Методы анализа антибиотиков и определение их содержания в пищевых продуктах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ШЕССЯШЙ! ЗАОЧШП ШСЯИТГ ШЗЩЗЮЙ ПР015ЕШЕШ1ССТИ

IIa ярззах рукопяоп

ШНИЧНАЛ Влада Коастаатвповка

13ТОДН АНАЛИЗ! аптижяжов и опрдапшш • и содатанка в шшщшх продуктах

02,00.02 - Аполнтачоокая хяыня

АВТОРЕФЕРАТ

диаооргоцив на ооеокйнео ученой стапеля кандидата зшиэтвокнх паук

Мооква 1991

Работа выполнена на кафедре аналитической химия Всесоюзного заочного института ллщэвой промышленности и в лаборатории внстру-менташшх методов анализа Института пптанш АШ СССР. Н -чние руководители: заслуженный деятель науки и техники РСФСР, доктор химических наук, профессор Клячко Ю.А., кандидат химических наук, старший научный сотрудник Меламед Д.Б.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Чеботарев О.В., кандидат химических наук, старший научный сотрудник Сладкова Т.В.

Ведущая организация: Мосховскг? технологичэский институт пищевой промышленности, кафедра аналитической химии

Защита состоится ^е^Л^/и^ 1991 г. в часов

на заседании специализированного Совета К.063.45.02 по специаль- .. ности 02.00.02 - Аналитическая химия во Всесоюзном заочном институте пищевой промышленности ( 105803, Москва, ул. Чкалова, 73, БЗИПП ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного заочного института пищевой промышленности.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химически наук, доцент

ОЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теин. Загрязнение пищевых продуктов является часть» глобальной экологической проблемы. Анализу продуктов питания и снижению содержания в них загрязняющих веществ значительное внимание уделяют Всемирная организация здравоохранения, международные организации, занклавшиеся вопросами продовольствия, защиты окружающей среды, изучения рака и др. Это объясняется тем, что в пищевых продуктах найдены вещества, обладающие канцерогенными, мутагенными, тератогенными, аллергенными и др. токсическими свойствами.

Загрязнители п.. :л могут быть естественного происхождения (алкалоиды, биогенные шины и др.),, биогенной природы (ыикоток-йины и др.) или результатом деятельности человека (нитрозоами -пи, полицяклячесхие ароматические углеводороды и др.).

К последней группе относятся лекарственные препараты, обнаруживаемые в мясе, молоке, сыре, яйцах, рыбе и др. пищевых продуктах.

Среди лекарственных средств в ветеринарии и животноводстве наиболее часто и.интенсивно используются антибиотики (АБ). Имеющиеся в литературе материалы позволяют проследить основные пути попадания этих.веществ в продукты. Чаще всего они заг лзня -ются остатками лекарственных средств вследствие достаточно широкого чспользоваяия для профилактики заболеваний и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и усвояемости кормов, а также при технологической переработке продуктов- для увеличения сроков их хранения.

Случайное введение в организм человека без соответствующих медицинских показаний и контроля лекарственных препаратов крайне нежелательно. Хотя нет никаких оснований- предполагать возможность острого токсического действия на людей пищевых продуктов, содержащих АБ, существует определенная опасность хронического попадания относительно-небольших количеств этих соединений о пшцей в организм человека, что может приводить к различного рода аллергическим.реакциям, нарушениям обмена веществ, дисбак-териозам и т.д., кроме того, возникает опасность распространения устойчивых форм микроорганизмов и, как следствие, снижается эффективность лечения ими людей.

..-Наличие их в пищевых продуктах кокет затруднять проведение вэтеринарно-оалигарной экспертизы я некоторых технологически

процессов переработки продуктов, а также ухудшать качество готовых изделий. .- - -

В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сиро, яйцах, рыбе, меде и др. продуктах достаточно часто обнаруживают остаточные количества АБ, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля. Эти работы выполняется микробиологическими методам и носят качественный или полуколЕгчествеиный характер. Микробиологические методы не всегда обладают высокой чувствительностью, малоспецифичны, дают плохо воспроизводимые результаты, требуют значительного времени и не поддаются метрологической оцонко.

Разработан .ряд физико-хшическнх методов анализа АБ . в пищевых продуктах, при этой лучшими характеристиками обладает способы, включающие хроматографическое разделение.

Однако официальный контроль до сж пор осуществляется, как правило,.микробиологическими способами. Это связано с отсутствием простых и надетых химических методов анализа АБ в пищевых продуктах. Работы, использующие дорогостоящее оборудование, не пригодны для серийных определений ::а уровне сельскохозяйственных, шщеперерабатнвающих предприятий и санэпидстанций. Отсутствие надёжных методов анализа АБ, пригодных для массовых обследований, не позволяет изучить содержание этих.посторонних веществ в пищевых продуктах,, сопоставить данные, полученные в различных лабораториях, п доляныгл образом оценить проблему.

В связи с атии разработка новых надежных химических ьгаго-дов анализа остаточных.количеств АБ в пищевых продуктах является важной.и актуальной.

Цель работы. Целью настоящего исследования являлось:

- изучить загрязненность основных видов шщовнх продуктов АБ, установить наиболее.распространенные из еех, подагеаадщо первоочередному контроля;

- разработать методы извлечения, идентификация п определения АБ, наиболее часто встречающихся.в пищевых продуктах, пригодные для проведения серийных анализов;

- создать методы для арбитражных анализов и выборочного контроля остаточных количеств АБ в пищевых продуктах;

- используя разработанные наглк методы определения АБ, провести анализ ¿1х уровней в товарных пищевых продуктах г. Ыосквн.

Б.

Научная новизна работы. Разработан метод определения хлорамфеникола с помощью высокоэффективной жидкостной хроматография (ВЭЖХ) па основе найденного нового модификатора злюеята и оригинального способа подтверждения правильности идентификации этого АБ. Метод защищен авторским свидетельством.

Рассмотрено 'строение хлорамфеникола с точки зрения функционального микроанализа и найдены условия его превращения в окрашенное о п -диметпланинобензальдегидом и флуоресцирующее с флуорескашшом производное. Впервые предложены основанные на этих реакциях химические методы определения остаточных количеств хлорамфеникола, пригодные для рутинных анализов.

Показана эффективность использования в анализе тетрадикли-нов, ранее не применявшихся для этих целей отечественных хрома-тографяческих пластин Плазмахром с обращенной фазой Сд в соче -тании с найденным элюентом, превосходящим описанные по селективности разделения АБ этой группы.

. Найден новый модификатор эяюента в жидкостной хроматографии тетрациклияов, обеспечивающий высонув эффективность разделения индивидуальных соединений этой группы АБ.

Получены масс-спектры НБД-производного <А-метшшикозамина, образующегося в результате 'гидролиза натамицина и взаимодействия с НЕД-хлоридои, установлены его максимумы возбуждения и флуорес тенции и создан новый флуориметрический метод определения натамицина по наиболее устойчивому фрагменту молекулы.

Предлогеа новый спектрофотсметричеркий метод определения латамицина в пищевых продуктах, для разработки которого использован простг*» и эффективный способ очистки проб на хрсматогра-фической пластинке!

Впервые химическими методами обследована загрязненность остаточными количествами АБ основных продуктов питания, реализуемых через-торговую сеть.

Практическая значимость работы. Разработанный нами метод определения хлорамфеникола, основанный на использовании ТСХ и достаточно простых приемах анализа, отличающийся быстротой и удобством выполнения, низким пределом обнаружения (0,05 мг/кг продукта) и надежностью внедрен в практику работы органов Гос-саннадзора. Методические рекомендации, составленные на его основе, утверждены Минздравом республики Беларусь и рекомендованы к утверждении Минздраву республики Молдова.

Дня проведения научно-исследовательских работ ло определении хлорамфеникола и его метаболитов в пищевых продуктах, органах, тканях и биологических жидкостях предложенный нами метод с применением ВЭЗЭС использован для анализа товарных образцов пищевых продуктов с целью установления в них уровней остаточных количеств хлорамфеникола.

В практику работы мясокомбинатов при производстве сырокопченых колбас внедрен разработанный нами снектрофотомстрический метод определение наташцина со стадией предварительного хрома-тографического разделения и способом подтверждения правильности идентификации. Метод удобен для проведения массовых анализов, нетрудоемок и не требует дорогостоящего оборудования. Он апробирован во Всесоюзном научно-исследовательском и конструкторском институте мясной промышленности (ВНИКИМП), а также использован при составлении Технологической инструкции по обработке белковых колбасных оболочек препаратом "Дельвоцид" фирмы Гист-Брокадес (Голландия) при производстве сырокопченых колбас.

Исследовано содержание хлорамфеникола, тетрациклияов и на-тшлицина в различных отечественных пищевых продуктах. Полученные достоверные данные представляют практический интерес для гигиенической оценки продуктов,. По результатам исследования загрязненности продуктов остатками АБ подготовлена справка для. Московского городского Центра государственного сааэпиднадзора.

На защиту выносятся:

Усовершенствованные методики извлечения хлорамфеникола и тетрациклинов из пищевых продуктов.

Модифицированный наш метод идентификации и определения хлорамфеникола с помощью ВЗЗХ, основанный на введении нового модификатора элюеята и стадии подтверздения наличия 'хлорамфеникола .

Разработанные нами новые методы 'определения АБ:

- спектрофотометрический метод идентификации, подтверждения наличия и определения хлорамфеникола с помощью ТСХ, предназначенный для серийных анализов;

_ - флуориметрический метод обнаружения, подтвервдения правильности идентификации и определения хлорамфеникола с использованием ТСХ;

- комплексный метод определения тетрациклинов, состоящий ■ из скрининг-теста, позволяющего разделить, идентифицировать и оце-

пять содержание тетрациклина, окситетрациклина и хлортетрацик-лгащ в пробе и способа определения этих АБ с помощью ВЭЕХ;

- сцектрофотометрический метод определения натамицина, включающий стадии разделения и очистки экстрактов с применением ТСХ а подтверждения правильности идентификации;

- флуориыетричвский метод определения натамицина в виде НБД-производцого оС-меТшвпшозамлна.

Результаты исследования загрязненности продуктов питания остатками хлорамфеяккола, тетрацихлинами и натаяицкном.

Апробация работы. Результаты, проведенных исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Применение хроматографии з палевой, микробиологической и медицинской промышленности" (Геленджик, 1990 г.), на II Сибирской'конференции по метрологическому обеспечению аналитических методов в сельском хозяйство (Новосибирск, 1990 г.), на У Всесоюзном симпозиуме по молекулярной зидкостной хроматографии (Рига, 1990 г), на Всесоюзной научной конференции молодых ученых и студентов "225 лет I ШИ.. Молодом - практическому здравоохранению" (Москва, 1990 г.) , на У1 Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991 г.) и на научной конференции-во Всесоюзном заочном институте пищевой промышленности (Москва,' 1991 г.).

Публикации. По теыэ диссертации получено Авторское свидетельство за изобретение й 1702302 и опубликовано 14 печатных работ.

Объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка- используемой литературы.

Работа изложена на ^¿^страяицах машинописного текста, включает «5* рисунков и *Г7 таблиц. Список цитируемой литературы содерют Л-3 5 папнзп'оганий.

К диссертации прилагаются технологическая инструкция, ут-взрлденныз методические рекомендации я справки о внедрении разработанных методов анализа.

I. Материалы я общие методические приемы анализа антибиотиков '

В качестве объектов исследования.были выбраны АБ: хлорам-феникол, тетрациклин, окситстрациклин, хлортетрациклин и ната-мициа.

АБ выделяли из пищевых продуктов экстракцией органическими растворителями.

Экстракты промывали растворами с различными значениями рН, концентрировали и подвергали анализу непосредственно или после превращения АБ в производные»

Хлорамфенккол обнаруживали непосредственно по поглощению УФ-света люминесцентного индикатора на хроматографической пластинке, а также в виде окрашенных или флуоресцирующих производных. Определение хлорамфеникола проводили разработанными нами методами с помощью ВЭЖХ или ТСХ в элюатах хроматогра гческих зон после гидролиза, восстановления SnCig и взаимодействия с а-диыетиламинобензальдегидом (п.- ЖАБ) или флуорескамином.

Обнаружение и идентификацию тетрациклина, окситетрацикли-на и хлортетрациклина проводили после разделения на хроматографической пластинке по фяуоресцешдо в УФ-свете л по образованию окрашенных производных. Определение АБ этой группы выполняли с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором при 355 нм.

Натамицин обнаруживали непосредственно по поглощению УФ-света люминесцентного индикатора на ТСХ пластинке, а также по образованию окрашенного производного с 2,4-динитрофеяилгидрази-ном (2,4-ДИГ). Определение непосредственно нагамкцина.проводили в'элюатах- хроматографических зон и с помощью ВЭЖХ.

Оптическую плотность элюатов и спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Хитачи 557 й СФ-26. Флуоресценцию индикатора, АБ и их производных возбуждали в УФ-свете с JL = 254 и 336 нм, а интенсивность измеряли на спектрофлуориметре Иеркин-Элмер MPF 43 А.

ТСХ выполняли в различных системах растворителей на пластинках: с силикагелем, силуфоле , сорбфиле , плазмахрома и.др.

Анализ проводили с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа Бекман на колонках ультрасфер 0DS ', 5 мкм (250 х 4,6 мм), используя спектрофтометрический и флуориметрический детекторы . .'Хроматограммы обрабатывали с помощью компьютерного т. тегратора.

Масс-спектры соединений записывали на хронато-масс-спектро-' метре Хьюлетт-Паккард.методом прямого ввода, работающем в режиме электронного удара.

Определение АБ. проводили в мясе,.яйцах и изделиях из них,а также в рыбе и меде. Анализ выполняли, как правило, двумя, различными методами на 6-18 образцах каждого продукта. Пробы, в . которых АБ не были обнаружены, обрабатывали растворами хлорам-

феяикола, тетрациклинов щ(И натаницика и исследовали для определения степени извлечения этих АБ. Полученные результаты подвергались статистической обработке.

П. Извлечение антибиотиков из пищевых продуктов

Проведено изучение и сравнительная оценка современных методик выделения 'исследуемых АБ из различных объектов и установлено., что в ряде случаев они не удовлетворяют требованиям, предъявляемым к анализу микроколичеств загрязняющих пищу веществ. С целью повышения степени извлечения и улучшения сочетания с разработанными вами новыми нетодамь определения способы извлечения исследуемых АГ, обладающие лучшими характеристиками, были кодифицированы.

I. Хлорамфеникол

Обобщение литературных материалов я специально поставленные предварительные опыты позволяли установить,, что наиболее приемлемой для мяса и мясных продуктов является методика, заключающаяся в гомогенизации образца о фосфатным буфером, экстракция этилацататои, обезжиривании гексаном, концентрировании экстракта и очистка его на колонке С18.

Было признано целесообразнш заменить трудоемкую стадию очистки на-дорогостоящей фазе С^д промывкой экстракта во, ,;ьки растворами о различными значениями рН.

Стядия промывки раствором с низким значением рН была заменена подкислением образца до рН 3-4 перед экстракцией.

Совокупность предложенных операций позволяем получать экстракты хлорамфеникола из мяса и мясных продуктов, свободные от значительного числа примесных соединений с относительно высоким выходом.

Для извлечения хлорамфеникола из молока, молочных продуктов и яиц за основу была выбрана методика, заключающаяся в де-протеинизации продуктов смесью и и экстракции

этилацетатом. Очистку экстрактов проводили предложенной нами, промывкой растворами с щелочным и.нейтральными значениями рН. Полученные данные свидетельствуют, что полнота извлечения хлорамфеникола, достигаемая по предлагаемой методике, колеблется в пределах 7А-ВВ% в зависимости от вида продукта и должна быть учтена при расчете результатов анализа.

2. Тетрациклина

Основное число методик извлечения тетрациклинов из пищевых продуктов основано на колоночной хроматографии на привитых фазах С18. Благодаря этой процедуре удается получить достаточно чистые экстракты с выходом порядка 50-60/ь. Стремясь избежать • применения дорогостоящей фазы С^ и повысить степень извлечения тетрациклинов, мы применили экстракцию бутанолом гоыогчиата продукта по следующей схеме:к вдцким или измельченным твердым продуктам добавляли сульфат аммония и 0,01н .и гомогенизировали. Гомогенат центрифугировали, декантировал!!, отбирали алик-вотный объем супернатанта и обезжиривали экстракцией изооктаноа. Тетрацшшшы извлекали бутанолом, бутанол упаривали.досуха, остаток растворяли в метаноле и использовали для анализа.

Талой ход выделения тетрациклинов оказался менее трудоем -ким, чем с использованием колоночной хроматографии, он обеспечивал достаточно высокие выходы тетрациклинов (65-75?) и удовлетворительную чистоту конечных экстрактов после предварительной хроматографической очистки и разделения.

3. Натамицип

Круг пищевых продуктов, подлежащих анализу содержания остаточных количеств натамицина ограничен в связи с применением его в качестве консерванта копченых колбас,.сыров, а также обработки суспензией этого АБ овощей к фруктов,.предназначенных для длительного ^хранения. Это позволяет предложить весьма универсальную и достаточно простую методику извлечения натамицина из этих продуктов. Полученные экстракты содержат значительное число сопутствующих соединений и поэтому требуют очистки, способы и характер которой.выбираются в зависимости от метода, выбранного для определения, и от объекта анализа. Предлагаемый вариант извлечения является первым этапом методики, обязательный! для любого вида исследуемого продукта: образцы колбас, сыров или оболочек экстрагируют метанолом, охлаждают до -20°С и фильтруют в охлажденном виде. Аликвотную часть полученного раствора используют для спектрофотометрического и хроматографического анализа.

Ш. Исследования по разработке методов огрзделения антибиотиков

Материалы, имеющиеся в литературе, и наличие у исследуемых АБ функциональных групп, способных вступать в реакции с образова-

циец легко детектируемых соединений, позволили на'летить направления совершенствования существующих и разработки новых методов анализа АБ;

I. Хлорамфеникол

Непосредственное определение. На первом этапе работы был' апробирован метод обнаружения хлорамфеникола по поглощению У5-света люминесцентного индикатора. Найден элюент, эффективно отделяющий хлорамфеникол от примесей, попадающих в экстракты из различных объектов (пищевые продукты, упаковочные материалы, биологические хядкости), - хлор оформ-ме тан ол-моно этан оламин 10 :• I : 0,03 и установлен предел обнаружения хлорамфеникола -0,5 мкг в зоне. ■

■ Испытанные нами условия определения хлорамфеникола с помощью ВЭЖХ, опубликованные в литературе, привели к выводу, что основными трудностями в этой методе анализа является максимальное отделение хлорамфеникола от коэкстрактивных веществ, погло-щахщшс в той же области спектра и присутствующих в значительно больших количествах, чем хлорамфеникол, а" также надежная идентификация его пика.

Нами испытаны модификаторы, широко применяемые в ион-парной ВЭЗХ --додецилсульфоновая кислота и тетрабутиламмони , а такяе нетрадиционные добавки - додециловый спирт, каприновая кислота, ;ециламин. Найдено, что наилучший эффект достигается при использовании децяламяна в смеси: ацетонитрил - вода н децил-амин 40:60 + 1-10~3 об.ч.

Применение найденного элюента позволило избирательно увеличить уцергтние хлорамфеникола на колонке и сдвинуть его пик в область, свободную от примесных соединений (рис. I а и б), что даю возможность приступить к разработке метода определения хлорамфеникола в экстрактах из пищевых продуктов.'

Рис. I. Хроматограммы экстракта мяса: а. и б. хлорамфеникол 10 нг, вр. уд. 5,2 и 5,6 мин соответственно; в. 1-п. -нигрофенил-2-ацетиламинопропандиол-1,3, получении!» из 10 нг хлорамфеникола, вр. уд. 5,3 мин.

Элюент: а.- ацетонитрил-вода 40:60, б. и в.- ацето-нитрил-вода-дециламин 40: 60:1-ГО"3 .

IV

Для разработки способа подтверждения'наличия хлорамфени-кола было признано целесообразным обработать образующийся после его гидролиза амин ацетилхлоридоы. При этом на хроматограм-ие происходит исчезновение пика хлорамфеникола и появляется ранее не наблюдавшийся пик 1-а-.чктрофенЕЛ-2-ацетиламинопропанди-ола-1,3 (рис. I б и в).

Найденный нами элюент и разработанный способ подтверждения правильности идентификации позволили предложить наде-кный метод определения хлорамфеникола в пищевых продуктах, отличающийся нивкш пределом обнаружения (I нг/мкл) и хорошей воспроизводи- . мостью результатов (относительное стандартное отклонение = 0,07 - 0,12).

Определение по производным. Большие возможности для получения легко детектируемых соединений открывает наличие в молекуле хлорамфеникола ароматической яитрогруппы, аывдной и двух атомов хлора.

Попытка использовать для разработки метода определения хлорамфеникола реакцию фудживара на полигалоидные соединения показала, что взаимодействие происходит с дяхлорунсусной кислотой, образующейся при гидролизе хлорамфеникола:

СИ ^ ---------

'еда> & «Г45^

^ д

Г°"

Получающиеся окрашенные соединения позволяют обнаруживать 0,5--I мг/кг хлорамфеникола, что недостаточно для определения этого АБ в пищевых продуктах. Проверка имеющихся указаний на возможность обнаружения хлорамфеникола по взаимодействию восста -новленной ароматической нитрогруппы с а -ДЛАБ или флуоресками-, ном показала целесообразность разработки методов.определения хлорамфеникола, основанных на описанных реакциях.

Были подобраны оптимальные условия превращения хлорамфеникола в соответствующий ароматический амин: ..онцентрация SnCCit HCl, экспозиция и температура. Образующийся амин обрабатывали раствором /г-ДОАБ в метаноле ила флуорескамина в ацетоне и получали окрашенное или флуоресцирующее производное. Специальными

о

и.

а

опытами доказано, что в избранных условиях реакция в растворах и на пластинке протекает только по ароматическому амину.

Для разработки метода, позволяющего подтверждать правильность идентификации хлорамфеникола, нами использовано различие в хроматографической подвижности самого АБ и алифатическо. ) амина, образующегося в результате кислотного гидролиза.

На "тастинку для ТСХ наносили аликвотный объём экстрактов из пищевых продуктов и стандарта хлорамфеникола, до и после' гидролиза. После хроматографирования пластинку последовательно опрыскивали растворами в НИ и п-ЩАБ или флуорескамина. Наличие окрашенного или флуоресцирующего пятна в гидролиз овально я опытной пробе, по соответствующего амину хлорамфеникола, подтверждало наличие этого АБ в продукте. Сравнивая интенсивности окраски с п-ДДАБ или флуоресценции с флуорескамином пятен на хроматограммах стандартов, содержащих различные количества хлорамфеникола, и экстракта иэ продукта, оценивали концентрацию этого АБ в образце.

Проведенные эксперименты с растворами хлорамфеникола, модельными системами, иммитирующими экстракты из пищевого продукта и реальндаи экстрактами, в которые предварительно добавляли известные количества стандарта, позволили разработать методы определения хлорамфеникола, основанные на реакциях с п-Д.'АБ и флуорескамином. Записаны спектры поглощения и флуоресценции де-. тектируемых соединений и найдены их максимумы (437 нм и 397/496 нм соответственно). Установлен предел обнаружения хлорамфеникола по реакции с /ь-ДМАБ (5-10 нг в зоне) и с флуорескамином (I-2 нг в зоне) и расчитаны ^ (0,10 - 0,18 и 0,08 - 0,14 соответ-

ственио).

2. Тетрациклины

Тонкослойная хроматография. Для создания метода определения тетрациклкнов мы использовали отечественные пластины Плав-иахром (?Р-3. С "'»мощью найденного нами элаента 105? щавелевой кислоты, насыщенной бутанолом, удалось добиться полного отделения 8он оксигетрацшшша, тетрациклина и хлортетрациклина ( соответственно 0,60, 0,53 и 0,44). Испытание известных из литературы цветных реакций на фенольную группу тетрациклинов позволили предложить' реакцию с тетраазотированным о-дианкзидином,позволяющую обнаруживать тетрациклины в количестве 5-12 нг в зоне. Она использована для подтверздения правильности идентификации этих АБ на хроматографяческой пластинке.

Найденные условия разделения окситетрациклипа, тетрациклина и хлортетрациклина, обнаружения по флуоресценции и подтверждения правильности идентификации с помощьв цветной реакции на фенольную группу, а также возможность оценки содержания тетра-циклинов на хромагографической пластинке позволили предложить скрининг-метод определения в пищевых продуктах индивидуальных АБ этой группы. Предел обнаружения 5-7 нг для.тетрациклина и окситетрациклина ч 10 нг для хлортетрациклина. .

^.¿сокоэффективяая жидкостная хроматография. Удалось разделить тетрациклин, окситетрациклин и хлортетрациклия, надёжно отделить их от примесей, используя введение в лучшую из предложенных смесь: 0,01 М щавелевая к-та - ацетонитрил -метанол 73:10:17 диметилформашда и дециламина в качестве модификатора элюента, не применявшегося ранее для этой цели (рис. "2).

Рис. 2. Хроматограммы:

а. смеси тетрациклинов по 3 нг:

б, экстракта из я?ца с добавкой тетрациклинов.

I. окситетрациклин, 2. тетрациклин, 3. хлортетрациклин. Вр. уд. 3,7, 4,4 и 7,5 мин соответственно. Элюент: 0,01 М щавелевая к-та -ацетонитрил - диметилформамид 60:34:6 + 10 мг дециламина.

'Полученные результаты позволили разработать метод определения тетрацшшшов в пищевых продуктах (табл. I).

Таблица I

Определение тетрациклинов в экстракте из пищевого продукта

Антибиотик ¡Предел обнаружения,нг| 6, Р = 0,95)

Оксигетрациклин 0,1 0,08 - 0,14

Тетрациклин 0,1 0,05 - 0,13

Хлортетрациклин 0,3 0,10 - 0,16

Сочетание данного метода с скрининг-тестом, используемым

для разделения, идентификации, подтверждения наличия тетрациклинов в образце и предварительной оценки их концентраций позволили предложить комплекс хроматографическях методов определения тетрациклина, окситетрациклина п хлортетрациклина в пищевых продуктах, в котором ВЭНХ используется для образцов с установлении наличием тетрациклинов.

3. Натамицкн

. Непосредственное определение. Для разработки метода определения натамицина в пищевых продуктах, пригодного для серийных анализов было предложено проводить очистку экстрактов из пищевых продуктов на пластинке для ТСХ, используя,смесь растворителей, в которых натамицин не хроматографируется: диоксан-хлоро-фор!,(-ацетон 1:1:1, При этом большинство примесных соединений вымываются, а натамяцин остается на старте. Затем пластинку сушат и погружают в найденный нами элюент: бутанол-уксусная к-та-вода 4:1:5. (верхняя фаза), обеспечивавший хорошие хроматографические характеристики зоны натамицина на сшшсагеле о люминесцентный индикатором (/?, = 0,33, относительный размер пятна 0,02).

Для повышения достоверности определения пластинку опрысюГ-ваыт раствором 2,4-ДПФГ. Окраска отмеченных в УФ-свете зон в аелтай цвет подтверждает наличие натамицина в.образце. Определение натамицина проводят спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность элюатов хроматографических зон стандарта и экстракта из пищевого продукта.

Определение по аминогруппе. Одной из основных трудностей в анализе натамицина является его неустойчивость. В особенности это касается тетраеновой структуры, легко подвергающейся окислению в среде пищевого продукта. Эта же структура является хромофором, участвующим в определении натамицина. Рассматривая воз -можность определения натамицина по функциональным группам, было

признано целесообразпда использовать для этой цели аминосодер-жащий фрагмент, входящий в состав его молекулы - 3,6-дидеаокси--3-аминогексозу (микозашш), отделяющийся от натамицина в виде ос-метилпроиэ водного:

¿Г.

м

Для определения микозамина использовано получение флуоресцирующего производного с 7-хлор-4-нитробзнгс-2-окса-1,3-даазсилом (НБД-хлоридом). Найдены условия проведения ¡реакции, обеспе-

■ ¿Г* <5? ^

чиваадпе количественный выход НБД-амина в получен шсс-спекгр, полностью подтверждающий его образование, Установлены максимумы возбуждения (467 ни) и флуоресценции (547 нм) и найдены элюэнты, позво^.шщие отделить его от других компонентов смеси на силуфо-ле, силикагеле в нормально-фазовой и наносило КР-18 в обращенное фазовом вариантах (табл. 2).

Таблица 2

Условия разделения НБД-шшозшина методом ТС1

Сорбент ' Система растворите-эй 1 «г

Силикагель Силуфол Наносил-№ С18-100 Хлороформ-метанол-укс.к-та 20:3:0,06 Хлороформ-метанол-укс.к-та 10:1:0.03 Ацетонатрил-вода-укс.к-та 4:6:0,1 0,-39 0,-48 0,41

Для получения контрольных проб использовали.свойство натамицина разлагаться в щелочной среде. Установлено, что кипячение в 10%-иом растворе КОН в течение 0,5-1 ч полностью его разрушает. Аликвотную часть рабочей пробы смешивали о 0,2 мл 10^-ного раствора КОН в метаноле, кипятили I ч, упаривали досуха, связывали щелочь и далее обрабатывали рабочие а контрольные пробы параллельно. Таким образом получали контрольные пробы, содержащие подавляющее количество примесей, имеющихся в рабочих пробах, но без натамицина. "

Сравнивая данные анализа контрольных проб (¿к=0,08-0,12) и рабочих проб (экстрактов) с добавкой натамицина (5Л= 0,120,18), можно придти к заключению, что определение натамицина возможно в присутствии примесей, имеющихся в экстракте из реальных объектов.

1У. Содержание антибиотиков в пищевых продуктах Было предпринято исследование содержания остаточных количеств хлорамфеникола, тетрациклина, окситетрациклина, хлортет-рациклина и натамицина в различных вицах отечественных и импортируемых пищевых продуктов. Как правило, анализы выполняли наиболее простыми методами, разработанными наш для серийных исследований. В тех случаях," когда результаты были положительными,их проверяли с помощью ВЭЖХ. Определение, проводили не менее чем в 6 образцах каждого вида продукта, часто двумя различными способами.

I. Хлорамфеникол Большое внимание было уделено анализу мяса (табл. 3), как основному ингредиенту колбас, ветчин и др. изделий. Степень га-грязнения и концентрации хлорамфеникола в свином мясе существенно ниже, чем в говяжьем и курином. Из субпродуктов существенно выделяется частотой обнаружения и остаточным количеством хлорамфеникола кожа кур. .

Таблица 3

Содержание (мкг/кг) хлорамфеникола в пищевых продуктах

Продукт

1 количество

•¡ивоа^и-"03 ' I "¿5йар"у-1 Пр еде л ы колебаний 'I найдейо,!жения

¡Процент

I

Мясо: говяжье свиное куриное Колбасы вареные• Почки гов. морож. Печень гов. морож. Кока куриная Молоко

Смесь "Малютка" Сметана Творог "Семилак" Яйца Рыба ■ Мёд

ед _._____

х) В таол. з-чз приведены максимальные и минимальные значения оО-наружения в образцах данного вида продукта.

Концентрации хлорамфеникола в молоке и детских молочных смесях

невелики, хотя вызывает беспокойство высокая частота обнаружения

в них АБ.

12 10 15 24 7

7 15 28 14

8 12

6 10 6 7

3 I

3

4

1 О 3 9

2 О I. О О

о о

25 10 20 17 14,3 О 20 32 14 О

8,3

О

О

О

О

29,7 - 112.6 О - 26,4 О - 124,6 О - 22,2 О - 164,2 Не обнаружено 58,6 - 124,6 16,4 - 77,1 10,0 - 28,4 Не обнаружено

О - 17,2 Не обнаружено то же

Таким образом, несмотря па запрещение использования хло-рамфеникола в лечении скота п птицы, мясо, молоко и яйца которых попадают в пшцу населению, степень загрязненности товарных продуктов эта; А.Б достаточно высока е указывает па нарушения, связанные с его применением.

Тетрациклин ь»

. Анализ шлцевых продуктов на наличие в них тетрациклинов выполняли с поисщьа разработанного намя комплекса хроматографичес-ких методов.

Таблица Л

Содержание (мкг/кг) тетрацикдлнов в пищевых продуктах

количество образцов ¡цределн колеодпик !проа~! Шмдсно ! ! окси^П хлор-Продукт 'нали-!тет- !окси- !хлор- !тетра-!тетра-!тетра-! зиро-! раца-! тетра-! тетра-! циклен ! циклен ! цихлии _!вано !клин ! циклил !циклин!_! 1

Не обнаружено то 28 8,1- 10,"4- 7,3-2$,5 .17,0 85,4 На обнаружено Не обнаружено ¡й.с-гз •Не обнаружено 1

10.2- не обна- 6,6 15,4 ругено

Не обнаружено Не обнаруже- 18; 5-но" 2ЭГ1

12,4 не обна- од д рушено 'Не обнаружено -

16.3- 12,1- 4,689,2 25,7 58,1

Не обнаружено Не обнарухоно

Как видно из табл. 4, основную опасность с точки зреаня поступления в оргаялсм человека неконтролируемых количеств тетрациклине® из мясных продуктов представляют отечественные куры.За-грязненность хлортетрацшшшои выявлена и при.анализе говяжьих почек до 28,5 ыкг/кг.

. Результаты определения остаточных количеств тетрациклияов в молоке и некоторых молочных продуктах свидетельствуют о невысокой частоте загрязнения. В ряде случаев наблюдается превышение ПДК, например, в молоке, приобретенном в торговой сети, твороге и сметане. В целом, загрязненность молочных продувов тетрацик-линами нияе, чем хлорамфениколом.

Проведенный анализ рыбы и меда показал, что ни в одной! из-8 образцов указанных продуктов тётрациклшш не были обнаружены.

Мясо: говяжье 10 0 0 0

свиное 6 0 0 0

куриное 15 6 2 5

Колбаса молодейн. 12 0 0 0

Почки говягьп 7 0 0 2

Печень говяжья 7 0 0 0

Молоко 15 2 0 т

Смесь "Малютка" ' 6 0 0 0

Сметаг 6 0 0 2

Творог 6 I 0 I

"Семилак" 6 0 0 0

Яйца 18 5 2 4

Рыба 8 0 0 0

Мед 8 0 0 0

Достаточно высока частота обнаружения тетрацяклинов в яйцах,а содержание, как правило, превышает ПДК, причем основное накопление тетрациклинов происходит в желтке.

3. Натамицин

Анализу подвергали продукты, в которые натвмицин может бить добавлен в соответствии с регламентом их производства, а также импортируемые пищевые продукты, консервированные этим АБ. Определение проводили-спектрофотометрически с применением ТСХ; в ряде случаев положительные результаты подтверждали с помощью ВЭЖХ.

Таблица 5

Остаточные количества натамицина в колбасах, сырах (мг/кг), на их оболочках (мг/дм^) и яблоках

Пределы колебании

Метод ВЭЖХ

Объект анализа

¡Количество; { образцов ¡Метод ТСХ

Колбасы: Майкопская: оболочка

1-й мм слой

2-й мм слой Сервелат:

оболочка

1-й мм слой

2-й .лм слой Сыр швейцарский

оболочка Яблоки Дтанатан (ВР)

0,48-0.62 0.44-0.60 21,30-30,9 18,8-29,1 Не обнаружено

0,24-0,45 0.21-0,33 11,5-1^,2 16,2-16,5 Не обнаружено то же

В табл. 5 приведены результаты определения натамицина в сырокопченых колбасах, сырах, на их оболочке и в яблоках. Методика отбора проб связана с документами,.регламентирующими применение этого АБ в пищевой промышленности. Остаточные количества натамицина, обнаруженные на оболочках и в колбасах, не превышают ПДК -

I мг/дм^. Ни в одном образце 2-го миллиметрового слоя натамицин не обнаружен.

Таким образом, в результате обследования основных видов пищевых продуктов, реализуемых через торговую сеть г. Москвы, установлено, что максимально загрязнены АБ мясо и мясные продукты, несколько меньше - яйца, содержание АБ в молоке и молочных продуктах находится на минимальном уровне..

. • ВЫВОДЫ'

I. Изучение загрязненности пищевых продуктов остатками антимикробных средств'позволило выявить.круг часто встречающихся в. них антибиотиков':хлорамфеникола, тетрациклина и натамицина .

■ 2., Определение остаточных количеств антибиотиков в СССР проводится, . как правило, микробиологическими методами, характеризую-

щшися низкой специфичностью, плохой воспроизводимостью и неудовлетворительной правильностью результатов. Это предопределило необходимость создания химических методов контроля уровней антибиотиков в пищевых продуктах, пригодных для серийных анализов, научно-исследовательских и арбитражных целей.

3. На основ^ши найденного нового модификатора элюента и разработанного оригинального способа подтверждения правильности идентификации предложен метод определения хлорамфеникола в продуктах животного происхождения с помощью ВЭЖХ, отличающийся от известных повышенной достоверностью результатов. Предел обнаружения - I нг/мкл, относительное стандартное отклонение -.0,070,12. Метод защищен авторским свидетельством й 1702302 Бюд, ЗД8.

4. В результате изучения условий гидролиза с одновременным восстановлением ароматической нитрогруппы в амин и превращения хлорамфеникола в окрашенное (с а-диметиламинобензальдегидом)шш флуоресцирующее (с флуорескамином) производное создана спектро-фотометрический й флуориметрический методы идентификации, подтверждения наличия и определения хлорамфеникола. Метод послужил основой для составления Методических рекомендаций по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств левомице-тина в продуктах животного происхождения, утвержденных Ышздра- . вом республики Беларусь и рекомендован для утверждения Минздраву республики Молдова.

5. Показа! ! эффективность использования в анализе тетрацик-линов-ранее не применявшихся для этих целей отечественных хрома-тографических пластин Плазмахром с обращенной фазой Сд.Сочетааие их с предложенным наш злюентом позволило отказаться от сложных этапов выделения и очистки экстрактов те^рациклинов из пищевых продуктов и предложить простой и доступный скрининг-метод для оценки содержания антибиотиков этой группы.

6. Разработан комплекс хроматографинеских методов определения тетрациклинов, заключающийся в разделении, обнаружении, идентификации и предварительной.оценке содержания их в образце скрининг-методом и определении с помощью ВЭЖХ. Предел обнаружения I мкг/кг, относительное стандартное отклонение не превышает 0,14. Предложенный вариант определения использован при составлении методических рекомендаций для органов Госсаннадзора.

7. Найденные условия количественного гидролиза натамицина

и взаимодействия образующегося ¿-мегилмикозамина с НБД-хлоридом, а также установленная возможность хроматографического анализа НДД-производного ос-метилмикозамина в нормально- и обращенно-фа-

эодои вариантах, позволила впервые предложим флуориыетрячвсяай метод определения нагамицива, позволявший яоигродировап исходные концентрации asoro антибиотика в продукте вне вввяояцостн ох о'ровов его хранения. Предел обввружения иетода 8 нг в зоне. РТН00ПТОП1ВО6 стандартное отклонение не превышает 0,18.

8. Уоловвя хроыатографичесного разделения иатвиицинз,очистка его оастрантов на пластинке для ТСХ л разработка способа подтверждения правильности идентификации нвтаницива на хроавтограц-не положена в основу разработанного нами спектрофотоыетричасного нетода опредопенпя натаницина в лицевых продунтвх. Предел обнаружения - 800 иг в зона, что еоответств^т 0,3 uv/vu оболочки, OTEOoasaniHOa стандартное отклонение - 0,12 - 0,2 . Созданный метод использован при составлении Технологической инструкции по обработав белковых иодбасних оболочек препаратом "дельвоцидИфир-ии.Гист-Брояадес (Голландия) паи производстве вырокопченнх колбас.

9. С поцо^ъю разработанных методов определено содержание остаточных количеств хлораыфеникона, татрвциклинов и на та шт. ла в основных лродуятэх зивотного происхождения, реализуемых через торговую "оть г. (jociibii. Обследовано бодво 50 наименований лицевых продуктов по 6-18 образцов каждого. алорвмфэнинои обнаружен в 30 аз 235 прознапизировэшшх проб, тетрациклина.- в 56 из 199, что сосгввляет 12.8 в 28,1? соответственно. Ни в одной из 115 нссладовашшх образцов сыров и колбас, консервированных натакациком, остаточке количестве па превышали предельно допустимых

аонцентрэпий. . , • .....

Основное оодеряанио диссертации изпоаоно в следующих работах;

2. кирпичная В.К., Неланед Д.Б. Определение аевомицеткна в пвдз-Т$ых продуктах. В ни.: "Теор. я клин. вспонты науки о питании. Сб. пэучн. трудов", Т. 9, Ц.,1989, С. I28-I3I. 2. Иояаиед Д.Б., Пнрничная В.К., Хмсеиов М.Ю. Зэгрявеиность полона и полочных - . продуктов э.шгибаотнлаин и хиничэсние методы их контроля: Обзор, иифори. и.2 АгроНИИТЭШП, 1990, 86 с. 3. Кирпичная В.К.,. ■ Цоланед Д.Б., Клячяо В.А. Методы контроля остаточных количеств натвницина. 3 сб.:"Передовоа производ.опыт в изд. проц., рекомендуемый для внедрения11, 1990, Вьп. 8, С. 48-51. Кирпичная В.К., Болова В.Ю., МелАнэд Д.Б. Хроцато-слватрофотоцатричесвие ыетодм айэлиэа нонсерзантов копченых колбас.а сыров. Мат.Всео. аонф.:"Приыадени0 хроматография в пядевоа, ыяяробкол. а под. дроц.", Н., 1990, С. 60, 5. Мелаиед Д.Б., Кирничная В.Л. Влияние аодифиизторов эпвентэ,на удерживание хлора ифениволв в.сбра-ценно-фвзовой B3SX-. Гез.до1.д.пВсбс.сиыл.по ыозвк.жидкостной хро-

ивтографан". Риги, IS90, С. 126, 6. Кирпичная В.К., Лпне cm Б.Г, lie » иод Д.Б. А но низ ввтамнцина ивтодвка ТСХ и B3IX. Твы eo,C.I8I. 7. Кирничная В.К. Эиспресс-иетод контроля загряэненноста шщешх продуктов девоцицатинои. Тез.довд.Вово.научн.воцф. иододше ученых и студентов "Молодежь - праатичэсаоиу здравоохранении". и., 1990, и. 14. 8. Ляпвов Б.Г., Кирничная В.К., Цедаыод Д.Б. Некоторые подходы в разработке арбитражного метода анализа хдорыицо-тина в седмвохозяаствэнных продуктах. Таз.довя. П Скб.иодф. по патрон, обеспечении внздит. ыоеодов г concuou хозяйство:"Ыогро— логия л стандартизация вввдпт.измерений". Новосибирск,1990, е.. 128-130. 9. Белова B.D., Зинина Л.В., Кузнецова Т.Н., Мздаыад Д.Б., Кирничная В.К. Применение препарата вДвдьвоцяди в качает- • ва сродства против пдесневения сырокопченых колбас. Сб.нзучп. трудов вНИЕИМПя. Повышение эффективности техаои. в техники производства мясных продувтбв. И., 1990, С. 40-47. Ю. ИурохВ.И., Кирничная В.К., Ыедамед Д.Б. Загряввнноогь шщевых продуктов антибиотиками; Обзор, информ. Юшек, БэеНИйНТИ, 1991, 40 о. П. Кирничная В.И., Ыевамед Д.Б., Лялвов Б.Г., Кпячно Ю.А. Метод одре деления оотаточных нодичеоив хдорамфенпкояз. Тез.докв. на 71 Вовс.аонф. по вшишт.хишш орган, в-в. Ц., 1991, С. 254. 12. Ие~ вамед Д.Б., Кирничная В.К., 2вячко ЮЛ. Определение наташцинз и виде ЯБД-прояэводного методом тонкослойной хроматографии. Ж. . анадит.хиыии, 1991, Т. 46, Вып. 6, С. I2I2-I2I7. 18; Ляпаов Б.Г, Медамед Д.Б., лирничная B.K.-, Мурох В.И. Нетод.рекомендацни по обнарук., идентификации и определение оотаз. кол-в иевоницвтшн в продуктах животного происхождения. Шшон-Ыосква, 1991, 12 с. 14. Болоуеов Л.А., Вагин В.В., Бедова B.D., Зимина Л.В., Зайцев

A.Н., Ляпвов Б.Г., Меламод Д.Б., Кирничная В.К. Техноп.инетрукц. по обработке белковых колбасных ободочен препаратом "Дэдьвоцид" фирмы Гист-Броаадос (Голландия) при производстве саронопченых нодбво. ВНШКИШ1, Ы., 1991, 9 с. 15. Ыедамед Д.Б., Кирничная ,

B.К., Ляпаов Б.Г. Способ в на пи аз девомицетинз в пищевых продуктах. Автор, свид. й 1702302 (СССР), f//' „ ,