01у121, С1у122, А1а204, фиксирующего карбонильный кислород ацетилхолина в активном центре АХЭ;

" С!и202 — один из остатков анионного кармана, стабилизирующий триметиламмониевую группу субстрата в активном центре АХЭ;

■ часть боковой цепи 8ег229, образующую водородную связь с каталитическим остатком С1и334.

Выбранная таким образом квантовая подсистема для АХЭ включала 79 атомов. Процедура подготовки структуры БХЭ была проведена аналогичным образом. Стационарные точки на поверхности потенциальной энергии были локализованы в ходе расчетов по минимизации полной энергии системы методом КМ/ММ в варианте механического внедрения. Расчеты в квантовой подсистеме проводились методом функционала электронной плотности с использованием функционала РВЕО и базиса 6-31-Ю*. Все расчеты проводились с использованием программы РС САМЕЗЯ.

Для описания взаимодействий в молекулярно-механической подсистеме было использовано силовое поле АМВЕЯ99. При оптимизации геометрических параметров были зафиксированы положения аминокислотных остатков внешнего слоя белка, находящиеся на расстоянии более 8-10 А от активного центра фермента. Моделирование реакции гидролиза в активном сайте БХЭ проводилось при помощи метода КМ/ММ в варианте конформационнеподвижных эффективных фрагментов.

Для локализации активационных барьеров геометрические конфигурации системы, соответствующие точкам на поверхности потенциальной энергии (ППЭ) между положениями минимумов, были получены варьированием координаты реакции от начального до конечного значения с заданным шагом (=0.05-0.1 Л). Каждая из стартовых промежуточных геометрических конфигураций системы оптимизировалась в ходе расчета методом КМ/ММ при фиксации координаты реакции.

Третья глава содержит результаты моделирования реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ. Был построен энергетический профиль обеих стадий реакции — ацилирования и деацилирования, и локализованы стационарные точки на поверхности потенциальной энергии: Геометрическая конфигурация фермент-субстратного (Рис. 3.) комплекса характеризуется планарной конформацией сложноэфирной группы субстрата и благоприятным для нуклеофильной атаки расстоянием между кислородным атомом каталитического серика О^елоз и карбонильным атомом субстрата Сдсь составляющим 2.48 А.

В геометрической конфигурации переходного состояния стадии ацилирования (Рис. 4) расстояние для нуклеофильной атаки серина по карбонильному атому углерода ацетилхолина О^оз-Сась составляет 2.16 А. Переход протона с Бег203 на Шв447 сопровождается растяжением связи О^ейоз-Н^егмз (с 1.01 А в фермент-субстратном комплексе до 1.17А в переходном состоянии), а также уменьшением расстояния Н^ейоз-М'ны« (с 1.71 А в фермент-субстратном комплексе до 1.4 А в переходном состоянии). Сложноэфирная группа теряет планарность.

Оксианионный центр

А1а204-N м^С1у122

\ I

НзС^.0 Н

Эеггоз ^ Г

О Л

Н

Каталитическая триада N

О

гг

/ \ н,с сн.

<3

о

Тфав

N

/ ™5«7

/ Анионный сайт

Ацилирование

Деацширование

Рис. 1. Ключевые аминокислоты активного сайта АХЭ.

1

^ Чн «У*

^ /Ч

н к н

$«(» н

Рис. 2. Схема реакции гидролиза сложного эфира в активном сайте АХЭ.

Рис. 3. Геометрия фермент-субстратного комплекса ацетилхолина и АХЭ.

Рис. 4. Г еометрия переходною состояния стадии ацилирования реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ.

Рис. 5. Геометрия тетраэдрического интермедиата стадии ацилирования реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ.

Рис. 6. Геометрия переходного состояния стадии деацилирования реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ.

о Ь

' , гиьчч I

Рис. 7. Геометрия тетраэдрического интермедиата стадии деацилирования реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ.

Рис. 8. Энергетический профиль реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ.

,о

ъг.'

Рис. 9. Аминокислотные остатки и молекула субстрата, входящие в «малую» квантовую часть комплексов АХЭ со сложноэфирными субстратами.

X

Стострахв-'

•4 >-<

г- Ч , ▼

/

01пМ2

Рис. 10. Аминокислотные остатки и молекула субстрата, входящие в «большую» квантовую часть комплексов АХЭ со сложноэфирными субстратами. 1одк„

• Экспериментальные данные ¿Вычисленные значения

Рис. 11. Зависимость константы скорости второго порядка реакции гидролиза сложноэфирных субстратов в активном сайте АХЭ от гидрофобное™ радикала п.

13

Рис. 12. Наложение ишюжения еукцнидихолина в фермент-субстратном комплексе сукцинилхолина и бутурилхолинэстеразы для нативного (показано красным) и модифицированного (показано синим) ферментов.

Рис. 13. Тетраэдрический интермедиат стадии ацилирования реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте БХЭ для нативного фермента (слева) и модифицированного (справа). Расстояния приведены в ангстремах.

- Н<шшный фермент

- А*р"001у

ТЭ2 ; 3.1 ккал/модь

| 3.2

координата реакции

Рис.14. Полученные энергетические барьеры для стадии ацилирования реакции гидролиза сукцинилхолина нативной и модифицированной БХЭ.

В геометрической конфигурации тетраэдрического интсрмедиата (рис. 5) расстояние между кислородом 5ег203 и карбонильным атомом углерода ацетилхолина составляет 1.42 А, что отвечает образованию ко валентной связи между молекулой субстрата и ферментом. Сложноэфирная группа принимает тетраэдрическую конфигурацию.

Сравнение полученного тетраэдрического интермедиата с известными кристаллографическими структурами АХЭ, ковалентно связанной с негидролизуемыми аналогами ацетилхолина, показывает, что полученная геометрическая конфигурация хорошо согласуется с экспериментальными данными.

В результате распада тетраэдрического интермедиата стадии ацилирования образуется молекула спирта, а также ацил-ферментный комплекс. Молекула воды, которая должна выступить нуклеофильным агентом на следующем этапе, удерживается двумя водородными сзязями в положении, подходящем для последующей атаки по карбонильному углероду ацилфермента. В переходном состоянии стадии деацилирования (рис. б) межъядерное расстояние вдоль одной из связей О-Н в молекуле воды увеличивается, протон смещается к №5447. Одновременно с этим уменьшается расстояние для нуклеофильной атаки воды по карбонильному атому углерода ацилфермента Сдсь-0\Уа! (2.59 и 2.35 А).

В геометрической конфигурации тетраэдрического интермедиата стадии деацилирования (рис. 7) атом кислорода молекулы воды связан ковалентной связью с межъядерным расстоянием 1.45 А с карбонильным углеродом ацилфермента. Протон, отделяясь от молекулы воды, переносится на НЬ447, расстояние Н\угг^5ны47 составляет 1.04 А.

Последующее деацилирование серина приводит к образованию второго продукта реакции — молекулы уксусной кислоты, и освобождению фермента. Для всех полученных конфигураций расстояние между атомом водорода гистидина Нен;5447 и атомом кислорода глутаминовой кислоты С1и334 составляет порядка 1.5А, что свидетельствует о том, что на всем протяжении

реакции перехода этого протона не происходит, и реакция протекает по однопротонному механизму.

Значения энергий конфигураций, соответствующих стационарным точкам на поверхности потенциальной энергии (ППЭ) системы, полученные в результате геометрической оптимизации, были использованы для построения энергетического профиля реакции (Рис. 8).

Рассчитанные барьеры стадий ацилирования и деацилирования составляют 7.2 ккал/моль и 8.4 ккал/моль, соответственно; этот результат хорошо согласуется с экспериментальными данными. То обстоятельство, что энергия тетраэдрического интермедиата ниже, чем энергия ацилфсрмента, качественно согласуется с экспериментальными данными.

Четвертая глава описывает метод оценки скорости гидролиза субстратов АХЭ, который не столь затратен, как расчет полных энергетических профилей реакции, и его применение для моделирования гидролиза серии незаряженных субстратов.

Ранее [Nemukhin и др., Mend. Com. 2006, 16, 290] было показано, что активационный барьер стадии ацилирования (а следовательно, и константа скорости) при катализе гидролиза серии субстратов сериновыми гидролазами коррелирует с равновесным расстоянием между атомом кислорода серина каталитической триады и углеродным атомом субстрата в структуре фермент-субстратного комплекса. Таким образом, анализ равновесных геометрических конфигураций фермент-субстратных комплексов, полученных методом КМ/ММ, позволяет прогнозировать закономерности в реакциях ферментативного катализа сериновых гидролаз даже без проведения дорогостоящих расчетов полных энергетических профилей реакционного пути. В работе [Jarv и др, Eur. J. Biochem., 1976, 62, 315] приводится экспериментально установленная зависимость скорости гидролиза АХЭ незаряженных аналогов ацетилхолина (т.е. сложных эфиров уксусной кислоты СНзС(0)0-Х) от гидрофобности субстрата.

В нашем исследовании оптимизация равновесных геометрических конфигураций фермент-субстратных комплексов проводилась методом

КМ/ММ с двумя вариантами квантовой части: малой, включающей только молекулу субстрата и аминокислотные фрагменты, непосредственно участвующие в реакции (Рис. 9), и расширенной, которая была выбрана так же, как и при расчетах пути гидролиза ацетилхолина (Рис. 10). Для равновесных геометрий фермент-субстратных комплексов получены расстояния нуклеофильной атаки <1(С-0). При детальном расчете методом КМ/ММ энергетического профиля реакционного пути выше было получено значение энергетического барьера 7.2 ккал/моль для первой стадии реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ. Соответствующее вычисленное значение <1(С-0) для ацетилхолина в рамках данной модели составляет 2.79 А. Принимая значения параметров для ацетилхолина в качестве реперных точек, мы можем оценить нормированные энергетические барьеры реакции гидролиза АХЭ серии субстратов, исследованных в данной работе (Табл. 1).

Табл. 1. Нормированные энергетические барьеры для серии незаряженных субстратов

СНзС(0)0-Х. я -параметр гидрофобности радикала субстрата.

X- я Малая квантовая часть Расширенная квантовая часть

d(C-O), А ДЕ, ккал/моль d(C-O), А ДЕ, ккал/моль

-СН3 0.5 3.52 9.1 4.60 13.3

-с2н5 1 3.46 8.9 3.34 9.7

-С3Н7 1.5 3.36 8.6 3.92 11.4

-С4Н9 2 3.27 8.4 3.37 9.8

-С2Н4С(СНз)з 2.98 3.05 7.8 2.85 8.3

-С2Н4СН(СН3)2 2.3 3.39 8.7 2.90 8.4

-СН2СН(СНЗ)2 1.8 3.21 8.3 3.53 10.2

С использованием уравнения Аррениуса получены оценки для логарифма константы скорости второго порядка log кп и произведено сравнение вычисленных величин с экспериментальными данными. Для расширенной квантовой подсистемы теоретические корреляционные зависимости констант скорости от параметра гидрофобности согласуются с экспериментальными

данными (Рис. 11). Для изучения причин отклонения рассчитанных значений от экспериментальных, наблюдаемого для некоторых точек, проведен анализ взаимодействий субстрата с анионным сайтом фермента. Результаты моделирования показывают, что установленная экспериментальная зависимость скорости гидролиза субстрата от его структуры в значительной степени определяется строением фермент-субстратного комплекса. При этом оптимальное положение в активном сайте АХЭ, обеспечивающее наименьший активационный барьер реакции гидролиза, достигается для соединения, наиболее близкого к природному субстрату АХЭ — ацетилхолину. Пятая глава описывает результаты моделирования реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте нативной БХЭ и ее полиморфной модификации АврТОИу. Эта замена заметно снижает скорость гидролиза сукцинилхолина БХЭ, что приводит к серьезным физиологическим последствиям у пациентов с этой полиморфной модификаций БХЭ при использовании сукцинилхолина в клинической практике. Методом молекулярного докинга и молекулярной динамики было показано, что замена аспарагиновой кислоты на глицин в полиморфной модификации БХЭ приводит к ухудшению связывания сукцинилхолина с ферментом. В ходе моделирования реакции гидролиза был получен набор стационарных точек на ППЭ модельной молекулярной системы, соответствующих прохождению реакции от фермент-субстратного комплекса к ацилферменту через тетраэдрический интермеяиат вдоль предполагаемых координат реакции. Для полученных стационарных точек был проведен расчет энергетических барьеров стадии ацилиования реакции для нативного и модифицированного ферментов. На Рис. 12 представлено положение субстрата в фермент-субстратном комплексе для нативного и модифицированного фермента. Сложноэфирная группа субстрата гшанарна, расстояния Н^ег^И^нызв и О^етюа-Свись составляют 1.51 А (1.56 А для Азр7(Ю1у) и 2.77 А (2.64 А для Азр7001у), что благоприятствует нуклеофильной атаке 8ег198 и синхронному переносу протона с Бег 198 на №$438 на первой стадии реакции.

В геометрической конфигурации тетраэдрического интермедиата (рис. 13) расстояние между кислородом Яег198 и карбонильным углеродом сукцинилхолина составляет 1.44 А (1.45 А для А5р7(Ю1у), что отвечает образованию ксвапентной связи между молекулой субстрата и ферментом. Сложнозфирная фуппа принимает тетраэдрическую конфигурацию. В результате распада тетраэдрического интермедиата стадии ацилирования образуется молекула спирта, а также ацилфермент. Расстояние между ОтЬег:9з и Сзись равно 1.31 А (1.30 А для А5р700у), что свидетельствует об образовании ковалентной связи между ними, ацильная группа становится пленарной. Переноса второго протона между Шб438 и 01и325 на стадии ацилирования, возможность которого обсуждалась в ряде работ, не происходит. Значения полных энергий конфигураций, соответствующих стационарным точкам на ППЭ системы, полученные в результате геометрической оптимизации, были использованы для построения энергетического профиля стадии ацилирования реакции гидролиза. Основной задачей данной части исследования было сравнение энергетических профилей модифицированного и нативного ферментов (рис.14).

Таким образом, введенная мутация не оказывает заметного влияния на энергию активации и, следовательно, на константу что подтверждает

предположение об идентичном механизме реакции, но вместе с тем ухудшает связывание субстрата с ферментом. Этот результат согласуется с экспериментальными данными, которые показывают, что эта мутация основное влияние оказывает на Ки- Тем не менее, влияние введенной мутации сказывается на общем энергетическом профиле реакции путем стабилизации переходных состояний.

Список сокращений

АХЭ — ацетилхолинэстераза

БХЭ — бутирилхолинэстераза

КМ/ММ — комбинированный метод квантовой и молекулярной механики

Основпые результаты и выводы

1. По результатам расчетов методами КМ/ММ энергетических профилей стадий ацилирования и деацилирования реакции гидролиза ацетилхолина сформулированы заключения о механизме химических превращений в активном сайте ацетилхолинэстеразы. Деацилирование является лимитирующей стадией процесса с активационным барьером 8.4 ккал/моль. Стадия ацилирования характеризуется активационным барьером 7.2 ккал/моль.

2. Оценены скорости гидролиза в активном сайте ацетилхолинэстеразы серии субстратов — незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты. Теоретические корреляционные зависимости констант скорости от параметра гидрофобности согласуются с экспериментальными результатами. Показано, что оптимальное положение в активном сайте ацетилхолинэстеразы, обеспечивающее наименьший активационный барьер реакции гидролиза, достигается для соединения наиболее близкого к природному субстрату ацетилхолинэстеразы — ацетилхолину.

3. Для стадии ацилирования реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинэстеразы сопоставлены энергетические барьеры для нативного фермента и его полиморфной модификации АБр70С1у. Показано, что данная мутация в ферменте приводит к уменьшению активационного барьера и способствует стабилизации тетраэдрического интермедиата. Заметное изменение скорости гидролиза связано, в первую очередь, с образованием фермент-субстратного комплекса, а не с изменением механизма гидролиза.

4. По результатам расчетов во всех рассмотренных примерах ферментативные реакции холинэстераз проходят по однопротонному механизму.

Основные публикации по теме диссертации

1. Nemukhin A.V., Lushchekina S.V., Bochenkova A.V., Golubeva A.A., Varfolomeev S.D. Characterization of a complete cycle of acetylcholinesterase catalysis by ab initio QM/MM modeling // J. Mol. Model., 2008, v. 14(5), pp. 409-416.

2. Лущекина C.B., Немухин A.B., Морозов Д.И., Варфоломеев С.Д. Квантово-химическое обоснование специфичности ферментативного катализа. Корреляции между скоростью ферментативного катализа ацетилхолинэстеразой и структурой субстратов // Доклады Академии Наук, 2009, том 426, №3, с. 344-346.

3. Лущекина С.В., Григоренко Б.Л., Морозов ДМ., Поляков И.В., Немухин A.B., Варфоломеев С.Д. Моделирование механизма реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте нативной и модифицированной (Asp70Gly) бутирилхолинэстеразы человека // Известия Академии наук. Серия химическая, 2010, № 1, с. 56-61.

4. Lushchekina S.V., Nemukhin А.К, Morozov D.I., Varfolomeev S.D., Correlation between the Substrate Structure and the Rate of Acetylcholinesterase Hydrolysis modeled with the Combined Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Studies // Chemico-BiologicalInteractions, 2010, v. 187, №1-3, pp.59-63.

5. Лущекина C.B., Боченкова A.B., Немухин A.B. Моделирование реакции гидролиза ацетилхолина в активном центре ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007», Москва, 2007.

6. Лущекина СВ., Боченкова A.B., Морозов Д.И., Немухин A.B. Изучение активного сайта ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008», Москва, 2008, с. 639.

7. Lushchekina S.V., Bochenkova А. К, Morozov D.I., Varfolomeev S.D., Nemukhin А. V. The QM/MM study of hydrolysis reactions in active site of acetylcholinesterase // Book of abstracts of 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media", Moscow, 2008, p. 22.

8. Лущекина С.В., Морозов Д.И., Немухин А.В. Изучение активного сайта ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ // Материалы VIII Международной молодежной конференции «Биохимическая физика», ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва, 2008, с. 132.

9. Лущекина С.В., Морозов Д.И., Немухин А.В. Изучение активного сайта ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ // Материалы 6-ой Всероссийской Конференции «Молекулярное моделирование», Москва, 2009, с. 30.

10.Lushchekina S.V., Polyakov I.V., Grigorenko B.L., Morozov D.I., Varfolomeyev S.D., Nemukhin A.V. The QM/MM study of hydrolisys reactions in active site of butyrylcholinesterase // Book of abstracts of International Conference «Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications» Arkhangelsk, 2009, p. 24.

11..Lushchekina S.V., Grigorenko B.L., Polyakov I.V., Morozov D.I., Varfolomeev S.D., Nemukhin A. V. The QM/MM study of hydrolysis reactions in activc sites of cholinesterases 11 Book of abstracts of 10th International Meeting on Cholinesterases», Sibenic, Croatia, 2009, p. 101.

ИЛущекина C.B., Григоренко Б.Л., Поляков И.В., Морозов Д.И., Варфоломеев С.Д., Немухин А.В. Изучение реакций гидролиза в активном сайте холинэстераз методом КМ/ММ // Материалы XIX Международной молодежной конференции «Биохимическая физика», ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва, 2009, с. 141-142 .

13. Немухин А.В., Лущекина С.В., Варфоломеев С.Д., Методы квантовой и молекулярной механики в моделировании механизмов реакций ферментативного катализа // Методы компьютерного моделирования для исследования полимеров и биополимеров, 2009, М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», с. 17-34.

Подписано в печать:

18.01.2011

Заказ № 4860 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ.

1.1 Физиологическая функция ацетилхолинэстеразы.

Классическая каталитическая функция АХЭ.

Неклассические функции АХЭ.

АХЭ — эритроцитарный антиген.

Молекулярный полиморфизм АХЭ.

1.2 Заболевания, связанные с АХЭ.

Болезнь Альцгеймера.

Миастенический синдром.

1.3 Структура и каталитический механизм действия АХЭ.

Структура АХЭ.

Механизм гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ.

1.4 Компьютерное моделирование реакций АХЭ.

Молекулярно-динамическое моделирование.

Молекулярный докинг.

Моделирование реакции гидролиза.

1.5 Бутирилхолинэстераза.

Функция БХЭ.

Сравнение строения БХЭ и АХЭ.

Особенности катализа БХЭ.

Роль БХЭ в терапии болезни Альцгеймера.

Взаимодействие с фосфорорганическими соединениями.

Молекулярный полиморфизм БХЭ.

Атипичная БХЭ, роль Азр70.

Гидролиз кокаина.

Для решения задач медицины, фармацевтики и биотехнологии необходимы представления о механизмах реакций ферментативного катализа, что предполагает знание элементарных стадий химических превращений в активных центрах белков. Экспериментальные приемы включают исследования структуры белков и их комплексов с аналогами субстратов с использованием методов рентгеноструктурного анализа и ядерного-магнитного резонанса. Закономерности протекания ферментативных реакций изучаются методами химической кинетики. Существенную поддержку этим исследованиям оказывают методы генной инженерии.

В настоящее время становится возможным проводить анализ элементарных стадий ферментативных реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые в экспериментальных исследованиях, с привлечением методов молекулярного моделирования. На данный момент наиболее перспективной группой методов можно считать комбинированные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), которые позволяют детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения и молекул растворителя. Основной принцип приближения КМ/ММ заключается в описании центральной части системы с использованием квантово-механических методов, а окружающей части — с использованием методов молекулярной механики.

Диссертация посвящена изучению механизмов реакций гидролиза в активном центре ферментов, относящихся к семейству холинэстераз: ацетилхолинэстеразы (АХЭ) — одного из ключевых ферментов центральной нервной системы, и фермента, выполняющего в организме защитные функции -— бутирилхолинэстеразы (БХЭ). Детальное исследование механизмов холинэстеразного гидролиза является актуальной задачей, поскольку эта информация позволяет не только предсказать активность нативных ферментов в отношении различных субстратов, но и предложить модификации природных белков для получения более эффективных с точки зрения медицинских приложений ферментов.

Целью работы являлось изучение механизмов реакций гидролиза сложных эфиров в активном сайте холинэстераз с использованием метода КМ/ММ. "

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Построить энергетический профиль реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы.

2. Оценить скорости гидролиза ряда незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты в активном сайте ацетилхолинэстеразы.

3. Исследовать влияние выбора квантовой подсистемы на. результаты моделирования механизма реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ.

4. Построить энергетический профиль реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинэстеразы.

5. Изучить влияние полиморфной модификации АБр7001у на механизм реакции гидролиза сукцинилхолина- в активном сайте бутирилхолинэстеразы.

В рамках настоящей работы впервые проведено компьютерное моделирование методом КМ/ММ и построен энергетический профиль полного цикла гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы. Локализованы стационарные точки на поверхности потенциальной энергии и определены энергетические барьеры обеих стадий реакции (ацилирования и деацилирования), составляющие, соответственно, 7.2 и 8.4 ккал/моль.

На основании полученных методом КМ/ММ структур фермент-субстратных комплексов оценены скорости гидролиза незаряженных сложноэфирных субстратов в активном сайте ацетилхолинэстеразы. Для серии незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты показано, что наиболее благоприятное положение субстрата в активном центре, обеспечивающее наименьший активационный барьер, достигается для соединений, наиболее близких по структуре к природному субстрату ацетилхолинэстеразы — ацетилхолину.

Показано, что для корректного моделирования реакций гидролиза в активном ~ сайте ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ в квантовую подсистему необходимо включать не только аминокислотные фрагменты, непосредственно участвующие в реакции (Н1б447, 8ег203), но другие ключевые аминокислотные остатки активного центра (01и202, С1и334, 01у121,01у122, А1а204).

Показано, что полиморфная модификация Азр7001у не оказывает существенного влияния на энергетический профиль первой стадии реакции гидролиза сукцинилхолина БХЭ; активационные барьеры для нативного фермента и его полиморфной модификации близки, но тетраэдрический интермедиат для модифицированного фермента отличается большей стабильностью.

По результатам расчетов во всех рассмотренных примерах ферментативные реакции холинэстераз проходят по однопротонному механизму.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты исследования позволяют детализировать механизм химической реакции, катализируемой ферментами на молекулярном уровне и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза в активном сайте холинэстераз позволяет предсказывать активность полиморфных модификаций этого фермента, встречающихся у человека, и облегчает создание модифицированных ферментов, способных расщеплять опасные для организма соединения.

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва,

2008), 2-ой международной конференции «Biocatalysis in Non-Conventional Media» (Москва, 2008), VIII Международной молодежной конференции "Биохимическая физика", ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2008), 6-ой Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва,

2009), Международной конференции «Biocatalysis-2009» (Архангельск, 2009), Международной конференции «10th International Meeting on Cholinesterases» (Шибеник, Хорватия, 2009), XIX Международной молодежной конференции "Биохимическая физика", ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2009).

Результаты работы опубликованы в 13 печатных работах, в том числе в 4 статьях в рецензируемых научных журналах.

Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 210 наименований. Работа изложена на 150 страницах и включает 49 рисунков и 7 таблиц.

Основные результаты и выводы

1. По результатам расчетов методами КМ/ММ энергетических профилей стадий ацилирования и деацилирования реакции гидролиза ацетилхолина сформулированы заключения о механизме химических превращений в активном сайте ацетилхолинэстеразы. Деацилирование является лимитирующей стадией процесса с активационным барьером 8.4 ккал/моль. Стадия ацилирования характеризуется активационным барьером 7.2 ккал/моль.

2. Оценены скорости гидролиза в активном сайте ацетилхолинэстеразы серии субстратов — незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты. Теоретические корреляционные зависимости констант скорости от параметра гидрофобности согласуются с экспериментальными результатами. Показано, что оптимальное положение в активном сайте ацетилхолинэстеразы, обеспечивающее наименьший активационный барьер реакции гидролиза, достигается для соединения наиболее близкого к природному субстрату ацетилхолинэстеразы — ацетилхолину.

3. Длястадии ацилирования реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинэстеразы сопоставлены энергетические барьеры для нативного фермента и его полиморфной модификации АБр7001у. Показано, что данная мутация в ферменте приводит к уменьшению активационного барьера и способствует стабилизации тетраэдрического интермедиата. Заметное ухудшение скорости гидролиза связано, в первую очередь, с образованием менее прочного фермент-субстратного комплекса, а не с изменением механизма гидролиза.

4. По результатам расчетов во всех рассмотренных примерах ферментативные реакции холинэстераз проходят по однопротонному механизму.

5.4 Заключение

Результаты моделирования образования фермент-субстратного комплекса методом молекулярной докинга и молекулярной динамики сукцинилхолина с нативной и модифицированной БХЭ показывают, что полиморфная модификация Азр7001у приводит к существенному снижению энергии связывания фермента с субстратом, т.е. образуется менее прочный комплекс Махаэлиса.

Результаты моделирования методом КМ/ММ показывают, что полиморфная модификация Азр7(Ю1у БХЭ не приводит к качественно отличному энергетическому профилю реакции гидролиза сукцинилхолина для стадии ацилирования по сравнению с нативным ферментом. Количественные отличия в активационных барьерах также не велики, однако, для модифицированного фермента характерна несколько большая стабилизации тетраэдрического интермедиата. Таким образом, объединяя результаты, полученные с использованием различных методов молекулярного моделирования, мы получаем, что полиморфная модификация Азр7(Ю1у приводит к ухудшению Км реакции гидролиза сукцинилхолина что согласуется с экспериментальными данными [189].

1. Дудель Й. Физиология человека. / Под ред. Р. Шмидт, Г. Тевс. Москва: Мир,1996.-Т. 1.-323 с.

2. Silman I., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: 'classical' and 'non-classical' functionsand pharmacology // Current Opinion in Pharmacology. 2005. - v. 5. - p. 293-302.

3. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Москва: Мир,1993.-Т. 2.-384 с.

4. Quinn D.M. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dynamics, and virtualtransition states // Chemical Reviews. 1987. - v. 87. - p. 955-979.

5. Rosenberry T.L. Acetylcholinesterase. // Advances in Enzymology and Related Areas of

6. Molecular Biology. 1975.-v. 43.-p. 103-218.

7. Silver A. A histochemical investigation of cholinesterases at neuromuscular junctions inmammalian and avian muscle. // Journal of Physiology. 1963. - v. 169. - p. 386393.

8. Momonoki Y.S. Occurrence of acetylcholine-hydrolyzing activity at the stele-cortexinterface//PlantPhysiology. 1992.-v. 99(1).-p. 130-133.

9. Sagane Y., Nakagawa Т., Yamamoto K., Michikawa S., Oguri S., Momonoki Y.S.

10. Molecular characterization of maize acetylcholinesterase. A novel enzyme family in the plant kingdom // Plant Physiology. 2005. - v. 138(3). - p. 1359-1371.

11. Soreq H., Seidman S. Acetylcholinesterase — new roles for an old actor //

12. Neuroscience. 2001. - v. 2. - p. 294-302.

13. Sternfeld M„ Ming G.-L., Song H.-J., Sela K., Timberg R., Poo M.-M., Soreq H.

14. Acetylcholinesterase enhances neurite growth and synapse development through alternative contributions of its hydrolytic capacity, core protein, and variable С termini // Journal of Neuroscience. 1998. - v. 18(4). - p. 1240-1249.

15. Grifman M., Galyam N., Seidman S., Soreq H. Functional redundancy ofacetylcholinesterase and neuroligin in mammalian neuritogenesis. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998. - v. 95. -p. 13935-13940.

16. Koenigsberger C., Chiappa S., Brimijoin S. Ncurite differentiation is modulated inneuroblastoma cells engineered for altered acetylcholinesterase expression. // Journal ofNeurochemistry. 1997. - v. 69. - p. 1389-1397.

17. Karpel R., Ben Aziz-Aloya R., Sternfeld M., Ehrlich G., Ginzberg D., Tarroni P.,

18. Clementi F., Zakut H., Soreq H. Expression of three alternative acetylcholinesterase messenger RNAs in human tumor cell lines of different tissue origins. // Experimental Cell Research. 1994. - v. 210. - p. 268.

19. Fitzpatrick-Mcelligott S., Stent G.S. Appearance and localization of acetylcholinesterasein embryos of the leech Helobdella triserialis. // Journal ofNeuroscience. 1981. - v. l.-p. 901-907.

20. Kawashima K., Fujii T. Extraneuronal cholinergic system in lymphocytes //

21. Pharmacology & Therapeutics. 2000. - v. 86. - p. 29-^18.

22. Lev-Lehman E., Deutsch V., Eldor A., Soreq H. Immature human megakaryocytesproduce nuclear-associated acetylcholinesterase // Blood. 1997. - v. 89(10). - p. 3644-3653.

23. Paoletti F., Mocali A., Vannucchi A.M. Acetylcholinesterase in murine erythroleukemia

24. Friend) cells: evidence for megakaryocyte-like expression and potential growth-regulatory role of enzyme activity. // Blood. 1992. - v. 79. - p. 2873-2879.

25. Masson P., Froment M.-T., Sorenson R.C., Bartels C.F., Lockridge O. Mutation His322Asn in human acetylcholinesterase does not alter electrophoretic and catalyticproperties of the erythrocyte enzyme // Blood. 1994. - v. 83(10). - p. 3003-3005.

26. Giles C.M., Metaxas-Buhler M., Romanski Y., Metaxas M.N. Studies on the Yt bloodgroup system.//Vox Sanguinis. 1967.-v. 13.-p. 171-180.

27. Варфоломеев С.Д., Курочкин И.Н., Гариев И.А. Ферменты человека —генетический, протеомный и каталитический полиморфизм / С.Д. Варфоломеев // Молекулярный полиморфизм человека. Москва: Российский университет дружбы народов, 2007. - с. 203-311.

28. Hasin Y., Avidan N., Bercovich D., Korczyn A., Silman I., Beckmann J.S., Sussman

29. J.L. A paradigm for single nucleotide polymorphism analysis: The case of the acetylcholinesterase gene // Human Mutation. 2004. - v. 24(5). - p. 408-416.

30. Hasin Y., Avidan N., Bercovich D., Korczyn A.D., Silman I., Beckmann J.S., Sussman

31. J.L. Analysis of genetic polymorphisms in acetylcholinesterase as reflected in different populations // Current Alzheimer Research. - 2005. - v. 2. - p. 207-218.

32. Giacobini E. Cholinesterases and cholinesterase inhibitors. Abingdon, UK: Informa1. Health Care, 2000. 270 p.

33. Giacobini E. Selective inhibitors of butyrylcholinesterase: a valid alternative for therapyof Alzheimer's disease? // Drugs & Aging. 2001. - v. 18(12). - p. 891-898.

34. Giacobini E. Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease //

35. Neurochemical Research. -2003. v. 28(3-4). - p. 515-522.

36. Giacobini E. Cholinergic function and Alzheimer's disease // International Journal of

37. Geriatric Psychiatry. 2003. - v. 18. - p. Sl-5.

38. Giacobini E. Butyrylcholinesterase, its function and inhibitors. London and New

39. York: Martin Dunitz Pub, 2003. 181 p.

40. Giacobini E. Cholinesterase inhibitors: new roles and therapeutic alternatives //

41. Pharmacological Research. 2004. - v. 50(4). - p. 433-440.

42. Махаева Г.Ф., Фетисов В.И., Соколов В.Б., Янковская В.JI., Горева Т.В., Малыгин

43. В.В., Безноско Б.К., Галенко Т.Г., Коломиец А.Ф., И.В. М. Взаимодействие диалкил(а-карбометокси-Ь,Ь,Ь-трифторэтил)фосфатов с эстеразами млекопитающих. // Биоорганическая химия. 1987. - т. 13. - с. 33-37.

44. Radchenko Е., Makhaeva G., Malygin V., Sokolov V., Palyulin V., Zefirov N.

45. Modeling of the relationships between the structure of O-phosphorylated oximes and their anticholinesterase activity and selectivity using molecular field topology analysis (MFTA) // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2008. - v. 418(1). - p. 47-51.

46. Makhaeva G.F., Aksinenko A.Y., Sokolov V.B., Serebryakova O.G., Richardson R.J.

47. Synthesis of organophosphates with fluorine-containing leaving groups as serine esterase inhibitors with potential for Alzheimer disease therapeutics // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.-2009.-v. 19(19).-p. 5528-5530.

48. Beeson D. Congenital myasthenic syndromes // Advances in Clinical Neuroscience and

49. Rehabilitation. -2005. v. 4(6). - p. 12-14.35. -Rotundo R.L., Rossi S.G., Kimbell L.M., Ruiz C., Marrero E. Targetingacetylcholinesterase to the neuromuscular synapse // Chemico-Biological Interactions.-2005.-v. 157-158.-p. 15-21.

50. Ohno K., Engel G. Congenital myasthenic syndromes: gene mutations // Neuromuscular

51. Disorders.-2004,-v. 14(1).-p. 117-121.

52. Belbeoc'h S., Massoulie J., Bon S. The C-terminal T peptide of acetylcholinesteraseenhances degradation of unassembled active subunits through the ERAD pathway // The EMBO Journal. 2003. - v. 22(14). - p. 3536-3545.

53. Sussman J.L., Harel M., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Silman I. Atomicstructure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein. // Science. 1991. - v. 253. - p. 872-879.

54. Tougu V., Pedak A., Kesvatera T., Aaviksaar A. Acetylcholinesterase as polyelectrolitein reaction with cationic substrates // FEBS Letters. 1987. - v. 225(1,2). - p. 77-81.

55. Tougu V. Acetylcholinesterase: mechanism of catalysis and inhibition // Current

56. Medicinal Chemistry -Central Nervous System Agents. 2001. - v. 1. - p. 155-170.

57. Kreienkamp H.-J., Weise C., Raba R., Aaviksaar A., Hucho F. Anionic subsites of thecatalytic center of acetylcholinesterase from Torpedo and from cobra venom. //

58. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -1991.-v. 88(14).-p. 6117-6121.

59. Sussman J.L., Harel M., Silman I. A. Shafferman, B. Velan // Multidisciplinary approaches to cholinesterase function. - New York: Plenum Press, 1992. - p. 95-107.

60. Fuxreiter M., Warshel A. Origin of the catalytic power of acetylcholinesterase:

61. Computer simulation studies // Journal of the American Chemical Society. 1998. -v. 120(1).-p. 183-194.

62. Bachovchin W.W., Roberts J.D. Nitrogen-15 nuclear magnetic resonance spectroscopy.

63. The state of histidine in the catalytic triad of .alpha.-lytic protease. Implications for the charge-relay mechanism of peptide-bond cleavage by serine proteases // Journal of the American Chemical Society. 1978. - v. 100(26). - p. 8041-8047.

64. Massiah M.A., Viragh C., Reddy P.M., Kovach I.M., Johnson J., Rosenberry T.L.,

65. Mildvan A.S. Short, strong hydrogen bonds at the active site of human acetylcholinesterase: proton NMR studies // Biochemistry. 2001. - v. 40. - p. 56825690.

66. Soreq H., Gnatt A., Loewenstein Y., Neville L.F. Excavations into the active-site gorgeof cholinesterases. // Trends in Biochemical Sciences. 1992. - v. 17. - p. 353.

67. Harel H., Kleywegt G.J., Ravelli R.B.G., Silman I., Sussman J.L. Crystal structure of anacetylcholinesterase-fasciculin complex: interaction of a three-fingered toxin from snake venom with its target // Structure. 1995. - v. 3. - p. 1355.

68. Ordentlich A., Barak D., Kronman C., Flashner Y., Leitner M., Segall Y., Ariel N.,

69. Radió Z., Pickering N.A., Vellom D.C., Camp S., Taylor P. Three distinct domains inthe cholinesterase molecule confer selectivity for acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitors // Biochemistry. 1993. - v. 32(45). - p. 12074-12084.

70. Radie Z., Quinn D.M., Vellom D.C., Camp S., Taylor P. Allosteric control ofacetylcholinesterase catalysis by fasciculin // Journal of Biological Chemistry. -1995. v. 270(35). - p. 20391-20399.

71. Shafferman A., Kronman C., Flashner Y., Leitner M., Grosfeld H., Ordentlich A., Gozes

72. Y., Cohen S., Ariel N., Barak D. Identification of residues involved in catalytic activity and in polypeptide folding // Journal of Biological Chemistry. 1992. - v. 267.-p. 17640-17648.

73. Radié Z., Gibney G., Kawamoto S., Macphee-Quigley K., Bongiorno C., Taylor P.

74. Expression of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants // Biochemistry. 1992. - v. 31(40). - p. 97609767.

75. Cléry-Barraud C., Ordentlich A., Grosfeld H., Shafferman A., Masson P. Pressure andheat inactivation of recombinant human acetylcholinesterase // European Journal of Biochemistry. 2002. - v. 269(17). - p. 4297-4307.

76. Jarv J., Kesvatera T., Aaviksaar A. Structure-activity relationships in acetylcholinesterase reactions. Hydrolysis of non-ionic acetic esters // European Journal of Biochemistry. 1976. - v. 67(2). - p. 315-322.

77. Kovarik Z., Radió Z., Berman H., Simeon-Rudolf V., Reiner E., Taylor P.

78. Acetylcholinesterase active centre and gorge conformations analysed by combinatorial mutations and enantiomeric phosphonates // Biochemical Journal. -2003.-v. 373.-p. 33-40.

79. Shaffermari A., Ordentlich A., Barak D., Kronman C., Ber R., Bino T., Ariel N., Osman

80. R., Velan B. Electrostatic attraction by surface charge does not contribute to the catalytic efficiency of acetylcholinesterase. // The EMBO Journal. 1994. - v. 13(15).-p. 3448-3455.

81. Macphee-Quigley K., Vedvick T.S., Taylor P., Taylor S.S. Profile of the disulfide bondsin acetylcholinesterase // Journal of Biological Chemistry. 1986. - v. 261(29). - p. 13565-13570.

82. Krupka R.M. Hydrolysis of neutral substrates by acetylcholinesterase // Biochemistry.1966.-v. 5(6).-p. 1983-1988.

83. Roskoski R. Choline acetyltransferase and acetylcholinesterase. Evidence for essentialhistidine residues //Biochemistry. 1974. - v. 13(25). -p. 5141-5144.

84. Stok J.E., Goloshchapov A., Song C., Wheeloclc C.E., Derbel M.B.H., Morisseau C.5

85. Hammock B.D. Investigation of the role of a second conserved serine in carboxylesterases via site-directed mutagenesis. // Archives of Biochemistry and . Biophysics. 2004. - v. 430. - p. 247-255.

86. Zhang Y., Kua J., McCammon J.A. Role of the catalytic triad and oxyanion hole inacetylcholinesterase catalysis: An ab initio QM/MM study // Journal of the American Chemical Society. -2002.-v. 124(35).-p. 10572-10577.

87. Viragh C., Harris T.K., Reddy P.M., Massiah M.A., Mildvan A.S., Kovach I.M. NMRevidence for a short, strong hydrogen bond at the active site of a cholinesterasc // Biochemistry. 2000. - v. 39(51).-p. 16200-16205.

88. Warshel A., Naray-Szabo G., Sussman F., Hwang J.K. How do serine proteases reallywork? // Biochemistry. 1989. - v. 28(9). - p. 3629-3637.

89. Blow D.M., Birktoft J.J., Hartley B.S. Role of a buried acid group in the mechanism ofaction of chymotrypsin //Nature. 1969. - v. 221. -p. 337-340.

90. Kovach I.M. Stereochemistry and secondary reactions in the irreversible inhibition ofserine hydrolases by organophosphorus compounds // Journal of Physical Organic Chemistry. 2004. - v. 17(6-7). - p. 602-614.

91. Sanson В., Nachon F., Colletier J.P., Froment M.T., Toker L., Greenblatt И.М.,

92. Carletti E.N., Li H., Li В., EkstroDm F., Nicolet Y., Loiodice M.L., Gillon E., Froment

93. M.T., Lockridge O., Schopfer L.M., Masson P., Nachon F. Aging of cholinesterases phosphylated by tabun proceeds through O-dealkylation // Journal of the American Chemical Society. 2008. - v. 130(47). - p. 16011-16020.

94. Carletti E., Aurbek N., Gillon E., Loiodice M., Nicolet Y., FontecillaD Camps J.C.,

95. Masson P., Thiermann H., Nachon F., Worek F. Structure-activity analysis of aging and reactivation of human butyrylcholinesterase inhibited by analogues of tabun // Biochemical Journal. 2009. - v. 421(1).-p. 97-106.

96. Carletti E.N., Colletier J.-P., Dupeux F., Trovaslet M., Masson P., Nachon F. Structuralevidence that human acetylcholinesterase inhibited by tabun ages through O-dealkylation // Journal of Medicinal Chemistry. 2010. - v. 53(10). - p. 4002-4008.

97. Массой П., Рошу Д. Каталитические «биоловушки» против токсических эфиров,альтернативный подход для профилактики и лечения отравлений // Acta naturae. -2009.-т. 1. — с. 68-78.

98. Nolte H.J., Rosenberry T.L., Neumann E. Effective charge on acetylcholinesteraseactive sites determined from the ionic strength dependence of association rate constants with cationic ligands // Biochemistry. 1980. - v. 19(16). - p. 3705-3711.

99. Felder C.E., Botti S.A., Lifson S., Silman I., Sussman J.L. External and internalelectrostatic potentials of cholinesterase models // Journal of Molecular Graphics and Modelling. 1997. - v. 15(5). - p. 318-327.

100. Antosiewicz J., McCammon J.A., Wlodek S.T., Gilson M.K. Simulation of chargemutant acetylcholinesterases // Biochemistry. 1995. - v. 34(13). - p. 4211-4219.

101. Antosiewicz J., Wlodek S.T., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: role of theenzyme's charge distribution in steering charged ligands toward the active site // Biopolymers. 1996. - v. 39(1). - p. 85-94.

102. Tara S., Elcock A.H., Kirchhoff P.D., Briggs J.M., Radic Z., Taylor P., McCammon J.A.

103. Rapid binding of a cationic active site inhibitor to wild type and mutant mouse acetylcholinesterase: Brownian dynamics simulation including diffusion in the active site gorge // Biopolymers. 1998. - v. 46(7). - p. 465-474.

104. Botti S.A., Felder C.E., Lifson S., Sussman J.L., Silman I.I. A modular treatment ofmolecular traffic through the active site of cholinesterase // Biophysical Journal. -1999. v. 77(5). - p. 2430-2450.

105. Wlodek S.T., Shen T., McCammon J.A. Electrostatic steering of substrate toacetylcholinesterase: analysis of field fluctuations // Biopolymers. 2000. - v. 53(3). -p. 265-271.

106. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase:electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry. 2002. - v. 32(2).-p. 401-403.

107. Zhou Y.C., Lu B., Huber G.A., Hoist M.J., McCammon J.A. Continuum simulations ofacetylcholine consumption by acetylcholinesterase: a Poisson-Nernst-Planck approach // The Journal of Physical Chemistry B. 2008. - v. 112(2). - p. 270-275.

108. Wlodek S.T., Clark T.W., Scott L.R., McCammon J.A. Molecular dynamics ofacetylcholinesterase dimer complexed with tacrine // Journal of the American Chemical Society. 1997. - v. 119(40). - p. 9513-9522.

109. Gilson M.K., Straatsma T.P., McCammon J.A., Ripoll D.R., Faerman C.IL, Axelsen

110. P.H., Silman I., Sussman J.L. Open "back door" in a molecular dynamics simulation . of acetylcholinesterase // Science. 1994. - v. 263(5151). -p. 1276-1278.

111. Henchman R.H., Tai K., Shen T., McCammon J.A. Properties of water molecules in theactive site gorge of acetylcholinesterase from computer simulation // Biophysical Journal. 2002. - v. 82(5). - p. 2671-2682.

112. Bui J.M., Henchman R.H., McCammon J.A. The dynamics of ligand barrier crossinginside the acetylcholinesterase gorge // Biophysical Journal. 2003. - v. 85(4). - p. 2267-2272.

113. Bui J.M., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: Pivotal roles of its long omega loop

114. Cys69-Cys96) in regulating substrate binding // Chemico-Biological Interactions. -2005.-v. 157-158.-p. 357-359.

115. Shi J., Tai K., McCammon J.A., Taylor P., Johnson D.A. Nanosecond dynamics of themouse acetylcholinesterase cys69-cys96 omega loop // Journal of Biological Chemistry. 2003. - v. 278(33). - p. 30905-30911.

116. Kua J., Zhang Y., McCammon J.A. Studying enzyme binding specificity inacetylcholinesterase using a combined molecular dynamics and multiple docking approach // Journal of the American Chemical Society. 2002. - v. 124(28). - p. 8260-8267.

117. Tara S., Straatsma T.P., McCammon J.A. Mouse acetylcholinesterase unliganded and incomplex with huperzine A: a comparison of molecular dynamics simulations // Biopolymers. 1999. - v. 50(1). - p. 35-43.

118. Tara S., Helms V., Straatsma T.P., McCammon J.A. Molecular dynamics of mouseacetylcholinesterase complexed with huperzine A // Biopolymers. 1999. - v. 50(4). - -p. 347^359.

119. Shen T.Y., Tai K., McCammon J.A. Statistical analysis of the fractal gating motions ofthe enzyme acetylcholinesterase // Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 2001. - v. 63(4 Pt 1). - p. 041902.

120. Tai K., Shen T., Borjesson U., Philippopoulos M., McCammon J.A. Analysis of a 10-nsmolecular dynamics simulation of mouse acetylcholinesterase // Biophysical Journal. -2001. v. 81(2).-p. 715-724.

121. Shen T., Tai K., Henchman R.H., McCammon J.A. Molecular dynamics ofacetylcholinesterase // Accounts of Chemical Research. 2002. - v. 35(6). - p. 332340.

122. Bui J.M., Andrew McCammon J. Intrinsic conformational flexibility ofacetylcholinesterase // Chemico-Biological Interactions. 2008. - v. 175(1-3). - p. 303-304.

123. Elcock A.H., Gabdoulline R.R., Wade R.C., McCammon J.A. Computer simulation of protein-protein association kinetics: acetylcholinesterase-fasciculin // Journal of Molecular Biology. 1999.-v. 291(1).-p. 149-162.

124. Tai K., Shen T., Henchman R.H., Bourne Y., Marchot P., McCammon J.A. Mechanismof acetylcholinesterase inhibition by fasciculin: a 5-ns molecular dynamics simulation- //Journal of the American Chemical Society. 2002. - v. 124(21). - p. 6153-6161.

125. Minh D.D., Bui J.M., Chang C.E., Jain T., Swanson J.M., McCammon J A. Theentropic cost of protein-protein association: a case study on acetylcholinesterase binding to fasciculin-2 // Biophysical Journal. 2005. - v. 89(4). - p. L25-27.

126. Bui J.M., Radic Z., Taylor P., McCammon J.A. Conformational transitions in proteinprotein association: binding of fasciculin-2 to acetylcholinesterase // Biophysical Journal. 2006. - v. 90(9). - p. 3280-3287.

127. Zhang D., Suen J., Zhang Y., Song Y., Radic Z., Taylor P., Hoist M.J., Bajaj C., Baker

128. N.A., McCammon J.A. Tetrameric mouse acetylcholinesterase: continuum diffusion rate calculations by solving the steady-state Smoluchowski equation using finite element methods // Biophysical Journal. 2005. - v. 88(3). - p. 1659-1665.

129. Gorfe A.A., Chang C.E., Ivanov I., McCammon J.A. Dynamics of the acetylcholinesterase tetramer // Biophysical Journal. 2008. - v. 94(4). - p. 11441154.

130. Gorfe A.A., Lu B., Yu Z., McCammon J.A. Enzymatic activity versus structural- dynamics: The case of acetylcholinesterase tetramer // Biophysical Journal. 2009. -v. 97(3).-p. 897-905.

131. Zhang D., McCammon J.A. The association of tetrameric acetylcholinesterase with

132. ColQ tail: a block normal mode analysis // PLoS Computational Biology. 2005. - v. 1(6).-p. e62.

133. Guo J., Hurley M.M., Wright J.B., Lushington G.H. A docking score function forestimating ligand-protein interactions: application to acetylcholinesterase inhibition // Journal of Medicinal Chemistry. 2004. - v. 47(22). - p. 5492-5500.

134. Kua J., Zhang Y., Eslami A.C., Butler J.R., McCammon J.A. Studying the roles of

135. W86, E202, and Y337 in binding of acetylcholine to acetylcholinesterase using a combined molecular dynamics and multiple docking approach // Protein Science. -2003.-v. 12(12).-p. 2675-2684.

136. Alisaraie L., Fels G. Molecular docking study on the "back door" hypothesis forproduct clearance in acetylcholinesterase // Journal of Molecular Modeling. 2006. -v. 12(3).-p. 348-354.

137. Shen Q., Peng Q., Shao J., Liu X., Huang Z., Pu X., Ma L., Li Y.M., Chan A.S, Gu L.

138. Synthesis and biological evaluation of functionalized coumarins as acetylcholinesterase inhibitors // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2005. -v. 40(12).-p. 1307-1315.

139. Da Silva C.H., Campo V.L., Carvalho I., Tail C.A. Molecular modeling, docking and

140. ADMET studies applied to the design of a novel hybrid for treatment of Alzheimer's disease // Journal of Molecular Graphics and Modelling. 2006. - v. 25(2). - p. 169175.

141. Doucet-Personeni C., Bentley P.D., Fletcher R.J., Kinkaid A., Kryger G., Pirard В.,

142. Taylor A., Taylor R., Taylor J., Viner R., Silman I., Sussman J.L., Greenblatt H.M., Lewis T. A structure-based design approach to the development of novel, reversible AChE inhibitors // Journal of Medicinal Chemistry. 2001. - v. 44(20). - p. 32033215.

143. Correa-Basurto J., Flores-Sandoval C., Marin-Cruz J., Rojo-Dominguez A., Espinoza

144. Fonseca L.M., Trujillo-Ferrara J.G. Docking and quantum mechanic studies on cholinesterases and their inhibitors // European Journal of Medicinal Chemistry. -2007.-v. 42(1).-p. 10-19.

145. Akula N., Lecanu L., Greeson J., Papadopoulos V. 3D QSAR studies of AChEinhibitors based on molecular docking scores and CoMFA // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2006. - v. 16(24). - p. 6277-6280.

146. Махаева Г.Ф., Малыгин B.B., Якубов Ш.М., Горбунов С.М. Исследование связиструктура-антиэстеразная активность" в ряду О-фосфорилированных оксимов.

147. Метилфосфонаты. // Химико-фармацевтический журнал. 1994. - т. 28. - с. 69.

148. Махаева Г.Ф., Малыгин В.В., Якубов Ш.М., Горбунов С.М. Исследование связиструктура-антиэстеразная активность" в ряду О-фосфорилированных оксимов.1.. Фосфаты и метилфосфонаты. // Химико-фармацевтический журнал. 1994. -т. 28.-с. 14-18.

149. Плямоватый А.Х., Вандюкова И.И., Шагидуллин P.P., Махаева Г.Ф., Малыгин

150. В.В. Исследование взаимосвязи между пространственной структурой и антихолинэстеразной активностью О-фосфорилированных оксимов. // Химико-фармацевтический журнал. 1997. - т. 31. - с. 38-43.

151. Makhaeva G.F., Filonenko I.V., Yankovskaya V.L., Fomicheva S.B., Malygin V.V.

152. Comparative studies of 0,0-dialkyl-0-chloromethylchloroformiinino phosphates: interaction with neuropathy target esterase and acetylcholinesterase // Neurotoxicology. 1998. - v. 19(4-5). - p. 623-628.

153. Махаева Г.Ф., Янковская В.Л., Ковалева H.B., Фетисов В.И., Малыгин В.В.,

154. Торгашева Н.А., Б.А. X. Антиэстеразная активность и токсичность 0,0136диалкил-Б-этоксикарбонил-бромметилтиофосфатов. // Биоорганическая химия. 1999.-т. 25.-с. 8-13.

155. Махаева Г.Ф., Янковская B.JL, Ковалева Н.В., Фетисов В.И., Малыгин В.В.,

156. Торгашева Н.А., Хаскин Б.А. 0,0-Диалкил-8-бромметилтио-фосфаты -ингибиторы холин- и карбоксилэстераз млекопитающих: связь "структура-активность". // Биоорганическая химия. — 1999. — т. 25. — с. 3-7.

157. Махаева Г.Ф., Малыгин В.В., Мартынов И.В. Оценка нейротоксичного потенциала ряда метил- и фенилфосфонатов с использованием стабильного препарата нейротоксичной эстеразы мозга кур. // Доклады Академии Наук. -2001.-т. 377.-с. 1-4.

158. Махаева Г.Ф., Малыгин B.B., Аксиненко А.Ю., Соколов В.Б., Страхова Н.Н.,

159. Раздольский А.Н., Ричардсон Р.Д., Мартынов И.В. Фторсодержащие а-аминофосфонаты новый тип необратимых ингибиторов сериновых гидролаз // Доклады академии наук, биохимия, биофизика, молекулярная биология. - 2005. -т. 400.-с. 1-5.

160. Махаева Г.Ф., Серебрякова О.Г., Болтнева Н.Г1., Галенко Т.Г., Аксиненко А.Ю.,

161. Соколов В.Б., И.В.Мартынов Эстеразный профиль и анализ связи структура-ингибиторная селективность гомологичных фосфорилированных 1-гидроперфторизопропанолов // Доклады академии наук, биохимия, биофизика, молекулярная биология.-2008.-т. 423.-е. 826-831.

162. Vagedes P., Rabenstein В., Aqvist J., Marelius J., Knapp E.-W. The deacylation step ofacetylcholinesterase: Computer simulation studies // Journal of the American Chemical Society. 2000. - v. 122(49). - p. 12254 -12262.

163. Wang Q.M., Jiang H.L., Chen K.X., Ji R.Y., Ye Y.-J. Theoretical studies on thepossible reaction pathway for the deacylation of the AChE-catalyzed reaction // International Journal of Quantum Chemistry. 1999. - v. 74(3). - p. 315 - 325.

164. Sant'anna C.M.R., Dos Santos Viana A., Do Nascimento N.M.J. A semiempiricalstudy of acetylcholine hydrolysis catalyzed by Drosophila melanogaster acetylcholinesterase // Bioorganic Chemistry. 2006. - v. 34(2). - p. 77-89.

165. Wang Q., Jiang H., Chen J., Chen K., Ji R. On the possible reaction pathway for theacylation of AChE-catalyzed hydrolysis of ACh: Semiempirical quantum chemical study // International Journal of Quantum Chemistry. 1998. - v. 70(3). - p. 515525.

166. Igarashi M., Ishibashi T., Nishihira J., Tachikawa H. Energetics of catalytic reaction ofacetylcholinesterase with acetylcholine: role of the oxyanion hole. // Internet Electronic Journal of Molecular Design. 2003. - v. 2. - p. 712-722.

167. Tachikawa H., Igarashi M., Nishihira J., Ishibashi T. Ab initio model study onacetylcholinesterase catalysis: potential energy surfaces of the proton transfer reactions. // Journal of Photochemistry and Photobiology. 2005. - v. 79. - p. 11-23.

168. Manojkumar T.K., Cui C., Kim K.S. Theoretical insights into the mechanism ofacetylcholinesterase-catalyzed acylation of acetylcholine // Journal of Computational Chemistry.-2005.-v. 26(6).-p. 606-611.

169. Zhang Y., Kua J., McCammon J.A. Influence of structural fluctuation on enzymereaction energy barriers in combined quantum mechanical/molecular mechanical studies // The Journal of Physical Chemistry B. 2003. - v. 107(18). - p. 4459-4463.

170. Cheng Y., Cheng X., Radic Z., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: mechanisms ofcovalent inhibition of wild-type and H447I mutant determined by computational analyses // Journal of the American Chemical Society. 2007. - v. 129(20). - p. 6562-6570.

171. Cheng Y.H., Cheng X.L., Radic Z., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: mechanisms of covalent inhibition of H447I mutant determined by computational analyses // Chemico-Biological Interactions. 2008. - v. 175(1-3). - p. 196-199.

172. Kwasnieski O.L., Verdier L., Malacria M., Derat E. Fixation of the two tabun isomersin acetylcholinesterase: a QM/MM study // The Journal of Physical Chemistry B. -2009.-v. 113(29).-p. 10001-10007.

173. Beck J.M., Hadad C.M. Reaction profiles of the interaction between sarin andacetylcholinesterase and the S203C mutant: Model nucleophiles and QM/MM potential energy surfaces // Chemico-Biological Interactions. 2010.

174. Соколовская Л.Г., Сиголаева Л.В., Еременко A.B., Курочкин И.Н., Махаева Г.Ф.,

175. Малыгин В.В., Зыкова И.Е., Холстов В.И., Завьялова Н.В., Варфоломеев С.Д. Семейство биосенсорных анализаторов для оценки «эстеразного статуса» организма. // Химическая и биологическая безопасность. 2004. - т. 13-14. - с. 21-31.

176. Manoharan I., Boopathy R., Darvesh S., Lockridge O. A medical health report onindividuals with silent butyrylcholinesterase in the Vysya community of India // Clinica Chimica Acta. 2007. - v. 378. - p. 128-135.

177. Gawin F.H., Ellinwood E.H. Cocaine and other stimulants. Actions, abuse, and treatment // The New England journal of medicine. 1988. - v. 318(18). - p. 11731182.

178. Masson P., Lockridge O. Butyrylcholinesterase for protection from organophosphoruspoisons: Catalytic complexities and hysteretic behavior // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2009.

179. Harel M., Sussman J.L., Krejci E., Bon S., Chanal P., Massoulie J., Silman I.

180. Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992. - v. 89(22).-p. 10827-10831.

181. Nachon F., Nicolet Y., Viguie N., Masson P., Fontecilla-Camps J.C., Lockridge O.

182. Engineering of a monomeric and low-glycosylated form of human butyrylcholinesterase // European Journal of Biochemistry. 2002. - v. 269. - p. 630-637.

183. Nicolet Y., Lockridge O., Masson P., Fontecilla-Camps J.C., Nachon F. Crystalstructure of human butyrylcholinesterase and of its complexes with substrate and products // Journal of Biological Chemistry. 2003. - v. 278(42). -p. 41141-41147.

184. Millard C.B., Kryger G., Ordentlich A., Greenblatt H.M., Harel M., Raves M.L., Segall

185. Y., Barak D., Shafferman A., Silman I., Sussman J.L. Crystal structures of aged phosphonylated acetylcholinesterase: nerve agent reaction products at the atomic level //Biochemistry. 1999. - v. 38(22). - p. 7032-7039.

186. Masson P., Froment M.-T., Fortier P.L., Visicchio J.E., Bartels C.F., Lockridge O.

187. Butyrylcholinesterase-catalysed hydrolysis of aspirin, a negatively charged ester, and aspirin-related neutral esters. // Biochimica et Biophysica Acta Protein Structure and Molecular Enzymology. - 1998. - v. 1387(1-2). - p. 41-52.

188. Masson P., Goldstein B.N., Debouzy J.C., Froment M.T., Lockridge O., Schopfer L.M.

189. Damped oscillatory hysteretic behaviour of butyrylcholinesterase with benzoylcholine as substrate // European Journal of Biochemistry. 2004. - v. 271(1). -p. 220r234.

190. Masson P., Froment M.T., Gillon E., Nachon F., Darvesh S., Schopfer L.M. Kineticanalysis of butyrylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of acetanilides // Biochimica et Biophysica Acta. 2007. - v. 1774(9). - p. 1139-1147.

191. Badiou A., Froment M.T., Fournier D., Masson P., Belzunces L.P. Hysteresis of insectacetylcholinesterase // Chemico-Biological Interactions. 2008. - v. 175(1-3). - p. 410-412.'

192. Suârez D., Diaz N., Fontecilla-Camps J., Field M.J. A computational study of thedeacylation mechanism of human butyrylcholinesterase // Biochemistry. 2006. - v. 45(24).-p. 7529-7543.

193. Darvesh S., Hopkins D.A., Geula C. Neurobiology of butyrylcholinesterase // Nature

194. Reviews Neuroscience. -2003. v. 4(2). - p. 131-138.

195. Wong L., Radic Z., Bruggemann R.J.M., Hosea N., Berman H.A., Taylor P. Mechanism of oxime reactivation of acetylcholinesterase analyzed by chirality and mutagenesis // Biochemistry. 2000. - v. 39(19). - p. 5750-5757.

196. Kovarik Z., Calic M., Sinko G., Bosak A., Berend S., Vrdoljak A.L., Radic B. Oximes:

197. Reactivators of phosphorylated acetylcholinesterase and antidotes in therapy against tabun poisoning // Chemico-Biological Interactions. 2008. - v. 175(1-3). - p. 173179.

198. Pang Y.-P., Kollmeyer T.M., Hong F., Lee J.-C., Hammond P.I., Haugabouk S.P.,

199. Brimijoin S. Rational Design of Alkylene-Linked Bis-Pyridiniumaldoximes as Improved Acetylcholinesterase Reactivators // 2003. - v. 10(6). - p. 491-502.

200. Wang J., Gu J., Leszczynski J., Feliks M., Sokalski W.A. Oxime-Induced Reactivationof Sarin-Inhibited AChE:D A Theoretical Mechanisms Study // The Journal of Physical Chemistry B. 2007. - v. 111(9). - p. 2404-2408.

201. Vyas S., Hadad C.M. Reactivation of model cholinesterases by oximes and intermediate phosphyloximes: A computational study // Chemico-Biological Interactions.-2008.-v. 175(1-3).-p. 187-191.

202. Lenz D.E., Broomfield C.A., Yeung D.T., Masson P., Maxwell D.M., Cerasoli D.M.

203. Millard C.B., Lockridge O., Broomfield C.A. Design and expression of organophosphorus acid anhydride hydrolase activity in human butyrylcholinesterase //Biochemistry. 1995.-v. 34(49).-p. 15925-15933.

204. Lockridge O., Blong R.M., Masson P., Froment M.T., Millard C.B., Broomfield C.A.

205. A single amino acid substitution, Glyll7His, confers phosphotriesteraseorganophosphorus acid anhydride hydrolase) activity on humanbutyrylcholinesterase // Biochemistry. 1997. - v. 36(4). - p. 786-795.141

206. Amitay M., Shurki A. The structure of G117H mutant of butyrylcholinesterase: Nerveagents scavenger // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2009. - v. 77(2).-p. 370-377.

207. Suärez D., Field M.J. Molecular dynamics simulations of human butyrylcholinesterase

208. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2005. - v. 59(1). - p. 104-117.

209. Vyas S., Beck J.M., Xia S., Zhang J., Hadad C.M. Butyrylcholinesterase and Gl 16H,

210. G116S, G117H, G117N, E197Q and G117H/E197Q mutants: A molecular dynamics study // Chemico-Biological Interactions. 2010. - v. 187(1-3). - p. 241-245.

211. Masson P., Froment M.T., Gillon E., Nachon F., Lockridge O., Schopfer L.M. Hydrolysis of oxo- and thio-esters by human butyrylcholinesterase // Biochimica et Biophysica Acta.-2007.-v. 1774(1).-p. 16-34.

212. Lockridge O. Genetic variants of human serum Cholinesterase influence metabolism ofthe muscle relaxant succinylcholine // Pharmacology & Therapeutics. 1990. - v. 47(1).-p. 35-60.

213. Primo-Parmo S.L., Wiersema B., Spek A.F.L.V.D. Characterization of 12 silent allelesof the human butyrylcholinesterase (BCHE) gene // American Journal of Human Genetics. 1996. - v. 58(1). - p. 52-64.

214. Lockridge O., Masson P. Pesticides and susceptible populations: people with butyrylcholinesterase genetic variants may be at risk // Neurotoxicology. 2000. - v. 21(1-2).-p. 113-126.

215. Simeon-Rudolf V., Reiner E., Evans R.T., George P.M., Potter H.C. Catalytic parameters for the hydrolysis of butyrylthiocholine by human serum butyrylcholinesterase variants. // Chemico-Biological Interactions. 1999. - v. 14(119-120).-p. 165-171.

216. Mikami L.R., Wieseler S., Souza R.L.R., Schopfcr L.M., Nachon F., Lockridge O.,

217. Chautard-Freire-Maia E.A. Five new naturally occurring mutations of the BCHE gene and frequencies of 12 butyrylcholinesterase alleles in a Brazilian population // Pharmacogenetics and Genomics. -2008. v. 18(3). - p. 213-218.

218. Souza R.L.R., Mikami L.R., Maegawa R.O.B., Chautard-Freire-Maia E.A. Four newmutations in the BCHE gene of human butyrylcholinesterase in a Brazilian blood donor sample // Molecular Genetics and Metabolism. 2005. - v. 84. - p. 349-353.

219. ICalow W., Davies R.O. The activity of various esterase inhibitors towards atypicalhuman serum cholinesterase. // Biochemical Pharmacology. 1958. - v. 1. - p. 183— 192.

220. Pirmohamed M., Park B.K. Genetic susceptibility to adverse drug reactions // Trends in

221. Pharmacological Sciences. 2001. - v. 22(6). - p. 298-305.

222. Mcguire M.C., Nogueira C.P., Bartels C.F., Lightstone H., Hajra A., Van Der Spek

223. Boeck A.T., Fry D.L., Sastre A., Lockridge O. Naturally occurring mutation, Asp70His, in human butyrylcholinesterase // Annals of Clinical Biochemistry. -2002.-v. 39(2).-p. 154-156.

224. Ehrlich G., Ginzberg D., Loewenstein Y., Glick D., Kerem B., Ben-Ari S., Zakut H.,

225. Soreq H. Population diversity and distinct haplotype frequencies associated with ACHE and BCHE genes of Israeli Jews from Trans-Caucasion Georgia and from Europe // Genomics. 1994. - v. 22. - p. 288-295.

226. Masson P., Legrand P., Battels C.F., Froment M.-T., Schopfer L.M., Lockridge O.

227. Role of Aspartate 70 and Tryptophan 82 in binding of succinyldithiocholine to human butyrylcholinesterase // Biochemistry. 1997. - v. 36(8). - p. 2266-2277.

228. Weingand-Ziade A., Renault F., Masson P. Differential effect of pressure and temperature on the catalytic behaviour of wild-type human butyrylcholinesterase and its D70G mutant // European Journal of Biochemistry. 1999. - v. 264(2). - p. 327335.

229. Masson P., Bee N., Froment M.-T., Nachon F., Balny C., Lockridge O., Schopfer L.M.

230. Rate-determining step of butyrylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of benzoylcholine and benzoylthiocholine. Volumetric study of wild-type and D70G mutant behaviour // European Journal of Biochemistry. 2004. - v. 271. - p. 19801990.

231. Sun H., Yazal J.E., Lockridge O., Schopfer L.M., Brimijoin S., Pang Y.-P. Predictedmichaelis-menten complexes of cocaine-butyrylcholinesterase // Journal of Biological Chemistry.-2001.-v. 276(12).-p. 9330-9336.

232. Gorelick D.A. Enhancing cocaine metabolism with butyrylcholinesterase as a treatment strategy. // Drug and Alcohol Dependence. 1997. - v. 48(3). - p. 159-165.

233. Zhan C.-G. Novel pharmacological approaches to treatment of drug overdose andaddiction // Expert Review of Clinical Pharmacology. 2009. - v. 2(1). - p. 1-4.

234. Zhan C.-G., Landry D.W., Ornstein R.L. Energy barriers for alkaline hydrolysis ofcarboxylic acid esters in aqueous solution by reaction field calculations // The Journal of Physical Chemistry A. 2000. - v. 104. - p. 7672-7678.

235. Zhan C.-G., Landry D.W., Ornstein R.L. Theoretical studies of fundamental pathwaysfor alkaline hydrolysis of carboxylic acid esters in gas phase // Journal of the American Chemical Society.-2000.-v. 122.-p. 1522-1530.

236. Zhan C.-G., Landry D.W. Theoretical studies of competing reaction pathways andenergy barriers for alkaline ester hydrolysis of cocaine // Journal of the American Chemical Society. 2001. -v. 105.-p. 1296-1301.

237. Li P., Zhao K. Nonenzymatic hydrolysis of cocaine via intramolecular acid catalysis //

238. Helvetica Chimica Acta. 1999. - v. 82. - p. 85-89.

239. Zhan C.G., Gao D. Catalytic mechanism and energy barriers for butyrylcholinesterasecatalyzed hydrolysis of cocaine // Biophysical Journal. 2005. - v. 89(6). - p. 38633872.

240. Zheng F., Zhan C.-G. Rational design of an enzyme mutant for anti-cocaine therapeutics // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2008. - v. 22(9). - p. 661-671.

241. Zheng F., Zhan C.G. Structure-and-mechanism-based design and discovery of therapeutics for cocaine overdose and addiction // Organic & Biomolecular Chemistry. 2008. - v. 6(5).-p. 836-843.

242. Yang W.; Pan Y., Fang L., Gao D., Zheng F., Zhan C.-G. Free energy perturbationsimulation on transition states and high-activity mutants of human butyrylcholinesterase for (-)-cocaine hydrolysis // The Journal of Physical Chemistry B. -2010.

243. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov

244. N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Research. 2000. - v. 28. -p. 235-242.

245. Kryger G., Harel M., Giles K., Toker L., Velan В., Lazar A., Kronman C., Barak D.,

246. Ponder J.W. TINKER: software tools for molecular design. электронная программа. - St. Louis: Washington University, 1999.

247. Wang J., Wolf R.M., Caldwell J.W., Kollman P.A., Case D.A. Development andtesting of a general Amber force field // Journal of Computational Chemistry. 2004. -v. 25(9).-p. 1157-1174.

248. Goldberg D. Genetic algorithms in search, optimization, and machine learning. Addison-Wesley Professional, 1989. 372 p.

249. Morris G.M., Goodsell D.S., Halliday R.S., Huey R., Hart W.E., Belew R.K., Olson

250. A.J. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical146binding free energy function // Journal of the American Chemical Society. 1998. — v. 19(14).-p. 1639-1662.

251. Hetenyi C., Van Der Spoel D. Efficient docking of peptides to proteins without priorknowledge of the binding site // Protein Science. 2002. - v. 11(7). - p. 1729-1737.

252. Phillips J.C., Braun R., Wang W., Gumbart J., Tajkhorshid E., Villa E., Chipot C.,

253. Skeel R.D., Kale L., Schulten K. Scalable molecular dynamics with NAMD // Journal of Computational Chemistry.-2005.-v. 26(16).-p. 1781-1802.

254. Mackerell A.D., Bashford D., Bellott, Dunbrack R.L., Evanseck J.D., Field M.J.,

255. Warshel A., Levitt M. Theoretical studies of enzymic reactions: dielectric, electrostaticand steric stabilization of the carbonium ion in the reaction of lysozyme. // Journal of Molecular Biology. 1976. - v. 103. - p. 227-249.

256. Parr R.G. Density functional theory // Annual Review of Physical Chemistry. 1983.v. 34(1).-p. 631-656.

257. Senn H.M., Thiel W. QM/MM methods for biomolecular systems // Angewandte

258. Chemie. International Ed. In English. 2009. - v. 48(7). - p. 1198-1229.

259. Bakowies D.s Thiel W. Hybrid models for combined quantum mechanical and molecular mechanical approaches // The Journal of Physical Chemistry. 1996. - v. 100(25).-p. 10580-10594.

260. Senn H.M., Thiel W. QM/MM studies of enzymes // Current Opinion in Chemical

261. Biology.-2007.-v. 11(2).-p. 182-187.

262. Nemukhin A.V., Grigorenko B.L., Topol I.A., Burt S.K. Flexible effective fragment

263. QM/MM method: Validation through the challenging tests // Journal of Computational Chemistry. 2003. - v. 24. - p. 1410-1420.

264. Day P.N., Jensen J.H., Gordon M.S., Webb S.P., Stevens W.J., Krauss M., Garmer D.,

265. Basch H., Cohen D. An effective fragment method for modeling solvent effects in quantum mechanical calculations // The Journal of Chemical Physics. 1996. - v. 105(5).-p. 1968-1986.

266. Sousa S.F., Fernandes P.A., Ramos M.J. General performance of density functionals //

267. The Journal of Physical Chemistry A. 2007. - v. 111(42). - p. 10439-10452.

268. Немухин A.B., Григоренко Б.Л., Грановский A.A. Молекулярное моделированиес программой PC GAMESS: от двухатомных молекул до ферментов // Вестник Москвоского Университета. Серия 2. Химия. 2004. - т. 45. - с. 75-102.

269. Li Н., Jensen J.H. Partial Hessian vibrational analysis: the localization of the molecularvibrational energy and entropy // Theoretical Chemistry Accounts: Theory, Computation, and Modeling (Theoretica Chimica Acta). 2002. - v. 107(4). - p. 211-219.

270. Head J.D. Computation of vibrational frequencies for adsorbates on surfaces // International Journal of Quantum Chemistry. 1997. - v. 65(5). - p. 827-838.

271. Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificity // Chemical Reviews. 2002.-v. 102(12).-p. 4501-4524.

272. Froede H., Wilson I. Direct determination of acetyl-enzyme intermediate in theacetylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of acetylcholine and acetylthiocholine // Journal of Biological Chemistry. 1984.-v. 259(17).-p. 11010-11013.

273. Tormos J.R., Wiley K.L., Seravalli J., Nachon F., Masson P., Nicolet Y., Quinn D.M.

274. The reactant state for substrate-activated turnover of acetylthiocholine by butyrylcholinesterase is a tetrahedral intermediate // Journal of the American Chemical Society.-2005.-v. 127(42).-p. 14538-14539.

275. Tormos J.R., Wiley K.L., Wang Y., Fournier D., Masson P., Nachon F., Quinn D.M.

276. Accumulation of tetrahedral intermediates in cholinesterase catalysis: a secondary isotope effect study // Journal of the American Chemical Society. 2010. в печати

277. Nemukhin A.V., Gariev LA., Rogov A.V., Varfolomeev S.D. Serine hydrolase catalytic sites: Geometry invariants and modeling catalytic activity // Mendeleev Communications. 2006. - v. 16(6). - p. 290-292.

278. Fujita T., Iwasa J., Hansch C. A new substituent constant, тс, derived from partitioncoefficients // Journal of the American Chemical Society. 1964. - v. 86(23). - p. 5175-5180.

279. Leo A., Hansch C., Elkins D. Partition coefficients and their uses // Chemical Reviews.- 1971.-v. 71(6).-p. 525-616.

280. Kabachnik M.I., Brestkin A.P., Godovikov N.N., Michelson M.J., Rozengart E.V.,

281. Rozengart V.I. Hydrophobic areas on the active surface of cholinesterases // Pharmacological Reviews. 1970. - v. 22(3). - p. 355-388.

282. Némethy G., Scheraga H.A. Structure of water and hydrophobic bonding in proteins. I.

283. Model for the thermodynamic properties of liquid water // The Journal of Chemical Physics. 1962. - v. 36(12). - p. 3382-3400.

284. Némethy G., Scheraga H.A. Structure of water and hydrophobic bonding in proteins.1.. Model for the thermodynamic properties of aqueous solutions of hydrocarbons // The Journal of Chemical Physics. 1962.-v. 36(12).-p. 3401-3417.

285. Némethy G., Scheraga H.A. Structure of water and hydrophobic bonding in proteins.

286. I. The thermodynamic properties of hydrophobic bonds in proteins // The Journal of Physical Chemistry. 1962. - v. 66(10). - p. 1773-1789.

287. Némethy G., Scheraga H.A. Structure of water and hydrophobic bonding in proteins.1.. The thermodynamic properties of liquid deuterium oxide // The Journal of Chemical Physics. 1964. - v. 41(3). - p. 680-689.

288. Till M.S., Ullmann G.M. McVol A program for calculating protein volumes andidentifying cavities by a Monte Carlo algorithm // Journal of Molecular Modeling. -2010.-v. 16(3).-p. 419-429.

289. Masson P., Froment M.-T., Bartels C.F., Lockridge O. Asp70 in the peripheral anionicsite of human butyrylcholinesterase // European Journal of Biochemistry. 1996. - v. 235(1-2). -p. 36-48.

290. Nemukhin A.V., Lushchekina S.V., Bochenkova A.V., Golubeva A.A., Varfolomeev

291. S.D. Characterization of a complete cycle of acetylcholinesterase catalysis by ab initio QM/MM modeling. // Journal of Molecular Modeling. 2008. - v. 14(5). - p. 409-416.

292. Bravaya K.B., Bochenkova A.V., Grigorenko B.L., Topol I.A., Burt S.K., Nemukhin

293. A.V. Molecular modeling the reaction mechanism of serine-carboxyl peptidases // Journal of Chemical Theory and Computation. 2006. - v. 2. - p. 1168-1175.