Микрофлюидные устройства для исследований биологических проб методами флуорометрии и оптической микроскопии высокого разрешения тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ



Евстрапов Анатолий Александрович

МИКРОФЛЮИДНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ МЕТОДАМИ ФЛУОРОМЕТРИИ И ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

специальность 01.04.01 - Приборы и методы экспериментальной

физики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

1 з СЕН 2012

Санкт-Петербург — 2012

005047217

Работа выполнена в лаборатории «информационно-измерительных био- и хемосенсорных микросистем» Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института аналитического приборостроения Российской академии наук

Научный консультант:

доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор, ведущий научный сотрудник ФТИРАН

Доктор технических наук, профессор, ведущий специалист ООО «Научные приборы»

Доктор биологических наук, заведующий лабораторией Института цитологии РАН

Курочкин

Владимир Ефимович

Зегря Георгий Георгиевич

Гуревич Борис Симхович

Негуляев Юрий Алексеевич

Ведущая организация:

Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «12» октября 2012 г. в «15» часов на заседании диссертационного совета Д002.034.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) по адресу 198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д. 31/33

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ИАП РАН по адресу: 190103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 26. Отзывы на диссертацию и автореферат направлять по адресу: 190103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 26.

Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета

2012 г.

А.П.Щербаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Развитие и доступность технологий микроэлектроники привели к появлению аналитических систем на основе микрофлюидных устройств (МФУ), позволяющих осуществлять уникальные манипуляции с микроколичествами жидкой или газообразной пробы. Такие системы получили название «лаборатория на чипе» (lab on а chip). Объединение всех стадий и этапов аналитического определения в одном компактном устройстве дает возможность проводить анализ пробы в микроформате с высокой чувствительностью, точностью и экспрессностью определения компонентов.

Современными тенденциями развития МФУ являются: а) миниатюризация; б) интеграция в устройства новых функциональных модулей; в) увеличение числа измерительных каналов; г) применение наноразмерных элементов; д) управление и контроль за всеми стадиями анализа; е) увеличение информативности измерений.

Создание аналитической системы на МФУ связано с решением ряда научных, методических, технических и технологических задач. Анализируемый компонент пробы и метод его анализа (или способ обнаружения) определяют топологию и конструкцию устройства, ассортимент применяемых материалов, технологии изготовления устройства, методы детектирования. Только комплексный подход, увязывающий выбор материалов, конструирование, способы изготовления, интеграцию новых элементов, внедрение оригинальных принципов управления движением и разделением компонентов пробы, дает возможность создавать современные приборы на МФУ. Известные зарубежные конструкции МФУ защищены патентами и режимами коммерческой тайны (know-how). Поэтому требуется проведение собственных исследований и разработок, которые позволят создавать аналитические системы на основе МФУ.

Наиболее востребованными при исследованиях многокомпонентных биологических проб являются электрофоретические методы анализа. При разнообразии конфигураций (конструкций) МФУ, применяемых для электрофоретических методов, существуют общие требования к этим устройствам. Поэтому перспективной является разработка универсальной и простой топологии, которая могла бы использоваться для решения различных исследовательских задач.

Применение оптически прозрачных материалов (стекол, полимеров) в микрогидродинамике (микрофлюидике) дает возможность использовать высокочувствительные оптические методы детектирования компонентов пробы. Востребованными являются исследования по изучению возможности применения отечественных марок стекол для МФУ, адаптация технологий изготовления и способов герметизации для этих материалов, изучение влияния различных факторов на свойства и характеристики устройств. В качестве альтернативных, относительно дешевых материалов могут применяться полимеры (поликарбонат, полиимид, полиметилметакрилат и др.). В этой связи важной задачей является исследование режимов воспроизводимого формирования микроразмерных структур с заданными характеристиками в полимерных материалах при использовании коммерческих технологических установок.

Интеграция в МФУ новых функциональных микро- и наноразмерных элементов и систем (микро- и наноэлектродов, наноразмерных каналов, нанопроволок, нанопористых сред и т.д.) представляется перспективным, так как дает возможность значительно расширить круг решаемых задач за счет использования новых физических принци-пов и методик анализа, улучшить аналитические характеристики устройств. Все это требует проведения комплексных исследований по изучению: способов создания наноразмерных элементов, взаимодействия наноструктур с жидкими средами, определению возможностей детектирования аналита.

Внедрение МФУ в практику лабораторных исследований все еще ограничено, так как рынок оснащен альтернативными аналитическими системами и приборами. Только немногие фирмы производят коммерческие аналитические системы на МФУ, среди них: Agilent Technologies Inc., Caliper Technologies Inc., Bio-Rad, Shimadzu Corp. и др. Разработка и создание отечественной приборной базы на основе МФУ позволила бы отказаться от импорта дорогостоящего оборудования и создать системы с техническими характеристиками, не уступающими лучшим зарубежным образцам.

Вышеизложенное определяет актуальность данного направления исследований, развивающего комплексный подход к созданию

аналитических систем на основе МФУ и оптических методов детектирования.

Цель работы: создание микрофлюидных устройств для исследований биологических проб методами флуорометрии и оптической микроскопии высокого разрешения.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Теоретические и экспериментальные исследования влияния геометрических и конструктивных параметров устройств, физико-химических свойств используемых материалов, технологий их обработки на характеристики МФУ;

2. Создание МФУ и приборно-аппаратных средств для электрофоретического разделения пробы и методов анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР);

3. Обоснование и реализация новых принципов исследований биологических проб с применением микро- и наноразмерных структур (нанопористых стекол, массива нитевидных нанокристаллов — ННК, наноразмерных каналов, микроэлектродов), как новых функциональных элементов МФУ (оптического сенсора, гидродинамических и диэлектрофоретических ловушек);

4. Апробация актуальных методик на МФУ: электрофоретического анализа пробы; ПЦР в реальном времени; изучения микрообъектов методами оптической микроскопии высокого разрешения.

Научная новизна диссертационной работы состоит в оригинальном методологическом подходе к проектированию приборно-аппаратных средств на основе МФУ, заключающемся в проведении комплексной системной разработки с учетом: специфики исследуемого объекта, методики анализа, свойств применяемых материалов, технологий формирования микро- и наноструктур, конструктивных элементов устройства, физико-химических свойств поверхности функциональных элементов, метода детектирования. Все это позволяет расширить область функциональных возможностей МФУ и улучшить аналитические характеристики создаваемых на их основе устройств.

В работе впервые:

1. Предложена и реализована новая универсальная топология микрофлюидного чипа (МФЧ), обеспечивающая возможность

5

дозирования разных объемов пробы электрокинетическими и гидродинамическими способами.

2. Экспериментально установлено, что отражательные свойства массива ННК из GaAs определяются формой вершины нанокристаллов. Обнаружено спектрально-селективное воздействие лазерного излучения на наноструктуры GaAs, приводящее к «слипанию» нанокристаллов и вызывающее изменение отражательной способности.

3. На примере обнаружения инсулина в пробе продемонстрирована возможность использования пористых стекол (в частности 8В-МАР), как основы нового оптического сенсорного элемента для регистрации конкурентной иммунной реакции.

4. Получены результаты теоретических и экспериментальных исследований, позволяющие осуществлять оценки влияния конструкционных, технологических, методических факторов при применении МФУ для анализа биологических проб, что является основой для решения задач оптимизации топологий или/и режимов анализа (управления).

Практическое значение определяется

1. Разработанными и созданными макетными образцами аналитических систем на МФУ с флуоресцентными детекторами, которые используются в ИАП РАН при проведении научно-исследовательских работ.

2. Изготовленными стеклянными МФЧ, предназначенными для электрофоретических и диэлектрофоретических методов исследований биологических проб, а также для методов ПЦР (за последние пять лет совместно с ЗАО «Светлана-полупроводники», г. Санкт-Петербург создано более 250 штук).

3. Отработанными режимами формирования микроразмерных структур с заданными геометрическими характеристиками в полиметилметакрилате методом лазерной абляции (ЛА) и полученными экспериментальными образцами МФЧ для электрофоретического разделения пробы (совместно с ООО «Лазерный центр», г. Санкт-Петербург).

4. Обнаруженным эффектом спектрально-селективного воздействия лазерного излучения на массив ННК, пригодным для применения в новых технологиях обработки наноструктур и при изготовлении

конструкций МФЧ с наноразмерными функциональными элементами.

5. Внедрением результатов работы в учебный процесс в форме авторских курсов лекций для бакалавров и магистров: «Микро- и нано- технологии в биологических и медицинских исследованиях» в СПб АУ НОЦНТ РАН, «Микро- и наноаналитические методы исследования жидких сред», «Биоаналитические системы на основе микрочиповых технологий» в НИУ ИТМО.

Положения, выносимые на защиту

1. Конфигурации МФЧ и аналитических систем, содержащие новые технические решения: МФЧ с универсальной топологией для электрофоретического разделения пробы, с гидродинамическими ловушками и флуорометрические системы детектирования.

2. Экспериментальные результаты разделения и анализа биологических проб (в частности, фрагментов ДНК) на МФЧ, подтверждающие достижение аналитических характеристик, превосходящих соответствующие макроаналоги: уменьшение объема анализируемой пробы (в 2-5 раз) и времени определения в 10 раз) при сопоставимых пределе обнаружения и динамическом диапазоне.

3. Новые эффекты, выявленные при экспериментальных исследованиях взаимодействия электромагнитного излучения с массивом ННК (зависимость отражательной способности массива от формы вершин кристаллов) и взаимодействия молекул флуорофора с ННК (образование пространственных регулярных структур), их интерпретация и применение в устройствах на основе МФУ.

4. Результаты экспериментальных исследований, подтверждающие возможность использования пористых стекол, как основы оптического сенсорного элемента в МФЧ для регистрации конкурентной иммунной реакции на примере обнаружения инсулина в пробе.

5. Результаты экспериментальных измерений рельефа поверхности структур при кислотном травлении и термической обработке стекла, полученные при исследовании технологий изготовления микроструктур в стеклянных материалах, и оценка их влияния на характеристики МФЧ.

6. Результаты экспериментальных исследований по выбору режимов ЛА для формирования микроразмерных каналов заданной

7

геометрии (шириной от 30 до 300 мкм и аспектным отношением <1) в полимерных материалах.

7. Способы управления движением и фиксацией микрочастиц размером от 1 до 6 мкм на МФЧ с микро- и наноструктурами для последующей их визуализации методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и их практическая реализация.

Личный вклад автора

Автор является одним из инициаторов работ по созданию и развитию МФУ и приборов на их основе для анализа биологических проб. Вклад автора состоит в формировании направления исследований, постановке цели и задач, разработке приборов и устройств, проведении экспериментальных, технологических и методических работ, интерпретации полученных результатов. Все экспериментальные результаты, представленные в работе, их обработка и анализ получены непосредственно при участии автора. Диссертация представляет собой обобщение материалов исследований и разработок, выполненных автором лично, с сотрудниками лаборатории, с коллегами из СПб АУ НОЦ НТ РАН (д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлин), ИХС РАН (д. хим. наук Т.В. Антропова), ФТИ РАН, НИУ ИТМО, ЗАО «Светлана-полупроводники», ООО «Лазерный центр». В работах, опубликованных в соавторстве, автору принадлежат результаты, сформулированные в защищаемых положениях и выводах.

Связь с государственными программами и НИР

Тематика исследований поддержана:

Межведомственной научно-технической программой "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего" проекты «Микроаналитические системы: портативные и лабораторные экспресс-анализаторы и биосенсоры на основе чип-реализации одноканального и мультиканального приборов капиллярного электрофореза» (2000-2001 гг.) и «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования» (2002-2006 гг.);

Научными Программами СПб НЦ РАН, проекты «Микрофлюидные чип-анализаторы» (2001 г.), «Аналитические приборы на основе микрофлюидных технологий» (2003 г.); «Микрофлюидные чип-анализаторы с интегрированными

8

наноструктурами (нановискерами)» (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.), «Микрофлюидные аналитические системы с интегрированными наноструктурами (пористыми стеклами)» (совместно с ИХС РАН, 2009г.);

Грантом РФФИ-ГФЕН 03-01-39003_а «Теоретические и экспериментальные исследования явлений переноса и взаимодействия биологических объектов в микрофлюидных устройствах» (2004-2005гг);

Грантом РФФИ 05-02-08090 офиа "Микроаналитические системы с интегрированными нитевидными кристаллическими наноструктурами" (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.);

Программой фундаментальных исследований ОХМН РАН «Создание и совершенствование методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов», проекты «Создание наноструктурных пористых элементов функционального назначения для микроаналитических систем» (совместно с ИХС РАН, 20062008гг.), «Микрофлюидные чипы для анализа биополимеров» (20102011 гг.);

Аналитической ведомственной целевой программой "Развитие научного потенциала высшей школы" проект «Исследования и диагностика клеточных структур: новые методические подходы и инструментальные решения на основе сканирующей зондовой микроскопии и микрочиповых технологий» (НИУ ИТМО, 20092011гг.)

Апробация работы

Основная часть разработок и результатов исследований, изложенных в диссертации, докладывалась и обсуждалась на Всероссийских и международных конференциях и симпозиумах: SPIE Conference BiOS 2002 (San Jose, USA, 2002); 1-ой Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, Россия, 2002 г); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, Россия, 2002 г); 14-th International Symposium Boron, Borides and Related Compounds (St Petersburg, Russia, 09-14 June 2002); XIV и XVI Российских конференциях по использованию синхротронного излучения (Новосибирск, 2002, 2006 гг); 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS-2003 (Moscow, Russia, 2003);

9

Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, Россия, 2003 г); Seventh, Eight, Night Seminars on Porous Glasses-Special Glasses (PGL'2005, 2007, 2009, Szklarska Рогфа, Poland); 2-ой Международной научно-практической конференции «Исследования, разработки и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, Россия, 2006 г); XIV Int. Symposium «Nanostructure: Phys&Techn» (Репино, Россия, 2006 г); European conference on surface science ECOSS 24 (Paris, 2006); Сессии Научного совета РАН по аналитической химии. Школа-конференция «Успехи аналитической химии» (Звенигород, 2006 г); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г, Волгоград, 2011 г); VIII и IX Международных конференциях «Прикладная оптика» (Санкт-Петербург, 2008, 2009 гг); XX Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008 г); Spring Meeting European Materials Research Society (EMRS Spring-2011, Nice, France, 2011); International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT 2011, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011); семинарах no микрочиповым технологиям, организованных в МГУ (Химический факультет) и Институте аналитического приборостроения РАН.

Публикации

Основные результаты работы представлены в 105 научных трудах, в том числе 45 работ опубликовано в рецензируемых отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка литературы из 551 наименования. Текст диссертации изложен на 353 стр., включая 104 рисунка и 9 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, ее практическое значение, сформулированы цель и задачи исследований. Изложены научная новизна работы, сформулированы защищаемые положения, приведены сведения об апробации

диссертации, личном вкладе автора, указаны объем диссертации и другие выходные данные.

Первая глава представляет собой аналитический обзор исследований и разработок приборов на основе МФУ, основных терминов и определений.

Для создания МФУ для аналитических систем необходимо проведение комплексных исследований и работ, включающих: расчет топологии и разработку конструкции устройства; выбор материалов; исследования влияния технологических процессов и условий обработки материала на свойства МФУ; разработку технологий воспроизводимого изготовления устройств; адаптацию методик анализа; создание приборно-аппаратного обеспечения.

Анализ топологий и конструкций МФУ, широко применяемых при электрофоретическом разделении пробы, показал, что существуют общие требования: устройство должно обеспечивать воспроизводимый ввод пробы разных объемов с минимальной дисперсией; возможность использования различных способов дозирования; быть простым и дешевым. Поэтому, актуальной задачей является разработка топологии и создание конструкции устройства, отвечающего этим требованиям.

При изготовлении МФУ используются, в основном, кремний, стекло, полимерные материалы. Наиболее распространенной технологией формирования микро- и наноразмерных структур в стеклянных и кремниевых материалах является метод фотолитографии и жидкостного травления, который хорошо отработан для небольшого ассортимента материалов (высокочистого кремния, стекол Corning, Пирекс и др.). При создании МФУ, ориентированных на отечественные материалы, приоритетными задачами являются выбор материалов, адаптация для них существующих способов и технологий обработки, исследование характеристик и оценка свойств получаемых структур.

Методы лазерного микроизготовления (в частности, лазерной абляции - ДА) в полимерах являются перспективной и доступной техникой формирования микроструктур, поэтому актуальным представляется определение условий и режимов изготовления микроструктур с заданными характеристиками с применением коммерческих установок.

Термическое связывание - самый распространенный способ герметизации стеклянных МФУ. Однако, применение высоких

11

температур приводит к изменению характеристик и свойств поверхности материалов, влияющих на аналитические характеристики микрочипа, что обуславливает необходимость проведения исследований поверхности. Способы герметизации полимерами (в том числе, склеивание) являются достойной заменой термического связывания, а развитие этих способов считается одной из востребованных задач.

Перспективным направлением совершенствования МФУ является интеграция в них новых функциональных наноразмерных элементов и структур. Многие функциональные возможности наноструктур связаны с воздействием на них электромагнитного излучения. Эта область исследований недостаточно хорошо изучена, что определяет актуальность исследований оптических свойств наноструктур, в частности ННК и пористых стекол, и изучения влияния на них лазерного излучения.

Среди технологий изготовления наноразмерных структур выгодно выделяется метод сфокусированного ионного пучка (СИП). Получение наноструктур в стеклянных материалах методом СИП обуславливает необходимость исследования режимов и определения условий формирования структур с заданными характеристиками.

Сочетание микрофлюидных технологий и микроскопии высокого разрешения является новым направлением развития исследовательских приборов для изучения биологических объектов в естественном состоянии, позволяющее получить уникальную информацию о влиянии среды окружения на объект. Поэтому разработка и создание МФУ для микроскопии высокого разрешения в настоящее время является актуальной и востребованной задачей.

Таким образом, в главе 1 сформулированы основные актуальные задачи и проанализированы способы их решения.

Вторая глава состоит из трех разделов и в ней рассмотрены основы создания аналитических систем на МФУ с оптическими методами детектирования. Приводится общая схема анализа биологической пробы на МФУ в виде последовательности операций с образцом пробы, которым соответствуют определенные методы и элементы микро- и нанофлюидных устройств.

В разделе 2.1 проанализированы процессы и явления наиболее существенные при реализации методов капиллярного электрофореза (КЭ) на МФУ, в частности, капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и капиллярного гель-электрофореза (КГЭ). Электроки-

12

нетические процессы определяют разрешение, достигаемое при разделении компонентов пробы. Из множества факторов, определяющих разрешение, наиболее значимы составляющие, обусловленные: продольной диффузией, размерами зон инжекции и детектирования, температурными эффектами. В некоторых случаях, при нелинейной геометрии сепарационного канала, существенной составляющей является дисперсия пробы за счет геометрии.

В этом же разделе представлен сравнительный анализ вариантов (способов и топологий) инжекции пробы в канал МФУ. Для получения высокого разрешения при разделении компонентов пробы необходимо создать условия для ввода небольшого объема пробы (зоны образца) с минимальной дисперсией. Технологичным и автоматизируемым считается электрокинетический ввод. Самой простой топологией инжектора является система в виде креста из двух пересекающихся каналов - подводящего и сепарационного. При заполнении системы буферным раствором и последовательной подаче напряжения на подводящий, а затем - на сепарационный каналы, создается электрокинетический поток, с помощью которого проба вводится в область пересечения каналов. Для предотвращения утечки пробы в сепарационный канал используют запирающие напряжения. Увеличение запирающих напряжений позволяет сформировать узкую зону вводимой пробы, но при этом увеличивается неоднородность вводимой в канал зоны образца. Для уменьшения неоднородности предпринимаются дополнительные меры, в частности применяют процедуру стэкинга сразу после ввода пробы в канал.

а б в На основе анализа наиболее

используемых топологий МФЧ разработана

универсальная конструкция, обеспечивающая инжекцию пробы различных объемов в сепарационный канал двумя способами — электрокинетическим и гидродинамичес-Рисунок 1. Универсальная топология ким (рис. 1). Для сохранения МФЧ и способы инжекции пробы: а - ламинарности потока и по схеме «крест», б - по г-схеме, в - ускорения процесса ввода по П-схеме пробы организованы подво-

13

дящие переходные каналы с шириной, соотносящей к ширине рабочего канала как 7:1. При средней ширине канала 50 мкм и глубине 20 мкм такая топология позволяет обеспечить дозирование разных объемов пробы: по схеме «крест» - объемом 50 пл (рис. 1а), или по Ъ - схеме (по П - схеме) - объемом 800 пл (рис. 16,в).

В разделе 2.2 обсуждаются особенности расчета характеристик флуоресцентного детектора для МФУ. В детекторах, ориентированных на методы КЭ, размер области детектирования определяет разрешающую способность и чувствительность измерений (величину аналитического сигнала). Для улучшения аналитических характеристик и уменьшения фонового сигнала целесообразно строить конфокальные схемы детектирования, позволяющие осуществить принцип пространственного сопряжения возбуждающего и регистрирующего каналов детектора. В микроканалах с ограниченными размерами в условиях многократных отражений от границ раздела сред происходит усиление, как фонового, так и полезного сигнала. Другими источниками фонового сигнала при детектировании флуоресценции являются: а) релеевское рассеяние от оптических элементов, материала и др. структур; б) рамановское рассеяние растворителя; в) люминесценция от оптических элементов; г) автофлуоресценция материалов. Эффективная оптическая фильтрация возбуждающего излучения и флуоресценции позволяет существенно уменьшить фоновый сигнал. Это не касается релеевского и рамановского рассеяния растворителя. Сложность фильтрации рамановского излучения заключается в том, что разным растворителям присущи разные спектры, а создать универсальную систему фильтрации не удается. В отдельных случаях на фоновый сигнал оказывают влияние потоки жидкости в канале МФУ, создающие условия для дополнительного рассеяния.

В разделе 2.3 изложены методы и способы фиксации биологических объектов в МФУ. Показано, что наиболее простыми устройствами, реализуемыми в МФУ, являются механические и гидродинамические ловушки с микро- и наноструктурами, а также планарные электроды для диэлектрофореза (ДЭ).

Принцип работы гидродинамической ловушки, обеспечивающей фиксацию и удерживание микрочастиц в каналах МФЧ для их дальнейшего исследования, заключается в том, что микрочастицы двигаются в потоке транспортной жидкости до тех пор, пока не

14

встречают препятствия в виде сети каналов или ячеек, имеющих размеры меньшие, чем размеры частиц. Препятствия задерживают частицы, а поток жидкости создает давление, фиксирующее частицы у препятствий. Диапазон размеров, предполагаемых для исследований частиц - от 1 до 6 мкм, соответствует размерам некоторых клеток и бактерий. В работе рассмотрены и смоделированы в рамках гипотезы сплошной среды при ламинарном потоке жидкости варианты топологий ловушек для микрочастиц: с прямоугольными препятствиями разной ширины и ячеечные ловушки с наноканалами.

В разделе также рассматриваются особенности фиксации и удерживания микрочастиц методами ДЭ на МФЧ с планарной квадрупольной конфигурацией электродов. Оценка ДЭ силы для квадрупольной ловушки с пленочными электродами дает величину вертикальной силы ~1(Г9 Н (на расстояние 50 мкм при напряжении 20В и электрической проводимости раствора 1 См-м"1). Недостатком такой ловушки является ее маленькая «жесткость», вызванная тем, что в вертикальном направлении ДЭ сила компенсируется только гравитационной силой. Для эффективного манипулирования клетками требуются высокие напряженности электрического поля (~ 10 В/см) и буферные растворы с высокой проводимостью, что приводит к нагреву раствора. Обсуждаются проблемы, связанные с влиянием электрических полей на объекты исследования.

Третья глава диссертации посвящена экспериментальным исследованиям способов формирования микро- и наноразмерных структур в стеклянных и полимерных материалах, процессов герметизации при изготовлении МФЧ.

В разделе 3.1 проводится анализ химических, теплофизических и оптических свойств стекол К8 и Ф1, с целью выявления их пригодности для использования в МФУ, исходя из требований: химической стойкости (к щелочам и слабым кислотам), оптической прозрачности в спектральном диапазоне от 400 до 700 нм, низкой фоновой флуоресценции. В состав К8 входят окислы металлов в достаточно высокой концентрации, что придает этому стеклу хорошую химическую стойкость. Для Ф1 характерно высокое содержание РЬО, что обеспечивает возможность термического связывания стекол К8 и Ф1 при относительно низкой температуре.

В разделе 3.2 рассмотрены методы фотолитографии и кислотного травления стекла и техника СИП при получении микро- и нано-

15

размерных структур в стекле К8. Изучались возможности методов, их особенности и достигаемые при травлении характеристики структур. Для изготовления микроструктур использовался процесс травления стекла в буферном травителе (ЗАО «Светлана-полупроводники», СПб). При изотропном травлении стекла наряду с глубинным травлением имеет место и боковое протравливание, что ограничивает минимальный размер формируемых микроструктур (3-5мкм) и достигаемые аспектные соотношения (<1). При травлении происходит удаление материала и образование новой поверхности с присущими ей структурными особенностями и физико-химическими характеристиками. Для стекла К8 в работе получена экспериментальная зависимость глубины травления 8 (мкм) от времени t (с) для времен от 10 до 600 с: 8 ~ 7.76 • 10~4 • t. На рис. 2 представлены изображения поверхности стекла К8 до и после травления,

полученные на

сканирующем ближне-польном микроскопе (СБОМ) «NTEGRA Solaris» (НТ-МДТ,

Россия) в режиме поперечно-силовой микроскопии (ПСМ). Показано, что после травления стекла образуется поверхность (с шероховатостью Ra<l нм), которая не влияет на ламинарность потока и является оптически прозрачной, что позволяет применить оптические методы детектирования.

Эксперименты по изготовлению наноразмерных каналов в стекле К8 методом СИП проводились на установке CrossBeam Neon (Carl Zeiss, Германия) в НИУ ИТМО. Под действием пучка заряженных частиц на поверхности стекла скапливается нескомпенсированный заряд, влияющий на исходный пучок, что делает невозможным формирование структур с субмикронными размерами. Поэтому образец стекла покрывался слоем проводящего материала (золото, углерод и хром). Исследованы режимы травления стекла К8 при разных ионных токах от 5 до 500 пА и временах травления от 5 до 200 с. Выявлена экспериментальная зависимость формируемого

а б

Рисунок 2. Изображения поверхности стекла К8 до (а) и после (б) кислотного травления, (а) - размер 5x5 мкм, (б) -размер 25x25 мкм

диаметра единичной поры D (нм) от ионного тока i (пА), которая может быть аппроксимирована параболой:

D = 42,945 + 1,422i - 0,0036i2. В МФУ между микроканалами методом СИП была изготовлена сеть наноразмерных каналов (шириной 250 нм, глубиной более 2 мкм) с заходами для удержания исследуемых микрообъектов (рис. 3).

В разделе 3.3 рассмотрены методы и способы герметичного соединения стеклянных пластин. Особое внимание уделяется методу термического связывания (thermal bonding) стекол, а б

Рисунок 3. Изображение канала с заходами (а) и сети наноразмерных каналов (б) гидродинамической ловушки МФЧ

Качество и прочностные характеристики соединения зависят от температуры и скорости нагревания, давления, длительности, от присутствия на поверхностях инородных частиц. Воздействие высоких температур на материал соединяемых образцов приводит к структурным изменениям поверхности материала.

В случае пары К8-Ф1 ожидалось, что соединение будет происходить при температурах 560-580°С, что являлось мотивацией изучения поверхности стекла после его нагрева до температур 400600°С. Результаты измерений топологии поверхности микроканала в стекле К8 до и после воздействия температур (400° С, 500° С и 600° С в течение 5 час) представлены на рис. 4. При температуре 400°С на поверхности стекла проявляются структурные образования. Повышение температуры приводит к увеличению их числа и укрупнению размеров. Имеются все основания предположить, что в диапазоне 400-600°С происходит фазовое разделение компонентов, приводящее к образованию структурных неоднородностей.

Анализ температур плавления компонентов стекла К8 позволяет сделать вывод, что при таких условиях возможно выделение и уход на поверхность оксидов металлов, содержащихся в стекле. Эти исследования позволили отработать технику термического связывания пластин К8 и Ф1 как способ герметизации МФЧ при нормальном давлении. Из-за длительного воздействия высоких температур поверхность стекла становится обезвоженной, что влияет

на величину электроосмотического потока и создает неблагоприятные условия для модификации поверхности. Среди известных способов восстановления гидроксильных групп промывка каналов раствором NaOH.

Рисунок 4. Изображения поверхности канала, вытравленного в стекле К8, до (а) и после (б, в, г) температурного воздействия: б - 400°С, в - 500°С, г - 600°С.

Изображение получено на СБОМ «NTEGRA Solaris», ПСМ, размер кадра 5x5 мкм

Альтернативным методом герметизации является склеивание фотоотверждаемыми полимерами, к достоинствам которого относится слабая чувствительность к присутствию на поверхности инородных частиц и возможность соединять пластины с функциональными покрытиями. Условием герметизации является обеспечение полной полимеризации соединяющего слоя, контроль которой может быть осуществлен прямыми методами тестирования на герметичность или косвенными методами (например, оптической спектроскопии). Динамика полимеризации может отслеживаться по трансформации полос поглощения и люминесценции полимера, поэтому в работе исследовалась возможность использования методов оптической спектроскопии для контроля полимеризации МФЧ. Изучались пластины К8, соединенные слоем (толщиной от 10 до 80 мкм) фотоотверждаемого клея Rite Lock UV02 (Chemence Ltd, UK). На рис. 5 приведена зависимость изменения флуоресценции слоя, свидетельствующая о том, что процесс отверждения слоя к 20-ой минуте практически завершился.

Раздел 3.4 посвящен исследованию методов JIA для получения микроразмерных структур с воспроизводимыми характеристиками в полимерных материалах. Применялся метод прямой обработки, при котором осуществляется перемещение по поверхности материала

сфокусированного лазерного луча. Для оценки размеров каналов при ЛА, использована модель, где принимается, что световой поток с энергией Еы, превышающий пороговое значение Е,н поглощения бесконечно тонкого слоя полимера, приводит к его удалению.

Если луч лазера перемещается дискретно с шагом, равным размеру светового пятна, то глубина формируемого канала И зависит от падающей мощности Ф,„ как:

12 к

7pd\ v

где к - коэффициент пропорциональности, обусловленный энергиями связей в макромолекулах полимера, а - коэффициент поглощения полимера, р — плотность материала, v - скорость перемещения луча, d-размер светового пятна.

Были изучены режимы, позволяющие изготовить в полиметилметакрилате (ПММА) марки ТОСП каналы с требуемыми характеристиками на установке фирмы

TROTEC «Speedy II» с лазером Synrad (25 Вт, длина волны 10.6 мкм). Полученные результаты подтверждают адекватность выбранной в данной работе модели. Если на

Время, мин

Рисунок 5. Изменение флуоресценции полимерного слоя на длине волны 320 нм (при возбуждении на 290 нм)

начальном участке (3000 Гц) зависимости (рис. 6) формируется широкий и неглубокий канал с аспектным соотношением (глубина/ширина) 1:5, то при высоких частотах (10000 Гц) отношение становится равным 1:2, т.е. формируется глубокий канал, а ширина увеличивается только на 40%. Варьируя частоту импульсов, можно менять геометрические характеристики канала, заметно увеличивая глубину и незначительно изменяя ширину, что является оригинальным способом регулирования геометрии канала. При герметизации полимерных материалов спеканием на прочность получаемых соединений влияет обработка поверхности, температура, время спекания и удельное давление. Для МФЧ из

ПММА приемлемое отклонение глубины канала (с вариацией 15%) достигается при спекании каналов с глубиной свыше 200 мкм.

Другим перспективным материалом для МФУ является поликарбонат (ПК), обладающий биологической устойчивостью, оптической прозрачностью и более высокой, чем у ПММА

температурой стеклования (150°С).

Изготовление микроструктур в пластинах ПК фирмы BARLO

(Германия) осуществлялось на технологической установке «ООО

Мултитех» (СПб, Россия) с длиной волны лазера 1.06 мкм. Приемлемые для МФУ каналы с аспектным соотношением <1 были сформированы при

энергии излучения на импульс 151 мкДж. При изготовлении каналов с ширинои до 30 мкм наблюдался значительный разброс по глубине (-50%), для широких каналов (свыше 40 мкм) разброс значений по глубине составил менее 10%.

Экспериментальные исследования ЛА полиимидных пленок различного состава и с добавками фуллерена С60 показали, что наличие фуллерена приводит к увеличению порогового значения Eth-

Четвертая глава состоит из трех разделов. В первом разделе рассматриваются конструкции МФУ для анализа биологических проб методами электрофореза и аналитические системы с флуоресцентным детектированием компонентов пробы. Отдельный раздел посвящен микрочипам для молекулярной диагностики проб на основе методов ПЦР и флуоресцентного детектирования. Особое внимание уделено конструкциям МФЧ для исследований биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения.

В разделе 4.1 рассматриваются МФЧ из стеклянных и полимерных материалов созданные для электрофоретических методов исследований биологических проб (рис. 7а,б,в). Для

20

2000 4000 6000 8000 10000

частота, Гц

Рисунок 6. Зависимость глубины (1) и ширины (2) канала от частоты импульсов лазера при мощности излучения 1.25 Вт, скорости перемещения луча 0.4% (от максимальной)

проведения анализа на этих МФЧ были разработаны и изготовлены прототипы аналитических систем (рис. 7г), в состав которых входили оптико-электронный блок с детектором лазер-индуцированной флуоресценции (1) и программно-управляемый прецизионный блок высокого напряжения (2). а б в_ г

ИННИН (¡ШЗЗИРвЯ ИИИ^И!

Рисунок 7. Микрофлюидные чипы из стекла (а, б) и ПММА (в), прототип аналитической системы (г)

Создание аналитических систем потребовало разработки оптических схем детектирования, в которых были реализованы принципы, рассмотренные в разделе 2.2.

В разделе 4.2 приводятся результаты работ по созданию прототипа прибора для постановки ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на МФЧ. В состав прибора входят: устройства термоциклирования, четырехканальный флуориметрический детектор, микропроцессорная система и блок питания, объединенные в единую конструкцию (рис. 8а). Прототип прибора ПЦР-РВ использовался с МФЧ, имеющими две реакционные камеры и отличающиеся объемами, топологией и размерами (рис. 8 б и в).

Рисунок 8. Прототип прибора для ПЦР РВ на микрочиповой платформе (а), МФЧ для ПЦР на 10 мкл (б) и на 2 мкл (в)

Раздел 4.3 посвящен обсуждению результатов работ по созданию экспериментальной установки для исследований микрообъектов на основе оптического инвертированного микроскопа и МФУ.

Особенностью методов микроскопии высокого разрешения является необходимость фиксации исследуемого объекта на время измерений. Для биологических объектов (например, клеток) метод фиксации должен обеспечивать сохранность объекта и не влиять на его свойства. Другим, существенным требованием, является возможность выделения из группы одинаковых объектов или частиц, движущихся в ламинарном потоке, объекта анализа. Для исследований возможности фиксации и удерживания микрочастиц с размерами от 1 до 6 мкм были изготовлены МФЧ с гидродинамическими ловушками (см. рис. 36), с U - образной ловушкой (с нанопротоками) и МФЧ для ДЭ. Проверка работоспособности, изучение режимов и условий фиксации частиц методом ДЭ осуществлялись на созданной экспериментальной установке на основе оптического микроскопа Axio Observer Dim Carl Zeiss (Германия).

В пятой главе приведены результаты экспериментальных исследований наноразмерных структур, перспективных для применения в МФУ: полупроводниковых кристаллических наноструктур и пористых стекол.

В разделе 5.1 рассматривается возможность использования ННК в МФЧ в качестве оптического элемента биосенсора, что являлось мотивацией изучения спектральных зависимостей отражательной способности массива ННК и влияния на них лазерного излучения. Объектами исследований были образцы легированных ННК из GaAs, выращенные методом молекулярно-пучковой эпитаксии (МПЭ) на легированных подложках GaAs (111)В, отличающиеся структурными особенностями (высотой, плотностью, формой острия). GaAs буферный слой и ННК GaAs в процессе МПЭ легировались кремнием с концентрацией электронов ~1018 см"3 (буферный слой) и 5*1017 см"3 (ННК) для создания проводимости п-типа. Диаметр нанокристаллов варьировался от 50 до 80 нм. При измерении отражательной способности образцов ННК были получены две характерные группы спектральных зависимостей. В первой группе для образцов с каплевидной вершиной наблюдалось уменьшение отражения с увеличением высоты ННК. Из полученных данных также следует, что: а) легирование подложки приводит к

22

увеличению отражательной способности по сравнению с отражением исходного материала; б) спектральные зависимости имеют сходный характер с зависимостью отражения подложки; в) увеличение высоты ННК приводит к трансформациям пиков отражения в областях 2.9-3.1 эВ и 5.2 эВ. Во второй группе для образцов с остроигольчатой формой вершины установлено монотонное уменьшение отражательной способности. Можно предположить, что не одинаковый характер зависимостей отражательной способности определяется разными процессами взаимодействия электромагнитного излучения с остроигольчатой и каплевидной формой вершин. Кроме того, вероятно, что в процессе поглощения фотонов ННК ОаАв происходят запрещённые переходы электронов из валентной зоны в зону проводимости. В результате исследований образцов методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) было выявлено, что лазерное излучение на длине волн 488 нм и 633 нм с плотностью мощности свыше 100 мВт/мм2 приводит к изменению структуры ННК даже при малом времени воздействия (несколько секунд). Обнаруженный эффект носит спектрально-селективный характер: при воздействии на ННК излучением с мощностью того же порядка на длинах волн 476 нм и 543нм видимого изменения структур не наблюдалось. Изображения площадок поверхности, полученные методом сканирующей электронной микроскопии, свидетельствуют, что при воздействии лазерного излучения на ННК происходит «слипание» верхушек наноструктур и частичное их разрушение, что увеличивает отражательную способность образца (рис. 9). Следует отметить, что этот эффект может использоваться при формировании дорожек и площадок в массиве ННК с отличающимися свойствами.

При изучении взаимодействия ННК с жидкими средами, в частности, с раствором флуоресцеина было обнаружено образование регулярных пространственных (дендридных) флуоресцирующих структур. В первом приближении, на качественном уровне предложено объяснение эффекта формирования регулярных структур в предположении доминирования кулоновского взаимодействия молекул флуоресцеина с ННК над другими эффектами (поверхностное натяжение и т.п.). Форма и размеры образующихся структур сложным образом связаны с характеристиками массива ННК и среды.

Наблюдаемый эффект в перспективе может быть использован для создания сенсорного устройства, в котором на основании анализа изображений можно судить о концентрации искомого аналита.

Рисунок 9. Область воздействия лазерного излучения (размер - 47x47 мкм) на ННК (а) и изменение отражательной способности образца массива ННК (высотой - 1300 нм) при воздействии лазерного излучения (б)

Раздел 5.2 посвящен изучению возможности применения пористых стекол (ПС) в качестве функциональных элементов МФУ, в частности - оптических сенсорных элементов, что обусловило необходимость исследования спектральных свойств ПС. Образцы двухфазных (8В, NFF-I и NK-I) и полученных из них ПС (PG2, PG9 и PG12, соответственно), а также двухфазного стекла ДВ-1Ш и полученных из него ПС MIP и MAP были изготовлены в ИХС РАН (д. хим. наук Антропова Т.В.). Для двухфазных и ПС измерены спектральные зависимости светопропускания и отражения, на основании которых получены зависимости коэффициентов поглощения и дисперсии показателей преломления. Эти результаты использовались для оценки пористости и размера пор ПС при применении моделей эффективной среды (например, Бруггемана). Оценки пористости образцов составили для PG2 - 0.30, PG9 - 0.29, что соответствует экспериментальным результатам порометрии и электронной микроскопии (для PG2 и PG9) г) -30%.

В этом же разделе рассмотрен вариант создания сенсора, основанного на постановке конкурентной иммунной реакции на твердофазной поверхности ПС. Первоначально на поверхности стекла осуществлялась иммобилизация иммуноглобулина IgG (антител), затем - его связывание с меченым флуоресцеин-изотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate - FITC) инсулином lns-

а

б

Время, с

FITC, приводящее к образованию комплекса IgG - (Ins - FITC). По изменению сигнала флуоресценции относительно первоначального уровня можно судить о количестве новых образовавшихся комплексов (.IgG-Ins). Создание в ПС чувствительного слоя связано с выбором способов активации поверхности стекла, модификации и иммобилизации чувствительного вещества, которые влияют на оптические и структурные характеристики образцов.

Изучение особенностей иммобилизации биологических веществ проводилось на образцах, изготовленных из двухфазного стекла 8В. На разных стадиях иммобилизации и после проведения иммунной реакции образцы исследовались методами флуоресцентной спектроскопии, КЛСМ, СБОМ и атомно-силовой микроскопии. Рис. 10 иллюстрирует изменение спектра флуоресценции ПС после проведения иммунной реакции. Показано, что оптимизация режимов иммобилизации позволяет увеличить чувствительность сенсора. В результате иммобилизации инсулина, на поверхности образца в режиме ПСМ визуализированы частицы и агломераты частиц со средним радиусом 0,6 мкм.

После проведения

иммунной реакции на поверхности образца в режиме отраженного света проявляется оптически неоднородная структура, которая может быть обусловлена появлением пленки с более крупными неоднородностями, чем поры самого стекла. Это подтверждается спектральными зависимостями светопропускания образцов, а именно тем фактом, что после проведения иммунной реакции светопропускание образцов возрастает. Такой эффект позволяет регистрировать иммунную реакцию без применения специальных флуоресцентных меток.

В шестой главе приведены результаты анализа биологических проб на МФЧ с использованием созданных аналитических приборов.

25

Рисунок 10. Спектры флуоресценции ПС 8В-МАП до (1) и после (2) проведения конкурентной иммунной реакции с инсулином (С=1СГб М)

RFU 2043

iV^vw^V^Y

60

180

300

Раздел 6.1 посвящен реализации метода КЭ биологических проб на МФЧ. Особое внимание уделено развитию методов экспресс-анализа полинуклеотидов на МФЧ. На рис. 11 приведены электрофореграммы разделения образца Amlx 100 (концентрация С =Ю"10М) содержащего фрагменты 10, 20, 30, 40, 50, 75 и 100 оснований (ЗАО "Синтол", г. Москва) на МФЧ и приборе КЭ НАНОФОР 02 (ИАП РАН).

Преимуществами использования МФУ перед традиционным методом КЭ являются, в частности: а) высокая скорость анализа (—10 раз); б) меньший объем пробы (по крайней мере в 2 раза); в) меньший расход реагентов и других материалов (в несколько раз).

Показано, что качество электрофоретического анализа олиго-

нуклеотидов, фрагмен-

Ó 400 800 1200 1600 2ооо с.к TOB рееСТрИКЦИИ ДНК,

продуктов ПЦР,

Рисунок 11. Разделения фрагментов фрагментов секвенса

образцов Amixl 00 (а, б) полученные на МФЧ ДНК на МФЧ в (а) и приборе КЭ НАНОФОР 02 (б). существенной степени

зависит от выбора сепарационной среды — полимерной матрицы. В разделе также приведены результаты работ по подбору сепарационной матрицы (раствора полидиметилакриламида -ПДМАА с различными молекулярной массой и концентрацией полимера) для разделения смеси маркеров молекулярного веса ДНК на стеклянном МФЧ. Исследования показали, что эффективное разделение достигается при концентрациях полимера 15-20% (Mw ~ 30000) и 10% (Mw ~ 66000) (рис. 12).

Известно, что иммунный анализ является методом, основанным на высокочувствительном и специфическом взаимодействии антигенов (АГ) и антител (AT). Иммунологические методы

26

используются для количественного определения белков и малых молекул в медицинской диагностике, фармацевтических и

Одной из задач

медицинского приборостроения является создание систем для высокочувствительного экспресс-определения инсулина в биопробах. В работе была продемонстрирована возможность электрофоре-тического разделения на МФЧ иммунного комплекса и свободного АГ (инсулина), что позволяет: а) упростить количественное определение АГ, б) исключить проблемы, связанные с иммобилизацией АГ и многочисленные стадии промывки, в) уменьшить время инкубации. Полученные результаты подтверждают, что сочетание иммунных методов с микрофлюидными технологиями дают возможность создавать новые аналитические системы для высокочувствительного экспрессного определения биологических веществ. Например, методом электрофореза аффинных (иммунных) проб на МФЧ было определено присутствие инсулина за время менее 160 с.

Соединения с функциональными аминными группами (в том числе сульфаниламиды) находят широкое применение в медицинской практике как препараты с разнообразной фармакологической активностью. Так как такие лекарственные соединения способны оказывать негативное воздействие на организм человека, то в лабораторную практику введен контроль над их содержанием в организме, в фармакологических препаратах и в продуктах питания. Была продемонстрирована возможность определения сульфадиазина методом электрофореза на МФЧ. Флуоресцеин - меченые производные сульфадиазина (трейсеры) были синтезированы на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (д.х.н. Еремин С.А.). Воспроизводимые результаты количественного анализа, при которых информативный сигнал пропорционален концентрации

биологических исследованиях.

220 240 260 280 300 320 340 360 300 400 420

Рисунок 12. Разделение компонентов маркера молекулярного веса (150, 200, 300, 350, 400,450, 500 п.о.)

сульфадиазина, получены для концентраций от 0,30 до 1,50 мкг/мл. При этом коэффициент вариации не превышал 10%.

Количественный анализ аминокислот (АК) имеет большое значение при исследованиях в медицине, фармацевтике и пищевой промышленности. Была продемонстрирована возможность разделения смесей АК. В экспериментах семь аминокислот (аспарагиновая кислота - Asp, аланин - Ala, валин - Val, лейцин -Leu, серин - Ser, аргинин - Arg и тирозин - Туг) метили флуоресцентной меткой - FITC. Использовали схему ввода пробы «крест». Методом КЗЭ было получено разделение модельной смеси трех АК (Asp, Ala, Arg), имеющих наиболее различающиеся времена выхода пиков (время разделения - 180 с). Результаты разделения АК, имеющих близкие времена выхода пиков (Asp - Ala - Val), показали необходимость увеличения длины сепарационного канала (на 20%) по сравнению с базовой (38 мм) для улучшения качества разделения.

В разделе 6.2 приведены результаты исследований связанных с постановкой жидкостной ПЦР в реальном времени на МФЧ из стеклянных материалов. Показано, что состав стекол (К8 и Ф1), а также методы герметизации (термического связывания, склеивания фотоотверждаемыми полимерами или полидиметилсилоксаном) после проведения обработки внутренней поверхности не оказывают существенного влияния на эффективность ПЦР. Исследованы способы очистки и регенерации стеклянного МФЧ после проведения ПЦР. Для МФЧ из стекла К8, герметизированных методом термического связывания, получены кинетические зависимости для концентраций ДНК-мишени (103 - 107 копий/мкл).

В седьмой главе приводятся результаты экспериментальных исследований на МФЧ с гидродинамическими наноразмерными ловушками и с ДЭ системой фиксации и удерживания частиц для методов оптической микроскопии, в том числе KJICM. Исследования по удержанию полимерных сферических частиц диаметром бмкм (Sigma-Aldrich) меченых флуорофором, как имитаторов биологических объектов, в МФЧ с диэлектрофоретической системой фиксации осуществлялись на частоте ~100 кГц, при напряжении на электродах от 1 до 10 В в 0,5 % растворе КОН. При приложении электрического поля в рабочей области наблюдался захват отдельных частиц (рис. 13а) или групп, состоящих из нескольких частиц (рис. 136), обусловленный наличием минимума потенциальной энергии на оси симметрии электродов.

28

Рисунок 13. Изображения частиц в камере МФЧ для ДЭ: а - фиксация отдельной частицы, б - группы частиц

Результаты экспериментов подтверждают возможность управления движением и фиксацией микрочастиц методом ДЭ на МФЧ с точностью, достаточной для методов оптической микроскопии (не хуже 0.2 мкм).

Изучение функционирования МФЧ с гидродинамическими ловушками проводилось на суспензии полимерных микрочастиц диаметром 3 мкм и 6 мкм меченых FITC в боратном буферном растворе с pH = 9.18. Регистрация потоков жидкости и микрочастиц проводилась на KJICM Leica TSC SL при длине волны возбуждения 488 нм в диапазоне детектирования 510-540 нм.

Результаты, полученные при фиксации частицы в ловушке из сети наноразмерных каналов с заходами (изображение каналов см. на рис. За) представлены на рис. 14. Частица стабильно удерживалась даже при изменении скорости потока жидкости в несколько раз. В разделе также приведены результаты исследований МФЧ с гидродинамической ловушкой с пониженным гидравлическим сопротивлением.

Проведенные исследования позволили осуществить широкую апробацию МФЧ и макетов созданных приборов на различных биологических пробах и имитаторах биологических объектов (полимерных частицах). Продемонстрирована возможность управления движением и фиксацией частиц для последующего их изучения методами оптической микроскопии высокого разрешения, что позволяет расширить круг задач, реализуемых на МФУ.

Рисунок 14. Изображение гидродинамической ловушки с сетью каналов и удерживаемой флуоресцирующей частицы Змкм. Изображение получено на КЛСМ Leica TSC SL

В заключении представлены основные результаты работы и выводы.

Основные результаты и выводы

1. На основе исследований факторов различной природы (конструктивных, геометрических, физико-химических), влияющих на разрешающую способность при электрофоретическом разделении многокомпонентной пробы на МФУ, выявлено, что наибольшую значимость имеют продольная диффузия компонентов, размеры областей детектирования и инжекции пробы, отклонение геометрии канала от линейной, а также свойства поверхности канала. Таким образом, сформулированы методические основы оптимизации конструкции и режимов электрофоретического разделения биологических проб.

2. Разработана универсальная топология МФЧ для электрофоретического разделения пробы, основанная на модернизации традиционных технических решений, позволяющая инжектировать различные объемы проб электрокинетическим и гидравлическим способами.

3. Экспериментальные исследования свойств и анализ физико-химических характеристик стекол К8 и Ф1 позволили выявить наличие у этих материалов химической стойкости, оптической прозрачности, низкого уровня флуоресценции при возбуждении в спектральном диапазоне 400-700 нм, возможности термического связывания при температурах 560-580°С, что обосновывает их применимость при изготовлении МФУ, предназначенных для методов оптической микроскопии и флуорометрии.

4. Адаптированы и апробированы технологии формирования микро- и наноразмерных структур с воспроизводимыми геометрическими характеристиками для стекла К8 методом фотолитографии и кислотного травления, а также методом сфокусированного ионного пучка, что позволило определить режимы формирования структур, выявить особенности и области применимости методов.

5. На основе теоретического изучения и экспериментальных исследований физико-химических процессов, происходящих при температурной обработке стекла К8, разработаны и проверены технологии герметизации МФЧ: а) способом термического

связывания с защитной пластиной из стекла Ф1; б) соединением фотоотвержаемым клеем с контролем качества полимеризации спектрофлуорометрическим методом, которые были использованы при создании конструкций МФУ для электрофоретических методов анализа, для ПЦР-РВ и для фиксации и удерживания микрочастиц.

6. Метод лазерной абляции полимеров применен для формирования микроразмерных каналов и реакционных камер для МФЧ. При этом экспериментально определены режимы изготовления каналов в ПММА на длине волны 10,6 мкм и в ПК на длине волны 1,06 мкм, что дало возможность изготовить прототипы МФЧ (для электрофоретического разделения пробы й для ПЦР).

7. На основе экспериментальных исследований оптических и структурных характеристик образцов массива ННК из GaAs методами оптической спектроскопии, KJICM и электронной микроскопии подтверждено, что отражательные свойства массива определяются формой вершин ННК, и впервые выявлено, что воздействие лазерного излучения с плотностью мощности свыше 100 мВт/мм2 на длинах волн 488 и 633 нм приводит к «слипанию» и разрушению вершин ННК.

8. Экспериментальные данные, полученные при изучении оптических свойств и структурных характеристик пористых стекол методами оптической спектроскопии и микроскопии высокого разрешения, позволили обосновать перспективность использования стекла 8-В MAP в качестве оптического чувствительного элемента для регистрации конкурентной иммунной реакции.

9. Созданы новые конструкции МФЧ с интегрированными микро-и наноразмерными функциональными элементами для разделения и фиксации частиц (с точностью не хуже 0.2 мкм) на заданном участке микрочипа с целью их дальнейших исследований методами микроскопии высокого разрешения.

10. Созданы действующие макеты аналитических систем на основе МФУ: для электрофоретического разделения пробы и для реализации ПЦР в реальном времени, позволяющие при сопоставимых пределе обнаружения и динамическом диапазоне по сравнению с макроаналогами значительно (до 10 раз) сократить время определения при анализе нуклеиновых кислот, уменьшить объем реагентов и пробы (более, чем в 2 раза).

Основные публикации по теме диссертации

1. Евстрапов А. А., Курочкин В.Е. Оценка поглощения тонкослойных чувствительных элементов ограниченного размера в отраженном свете // Оптический журнал. 1995. №5. С.50-53.

2. Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Буляница A.JI. и др. Микрофлюидная аналитическая система с детектором лазер-индуцированной флуоресценции // Аллергология и иммунология. 2000. Т. 1. № 3. С. 101-102.

3. Беленький Б.Г., Евстрапов А. А., Комяк Н.И. и др. Микрофлюидные аналитические системы. Часть I // Научное приборостроение. 2000. Т. 10. № 2. С. 57-64.

4. Беленький Б.Г., Евстрапов А.А., Комяк Н.И. и др. Микрофлюидные аналитические системы. Часть II // Научное приборостроение. 2000. Т. 10. № 3. С. 3-16.

5. Antropova T.V., Drozdova I.A., Yastrebov S.G., Evstrapov A.A. Porous glass: inhomogeneities and light transmission // Optica Applicata. 2000. Vol. XXX. N 4. P. 553-567.

6. Беленький Б.Г., Курочкин B.E., Евстрапов A.A. и др. Микрофлюидные аналитические системы на основе электрофоретических методов анализа // Новости науки и техники. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001. № 1. С. 190-193.

7. Беленький Б.Г., Козулин Р.А., Евстрапов А.А. Влияние отраженного капилляром излучения лазера на чувствительность флуориметра капиллярного электрофореза // Научное приборостроение. 2001. Т. 11. № 2. С. 21-25.

8. Евстрапов А.А., Антропова Т.В., Муравьев Д.О., Ястребов С.Г. Изучение оптических свойств двухфазных и микропористых стекол // Оптический журнал. 2001. Т. 68. № 1. С. 34-40.

9. Evstrapov А.А., Antropova T.V., Drozdova I.A., Yastrebov S.G. Optical properties and structure of porous glasses // Optica Applicata. 2003. Vol. 33. N 1. P. 45-50.

10. Евстрапов A.A., Буляница A.JI., Рудницкая Г.Е. и др. Особенности применения алгоритмов цифровой фильтрации электрофореграмм при анализе веществ на микрочипе // Научное приборостроение. 2003. Т. 13. № 2. С. 57-63.

11. Буляница A.JL, Евстрапов А.А., Рудницкая Г.Е. Метод моментов при расчете параметров каналов в микроразмерных системах //

32

Научное приборостроение. 2003. Т. 13. № 4. С. 28-40.

12. Евстрапов А.А., Курочкин В.Е. Микрофлюидные аналитические системы // Журнал аналитической химии. 2003. Т. 58. № 7. С. 743-744.

13. Евстрапов А.А., Буляница A.JI., Рудницкая Г.Е. и др. Микрофлюидные аналитические системы на основе методов капиллярного электрофореза и микрочиповых технологий // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. Т. 7. № 9. С. 205211.

14. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Курочкин В.Е. и др. Экспресс-анализ олигонуклеотидов на планарном микрофлюидном чипе // Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. № 6. С. 587-594.

15. Евстрапов А.А. Физические методы управления движением и разделением микрочастиц в жидких средах. Часть 1. Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет // Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 1. С. 8-21.

16. Поздняков А.О., Евстрапов А.А., Лишевич И.В. Микрофлюидные устройства с точки зрения технологии полимерных композитов // Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 67-71.

17. Евстрапов А.А., Рудницкая Г.Е., Петухова Н.А. Микрочиповые технологии в биологических исследованиях. Экспресс-анализ ДНК: сепарационные матрицы для разделения ДНК // Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 27-40.

18. Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Горный С.Г., Юдин К.В. Микрофлюидные чипы из полиметилметакрилата: метод лазерной абляции и термического связывания // Научное приборостроение, 2005. Т. 15. №2. С. 72-81.

19. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Лукашенко Т.А. и др. Микрофлюидные аналитические системы на основе методов электрофореза и микрочиповых технологий: управление микропотоками вещества с помощью тепловых полей, получение микрофлюидных чипов с интегрированными элементами // Физиология и патология иммунной системы. 2005. № 8. С. 52-57.

20. Евстрапов А.А., Поздняков А.О., Горный С.Г., Юдин К.В. Формирование края микроразмерного канала в полиимидах методом лазерной абляции // Письма в ЖТФ. 2005. Т. 31. Вып. 13. С. 10-17.

21. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Antropova T.V. Spectral characteristics and structure of porous glasses // Optica Applicata. 2005. Vol. XXXV. N 4. P. 32-39.

22. Неучева O.A., Евстрапов A.A., Самсоненко Ю.Б., Цырлин Г.Э. Взаимодействие оптического излучения с массивом нитевидных кристаллов GaAs // Письма в ЖТФ. 2007. Т. 33. Вып. 21. С. 56-62.

23. Тупик А.Н., Евстрапов A.A. Исследование движения потоков вещества в микрофлюидных чипах // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2007. № 44. С. 165-169.

24. Буляница А.Л., Рудницкая Г.Е., Евстрапов A.A. Информативные сигналы при электрофорезе на микрочипе: математические модели и оценки // Научное приборостроение. 2007. Т. 17. № 3. С. 31-39.

25. Евстрапов A.A., Есикова H.A., Антропова Т.В. Исследование пористых стекол методами оптической спектроскопии // Оптический журнал. 2008. Т. 75. № 4. С. 71 -77.

26. Розанов В.В., Евстрапов A.A. Высокоразрешающие методы микроскопии при анализе структуры неоднородностей на поверхности органических пленок // Письма в ЖТФ. 2008. Т. 34. Вып. 15. С. 43-48.

27. Рудницкая Г.Е., Евстрапов A.A. Микрочиповые устройства для полимеразной цепной реакции. Часть 1: Основные принципы ПЦР. Конструкция и материалы микрочипов // Научное приборостроение. 2008. Т. 18. №3. с. 22-40.

28. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Rudnitskaja G.E., Antropova T.V. Application of porous glasses in microfluidic devices // Optica Applicata. 2008. Vol. XXXVIII. N 1. P. 31-38.

29. Евстрапов A.A., Есикова H.A., Клоков M.B. и др. Исследование пористых стекол методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и оптической микроскопии ближнего поля // Научное приборостроение. 2009. Т. 19. № 2. С. 52-65.

30. Евстрапов A.A., Тупик А.Н. Обработка поверхности стеклянных микрочипов после анализа биологических проб // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2009. № 4. С. 42-47.

31. Евстрапов A.A., Лукашенко Т.А., Тупик А.Н. Применение фотоотверждаемых оптических клеев для герметизации аналитических микрочипов // Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 29-38.

32. Евстрапов A.A., Есикова H.A., Рудницкая Г.Е. и др., Разработка оптического сенсорного элемента для микрофлюидных чипов на основе натриево-боросиликатного пористого стекла // Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 52-58.

33. Evstrapov A., Esikova N., Rudnitskaya G., Antropova T. Porous Glasses as a Substrate For Sensor Elements // Optica Applicata. 2010. Vol. XL. N 2. P. 333-340.

34. Евстрапов A.A., Мухин И.С, Кухтевич И.В., Букатин A.C. Применение ионной литографии для формирования наноразмерных каналов микрофлюидных чипов в стеклянных подложках // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2010. Т. 68. № 4. С. 59-63.

35. Кухтевич И.В., Евстрапов A.A. Статистический анализ структуры нанопористых стекол по изображениям, полученным методом конфокальной сканирующей лазерной микроскопии // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2010. Т. 69. №5. С. 101-105.

36. Кухтевич И.В., Букатин A.C., Евстрапов A.A., Мухин И.С. Создание аналитической установки для биологических исследований на основе оптического микроскопа Axio Observer Dl и микрочиповых технологий. Часть 1 // Научное приборостроение.

2010. Т. 20. № 3. С. 3-8.

37. Курочкин В.Е., Евстрапов A.A., Буляница A.JL, и др. Разработка микрочиповых устройств для проведения ПЦР в геле // Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 4. С. 127-131.

38. Antropova Т., Drozdova I., Kukhtevich I., Evstrapov A. et al. Application of high resolution microscopy and optical spectroscopy for study of phase separation in phosphorus- and fluorine-containing sodium borosilicate glasses // Optica applicata. 2010. Vol. XL. N 2. P. 293-304.

39. Евстрапов A.A., Мухин И.С., Кухтевич И.В. , Букатин A.C. Метод сфокусированного ионного пучка при формировании наноразмерных структур в микрофлюидных чипах // Письма в ЖТФ.

2011. Т. 37. Вып. 20. С. 32-40.

40. Евстрапов A.A. Наноразмерные структуры в микрофлюидных устройствах // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. №3. С. 3-16.

41. Кухтевич И.В., Букатин A.C., Мухин И.С., Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы с интегрированными наноразмерными структурами для фиксации биологических объектов // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. № 3. С. 17-22.

42. Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы для биологических и медицинских исследований // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2011. Т. LV. № 2. С. 99-110.

43. Кухтевич И.В., Букатин A.C., Мухин И.С., Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов

35

методами микроскопии высокого разрешения // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2012. Т. 77. № 1. С. 111-115.

44.Evstrapov A.A., Mukhin I.S., Bukatin A.S., Kukhtevich I.V. Ion and electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in microfluidic chips // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2012. N 282. P. 145-148.

45.Евстрапов A.A., Лукашенко T.A., Рудницкая Г.Е. и др. Микрофлюидные чипы из стеклянных материалов // Научное приборостроение. 2012. Т. 22. № 2. С. 27-43.

Подписано в печать 12.07.12 Формат 60х84'/іб Цифровая Печ. л. 2.0 Тираж 150 Заказ 04/07 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Обозначения и сокращения Введение

Глава 1 Аналитические системы на основе микрофлюидных устройств

1.1 Микроаналитические системы и микрофлюидные устройства

1.2 Микрофлюидная платформа. Классификация, состав, основные элементы микрофлюидных устройств

1.3 Моделирование в микрофлюидике

1.4 Материалы и методы изготовление микрофлюидных устройств

1.4.1 Материалы для микрофлюидных устройств

1.4.2 Методы и способы изготовления микрофлюидных устройств

1.5 Наноразмерные структуры в микрофлюидных устройствах

1.6 Разделение компонентов пробы в микрофлюидных устройствах ^

1.6.1 Выделение и разделение частиц в микрофлюидных устройствах

1.6.2 Микрофлюидные устройства для разделения и анализа нуклеиновых кислот и белков

1.7 Микрочиповые устройства для полимеразной цепной реакции

1.8 Детектирование в микрофлюидных устройствах

1.9 Коммерциализация микрофлюидных устройств и приборов для исследований биологических проб ^

Выводы к Главе 1 ^

Глава 2 Теоретические основы создания аналитических систем на базе микрофлюидной платформы и оптических методов детектирования

2.1 Микрофлюидные устройства для электрофоретического анализа

2.1.1 Электроосмотический поток и электрофоретическое разделение пробы в микрофлюидном устройстве

2.1.2 Инжекция пробы в микроканал

2.2 Оптическое детектирование в микрофлюидных устройствах ЮЗ

2.2.1 Детектирование флуоресценции

2.2.2 Особенности флуоресцентного детектирования в МФЧ Ю

2.3 Методы и способы фиксации биологических объектов для микроскопии высокого разрешения

2.3.1 Способы фиксации и удержания биологических объектов в микрофлюидных устройствах

2.3.2 Фиксация и удерживание микрообъектов в гидродинамических (механических) ловушках

2.3.3 Особенности диэлектрофоретического метода фиксации и удерживания биологических объектов

Выводы к Главе

Глава 3 Экспериментальные исследования. Методы и способы изготовления микрофлюидных чипов

3.1 Химические, теплофизические и оптические свойства стеклянных материалов для МФЧ

3.2 Формирование микро- и наноразмерных структур в стеклянных подложках

3.2.1 Формирование микроструктур методами фотолитографии и кислотное травления стекла

3.2.2 Формирование наноразмерных каналов и пор в стеклянной подложке техникой сфокусированного ионного пучка ^^

3.3 Герметизация микрофлюидных чипов ^^

3.3.1 Герметизация стеклянных микрочипов методом термического связывания

3.3.2 Герметизация микрочипов полимерными материалами

3.4 Формирование микроструктур в полимерных материалах

3.4.1 Метод лазерной абляции при формировании микроразмерных структур

3.4.2 Формирование микроразмерных структур в полиметилметакрилате

3.4.3 Герметизация микрочипов из полиметилметакрилата

3.4.5 Формирование каналов в полиимидных пленках

3.4.4 Формирование микроразмерных структур в поликарбонате

Выводы к Главе

Глава 4 Аналитические системы и приборы на основе микрофлюидных чипов 4.1 Аналитическая система для электрофоретических методов исследования проб 4.1.1 Микрофлюидные чипы для электрофоретических методов исследования

4.1.2 Аналитическая система с детектором лазер-индуцированной флуоресценции для электрофоретических методов анализа на МФЧ

4.1.3 Основные правила работы с МФЧ для электрофореза: подготовка, эксплуатация и хранение

4.2 Приборы и микрочипы для проведения ПНР

4.3 Экспериментальная установка для исследований микрообъектов на основе оптического инвертированного микроскопа и микрофлюидной платформы

4.3.1 Микрофлюидные чипы с гидродинамическими ловушками

4.3.2 Микрофлюидный чип для диэлектрофореза 242 Выводы к Главе

Глава 5 Экспериментальные исследования наноразмерных структур

5.1 Массив полупроводниковых нитевидных нанокристаллов ваАБ

5.1.1 Оптические свойства массива ННК

5.1.2 Воздействие лазерного излучения на массив ННК

5.1.3 Образование пространственных регулярных структур в массиве ННК

Выводы к разделу 5.

5.2 Пористые стекла, как функциональные элементы микрофлюидных устройств

5.2.1 Оптические свойства пористых стекол

5.2.2 Исследование пористых стекол методами конфокальной лазерной микроскопии и оптической микроскопии ближнего поля

5.2.3 Пористые стекла как основа для создания оптических чувствительных элементов

Выводы к разделу 5.

Глава 6 Экспериментальные исследования. Анализ биологических проб на микрофлюидном чипе

6.1 Электрофоретическое разделение биологических проб на микрофлюидном чипе

6.1.1 Экспресс-анализ полинуклеотидов

6.1.2 Разделение фрагментов ДНК

6.1.3 Иммунный анализ инсулина

6.1.4 Определение меченного сульфадиазина

6.1.5 Разделение аминокислот

6.2 ПЦР в реальном времени на микрофлюидном чипе 311 Выводы к Главе

Глава 7 Экспериментальные исследования микрофлюидных чипов для диэлектрофореза и микрочипов с гидродинамической ловушкой

6.3 Удерживание микрочастиц в чипе для диэлектрофореза 314 6.4Фиксация микрочастиц в гидродинамических ловушках 316 Выводы к Главе

Актуальность темы. Развитие и доступность технологий микроэлектроники привело к появлению аналитических систем на основе микрофлюидных устройств (МФУ), позволяющих осуществлять уникальные манипуляции с микроколичествами жидкой или газообразной пробы. Такие системы получили название «лаборатория на чипе» (lab on a chip). Объединение всех стадий и этапов аналитического определения в одном компактном устройстве дает возможность проводить анализ пробы в микроформате с высокой чувствительностью, точностью и экспрессностью определения компонентов.

Современными тенденциями развития МФУ являются: а) миниатюризация; б) интеграция в устройства новых функциональных модулей; в) увеличение числа измерительных каналов; г) применение наноразмерных элементов и систем; д) управление и контроль за всеми стадиями анализа; е) увеличение информативности измерений.

Создание аналитической системы на МФУ связано с решением ряда научных, методических, технических и технологических задач. Анализируемый компонент пробы и метод его анализа (или способ обнаружения) определяют топологию и конструкцию устройства, ассортимент применяемых материалов, технологии изготовления устройства, методы детектирования. Только комплексный подход, увязывающий выбор материалов, конструирование, технологии изготовления, интеграцию новых элементов и систем, внедрение новых принципов управления движением и разделением анализируемых компонентов пробы дает возможность создавать современные приборы на МФУ. Известные зарубежные конструкции МФУ защищены патентами и режимами коммерческой тайны {know-how). Поэтому требуется проведение собственных исследований и разработок, которые позволят создавать аналитические системы на основе МФУ.

Наиболее востребованными при исследованиях многокомпонентных биологических проб являются электрофоретические методы анализа. При разнообразии конфигураций (конструкций) МФУ, применяемых для электрофоретических методов, существуют общие требования к этим устройствам. Поэтому перспективной является разработка универсальной и простой топологии, которая могла бы использоваться для решения различных исследовательских задач.

Применение оптически прозрачных материалов (стекол, полимеров) в микрогидродинамике (микрофлюидике) дает возможность использовать высокочувствительные оптические методы детектирования компонентов пробы. Востребованными являются исследования по изучению возможности применения отечественных марок стекол для МФУ, адаптация технологий микроизготовления и способов герметизации для этих материалов, изучение влияния различных факторов на свойства и характеристики устройств. В качестве альтернативных, относительно дешевых материалов могут применяться полимеры (поликарбонат, полиметилметакрилат, полиимид и др.). В этой связи важной задачей является исследование режимов воспроизводимого формирования микроразмерных структур с заданными характеристиками в полимерных материалах при использовании коммерческих технологических установок.

Интеграция в МФУ новых функциональных микро- и наноразмерных элементов и систем (микро- и наноэлектродов, наноразмерных каналов, массивов нанопроволок, нанопористых сред и т.д.) является перспективным направлением совершенствования устройств, так как дает возможность значительно расширить круг решаемых задач за счет использования новых физических принципов и методик анализа, улучшить аналитические характеристики устройств. Все это требует проведения комплексных исследований по изучению способов создания наноразмерных элементов, их характеристик, взаимодействия наноструктур с жидкими средами, определению возможностей детектирования аналита.

Внедрение МФУ в практику лабораторных исследований все еще ограничено, так как рынок оснащен альтернативными аналитическими системами и приборами. Только немногие фирмы производят коммерческие аналитические системы на МФУ, среди них: Agilent Technologies Inc., Caliper Technologies Inc., Bio-Rad, Shimadzu Corp. и др. Разработка и создание отечественной приборной базы на основе МФУ позволила бы отказаться от импорта дорогостоящего оборудования и создать системы с техническими характеристиками, не уступающими лучшим зарубежным образцам.

Вышеизложенное определяет актуальность данного направления исследований, развивающего комплексный подход к созданию аналитических систем на основе МФУ и оптических методов детектирования.

Цель работы: создание микрофлюидных устройств для исследований биологических проб методами флуорометрии и оптической микроскопии высокого разрешения.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Теоретические и экспериментальные исследования влияния геометрических и конструктивных параметров устройств, физико-химические свойств используемых материалов, технологий их обработки на характеристики МФУ;

2. Создание МФУ и приборно-аппаратных средств для электрофоретического разделения пробы, полимеразной цепной реакции (ПЦР);

3. Обоснование и реализация новых принципов исследований биологических проб на МФУ с применением микро- и наноразмерных структур (нанопористых стекол, массива нитевидных нанокристаллов -ННК, наноразмерных каналов, микроэлектродов), как новых функциональных элементов МФУ (оптического сенсора, гидродинамических и диэлектрофоретических ловушек); 4. Апробация актуальных методик на МФУ: электрофоретического анализа пробы; ПЦР в реальном времени; изучения микрообъектов методами оптической микроскопии высокого разрешения.

Научная новизна диссертационной работы состоит в оригинальном методологическом подходе к проектированию приборно-аппаратных средств на основе МФУ, заключающемся в проведении комплексной системной разработки с учетом: специфики исследуемого объекта, методики анализа, применяемых материалов, технологий формирования микро- и наноструктур, конструктивных элементов устройства, физико-химических свойств поверхности функциональных элементов, метода детектирования. Все это позволяет расширить область функциональных возможностей МФУ улучшить аналитические характеристики создаваемых на их основе устройств.

В работе впервые:

1. Предложена и реализована новая универсальная топология микрофлюидного чипа (МФЧ), обеспечивающая возможность дозирования разных объемов пробы электрокинетическими и гидродинамическими способами.

2. Экспериментально установлено, что отражательные свойства массива ННК из GaAs определяются формой вершины нанокристаллов. Обнаружено спектрально-селективное воздействие лазерного излучения на наноструктуры GaAs, приводящее к «слипанию» нанокристаллов и вызывающее изменение отражательной способности.

3. На примере обнаружения инсулина в пробе продемонстрирована возможность использования пористых стекол (в частности 8В-МАР), как основы нового оптического сенсорного элемента для регистрации конкурентной иммунной реакции.

4. Экспериментальные и теоретические исследования позволили получить ряд оригинальных результатов по оценке влияния конструкционных, технологических, методических факторов при применении МФУ для анализа биологических проб, которые позволяют создать основу для решения задач оптимизации топологий или/и режимов анализа (управления).

Практическое значение работы определяется

1. Разработанными и созданными макетными образцами аналитических систем на МФУ с флуоресцентными детекторами, которые используются в ИАП РАН при проведении научно-исследовательских работ.

2. Изготовленными стеклянными МФЧ, предназначенными для электрофоретических и диэлектрофоретических методов исследований биологических проб, а также для методов ПЦР (за последние пять лет совместно с ЗАО «Светлана-полупроводники», г. Санкт-Петербург создано более 250 штук).

3. Отработанными режимами формирования микроразмерных структур в полиметилметакрилате методом лазерной абляции (ЛА) и полученными экспериментальными образцами МФЧ для электрофоретического разделения пробы (совместно с ООО «Лазерный центр», г. Санкт-Петербург).

4. Обнаруженным эффектом спектрально-селективного воздействия лазерного излучения на массив ННК, пригодным для применения в новых технологиях обработки наноструктур и при изготовлении конструкций МФЧ с наноразмерными функциональными элементами.

5. Внедрением результатов работы в учебный процесс в форме авторских курсов лекций для бакалавров и магистров: «Микро- и нано- технологии в биологических и медицинских исследованиях» в СПб АУ НОЦ НТ РАН, «Микро- и наноаналитические методы исследования жидких сред», «Биоаналитические системы на основе микрочиповых технологий» в НИУ ИТМО.

Положения, выносимые на защиту

1. Конфигурации МФЧ и аналитических систем, содержащие новые технические решения: МФЧ с универсальной топологией для электрофоретического разделения пробы, с гидродинамическими ловушками и флуорометрические системы детектирования.

2. Экспериментальные результаты разделения и анализа биологических проб (в частности, фрагментов ДНК) на МФЧ, подтверждающие достижение аналитических характеристик, превосходящих соответствующие макроаналоги: уменьшения объема анализируемой пробы (в 2-5 раз) и времени определения в 10 раз) при сопоставимом пределе обнаружения и динамическом диапазоне.

3. Новые эффекты, выявленные при экспериментальных исследованиях взаимодействия электромагнитного излучения с массивом ННК (зависимость отражательной способности массива от формы вершин кристаллов) и взаимодействия молекул флуорофора с ННК (образование пространственных регулярных структур), их интерпретация и применение в устройствах на основе МФУ.

4. Результаты экспериментальных исследований, подтверждающие возможность использования пористых стекол, как основы оптического сенсорного элемента в МФЧ для регистрации конкурентной иммунной реакции на примере обнаружения инсулина в пробе.

5. Результаты экспериментальных измерений рельефа поверхности структур при кислотном травлении и термической обработке стекла, полученные при исследовании технологий изготовления микроструктур в стеклянных материалах, и оценка их влияния на характеристики МФЧ.

6. Результаты экспериментальных исследований по выбору режимов ЛА для формирования микроразмерных каналов заданной геометрии (шириной от 30 до 300 мкм и аспектным отношением <1) в полимерных материалах.

7. Способы управления движением и фиксацией микрочастиц размером от 1 до 6 мкм на МФЧ с микро- и наноструктурами для последующей их визуализации методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и их практическая реализация.

Личный вклад автора

Автор является одним из инициаторов работ по созданию и развитию МФУ и приборов на их основе для анализа биологических проб. Вклад автора состоит в формировании направления исследований, постановке цели и задач, разработке приборов и устройств, проведении экспериментальных, технологических и методических работ, интерпретации полученных результатов. Все экспериментальные результаты, представленные в работе, их обработка и анализ получены непосредственно при участии автора. Диссертация представляет собой обобщение материалов исследований и разработок, выполненных автором лично, с сотрудниками лаборатории, с коллегами из СПб АУ НОЦ НТ РАН (д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлин), ИХС РАН (д. хим. наук Т.В. Антропова), ФТИ РАН, НИУ ИТМО, ЗАО «Светлана-полупроводники», ООО «Лазерный центр». В работах, опубликованных в соавторстве, автору принадлежат результаты, сформулированные в защищаемых положениях и выводах.

Связь с государственными программами и НИР

Тематика исследований поддержана: Межведомственной научно-технической программой "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего" проекты «Микроаналитические системы: портативные и лабораторные экспресс-анализаторы и биосенсоры на основе чип-реализации одноканального и мультиканального приборов капиллярного электрофореза» (2000-2001 гг.) и «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования» (20022006 гг.);

Научными Программами СПб НЦ РАН, проекты «Микрофлюидные чип-анализаторы» (2001 г.), «Аналитические приборы на основе микрофлюидных

14 технологий» (2003 г.); «Микрофлюидные чип-анализаторы с интегрированными наноструктурами (нановискерами)» (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.), «Микрофлюидные аналитические системы с интегрированными наноструктурами (пористыми стеклами)» (совместно с ИХС РАН, 2009г.);

Грантом РФФИ-ГФЕН 03-01-39003а «Теоретические и экспериментальные исследования явлений переноса и взаимодействия биологических объектов в микрофлюидных устройствах» (2004-2005гг);

Грантом РФФИ 05-02-08090 офиа "Микроаналитические системы с интегрированными нитевидными кристаллическими нанострукту-рами" (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.);

Программой фундаментальных исследований ОХМН РАН «Создание и совершенствование методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов», проекты «Создание наноструктурных пористых элементов функционального назначения для микроаналитических систем» (совместно с ИХС РАН, 2006-2008гг.), «Микрофлюидные чипы для анализа биополимеров» (2010-2011 гг.);

Аналитической ведомственной целевой программой "Развитие научного потенциала высшей школы" проект «Исследования и диагностика клеточных структур: новые методические подходы и инструментальные решения на основе сканирующей зондовой микроскопии и микрочиповых технологий» (НИУ ИТМО, 2009-2011гг.)

Апробация работы

Основная часть разработок и результатов исследований, изложенных в диссертации, докладывалась и обсуждалась на Всероссийских и международных конференциях и симпозиумах: SPIE Conference BiOS 2002 (San Jose, USA, 2002); 1-ой Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, Россия, 2002 г); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, Россия, 2002 г); 14th International Symposium Boron, Borides and Related Compounds (St

15

Petersburg, Russia, 09-14 June 2002); XIV и XVI Российских конференциях по использованию синхротронного излучения (Новосибирск, 2002, 2006 гг); 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS-2003 (Moscow, Russia, 2003); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, Россия, 2003 г); Seventh, Eight, Night Seminars on Porous Glasses-Special Glasses (PGL'2005, 2007, 2009, Szklarska Por?ba, Poland); 2-ой Международной научно-практической конференции «Исследования, разработки и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, Россия, 2006 г); XIV Int. Symposium «Nanostructure: Phys&Techn» (Репино, Россия, 2006 г); European conference on surface science ECOSS 24 (Paris, 2006); Сессии Научного совета РАН по аналитической химии. Школа-конференция «Успехи аналитической химии» (Звенигород, 2006 г); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г, Волгоград, 2011 г); VIII и IX Международных конференциях «Прикладная оптика» (Санкт-Петербург, 2008, 2009 гг); XX Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008 г); III Russian Conference on Nanomaterials "NANO-2009" (Ural, Ekaterinburg, 2009); Spring Meeting European Materials Research Society (EMRS Spring-2011, Nice, France, 2011); International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT 2011, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011); семинарах по микрочиповым технологиям, организованных в МГУ (Химический факультет) и Институте аналитического приборостроения РАН.

Публикации

Основные результаты работы представлены в 105 научных трудах, в том числе 45 работ опубликовано в рецензируемых отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка литературы из 551 наименования. Текст диссертации изложен на 353 стр., включая 104 рисунка и 9 таблиц.

Выводы к главе 7

Результаты экспериментальных исследований прототипов МФУ с диэлектрофоретическими и гидродинамическими ловушками для частиц показали возможность устойчивой фиксации отдельных частиц и группы частиц в созданных устройствах для последующего их исследования методами оптической микроскопии, в том числе конфокальной лазерной микроскопии, что подтверждает работоспособность созданных конструкций и адекватность предлагаемых подходов.

В МФЧ для ДЭ при длительном воздействии электрического поля происходит нагрев жидкости и выделение газообразных продуктов, что приводит к нестабильности захвата и удержания частиц. Для предотвращения этого, необходим подбор буферной среды, ограничение времени воздействия, эффективный отвод тепла. При точном знании объектов исследования необходимо осуществить оптимизацию формы и конструкции электродов для достижения более высокой эффективности ДЭ захвата частиц.

При создании МФЧ с гидродинамическими ловушками требуется осуществлять расчет под определенные характеристики частиц (размер и форму), учитывать гидравлическое сопротивление системы, которое, в конечном итоге, влияет на жесткость фиксации частиц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволяют сформулировать следующие основные результаты и выводы.

1. На основе исследований факторов различной природы (конструктивных, геометрических, физико-химических характеристик, физических полей), влияющих на разрешающую способность при электрофоретическом разделении многокомпонентной пробы на МФУ, выявлено, что наибольшую значимость имеют продольная диффузия компонентов, размеры областей детектирования и инжекции пробы, отклонение геометрии канала от линейной, а также свойства поверхности канала. Таким образом, сформулированы методические основы оптимизации конструкции и режимов электрофоретического разделения биологических проб.

2. Разработана универсальная топология МФЧ для электрофоретического разделения пробы, основанная на модернизации традиционных технических решений, позволяющая инжектировать различные объемы проб электрокинетическим и гидравлическим способами.

3. Экспериментальные исследования свойств и анализ физико-химических характеристик стекол К8 и Ф1 позволили выявить наличие у этих материалов химической стойкости, оптической прозрачности, низкого уровня флуоресценции при возбуждении в спектральном диапазоне 400-700 нм, возможности термического связывания при температурах 560-580°С, что обосновывает их применимость при изготовлении МФУ, предназначенных для методов оптической микроскопии и флуорометрии.

4. Адаптированы и апробированы технологии формирования микро- и наноразмерных структур с воспроизводимыми геометрическими характеристиками для стекла К8 методом фотолитографии и кислотного травления, а также методом сфокусированного ионного пучка, что позволило определить режимы формирования структур, выявить особенности и области применимости методов.

5. На основе теоретического изучения и экспериментальных исследований физико-химических процессов, происходящих при температурной обработке стекла К8, разработаны и проверены технологии герметизации МФЧ: а) способом термического связывания с защитной пластиной из стекла Ф1; б) соединением фотоотвержаемым клеем с контролем качества полимеризации спектрофлуорометрическим методом, которые были использованы при создании конструкций МФУ для электрофоретических методов анализа, для ПЦР-РВ и для фиксации и удерживания микрочастиц.

6. Метод лазерной абляции полимеров применен для формирования микроразмерных каналов и реакционных камер для МФЧ. При этом экспериментально определены режимы изготовления каналов в ПММА на длине волны 10,6 мкм и в ПК на длине волны 1,06 мкм, что дало возможность изготовить прототипы МФЧ (для электрофоретического разделения пробы и для ПЦР).

7. На основе экспериментальных исследований оптических и структурных характеристик образцов массива ННК из GaAs методами оптической спектроскопии, KJICM и электронной микроскопии подтверждено, что отражательные свойства массива определяются формой вершин ННК, и впервые выявлено, что воздействие лазерного излучения с плотностью мощности свыше 100 мВт/мм на длинах волн 488 и 633 нм приводит к «слипанию» и разрушению вершин ННК.

8. Экспериментальные данные, полученные при изучении оптических свойств и структурных характеристик пористых стекол методами оптической спектроскопии и микроскопии высокого разрешения, позволили обосновать перспективность использования стекла 8-В MAP в качестве оптического чувствительного элемента для регистрации конкурентной иммунной реакции.

9. Созданы новые конструкции МФЧ с интегрированными микро- и наноразмерными функциональными элементами для разделения и фиксации частиц (с точностью не хуже 0.2 мкм) на заданном участке микрочипа с

322 целью их дальнейших исследований методами микроскопии высокого разрешения.

10. Созданы действующие макеты аналитических систем на основе МФУ: для электрофоретического разделения пробы и для реализации ПЦР в реальном времени, позволяющие при сопоставимых пределе обнаружения и динамическом диапазоне по сравнению с макроаналогами значительно (до 10 раз) сократить время определения при анализе нуклеиновых кислот, уменьшить объем реагентов и пробы (более, чем в 2 раза).

Автор выражает искреннюю благодарность доктору физ-мат. наук Булянице А.Л. за бескомпромиссную, конструктивную и полезную критику данной работы, а также за проявленную выдержку и терпение при обсуждении отдельных вопросов. Автор весьма признателен доктору физмат. наук Иркаеву С.М., без усилий которого продвижение и написание данной работы могло бы затянуться на более долгое время.

Особую благодарность следует выразить своим коллегам, сотрудникам лаборатории «информационно-измерительных био- и хемосенсорных микросистем», оказывшим существенную поддержку в непростой период написания этой работы.

1. Terry S.C., Jerman J.H., Angell J.B. A Gas Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon Wafer//IEEE T Electron Dev. 1979. N 26. P. 1880-1886.

2. Manz A., Miyahara Y., Miura J., Watanabe Y., Miyagi H., Sato K. Design of an Open-tubular Column Liquid Chromatograph Using Silicon Chip Technology// Sens. Actuators B. 1990. N l.P. 249-255.

3. Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing//Sensors and Actuators B: Chemical. 1990. N 1. P. 244-248.

4. Manz A., Harrison D.J., Verpoorte E.M.J., Fettinger J.C., Ludi H., Widmer H.M., Miniaturization of Chemical Analysis Systems A Look into Next Century's Technology or Just a Fashionable Craze// Chemia. 1991. N 45. P. 103-105.

5. Harrison D.J., Flury K., Seiler K., Fan Z., Effenhauser C.S., Manz A. Micromachining a Miniaturized Capillary Electrophoresis Based Chemical Analysis System on a Chip // Science. 1993. N 261. P. 895-897.

6. Reyes D., Iossifidis D., Auroux P., Manz A. Micro total analysis systems. 1. Introduction, theory, and technology // Analytical Chemistry 2002. N 74. P. 2623-2636.

7. Nanofluidics. Nanoscience and Nanotechnology / Ed. by J. B. Edel and A. J. deMello. Cambridge: The Royal Society of Chemistry. Thomas Graham House. 2009. 198 p.

8. Squires T., Quake S. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale // Reviews of modern physics 2005. N 77. P. 977-1007.

9. Shoffner M.A., Cheng J., Hvichia G.E., Kricka L.J., Wilding P. Chip PCR. I. Surface passivation of micro fabricated silicon-glass chips for PCR // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24. N2. P. 375-379.

10. Cheng J., Shoffner M.A., Hvichia G.E., Kricka L.J., Wilding P. Chip PCR. II. Investigation of different PCR amplification systems in microbabricated silicon-glass chips // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24. N 2. P. 380-385.

11. Woolley A. T., Hadley D., Landre P., deMello A. J., Mathies R. A., Northrup M. A. Functional Integration of PCR Amplification and Capillary Electrophoresis in a Microfabricated DNA Analysis Device // Anal. Chem. 1996. Vol. 68. N 23. P. 4081-4086.

12. Jacobson S. C., Hergenroder R., Koutny L. B., Ramsey J. M. Open Channel Electrochromatography on a Microchip // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. N 14. P. 2369-2373.

13. Jacobson S. C., HergenrSder R., Koutny L. B., Ramsey J. M. High Speed Separations on a Microchip // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. N 7. P. 1114-1118.

14. Jacobson S. C., Hergenroder R., Koutny L. B., Warmack R. J., Ramsey J. M. Effects of Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. N7. P. 1107-1113.

15. Jacobson S. С., Koutny L. В., Hergenroder R., Moore A. W., Ramsey J. M. Microchip Capillary Electrophoresis with an Integrated Postcolumn Reactor // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. N 20. 3472-3476.

16. Harrison D.J., Manz A., Fan Z., Luedi H., Widmer H.M. Capillary electrophoresis and sample injection systems integrated on a planar glass chips // Anal. Chem. 1992. Vol. 64. N 17. P. 1926-1932.

17. Abgrall P., Gue A.-M. Lab-on-a-chip technologies: making a microfluidic network and coupling it into a complete microsystem. A review // Journal of Micromechanics and Microengineering. 2007. N 17. P. R15-R49.

18. Yager P., Edwards Т., Fu E., Helton K„ Nelson K., Tam M. R., Weigl В. H. Microfluidic diagnostic technologies for global public health // Nature. 2006. N 442. P. 412-418.

19. Whitesides G. M. The origins and the future of microfluidics // Nature. 2006. N 442. P. 368373.

20. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics / Editor-in-Chief Dongqing Li. New York: Springer Science&Business Media. 2008. 2226 p.

21. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Volume II. Micro/Nano Technology for Genomics and Proteomics / Editor-in-Chief Mauro Ferrari, Ed. Ozkan M., Heller M. J. New York: Springer Science&Business Media. 2006. 554 p.

22. Microarrays. Preparation, Microfluidics, Detection Methods, and Biological Applications / Ed. Dill K., Liu R. H., Grodzinski P. New York: Springer Science&Business Media. 2009. 356 p.

23. Handbook of capillary and microchip electrophoresis and associated microtechniques / Ed. Landers J.P. Boca Raton: CRC Press: Tailor & Francis Group, 2008. 1598 p;

24. Methods in Molecular Biology, 339. Microchip Capillary Electrophoresis / Ed. Charles S. Henry. New Jersey: Humana Press Inc. 2006. 249 p.

25. Design Automation Methods and Tools for Microfluidics-Based Biochips / Ed. Chakrabarty K., Zeng J. The Netherlands: Dordrecht: Springer. 2006. 403 p.

26. Microfluidics for Biological Applications / Ed. W.-C. Tian, E. Finehout. New York: Springer Science&Business Media. 2008. 416 p.

27. Золотов Ю.А. Аналитические схемы на чипе (микроприборы) // Журнал анал. хим. 1996. Т. 51. №4. С. 357-358.

28. Беленький Б.Г., Зимина Т.М., Комяк Н.И. Микроаналитические системы новое направление аналитического приборостроения // Заводская лаборатория. 1997. Т. 63. С. 1-11.

29. Беленький Б.Г., Комяк Н.И., Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Суханов B.JI. Микрофлюидные аналитические системы (Часть 1) // Научное приборостроение. 2000. Т. 10. №2. С. 57-64.

30. Беленький Б.Г., Комяк Н.И., Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Суханов B.JI. Микрофлюидные аналитические системы (Часть 2) // Научное приборостроение. 2000. Т. 10. №3. С. 3-16.

31. Беленький Б.Г. Новые возможности лабораторной аналитики: микрофлюидные чип-анализаторы // Клин. лаб. диагност. 2001. № 4. С. 25-32

32. Микрофлюидные системы для химического анализа // под. Ред. Ю.А. Золотова и В.Е. Курочкина. М.: ФИЗМАТЛИТ. 2011. 528 с.

33. Fredrikson C.K., Fan Z.H. Macro-to-micro interfaces for microfluidic devices // Lab Chip. 2004. N4. P. 526-533.38. de Jong J., Lammertink R. G. H., Wessling M. Membranes and microfluidics: a review // Lab Chip. 2006. Vol. 6. P. 1125-1139.

34. Lai S., Wang S., Luo J., Lee L. J., Yang S., Madou M. J. Design of a Compact Disk-like Microfluidic Platform for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay // Anal. Chem. 2003. Vol. 76. N7. P. 1832-2837.

35. Tsutsui H., Ho C.-M. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems // Mechanics Research Communications. 2009. N 36. P. 92-103.

36. Vanapalli S.A., Duits M. H. G., Mugele F. Microfluidics as a functional tool for cell mechanics // Biomicrofluidics. 2009. N 3. P. 012006.

37. Castillo J., Dimaki M., Svendsen W. E. Manipulation of biological samples using micro and nano techniques // Integr. Biol. 2009. N 1. P. 30 42.

38. Yi C., Li C.-W., Ji S., Yang M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells // Analytica Chimica Acta. 2006. Vol. 560. N 1-2. P. 1-23.

39. Oakey J., Applegate R. W., Arellano E., Carlo D. D., Graves S. W., Toner M. Particle Focusing in Staged Inertial Microfluidic Devices for Flow Cytometry // Anal. Chem. 2010. Vol. 82. N9. P. 3862-3867.

40. Евстрапов A.A. Физические методы управления движением и разделением микрочастиц в жидких средах. Часть 1. Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет// Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 1. С. 8-21.

41. Voldman J. Electrical Forces For Microscale Cell Manipulation // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2006. N 8. P. 425-454.

42. Braschler Т., Demierre N., Nascimento E., Silva Т., Oliva A. G., Renaud P. Continuous separation of cells by balanced dielectrophoretic forces at multiple frequencies // Lab Chip. 2008. N8. P. 280-286.

43. Vahey M. D., Voldman J. An Equilibrium Method for Continuous-Flow Cell Sorting Using Dielectrophoresis // Anal. Chem. 2008. Vol. 80. N 9. P. 3135-3143.

44. Zhao B. S., Koob Y.-M., Chung D. S. Separations based on the mechanical forces of light // Analytica Chimica Acta. 2006. Vol. 556. N 1. P. 97-103.

45. Godin J., Chen C-H., Cho S. H., Qiao W., Tsai F., Lo Y-H. Microfluidics and photonics for Bio-System-on-a-Chip: A review of advancements in technology towards a microfluidic flow cytometry chip // J. Biophotonics. 2008. Vol. 1. N 5. P. 355-376.

46. Pamme N., Wilhelm C. Continuous sorting of magnetic cells via on-chip free-flow Magnetophoresis // Lab Chip. 2006. N 6. P. 974-980.

47. Tarn M.D., Hirota N., lies A., Pamme N. On-chip diamagnetic repulsion in continuous flow // Sci. Technol. Adv. Mater. 2009. N 10. P. 014611 (6 p).

48. Shi J., Мао X., Ahmed D., Colletti A., Huang T. J. Focusing microparticles in a microfluidic channel with standing surface acoustic waves (SSAW) // Lab Chip. 2008. N 8. P. 221-223.

49. Manneberg O., Vanherberghen В., Onfelt В., Wiklund M. Flow-free transport of cells in microchannels by frequency-modulated ultrasound // Lab Chip. 2009. N 9. P. 833 837.

50. Persat A., Suss M. E., Santiago J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers // Lab Chip. 2009. N 9. P. 2437-2453.

51. Persat A., Suss M. E., Santiago J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part II: Coupling between ion mobility, electrolysis, and acid-base equilibria // Lab Chip. 2009. N 9. P. 2454-2469.

52. Futtere C., Mine N., Bormuth V., Codarbox J-H., Laval P., Rossier J., Viovy J-L. Injection and flow control system for microchannels // Lab Chip. 2004. N 4. P. 351-356.

53. Magargle R., Hoburg J.F., Mukherjee T. An injector component model for complete microfluidic electrokinetic separation system // NSTI Nanotech. 2004. N 1. P. 77-80.

54. Bias M., Delaunay N., Rocca J.-L. Electrokinetic-based injection modes for separative Microsystems // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 1. P. 20-32.

55. Lee N.Y., Yamada M., Seki M. Pressure-driven sample injection with quantitative liquid dispensing for on-chip electrophoresis // Anal Sci. 2004. Vol. 20. N 3. P. 483-487.

56. Reichmuth D. S., Shepodd T. J., Kirby B.J. On-Chip High-Pressure Picoliter Injector for Pressure-Driven Flow through Porous Media // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. N 17. P. 50635068.

57. Зимина T.M. Микро- и наносистемы в задачах жидкостного и газового анализа// Нано- и микросистемная техника. 2007. № 8. С. 27-49.

58. Зимина Т. М. Миниатюрные аналитические системы биомедицинского назначения -лаборатории на чипе // Биотехносфера. 2009. № 1. С. 11-17.

59. Wang X., Cheng С., Wang S., Liu S. Electroosmotic pumps and their application in microfluidic systems // Microfluid Nanofluid. 2009. Vol. 6. N 2. P. 1-34.

60. Nguyen N-T., Wu Z. Micromixer a review // J. Micromech. Microeng. 2005. N 15. P. Rl-R16.

61. Khandurina J., Jacobson S.C., Waters L.C., Foote R.S., Ramsey J.M. Microfabricated porous membrane structure for sample concentration and electrophoretic analysis// Anal. Chem. 1999. Vol. 71. N 9. P. 1815-1819.

62. Niu X., Liu L., Wen W., Sheng P. Active microfluidic mixer chip // Applied Physics Letters. 2006. Vol. 88. N 15. P. 153508 (3 p).

63. Mansur E.A., Mingxing YE, Yundong W., Youyuan D. A state-of-the-art of mixing in microfluidic mixer // Chinese J. Of Chemical Engineering. 2008. Vol. 16. N 4. P. 503-516.

64. Probstein R.F. Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction. 2nd ed. New-York: John Wiley & Sons. 1994. 400 p.

65. Sharp K.V., Adrian R.J., Santiago J.G., Molho J.I. The MEMS Handbook. Chapter 6. Liquid Flows in Microchannels / Ed. M. Gad-el-Hak. Boca Raton-London-New-York-Washington: CRC Press LLC. 2002. P. 6-1-6-38

66. Дой M., Эдварде С. Динамическая теория полимеров. М.: Мир. 1998. 440 с.

67. Буляница A.JI. Математическое моделирование в микрофлюидике: Основные положения // Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 51-66.

68. Chung T. J. Computational Fluid Dynamics. Cambridge University Press. 2010. 1034 p.

69. Wesseling P. Principles of computational fluid dynamics. The Netherlands: Springer. 2001. 644 p.

70. Akin J. E. Finite element analysis with error estimators: an introduction to the FEM and adaptive error analysis for engineering students. Butterworth-Heinemann. 2005. 447 p.

71. Pepper D.W., Heinrich J. C. The finite element method: basic concepts and applications. Taylor & Francis. 2006. 312 p.78. http://www.fluent.com79. http://www.femlab.com80. http://www.cfdrc.com81. http://www.coventor.com

72. Erickson D. Towards numerical prototyping of labs-on-chip: modeling for integrated microfluidic devices // Microfluid Nanofluid. 2005. N 1. P. 301-318.

73. Baharudin L. Microfluidics: Fabrications and Applications // Instrumentation Science & Technology. 2008. Vol. 36. N 2. P. 222 230.

74. Schneegass I., Brautigam R., Kohler J.M. Miniaturized flow-through PCR with different template types in a silicon chip thermocycler // Lab Chip. 2001. Vol. 1. N l.P. 42-49.

75. Weiping Y., Liqun D., Jing W., Lingzhi M., Zhu J. Simulation and experimental study of PCR chip based on silicon // Sensors and Actuators B: Chem. 2005. Vol. 108. N 1-2. P. 695699.

76. Chen L., Luo G., Liu K. et al. Bonding of glass-based microfluidic chips at low- or room-temperature in routine laboratory // Sensors and Actuators B: Chemical. 2006. Vol. 119. N l.P. 335-344.

77. Kutchoukov V.G., Laugere F., Van Der Vlist et al. Fabrication of nanofluidic devices using glass-to-glass anodic bonding // Sensors and Actuators A: Phys. 2004. Vol. 114. N 2-3. P. 521-527.

78. Easley C.J., Legendre L.A., Landers J.P., Ferrance J.P. Rapid DNA amplification in glass microdevices // Methods Mol Biol. 2006. N 339. P. 217-732.

79. Chandrasekaran A., Acharya A., You J. L. et al. Hybrid Integrated Silicon Microfluidic Platform for Fluorescence Based Biodetection // Sensors. 2007. N 7. P. 1901-1915.

80. Wang W., Wang H.B., Li Z.X., Guo Z.Y. Silicon inhibition effects on the polymerase chain reaction: a real-time detection approach // J. Biomed Mater. Res. A. 2006. Vol. 77. N 1. P. 28-34.

81. Felbel J., Bieber I., Pipper J., Kohler J.M. Investigation on the compatibility of chemically oxidezed silicon (SiOx)-surfaces for applications towards chip-based polymerase chain reaction // Chemical Engineering Journal. 2004. N 101. P. 333-338.

82. Christensen T.B., Pedersen C.M., Gröndahl K.G., Jensen T.G., Sekulovic A., Bang D.D., Wolff A. PCR biocompatibility of lab-on-a-chip and MEMS materials // J. Micromech. Microeng. 2007. N 17. P. 1527-1532.

83. Madou M.J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturisation. CRC Press, Boca Raton. 2002. 752 p.

84. Lee D.-J., Lee Y.-H., Jang J., Ju B.-K. Glass-to-glass electrostatic bonding with intermediate amorphous silicon film for vacuum packaging of microelectronics and its application // Sensors and Actuators, A: Physical. 2001. Vol. 89. N 1-2. P. 43-48.

85. Zhuang G., Jin Q., Liu J., Cong H., Liu K., Zhao J., Yang M., Wang H. A low temperature bonding of quartz microfluidic chip for serum lipoproteins analysis // Biomedical Microdevices. 2006.Vol. 8. N 3. P. 255-261.

86. Wei J., Nai S. M. L., Wong C. K., Lee L. C. Glass-to-glass anodic bonding process and electrostatic force // Thin Solid Films. 2004. N 462-463. P. 487-491.

87. Becker H., Locascio L.E. Polymer microfluidic devices // Talanta. 2002. N 56. P. 267-287.

88. Becker H., Gartner C. Polymer microfabrication technologies for microfluidic systems // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2008. Vol. 390. N 1. P. 89-111.

89. Friend J., Yeo L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane// Biomicrofluidics. 2010. N 4. P. 026502 (5 p.).

90. McDonald J.C., Duffy D.C., Anderson J.R., Chiu D.T., Wu H., Schueller O.J., Whitesides G.M. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane) // Electrophoresis. 2000. Vol. 21. N l.P. 27-40.

91. Sia S.K., Whitesides G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies // Electrophoresis. 2003. Vol. 24. N 21. P. 3563-3576.

92. Xiang Q, Xu B, Fu R, Li D. Real time PCR on disposable PDMS chip with a miniaturized thermal cycler // Biomed Microdevices. 2005. Vol. 7. N 4. P. 273-279.

93. Wu H., Huang B., Zare R.N. Construction of microfluidic chips using polydimethylsiloxane for adhesive binding // Lab Chip. 2005. N 5. P. 1393-1398.

94. Nakayama T., Kurosawa Y., Furui S. et al. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications // Anal. Bioanal. Chem. 2006. N 386. P. 1327-1333.

95. Shin Y.S., Cho K., Lim S.H. et al. PDMS-based micro PCR chi with Parylene coating // J. Micromech. Microeng. 2003. N 13. P. 768-774.

96. Mathur A., Roy S.S., Tweedie M. et al. Characterisation of PMMA microfluidic channels and devices fabricated by hot embossing and sealed by direct bonding // Current Applied Physics. 2009. N 9. P. 1199-1202.

97. Yao L., Liu B., Chen T., Liu S., Zuo T. Micro flow-through PCR in a PMMA chip fabricated by KrF excimer laser // Biomed Microdevices. 2005. Vol. 7. N 3. P. 253-357.

98. O.Li J. M., Liu C., Dai X. D., Chen H. H. et al. PMMA microfluidic devices with three-dimensional features for blood cell filtration // J. Micromech. Microeng. 2008. Vol. 18. N 9. P.095021.

99. Chen Y., Zhang L., Chen G. Fabrication, modification and application of Poly(methyl methacrylate) microfluidic chips // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 9. P. 1801-1814.

100. Chen J., Wabuyele M., Chen H., Patterson D., Hupert M., Shadpour H., Nikitopoulos D., Soper S.A. Electrokinetically synchronized polymerase chain reaction microchip fabricated in polycarbonate // Anal Chem. 2005. Vol. 77. N 2. P. 658-666.

101. Liu Y., Ganser D., Schneider A. et al. Microfabricated Polycarbonate CE Devices for DNA Analysis // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. N 17. P. 4196-4201.

102. Li J.M., Liu C., Qiao H.C. et al. Hot embossing/bonding of a poly(ethylene terephthalate) (PET) microfluidic chip // J. Micromech. Microeng. 2008. N 18. P. 015008. (10 p.).

103. Abgrall P., Conedera V., Camon H., Gue A.M., Nguyen N.T. SU-8 as a structural material for labs-on-chips and microelectromechanical systems // Electrophoresis. 2007. Vol. 28. N 24. P. 4539-4551.

104. Tsai N-C., Sue C-Y. SU-8 based continuous-flow RT-PCR bio-chips under high-precision temperature control // Biosensors and Bioelectronics. 2006. Vol. 22. N 2. P. 313-317.

105. Sato H., Matsumura H., Keino S., Shoji S. An all SU-8 microfluidic chip with built-in 3D fine microstructures // J. Micromech. Microeng. 2006. N 16. P. 2318-2322.

106. Ribeiro J., Minas G., Turmezei P., Wolffenbuttel R., Correia J. A SU-8 fluidic microsystem for biological fluids analysis // Sensors and Actuators A. 2005. N 123-124. P. 77-81.

107. Gonzalez A., Grimes R., Walsh E. J., Dalton T., Davies M. Interaction of quantitative PCR components with polymeric surfaces // Biomed Microdevices. 2007. N 9. P. 261-266.

108. Bu M., Melvin T., Ensell G., Wilkinson J., Evans A. A new masking technology for deep glass etching and its microfluidic application // Sensors and Actuators A. 2004. Vol. 115. N 2. P. 476-482.

109. Li X., Abe T., Esashi M. Deep reactive ion etching of Pyrex glass using SF6 plasma // Sensors and Actuators A. 2001. Vol. 87. N 3. P. 139-145.

110. Thienot E., Domingo F., Cambril E., Gosse C. Reactive ion etching of glass for biochip applications: Composition effects and surface damages // Microelectronic Engineering. 2006. Vol. 83. N 4-9. P. 1155-1158.

111. Akashi T., Yoshimura Y. Deep reactive ion etching of borosilicate glass using an anodically bonded silicon wafer as an etching mask // Journal of Micromechanics and Microengineering. 2006. N 16. P. 1051-1056.

112. Altissimo M. E-beam lithography for micro/ nanofabrication // Biomicrofluidics. 2010. N 4. P. 026503 (6 p.).

113. Qi H., Wang X., Chen T., Ma X., Zuo T. Fabrication and characterization of a polymethyl methacrylate continuous-flow PCR microfluidic chip using CO2 laser ablation // Microsystem Technologies. 2009. Vol. 15. N 7. P. 1027-1030.

114. Duffy D. C., McDonald J. C., Schueller O. J. A., Whitesides G.M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane) // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. N 23. P. 4974-4984.

115. Dang F., Tabata S., Kurokawa M., Ewis A. A. et al. High-Performance Genetic Analysis on Microfabricated Capillary Array Electrophoresis Plastic Chips Fabricated by Injection Molding // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. N 7. P. 2140-2146.

116. Abdelgawad M., Watson M. W. L., Young E.W. K., Mudrik J. M., Ungrin M. D., Wheeler A. R. Soft lithography: masters on demand // Lab Chip. 2008. N 8. P. 1379-1385.

117. Kim P., Kwon K. W., Park M. C., Lee S. H., Kim S.M., Suh K. Y. Soft Lithography for Microfluidics: a Review // Biochip Journal. 2008. Vol. 2. N 1. P. 1-11.

118. Pemg B.-Y., Wu C.-W., Shen Y.-K., Lin Y. Microfluidic chip fabrication using hot embossing and thermal bonding of COP // Polymers for Advanced Technologies. 2009. Vol. 21. N7. P. 457-466.

119. Qin D., Xia Y., Whitesides G. M. A Rapid Prototyping Method for Generating Patterns and Structures with Feature Sizes Larger Than 20 um // Adv. Mater. 1996. N 8. P. 917-919.

120. Zhu X., Liu G., Xiong Y., Guo Y., Tian Y. Fabrication of PMMA Microchip of Capillary Electrophoresis by Optimized UV-LIGA Process // Journal of Physics: Conference Series. 2006. N 34. P. 875-879.

121. Сейсян P.П. Нанолитография в микроэлектронике // Журнал технической физики. 2011. Т. 81. Вып. 8. С. 1-14.

122. Mijatovic D., Eijkel J. С. Т., van den Berg A. Technologies for nanofluidic systems: top-down vs. bottom-up—a review // Lab Chip. 2005. N 5. P. 492-500.

123. Lab-on-a-Chip Technology. Vol. 1: Fabrication and Microfluidics / Ed. Herold К. E. and Rasooly A. Norwich: Caister Academic Press. 2009. 410 p.

124. Hector J. De Los Santos Principles and Applications of NanoMEMS Physics. Dordrecht: Springer. 2005. 254 p.

125. Fiorini G.S., Chiu D.T. Disposable microfluidic devices: fabrication, function, and application // Biotechniques. 2005. Vol. 38. N 3. P. 429-446.

126. Анисимов С.И., Лукьянчук Б.С. Избранные задачи теории лазерной абляции // УФН. 2004. Т. 172. Вып. 36. С. 301-330.

127. Schmidt Н., Ihlemann J., Luther К., Troe J. Modeling of velocity and surface temperature of the moving interface during laser ablation of polyimide and polymethylmethacrylate // Applied Surface Science. 1999. N 138-139. P. 102-106.

128. Arnold N., Bityurin N., Bauerle D. Laser-induced thermal degradation and ablation of polymers: bulk model // Applied Surface Science. 1999. N 138-139. P. 212-217.

129. Snakenborg D., Klank H., Kutter J.P. Microstructure fabrication with a CO2 laser system // J. Micromech. Microeng. 2004. N 14. P. 182-189.

130. Atanasov P. A., Baeva M. G. CW CO2 laser cutting of plastics // XI International Symposium on Gas Flow and Chemical Lasers and High-Power Laser Conference; Eds. Howard J. Baker, Denis R. Hall. Proc. SPIE. 1997. N 3092. P. 772-775.

131. Arisawa H., Brill Т. B. Kinetics and mechanisms of flash pyrolysis of poly (methyl methacrylate) (PMMA) // Combust. Flame. 1997. N 109. P. 415-426.

132. Hong Ting-Fu, Ju Wei-Jhong, Wu Ming-Chang, Tai Chang-Hsien et al. Rapid prototyping of PMMA microfluidic chips utilizing a CO2 laser // Microfluidics and nanofluidics. 2010. Vol. 9. N. 6. P. 1125-1133.

133. Klank H, Kutter J. P., Geschke O. C02-Laser micromachining and back-end processing for rapid production of PMMA-based microfluidic systems // Lab on a Chip. 2002. N2. P. 242246.

134. Powell J. C02 laser Cutting. 1998. 2nd edn. Springer-Verlag, UK. 248 p.

135. Dowden J.M. The Mathematics of Thermal Modelling: An Introduction to the Theory of Laser Material. Processing. Chapman & Hall, CRC Press. 2001. 304 p.

136. Bowden M., Geschke O., Kutter J. P., Diamond D. C02 laser microfabrication of an integrated polymer microfluidic manifold for the determination of phosphorus // Lab Chip, 2003. N3. P. 221-223.

137. Stratakis E., Ranella A., Fotakis C. Biomimetic micro/nanostructured functional surfaces for microfluidic and tissue engineering applications // Biomicrofluidics. 2011. N 5. P. 013411 (31 p.).

138. Abgrall P., Nguyen N. T. Nanofluidic Devices and Their Applications // Anal. Chem. 2008. Vol. 80. N7. P. 2326-2341.

139. Kaji N., Okamoto Y., Tokeshi M., Baba Y. Nanopillar, nanoball, and nanofibers for highly efficient analysis of biomolecules // Chem. Soc. Rev. 2010. N 39. P. 948-956.

140. Hoang H.T., Segers-Nolten I.M., Berenschot J.W. et al. Fabrication and interfacing of nanochannel devices for single-molecule studies // J. Micromech. Microeng. 2009. N 19. P. 065017 (10p.).

141. Herbstman J. F., Hunt A. J. Single femtosecond pulse nanochannel formation in glass // Proc. SPIE. 2010. N 7585. P. 75850X.

142. White Y. V., Parrish M., Li X., Davis L. M., Hofmeister W. Femtosecond micro- and nano-machining of materials for microfluidic applications // Nanoengineering: Fabrication, Properties, Optics, and Devices V. Proc. of SPIE. 2008. N 7039. P. 70390J.

143. Fu Y.Q., Colli A., Fasoli A., Luo J.K., Flewitt A.J., Ferrari A.C., Milne W.I. Deep reactive ion etching as a tool for nanostructure fabrication // J. Vac. Sci. Technol. 2009. Vol. B 27. N 3.P. 1520-1526.

144. Abdolvand R., Ayazi F. An advanced reactive ion etching process for very high aspect-ratio sub-micron wide trenches in silicon // Sensors and Actuators A. 2008. N 144. P. 109-116.

145. Ali M.Y., Hung W., Yongqi F. A Review of Focused Ion Beam Sputtering // International Journal of Prec. Eng. and Manufacturing. February. 2010. Vol. 11. N 1. P. 157-170.

146. Davis F., Higson S. P.J. Structured thin films as functional components within biosensors // Biosensors and Bioelectronics. 2005. Vol. 21. N 1. P. 1-20.

147. Siqueira J.R. Jr., Caseli L., Crespilho F.N. et al. Immobilization of biomolecules on nanostructured films for biosensing // Biosens Bioelectron. 2010. Vol. 25. N 6. P. 12541263.

148. Guo L. J. Nanoimprint Lithography: Methods and Material Requirements // Adv. Mater. 2007. N 19. P. 495-513.

149. Schift H. Nanoimprint lithography: An old story in modern times? A review // J. Vac. Sci. Technol. B. 2008. Vol. 26. N 2. P. 458-480.

150. Xia Y., Whitesides G. M. Soft Lithography // Annu. Rev. Mater. Sci. 1998. 28. 153-184

151. Tseng A. A., Notargiacomo A., Chen T. P. Nanofabrication by scanning probe microscope lithography: A review// J. Vac. Sci. Technol. B 23. 2005. N 3. P. 877-894.

152. Sotomayor Torres C. M., Zankovych S., Seekamp J. et al. Nanoimprint lithography: an alternative nanofabrication approach // Materials Science and Engineering: C. 2003. Vol. 23. N 1-2. P. 23-31.

153. Cao H., Yu Z., Wang J., Tegenfeldt J. O. et al. Fabrication of 10 nm enclosed nanofluidic channels // Appl. Phys. Lett. 2002. Vol. 81. N 1. P. 174-176.169. http://www.tbs-semi.ru/companies/suss/MA6.html

154. Handbook of Nanofabrication / Ed. G.P. Wiederrecht. Elsevier B.V.: Netherlands. 2010. 307 P

155. Kumar G., Tang H. X., Schroers J. Nanomoulding with amorphous metals // Nature. 2009. N 457. P. 868-872.

156. Piner R. D., Zhu J., Xu F., Hong S., Mirkin C. A. "Dip-Pen" Nanolithography // Science. 1999. Vol. 283. N 5402. P. 661-663.

157. Liu H., Ding Y., Lan H. Nanoimprint Lithography: Principles, Processes and Materials. Nova Science Pub Inc. 2011. 73 p.

158. Nanofabrication. Fundamentals and Applications / Ed. A. A. Tseng. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. Singapore. 2008. 583 p.

159. Справочник Шпрингера по нанотехнологиям / Под ред. Б. Бхушана. В 3-х томах. М.: Техносфера. 2010.

160. Niklaus F., Stemme G., Lu J.-Q., Gutmann R. Adhesive wafer bonding // J. Appl. Phys. 2006. N 99. P. 031101-1-031101-27.

161. Schlautmann S, Besselink G.A.J., Prabhu G R, Schasfoort R.B.M. Fabrication of a microfluidic chip by UV bonding at room temperature for integration of temperature-sensitive layers // J. Micromech. Microeng. 2003. N 13. P. S81-S84.

162. Lu C., Lee L.J, Juang Y.J. Packaging of microfluidic chips via interstitial bonding technique // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 7. P. 1407-1414.179. http ://en. wikipedia. or g/wiki/Nano structure

163. Mawatari K., Tsukahara Т., Sugii Y., Kitamori T. Extended-nano fluidic systems for analytical and chemical technologies //Nanoscale. 2010. N 2. P. 1588-1595.

164. Daiguji H. Ion transport in nanofluidic channels // Chem. Soc. Rev. 2010. N 39. P. 901-911.

165. Ayappa K. G., Malani A., Kalyan P., Thakkar F. Molecular Simulations: Probing Systems From the Nanoscale to Mesoscale // Journal of the Indian Institute of Science. 2007. Vol. 87. N l.P. 35-60.

166. Boquet L., Charlaix E. Nanofluidics, from bulk to interface // Chem. Soc. Rev. 2010. N 39. P. 1073-1095.

167. Keyser U. F., Stijn van Dorp, Lemay S. G. Tether forces in DNA electrophoresis // Chem. Soc. Rev. 2010. N 39. P. 939-947.

168. Movahed S, Li D. Electrokinetic transport through nanochannels // Electrophoresis. 2011. Vol. 32. N 11. P. 1259-1267.

169. Rosi N. L., Mirkin C. A. Nanostructures in Biodiagnostics // Chem. Rev. 2005. N 105. P. 1547-1562.

170. Balasubramanian K. Challenges in the use of ID nanostructures for on-chip biosensing and diagnostics: A review // Biosensors and Bioelectronics. 2010. Vol. 26. N 4. P. 1195-1204.

171. Yeom S.H., Kang B.H., Kim K.J., Kang S.W. Nanostructures in biosensor a review // Front Biosci. 2011. Vol. l.N 16. P. 997-1023.

172. Pumera M., Escarpa A. Nanomaterials as electrochemical detectors in microfluidics and CE: Fundamentals, designs, and applications // Electrophoresis. 2009. Vol. 30. N 19. P. 33153323.

173. Daghestani H.N., Day B.W. Theory and applications of surface plasmon resonance, resonant mirror, resonant waveguide grating, and dual polarization interferometry biosensors // Sensors. 2010. N 10. P. 9630 9646.

174. Moon S., Kim D.J., Kim K., Kim D., Lee H., Lee K., Haam S. Surface-enhance plasmon resonance detection of nanoparticle-conjugated DNA hybridization // Appl. Opt. 2010. N 49. P. 484-491.

175. Choi S., Goryll M., Sin L. Y. M., Wong P. K., Chae J. Microfluidic-based biosensors toward point-of-care detection of nucleic acids and proteins // Microfluid Nanofluid. 2011. N 10. P. 231-247.

176. Merkoc A. Biosensing using nanomaterials. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. 2009. 505 P

177. Wang X., Cheng C., Wang S., Liu S. Electroosmotic pumps and their applications in microfluidic systems // Microfluidics and Nanofluidics. 2009. Vol. 6. N 2. P. 145-162.

178. Glawdel T., Elbuken C., Lee L. E. J., Ren C. L. Microfluidic system with integrated electroosmotic pumps, concentration gradient generator and fish cell line (RTgill-Wl) — towards water toxicity testing // Lab Chip. 2009. N 9. P. 3243-3250.

179. Kim J., Li Z., Park I. Direct synthesis and integration of functional nanostructures in microfluidic devices // Lab Chip. 2011. N 11. P. 1946-1951.

180. Plecis A., Nanteuil C., Haghiri-Gosnet A.-M., Chen Y. Electropreconcentration with Charge-Selective Nanochannels // Anal. Chem. 2008. Vol. 80. N 24. P. 9542-9550.

181. Kuo C.-W., Wei K. H., Lin C.-H., Shiu J.-Y., Chen P. Nanofluidic system for the studies of single DNA molecules // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 14. P. 2931-2938.

182. Huang K.D., Yang R.J. A nanochannel-based concentrator utilizing the concentration polarization effect // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 24. P. 4862-4870.

183. Levy S. L., Craighead H. G. DNA manipulation, sorting, and mapping in nanofluidic systems//Chem. Soc. Rev. 2010. N39. P. 1133-1152.

184. Piruska A., Gong M., Sweedler J.V., Bohn P.W. Nanofluidics in chemical analysis // Chem. Soc. Rev. 2010. N 39. P. 1060-1072.

185. Radwan S., Azzazy H.M.E. Gold nanoparticles for molecular diagnostics // Expert Rev Mol Diagn. 2009. Vol. 9. N 5. P. 511-524.

186. Konstantatos G., Sargent E. H. Nanostructured materials for photon detection // Nature Nanotechnology. 2010. N 5. P. 391^100.

187. Biswas A., Wang T., Biris A. S. Single metal nanoparticle spectroscopy: optical characterization of individual nanosystems for biomedical applications // Nanoscale. 2010. N2. P. 1560-1572.

188. Timofeeva E. V., Yu W., France D. M., Singh D., Routbort J. L. Nanofluids for heat transfer: an engineering approach // Nanoscale Research Letters. 2011. N 6. P. 182 (7p.).

189. Advanced polymer nanoparticles: synthesis and surface modifications / Ed. by V. Mittal. CRC Press. Taylor & Francis Group. 2011. 384 p.

190. Soloducho J., Cabaj J. Biocatalysts Immobilized in Ultrathin Ordered Films // Sensors. 2010. N 10. P. 10298-10313.

191. Yao S. Electroosmotic Pump Technologies Theory, Design, and Demonstration Book Description. VDM Verlag. 2008. 140 p.

192. Yao S., Hertzog D. E., Zeng S., Mikkelsen J. C., Santiago J. G. Porous glass electroosmotic pumps: design and experiments // Journal of Colloid and Interface Science. 2003. N 268. P. 143-153.

193. Wang P., Chen Z., Chang H.-C. A new electro-osmotic pump based on silica monoliths // Sensors and Actuators B. 2006. N 113. P. 500-509.214.www.dolomite-centre.com

194. Suh Y. K., Kang S. A Review on Mixing in Microfluidics // Micromachines. 2010. N 1. P. 82-111.

195. Hardt S., Drese K.S., Hessel V., Schönfeld F. Passive micromixers for applications in the microreactor and jiTAS fields // Microfluid Nanofluid. 2005. N 1. P. 108-118.

196. Lee C.-Y., Chang C.-L., Wang Y.-N., Fu L.-M. Microfluidic Mixing: A Review // Int. J. Mol. Sei. 2011. N 12. P. 3263-3287.

197. Jeon S., Malyarchuk V., White J. O., Rogers J.A. Optically Fabricated Three Dimensional Nanofluidic Mixers for Microfluidic Devices //Nano Lett. 2005. Vol. 5. N 7. P. 1351-1356.

198. Park S.-G., Lee S.-K., Moon J. H., Yang S.-M. Holographic fabrication of three-dimensional nanostructures for microfluidic passive mixing // Lab Chip. 2009. N 9. P. 3144-3150.

199. Kim D., Raj A., Zhu L., Masel R. I., Shannon M. A. Non-equilibrium electrokinetic micro/nano fluidic mixer // Lab Chip. 2008. N 8. P. 625-628.

200. Tegenfeldt J. O., Prinz C., Cao H., Huang R. L., Austin R. H., Chou S.Y., Cox E. C., Sturm J. C. Micro- and nanofluidics for DNA analysis // Anal Bioanal Chem. 2004. N 378. P. 1678-1692.

201. Snyder J.L., Clark A. Jr., Fang D.Z. et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes // J. of Membrane Science. 2011. Vol. 369. N 1-2. P. 119-129.

202. Gaborski T. R., Snyder J.L., Striemer C. C. et al. High-Performance Separation of Nanoparticles with Ultrathin Porous Nanocrystalline Silicon Membranes // ACS Nano. 2010. Vol. 4. N 11. P. 6973-6981.

203. Fang D. Z., Striemer C. C., Gaborski T. R., McGrath J. L., Fauchet P.M. Methods for controlling the pore properties of ultra-thin nanocrystalline silicon membranes // J. Phys.: Condens. Matter. Vol. 22. N 45. P. 454134.

204. Baldessari F., Santiago J. G. Electrophoresis in nanochannels: brief review and speculation // Journal of Nanobiotechnology. 2006. Vol. 4. N 12. P. 1-6.

205. Stein D., van der Heyden F.H.J., Koopmans W.J.A., Dekker C. Pressure-driven transport of confined DNA polymers in fluidic channels // Proc. Natl. Acad. Sei. 2006. Vol. 103. P. 15853-15858.

206. Huang L.R., Cox E.C., Austin R.H., Sturm J.C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement // Science. 2004. Vol. 304. N 5673. P. 987-990.

207. Han J., Turner S.W., Craighead H.G. Entropie Trapping and Escape of Long DNA Molecules at Submicron Size Constriction // Phys. Rev. Lett. 1999. Vol. 83. N 8. P. 16881691.

208. Han J., Craighead H.G. Separation of Long DNA Molecules in a Microfabricated Entropie Trap Array // Science. 2000. Vol. 288. N 5468. P. 1026-1029.

209. Turner S.W.P., Cabodi M., Craighead H.G. Confinement-Induced Entropie Recoil of Single DNA Molecules in a Nanofluidic Structure // Phys. Rev. Lett. 2002. Vol. 88. N 12. P. 128103 (4p).

210. Levene M.J., Korlach J., Turner S.W., Foquet M., Craighead H.G., Webb W.W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations // Science. 2003. Vol. 299. N 5607. P. 682-686.

211. Fologea D., Gershow M., Ledden B., McNabb D. S., Golovchenko J. A., Li J. Detecting Single Stranded DNA with a Solid State Nanopore // Nanoletters. 2005. Vol. 5. N 10. P. 1905-1909.

212. Bezuidenhout L.W., Nazemifard N., Jemere A. B., Harrison D. J., Brett M. J. Microchannels filled with diverse micro- and nanostructures fabricated by glancing angle deposition // Lab Chip. 2011. N11. P. 1671-1678.

213. Prakash S., Piruska A., Gatimu E. N.et al. Nanofluidics: Systems and Applications // IEEE Sensors Journal. 2008. Vol. 8. N 5. P. 441-450.

214. Napoli M., Eijkel J.C., Pennathur S. Nanofluidic technology for biomolecule applications: a critical review // Lab Chip. 2010. Vol. 10. N 8. P. 957-985.

215. Gardeniers H.J.E. Chemistry in nanochannel confinement // Anal. Bioanal. Che. 2009. N 394. P. 385-397.

216. Schjch R.B., Yan J., Renaud P. Transport phenomena in nanofluidics // Reviews of Modern Physics. 2008. N 80. P. 839-883.

217. Stavis S.M., Edel J. B., Samiee K.T., Craighead H.G. Single molecule studies of quantum dot conjugates in a submicrometer fluidic channel // Lab on a Chip. 2005. N 5. P. 337-343.

218. Boeneman K., Prasuhn D. E., Melinger J. S. et al. Quantum dots as a FRET donor and nanoscaffold for multivalent DNA photonic wires // Proc. SPIE. 2011. Vol. 7909. P. 79090R.

219. Medintz I. L., Mattoussi H., Clapp A. R. Potential clinical applications of quantum dots // Int. J. Nanomedicine. 2008. Vol. 3. N 2. P. 151-167.

220. Patolsky F., Timko B.P., Zheng G., Lieber C.M. Nanowire-Based Nanoelectronic Devices in the Life Sciences // MRS Bull. 2007. N 32. P. 142-149.

221. Lieber C.M., Wang Z.L. Functional Nanowires // MRS Bull. 2007. N 32. P. 99-104.

222. Yu G., Lieber C. M. Assembly and integration of semiconductor nanowires for functional nanosystems // Pure Appl. Chem. 2010. Vol. 82. N 12. P. 2295-2314.

223. Timko B.P., Cohen-Karni T., Qing Q., Tian B., Lieber C.M. Design and implementation of functional nanoelectronic interfaces with biomolecules, cells and tissue using nanowire device arrays // IEEE Trans. Nanotechnol. 2010. N 9. P. 269-280.

224. Kotov N.A., Winter J.O., Clements I.P. et al. Nanomaterials for neural interfaces // Adv. Mater. 2009. N 21. P. 3970-4004.

225. Dutta P., Morse J. A review of nanofluidic patents // Recent Pat Nanotechnol. 2008. Vol. 2. N 3. P. 150-159.

226. Kersaudy-Kerhoas M., Dhariwal R., Desmulliez MP.Y. Recent advances in microparticle continuous separation // IETNanobiotechnol. 2008. Vol. 2. N l.P. 1-13.

227. Handbook of capillary and microchip technology and associated microtechniques / Ed. J.P. Landers. CRC Press, Taylor and Francis Group. Boca Raton. 2008. 1598 p.

228. Gascoyne P.R.C., Vykoukal J. Particle separation by dielectrophoresis // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 13. P. 1973-1983.

229. Hughes M.P. Strategies for dielectrophoretic separation in laboratory-on-a-chip systems // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 16. P. 2569-2582.

230. Durr M., Kentsch J., Miiller T., Schnelle T., Stelzle M. Microdevices for manipulation and accumulation of micro- and nanoparticles by dielectrophoresis // Electrophoresis. 2003. Vol. 24. N4. P. 722-731.

231. Li Y., Kaler K. V. I. S. Dielectrophoretic fluidic cell fractionation system // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 507. N 1. P. 151-161.

232. Jones T.B. Electromechnics of particles. Cambridge University Press, Cambridge, UK. 1996. 285 p.

233. Huang Y., Ewalt K.L., Tirado M. et al. Electric Manipulation of Bioparticles and Macromolecules on Microfabricated Electrodes // Anal Chem. 2001. Vol. 73. N 7. P. 15491559.

234. Yang J., Huang Y., Wang X.B., Becker F.F., Gascoyne P.R.C. Cell Separation on Microfabricated Electrodes Using Dielectrophoretic/Gravitational Field-Flow Fractionation // Anal Chem. 1999. Vol. 71. N 5. P. 911-918.

235. Yang J., Huang Y., Wang X.B., Becker F.F, Gascoyne P.R.C. Differential Analysis of Human Leukocytes by Dielectrophoretic Field-Flow-Fractionation // Biophys J. 2000. Vol. 78. N5. P. 2680-2689.

236. Yamada M., Nakashima M., Seki M. Pinched flow fractionation: continuous size separation of particles utilizing a laminar flow profile in a pinched microchannel // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. N 18. P. 5465-5471.

237. Yamada M., Seki M. Hydrodynamic filtration for on-chip particle concentration and classification utilizing microfluidics // Lab Chip. 2005. N 5. P. 1233-1239.

238. Takagi J., Yasuda M., Yamada M., Seki M. Continuous particle separation in a microchannel having asymmetrically arranged multiple branches // Lab Chip. 2005. N 5. P. 778-784.

239. Morijiri T., Sunahiro S., Senaha M., Yamada M., Seki M. Sedimentation pinched-flow fractionation for size- and density-based particle sorting in microchannels // Microfluid Nanofluid. 2011. N 11. P. 105-110.

240. Vig A.L., Kristensen A. Separation enhancement in pinched flow fractionation // Appl. Phys. Lett. 2008. Vol. 93. N 20. P. 203507.

241. Davis J. A., Inglis D.W., Morton K. J., Lawrence D. A., Huang L. R., Chou S. Y., Sturm J. C., Austin R. H. Deterministic hydrodynamics: Taking blood apart // PNAS. 2006. Vol. 103. N40. P. 14779-14784.

242. Edwards T.L., Gale B. K., Frazier A. B. A Microfabricated Thermal Field-Flow Fractionation System // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. N 6. P. 1211-1216.

243. Kapishnikov S., Kantsler V., Steinberg V. Continuous particle size separation and size sorting using ultrasound in a microchannel // J. Stat. Mech. 2006. Vol. 2006. N 1. P. 1-15.

244. Nilsson A, Petersson F, Jönsson H, Laurell T. Acoustic control of suspended particles in micro fluidic chips // Lab Chip. 2004. Vol. 4. N 2. P. 131-135.

245. Wiklund M., Günther C., Lemor R., Jäger M., Fuhr G., Hertz H. M. Ultrasonic standing wave manipulation technology integrated into a dielectrophoretic chip // Lab Chip. 2006. Vol. 6.N 12. P. 1537-1544.

246. Ravulaa S. K., Brancha D. W., Jamesa C. D. et al. A microfluidic system combining acoustic and dielectrophoretic particle preconcentration and focusing // Sensors and Actuators B: Chem. 2008. Vol. 130. N 2. P. 645-652.

247. Verpoorte E. Microfluidic chips for clinical and forensic analysis // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N5. P. 677-712.

248. Landers, J.P. Molecular Diagnostic Analysis Using Electrophoretic Microchips //Anal. Chem. 2003. Vol. 75. N 12. P. 2919-2927.

249. Carey L., Mitnik L. Trends in DNA forensic analysis // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 10. P. 1386-1397.

250. Wua D., Qin J., Lin B. Electrophoretic separations on microfluidic chips // Journal of Chromatography A. 2008. Vol. 1184. N 1-2. P. 542-559.

251. Fritzsche S., Hoffmann P., Beider D. Chip electrophoresis with mass spectrometric detection in record speed // Lab Chip. 2010. Vol. 10. N 10. P. 1227 1230.

252. Pinto D.M., Ning Y., Figeys D. An enhanced microfluidic chip coupled to an electrospray Qstar mass spectrometer for protein identification // Electrophoresis. 2000. Vol. 21. N 1. P. 181-190.

253. Koster S, Verpoorte E. A decade of microfluidic analysis coupled with electrospray mass spectrometry: an overview // Lab Chip. 2007. Vol. 7. N 11. P. 1394-1412.

254. Kolchinsky A., Mirzabekov A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips // Hum. Mutat. 2002. N 19. P. 343-360.

255. Figeys D., Pinto D Lab-on-a-chip: A revolution in biological and medical sciences // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. N 9. P. 330A-335A.

256. Reyes D. R., lossifidis D., Auroux P. A, Manz A. Micro Total Analysis Systems // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 2637-2652.

257. Paegel B.M., Blazej R. G., Mathies R. A. Microfluidic devices for DNA sequencing: sample preparation and electrophoretic analysis // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. N 14. P. 42-50.

258. Woolley A.T., Mathes R.A. Ultra-high-speed DNA fragment separations using microfabricated capillary array electrophoresis chips // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. Vol. 91. P. 11348-11352.

259. Effenhauser C.S., Paulus A., Manz A., Widmer H.M. High-Speed Separation of Antisense Oligonucleotides on a Micromachined Capillary Electrophoresis Device // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. N 18. P. 2949-2953.

260. Barbier V., Viovy J.L. Advanced polymers for DNA separation // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. Vol. 14. N l.P. 51-57.

261. Cretich M., Chiari M., Rech I., Cova S. Use of high-molecular-mass polyacrylamides as matrices for microchip electrophoresis of DNA fragments // Electrophoresis. 2003. Vol. 24. N21. P. 3793-3799.

262. Xu F., Jabasini M., Liu S., Baba Y. Reduced viscosity polymer matrices for microchip electrophoresis of double-stranded DNA // Analyst. 2003. Vol. 128. N 6. P. 589-592.

263. Tian H., Brody L.C., Mao D., Landers J.P. Effective capillary electrophoresis-based heteroduplex analysis through optimization of surface coating and polymer networks // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. N 21. P. 5483-5492.

264. Munro N.J., Huhmer A.F.R., Landers J.P. Robust polymeric microchannel coatings for microchipbased analysis of neat PCR products // Anal. Chem. 2001. Vol. 75. N 8. P. 17841794.

265. Ugaz, V. M., Brahmasandra, S. N., Burke, D. T., Burns, M. A. Cross-linked polyacrylamide gel electrophoresis of single-stranded DNA for microfabricated genomic analysis systems // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 10. P. 1450-1459.

266. Ugaz V. M., Lin R., Srivastava N., Burke D. T., Burns M. A. A versatile microfabricated platform for electrophoresis of double- and single- stranded DNA // Electrophoresis 2003. Vol. 24. N 1-2. P. 151-157.

267. Liu S. R., Shi Y. N. Ja, W. W., Mathies R. A. Optimization of High-Speed DNA Sequencing on Microfabricated Capillary Electrophoresis Channels // Anal. Chem. 1999. Vol. 71. N3. P. 566-573.

268. Liu S., Ren H., Gao Q., Roach D. J. et al. Automated parallel DNA sequencing on multiple channel microchips // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. N 10. P. 5369-5374.

269. Paegel B. M., Emrich C. A.,Wedemayer G. J., Scherer J. R., Mathies R. A. High throughput DNA sequencing with a microfabricated 96-lane capillary array electrophoresis bioprocessor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. N 2. P. 574-579.

270. Sedgwick H., Caron F., Monaghan P.B., Kolch W., Cooper J.M. Lab-on-a-chip technologies for proteomic analysis from isolated cells // J. R. Soc. Interface. 2008. N 5. P. S123-S130.

271. Effenhauser C.S., Bruin G.J.M., Paulus A. Integrated chip-based capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1997. Vol. 18. N 12-13. P. 2203-2213.

272. Colyer C.L., Mangru S.D., Harrison D.J. Microchip-based capillary electrophoresis of human serum proteins // J. Chromatogr A. 1997. N 781. P. 271-276.

273. Liu J., Lee M.L. Permanent surface modification of polymeric capillary electrophoresis microchips for protein and peptide analysis // Electrophoresis. 2006. Vol. 27. N 18. P. 35333546.

274. Han J., Singh A.K. Rapid protein separations in ultra-short microchannels: microchip sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing // J. Chromatogr A. 2004. N 1049. P. 205-209.

275. Herr A.E., Molho J.I., Drouvalakis K.A., Mikkelsen J.C., Utz P.J., Santiago J.G., Kenny T.W. On-chip coupling of isoelectric focusing and free solution electrophoresis for multidimensional separations // Anal Chem. 2003. Vol. 75. N 2. P. 1180-1187.

276. Sommer G.J., Singh A.K., Hatch A.V. On-Chip Isoelectric Focusing Using Photopolymerized Immobilized pH Gradients // Anal. Chem. 2008. Vol. 80. N 9. P. 33273333.

277. Reichmuth D.S., Shepodd T.J., Kirby B.J. Microchip HPLC of Peptides and Proteins // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. N 9. P. 2997-3000.

278. Hou C., Herr A. E. Clinically relevant advances in on-chip affinity-based electrophoresis and electrochromatography // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N16. P. 3306-3319.

279. Throckmorton D.J., Shepodd T.J., Singh A.K. Electrochromatography in microchips: reversed-phase separation of peptides and amino acids using photopatterned rigid polymer monoliths // Anal Chem. 2002. Vol. 74. N 4. P. 784-789.

280. Hatch A.V., Herr A.E., Throckmorton D.J., Brennan J.S., Singh A.K. Integrated preconcentration SDS-PAGE of proteins in microchips using photopatterned cross-linked polyacrylamide gels // Anal Chem. 2006. Vol. 78. N 14. P. 4976-4984.

281. Wang Y.C., Choi M.H., Han J. Two-dimensional protein separation with advanced sample and buffer isolation using microfluidic valves // Anal Chem. 2004. Vol. 76. N 15. P. 44264431.

282. Emrich C.A., Medintz I.L., Chu W.K., Mathies R.A. Microfabricated two dimensional electrophoresis device for differential protein expression profiling // Anal Chem. 2007. Vol. 79. N 19. P. 7360-7366.

283. Zhang H., Zhao Q., Li X.-F., Le X. C. Ultrasensitive assays for proteins // Analyst. 2007. Vol. 132. N 8. P. 724 737.

284. Bedair M., Oleschuk R.D. Lectin affinity chromatography using porous polymer monolith assisted nanoelectrospray MS/MS // Analyst. 2006. Vol. 131. N 12. P. 1316-1321.

285. Chovan T., Guttman A. Microfabricated devices in biotechnology and biochemical processing // Trends Biotechnol. 2002. N 20. 116-122.

286. Kameoka J., Craighead H.G., Zhang H., Henion J. A polymeric microfluidic chip for CE MS determination of small molecules // Anal Chem. 2001. Vol. 73. N 9. P. 1935-1941.

287. Wang J. On-chip enzymatic assays // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 5. P. 713-718.

288. Ristenpart W. D., Wan J., Stone H. A. Enzymatic Reactions in Microfluidic Devices: Michaelis-Menten Kinetics //Anal. Chem. 2008. Vol. 80. N 9. P. 3270-3276.

289. Lee C.-C., Snyder T. M., Quake S. R. A microfluidic oligonucleotide synthesizer // Nucleic Acids Research. 2010. Vol. 38. N 8. P. 2514-2521.

290. Martinez A. W., Phillips S. T., Whitesides G. M. Diagnostics for the Developing World: Microfluidic Paper-Based Analytical Devices // Anal. Chem. 2010. Vol. 82. N 1. P. 3-10.

291. Lu Y., Shi W., Qin J., Lin B. Fabrication and Characterization of Paper-Based Microfluidics Prepared in Nitrocellulose Membrane By Wax Printing // Anal. Chem. 2010. Vol. 82. N 1. P. 329-335.

292. Nie Z., Nijhuis C. A., Gong J., Chen X. et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices // Lab Chip. 2010. Vol. 10. N 4. P. 477 483.

293. Martinez A. W., Phillips S. Т., Wiley B. J., Gupta M., Whitesides G.M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices // Lab Chip. 2008. Vol. 8. N 12. P. 2146-2150.

294. Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Ed.: Ian M. Mackay. Caister Academic Press. 2007. 454 p.

295. Kaltenboeck В., Wang C. Advances in Real-Time PCR: Application to Clinical Laboratory diagnostics // Advances in Clinical Chemistry. 2005. N 40. P. 220-259.

296. Zhang C., Xing D. Miniaturized PCR chips for nucleic acid amplification and analysis: latest advances and future trends // Nucleic Acids Research. 2007. Vol. 35. N 13. P. 42234237.

297. Ong S.-E., Zhang S., Du H., Fu Y. Fundamental principles and applications of microfluidic systems // Frontiers in Bioscience. 2008. N 13. P. 2757-2773.

298. Erill I., Campoy S., Rus J., Fonseca L. et al. Development of a CMOS-compatible PCR chip: comparison of design and system strategies // J. Micromech. Microeng. 2004. N 14. P. 1558-1568

299. Gulliksen A., Solli L., Karlsen F., Rogne H., Hovig E., Nordstrom Т., Sirevag R. Real-time nucleic acid sequence based amplification in nanoliter volumes // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. N 1. P. 9-14.

300. Matsubara Y., Kerman K., Kobayashi M., Yamanura S., Morita Y., Tamiya E. Microchamber array based DNA quantification and specific sequence detection from a single copy via PCR in nanoliter volumes // Biosens. Bioelectron. 2005. N 20. P. 1482-1490.

301. Nagai H., Murakami Y., Morita Y., Yokoyama K., Tamiya E. Development of a microchamber array for picoliter PCR // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. N 5. P. 1043-1047.

302. Zou Q., Miao Y., Chen Y., Sridhar U. et al. Micro-assembled multi-chamber thermal cycler for low-cost reaction chip thermal multiplexing // Sens. Actuators A Phys. 2002. N 102. P. 114-121.

303. Dahl A., Sultan M., Jung A., Schwartz R., Lange M., Steinwand M., Livak K.J., Lehrach H., Nyarsik L. Quantitative PCR based expression analysis on a nanoliter scale using polymer nano-well chips // Biomed Microdevices. 2007. N 9. P. 307-314.

304. Morrison Т., Hurley J., Garcia J., Yoder K., Katz A., Roberts D., Cho J., Kanigan Т., Ilyin S. E., Horowitz D., Dixon J. M., Brenan C. J.H. Nanoliter high throughput quantitative PCR //Nucleic Acids Researc. 2006. Vol. 34. N 18. P. el23.

305. Сляднев M.H., Казаков В.А., Лаврова M.B., Танеев А.А., Москвин JI.H. Микрочиповая мультиреакторная система для биохимического анализа// Научное приборостроение. 2005. Т. 15. №2. С. 41-50.

306. Наволоцкий Д. В., Крисько А. В., Арнаутов В. А., Гейбо Д. С., Танеев А. А., Сляднев М. Н. Мультиплексная аналитическая система для определения ДНК методом ПЦР в реальном времени// Научное Приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 10-20.

307. Neuzil,P., Zhang C.Y., Pipper J., Oh S., Zhuo L. Ultra fast miniaturized real-time PCR: 40 cycles in less than six minutes // Nucleic Acids Res. 2006. N 34. P. e77.

308. Nakano H., Matsuda K., Yohda M., Nagamune T., Endo I., Yamane T. High-speed polymerase chain reaction in constant flow // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. N 58. P. 349-352.

309. Kopp M.U., de Mello A.J. and Manz A. Chemical amplification: continuous-flow PCR on a chip // Science. 1998. Vol. 280. N 5356. P. 1046-1048.

310. Hashimoto M., Chen P.C., Mitchell M.W., Nikitopoulos D.E., Soper S.A., Murphy M.C. Rapid PCR in a continuous flow device // Lab Chip. 2004. Vol. 4. N 6. P. 638-645.

311. Liu H-B., Gong H.-Q., Ramalingam N., Jiang Y., Dai C.-C., Hui K. M. Micro air bubble formation and its control during polymerase chain reaction (PCR) in polydimethylsiloxane (PDMS) microreactors // J. Micromech. Microeng. 2007. N 17. P. 2055-2064.

312. Gong H., Ramalingam N., Chen L., Che J. et al. Microfluidic handling of PCR solution and DNA amplification on a reaction chamber array biochip // Biomed Microdevices. 2006. Vol. 8. N2. P. 167-176.

313. Wang W., Li Z.X., Luo R„ Lu S.H., Xu A.D., Yang Y.J. Droplet-based micro oscillating-flow PCR chip // J. Micromech. Microeng. 2005. N 15. P. 1369-1377.

314. Zou Z.Q., Chen X., Jin Q.H., Yang M.S., Zhao J.L. A novel miniaturized PCR multi-reactor array fabricated using flip-chip bonding techniques // J. Micromech. Microeng. 2005. N 15. P. 1476-1481.

315. Oh K.W., Park C„ Namkoong K„ Kim J., Ock K.S., Kim S„ Kim Y.A., Cho Y.K., Ko C. World-to-chip microfluidic interface with built-in valves for multichamber chip-based PCR assays // Lab Chip. 2005. Vol. 5. N 8. P. 845-850.

316. Cho Y.K., Kim J., Lee Y., Kim Y.A. et al. Clinical evaluation of microscale chip-based PCR system for rapid detection of hepatitis B virus // Biosens. Bioelectron. 2006. Vol. 21. P. 2161-2169.

317. Prakash R., Kaler K.V.I. An integrated genetic analysis microfluidic platform with valves and a PCR chip reusability method to avoid contamination // Microfluid. Nanofluid. 2007. N 3.P. 177-187.

318. Legendre L.A., Bienvenue J.M., Roper M.G., Ferrance J.P., Landers J.P. A simple, valveless microfluidic sample preparation device for extraction and amplification of DNA from nanoliter-volume samples // Anal. Chem. 2006. Vol. 78. N 5. P. 1444-1451.

319. Liu C.N., Toriello N.M., Mathies R.A. Multichannel PCR-CE microdevice for genetic analysis // Anal. Chem. 2006. Vol. 78. N 15. P. 5474-5479.

320. Lee J.G., Cheong K.H., Huh N., Kim S., Choi J.W. Microchip-based one step DNA extraction and real-time PCR in one chamber for rapid pathogen identification // Lab Chip. 2006. Vol. 6. N7. P. 886-895.

321. Marcus J.S., Anderson W.F., Quake S.R. Parallel picoliter RT-PCR assays using microfluidics // Anal. Chem. 2006. Vol. 78. N 3. P. 956-958.

322. Easley C.J., Karlinsey J.M., Landers J.P. On-chip pressure injection for integration of infrared-mediated DNA amplification with electrophoretic separation // Lab Chip. 2006. Vol. 6. N5. P. 601-610.

323. Beer N.R., Hindson B.J., Wheeler E.K., Hall S.B. et al. On-chip, real-time, single-copy polymerase chain reaction in picoliter droplets // Anal Chem. 2007. Vol. 79. N 22. P. 84718475.

324. Huang F.C., Liao C.S., Lee G.B. An integrated microfluidic chip for DNA/RNA amplification, electrophoresis separation and on-line optical detection // Electrophoresis. 2006. Vol. 27. N 16. P. 3297-3305.

325. Shen F., Du W., Kreutz J. E., Fok A., Ismagilov R. F. Digital PCR on a SlipChip // Lab Chip. 2010. Vol. 10. N 20. P. 2666-2672.

326. Dube S., Qin J., Ramakrishnan R. Matematical Analysis of Copy Number Variation in DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device // PLoS ONE. 2008. Vol. 3. N 8. P. e2876.

327. White III R. A., Blainey P. C., Fan H. C., Quake S. R. Digital PCR provides sensitive and absolute calibration for high throughput sequencing // BMC Genomics. 2009. Vol. 10. N 116. P. 1-12.368.http://www.fluidigm.com/biomark-system.html

328. Chabinyc M.L., Chiu D.T., McDonald J.C., Stroock A.D., Christian J.F., Karger A.M., Whitesides G.M. An integrated fluorescence detection system in poly(dimethylsiloxane) for microfluidic applications // Anal Chem. 2001. Vol. 73. N 18. P. 4491-498.

329. Lee H.G., Kumar K.S., Soh J.-R., Cha Y.-S., Kang S.H. Ultra-fast simultaneous detection of obesity-related coenzymes in mice using microchip electrophoresis with a LIF detector // Anal. Chim. Acta. 2008. Vol. 619. N 1. P. 94-100.

330. Kulmala S., Suomi J. Current status of modern analytical luminescence methods // Analytica Chimica Acta. 2003. Vol. 500. P. 21-69.

331. WoolleyA. T., Lao K., Glazer A. N., Mathies R. A. Capillary Electrophoresis Chips with Integrated Electrochemical Detection // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. N 4. P. 684-688.

332. Galloway M., Stryjewski W., Henry A., Ford S. M. et al. Contact Conductivity Detection in Poly(methyl methacylate)-Based Microfluidic Devices for Analysis of Mono- and Polyanionic Molecules // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. N 10. P. 2407-2417.

333. Galloway M., Soper S. A. Contact conductivity detection of polymerase chain reaction products analyzed by reverse-phase ion pair microcapillary electrochromatography // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 21. P. 3760-3768.

334. Pumera M., Merkoce A., Alegret S. Microchip electrophoresis with wall-jet electrochemical detector: Influence of detection potential upon resolution of solutes // Electrophoresis. 2006. Vol. 27. N 24. P. 5068-5072.

335. Vazquez M., Frankenfeld C., Coltro W. K. T., Carrilho E., Diamond D., Lunte S. M. Dual contactless conductivity and amperometric detection on hybrid PDMS/glass electrophoresis microchips//Analyst. 2010. Vol. 135. N 1. P. 96 103.

336. Limbach P. A., Meng Z. Integrating micromachined devices with modern mass spectrometry // Analyst. 2002. Vol. 127. N 6. P. 693-700.

337. Walker P. A., Morris M. D., Burns M. A., Johnson B. N. Isotachophoretic Separations on a Microchip. Normal Raman Spectroscopy Detection // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. N 18. P. 3766-3769.

338. Swinney K., Markov D., Bornhop D. J. Chip-Scale Universal Detection Based on Backscatter Interferometry // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. N 13. P. 2690-2695.

339. Viskari P.J., Landers J.P. Unconventional detection methods for microfluidic devices // Electrophoresis. 2006. Vol. 27. N 9. P. 1797-1810.

340. Johnson M.E., Landers J.P. Fundamentals and practice for ultrasensitive laser-induced fluorescence detection in microanalytical systems // Electrophoresis. 2004. Vol. 25. N 2122. P. 3513-27.

341. Uchiyama K., Nakajima H., Hobo T. Detection methods for microchip separations // Anal. Bioanal. Chem. 2004. Vol. 379. N 3. P. 375-382.

342. Tanret I., Mangelings D., Heyden Y. V. Detection Systems for Microfluidic Devices with a Major Focus on Pharmaceutical and Chiral Analysis // Current Pharmaceutical Analysis.2009. Vol. 5. N2. P. 101-111.

343. Schulze P., Belder D. Label-free fluorescence detection in capillary and microchip electrophoresis // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2009. Vol. 393. N 2. Р/ 16182642.

344. Nilsson J., Evander M., Hammarstrom В., Laurell T. Review of cell and particle trapping in microfluidic systems // Analytica Chimica Acta. 2009. Vol. 649. N2. P. 141-157.

345. Radisic M., Iyer R. K., Murthy S. K. Micro- and nanotechnology in cell separation // International Journal of Nanomedicine. 2006. Vol. 1. N 1. P. 3 -14.

346. Ebner A., Madl J., Kienberger F., Chtcheglova L. A., Puntheeranurak Т., Zhu R., Tang J., Gruber H. J., Schetz G. J., Hinterdorfer P. Single Molecule Force Microscopy on Cells and Biological Membranes // Current Nanoscience, 2007. N 3. P. 49-56.

347. Ryu W.H., Huang Z., Park J. S., Moseley J., Grossman A. R., Fasching R. J., Prinz F. B. Open micro-fluidic system for atomic force microscopy-guided in situ electrochemical probing of a single cell // Lab Chip. 2008. Vol. 8. N 9. P. 1460-1467.

348. Miksik I., Sedlakova P., Mikulikova K., Eckhardt A., Cserhati Т., Horvath T. Matrices for capillary gel electrophoresis—a brief overview of uncommon gels // Biomed. Chromatogr. 2006. N 20. P. 458^165.

349. Li D. Electrokinetics in Microfluidics. Elsevier, Amsterdam. 2004. 643 p.

350. Yao S., Santiago J. G. Porous glass electroosmotic pumps: theory // Journal of colloid and interface science. 2003. Vol. 268. N1. P. 133-142.

351. Руководство по капиллярному электрофорезу / Под ред. ВолошукаА.М. М.: Медицина. 1996. 111 с.

352. Rise C.L., Whitehead R. Electrokinetic flow in narrow cylindrical capillary // J. Phys. Chem. 1965. Vol. 69. N 11. P. 4017-4024.

353. Bruus H. Theoretical microfluidics. NY: Oxford Univer. Press. 2008. 363 p.

354. Albarghouthi M.N., Barron A.E. Polymeric matrices for DNA sequencing by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2000. Vol. 21. N 18. P. 4096-4111.

355. Luckey J. A., Norris T.B., Smith L. M. Analysis of Resolution in DNA Sequencing by Capillary Gel-Electrophoresis // J. Phys. Chem. 1993. Vol. 97. N 12. P. 3067-3075.

356. Jacobson S. C., Hergenroder R., Koutny L.B., Warmack R. J., Ramsey J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. N 7. P. 1107-1113.

357. Wang Y., Lin Q., Mukherjee T. Composable Behavioral Models and Schematic-Based Simulation of Electrokinetic Lab-on-a-Chip Systems // IEEE Transactions on Computer-Aided Design of Integrated Circuits and Systems. 2006. Vol. 25. N 2. P. 258-273.

358. Электрофорез белков и пептидов в полиакриламидном геле // Методическая разработка. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова: Биологический Факультет Кафедра Биоинженерии. 2007. 15 с.

359. Rodbard D., Chrambach A. Unified Theory for Gel Electrophoresis and Gel Filtration // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1970. Vol. 65. N 4. P. 970-977.

360. Karger B.L., Cohen A.S., Guttman A. High performance capillary electrophoresis in the biological sciences // J. Chromatogr. 1989. Vol. 492. P. 585-614.414.http://www8.nau.edu/chem/OnlineCourseMaterial/Ingram/CHM%20620%20Spring%2007/ CE tutorial.pdf

361. Jacobson S.C., Ermakov S.V., Ramsey J.M. Minimizing the Number of Voltage Sources and Fluid Reservoirs for Electrokinetic Valving in Microfluidic Devices // Anal. Chem. 1999. Vol. 71. N 15. P. 3273-3276.

362. Fu L.-M., Yang R.-J., Lee G.-B., Liu H.-H. Electrokinetic injection techniques in microfluidic chips // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. N 19. P. 5084-5091.

363. Chang C.-L., Leong J.-C., Hong T.-F., Wang Y.-N., Fu L.-M. Experimental and Numerical Analysis of High-Resolution Injection Technique for Capillary Electrophoresis Microchip // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 3594-3605.

364. Melanson J. E., Boulet C. A., Lucy C. A. Indirect Laser-Induced Fluorescence Detection for Capillary Electrophoresis Using a Violet Diode Laser // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. N 8. P. 1809-1813.

365. Буляница А.Л., Курочкин В.Е. Оценивание необходимого числа точек наблюдения при построении линейных регрессионных моделей // Научное приборостроение. 2000. Т. 10. № 1.С. 25-34.

366. Евстрапов А.А. Фотометрические детекторы иммунного и химического экспресс-анализа: Дисс. . канд. техн. наук. С.Пб., ИАнП РАН, 1994. 217 с.

367. Миронов А. А., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. СПб.: Наука. 1994. 400 с.

368. Beckmann М., Kolb Н.А., Lang F. Atomic force microscopy of peritoneal macrophages after particle phagocytosis // Membrane Biology. 1994. Vol. 140. P. 197 204.

369. Dufrene Y.F. Application of atomic force microscopy to microbial surfaces: from reconstituted cell surface layers to living cells // Micron. 2001. N 32. P. 153-165.

370. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Теоретическая физика: т. VI Гидродинамика. Москва: Наука. 1988. 736 с.

371. Fuhr G., Arnold W.M., Hagedorn R., Muller Т., Benecke W. et al. Levitation, holding, and rotation of cells within traps made by high-frequency fields // Biochim. 1992. N 140. P. 79102.

372. Voldman J., Braff R.A., Toner M., Gray M.L., Schmidt M.A. Holding forces, of single-particle dielectrophoretic traps // Biophys. J. 2001. Vol. 80. P. 531-841.

373. Voldman J., Toner M., Gray M.L., Schmidt M.A. Design and analysis of extruded quadrupolar dielectrophoretic traps // J. Electrostat. 2003. N 57. P. 69-90.

374. Schnelle Т., Hagedorn R., Fuhr G., Fiedler S., Muller T. 3-Dimensional electric-field traps for manipulation of cells—calculation and experimental verification // Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1157. P. 127-140.

375. Catterall W.A. Structure and function of voltage-gated ion channels // Annu. Rev. Biochem. 1995. N64. P. 493-531.

376. Tsong T.Y. Molecular recognition and processing of periodic signals in cells: study of activation of membrane ATPases by alternating electric fields // Biochim. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1113. P. 53-70.

377. Zimmermann U. Electrical breakdown, electropermeabilization and electrofusion // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1986. Vol. 105. P. 175-256.

378. Mehrishi J.N, Bauer J. Electrophoresis of cells and the biological relevance of surface charge // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. N 13. P. 1984-1994.

379. Desai M.J, Armstrong D.W. Separation, identification, and characterization of microorganisms by capillary electrophoresis // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 38-51.

380. Ramos A., Morgan H., Green N. G. Ac electrokinetics: a review of forces in microelectrode structures //J. Phys. D. 1998. Vol. 31. P. 2338-2353.

381. Вильчинская С.С., Лисицын В.M. Оптические материалы и технологии. Томск: издательство Томского политехнического университета, 2011. 107 с.

382. Химическая энциклопедия: В 5 т. Редкол.: Клунянц И.Л. (гл. ред.) и др.- М.: Большая Российская энцикл.

383. Тупик A.H., Евстрапов A.A. Исследование движения потоков вещества в микрофлюидных чипах // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2007. № 44. С. 165-169.

384. Никоноров H.В. Влияние ионообменной обработки на физико- химические свойства поверхности стекол и волноводов // Физика и химия стекла. 1999. Т. 25. №3. С. 271308.

385. Справочник Шпрингера по нанотехнолгиям // под ред. Б. Бхушана. Том 1. М.: Техносфера, 2010. 864 с.451 .http://www.integral.by/

386. Abgrall P., Gue А-М. Lab-on-chip technologies: making a microfluidic network and coupling it into a complete microsystem—a review // J. Micromech. Microeng. 2007. 17. R15-R49.

387. Абаев H.И, Лисицин Ю.В., Путилин Э.С. Исследование зоны оптического контакта стеклянных поверхностей методом эллипсометрии // Письма в ЖТФ. 1984. Т. 4. № 24. С. 1505-1507.

388. Когезия и адгезия горячего стекла / Под ред. К.С. Евстропьева. М.: Машиностроение, 1969. 175 с.

389. Артамонова М.В., Рабухин А.И., Савельев В.Г. Электронное строение и свойства силикатных и других тугоплавких материалов: Учебное пособие. М.: МХТИ им Д.И. Менделеева, 1989. 84 с.

390. Лисицын Ю.В., Торбин И.Д. Соединение оптических элементов: Учебное пособие / Межотраслевой институт повышения квалификации кадров по новым направлениям развития техники и технологии при Лен. ин-те точной мех. и оптики, 1989. 40 с.

391. Тонкая техническая керамика / Под. ред. X. Янагида. М.: Металлургиздат, 1986. 280 с.

392. Справочник технолога-оптика: Справочник. 2-е изд. / Под ред. М.А. Окатова. СПб.: Политехника. 2004. 680 с.

393. Оптическое стекло СССР-ГДР. Каталог. М.: Машприбор, 1977. 875 С.

394. Справочник химика. Т.5. Под ред. Б.П. Никольского. М.-Л.: Химия, 1966. 974 С.

395. Евстрапов А.А., Мухин И.С., Кухтевич И.В., Букатин А.С. Метод сфокусированного ионного пучка при формировании наноразмерных структур в микрофлюидных чипах// Письма в ЖТФ. 2011. Т. 37. № 20. С. 32-40.

396. Волков С.С. Сварка и склеивание полимерных материалов. М.: Химия, 2001. 376 с.463.www.mona.ru

397. Кулезнев В.Н., Шершнев В.А. Химия и физика полимеров. М.: Высшая школа, 1988. 312 с.

398. Riegger L., Strohmeier О., Faltin В., Zengerle R., Koltay P. Adhesive bonding of microfluidic chips: influence of process parameters // J. Micromech. Microeng. 2010. Vol. 20. P. 087003 (5p)

399. Марек О., Томка M. Акриловые полимеры. М.: Химия, 1966. 318 с.

400. Евстрапов А. А., Лукашенко Т. А., Тупик А. Н. Применение фотоотверждаемых оптических клеев для герметизации аналитических микрочипов // Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 29-38.

401. Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Рудницкая Г.Е., Лукашенко Т.А., Тупик А.Н., Цымбалов А.И. Разработка микрочиповых устройств для проведения ПЦР в геле // Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 4. С. 127-131.

402. Анисимов С.И., Лукьянчук Б.С. Избранные задачи теории лазерной абляции // УФН.2004. Т. 172. №36. С. 301-330.

403. Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Горный С.Г., Юдин К.В. Микрофлюидные чипы из полиметилметакрилата: метод лазерной абляции и термического связывания // Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 72-81.473 .http://www.laser-design.ru/

404. Поздняков А.О., Гинзбург Б.М., Маричева Т.А., Кудрявцев В.В., Поздняков О.Ф. Термостимулированная десорбция фуллеренов Сбо и С70 из пленок жесткоцепного полиимида // ФТТ. 2004. Т. 46. № 7. С. 1328-1332.

405. Brannon J.H., Lankard J.R. Pulsed CO2 laser etching of polyimide // Appl. Phys. Lett. 1986. Vol. 48. N 18. P. 1226-1228.

406. Pozdnyakov A.O., Kudryavtsev V.V., Friedrich K. Sliding wear of polyimide-C60 coatings // Wear. 2003. Vol. 254. P. 501-513.

407. Евстрапов A.A., Поздняков A.O., Горный С.Г., Юдин К.В. Формирование края микроразмерного канала в полиимидах методом лазерной абляции // Письма в ЖТФ.2005. Т. 31. № 13. С. 10-17.

408. Беленький Б.Г., Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Суханов В.Л., Буляница А.Л., Поздняков О.Ф. Микрофлюидная аналитическая система с детектором лазер-индуцированной флуоресценции // Аллергология и иммунология. 2000. Т. 1. № 3. С. 101-102.

409. Huang X., Gordon M.Y., Zare R.N. Current-monitoring method for measuring the electroosmotic flow rate in capillary zone electrophoresis // Anal. Chem. 1988. Vol. 60. P. 1837-1838.

410. Евстрапов А.А., Тупик A.H. Обработка поверхности стеклянных микрочипов после анализа биологических проб // Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики. 2009. № 4. С. 42-47.

411. Yu X., Kim S. N., Papadimitrakopoulos F., Rusling J.F. Protein immunosensor using singlewall carbon nanotube forests with electrochemical detection of enzyme labels // Mol. BioSyst. 2005. 1. 70-78;

412. Patolsky F., Lieber С. M. Nanowire nanosensors // Materials Today. April 2005. P. 20-28.

413. Patolsky F., Zheng G., Hayden O., Lakadamyali M., Zhuang X., Lieber Ch. Electrical detection of single viruses // Proceedings of National Academy of Science. 2004. Vol. 101. N39. P. 14017-14022.

414. Meijers R., Richter Т., Calarco R., Stoica Т., Bochem H.-P., Mapso M., Luth H. GaN-nanowhiskers: MBE-growth conditions and optical properties // J. Crystal Growth. 2006. Vol. 289. N 1. P. 381-386.

415. Wu R. Morphological characteristic of Zn/ZnO nanowelers and the optical properties// Materials Science and Engineering. 2006. Vol. 328. N 1-2. P. 196-200.

416. Lin Y., Wu G. S., Yuan X. Y., Xie Т., Zhang L. D. Fabrication and optical properties of ТЮ2 nanowire arrays made by sol-gel electrophoresis deposition into anodic alumina membranesM // J. Phys.: Condens. Matter . 2003. Vol. 15. N 17. P. 2917.

417. Tsakalakos L., Balch J., Fronheiser J., Shih M.-Y. et al. Strong broadband optical absorption in silicon nanowire films // J. Nanophotonics. 2007. Vol. 1. P. 013552. 1-10

418. Lysov A., Offer M., Gutsche C., Regolin I., Topaloglu S., Geller M., Prost W., Tegude F-J. Optical properties of heavily doped GaAs nanowires and electroluminescent nanowire structures // Nanotechnology. 2011. Vol. 22. N 8. P. 085702.

419. Цырлин Г.Э., Дубровский В.Г., Сибирев Н.В., Сошников И.П. и др. Диффузионный механизм роста нановискеров в методе молекулярно-пучковой эпитаксии // Физика и техника полупроводников. 2005. Т. 39. № 5. С. 587-594.

420. Неучева О.А., Евстрапов A.A., Самсоненко Ю.Б., Цырлин Г.Э. Взаимодействие оптического излучения с массивом нитевидных кристаллов GaAs // Письма в ЖТФ. 2007. Т. 33. №21. С. 56-62.

421. Khandurina J., Jacobson S.C., Waters L.C., Foote R.S., Ramsey M.J. Microfabricated Porous Membrane Structure for Sample Concentration and Electrophoretic Analysis // Anal. Chem. 1999. Vol. 77. N 9. P. 1815-1819.

422. Косарев Е.Л.,Муранов. K.O. Хроматография сверхвысокого разрешения // ПТЭ. 2001. № 5.С. 74-79.501 .Ulbricht М. Advanced functional polymer membranes // Polymer. 2006. Vol. 47. P. 2217— 2262.

423. Курочкин B.E., Муравьев Д.О., Евстрапов A.A., Котов В.П. Люминесцентные сенсоры кислорода: тенденции и перспективы развития // Микросистемная техника. 2000. № 4. С. 27-32.

424. Mojumdar S.C., Kozankova J., Chocholousek J., Majling J., Nemecek V. The Microstructure and optical transmittance thermal analysis of sodium borosilicate bio-glasses // J. Thermal Analysis and Calorimetry. 2004. Vol. 78. N 1. P. 145-152.

425. Антропова T.B., Дроздова И.А. Влияние условий получения пористых стекол на их структуру // Физика и химия стекла. 1995. Т. 21. № 2. С. 199-209.

426. Захаров С. Л. Получение и свойства пористых боросиликатных стекол // Материаловедение. 2004. № 1. С. 53-56.

427. Альтшулер Г.Б., Баханов В.А., Дульнева Е.Г., Мешковский И.К. Исследование оптических характеристик активных элементов из кварцевого микропористого стекла // Оптика и спектроскопия. 1983. Т. 55, № 2. С. 369-374.

428. Evstrapov А.А., Esikova N.A., Rudnitskaja G.E., Antropova T.V. Application of porous glasses in microfluidic devices // Optica Applicata. 2008. Vol. 38. N 1. P. 31-38.

429. Крейсберг В.А., Ракчеев В.П., Антропова Т.В. Влияние концентрации кислоты на морфологию микро- и мезопор пористых стекол// Физика и химия стекла. 2006. Т. 32, № 6. С. 845-854.

430. Кучинский С.А., Суханов В.И., Хазова М.В., Доценко А.В. Эффективные оптические постоянные пористого стекла//Оптика и спектроскопия. 1991.Т.70.№ 1.С. 150-154.

431. Кучинский С.А., Суханов В.И., Хазова М.В. Принципы формирования голограмм в капиллярных композитах // Оптика и спектроскопия. 1992. Т. 72. № 3. С. 716-730.

432. Evstrapov A.A., Antropova T.V., Drozdova I.A., Yasrtebov S.G. Optical properties and structure of porouse glasses// Optica Applicata. 2003. Vol. XXXIII. N 1. P. 45-54.

433. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Antropova T.V. Spectral characteristics and structure of porous glasses // Optica Applicata. 2005. Vol. 35. N 4. P. 32-39.

434. Шишловский А.А. Прикладная физическая оптика. M.: Физматгиз, 1961. 822 с.

435. Иванов А.П. Оптика рассеивающих сред. Минск. Наука и техника, 1969. 592 с.

436. Виноградов А.П. Электродинамика композитных материалов. М.: Эдиториал УРСС, 2001.208 с.

437. Верещагин В. Г., Дынич Р. А., Понявина А. Н. Эффективные оптические параметры пористых диэлектрических структур // Оптика и спектроскопия. 1998. Т. 84. № 3. С. 486-490.

438. Antropova T.V., Drozdova I.A., Yastrebov S.G., Evstrapov A.A. Porous glass: inhomogeneities and light transmission // Optica Applicata. 2000. Vol. XXX. N 4. P. 553567.

439. Евстрапов A.A., Есикова H.A., Антропова Т.В. Исследование пористых стекол методами оптической спектроскопии // Оптический журнал. 2008. Т. 75. № 4. С. 71-77.

440. Gutina A., Antropova Т., Rysiakiewicz-Pasek Е., Virnik К., Feldman Y. Dielectric relaxation in porous glasses // Microporous and Mesoporous Materials. 2003. Vol. 58. N 3. P. 237-254.

441. Xiong L., Regnier F.E., Channel -specific coatings on microfabricated chips // J. Chromatography A. 2001. Vol. 924. P. 165-176.

442. Pijanowska D.G., Remiszewska E., Pederzolli C. and etc, Surface modification for microreactor fabrication // Sensors. 2006. Vol. 6. P. 370-379.

443. Reigosa Roger M. J., Handbook of Plant Ecophysiology Techniques, Springer Netherlands, Netherlands. 2001. P. 283-295.

444. Jacobson S.C., Ramsey J.M. Microchip Electrophoresis with Sample Stacking // Electrophoresis. 1995. Vol. 16. N 4. P. 481-486.

445. Sinton D., Ren L., X. Xuan, Li D. Effects of liquid conductivity differences on multi-component sample injection, pumping and stacking in microfluidie chips // Lab Chip. 2003. Vol. 3.N3.P. 173-179.

446. Brenner M., Niederwieser A. Thin-layer chromatography (TLC) of amino acids // Methods in Enzymology. 1967. Vol. 11. P. 39-59.

447. Giguere R., Shapcott D., Lemieux B. Thin-layer chromatography of amino acids in blood // J. Chromatography A. 1974. Vol. 95. N 1. P. 122-126.

448. Рожнова О.И., Котова Д.Л., Селеменев В.Ф., Крысанова Т.А. Спектрофотометрическое определение цистеина в водном растворе // Журнал аналитической химии. 1999. Т. 54. № 12. С. 1265-1267.

449. Hughes G. J., Winterhalter К. Н., Boiler Е., Wilson К. J. Amino acid analysis using standard high-performance liquid chromatography equipment // J. Chromatography A. 1982. Vol. 235. N2. P. 417-426.

450. Frank M. P., Powers R. W. Simple and rapid quantitative high-performance liquid chromatographic analysis of plasma amino acids // J. Chromatography B. 2007. Vol. 852. N 1-2. P. 646-649.

451. Smith J. T. Recent advancements in amino acid analysis using capillary electrophoresis. Review // Electrophoresis. 1999. Vol. 20. N 15-16. P. 3078-3083.

452. Poinsot V., Lacroix M., Maury D., Chataigne G., Feurer В., Couderc F. Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis. Review // Electrophoresis. 2006. Vol. 27. N 1. P. 176-194.

453. Poinsot V., Rodat A., Gavard P., Feurer В., Couderc F. Recent advances in amino acid analysis by CE Review // Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 1. P. 207-223.

454. Iadarola P., Ferrari F., Fumagalli M., Viglio S. Determination of amino acids by micellar EKC: Recent advances in method development and novel applications to different matrices. Review// Electrophoresis. 2008. Vol. 29. N 1. P. 224-236.

455. Harrison D.J., Fluri K., Seiler K., Fan Z., Effenhauser C.S., Manz A. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip // Science. 1993. Vol. 261. N 5123. P. 895-897.

456. Pumera M. Microfluidics in amino acid analysis // Electrophoresis. 2007. Vol. 28. N 13. P. 2113-2124.

457. Bo Xu, Xiaojun Feng, Youzhi Xu, Wei Du, Qingming Luo, Bi-Feng Liu. Two-dimensional electrophoresis on a microfluidic chip for quantitative amino acid analysis // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2009. Vol. 394. N 7. P. 1911-1917.

458. Charvatova J., Deyl Z., Klevar M., Miksik I., Eckhardt A., Charvatov J. et al. Plastic substrates based separation channels in electromigration techniques // J. Chromatography B. 2004. Vol. 800. N 1-2. P. 83-89.

459. Рудницкая Г.Е., Евстрапов A.A. Микрочиповые устройства для полимеразной цепной реакции. Часть 1: Основные принципы ПЦР. Конструкция и материалы микрочипов // Научное приборостроение. 2008. Т. 18. № 3. С. 22-40.

460. Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы для биологических и медицинских исследований // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2011. т. LV, № 2. С. 99-110.

461. Евстрапов А.А., Буляница A.JL, Курочкин В.Е., Петряков А.О., Рудницкая Г.Е., Сальникова Т.А., Алексеев Я.И. Экспресс-анализ олигонуклеотидов на планарном микрофлюидном чипе //Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. №6. С. 587-594.

462. Евстрапов А.А., Рудницкая Г.Е., Петухова Н.А. Микрочиповые технологии в биологических исследованиях. Экспресс-анализ ДНК: сепарационные матрицы для разделения ДНК// Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 27-40.

463. Evstrapov А.А., Mukhin I.S., Bukatin A.S., Kukhtevich I.V. Ion and electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in microfluidic chips // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2012. N. 282. P. 145-148.

464. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения // Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2012. Т. 77. № 1. С. 111-115.

465. Евстрапов А. А. Наноразмерные структуры в микрофлюидных устройствах (Обзор) // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. № 3. С. 3-16.

466. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы с интегрированными наноразмерными структурами для фиксации биологических объектов // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. № 3. С. 17-22.