Методы выделения и состав биологически активных веществ одуванчика лекарственного Taraxacum Officinale Wigg тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

(fniiaJ

ТИГУНЦЕВА Надежда Павловна

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И СОСТАВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ОДУВАНЧИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО TARAXACUM OFFICINALE fVIGG.

Специальность: 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ФЕВ 2015

Иркутск - 2014

005558568

005558568

Работа выполнена на кафедре органической химии и пищевой технологии им. проф. В.В. Тутуриной федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Иркутский государственный технический университет» (ФГБОУ ВПО «ИрГТУ»)

Евстафьев Сергей Николаевич

доктор химических наук, профессор, директор Института пищевой инженерии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «ИрГТУ» >

Пономарев Дмитрий Андреевич доктор химических наук, профессор, профессор кафедры химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. Кирова»

Полякова Ирина Николаевна кандидат химических наук, заместитель директора федерального государственного унитарного предприятия "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный университет»

Защита состоится « 4 » марта 2015 г. в « 16:00 » часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.230.02 при федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)» по адресу: 190013, г. Санкт-Петербург, Московский пр., 26.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке СПбГТИ(ТУ) и на официальном сайте по ссылке: lmp://technolog.ediLru/rii/dociiments/file/1544-tigtintseva-nadezhda-pavlovna.litml.

Замечания и отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять на имя ученого секретаря по адресу: 190013, г. Санкт-Петербург, Московский пр., 26, СПбГТИ (ТУ). Ученый совет, тел.: (812)494-93-75; факс: (812)712-77^91; e-mail: dissowet@teclinolog.edii.ru

Автореферат разослан «ЗС? f<?

Ученый секретарь диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.230.02, кандидат химических наук, доцент

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Н.Б. Соколова

Я

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время большое внимание уделяется выделению и изучению биологически активных веществ (БАВ) дикорастущих растений, которые находят широкое применение в пищевой, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности. Естественная возобнов-ляемость и приспособленность к условиям окружающей среды делает растения дикой флоры неисчерпаемым сырьем для производства БАВ.

Одуванчик лекарственный Taraxacum Officinale IVigg. имеет древнюю традицию использования в народной медицине в качестве желчегонного, жаропонижающего, слабительного, отхаркивающего, успокаивающего и спазмолитического средства. Интерес к одуванчику объясняется не только его биологическими особенностями, такими как высокая скорость роста надземных органов, мощное развитие корневой системы, но и наличием уникального набора природных БАВ, состав и содержание которых зависит от множества факторов, в том числе, и от почвенно-климатических условий. Поэтому изучение химического состава БАВ одуванчика, собранного с ранее не изученных в этом плане территорий Иркутской области, а также методов их выделения является важной и актуальной задачей.

Степень разработанности. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что сведения о составе БАВ одуванчика лекарственного, произрастающего в Восточно-Сибирском регионе, весьма ограничены. Наиболее изученными на сегодняшний день с использованием современных методов анализа являются одуванчики, произрастающие па Украине и Красноярском крае. Учитывая перспективность данного вида для медицины и пищевой промышленности необходимы дополнительные исследования состава и методов выделения биологически активных веществ.

Для извлечения БАВ из растительного сырья используются методы, основанные, чаще всего, на экстракции жидкими растворителями. При этом состав смеси экстрактивных веществ, выделяемой из одного и того же растительного сырья, и, как следствие, ее физиологические свойства определяются, прежде всего, условиями процесса выделения и селективностью растворителя. К недостаткам методов выделения, использующих органические растворители, наряду с низкой эффективностью и применением повышенных температур можно отнести также их экологическую опасность.

В связи с чем возрос интерес к технологиям экстракции растительного сырья сжатыми и сжиженными газами — технологиям «зеленой химии». Одним из перспективных направлений в этой области является использование экологически чистой экстракции сверхкритическим диоксидом углерода, предусматривающей низкотемпературную обработку растительного сырья, что очень важно при выделении БАВ. Полученные экстракты имеют не только уникальную микробиологическую чистоту, но и хорошо сохраняют запах, вкус и биологическую ценность исходного сырья. Сведения об использовании СОг-экстракции одуванчика лекарственного в литературе отсутствуют.

Целью работы являлось изучение влияния условий выделения на выход и состав биологически активных веществ надземной части и корней одуванчика лекарственного Taraxacum Officinale fVigg., произрастающего на территории Иркутского района.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- обоснование выбора одуванчика лекарственного для выделения БАВ;

- изучение выхода и состава эфирных масел надземной части и корней одуванчика;

' - выделение и изучение состава водорастворимых соединений одуванчика;

- исследование зависимости выхода и состава водно-этанольных экстрактов от концентрации этанола;

- исследование влияния условий сверхкритической С02-экстракции и природы модификатора на выход и состав биологически активных соединений одуванчика;

- разработка схемы выделения пектиновых полисахаридов из одуванчика и исследование их выхода, состава и свойств.

Научная новизна. Впервые выполнен сравнительный анализ методов выделения БАВ из надземной части и корней одуванчика лекарственного, произрастающего в Иркутском районе, и изучено влияние условий выделения на выход и состав соединений экстрагируемых экологически чистыми растворителями (вода, этанол, диоксид углерода).

Получены новые данные о содержании и составе биологически активных веществ надземной части и корней одуванчика лекарственного.

Разработана схема выделения и изучен качественный и количественный моносахаридный состав пектиновых полисахаридов надземной части и корней одуванчика комплексом методов химического анализа, ИК- и ЯМР |3С-спектроскопии и ГХ-МС.

Установлено влияние концентрации этанола на выход и состав экстрагируемых соединений из надземной части и корней одуванчика. .

Впервые изучено влияние условий сверхкритической С02-экстракции и природы модификатора на выход и состав БАВ одуванчика.

Практическая значимость. Предложенные схемы позволяют получать из одуванчика углекислотные, водные и спиртовые экстракты с высоким содержанием биологически активных веществ, которые могут быть использованы в пищевой и кондитерской промышленности, а так же в качестве составляющих лекарственных препаратов для приготовления витаминных сборов.

Результаты диссертационной работы используются при чтении лекций и выполнении лабораторных работ дисциплин «Химия природных соединений», «Пищевая химия» для студентов направления 260100 «Продукты питания из растительного сырья» на кафедре органической химии и пищевой технологии им. проф. В.В. Тутуриной Иркутского государственного технического университета.

Методология н методы исследования. Результаты работы были получены при изучении составов экстрактов, выделенных из надземной части и кор-

ней одуванчика водой, водно-этанолыюй смесью и сверхкритическим диоксидом углерода. В ходе работы использованы методы УФ-, ИК-, ЯМР |3С- спектроскопии, ГХ-МС, элементного и аминокислотного анализов, а также стандартные аттестованные методы аналитической химии.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в подготовке и проведении экспериментов, интерпретации и обсуждении результатов, написании научных материалов к публикации.

Положения, выносимые па защиту:

1. Научное обоснование выбора одуванчика лекарственного Taraxacum officinale IVigg. для исследования состава БАВ и методов их выделения.

2. Результаты исследования выделения БАВ из надземной части и корней одуванчика парами воды, водой и водно-этанольными смесями различной концентрации.

3. Результаты исследования влияния условий сверхкритической экстракции диоксидом углерода и природы модификатора на выход и состав экстрагируемых веществ.

4. Схема выделения и результаты изучения состава и свойств пектиновых полисахаридов одуванчика.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов и сделанных на их основе выводов обеспечивается значительным объемом проведенной экспериментальной работы, базируется на анализе литературных сведений по составу БАВ одуванчика лекарственного, обеспечивается применением современных методов химического анализа и подтверждается публикациями основных результатов работы в рецензируемых печатных изданиях. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на международных и всероссийских конференциях: «Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность продуктов питания» (Иркутск, 2010); 1 Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Казань, 2012); Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012); Всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Перспективы развития технологии переработки углеводородных, растительных и минеральных ресурсов» (Иркутск, 2013); Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, включая, 6 статей, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 6 тезисов докладов на международных, всероссийских и региональных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем составляет 149 страниц печатного текста, в том числе 39 рисунков, 32 таблицы. Список литературы содержит 186 источников, в том числе 42 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении раскрыта актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна и практическая значимость работы, а также основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе приведен анализ имеющейся информации о составе биологически активных веществ одуванчика лекарственного Taraxacum officinale IVigg-, методах их выделения и области использования.

Во второй главе дано описание объектов и методов исследования. Объектом исследования являлись образцы надземной части и корней одуванчика лекарственного Taraxacum Officinale IVigg., собранные в июне 2010 г. до цветения в Иркутском районе.

Для выявления биологически активных веществ в исходных образцах проводили качественные и количественные определения по общепринятым стандартным методикам.

Анализ состава аминокислот проводили на анализаторе ААА-Т339, макро-и микроэлементов - на квадруполыюм масс-спектрометре Agilent 7500 се с индуктивно-связанной плазмой, эфирного масла, экстрактов и гидролизатов - на хроматографе 7820 А с селективным масс-спектрометрическим детектором HP 5975 фирмы «Agilent Technologies». Элементный состав определяли на анализаторе Vario micro Cube Elementar, ИК-спектры регистрировали в диапазоне волновых чисел 4000-400 см"1 на спектрометре Сагу 670 фирмы «Agilent Technologies», количественные спектры ЯМР |3С - на спектрометре ЯМР фирмы «Bruker». УФ-спектры снимали на приборе HP 8452 фирмы «Agilent Technologies».

- Определение комплексообразующей способности пектиновых полисахаридов, массовой доли ацетильных групп и степени этерификации проводили по известным методикам.

Сверхкритическую С02-экстракцию одуванчика выполняли на установке R-401 производства южнокорейской компании «Reaction Engineering».

Статистическую обработку полученных данных проводили в компьютерной программе Excel 7.0.

В третьей и четвертой главах приведены основные результаты исследования и их обсуждение.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Химический состав комплекса БАВ одуванчика

Исследуемые образцы надземной части и корней одуванчика содержат в своем составе различные группы БАВ с широким спектром фармакологического действия (таблица 1). Витамины, каротиноиды и основной представитель углеводов одуванчика - инулин сконцентрированы преимущественно в корнях, а эфирные масла, хлорофилл, фенольные соединения, макро-и микроэлементы -в надземной части одуванчика.

В составе образцов определено 68 макро- и микроэлементов, 9 из которых являются эссенциальными: железо, йод, медь, цинк, кобальт, хром, молибден, селен и марганец.

Таблица 1 - Характеристика состава образцов одуванчика

Вещества Надземная часть Корни

Эфирные масла, в % на а.с.м* 0,82 0,27

Хлорофилл, мг % 3,70 -

Крротиноиды, мг % + 0,36

Фенольные соединения, в % на а.с.м. 6,85 4.55

в том числе:

-таниииы 0,25 0,13

- фенолкарбоиовые кислоты 0,12 0,02

- флавоноиды 0,16 0,74

- катехины +

-кумарины + +

Витамин РР, мг % 0,83 0,92

Инулин, в % на а.с.м.: 9,60 44,1

Сапонины, в % на а.с.м. 1,14 1,28

Аскорбиновая кислота, в % на а.с.м. 0,03 0,30

*на абсолютно сухую массу **в ыявлено присутствие по качественным реакциям

Среди макроэлементов в составе надземной части и корней одуванчика преобладают калий, кальций, кремний, алюминий и натрий. Содержание токсичных элементов, таких как свинец, ртуть, кадмий, мышьяк, уран не превышает допустимых уровней.

Выход и химический состав эфирных масел Обработка образцов одуванчика парами воды в условиях процесса гидродистилляции позволила выделить из надземной части 0,82 % летучих компонентов, что сравнимо с выходом С02-экстракта, и лишь 0,27 % из корней. Несмотря на низкий выход, эфирные масла корней включают обширный набор групповых компонентов: жирные кислоты, сложные эфиры, спирты, кетоны, альдегиды, терпены и терпеноиды, алканы, а эфирные масла надземной части дополнительно гетероциклические, алициклические и ароматические соединения (рисунок 1).

40 I 55 1 .К) 25

Р 15

I I»

Рисунок 1 — Групповой состав эфирных масел одуванчика: I - карбоновые кислоты; 2 - сложные эфиры; 3 - терпены; 4 - терпеноиды; 5-кетоны; 6 - альдегиды; 7-спирты; 8 - алканы; 9 - гетероциклические соединения; 10 — алициклические соединения; II- ароматические соединения

□ к(>1>!!1[ ■Н.1;1)|.'МК11'ТЧПС11.

Основными компонентами эфирных масел являются насыщенные жирные кислоты состава С5-С|<, (до 37 %) и кетоны (до 23 %). Среди кислот преобладает пальмитиновая кислота, на долю которой приходится до 45 % от суммы кислот. Ее метиловый эфир и этиловый эфир линолевой кислоты являются основными представителями сложных эфиров полученных масел.

> Отличительной особенностью эфирных масел является относительно низкое содержание терпенов и терпеноидов (менее 20 %), а также отсутствие непредельных жирных кислот и стеролов. Среди терпенов эфирного масла корней выделяются содержанием а-патчоулен, а-бисаболен и 1-метил-10,18-биснорабиет-8,11,13-триен, а в эфирном масле надземной части - сесквитерпен Р-элемен и среди терпеноидов - ионол, дигидроактинидиолид и производное ациклического сесквитерпенового углеводорода а-фарнезена - гексагидрофар-незилацетон. В эфирном масле надземной части в небольших количествах идентифицирован лимонен.

Выход и состав водорастворимых соединений одуванчика Наибольшее количество экстрагируемых веществ из одуванчика выделено водой, выход которых с повышением температуры обработки с 25 до 100 °С возрастает для надземной части с 15,6 до 37,5 %. При этом, прирост выхода обеспечен извлечением пектиновых полисахаридов (гидратопектина), доля которых в экстракте возрастает с 26 до 44 %. При обработке корней одуванчика влияние температуры менее выражено, выход водорастворимых соединений увеличивается лишь на 5 % (с 34,8 до 39,6 %). В их составе доля пектиновых полисахаридов при повышении температуры обработки с 25 до 100 °С изменяется с 9 до 22 %.

Основными компонентами водорастворимых экстрактов, независимо от температуры обработки, являются низкомолекулярные соединения, представленные моно-и олигосахаридами, оксикислотами, а в экстракте надземной части -дополнительно растворимыми белками и свободными аминокислотами. По данным УФ-спектроскопии в водных извлечениях надземной части и корней одуванчика присутствуют также соединения фенольного ряда: флавононы, ка-техины, лейкоантоцианы, оксибензойные кислоты, ксантоны, оксикоричные кислоты, простые фенолы и флавоны.

Моносахариды исходных фракций низкомолекулярных продуктов представлены арабинозой, ксилозой, маннозой, галактозой, глюкозой и фруктозой с суммарным содержанием 16,4 и 19,6 % для фракции надземной части и корней соответственно (таблица 2). Доминирующим моносахаридом в полученных

Таблица 2 - Состав моносахаридов фракций низкомолекулярных водорастворимых соединений, в %*_

Фракция Моносахариды

Ага Ху1 ас ва1 Мап Рш Ю1а

Надземная часть

Исходная 0,5 3,8 2,7 1,1 0,02 8,2 _

Гидролизат 5,8 1,0 20,6 1,9 0,2 2,1 1,2

Корни

Исходная Гидролизат 0,3 2,5 0,1 0,7 2,1 57,8 1,3 1,2 0,18 15,9 -

*на а.с.м исходных низкомолекулярных водорастворимых соединений.

фракциях является фруктоза. На ее долю приходится 50 % суммы редуцирующих Сахаров фракции надземной части и 82 % - фракции корней одуванчика.

Наибольшее содержание олигосахаридов выявлено во фракции корней (42,7 %), во фракции из надземной части их доля не превышает 17 %. Основными представителями олигосахаридов фракции надземной части является ара-бинан, а во фракции корней - полифруктаны, так как после гидролиза трифто-руксусной кислотой содержание моносахаридов в гидролизатах надземной части и корней возрастает до 32,8 и 62,3 % соответственно, прежде всего, за счет выделения арабинозы во фракции надземной части и глюкозы - во фракции из корней. Относительно высокое содержание глюкозы и низкое - фруктозы, а в гидролизате фракции корней ее отсутствие, может быть обусловлено гидролизом полифруктанов с образованием фруктозы, которая в условиях гидролиза изомеризуется в глюкозу. В следовых количествах в составе гидролиза-тов фракций обнаружена рамноза, являющаяся структурным фрагментом пек-типовых веществ.

Суммарный выход Сахаров в исходных фракциях водорастворимых соединений в пересчете на а.с.м. надземной части и корней одуванчика составляет 6,1 и 7,8 %, а после гидролиза их содержание возрастает до 12,3 и 24,7 %. Присутствие во фракциях наряду с моно-и олигосахаридами оксикислот, а во фракции из надземной части дополнительно свободных аминокислот и растворимых белков определяет фармакологическое действие водорастворимых соединений одуванчика как препаратов, обладающих противовоспалительным и бактерицидным действием.

Выход и состав водно-этанольных экстрактов

Добавление в воду этанола в качестве сорастворителя до 40 % об. при обработке корней увеличивает выход экстрагируемых веществ на 4 %, а последующее повышение его содержания до 96 % об. приводит к уменьшению выхода экстракта до 12,8 % на а.с.м. (рисунок 2).

Выход экстрагируемых веществ из надземной части при обработке водно-этанолыюй смесью с повышением концентрации этанола до 60 % об. снижается на 6-8 %, а в интервале от 60 до 96 % - на 17-20 %. В этом интервале концентраций этанола в составе экстрактов возрастает доля липидов, извлекаемых гекса-ном, до 1,6 %для корней и 1,8 %для надземной части и снижается доля водорастворимых соединений до 5 и 8 % для надземной части и корней соответственно.

Снижение выхода экстрагируемых веществ и доли водорастворимых продуктов в их составе при повышении концентрации этанола обусловлено тем, что этанол экстрагирует в основном липиды и препятствует переходу в раствор пектино-

0 20 40 60 60 100 Концентрация этанола в растворителе. ® г оо.

♦ Надземная часть ■ Корнн

Рисунок 2 - Зависимость выхода водно-этанольных экстрактов от концентрации этанола

вых полисахаридов. Этим можно объяснить иную зависимость выхода экстракта из надземной части от концентрации этанола. Согласно полученным данным водорастворимые продукты надземной части одуванчика характеризуются практически в два раза большим содержанием пектиновых полисахаридов, в сравнении с экстрактами из корней. Поэтому присутствие этанола в составе растворителя заметно сказывается на выходе экстракта уже при низких концентрациях.

Независимо от концентрации этанола на долю водорастворимых соединений в экстрактах приходится 50-60 %. Состав моносахаридов в гидролизатах водорастворимых соединений аналогичен составу моносахаридов, выделенных из одуванчика водой при 100 °С. Основными моносахаридами надземной части являются арабиноза, корней - глюкоза. Галактуроновая кислота и рамноза обнаружены только в гидролизатах водорастворимых соединений, выделенных водно-этанольной смесью с концентрацией этанола до 60 %. Это подтверждает предположение об осаждении пектиновых полисахаридов в процессе экстракции при использовании этанола большей концентрации.

Выход липидов, извлекаемых из водно-этанольных экстрактов гексаном, сравним с выходом экстрактов, выделенных диоксидом углерода с модификатором (вода). Согласно результатам исследования методами ИК-спектроскопии и ГХ-МС установлено, что в их составе присутствуют вещества различных классов, основными из которых являются: углеводороды, насыщенные, мононенасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты, сложные эфиры карбо-новых кислот, спирты, а также стеролы и терпеноиды (рисунок 3).

1 2 3 4 5 б 7 1 2 3 4 5 6

□ 20*« ■404» 060% И80% И96% О20% "40% 060"» 080% И96%

Рисунок 3 - Групповой состав гексановых экстрактов надземной части (а) и

корней (б) одуванчика: / - алканы; 2 - карбоновые кислоты; 3 - сложные эфиры;4 - терпеноиды; 5 - стеролы; 6 — альдегиды ti кетоны; 7 — спирты. Независимо от концентрации этанола основными компонентами экстрактов из надземной части являются карбоновые кислоты, терпеноиды и стеролы. Водно-этанольной смесыо с концентрацией 20 % извлекается 29,7 % терпенои-

дов, представленных гексагидрофарнезилацетоном, дигидроактинидиолидом и лупеолом, и 15,9 % стеролов ф-стнгмастерол, р-ситостерол).

При повышении концентрации этанола в состав терпеноидов дополнительно извлекаются фитол, урс-12-ен-З-ол, лупеноц и др. При этом изменяется и качественный состав стеролов, появляются 4,6-холестадиен-Зр-ол, 22,23-дигидробрассикастерол, 22-дегидрохолестерол и ацетат 3-р-стигмаст-5,22-диен-3-ола. Наиболее представителен по составу стеролов экстракт, выделенный 80 %-ым этанолом.

В этанольных экстрактах корней одуванчика доля предельных одноосновных карбоновых кислот ниже и не превышает 27,5 %, а преобладающее содержание карбоновых кислот наблюдается лишь в экстрактах, выделенных этанолом с концентрацией до 60 %. При использовании больших концентраций в полученных экстрактах преобладают терпеноиды (52-58 %). Доля стеролов независимо от концентрации этанола выше, чем в экстрактах надземной части, и изменяется от 14 до 24 % .

Отличительным признаком этанольных экстрактов является присутствие высокомолекулярных одноосновных кислот до С25, двухосновных кислот (ади-пиновая, пробковая и азелаиновая) и биологически важных непредельных одноосновных кислот, представленных пальмитолеиновой, олеиновой и линоле-вой кислотами (до 10 % для корней и до 19 % для надземной части). С повышением концентрации этанола в составе экстрактов возрастает доля высокомолекулярных предельных кислот и ароматических кислот, таких как коричная и 3,4-диметоксикоричная кислоты.

Установлено, что при концентрации спирта более 80 % извлекаются преимущественно липидные компоненты, в составе которых наряду с терпеноида-ми, стеролами и жирными кислотами присутствуют аминокислоты, воски, тан-нины, фенолокислоты, флавоноиды, сапонины, витамины и др. Среди идентифицированных 16 аминокислот, 5 являются незаменимыми (лизин, треонин, фенилаланин, лейцин и изолейцин), что свидетельствует о высокой биологической ценности экстрактов. Аминокислоты экстракта корней одуванчика характеризуются высоким содержанием глютамина, аспарагина, аргинина и относительно низким - лизина. В экстракте надземной части в наибольшем количестве присутствуют фенилаланин и глютаминовая кислота, а аспарагин и глютамин не обнаружены.

Максимальный выход восков из надземной части и корней одуванчика 1,4 % и 1,2 % па а.с.м. соответственно получен при использовании 96 %-ого этанола. Методом ГХ-МС установлено, что кислотной составляющей восков являются предельные одноосновные С7-С27 и непредельные (олеиновая, линолевая и 8,11,14 -докозатриеновая) кислоты. Среди насыщенных жирных кислот в вос-ках надземной части выделяется относительно высоким содержанием пальмитиновая, генэйкозановая, церотиновая и монтановая кислоты. Одноосновные предельные кислоты восков корней менее высокомолекулярны (Сн-Сгз) и характеризуются преобладающим содержанием стеариновой, бегеновой и лигно-цериновой.

Влияние условий процесса на выход и состав С02-экстрактов

Установлено, что диоксид углерода в сверхкритических условиях обладает относительно высокой селективностью по отношению к терпенам, терпеноидам и стеролам оДуванчика.

Сверхкритическая экстракция диоксидом углерода при 10 МПа (55 °С, 45 мин) характеризуется относительно низкой эффективностью. В этих условиях из корней одуванчика выделено лишь 0,14 % экстрагируемых веществ. Повышение давления до 20 МПа способствует увеличению выхода С02-экстрактов до 0,46 % из корней и до 0,86 % из надземной части. При давлении процесса 30 МПа увеличения выхода экстракта из корней не наблюдается, а из надземной части он возрастает до 1,04 % на а.с.м. Таким образом, полученные выходы С02-экстрактов сопоставимы с выходами эфирных масел, по существенно уступает выходу эта-нольных экстрактов.

Отличительной особенность С02-экстрактов, полученных при 55 °С в интервале давления от 10 до 30 МПа и продолжительности от 45 до 180 минут (рисунок 4) является преобладающее содержание терпенов и терпеноидов, которое при 20 МПа для надземной части и корней одуванчика достигает 56 % и 74 % от суммы идентифицированных соединений соответственно. Увеличение их доли в экстрактах при повышении давления обусловлено извлечением высокомолекулярных компонентов. Терпены С02-экстракта, выделенного при 20 МПа из корней одуванчика, представлены скваленом, а в составе терпеноидов преобладают хопенон Б, лупеол и ацетат лупеола. В составе терпеноидов экстракта, выделенном при 30 МПа, обнаружены также p-амирин, 13,27-циклоурсан-3-ол и глобулол.

□ 10 МПа В20МПП ИЗО МПа 0 45 мин В 90 мин В180 мня

Рисунок 4 - Зависимость группового состава С02-экетрактов корней от давления (а) и от продолжительности экстракции при 30 МПа (б) 1 - алканы; 2 - карбоновые кислоты; 3 - сложные эфиры: 4 - терпены и терпеноиды; 5 - стеролы; 6 — альдегиды и кетоны; 7 — спирты

Терпеноиды, полученные из надземной части при 20 МПа, по количественному и качественному составу менее представительны. В их составе обнаружены четыре компонента: лупеол, ацетат лупеола, 12-олеанен-З-илацетат и

дигидроактинидиолид. При повышении давления до 30 МПа в экстракт дополнительно извлекаются лупенон, гексагидрофарнезилацетон и фитол.

Важным компонентом СОг-экстрактов одуванчика являются стеролы. Общим для экстрактов является преобладающее содержание [3-ситостерола, а также ацетата |3-сигостерола в экстракте корней и кампестерола в экстракте надземной части. При 30 МПа из корней одуванчика дополнительно извлекаются 22,23-дигидробрассикастерол, 22-дегидрохолестерол и стигмаст-5-ен-З-ол оле-ат, а из надземной части - 22,23-дигидробрассикастерол. В целом, по составу стеролы С02-экстрактов близки составу стеролов этанольных экстрактов.

Карбоновые кислоты С02-экстрактов (20 МПа) надземной части и корней одуванчика близки по суммарному содержанию (около 10 %), но существенно различаются по качественному составу. В составе экстракта надземной части идентифицированы одноосновные предельные кислоты С5-С19, с преобладающим содержанием арахиновой и миристиновой кислот, и непредельные кислоты (С161 и С181), на долю которых приходится около 20 % от суммы кислот. Одноосновные предельные кислоты корней более высокомолекулярные (С|3-См) с преобладающим содержанием пальмитиновой кислоты (более 90 %). На долю непредельных кислот (С181 и С^г) приходится более 40 % от суммы кислот. В сравнении с методом перегонки с паром диоксидом углерода в сверхкритических условиях извлечены предельные кислоты с большей молекулярной массой и ненасыщенные кислоты. Однако их качественный и количественный состав существенно уступает составу кислот этанольных экстрактов.

Влияние природы модификатора на выход и состав СОг-экстрактов

Эксперимент по изучению влияния природы модификатора на выход и состав СОг-экстрактов из одуванчика выполнен при давлении 20 МПа, температуре 55 °С и продолжительности 45 мин.

Установлено, что применение в качестве модификаторов воды, этанола и тетрагидрофурана приводит к повышению выхода экстрагируемых веществ. Использование воды в количестве 1,5 % масс, практически в 1,5 раза увеличивает выход экстракта из корней одуванчика. При последующем повышении концентрации прирост выхода экстракта происходит менее интенсивно. Так, при изменении концентрации воды от 3 до 5 % масс, выход экстракта увеличился лишь на 0,06 %, поэтому дальнейшее повышение ее содержания в диоксиде углерода является нецелесообразным.

При использовании 5 % масс, воды выход С02-экстракта из надземной части составил 1,1 % на а.с.м. против 0,8 % из корней, несмотря на то, что прирост выхода при этом лишь 37,5 %, а для корней 74 %. Применение в качестве сорастворителя этанола (5 % масс.) способствует увеличению выхода экстракта из надземной части и корней до 2,9 и 2,4 % на а.с.м. соответственно. Максимальные выходы СОг-экстрактов, составляющие 3,2 % для надземной части и 4,1 % для корней, получены при использовании 5 % масс, тетрагидрофурана.

Установлено, что прирост выхода СОг-экстрактов в присутствии модификаторов обусловлен, в большей степени, извлечением высокомолекулярных

алифатических кислот, в том числе и ненасыщенных, и в меньшей степени альдегидов, кетонов и спиртов (рисунок 5).

80 70 60 50 40 30 20 10 0

12 3 4 5 6 7 5 9 □Исходный Я Вода Я Спирт ТГФ

80 70 60 50 40 30 20 10 О

1,

1..............л

„1 ш ; 1__ж» —

1 2 3 4 5 6 7 8 □Исходный «Вода 0Спирт ВТГФ Рисунок 5 - Групповой состав СОг-экстрактов надземной части (а) и корней (б) в зависимости от природы модификатора: / - алкаиы; 2 — карбоновые кислоты; 3 - сложные эфиры; 4 - терпены и терпеноиды;

5 - стеролы; 6 — альдегиды; 7 - кетоны; 8 — спирты; 9 - витамины На выход и состав терпеноидов и стеролов присутствие модификаторов сказывается слабо. Несмотря на снижение доли терпеноидов в экстрактах при использовании модификаторов их превалирующая роль сохраняется.

Состав и свойства пектиновых полисахаридов одуванчика В работе предложена двухстадийная обработка исследуемых образцов с добавлением на первой стадии дистиллированной воды, а на второй - водного раствора щавелевокислого аммония для выделения пектиновых полисахаридов ПС-1 и ПС-2 соответственно. Изучена зависимость выхода полисахаридов от температуры на каждой стадии обработки. Установлено, что максимальные выходы могут быть получены при 100 °С.

Суммарный выход пектиновых полисахаридов из надземной части при 100 °С составил 27,9 % на а.с.м. В их составе около 60 % приходится на гидратопектин, выделенный на первой стадии обработки и характеризующийся высокой зольностью. Для гидратопектина и протопектина надземной части характерно высокое содержание пектинатов. В составе минеральной части исследуемых образцов пектиновых полисахаридов определено 22 элемента. Среди макроэлементов преобладают калий, кальций, магний и кремний. Наиболее выражено это для гидратопектина, а в составе минеральной части протопектина отмечено сравнительно высокое содержание кремния, алюминия, цинка и ряда микроэлементов. Содержание токсичных элементов не превышает допустимых норм.

По данным ЯМР |3С основным компонентом макромолекулы гидратопектина надземной части является Э-галактуроновая кислота с содержанием около 52 % масс, (таблица 3). Ее карбоксильные группы на 34 % метилированы, а около 60 % связано с металлами. Макромолекула протопектина надземной части содержит 37,4 % а-1,4-связанной Э-галактопиранозилуроновой кислоты,

около 38 % карбоксильных групп галактуроновой кислоты метилировано и 35 % связано с металлами.

Таблица 3 - Содержание функциональных групп и углеводных остатков __в полисахаридах, в % масс._

Образец Углеводы Функциональные группы

a-Gal Ар a-L-Ara/' нс=о С(0)0Н С(0)0СНз СНзС(0)0 ОСНз

Надземная часть

ПС-1 51,9 - 6,6 11,7 7,8 следы 4,2

ПС-2 37,4 12,8 - 15,3 12,2 следы 6,4

Корни

ПС-2 41,9 13,4 10,2 9,82 15,9 5,2

Суммарный выход гидратопектина и протопектина из корней одуванчика при незначительном преобладании последнего составил 18 %, что в 1,5 раза ниже выхода пектиновых полисахаридов из надземной части.

Установлено, что в состав гидратопектина корней входят преимущественно остатки нейтральных моносахаридов: арабинозы, ксилозы, галактозы, глюкозы и в минорном количестве маннозы (таблица 4).

По данным ГХ-МС доминирующим моносахаридом является глюкоза с содержанием более 70 % от суммы моносахаридов, а по данным ЯМР |3С -фруктоза с содержанием около 90 % мае. На долю остатков галактуроновой кислоты приходится около 16 %, что говорит о примесном характере пектиновых полисахаридов во фракции. Основными компонентами ее являются полифрук-таны и, возможно, глюкан.

Таблица 4 - Состав гидролизатов пектиновых полисахаридов, в %

Образец GalA Ага Ху1 Мап йа! Glc Rha

Надземная часть

ПС-1 35,5 20,4 2,1 0,3 12,5 10,6 8,0

ПС-2 29,7 33,4 4,6 0,1 13,7 11,6 2,4

Корни

ПС-1 16,4 14,9 2,3 0,3 6,7 59,3 Следы

ПС-2 31,0 31,0 1,0 0,1 12,2 6,2 2,1

Качественный состав гидролизата протопектина корней аналогичен, но доминирующими компонентами среди моносахаридов являются арабиноза и галактоза, их соотношение составляет 2,7:1. Как и в протопектине надземной части имеет место аномально высокое содержание арабинозы. По данным ЯМР "С содержание галактуроновой кислоты в протопектине составляет 41,9 %, при этом около 42 % карбоксильных групп галактуроновой кислоты этерифициро-вано. Макромолекула протопектина характеризуется низкой степенью разветв-ленности и содержит боковые цепи, образованные с участием а-Ь-арабинофуранозы.

Установлено, что по основным физико-химическим показателям гидрато-пектин надземной части одуванчика после деминерализации и очистки от сопутствующих арабинана и арабиногапактана может быть рекомендован для использования при приготовлении продуктов лечебно-профилактического назначения.

Заключение

В результате выполненной работы выявлено, что максимальный выход экстрагируемых из одуванчика веществ может быть получен обработкой водой при 100 °С. В полученных экстрактах сконцентрированы моносахариды, олиго-сахариды, окси- и аминокислоты, а также, что очень важно, пектиновые полисахариды, представляющие собой уникальный биологически активный продукт с лечебно-профилактическими свойствами.

При использовании водно-этанолыюй смеси с повышением концентрации этанола выход экстрагируемых соединений, в том числе пектиновых полисахаридов, существенно снижается до 9,6 % для надземной части и 12,8 % для корней. В составе экстрактов, полученных этанолом с концентрацией более 60 %, повышается доля липидов до 1,6-1,8 % на а.с.м., что сравнимо с выходом экстрактов, выделенных диоксидом углерода с модификаторами. Полученные экстракты содержат богатый комплекс биологически активных веществ, тем не менее, по ряду групповых компонентов, прежде всего по содержанию терпе-ноидов, существенно уступают сверхкритическим СОг-экстрактам. Кроме того, при выделении липидных компонентов используются относительно высокая температура и сложная схема фракционирования этанолыюго экстракта.

Для извлечения БАВ из одуванчика заслуживает внимания использование сверхкритического диоксида углерода, характеризующегося относительно высокой селективностью по отношению к терпенам, терпеноидам и стеролам одуванчика. Выход и состав комплекса БАВ ССЬ-экстрактов можно регулировать изменением давления и продолжительности процесса, а также подбором модификатора.

Выводы

1. Экспериментально установлено присутствие в составе одуванчика лекарственного различных групп биологически активных веществ с широким спектром фармакологического действия: танинов, фснолокислот, флавоноидов, ка-техинов, кумаринов, сапонинов, витаминов, каротиноидов, углеводов, макро-и микроэлементов. Наибольшее содержание витаминов, каротиноидов и инулина характерно для корней, а эфирных масел, хлорофилла и фенольных соединений -для надземной части одуванчика.

2. Выделение БАВ обработкой одуванчика парами воды в условиях процесса гидродистилляции характеризуется наименьшей эффективностью. В составе эфирных масел надземной части и корней одуванчика с выходом 0,82 и 0,27 % соответственно присутствует свыше 50 соединений, среди которых значительна доля жирных кислот (32-37 %), кетонов (17-23 %) и относительно низкая -биологически активных терпенов (5-11 %) и терпеноидов (7-14 %).

3. При экстрагировании водой как из надземной части так и из корней одуванчика извлекается до 40 % соединений, представленных моно- и олигосаха-ридами (от 12,3 до 24,7 %), пектиновыми полисахаридами (от 8,6 до 16,6 %), а для надземной части - также белками, свободными окси- и аминокислотами. В составе моносахаридов присутствуют арабиноза, ксилоза, манноза, галактоза, глюкоза и фруктоза, при подавляющем доминировании последней (до 82 %), а в составе олигосахаридов надземной части — арабинаны, корней - полифруктаны.

4. Получены зависимости выхода экстрактивных веществ от концентрации этанола. Установлено, что выход этанолрастворимых соединений из корней одуванчика проходит через максимум при 40 % об. и составляет 43,6 %. Последующее повышение концентрации до 96 % при экстрагировании надземной части и корней наряду с уменьшением выхода извлекаемых соединений (до 9 % для надземной части и 12,8 % - для корней) сопровождается повышением в их составе доли липидов и снижением доли моно- и олигосахаридов. Независимо от концентрации этанола в составе липидов преобладают жирные кислоты (от 27 до 72 %), терпеноиды (от 4 до 58 %) и стеролы (от 12 до 25 %). На долю ненасыщенных жирных кислот,, обладающих высокой биологической активностью, приходится от 10 до 19 %.

5. Впервые получены и исследованы СОг-экстракты из анатомических частей одуванчика лекарственного. Установлено, что повышение давления и продолжительности процесса способствует увеличению выхода экстрактов до 0,45 % при 20 МПадля корней и 1,04 % при 30 МПа для надземной части. Основными компонентами экстрактов являются терпеноиды (от 55 до 85 %), жирные кислоты (от 10 до 24 %) и стеролы (от 5 до 12 %). Применение модификаторов (вода, этанол, тетрагидрофуран) в количестве 5 % масс, в 2-4 раза увеличивает выход экстрактов за счет извлечения жирных кислот, в том числе ненасыщенных, сложных эфиров, альдегидов, кетонов и спиртов. Максимальный выход С02-экстрактов (3,2 % для надземной части и 4,1 % для корней) получены при использовании тетрагидрофурана.

6. Методами химического анализа, ИК-и ЯМР 13С-спектроскопии выявлено, что гидратопектин надземной части и протопектины надземной части и корней одуванчика с суммарным выходом 37 % на а.с.м., близким моносахаридным составом (арабиноза, ксилоза, галактоза, глюкоза, рамноза) и содержанием а-1,4-связанной D-галактопиронозилуроновой кислоты 51,9 %, 37,4 % и 41,9 %, соответственно, характеризуются высоким содержанием пектинатов (до 60 %), низкими степенью метилирования (от 0,34 до 0,42) и степенью разветвленное™ макромолекул. По основным физико-химическим показателям гидратопектин надземной части одуванчика после деминерализации и очистки от сопутствующих арабинана и арабиногалактана может быть рекомендован для использования при приготовлении продуктов лечебно-профилактического назначения.

Основные публикации по теме диссертации 1. Тигунцева Н.П., Евстафьев С.Н. Сравнительное исследование состава летучих с паром соединений одуванчика лекарственного Taraxacum officinale И Вестник ИрГТУ. - 2011. - № 10 (57). - С. 176 - 178.

2. Тигунцева Н.П., Евстафьев С.Н. Сравнительное исследование состава эфирного масла, гексанового и сверхкритического ССЬ-экстрактов из корней одуванчика лекарственного // Химия растительного сырья. - 2013. - № 3. - С. 129 -136.

3. Тигунцева Н.П., Каницкая J1.B., Евстафьев С.Н., Ушаков И.А. Пектиновые полисахариды корней одуванчика лекарственного Taraxacum officinale Wigg.ll Фундаментальные иселедования.-2013.-№ 10(часть 6).-С. 1243-1247.

4. Тигунцева Н.П. Состав сверхкритического ССЬ-экстракта из надземной части одуванчика лекарственного // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2013.-№ 1 (4).-С. 50-54.

5. Тигунцева Н.П., Евстафьев С.Н. Исследование влияние модификатора на выход и состав ССЪ-экстрактов из надземной части одуванчика лекарственного // Химия и технология растительных веществ: тез. докл. Всероссийской науч. конф. с междунар. участием. - Калининград, 2013. — С. 211.

6. Тигунцева Н.П., Воробьева Р.А., Евстафьев С.Н. Биологически активные вещества одуванчика лекарственного Taraxacum Officinale Wigg. // Перспективы развития технологии переработки углеводородных, растительных и минеральных ресурсов: материалы докл. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Иркутск, 2013.-С. 183- 185.

7. Тигунцева Н.П., Евстафьев С.Н. Состав низкомолекулярных водорастворимых соединений одуванчика лекарственного Taraxacum officinale IVigg. // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2012. - № 2 (3). - С. 27 - 29.

8. Тигунцева Н.П., Евстафьев С.Н. Химический состав экстрактивных веществ одуванчика Taraxacum officinale // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы докл. Всерос. науч. конф. с междунар. участием. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2012. - С. 303 - 304.

9. Тигунцева Н.П., Воробьева Р.А., Евстафьев С.Н. Сравнительное исследование аминокислотного состава одуванчика лекарственного Taraxacum officinale // Перспективы развития технологии'переработки углеводородных, растительных и минеральных ресурсов: материалы докл. науч.-практ. конф. с междунар. участием - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2012. - С.185 - 187.

10. Тигунцева Н.П., Каницкая Л.В., Евстафьев С.Н. Исследование состава и строения полисахаридов одуванчика лекарственного Taracaxum officinale // Фундаментальная гликобиология: тез. докл. I Всерос. науч. конф. - Казань, 2012.-С. 59.

11. Тигунцева Н.П., Каницкая Л.В., Евстафьев С.Н. Состав водорастворимых соединений надземной части одуванчика лекарственного Taraxacum officinale // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология.-2011.-№ 1.-С. 71 -75.

12. Тигунцева Н.П., Евстафьев С.Н. О комплексообразугощей способности пектиновых веществ // Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность продуктов питания: материалы докл. науч.-практ. конф., посвященной 80-летию ИрГТУ. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2010. - С. 38 - 42.