Микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода в биологических объектах

Большаков, Иван Александрович

Микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода в биологических объектах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Большаков, Иван Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода в биологических объектах»

Автореферат диссертации на тему "Микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода в биологических объектах"

На правах рукописи

Большаков Иван Александрович

МИКРОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ БЕРЛИНСКОЙ ЛАЗУРИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2010

004616343

Работа выполнена на Факультете наук о материалах и кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Карякин Аркадий Аркадьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Медянцева Эльвина Павловна Казанский федеральный университет, Химический институт имени A.M. Бутлерова

доктор биологических наук, профессор Шумянцева Виктория Васильевна Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН, г. Москва

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН,

г. Москва

Защита состоится 17 ноября 2010 г. в 15 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический факультет, аудитория 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 16 октября 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Требования современного анализа - это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Электрохимические сенсоры как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. Они просты, удобны в применении, а также позволяют осуществлять непрерывный контроль ключевых аналитов, что является важным для клинической диагностики, контроля промышленного производства и состояния окружающей среды. Требования современной медицины делают необходимым анализ крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе, поскольку некоторые ключевые метаболиты (в частности, активные формы кислорода) являются нестабильными, и традиционные диагностические методы, требующие доставку образца к прибору, становятся неинформативными. Напротив, имплантируемые сенсоры способны давать корректную и своевременную информацию о состоянии пациента. Очевидно, такой персонизированный клинический анализ может быть осуществлен только с использованием химических или биологических сенсоров.

Современные медицина и биология рассматривают пероксид водорода как важнейший метаболит, являющийся индикатором окислительного стресса, воспалительных процессов в организме и апоптоза. Также востребованы методы избирательного и экспрессного определения глюкозы и лактата - ключевых продуктов обмена веществ, определяющих физиологическое состояние человека.

Наиболее совершенным методом определения пероксида водорода является амперометрическая регистрация на электродах, модифицированных берлинской лазурью, которая по чувствительности, экспрессности и простоте исполнения намного превосходит все другие методы. Электроды на основе берлинской лазури находят широкое применение при конструировании сенсоров пероксида водорода и биосенсоров, содержащих иммобилизованные оксидазы в качестве биочувствительного элемента. Тем не менее, берлинская лазурь как электрокатализатор восстановления пероксида водорода не лишена одного недостатка, ограничивающего ее применение в электроанализе, - недостаточной стабильности. Пленка берлинской лазури на поверхности электрода представляет собой осажденный поликристалл. Очевидно, подобные покрытия не обладают достаточной механической и операционной стабильностью.

электрода, при которой изменяется соотношение сигнал/шум. В случае микроэлектродов большую роль играют краевые эффекты, связанные с полусферической диффузией определяемого вещества к поверхности электрода. При этом уменьшение радиуса электрода приводит к возрастанию плотности регистрируемого тока. Миниатюризация сенсоров также необходима для проведения анализа крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе.

Обзор компаний, производящих сенсоры на пероксид водорода, показал, что существующие коммерческие решения преимущественно ориентированы на использование в промышленности и малопригодны для применения в клиническом анализе.

Цель работы состояла в разработке амперометрических микросенсоров на основе гексацианоферратов переходных металлов для определения пероксида водорода в биологических объектах, а также в создании биосенсора на лактат на основе микросенсора.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

- создание амперометрических микросенсоров на основе берлинской лазури с использованием микроэлектродов со встроенным электродом сравнения для определения пероксида водорода;

- повышение стабильности покрытий берлинской лазури на поверхности микроэлектродов;

- увеличение чувствительности микросенсоров;

- иммобилизацию лактатоксидазы на поверхности микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью и создание биосенсора для определения лактата;

- расчет аналитических характеристик микросенсоров и анализ реальных биологических объектов, разработку методик определения пероксида водорода и лактата.

Научная новизна. Разработаны амперометрические микросенсоры для определения пероксида водорода путем электросинтеза берлинской лазури на поверхности микроэлектродов новой конструкции. Разработан импульсный метод электросинтеза берлинской лазури. Изучена морфология покрытий берлинской лазури; измерена толщина пленок катализатора, оптимальных с точки зрения аналитических характеристик сенсоров. Изучено влияние буферных слоев гексацианоферрата никеля на стабильность покрытий берлинской лазури и аналитические характеристики микросенсоров на их основе. Предложен способ структурирования берлинской лазури за счет предварительного синтеза макропористого золота на поверхности микроэлектродов. Показана применимость микросенсоров для определения пероксида водорода непосредственно в биологических объектах, в частности, в непрерывном режиме измерены скорости распада пероксида водорода, катализируемого цитохромоксидазами из митохондрий сердца быка и бактерии Я. хрИаегоИез и скорость генерации пероксида водорода

субмитохондриальными частицами. Путем иммобилизации лактатоксидазы поверх микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью, создан биосенсор на лактат.

Практическая значимость. Разработана конструкция микроэлектрода со встроенным хлоридсеребряным электродом сравнения, работающего по двухэлектродной схеме с любым коммерчески доступным потенциостатом. Получено несколько типов микросенсоров для определения пероксида водорода, обладающих следующими преимуществами: низким пределом обнаружения (до 8-10"9 М), высоким коэффициентом чувствительности (до 2.6 А-л-моль"'-см"2), широким диапазоном линейности градуировочного графика (от 1-Ю"8 до 1-Ю"3 М), высокой стабильностью (постоянный сигнал более 3 ч); создан биосенсор на лактат с нижней границей определяемых содержаний 0.5 мкМ и коэффициентом чувствительности

0.5.А-л-моль'-см"2. Разработана методика определения пероксида водорода в биологических системах. Показано, что при помощи микросенсоров можно регистрировать в непрерывном режиме даже небольшие изменения концентрации пероксида водорода в биологических объектах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Амперометрический микросенсор на основе берлинской лазури со встроенным электродом сравнения для определения пероксида водорода.

2. Амперометрический микросенсор со структурированным покрытием берлинской лазури, позволяющим увеличить чувствительность датчика.

3. Результаты исследования морфологии и электрохимической активности покрытий берлинской лазури.

4. Способ увеличения операционной стабильности микросенсоров путем электросинтеза многослойных структур берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности микроэлектродов.

5. Методика определения пероксида водорода с пределом обнаружения 8-Ю"9 М, позволяющая определять Н202 в присутствии ферментов, клеточных мембран и органелл.

6. Амперометрический биосенсор для определения лактата на основе берлинской лазури и лактатоксидазы.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Четвертом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), симпозиуме «The IIth International and The 1st Sino-Japan Bilateral Symposium on Electroanalytical Chemistry» (Чанчунь, 2007), Всероссийских конференциях по аналитической химии с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2007, 2009), Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008-2010), конференции «International Conference on Electrochemical Sensors (Mátrafdred 08)» (Dobogókó, Венгрия, 2008), Втором Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009, 1 премия Конкурса работ молодых ученых), Съезде аналитиков России и Школе

молодых ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010) и др.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 13 работах, в том числе в 2 статьях в российских и зарубежных научных журналах и 11 тезисах докладов на всероссийских и международных научных конференциях. Также подана 1 заявка на патент РФ. Список основных работ приведён в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных разделов (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы (199 ссылок). Работа изложена на 131 странице машинописного текста, включая 66 рисунков и 11 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель исследований, показана научная новизна и практическая значимость работы.

Обзор литературы

В главе 1 систематизированы сведения о методах определения пероксида водорода в жидких средах. Показано, что амперометрическое определение Н202 на электродах, модифицированных берлинской лазурью, имеет, по сравнению с другими аналитическими методами, такие преимущества как низкий предел обнаружения, широкий диапазон линейности градуировочного графика, метод является простым по технике исполнения и не требует предварительной пробоподготовки, позволяя тем самым проводить анализ реальных объектов. В главе 2 показано, что берлинская лазурь является перспективным материалом для конструирования не только сенсоров пероксида водорода, но и биосенсоров на основе оксидаз. В главе 3 рассмотрены преимущества микроэлектродов перед традиционными электродами. Сделанные на основании обзора литературы выводы подтверждают актуальность выбранной темы исследования.

Экспериментальная часть

В работе разработана конструкция золотых дисковых микроэлектродов с электродом сравнения. Для изготовления микроэлектродов использовали медно-серебряный коаксиальный кабель (марка РК-50-0.3-21, ОАО «ВНИИКП», Россия), диаметром 1 мм; золотую проволоку, диаметром 125 мкм («Goodfellow», Великобритания); серебряную пасту (Silver Counter Electrode Paste C2040922D1, «Gwent Electronic Materials Ltd», Великобритания); полиэтиленовую трубку (внутренний диаметр 0.6 мм, внешний диаметр 1 мм); жидкую эпоксидную смолу. К центральной жиле кабеля (диаметр 100 мкм, изолятор - тефлон) припаивали золотую проволоку, затем вклеивали контакт в отрезок полиэтиленовой трубки при помощи жидкой эпоксидной смолы. Оплетку кабеля модифицировали серебряной

пастой, затем потенциостатически (5 В, 5 мин) покрывали ее хлоридом серебра растворе фонового электролита I (0.1 М Н+, 0.1 М К+, 0.2 М СГ) (рис. 1).

Внешняя РУС-изоляцня

Электрод сравнения, АоС1/А(>

Одножильный проводник. Си-А^-еплав

Изолятор

Золотая проволока, 0 125 мкн

Рабочий электрод, пленка злектрокаталнзатора

Аи рабочий Полиэтиленовая

электрод \ / трубка

\ V Эпоксидная

ЙШ £ смола

Электрод В

сравнения. V

А§С1/Аё ^ V • У Мк ■ М

|2128 2010/02/18 1 мм

Рис. 1. Схема изготовления и СЭМ-изображение (торца) золотого микроэлектрода с электродом сравнения.

Электрохимический рост берлинской лазури на поверхности электродов осуществляли в трехэлектродной электрохимической ячейке (далее - стандартная методика роста). Раствор для синтеза пленок берлинской лазури (БЛ) содержал 263.2 мг К3[Те(СМ)6] и 216.3 мг РеС13-6Н20 (по 4 мМ) в 8 мл фонового электролита I. Осаждение БЛ проводили в потенциодинамическом режиме, при значениях потенциала рабочего электрода от 400 до 750 мВ и скорости развертки потенциала 20 мВ/с. Нанесенные на электрод покрытия БЛ активировали электрохимически в диапазоне потенциалов от -50 до 350 мВ в фоновом электролите I при скорости развертки потенциала 40 мВ/с до получения стабильных вольтамперограмм. Затем электроды подвергали термической обработке при 100°С в сушильном шкафу в течение 1 ч.

Послойный электросинтез каталитических слоев БЛ и буферных слоев гексацианоферрата никеля проводили в различных трехэлектродных ячейках. Одна из ячеек содержала раствор для синтеза гексацианоферрата никеля (№НСР): 1.64 мг К3|Те(СМ)6] (0.5 мМ), 2.39 мг №С12-6Н20 (1 мМ), 372.5 мг КС1 (0.5 М) в 10 мл фонового электролита I; другая - раствор для электросинтеза БЛ. Электроосаждение N¡110? проводили в потенциодинамическом режиме, при значениях потенциала рабочего электрода от 0 до 750 мВ при скорости развертки потенциала 100 мВ/с. Количество циклов осаждения каждого из слоев изменяли в пределах от одного до пяти. После осаждения одного из слоев электрод ополаскивали дистиллированной водой и переносили в другую ячейку. Электроды, модифицированные многослойными покрытиями БЛ/№НСР, циклировали в диапазоне потенциалов от 0 до 750 мВ в фоновом электролите I при скорости развертки потенциала 40 мВ/с в течение 20 циклов.

Иммобилизацию лактатоксидазы на поверхности золотых микроэлектродов, модифицированных БЛ, проводили следующим образом: охлажденный при температуре 4°С раствор у-аминопропилтриэтоксисилоксана в изопропаноле смешивали со свежеприготовленным водным раствором фермента с концентрацией

1 мг/мл и эту смесь наносили на рабочую поверхность микроэлектродов. Биосенсоры сушили и хранили при 4°С. Использовали лактатоксидазу (ЛОД) (ЕС 1.1.3.2) из Pediococcus species (Sorachim, Франция), в виде лиофилизованного белка с заявленной активностью 90 IU.

Амперометрическое определение H2C>2 в модельных растворах проводили в 15 мл 0.05 М фосфатного буферного раствора (pH 7.0) в периодическом режиме по двухэлектродной схеме: а) с внутренним хлоридсеребряным электродом микросенсора, б) с внешним хлоридсеребряным электродом сравнения; при потенциале рабочего электрода 0 мВ (рис. 2). После установления базового тока в раствор добавляли от 7.5 до 15 мкл раствора с концентрациями пероксида водорода в 0.05 М фосфатном буферном растворе от МО"5 до 10 М. В результате, концентрации пероксида водорода в растворе составляли от 5-Ю"9 до 1-Ю"2 М. Регистрацию сигнала (тока) осуществляли при помощи потенциостата PalmSens («Palm Instruments BV», Нидерланды, программное обеспечение PSLite 1.8) и высокочувствительного амперометрического детектора Фотон 7 (Физико-технический институт имени А.Ф. Иоффе, Санкт-Петербург, Россия), соединенных с компьютером. О величине сигнала судили по изменению тока после добавления пероксида водорода. Время единичного отклика микросенсора составляло от 5 до 60 с в зависимости от интенсивности перемешивания.

Тестирование биосенсоров на лактат проводили по этой же схеме, внося в раствор добавки лактата вместо пероксида водорода. Эксперименты с биологическими объектами (цитохромоксидаза, субмитохондриальные частицы) проводили в спектрофотометрической кювете в объеме раствора 2 мл. а б

Микросенсор Мешалка

Стакан

Внешний электрод сравнения

Рис. 2. Схема проведения амперометрического измерения в периодическом режиме: с электродом сравнения микросенсора (а), с отдельным электродом сравнения (б).

Для получения макропористого золота на поверхности золотых микроэлектродов применяли метод темплатного синтеза. В качестве основы темплата использовали монодисперсные микросферы полистирола диаметром 600 нм (суспензия в этаноле), упорядоченную структуру (коллоидный кристалл) которых получали на поверхности микроэлектродов методом вертикального осаждения. Полученные пленки полистирола использовали в качестве матриц для синтеза инвертированных макропористых структур путем электрокристаллизации золота. Потенциостатическое осаждение золота (при -660 мВ, в течение 15-30 мин) осуществляли из раствора для золочения № 1870С фирмы «Baleo» (Великобритания), после чего растворяли микросферы полистирола в тетрагидрофуране (ТГФ) в течение 10-20 мин. Осаждение БЛ на макропористое золото осуществляли по стандартной методике.

Результаты и их обсуждение

В главе 5 описана технология получения покрытий БЛ электрохимическим способом, покрытия охарактеризованы физико-химическими методами.

Берлинскую лазурь обычно осаждают на электроды из стеклоуглерода (СУ), реже - из золота и платины. Электроды из СУ наиболее часто используют в электроанализе, методы электрохимического осаждения БЛ на поверхность СУ электродов хорошо изучены и описаны. Однако СУ не пригоден для изготовления микроэлектродов. В настоящей работе микроэлектроды изготавливали из поликристаллической золотой проволоки. Выбор этого материала обусловлен следующим фактором: из золотой проволоки диаметром 1 мм изготавливали макроэлектроды, из проволоки диаметром 125 мкм - микроэлектроды; сравнивали процессы получения покрытий БЛ на макроэлектродах из СУ и золота и затем использовали методики для электросинтеза БЛ на золотых микроэлектродах.

К наиболее распространенным способам осаждения БЛ относят гальваностатический, потенциодинамический и химический методы, при этом электрохимические свойства покрытия БЛ не зависят от способа осаждения. Гальваностатический рост проводят при определенном значении плотности тока, соответственно, необходимо точно знать площадь рабочей поверхности электрода. Чтобы избежать влияния размеров электрода на процесс осаждения, синтез пленок БЛ проводили в потенциодинамическом режиме. Циклические вольтамперограммы (ЦВА) роста БЛ на поверхности золотого микроэлектрода и СУ электрода принципиально не отличались (рис, 3).

Е, мВ Е, мВ

Рис. 3. ЦВА потенциодинамичеекого роста БЛ на поверхности золотого микроэлектрода (диаметр 125 мкм) (а), стеклоуглеродното электрода (диаметр 2 мм) (б). Скорость развертки потенциала 20 мВ/с, 400 - 750 мВ, 5 циклов. Увеличение количества осажденной БЛ приводит к увеличению тока.

Электроды с электроосажденной БЛ подвергали активации путем циклирования в фоновом электролите I до получения стабильной вольтамперограммы (рис. 4). Рост токов пиков редокс-реакций БЛ указывал на увеличение активности электрокатализатора по мере насыщения пленки БЛ ионами К+ в ходе циклирования. Пики редокс-переходов берлинская лазурь/берлинский белый (восстановленная форма БЛ) были смещены друг относительно друга по шкале потенциала на 15-30 мВ,

что свидетельствовало о регулярности структуры поликристалла и равномерном распределении скоростей переноса заряда внутри пленки.

Рис. 4. ЦВА активации золотых микроэлектрода (диаметр 125 мкм) (а) и макроэлектрода (диаметр 1 мм) (б), модифицированных БЛ. Скорость развертки потенциала 40 мВ/с, -50 - +350 мВ, 20 циклов.

Локальную электрокаталитическую активность БЛ исследовали методом сканирующей электрохимической микроскопии (SECM) в режиме редокс-конкуренции. В эксперименте с использованием би-потенциостата движущийся Pt зонд (диаметр 25 мкм) окислял (при 700 мВ), а неподвижный электрод с БЛ -восстанавливал (0 мВ) имеющийся в растворе Н2О2, значение тока на зонде уменьшалось при его нахождении непосредственно над пленкой БЛ и оставалось неизменным при движении над немодифицированной частью электрода. Образцы с БЛ готовили при помощи электрохимической микроячейки из стеклянного капилляра: на стеклоуглеродную пластинку осаждали по два или три «пятна» БЛ с различной толщиной пленки (варьировали в стандартной методике роста БЛ число циклов от 2 до 20). Капилляр закрепляли в электрохимическом микроскопе, заполняли раствором, опускали в него Pt проволоку (вспомогательный электрод) и миниатюрный электрод сравнения. Рабочим электродом служила стеклоуглеродная пластинка. При помощи системы шаговых пьезодвигателей микроскопа подводили ячейку вплотную к пластинке, осаждали БЛ, отводили ячейку от поверхности, отступали на 1000 мкм и повторяли операцию электросинтеза. Полученные таким образом пятна имели диаметр 400-600 мкм.

На рис. 5 представлен образец с тремя пятнами БЛ, видимый в отраженном свете (рис. 5а), в оптическом микроскопе (рис. 56), а также приведены изображения, полученные при сканировании образца методом SECM (рис. 5в). При помощи последнего метода можно различать поверхности электрода, модифицированные БЛ и немодифицированные. Все три пятна с различным количеством БЛ демонстрировали одинаковую электроактивность при измерении, что связано в первую очередь с тем, что скорость окисления Н2О2 на платине значительно меньше (kcai = 410"6 см/с), чем скорость восстановления на БЛ (кса, = МО"2 см/с), на пятнах с различной толщиной пленки БЛ скорости реакции сопоставимы. Тем не менее, для получения сенсоров на основе БЛ для определения Н2О2 нет необходимости наносить толстые покрытия катализатора.

-50

50 100 150 200 250 300 350

Е,мВ

-50 0 50 100 150 200 250 300 350

Е.мВ

! »V" , JS

/ \

/ X

иДШЯ

5 циклон 2 никла 20 циклов

¡»с нннн

ЩШ

% КО 'ОСС J500 г»К! ~ 2500

Рис. 5. Образец с тремя пятнами БЛ на пластинке ш стеклоуглерода: визуальное наблюдение (а), изображение в оптическом микроскопе (б), результат БЕСМ-измерения (в, г).

STJ» w>

К, >>,КМ

Морфологию покрытий БЛ исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Пленка электроосажденной БЛ на поверхности золотого электрода представляла собой поликристалл, который полностью покрывал поверхность рабочего электрода (рис. 6). Размеры кристаллитов варьировались в интервале 50-100 нм. Также при помощи метода АСМ оценили среднюю толщину пленки электрокатализатора. Для этого удалили часть БЛ с поверхности 1 мм золотого электрода следующим образом: кончиком деревянной зубочистки, смоченной в 0.01 М растворе КОН, провели посередине электрода и тщательно ополоснули его дистиллированной водой (как известно, БЛ моментально растворяется даже в слабощелочной среде). Затем просканировали поверхность образца и провели статистический анализ на шероховатость при помощи программного обеспечения Image Analysis 2.2.0. Среднее распределение по высотам поверхности образца с БЛ составило 330 нм, в случае поверхности золота - 260 нм (рис. 7, участки 1 и 2 размером 25x25 мкм соответственно). Таким образом, толщина пленки БЛ была порядка 70-80 нм.

Рис. 6. АСМ-изображение БЛ на поверхности золота. Область сканирования 500x500 нм. Осаждение БЛ проводили по стандартной методике роста БЛ.

сй2озо>»аас5озэ5о мкм Рис. 7. АСМ-изображение границы БЛ/золото на поверхности электрода. Область сканирования 100x100 мкм. размер участков 1 и 2 - 25x25 мкм.

Глава б посвящена созданию микросенсоров на основе БЛ со встроенным хлоридсеребряным электродом сравнения, изучено влияние материалов и геометрии электродов на аналитические характеристики датчиков.

Для того чтобы создать микросенсор, который можно малоинвазивно имплантировать в организм, необходимо расположить два электрода близко друг к другу. Для решения поставленной задачи использовали медно-серебряный коаксиальный кабель, центральная жила которого служила основой для рабочего электрода, а оплетка - для хлоридсеребряного электрода сравнения. Попытки осадить берлинскую лазурь непосредственно на медную основу кабеля, а также на буферные слои электрохимически осажденных никеля и золота, закончились неудачно, поэтому основным вариантом изготовления микросенсора стало припаивание небольшого отрезка (~0.5-1 см) золотой проволоки диаметром 125 мкм к центральной жиле коаксиального кабеля и изолирование места спайки (рис. 1). Очевидно, что в этом случае микросенсоры вели себя как золотые дисковые микроэлектроды, модифицирование которых БЛ описано выше в главе 5.

Использование электрода сравнения микросенсора возможно только при наличии в исследуемой жидкости хлорид-ионов. Отметим, что в физиологических жидкостях (кровь, пот, слезы) этот анион присутствует в большом количестве (например, в крови, около 0.2 М СГ). При проведении модельных экспериментов в 0.05 М фосфатный буферный раствор добавляли СГ до концентрации не менее 0.1 М.

Для сравнения аналитических характеристик электродов, модифицированных БЛ, использовали следующие величины: 1) линейный диапазон определяемых содержаний; 2) нижнюю границу определяемых содержаний пероксида водорода; 3) коэффициент чувствительности, определяемый как тангенс угла наклона линейного участка градуировочной зависимости в координатах ¡'(с), где / - плотность тока, А/см2, с - концентрация Н202, М; 4) соотношение сигнал/шум.

Методика определения пероксида водорода включала амперометрическое измерение сигнала тока при потенциале 0 мВ после введения аналита в раствор. Уровень шума немодифицированных золотых микроэлектродов в фиксированном объеме 0.05 М фосфатного буферного раствора (15 мл) при постоянной скорости перемешивания механической мешалкой составлял от 0.2 до 1 пА. Шум фонового тока для микроэлектродов, модифицированных БЛ, в этих же условиях был около 3 пА. Отклик микросенсора на добавление минимально определяемой концентрации пероксида водорода МО"8 М составлял 3-6 пА. На рис. 8 показано изменение тока во времени при последовательном введении проб с различным содержанием Н2О2, при добавлении одной и той же концентрации аналита значение тока изменялось на постоянную величину.

На основании этих экспериментов в модельных растворах (0.05 М фосфатный буферный раствор + Н202) строили градуировочные зависимости плотности тока (с учетом площади электрода) от концентрации аналита. При использовании микросенсоров с внутренним электродом сравнения градуировочная зависимость

линейна в диапазоне концентраций от МО"8 до МО"3 М пероксида водорода (рис. 9). Значение коэффициента чувствительности в периодическом режиме составляло 1.00±0.05 А-л-моль'-см"2 (п = 20 ,Р = 0.95).

Использование БЛ в качестве чувствительного элемента позволило создать микросенсор для определения пероксида водорода с улучшенными аналитическими характеристиками по сравнению с традиционными дисковыми электродами, модифицированными БЛ (Karyakin A.A., Karyakina Е.Е. // Sensors and Actuators В: Chemical. 1999. V. 57. P. 268): коэффициент чувствительности увеличен в 1.5 раза, нижняя граница определяемых содержаний понижена в 10 раз и составила 10 нМ Н202.

-900 -800 5-10"7 М VX4"* _—--г*

-700 \\

•600 "ei -500 мо'м \

-400 \\ г

-300 -200 Itv-T

-100

/ 1,2 А

/ i и У

0.4

у/ И

0.0 0.2 0.4 0,6 0.« 1.0

Время, мин

Рис. 8. Зависимость сигнала микросенсора от времени при последовательном введении проб с различным содержанием Н2О2, фосфатный буферный раствор (0.05 М К2НР04,0.1 М КС1, рН 7.0), Е=0 мВ.

1x10" 1x10 1x10* 1x10 1x10"* 1x10* 1x10 С(Н2Ог),М

Рис. 9. Градуировочный график для определения Н202 с использованием микросенсора, модифицированного БЛ (на врезке показан начальный участок графика в линейных координатах). /=1.08с.

Чувствительность амперометрического метода можно повысить, увеличивая активную (истинную) площадь поверхности микроэлектрода без изменения его видимой (геометрической) площади. При этом сохраняется отношение количества БЛ на единицу площади электрода, однако общее количество БЛ и, как следствие, регистрируемый ток увеличиваются. Одним из популярных подходов к структурированию поверхности является предварительное изготовление на поверхности электрода инертной матрицы, имеющей систему пор (темплатный синтез). Для создания микросенсора с развитой поверхностью электрода взяли за основу известный метод вертикального осаждения микросфер полистирола, значительно сократив время осаждения, так как площадь микроэлектродов очень мала. Время осаждения микросфер путем испарения в печи при 50°С составляло 4-8 ч, в зависимости от диаметра используемого химического стакана (влияющего на скорость испарения), синтез в присутствии внешнего электрического поля проводили при комнатной температуре в течение 15-60 мин.

Полученные пленки полистирола на микроэлектродах использовали в качестве матриц для синтеза инвертированных структур путем электрокристаллизации золота в пустотах темплата из полистирольных микросфер с последующим растворением матрицы в ТГФ. На регистрируемых хроноамперограммах при потенциостатическом

осаждении золота в пустотах полистирольной пленки наблюдали осциллирующее поведение тока восстановления (рис. 10). Этим колебаниям соответствовало периодическое изменение активной площади поверхности электрода в процессе роста золота в матрице полистирола. Увеличение абсолютного значения осциллирующего тока восстановления золота во времени (наклона кривой) объясняли изменением относительной глубины полостей во время процесса осаждения золота. В начале электрохимического осаждения полости довольно глубокие и поток ионов [Аи(СЫ)2]" к поверхности электрода был затруднен. По мере заполнения полостей металлом их глубины уменьшались, и диффузия ионов к поверхности электрода нарушалась все меньше и меньше, что приводило к увеличению тока.

Время, мин

Рис. 10. Хроиоамперометрическая кривая осаждения золота в пустоты пленки полистирола (испарение суспензии в печи при 50°С, 8 ч). Е—660 мВ.

Рис. 11. СЭМ-изображение макропористого золота после удаления темплата с поверхности микроэлектрода: наблюдение пор в структуре.

После электроосаждения золота полистирольный темплат растворяли в ТГФ. На рис. 11 приведено СЭМ-изображение макропористого золота после удаления темплата с поверхности электрода. Хорошо видны бывшие точки соприкосновения микросфер полистирола (черные на белом), теперь это поры в структуре.

После удаления темплата с поверхности микроэлектрода осаждали берлинскую лазурь на поверхность макропористого золота (по стандартной методике). На рис. 12а показаны ДВА активации БЛ, электроосажденной на макропористое золото, полученное в разных условиях синтеза темплатов; также для сравнения приведены ДВА активации сплошной пленки БЛ, полученной на обычном золотом дисковом микроэлектроде. В случае структурированной поверхности электрода пики редокс-переходов БЛ/берлинский белый уширялись (снижалась регулярность структуры БЛ).

Если после проращивания золота через поры в матрице из полистирольных микросфер темплат не удалять, то можно получить на поверхности микроэлектрода ансамбль золотых наноэлектродов, изолированных друг от друга полистиролом и имеющих общий токоотвод. Сравнение ДВА активации БЛ, осажденной на микроэлектроды с удаленным и неудаленным темплатом, приведено на рис. 126. Видно, что токи редокс-переходов отличались примерно в три раза, кроме того, у микроэлектрода с матрицей полистирола наблюдали высокий емкостной ток.

Рис. 12. ЦВА активации БЛ, электроосажденной на макропористое золото, полученное в разных условиях синтеза темплатов (а), влияние наличия темплата на редокс-акгивность БЛ (б).

Таблица 1. Метрологические характеристики микросенсоров, модифицированных структурированными покрытиями БЛ (1-111), сплошной пленкой БЛ (IV), многослойным покрытием БЛ/№НСР (V) (/ - плотность тока. А/см , с - концентрация 1ЬО;, М, а - коэффициент чувствительности, А-л моль''-см")

Методика изготовления датчика / = (а±Аа)с Диапазон определяемых содержаний, М £-МИН> М (п = 3)

а Д а

I 0.99 0.07 5-10"7-5-10"4 3-Ю"7 0.09 (с = 5 мкМ)

II 1.60 0.09 М0"7-1-10"3 9-10"8 0.07 (с = 1 мкМ)

III 2.60 0.15 1-10"7 — 5-10° 4-10"8 0.07 (с = 1 мкМ)

IV 1.00 0.05 МО"8-1-Ю"3 8-Ю"9 0.05 (с = 0.5 мкМ)

V 0.40 0.03 5-Ю"7-1-Ю"3 2-10"7 0.06 (с = 5 мкМ)

Примечание: I - осаждали микросферы полистирола в электрическом поле, растили золото, темплат оставили, II - осаждали микросферы полистирола в электрическом поле, растили золото, темплат удалили, III - испарение при 50°С, растили золото, темплат удалили. Затем растили БЛ в матрице макропористого золота по стандартной методике. IV - осаждали БЛ по стандартной методике на золотые микроэлекгроды. V - осаждали многослойные структуры БЛ/МШСР на золотые микроэлектроды (см. далее, гл. 7).

Микросенсоры со структурированными покрытиями БЛ тестировали по отношению к пероксиду водорода, проводя амперометрическую регистрацию сигнала на Н202 в периодическом режиме. Аналитические характеристики датчиков приведены в табл. 1, из которой следует вывод, что при использовании метода темплатного синтеза можно получать микросенсоры со структурированными покрытиями БЛ, характеризующиеся высоким коэффициентом чувствительности (до 2.6 А-л-моль"'-см"2) и обладающие широким линейным диапазоном определяемых концентраций (от 1-10" до 5-10" М).

Глава 7 посвящена стабилизации покрытий БЛ. Известно, что берлинский белый - восстановленная форма БЛ, образующаяся в ходе катализа, -термодинамически нестабилен, кроме того, комплексоны железа и даже гидроксил-ион, являющийся продуктом электровосстановления пероксида водорода на БЛ, эффективно смывают электрокатализатор с поверхности электрода.

Среди различных стабилизаторов БЛ в настоящее время наибольший интерес представляют гексацианоферраты некоторых металлов (например, кобальта и

никеля), обладающие в тысячи раз меньшей электрокаталитической активностью. На их основе можно формировать смешанные поликристаллические покрытия с БЛ, придавая пленкам высокую операционную и даже механическую стабильность.

По сравнению с синтезом БЛ использование полностью окисленных прекурсоров для осаждения пленки №НСБ невозможно (для никеля степень окисления 3+ реализуется только в отдельных комплексных соединениях, простые соли №3+ получить не удается). Смешение растворов, содержащих №2* и [Ре(СЫ)6]3", приводило к образованию опалесцирующего коллоида. Для предотвращения агрегации частиц комплекса №и-|Тега(СМ)6] использовали пятисоткратный и более избыток КС1 (0.5 М) по сравнению с концентрациями №СЬ (1 мМ) и К3[Те(СМ)б] (0.5 мМ), что обеспечивало образование метастабильного раствора, стабильного в течение 2 ч и более (времени, достаточного для осуществления электросинтеза).

Синтез пленок №НСР осуществляли в потенциодинамическом режиме с линейной разверткой потенциала. Предложена методика послойного осаждения БЛ и №НСР из раздельных растворов на поверхность одного и того же электрода (рис. 13).

Во время осаждения БЛ (рис. 13а) наблюдали процесс активации пленки гексацианоферрата никеля:

т"[т"Ре"(СЛГ)6] + К+ -ё >К[№"Ре"'(СЛ06]. На ЦВА осаждения первого слоя БЛ нет пиков редокс-активности №НСР (потому что его еще не осаждали на этот электрод), а на 3, 5, 7 и 9 слоях БЛ токи редокс-переходов присутствовали и значительно увеличивались.

В процессе осаждения №НСР (рис. 136) также наблюдали растущие пики:

- редокс-переходов берлинский белый / берлинская лазурь (150-200 мВ):

Fe"'[Fe/"Fe"(C^V)6]з + 6К* К2[Ре" Ре" (СЩ6],

- редокс-переходов берлинская лазурь / берлинский зеленый (700-750 мВ):

Ре'"[Ре'"Ре"(С^6]3 +ЗСГ -Зё->^е"'[^е/"^е'"(САг)6С/]3,

потому что на электроде уже присутствовала пленка БЛ.

Е, мВ Е, мВ

Рис. 13. Осаждение многослойной пленки на поверхность микроэлектрода: (а) ЦВА осаждения БЛ, скорость развертки потенциала 20 мВ/с, по 2 цикла; (б) ЦВА осаждения МНСИ, скорость развертки потенциала 100 мВ/с, по 2 цикла.

Плечо на ЦВА в диапазоне 400-600 мВ соответствовало переходу железа в гексацианоферрате никеля:

М"[М"Ре"(С/У)б] + к* _А,,;, >К[М"Ре'" (ОУ)»]. В результате такого осаждения получали многослойную структуру (10 слоев), в которой слои БЛ закрыты слоями №НСР.

Аналитические характеристики микросенсоров на основе многослойных пленок БЛ/№НСР приведены в табл. 1 (методика V, стр. 15). Коэффициент чувствительности микросенсоров составил не менее 0.4 А-л-моль"1-см"2, нижняя граница определяемых содержаний - 0.5 мкМ Н202.

Рис. 14. Сравнение операционной стабильности микросенсоров на основе сплошной пленки БЛ и многослойных покрытий БЛ/МНСИ. Регистрация амперометрического сигнала во времени после введения МО"3 М Н2О2, периодический режим.

О 30 60 90 120 150 180

Время, мин

Послойное осаждение БЛ и гексацианоферрата никеля позволило значительно стабилизировать электрод. На рис. 14 приведены сравнения операционной стабильности двух типов микросенсоров. Эксперимент заключался во введении высокой концентрации пероксида водорода (МО"3 М) в 0.05 М фосфатный буферный раствор и амперометрической регистрации сигнала сенсора. Уже через несколько минут БЛ начинала растворяться с поверхности микросенсора со сплошной пленкой электрокатализатора, тогда как для сенсора с многослойной пленкой БЛ/№НСР наблюдали стабильный, мало изменяющийся отклик в течение 3 ч.

Таблица 2. Сравнение аналитических характеристик микросенсоров со сплошной пленкой БЛ и многослойным покрытием БЛ/№НСР_

Характеристика Микросенсор со сплошной пленкой БЛ Микросенсор с многослойной пленкой БЛ/ЫШСР Печатный графитовый электрод, модифицированный №НСР(*)

Коэффициент чувствительности, Л'Л'МОЛЬ 1'см"2 1.00 0.40 0.006

с„„„, М 8-10"9 2-Ю"7 1.2-10"6

Линейный диапазон определяемых содержаний, М 1-Ю"8-1-Ю"3 5-Ю"7- 1-Ю"3 2-Ю"5-1-Ю"3

Стабильность, ч <0.1 >3 данные отсутствуют

Примечание: (*) J. Lin, D.M. Zhou, et al. // Frontiers in Bioscience. 2005. V. 10. P. 483.

В табл. 2 приведено сравнение аналитических характеристик двух типов микросенсоров, со сплошной пленкой БЛ и многослойной пленкой БЛ/№НСР

(см. также табл. 1, методики IV, V, стр. 15). Видно, что микросенсоры обоих типов имеют как недостатки, так и преимущества. Для сравнения, в табл. 2 указаны данные по датчику на основе NiHCF из литературного источника.

Таким образом, показано, что послойное осаждение БЛ и NiHCF на поверхность микроэлектродов приводит к значительному увеличению операционной стабильности микросенсоров без существенного ухудшения их аналитических характеристик.

В главе 8 обсуждено практическое применение микросенсоров на основе БЛ. Микросенсоры использовали in vitro для определения активностей реальных биологических объектов, разработана методика для определения пероксида водорода. Проведены предварительные эксперименты по определению пероксида водорода in vivo. Создан биосенсор для определения лактата.

С помощью микросенсоров удалось измерить стационарную скорость распада Н2О2 при инкубации с окисленной цитохромоксидазой из митохондрий сердца быка и бактериальной цитохромоксидазой из Rhodobacter sphaeroides.

Время, мин Время, мин

Рис. 15. Амперометрическое измерение каталазной Рис. 16. Регистрация катштазной активности активности ЦО из митохондрий сердца быка с бактериальной ЦО из Rhodobacter sphaeroides, помощью микросенсора на основе БЛ. показано действие инактивированного фермента.

Добавки: Н202 - 200 мкМ, ЦО из мутантного штамма К362М - 0.38 мкМ. ЦО,,,,, - фермент, денатурированный прогреванием при 100 "С.

На рис. 15 показана типичная картина регистрации каталазной активности цитохромоксидазы (ЦО), выделенной из митохондрий сердца быка. Микросенсор помещали в кювету с буферным раствором (0.05 М К2НРО4, 0.1 М KCl, 0.05% додецилмальтозида, pH 7.0), который перемешивался механической мешалкой. В кювету последовательно вносили добавки Н202 и ЦО. Каждая добавка составляла для пероксида водорода 50 мкМ, для ЦО - 1 мкМ (указаны конечные концентрации реагентов после добавления). Следует отметить, что из-за постоянного уменьшения концентрации Н2О2 в среде кинетика его распада нелинейна, однако, имелись достаточно протяженные и близкие к линейным участки кинетической кривой, позволяющие определить начальную скорость реакции. Для надежного определения

скорости реакции при конкретной концентрации ЦО в раствор, после исчерпания половины добавленного пероксида водорода, снова вводили Н202 до той же конечной концентрации 100 мкМ и измеряли начальную скорость. Аналогичные результаты получили в экспериментах с цитохром с оксидазой, выделенной из бактерии Я. зрЬаего\с1ев (рис. 16, табл. 3).

К сожалению, оказалось невозможным проверить специфичность каталазной активности ЦО путем добавления специфических ингибиторов кислород-редуктазного центра фермента, таких как цианид, сульфид или азид, поскольку эти лиганды оказывали сильное воздействие на БЛ. Однако было показано, что ЦО, денатурированная прогреванием фермента при температуре 100°С в течение 10 мин, полностью теряла способность стимулировать разложение Н2О2, как это показано для мутантной формы бактериальной ЦО на рис. 16. Результаты определения каталазной активности цитохромоксидаз просуммированы в табл. 3.

Таблица 3. Скорости распада пероксида водорода, катализируемого цитохромоксидазами (и = 3, Р = 0.95)

Цитохромоксидаза Константа скорости второго порядка распада пероксида водорода, М"'с"' ■5Y

из митохондрий сердца быка 170±20 0.05

из R. sphaeroides, дикий тип 1200±50 0.02

из R. sphaeroides, мутант К362М 2800±200 0.03

Величина удельной каталазной активности, полученная для митохондриального фермента, находится в соответствии со значениями, характеризующими скорость взаимодействия Н2О2 с кислород-редуктазным центром ЦО, определенную спектрофотометрически. В то же время, скорость разложения пероксида водорода бактериальной ЦО и, особенно, мутантным ферментом К362М, настолько высока, что не может быть объяснена каталитическим распадом Н2О2 в кислород-редуктазном центре ЦО. Действительно, скорость связывания пероксида водорода с гемом а3 в окисленной ЦО из R. sphaeroides, определенная методами быстрой кинетики, составляет около 800 М"'с"'. Близкие значения бимолекулярной константы скорости связывания получены для фермента из сердца быка (около 500 М''с-1, данные из литературы: L.C. Weng, G.M. Baker. // Biochemistry. 1991. V. 30(23). P. 5727). Трудно представить, чтобы скорость разложения Н2О2 в активном центре фермента могла превышать скорость его связывания в этом центре. Возможно, причина высокой каталазной активности бактериального фермента заключается в том, что ион Mg2+, расположенный на границе между субъединицами I и II митохондриальной оксидазы и играющий важную роль в механизме переноса протона и воды, в бактериальной ЦО частично или полностью замещен ионом Мп2+. Как известно, двухвалентный марганец - один из лучших катализаторов разложения Н202. Степень, в которой происходит замещение Mg2+ на Мп2+ в бактериальных оксидазах, зависит от среды, условий выращивания и сильно варьирует от препарата к препарату, что могло бы также объяснять разницу в удельной каталазной активности бактериального фермента дикого типа и мутанта К362М.

На второй биологической модели, субмитохондриальных частицах (СМЧ ) из митохондрий сердца быка, следили уже не за разложением Н202, а за его генерацией, процессом, который аналогичным образом протекает в живой клетке. Предполагается, что источником образования супероксида/пероксида водорода комплексом bel (одним из основных мест генерации активных форм кислорода в дыхательной цепи) является короткоживущий радикал убисемихинона, образующийся после одноэлектронного восстановления убихинона. Антимицин блокирует приход второго электрона, увеличивая время жизни радикала и, тем самым, вероятность его контакта с кислородом, то есть продукцию супероксида, дисмутирующего в пероксид водорода.

На рис. 17 представлены результаты регистрации генерации пероксида водорода СМЧ на сукцинате в присутствии антимицина. Микросенсор помещали в кювету с 2 мл буферного раствора (0.3 M сахароза, 50 мМ MOPS, 0.1 M KCl, pH 7.0), перемешиваемого механической мешалкой; в буферный раствор также добавляли разобщитель карбонилцианид-М-хлорфенилгидразон (СССР, 1 мкМ) и супероксид дисмутазу (10 мкг/мл). В кювету последовательно вносили добавки пероксида водорода (по 1 мкМ каждая), СМЧ (0.6 мг белка/мл), сукцината (5 мМ), антимицина (1 мкМ), миксотиазола (1 мкМ), каталазы (5 мкл продажной суспензии, разведенной 1:100). В скобках указаны конечные концентрации реагентов после добавки.

Внутренняя калибровка микросенсора последовательными добавками пероксида водорода кроме стабильности работы датчика демонстрировала также, что уменьшение тока указывало на увеличение концентрации Н202 и, соответственно, свидетельствовало о генерации пероксида водорода. В среду вносили СМЧ и, после стабилизации сигнала, дыхательный субстрат, сукцинат. При включении дыхания стимулировался слабый распад пероксида водорода (ток увеличивался), возможно, за счет слабой пероксидазной активности цитохромоксидазы.

Рис. 17. Амперометрическая регистрация генерации Н2О2 субмитохондриальными частицами на сукцинате в присутствии антимицина и разобщителя СССР. Шумы на кривой сглажены в программе OriginPro 8.0.

/ сукцинат 5 мМ

СМЧ 0.6 мг белка/мл

■ I ■

15 20 25 30 35 40

Время, мин

После введения антимицина система полностью переключалась на выделение Н202 (уменьшение сигнала, отмечено стрелкой на рис. 17), которое затем полностью

СМЧ - замкнутые пузырьки из фрагментов внутренней мембраны митохондрий сердца быка с полным набором дыхательных ферментов.

ингибировапи миксотиазолом, поскольку он блокирует центр образования радикала убисемихинона. В конце эксперимента в среду вносили каталазу, которая практически мгновенно разрушала весь имеющийся в среде пероксид водорода (резкое увеличение тока). Скорость генерации пероксида водорода СМЧ на сукцинате и антимицине в присутствии разобщителя, рассчитанная на основании данных независимых экспериментов, составила 0.86±0.21 наномоль Н202/мин на 1 мг белка (л = 3, Р = 0.95, sr = 0.07), что согласуется с имеющимися литературными данными (A. Boveris, В. Chance. // Biochemical Journal. 1973. V. 134(3). P. 707; D. Malinska, et al. Methods in Enzymology, S.A. William and E.S. Immo (Editors). Academic Press. 2009. P. 419-437).

Таким образом, микросенсоры на пероксид водорода можно успешно применять для изучения биохимических реакций с участием ферментов, клеточных мембран и органелл.

Амперометрическая методика определения пероксида водорода включает предварительное построение градуировочного графика микросенсора в модельном растворе (описание см. на стр. 12, рис. 8, 9), после чего микросенсор можно многократно использовать для измерения. Непосредственно измерение: датчик подключают к потенциостату по двухэлектродной схеме, помещают его в среду (раствор фермента или СМЧ) фиксированного объема, прикладывают к рабочему электроду потенциал 0 мВ и детектируют изменение тока в ходе генерирования или разложения Н202 (в результате ферментативных реакций). Метрологические характеристики амперометрической методики определения Н202:

- уравнение градуировочного графика i = 1.0с или с = 8130/,

где с - искомая концентрация, М; / - регистрируемое изменение тока (по модулю), A, i - плотность тока (по модулю, с учетом площади электрода, равной 1.23-10"4 см2), А/см2;

- диапазон определяемых содержаний (линейный участок градуировочной зависимости): МО"8 - МО"3 М,

- предел обнаружения 8-10"9 М (нижняя граница определяемых содержаний МО"8 М).

Введение каталазы в анализируемый раствор в конце эксперимента приводило к исчезновению сигнала и детектированию фонового тока, близкого к нулю (см. рис. 17), что свидетельствовало о том, что микросенсор откликался именно на пероксид водорода, а не на какое-либо другое соединение.

Правильность методики определения пероксида водорода в биологических объектах подтверждали методом «введено - найдено» при анализе суспензий (табл. 4). Можно утверждать, что состав анализируемой среды, а именно, ферменты, СМЧ, клеточные мембраны, сукцинат (и проч.), не оказывали значительного влияния на измерение концентрации Н202.

Таким образом, методика не уступает по чувствительности другим известным методикам определения пероксида водорода и позволяет определять его на уровне 1 -10-8 — 1-10~3 М; методика отличается простотой и экспрессностью.

Таблица 4. Проверка правильности методики определения пероксида водорода в биологических объектах методом «введено - найдено» (я = 3, Р = 0.95)

Объект Введено, мкМ Найдено, мкМ Sr

ЦО из сердца быка 50 47±5 0.04

ЦО из Я. зрЬаею1<1ез, дикий тип 100 90±11 0.05

ЦО из К. 5рЬаего!^, мутант К362М 200 181±23 0.05

Субмитохондриальные частицы 1 0.87±0.16 0.07

Состав сред приведен в тексте при описании соответствующих экспериментов.

Определение пероксида водорода in vivo проводили в тканях легких здоровых и зараженных туберкулезом (хроническая форма заболевания) мышей. Суть эксперимента сводилась к следующему: проводили вскрытие животного, получали доступ к его легким, затем проникали микросенсором в ткань легкого и проводили измерение (рис. 18). В ходе измерений регистрировали увеличение значений тока, что позволило судить о мешающем влиянии среды организма (наличие восстановителей) на процесс определения пероксида водорода в тканях легких. Необходимо отметить, что при использовании немодифицированных микроэлектродов (без пленки БЛ) регистрировали нулевое значение сигнала. Влияние среды пытались скомпенсировать, варьируя потенциал, приложенный к рабочему электроду микросенсора, от -300 до 0 мВ. Тем не менее, во всех экспериментах получили положительные отклики, составлявшие от 0.2 до 1 нА. Полученный массив данных представили в виде диаграммы как зависимость сигнала тока от приложенного потенциала (рис. 19).

Е. мВ

Рис. 19. Зависимость сигналов микросенсоров от приложенного потенциала при измерениях содержания пероксида водорода в легких здоровых и тубинфицированных мышей (п = 3, Р= 0.95).

i I отклик в здоровых мышах I I отклик в тубииф. мышах

Рис. 18. Процесс введения микросенсора в легкое животного.

Из приведенной диаграммы можно сделать вывод, что эксперименты в живых объектах лучше проводить при потенциалах от -100 до 0 мВ, так как при этих

потенциалах значения токов наименьшие (то есть влияние среды организма минимально), а различия в значениях токов в здоровых и тубинфицированных животных наибольшие. Уменьшение потенциала измерения до -200 мВ и менее нецелесообразно, так как значение тока снова начинало увеличиваться, и при этом не было значимых различий в сигналах тока в здоровых и тубинфицированных мышах.

Пока не удалось показать количественных различий между разными группами животных, однако работа в этом направлении будет продолжена.

Биосенсор па лактат. На основе микросенсоров, модифицированных БЛ, создали биосенсор для определения лактата: при окислении лактата кислородом воздуха в присутствии лактатоксидазы образуются пируват и пероксид водорода, образование последнего можно зарегистрировать микросенсором на основе БЛ. Реакция окисления протекает стехиометрически, по концентрации продукта можно рассчитать исходное количество лактата. Из литературы известны примеры успешного применения различных силоксанов для иммобилизации лактатоксидазы на поверхность электродов. В настоящей работе в качестве мембраны для иммобилизации фермента выбрали у-аминопропилтриэтоксисилоксан ГШг-СНз-СНз-СНз-З^ОЕ^з. После высушивания мембраны изучали аналитические характеристики полученных биосенсоров амперометрически в периодическом режиме, результаты представлены в табл. 5.

Коэффициент чувствительности датчиков составил не менее 0.5 А-л-моль"'-см"2, нижняя граница определяемых содержаний - 0.5 мкМ лактата. Кроме того, один и тот же биосенсор использовали поочередно для определения лактата и пероксида водорода. Очевидно, что, имея в своей основе БЛ, датчик должен был реагировать и на Н202. Действительно, для биосенсоров удалось получить градуировочную зависимость для определения пероксида водорода, линейную в диапазоне от МО"7 до 5-10" М, коэффициент чувствительности в этом случае составил 1.1 А-л-моль'1-см"2, он совпал со значением, полученным для обычного микросенсора (см. табл. 1, методика IV, и табл. 5). Немного отличались пределы обнаружения, по сравнению с результатом, представленным в табл. 1, что, объясняли наличием мембраны на основе силоксана: с одной стороны, она препятствовала определению низких концентраций Н202, с другой - механически защищала БЛ, увеличивая верхнюю границу определяемых концентраций.

Таблица 5. Аналитические характеристики биосенсоров для определения лактата (/ - плотность тока, А/см2, с - концентрация Н20;, М, а - коэффициент чувствительности, А-л-моль'-см"2)

Определяемое вещество г = (а±Аа)с Диапазон определяемых содержаний, М •*г (п = 3)

а Д а

Лактат 0.50 0.03 5-10"7-5-10"4 0.05 (с = 5 мкМ)

Пероксид водорода 1.10 0.05 М0"7-5-10"3 0.05 (с = 1 мкМ)

Таблица 6. Сравнение аналитических характеристик датчиков на лактат, разработанного и известных из литературы

Сенсор Коэффициент чувствительности, мА-л-моль"''см-2 Диапазон определяемых содержаний, М Литературный источник

ЛОД на золотом микроэлектроде 30 2.5-10"4- 1.5-10"3 N. Ito, et al. // Biosensors & Bioelectronics. 1996. V. 11. P. 119.

ЛОД + БЛ на стеклоуглеродном электроде нет данных 2.8-10"7- 8.4' 10"4 D. Lowinsohn, M. Bertotti. И Journal of the Brazilian Chemical Society. 2008. V. 19(4), P. 637.

ЛОД на Р1 электроде 125 нет данных H. Minagawa, et al. // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13. P. 313.

ЛОД + БЛна стеклоуглеродном электроде (3 мм) 90 2-Ю-5-2-103 R. Gaqonyte, et al. // Sensors and Actuators B: Chemical. 2001. V. 79(1). P. 33.

ЛОД + Р1 на печатном электроде 16 до 2-10° A.L. Hart, et al. // Biosensors & Bioelectronics. 1996. V. 11. P. 263.

ЛОД + БЛна печатном электроде 180 5-Ю"7 - 1-Ю"3 Yashina Е.1., et al. // Analytical Chemistry. 2010. V. 82(5). P. 1601.

Биосенсор, ЛОД+БЛ 500 5-10"7 - 5' 10"4 настоящая работа

Таким образом, можно ожидать, что показания сенсора по лактату в присутствии пероксида водорода будут завышены, однако следует заметить, что трудно найти систему, в которой будут находиться оба аналита в соизмеримых концентрациях (так, в крови содержание лакгата в состоянии покоя организма на уровне 1-2 мМ, а Н2О2, как минимум, на два порядка меньше). Если сравнить полученный результат с данными литературы (табл. 6), то видно, что разработанные биосенсоры превосходят уже существующие датчики как по коэффициенту чувствительности, так и по величинам линейного интервала и нижней границы определяемых содержаний. Высокая чувствительность и широкий линейный диапазон разработанных биосенсоров позволяют использовать их в методах малоинвазивного анализа.

Выводы

1. Разработаны амперометрические микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода. Микросенсоры обладают улучшенными аналитическими характеристиками по сравнению с традиционными дисковыми электродами, модифицированными берлинской лазурью: коэффициент чувствительности увеличен в 1.5 раза и равен 1 А-л-моль*'-см"2, нижняя граница определяемых содержаний понижена в 10 раз и составляет 10 нМ Н202, градуировочная зависимость линейна в интервале от 1-Ю"8 до 1-Ю"3 М пероксида водорода.

2. При помощи метода атомно-силовой микроскопии показано, что покрытия берлинской лазури, оптимальные с точки зрения аналитических характеристик сенсоров, представляют собой поликристаллические пленки с размерами кристаллитов 50-100 нм и толщиной не более 100 нм.

3. Послойный электросинтез берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности микроэлектродов значительно увеличивает операционную стабильность

микросенсоров без существенного ухудшения их аналитических характеристик. Микросенсоры со стабилизированной БЛ демонстрируют неизменяющийся сигнал в присутствии 1-10"3 М Н202 в течение 3 ч, что, как минимум, в 30 раз дольше, чем для обычных микросенсоров.

0.5.мкМ, коэффициент чувствительности составляет не менее 0.5 Ачгмоль"'-см"2, что в 3 раза больше, чем для других датчиков на основе лактатоксидазы.

5. С применением микросенсоров на основе берлинской лазури и амперометрии разработана методика определения пероксида водорода с пределом обнаружения 8-10"9 М. Методика позволяет определять пероксид водорода в присутствии таких биологических объектов как ферментов, клеточных мембран и органелл. Микросенсоры можно применять для изучения биохимических реакций. В частности, с помощью микросенсоров удается регистрировать кинетику генерации пероксида водорода субмитохондриальными частицами.

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1. Karyakin A.A., Puganova Е.А., Bolshakov I.A.. Karyakina E.E. Electrochemical sensor with record performance characteristics. // Angewandte Chemie International Edition. 2007. V. 119. N. 40. P. 7822-7824.

2. Большаков И.А.. Выгодина T.B., Gennis R., Карякин A.A., Константинов A.A. Определение каталазной активности цитохром с оксидазы с помощью электродного микросенсора на перекись водорода. // Биохимия. 2010. Т. 75. Вып. 11. С. 1533-1543.

3. Карякин A.A., Карякина Е.Е., Большаков И.А.. Ситникова H.A. Способ приготовления высокостабильного чувствительного элемента сенсора на пероксид водорода. Заявка о выдаче патента РФ на изобретение № 2009144161 от 30.11.2009.

4. Bolshakov I.A.. Vavilova N.A., Karyakin A.A. Microsensors based on nanosized structures of Prussian Blue for hydrogen peroxide detection. The Fourth Moscow International Congress Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development, March 12-16 2007, Moscow, Russia. Congress Proceedings. Part 1. P. 87.

5. Elena E. Karyakina, Anastasya V. Borisova, Eugene I. Yashina, Ivan A. Bolshakov. Arkady A. Karyakin. Food and Clinical Analysis. The 11th International and The 1st Sino-Japan Bilateral Symposium on Electroanalytical Chemistry, August 2007, Changchun, China. Program and Extended Abstracts. P. 182.

6. Большаков И.А.. Вавилова H.A., Карякин A.A. Микросенсоры для определения пероксида водорода на основе наноразмерных структур БЛ. II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007», 7-12 октября 2007 г., Краснодар, Россия. Материалы конференции. С.251.

7. Яшина Е.И., Карякина Е.Е., Большаков И.А.. Карякин A.A. Биосенсорные системы для анализа качества продуктов питания на основе электродов,

модифицированных наноразмерными пленками БЛ. II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», 7-12 октября 2007 г., Краснодар, Россия. Материалы конференции. С. 487.

8. Вавилова Н.А., Большаков И.А.. Карякин А.А. Датчики для определения пероксида водорода на основе БЛ, стабилизированной гексацианоферратами никеля и кобальта. XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2008», 8-11апреля 2008 года, Москва, Россия. Материалы докладов на CD, секция «Фундаментальное материаловедение».

9. Nataliya A. Vavilova, Ivan A. Bolshakov, Arkady A. Karyakin. The Super-Stable Microsensor for Hydrogen Peroxide Detection based on Mixed Nickel-Iron Hexacyanoferrate Electrocatalyst. International Conference on Electrochemical Sensors (Matrafured 08), October 5-10, 2008, Dobogoko, Hungary. Book of Abstracts. P. 80.

10. Большаков И.А.. Вавилова H.A., Карякин А.А. Высокоэффективный микросенсор на основе БЛ для определения пероксида водорода. XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009», 13-18 апреля 2009 г., Москва, Россия. Материалы докладов на CD, секция «Химия», подсекция «Аналитическая химия».

11. Большаков И.А.. Вавилова Н.А., Карякин А.А. Высокоэффективный микросенсор на основе БЛ для определения пероксида водорода в живых системах. III Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», 27 сентября - 3 октября 2009 г., Краснодар, Россия. Материалы конференции. С. 121.

12. Bolshakov I.A.. Romanov V.V., Karyakin А.А. Prussian Blue based High Performance Microsensor for Hydrogen Peroxide Detection in Biosystems. The Second Nanotechnology International Forum, The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers, October 6-8, 2009, Moscow, Russia. Book of Abstracts. P. 478-479.

13. Большаков И.А.. Карякин А.А. Микросенсор на основе БЛ для определения пероксида водорода в биологических объектах. XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010», 12-15 апреля 2010 г., Москва, Россия. Материалы докладов на CD, секция «Фундаментальное материаловедение».

14. Большаков И.А.. Выгодина Т.В., Карякин А.А. Высокоэффективный микросенсор на основе БЛ для определения пероксида водорода в биологических объектах. Съезд аналитиков России и Школа молодых ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности», 26-30 апреля 2010 года, Москва, Россия. Сборник тезисов. С. 46.

Заказ № 92-а/10/10 Подписано в печать 14.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 ^С^)/ www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.т

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Большаков, Иван Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Пероксид водорода как важный аналит для современного анализа.

1.1. Методы определения пероксида водорода.

1.1.1. Спектрофотометрические методы.

1.1.2. Люминесцентные методы.

1.1.2.1. Флуориметрический анализ.

1.1.2.2. Хемилюминесценция.

1.1.3. Электрохимические методы.

1.1.3.1. Амперометрическое определение пероксида водорода на электродах из платины.

1.1.3.2. Ферментативные методы анализа пероксида водорода.

1.1.3.3. Другие электрохимические системы для определения пероксида водорода.

1.1.3.4. Датчики для определения пероксида водорода на основе берлинской лазури и гексацианоферратов переходных металлов.:.

1.1.3.5. Структура и свойства берлинской лазури.

1.2. Сравнение методов определения пероксида водорода.

Глава 2. Биосенсоры.'.

2.1. Общие сведения о биосенсорах.

2.2. Биосенсоры на основе берлинской лазури.

2.3. Определение лактата.

2.4. Использование ионообменных полиэлектролитов.

Глава 3. Электроды.

3.1. Материалы электродов.

3.2. Свойства микроэлектродов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Электроды.

4.2. Реагенты.

4.3. Оборудование.

4.4. Методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. Берлинская лазурь и ее тонкопленочные покрытия.

5.1. Электрохимическое осаждение берлинской лазури на поверхность электрода.

5.1.1. Импульсный метод электросинтеза покрытий берлинской лазури.

5.2. Визуализация электрокаталитической активности берлинской лазури методом сканирующей электрохимической микроскопии.

5.3. Морфология покрытий берлинской лазури.

5.3.1. АСМ-микроскопия сплошных пленок берлинской лазури.

5.3.2. АСМ-анализ структурированных покрытий берлинской лазури.

Глава 6. Микросенсор на основе берлинской лазури.

6.1. Изготовление микросенсоров.

6.1.1. Влияние материала микроэлектрода на качество пленки берлинской лазури.

6.1.2. Внутренний электрод сравнения микросенсора.

6.2. Аналитические характеристики микросенсоров.

6.2.1. Определение пероксида водорода с использованием микроэлектродов, модифицированных сплошной пленкой берлинской лазури.

6.2.2. Микросенсоры на пероксид водорода с макропористой структурой золота.'.

Глава 7. Стабилизация покрытий берлинской лазури.

7.1. Влияние полиэлектролитных мембран на стабильность микросенсоров.

7.2. Стабилизация поликристалла берлинской лазури гексацианоферратом никеля.

Глава 8. Практическое применение микросенсоров на основе берлинской лазури.

8.1. Мониторирование концентрации пероксида водорода в биологических объектах.

8.2. Мониторирование пероксида водорода в живых организмах.

8.3. Биосенсор для определения лактата.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода в биологических объектах"

Актуальность темы. Требования современного анализа — это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Электрохимические сенсоры как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. Они просты, удобны в применении, а также позволяют осуществлять непрерывный контроль ключевых аналитов, что является важным для клинической диагностики, контроля промышленного производства и состояния окружающей среды. Требования современной медицины делают необходимым анализ крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе, поскольку некоторые ключевые метаболиты (в частности, активные формы кислорода) являются нестабильными, и традиционные диагностические методы, требующие доставку образца к прибору, становятся неинформативными. Напротив, имплантируемые сенсоры способны давать корректную и своевременную информацию о состоянии пациента. Очевидно, такой персонизированный клинический анализ может быть осуществлен только с использованием химических или биологических сенсоров.

Современные медицина и биология рассматривают пероксид водорода как важнейший метаболит, являющийся индикатором окислительного стресса, воспалительных процессов в организме и апоптоза [1-3]. Также востребованы методы избирательного и экспрессного определения глюкозы и лактата — ключевых продуктов обмена веществ, определяющих физиологическое состояние человека [4].

Наиболее совершенным методом определения пероксида водорода является амперометрическая регистрация на электродах, модифицированных берлинской лазурью, которая по чувствительности, экспрессности и простоте исполнения намного превосходит все другие методы [5]. Электроды на основе берлинской лазури находят широкое применение при конструировании сенсоров пероксида водорода и биосенсоров, содержащих иммобилизованные оксидазы в качестве биочувствительного элемента [6-16]. Тем не менее, берлинская лазурь как электрокатализатор восстановления пероксида водорода не лишена одного недостатка, ограничивающего ее применение в электроанализе, — это недостаточная стабильность. Пленка берлинской лазури на поверхности электрода представляет собой осажденный поликристалл. Очевидно, подобные покрытия не обладают достаточной механической и операционной стабильностью.

Стремление к повышению чувствительности и избирательности, а также долговечности электрохимических сенсоров и биосенсоров породило огромное количество исследований, направленных на проектирование функциональных слоев на поверхности электродов. Значительные успехи в этой области происходят из химического подхода к нанотехнологиям, включая синтетический подход «снизу вверх» для получения наноструктурированных материалов на поверхности электродов (например, наноструктурированные пленки, полученные методом послойный самосборки [17], или ансамбли наноэлектродов [18-19]). Кроме того, понизить предел обнаружения электрохимического датчика можно за счет минимизации размера электрода, при которой изменяется соотношение сигнал/шум. В случае микроэлектродов большую роль играют краевые эффекты, связанные с полусферической диффузией определяемого вещества к поверхности электрода. При этом уменьшение радиуса электрода приводит к возрастанию плотности регистрируемого тока. Миниатюризация сенсоров также необходима для проведения анализа крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе.

Обзор компаний, производящих сенсоры на пероксид водорода показал, что существующие коммерческие решения преимущественно ориентированы на использование в промышленности и малопригодны для применения в клиническом анализе [20].

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач: создание амперометрических микросенсоров на основе берлинской лазури с использованием микроэлектродов со встроенным электродом сравнения для определения пероксида водорода; повышение стабильности покрытий берлинской лазури на поверхности микроэлектродов; увеличение чувствительности микросенсоров; иммобилизацию лактатоксидазы на поверхности микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью и создание биосенсора для определения лактата; расчет аналитических характеристик микросенсоров и анализ реальных биологических объектов, разработку методик определения пероксида водорода и лактата.

Научная новизна. Разработаны амперометрические микросенсоры для определения пероксида водорода путем электросинтеза берлинской лазури на поверхности микроэлектродов новой конструкции. Разработан импульсный метод электросинтеза берлинской лазури. Изучена морфология покрытий берлинской лазури; измерена толщина пленок катализатора, оптимальных с точки зрения аналитических характеристик сенсоров. Изучено влияние буферных слоев гексацианоферрата никеля на стабильность покрытий берлинской лазури и аналитические характеристики микросенсоров на их основе. Предложен способ структурирования берлинской лазури за счет предварительного синтеза макропористого золота на поверхности микроэлектродов. Показана применимость микросенсоров для определения пероксида водорода непосредственно в биологических объектах, в частности, в непрерывном режиме измерены скорости распада пероксида водорода, катализируемого цитохромоксидазами из митохондрий сердца быка и бактерии Л. $ркаего1с1е8 и скорость генерации пероксида водорода субмитохондриальными частицами. Путем иммобилизации лактатоксидазы поверх микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью, создан биосенсор на лактат.

Практическая значимость. Разработана конструкция микроэлектрода со встроенным хлоридсеребряным электродом сравнения, работающего по двухэлектродной схеме с любым коммерчески доступным потенциостатом. Получено несколько типов микросенсоров для определения пероксида водорода, обладающих следующими преимуществами: низким пределом обнаружения (до 8-10"9 М), высоким коэффициентом чувствительности (до 2.6 А-л-моль"'-см~2), широким диапазоном линейности градуировочного графика (от 1-Ю"8 до 1-103 М), высокой стабильностью (постоянный сигнал более 3 ч); создан биосенсор на лактат с нижней границей определяемых

I о содержаний 0.5 мкМ и коэффициентом чувствительности 0.5 А-л-моль" -см" . Разработана методика определения пероксида водорода в биологических системах. Показано, что при помощи микросенсоров можно регистрировать в непрерывном режиме даже небольшие изменения концентрации пероксида водорода в биологических объектах.

Положения, выносимые на защиту:

3. Результаты исследования морфологии и электрохимической активности покрытий берлинской лазури.

5. Методика определения пероксида водорода с пределом обнаружения 8- i О"9 М, позволяющая определять Н2О2 в присутствии ферментов, клеточных мембран и органелл.

6. Амперометрический биосенсор для определения лактата на основе берлинской лазури и лактатоксидазы.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Четвертом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), симпозиуме «The 11th International and The 1st Sino-Japan Bilateral Symposium on Electroanalytical Chemistry» (Чанчунь, 2007), Всероссийских конференциях по аналитической химии с международным учас тием «Аналитика России» (Краснодар, 2007, 2009), Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008-2010), конференции «International Conference on Electrochemical Sensors (Mátrafiired 08)» (Dobogókó, Венгрия, 2008), Втором Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009, 1 премия Конкурса работ молодых ученых), Съезде аналитиков России и Школе молодых ученых «Аналитическая химия — новые методы и возможности» (Москва, 2010) и др.

Вклад автора в представленную работу.

В основу диссертации положены результаты научных исследований, выполненных непосредственно автором в период 2007-2010 гг. Синтетическая, аналитическая части работы были выполнены в лаборатории электрохимических методов кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Исследования морфологии покрытий берлинской лазури осуществляли под руководством к.х.н., н.с. Иткиса Д.М. с использованием оборудования Факультета наук о материалах МГУ имени М.В.Ломоносова. Раствор полистирольных микросфер любезно предоставили к.х.н., н.с. Напольский К.С. и аспирант Саполетова H.A. (ФНМ МГУ). Измерения электрокаталитической активности берлинской лазури на сканирующем электрохимическом микроскопе проводились автором под руководством Артема Малюша, Dr. Kathrin Eckhard, Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann в Рурском Университете города Бохум (Германия) во время стажировки, осуществленной при финансовой поддержке Германской службы академических обменов (DAAD). Определение пероксида водорода в биологических объектах проводили совместно с к.б.н. Выгодиной Т.В., д.б.н., проф. Константиновым A.A. (НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, МГУ), эксперименты на мышах осуществляли с к.м.н. Бочаровой И.В., д.м.н. Романовым В.В. (Центральный НИИ туберкулеза РАМН).

Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 0б-03-33013-а и 07-03-12211-офи), гранта МНТЦ 32-09, а также государственных контрактов №№ П959, 02.512.11.2326.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных разделов (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка цитированной литературы из 199 ссылок. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, включая 66 рисунков и 11 таблиц.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

ВЫВОДЫ

1. Разработаны амперомегрические микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода. Микросенсоры обладают улучшенными аналитическими характеристиками по сравнению с традиционными дисковыми электродами, модифицированными берлинской лазурью: коэффициент чувствительности увеличен в 1.5 раза и равен 1 А-л-моль"'-см"2, нижняя граница определяемых содержаний понижена в 10 раз и составляет 10 нМ Н2О2, градуировочная зависимость линейна в интервале от ЫО"8 до 1-10-3 М пероксида водорода.

3. Послойный электросинтез берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности микроэлектродов значительно увеличивает операционную стабильность микросенсоров без существенного ухудшения их аналитических характеристик. Микросенсоры со стабилизированной БЛ демонстрируют неизменяющийся сигнал в присутствии 1-10"3 М Н2О2 в течение 3 ч, что, как минимум, в 30 раз дольше, чем для обычных микросенсоров.

4. Путем иммобилизации лактатоксидазы на поверхности микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью, создан амперометрический биосенсор для определения лактата, нижняя граница определяемых содержаний которого равна 0.5 мкМ, коэффициент чувствительности составляет не менее 0.5 А-л-моль"' см"2, что в 3 раза больше, чем для других датчиков на основе лактатоксидазы.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Большаков, Иван Александрович, Москва

1. S. Tada-Oikawa, Y. Hiraku, M. Kawanishi, S. Kawanishi. Mechanism for generation of hydrogen peroxide and change of mitochondrial membrane potential during rotenone-induced apoptosis. // Life Sciences, 2003, V. 73(25), p. 3277-3288.

2. M.A. Yorek. The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease. // Free Radic Res, 2003, V. 37(5), p. 471-80.

3. Y. Wei, Y. Zhang, Z. Liu, M. Guo. A novel profluorescent probe for detecting oxidative stress induced by metal and H2O2 in living cells. П Chemical Communications, 2010, V. 46(25), p. 4472-4474.

4. J. Wang. Amperometric biosensors for clinical and therapeutic drug monitoring: a review. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1999, V. 19(1-2), p. 4753.

5. A.A. Karyakin. Prussian Blue and Its Analogues: Electrochemistry and Analytical Applications. //Electroanalysis, 2001, V. 13(10), p. 813-819.

6. A.A. Karyakin, O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. A high-sensitive glucose amperometric biosensor based on prussian-blue modified electrodes. // Analytical Letters, 1994, V. 27(15), p. 2861-2869.

7. A.A. Karyakin, E.E. Karyakina. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors. // Sensors and Actuators B: Chemical, 1999, V. 57(1-3), p. 268-273.

8. A.A. Karyakin, O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. Prussian blue based first-generation biosensor a sensitive amperometric electrode for glucose. II Analytical Chemistry, 1995, V. 67(14), p. 2419-2423.

9. Q J. Chi, S.J. Dong. Amperometric biosensors based on the immobilization of oxidases in a Prussian Blue film by electrochemical codeposition. // Analytica Chimica Acta, 1995, V. 310(3), p. 429-436.

10. E.A. Puganova, A.A. Karyakin. New materials based on nanostructured Prussian blue for development of hydrogen peroxide sensors. // Sensors and Actuators B-Chemical, 2005, V. 109(1), p. 167-170.

11. F. Ricci, G. Palleschi. Sensor and biosensor preparation, optimisation and applications of Prussian Blue modified electrodes. I I Biosensors and Bioelectronics, 2005, V. 21(3), p. 389-407.

12. K.-S. Tseng, L.-C. Chen, K.-C. Ho. Amperometric detection of hydrogen peroxide at a Prussian Blue-modified FTO electrode. II Sensors and Actuators B: Chemical, 2005, V. 108(1-2), p. 738-745.

13. D. Lowinsohn, M. Bertotti. Flow injection analysis of blood L-lactate by using a Prussian Blue-based biosensor as amperometric detector. И Analytical Biochemistry, 2007, V. 365(2), p. 260-265.

14. D. Lowinsohn, M. Bertotti. A biosensor based on immobilization of lactate oxidase in a PB-CTAB film for FIA determination of lactate in beer samples. II Journal of the Brazilian Chemical Society, 2008, V. 19(4), p. 637-642.

15. F.N. Crespilho, V. Zucolotto, O.N. Oliveira Jr., F.C. Nart. Electrochemistry ofLayer-by-Layer Films: a review. //International Journal of Electrochemical Science, 2006, V. 1, p. 194-214.

16. C.R. Martin, D.T. Mitchell, Template-synthesized nanomaterials in electrochemistry, in Electro analytical Chemistry, Vol 21. 1999, Marcel Dekker: New York. p. 1-74.

17. P. Ugo, L.M. Moretto, F. Vezza. Ionomer-coated electrodes and nanoelectrode ensembles as electrochemical environmental sensors: Recent advances and prospects. II Chemphyschem, 2002, V. 3(11), p. 917-925.

18. R. Hage, A. Lienke. Applications of Transition-Metal Catalysts to Textile and Wood-Pulp Bleaching. // Angewandte Chemie International Edition, 2006, V. 45(2), p. 206-222.

19. Y. Wang, J. Huang, C. Zhang, J. Wei, X. Zhou. Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater by Using a Polyaniline Film and Platinum Particles Co-Modified Carbon Fiber Microelectrode. // Electroanalysis, 1998, V. 10(11), p. 776-778.

20. L. Marie, G.M. Greenway. Determination of hydrogen peroxide in rainwater in a miniaturised analytical system. // Analytica Chimica Acta, 2005, V. 548(1-2), p. 20-25.

21. S.B. Mathew, A.K. Pillai, V.K. Gupta. Spectrophotometry Determination of Hydrogen Peroxide Using Leucocrystal Violet in Micellar Medium. // Journal of Dispersion Science and Technology, 2009, V. 30(5), p. 609 612.

22. G.G. Guilbault, G.J. Lubrano. An enzyme electrode for amperometric determination of glucose. // Analytica Chimica Acta, 1973, V. 64(3), p. 439-455.

23. P. Niethammer, C. Grabher, A.T. Look, T.J. Mitchison. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. II Nature, 2009, V. 459(7249), p. 996-1000.

24. J.M. Cook-Mills. Hydrogen peroxide activation of endothelial cell-associated MMPS during VCAM-1-dependent leukocyte migration. I I Cellular and Molecular Biology, 2006, V. 52(4), p. 8-16.

25. C.E. Huckaba, F.G. Keyes. The Accuracy of Estimation of Hydrogen Peroxide by Potassium Permanganate Titration. I I Journal of the American Chemical Society, 1948, V. 70(4), p. 1640-1644.

26. D.T.V. Anh, W. Olthuis, P. Bergveld. A hydrogen peroxide sensor for exhaled breath measurement. // Sensors and Actuators B: Chemical, 2005, V. 111-112, p. 494-499.

27. N. Stephenson, A. Bell. Quantitative analysis of hydrogen peroxide by IH NMR spectroscopy. // Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, V. 381(6), p. 1289-1293.

28. Z.K. Shihabi. Direct analysis of hydrogen peroxide by capillaty electrophoresis. II Electrophoresis, 2006, V. 27(21), p. 4215-4218.

29. C. Matsubara, N. Kawamoto, K. Takamura. Oxo 5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)porphyrinato titanium(iv) an ultra-high sensitivity spectrophotometric reagent for hydrogen-peroxide. //Analyst, 1992, V. 117(11), p. 1781-1784.

30. K.F. Fernandes, C.S. Lima, F.M. Lopes, C.H. Collins. Hydrogen peroxide detection system consisting of chemically immobilised peroxidase and spectrometer. II Process Biochemistry, 2005, V. 40(11), p. 3441-3445.

31. A. Gomes, E. Femandes, J.L.F.C. Lima. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. 11 Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2005, V. 65(2-3), p. 45-80.

32. T.V. Votyakova, IJ. Reynolds. Detection of hydrogen peroxide with Amplex Red: interference by NADH and reduced glutathione auto-oxidation. // Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004, V. 431(1), p. 138-144.

33. B. Zhou, J. Wang, Z. Guo, II. Tan, X. Zhu. A simple colorimetric method for determination of hydrogen peroxide in plant tissues. II Plant Growth Regulation, 2006, V. 49(2), p. 113-118.

34. R.C. Matos, E.O. Coelho, C.F.d. Souza, F.A. Guedes, M.A.C. Matos. Peroxidase immobilized on Amberlite IRA-743 resin for on-line spectrophotometric detection of hydrogen peroxide in rainwater. //Talanta, 2006, V. 69(5), p. 1208-1214.

35. K. Hirakawa. Fluorometiy of hydrogen peroxide using oxidative decomposition of folic acid. II Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, V. 386(2), p. 244-248.

36. O. Johansson, J. Bood, M. Alden, U. Lindblad. Detection of Hydrogen Peroxide Using Photofragmentation Laser-Induced Fluorescence. I I Appl. Spectrosc., 2008, V. 62(1), p. 66-72.

37. V.V. Belousov, A.F. Fradkov, K.A. Lukyanov, D.B. Staroverov, K.S. Shakhbazov, A.V. Terskikh, S. Lukyanov. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. II Nature Methods, 2006, V. 3(4), p. 281-286.

38. A. Tahirovic, A. Copra, E. Omanovic-Miklicanin, K. Kalcher. A chemiluminescence sensor for the determination of hydrogen peroxide. II Talanta, 2007, V. 72(4), p. 13781385.

39. D. Lee, S. Khaja, J.C. Velasquez-Castano, M. Dasari, C. Sun, J. Petros, W.R. Taylor, N. Murthy. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. // Nature Materials, 2007, V. 6(10), p. 765-769.

40. D. Lee, V.R. Erigala, M. Dasari, J. Yu, R.M. Dickson, N. Murthy. Detection of hydrogen peroxide with chemiluminescent micelles. // Int J Nanomedicine, 2008, V. 3(4), p. 471-6.

41. Y. Zhang, G.S. Wilson. Electrochemical oxidation of H2O2 on Pt and Pt + Ir electrodes in physiological buffer and its applicability to H202~based biosensors. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 1993, V. 345(1-2), p. 253-271.

42. S.A.G. Evans, J.M. Elliott, L.M. Andrews, P.N. Bartlett, P.J. Doyle, G. Denuault. Detection of Hydrogen Peroxide at Mesoporous Platinum Microelectrodes. I I Analytical Chemistry, 2002, V. 74(6), p. 1322-1326.

43. A. Kicela, S. Daniele. Platinum black coated microdisk electrodes for the determination of high concentrations of hydrogen peroxide in phosphate buffer solutions. I I Talanta, 2006, V. 68(5), p. 1632-1639.

44. S. Kozlovskaja, G. Baltrunas, A. Malinauskas. Response of hydrogen peroxide, ascorbic acid, and paracetamol at a platinum electrode coated with microfilms of polyaniline. II Microchimica Acta, 2009, V. 166(3), p. 229-234.

45. M.R. Guascito, E. Filippo, C. Malitesta, D. Manno, A. Serra, A. Turco. A new amperometric nanostructured sensor for the analytical determination of hydrogen peroxide. II Biosensors and Bioelectronics, 2008, V. 24(4), p. 1057-1063.

46. X.-M. Miao, R. Yuan, Y.-Q. Chai, Y.-T. Shi, Y.-Y. Yuan. Direct electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide based on Nafion and copper oxide nanoparticles modifiedPt electrode. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 2008, V. 612(2), p. 157163.

47. A.I. Yaropolov, V. Malovik, S.D. Varfolomeev, I.V. Berezin. Electroreduction of hydrogen peroxide on an electrode with immobilized peroxidase. // Doklady Akademii Nauk SSSR, 1979, V. 249(6), p. 1399-1401.

48. L. Setti, A. Fraleoni-Morgera, I. Mencarelli, A. Filippini, B. Ballarin, M. Biase. An HRP-based amperometric biosensor fabricated by thermal inkjet printing. II Sensors and Actuators B-Chemical, 2007, V. 126(1), p. 252-257.

49. E. Ekanayake, D.M.G. Preethichandra, K. Kaneto. Bi-functional amperometric biosensor for low concentration hydrogen peroxide measurements using polypyrrole immobilizing matrix. II Sensors and Actuators B-Chemical, 2008, V. 132(1), p. 166-171.

50. Z. Wang, Q. Xu, H.Q. Wang, Q. Yang, J.H. Yu, Y.D. Zhao. Hydrogen peroxide biosensor based on direct electron transfer of horseradish peroxidase with vapor deposited quantum dots. II Sensors and Actuators B-Chemical, 2009, V. 138(1), p. 278282.

51. S. Varma, В. Mattiasson. Amperometric biosensor for the detection of hydrogen peroxide using catalase modified electrodes in polyacrylamide. // Journal of Biotechnology, 2005, V. 119(2), p. 172-180.

52. F. Mizutani, E. Ohta, Y. Mie, O. Niwa, T. Yasukawa. Enzyme immunoassay of insulin at picomolar levels based on the coulometric determination of hydrogen peroxide. // Sensors and Actuators B: Chemical, 2008, V. 135(1), p. 304-308.

53. S. Yabuki, S.-i. Fujii. Hydrogen peroxide biosensor based on a polyion complex membrane containing peroxidase and toluidine blue, and its application to the fabrication of a glucose sensor. // Microchimica Acta, 2009, V. 164(1), p. 173-176.

54. X. Liu, Y. Xu, X. Ma, G. Li. A third-generation hydrogen peroxide biosensor fabricated with hemoglobin and Triton X-100. // Sensors and Actuators B: Chemical, 2005, V. 106(1), p. 284-288.

55. Z. Li, X. Cui, J. Zheng, Q. Wang, Y. Lin. Effects of microstructure of carbon nanofibers ■ for amperometric detection of hydrogen peroxide. // Analytica Chimica Acta, 2007, V. 597(2), p. 238-244.

56. T. Monika, et al. An approach to in situ detection of hydrogen peroxide: application of a commercial needle-type electrode. // Physiological Measurement, 2007, V. 28(12), p. 1533.

57. S.A. Jaffari, J.C. Pickup. Novel hexacyanoferrate(III)-modiJied carbon electrodes: application in miniturized biosensors with potential for in vivo glucose sensing. // Biosensors & Bioelectronics, 1996, V. 11(11), p. 1167-1175.

58. S.A. Jaffari, A.P.F. Turner. Novel hexacyanoferrate(IJI) modified graphite disc electrodes and their application in enzyme electrodes . I. // Biosensors & Bioelectronics, 1997, V. 12(1), p. 1-9.

59. A. A. Karyakin, E.E. Karyakina, L. Gorton. The electrocatalytic activity of Prussian blue in hydrogen peroxide reduction studied using a wall-jet electrode with continuous flow. I! Journal of Electroanalytical Chemistry, 1998, V. 456(1-2), p. 97-104.

60. T. Ruzgas, E. Csoregi, J. Emneus, L. Gorton, G. MarkoVarga. Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and application. II Analytica Chimica Acta, 1996, V. 330(2-3), p. 123-138.

61. M.S. Lin, W.C. Shih. Chromium hexacyanoferrate based glucose biosensor. II Analytica Chimica Acta, 1999, V. 381(2-3), p. 183-189.

62. J. Wang, X.J. Zhang, M. Prakash. Glucose microsensors based on carbon paste enzyme electrodes modified with cupric hexacyanoferrate. II Analytica Chimica Acta, 1999, V. 395(1-2), p. 11-16.

63. J.Z. Zhang, S.J. Dong. Cobalt(II)hexacyanoferrate film modified glassy carbon electrode for construction of a glucose biosensor. 11 Analytical Letters, 1999, V. 32(15), p. 29252936.

64. A.A. Karyakin, E.A. Puganova, I.A. Budashov, I.N. Kurochkin, E.E. Karyakina, V.A. Levchenko, V.N. Matveyenko, S.D. Varfolomeyev. Prussian Blue based nanoelectrode arrays for H202 detection. 11 Analytical Chemistry, 2004, V. 76(2), p. 474-478.

65. A.A. Karyakin, E.A. Puganova, I.A. Bolshakov, E.E. Karyakina. Electrochemical sensor with record performance characteristics. H Angewandte Chemie-International Edition, 2007, V. 46(40), p. 7678-7680.

66. J. Lin, D.M. Zhou, S.B. Hocevar, E.T. McAdams, B. Ogorevc, X. Zhang. Nickel hexacyanoferrate modified screen-printed carbon electrode for sensitive detection of ascorbic acid and hydrogen peroxide. II Front Biosci, 2005, V. 10, p. 483-91.

67. A.B. Bocarsly, S. Sinlia. Chemically derivatized nickel surfaces synthesis of a new class of stable electrode interfaces. II Journal of Electroanalytical Chemistry, 1982, V. 137(1), p. 157-162.

68. K. Itaya, I. Uchida, V.D. Neff. Electrochemistry of polynuclear transition-metal cyanides Prussian blue and its analogs. II Accounts of Chemical Research, 1986, V. 19(6), p. 162-168.

69. P.J. Kulesza, Z. Galus. Polynuclear transition-metal hexacyanoferrate films — in situ electrochemical determination of their composition. II Journal of Electroanalytical Chemistry, 1989, V. 267(1-2), p. 117-127.

70. S.M. Chen. Electrocatalytic oxidation of thiosidfate by metal hexacyanoferrate film modified electrodes. I I Journal of Electroanalytical Chemistry, 1996, V. 417(1-2), p. 145153.

71. S3. M.S. Lin, T.F. Tseng, W.C. Shih. Chromium(III) hexacyanoferrate(II)-based chemical sensor for the cathodic determination of hydrogen peroxide. // Analyst, 1998, V. 123(1), p. 159-163.

72. I.L. de Mattos, L. Gorton, T. Laurell, A. Malinauskas, A.A. Karyakin. Development of biosensors based on hexacyanoferrates. // Talanta, 2000, V. 52(5), p. 791-799.

73. R. Pena, J. Gamboa, T. Paixao, M. Bertotti. Flow injection amperometric determination of hydrogen peroxide in household commercial products with a ruthenium oxide hexacyanoferrate modified electrode. // Microchimica Acta, 2009, V. 166(3), p. 277-281.

74. M.O. Salles, T. Paixao, M. Bertotti. Hydrogen peroxide monitoring in photo-Fenton reactions by using a metal hexacyanoferrate modified electrode. // International Journal of Electrochemical Science, 2007, V. 2(3), p. 248-256.

75. C.G. Tsiafoulis, P.N. Trikalitis, M.I. Prodromidis. Synthesis, characterization and performance of vanadium hexacyanoferrate as electrocatalyst of H2O2. H Electrochemistry Communications, 2005, V. 7(12), p. 1398-1404.

76. M.S. Lin, B.I. Jan. Determination of hydrogen peroxide by utilizing a cobalt(II) hexacyanoferrate-modified glassy carbon electrode as a chemical sensor. II Electroanalysis, 1997, V. 9(4), p. 340-344.

77. J. Bartoll, B. Jackisch, M. Most, E. Wenders de Calisse, C.M. Vogtherr. Early Prussian Blue. Blue and green pigments in the paintings by Watteau, Lancret and Pater in the collection of Frederick II of Prussia. U Techne, 2007, V. 25, p. 39-46.

78. V.D. Neff. Electrochemical Oxidation and Reduction of Thin Films of Prussian Blue. II Journal of the Electrochemical Society, 1978, V. 128(6), p. 886-887.

79. J.F. Duncan, P.W.R. Wigley. Electronic structure of the iron atoms in complex iron cyanides. II Journal of the Chemical Society, 1963, V. (FEB), p. 1120-1125.

80. J.F. Keggin, F.D. Miles. Structure and formulae of the Prussian Blue and related compounds. //Nature, 1936, V. 137(4), p. 577-578.

81. F. Herren, P. Fisher, A. Ludi, W. Halg. Neutron difraction study of Prussian Blue, Fe4Fe(CN)o.3 XH2O. Location of water molecules and long-range magnetic order. I I Inorganic Chemistry, 1980, V. 19, p. 956-959.

82. R. Yang, Z.B. Qian, J.Q. Deng. Electrochemical deposition of prussian blue from a single ferricyanide solution. // Journal of the Electrochemical Society, 1998, V. 145(7), p. 2231-2236.

83. К. Itaya, Т. Ataka, S. Toshima. Spectroelectrochemistry and electrochemical preparation method of prussian blue modified electrodes. // Journal of the American Chemical Society, 1982, V. 104(18), p. 4767-4772.

84. D. Ellis, M. Eckhoff, V.D. Neff. Electrochromism in the mixed-valence hexacyanides. I. Voltammetric and spectral studies of the oxidation and reduction of thin films of Prussian Blue. //Journal of Physical Chemistry, 1981, V. 85, p. 1225-1231.

85. A.L. Crumbliss, P.S. Lugg, N. Morosoff. Alkali metal cation effects in a Prussian blue surface modified electrode. I! Inorganic Chemistry, 1984, V. 23(26), p. 4701-8.

86. A. Eftekhari. Electrocatalysis and Amperometric Detection of Hydrogen Peroxide at an Aluminum Microelectrode Modified with Cobalt Hexacyanoferrate Film. // Microchimica Acta, 2003, V. 141(1), p. 15-21.

87. M. Gerlache, Z. Senturk, G. Quarin, J.-M. Kauffmann. Electrochemical behavior of H202 on gold. // Electroanalysis, 1997, V. 9(14), p. 1088-1092.

88. M.P. O'Halloran, M. Pravda, G.G. Guilbault. Prussian Blue bulk modified screen-printed electrodes for H2O2 detection andfor biosensors. U Talanta, 2001, V. 55(3), p. 605-611.

89. R. Garjonyte, A. Malinauskas. Electrocatalytic reactions of hydrogen peroxide at carbon paste electrodes modified by some metal hexacyanoferrates. // Sensors and Actuators B-Chemical, 1998, V. 46(3), p. 236-241.

90. I.L. de Mattos, L. Gorton, T. Ruzgas, A. A. Karyakin. Sensor for hydrogen peroxide based on Prussian Blue modified electrode: Improvement of the operational stability. // Analytical Sciences, 2000, V. 16(8), p. 795-798.

91. D.R. Thevenot, K. Toth, R.A. Durst, G.S. Wilson. Electrochemical Biosensors: Recommended Definitions and Classification. // Pure and Applied Chemistry, 1999, V. 71(12), p. 2333-2348.

92. А.А. Карякин, E.A. Уласова, М.Ю. Вагин, E.E. Карякина. Биосенсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики. // Сенсор, 2002, V. 1, р. 16-22.

93. J. Liu, J. Wang. A novel improved design for the first-generation glucose biosensor. // Food Technology and Biotechnology, 2001, V. 39(1), p. 55-58.

94. W. Zhang, G. Li. Third-Generation Biosensors Based on the Direct Electron Transfer of Proteins. II Analytical Sciences, 2004, V. 20(4), p. 603-609.

95. A.A. Karyakin, E.E. Karyakina, L. Gorton. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis. II Talanta, 1996, V. 43(9), p. 1597-1606.

96. R. Garjonyte, Y. Yigzaw, R. Meskys, A. Malinauskas, L. Gorton. Prussian Blue- and lactate oxidase-based amperometric biosensor for lactic acid. // Sensors and Actuators B-Chemical, 2001, V. 79(1), p. 33-38.

97. A.A. Karyakin, E.E. Karyakina, L. Gorton. Amperometric biosensorfor glutamate using Prussian Blue-based "artificial peroxidase" as a transducer for hydrogen peroxide. II Analytical Chemistry, 2000, V. 72(7), p. 1720-1723.

98. O. Smutok, G. Gayda, M. Gonchar, W. Schuhmann. A novel L-lactate-selective biosensor based on flavocytochrome b(2) from methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. // Biosensors & Bioelectronics, 2005, V. 20(7), p. 1285-1290.

99. R. Dringen, R. Gebhardt, B. Hamprecht. Glycogen in astrocytes possible function as lactate supply for neighboring cells. // Brain Research, 1993, V. 623(2), p. 208-214.

100. A. Schurr, R.S. Payne, J.J. Miller, B.M. Rigor. Brain lactate is an obligatory aerobic energy substrate for functional recovery after hypoxia: Further in vitro validation. II Journal ofNeurochemistry, 1997, V. 69(1), p. 423-426.

101. A. Schurr, R.S. Payne, J.J. Miller, B.M. Rigor. Brain lactate, not glucose, fuels the recovery of synaptic function from hypoxia upon reoxygenation: An in vitro study. H Brain Research, 1997, V. 744(1), p. 105-111.

102. J.W. Deitmer. Strategies for metabolic exchange between glial cells and neurons. 11 Respiration Physiology, 2001, V. 129(1-2), p. 71-81.

103. MJ. Patterson, S.D.R. Galloway, M.A. Nimmo. Variations in regional sweat composition in normal human males. II Experimental Physiology, 2000, V. 85(6), p. 869875.

104. M.D. Leonida, D.T. Starczynowski, R. Waldman, B. Aurian-BIajeni. Polymeric FAD used as enzyme-friendly mediator in lactate detection. // Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2003, V. 376(6), p. 832-837.

105. P.A. Sullivan, C.Y. Soon, W.J. Schreurs, J.F. Cutfield, M.G. Shepherd. Structure of L-lactate oxidase from mycobacteriurn-smegmatis. //Biochemical Journal, 1977, V. 165(2), p. 375-&.

106. N. Ito, S. Miyamoto, J. Kimura, I. Karube. The detection of lactate using the repeated application of stepped potentials to a micro-planar gold electrode. И Biosensors & Bioelectronics, 1996, V. 11(1-2), p. 119-126.

107. H. Minagawa, N. Nakayama, T. Matsumoto, N. Ito. Development of long life lactate sensor using theimostable mutant lactate oxidase. // Biosensors & Bioelectronics, 1998, V. 13(3-4), p. 313-318.

108. A.L. Hart, A.P.F. Turner, D. Hopcroft. On the use of screen- and ink-jet printing to produce amperometric enzyme electrodes for lactate. II Biosensors & Bioelectronics, 1996, V. 11(3), p. 263-270.

109. A.L. Hart, H. Cox, D. Janssen. Stabilization of lactate oxidase in screen-printed enzyme electrodes. И Biosensors & Bioelectronics, 1996, V. 11(8), p. 833-837.

110. N.G. Patel, A. Erlenkotter, K. Cammann, G.C. Chemnitius. Fabrication and characterization of disposable type lactate oxidase sensors for dahy products and clinical analysis. // Sensors and Actuators B-Chemical, 2000, V. 67(1-2), p. 134-141.

111. A. Guiseppi-Elie, S. Brahirn, G. Slaughter, K.R. Ward. Design of a subcutaneous implantable biochip for monitoring of glucose and lactate. // Ieee Sensors Journal, 2005, V. 5(3), p. 345-355.

112. J.A. Cox, P.M. Hensley, C.L. Loch. Evaluation of polycation-stabilized lactate oxidase in a silica sol-gel as a biosensor platform. II Microchimica Acta, 2003, V. 142(1-2), p. 1-5.

113. Электрохимия полимеров. Под ред. Тарасевич М. и Хрущевой Е. 1990: М.:Наука. 230 стр.

114. А.М. Тимонов. Твердые полимерные электролиты: структура, свойства и применение. И Соросовский образовательный журнал, 2000, У. 6(8), р. 69-75.

115. J. Wang, E. Dempsey, M. Ozsoz, M.R. Smyth. Amperometric enzyme electrode for theophylline. //Analyst, 1991, V. 116(10), p. 997-999.

116. C.Y. Chen, E. Tamiya, K. Ishihara, Y. Kosugi, Y.C. Su, N. Nakabayashi, I. Karube. A biocompatible needle-type glucose sensor based on platinum-electroplated carbon electrode. // Applied Biochemistry and Biotechnology, 1992, V. 36(3), p. 211-226.

117. T. Yao. Enzyme electrode for the successive detection of hypoxanthine and inosine. // Analytica Chimica Acta, 1993, V. 281(2), p. 323-326.

118. R.F.B. Turner, D.J. Harrison, R.Y. Rajotte, H.P. Baltes. A biocompatible enzyme electrode for continuous in vivo glucose monitoring in whole blood. // Sensors and Actuators B: Chemical, 1990, V. 1(1-6), p. 561-564.

119. I.L. de Mattos, L. Gorton, T. Ruzgas. Sensor and biosensor based on Prussian Blue modified gold and platinum screen printed electrodes. II Biosensors and Bioelectronics, 2003, V. 18(2-3), p. 193-200.

120. R. Garjonyte, A. Malinauskas. Amperometric glucose biosensor based on glucose oxidase immobilized in poly(o-phenylenediamine) layer. II Sensors and Actuators B: Chemical, 1999, V. 56(1-2), p. 85-92.

121. D. Pan, J. Chen, L. Nie, W. Tao, S. Yao. An amperometric glucose biosensor based on poly(o-aminophenol) and Prussian blue films at platinum electrode. // Analytical Biochemistry, 2004, V. 324(1), p. 115-122.

122. A. Abbaspour, M.A. Kamyabi. Electrochemical formation of Prussian blue films with a single ferricyanide solution on gold electrode. I I Journal of Electroanalytical Chemistry, 2005, V. 584(2), p. 117-123.

123. A. Eftekhari. Aluminum electrode modified with manganese hexacyanoferrate as a chemical sensor for hydrogen peroxide. // Talanta, 2001, V. 55, p. 395 402.

124. A.A. Karyakin, E.A. Kuritsyna, E.E. Karyakina, Y.L. Sukhanov. Diffusion controlled analytical performances of hydrogen peroxide sensors: Towards the sensor with the largest dynamic range. II Electrochimica Acta, 2009, V. 54(22), p. 5048-5052.

125. R.M. Wightman. Microvoltammetric electrodes. // Analytical Chemistry, 1981, V. 53(9), p. 1125-1134.

126. K.R. Wehmeyer, R.M. Wightman. Cyclic voltammetiy and anodic-stripping voltammetry with mercury ultramicroelectrodes. II Analytical Chemistry, 1985, V. 57(9), p. 19891993.

127. S. Pons, M. Fleischmann. The behavior of microelectrodes. // Analytical Chemistry, 1987, V. 59(24), p. 1391-1399.

128. A.J. Bard, L.R. Faulkner, Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, 2nd Edition. 2001: John Wiley & Sons. 856 pages, p. 169.

129. P.J. Lingane. Chronopotentiometry + Chronoamperometry with Unshielded Planar Electrodes. //Analytical Chemistry, 1964, V. 36(9), p. 1723-1726.

130. Z.G. Soos, P.J. Lingane. Derivation of chronoamperometric constant for unshielded circular planar electrodes. // Journal of Physical Chemistry, 1964, V. 68(12), p. 38213828.

131. J. Heinze. Diffusion processes at finite (micro) disk electrodes solved by digital simulation. //Journal of Electroanalytical Chemistry, 1981, V. 124, p. 73-86.

132. K. Aoki, J. Osteryoung. Diffusion-controlled current at the stationary finite disk electrode theory. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 1981, V. 122(MAY), p. 1935.

133. K. Aoki. Theory of ultramicroelectrodes. П Electroanalysis, 1993, V. 5, p. 627-39.

134. K.B. Oldham. Edge effects in semiinfinite diffusion. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 1981, V. 122, p. 1-17.

135. Б.Б. Дамаскин, O.A. Петрий, Г.А. Цирлина, Электрохимия, 2 изд. 2008: Москва: Химия. 672 стр., стр. 433-442.

136. А.Е. Cohen, R.R. Kunz. Large-area interdigitated array micro electrodes for electrochemical sensing. // Sensors and Actuators B: Chemical, 2000, V. 62(1), p. 23-29.

137. J. Chen, C.-s. Cha. Detection of dopamine in the presence of a large excess of ascorbic acid by using the powder microelectrode technique. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 1999, V. 463(1), p. 93-99.

138. M. Morita, O. Niwa, T. Horiuchi. Interdigitated array microelectrodes as electrochemical sensors. // Electrochimica Acta, 1997, V. 42(20-22), p. 3177-3183.

139. R. Wehrens, W.E. van der Linden. Calibration of an array of voltammetric microelectrodes. И Analytica Chimica Acta, 1996, V. 334(1-2), p. 93-101.

140. J.-D. Qiu, H.-Z. Peng, R.-P. Liang, M. Xiong. Preparation of Three-Dimensional Ordered Macroporous Prussian Blue Film Electrode for Glucose Biosensor Application. II Electroanalysis, 2007, V. 19(11), p. 1201-1206.

141. A. Goux, J. Ghanbaja, A. Walcarius. Prussian Blue electrodeposition within an oriented mesoporous silica film: preliminary observations. I I Journal of Materials Science, 2009, V. 44(24), p. 6601-6607.

142. К. Aoki, J. Osteryoung. Diffusion controlled current at a stationary finite disk electrode -experiment. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 1981, V. 125(2), p. 315-320.

143. R. Feeney, S.P. Kounaves. Microfabricated ultramicroelectrode arrays: Developments, advances, and applications in environmental analysis. // Electroanalysis, 2000, V. 12(9), p. 677-684.

144. H.X. He, Q.G. Li, Z.Y. Zhou, H. Zhang, S.F.Y. Li, Z.F. Liu. Fabrication of microelectrode arrays using microcontact printing. // Langmuir, 2000, V. 16(25), p. 9683-9686.

145. Y.H. Lanyon, D.W.M. Arrigan. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. // Sensors and Actuators B-Chemical, 2007, V. 121(1), p. 341-347.

146. M. Riepl, V.M. Mirsky, O.S. Wolfbeis. Electrical control of alkanethiols self-assembly on a gold surface as an approach for preparation of microelectrode arrays. // Mikrochimica Acta, 1999, V. 131(1-2), p. 29-34.

147. P. Karam, L.I. Halaoui. Sensing of H2O2 at low surface density assemblies of pt nanoparticles in polyelectrolyte. // Analytical Chemistry, 2008, V. 80(14), p. 5441-5448.

148. I. Choi, S.K. Kang, J. Lee, Y. Kim, J. Yi. Fabrication of island-type microelectrode via AFM lithography for a highly sensitive Pt-ion detection system. I I Sensors and Actuators B: Chemical, 2008, V. 129(2), p. 734-740.

149. R.G. Compton, G.G. Wildgoose, N.V. Rees, I. Streeter, R. Baron. Design, fabrication, characterisation and application of nanoelecfrode arrays. II Chemical Physics Letters, 2008, V. 459(1-6), p. 1-17.

150. E.C. Walter, M.P. Zach, F. Favier, B.J. Murray, K. Inazu, J.C. Hemminger, R.M. Penner. Metal nanowire arrays by electrodeposition. // Chemphyschem, 2003, V. 4(2), p. 131138.

151. Ф. Шолыд, Электроаналитические методы. Теория и практика. 2006: Москва: "БИНОМ. Лаборатория знаний". 326 стр., стр. 260-264.

152. D.M. Mitchell, R.B. Gennis. Rapid Purification of Wildtype and Mutant Cytochrome с Oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni2+-NTA Affinity Chromatography. // FEBS Lett., 1995, V. 368, p. 148-150.

153. F.L. Crane, J.L. Glenn, D.E. Green. Studies on the electron transfer system IV. The electron transfer particle. // Biochimica et Biophysica Acta, 1956, V. 22(3), p. 475-487.

154. H.U. Bergmeyer, K. Gawehn, M. Grassl, Methoden der enzymatischen Analyse, ed. H.U. Bergmeyer. Vol. 1. 1970, Weinheim/BergstraBe: Verlag Chemie. pp. 411-412.

155. A. Walcarius. Template-directed porous electrodes in electroanalysis. // Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, V. 396(1), p. 261-272.

156. G.M. Swain, Solid Electrode Materials: Pretreatment and Activation, in Handbook of Electrochemistry, G.Z. Cynthia, Editor. 2007, Elsevier: Amsterdam, 934 pages, p. 121.

157. ГОСТ 9.305-84. Единая система защиты от коррозии и старения. Покрытия металлические и неметаллические неорганические. Операции технологических процессов получения покрытий. Издание официальное. 2003: Москва: ИПК Издательство Стандартов.

158. V.M. Mirsky. New electroanalytical applications of self assembled monolayers. II TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2002, V. 21(6-7), p. 439-450.

159. J.J. Gooding, F. Mearns, W.R. Yang, J.Q. Liu. Self-assembled monolayers into the 21 (st) century: Recent advances and applications. // Electroanalysis, 2003, V. 15(2), p. 81-96.

160. P. Jiang, J.F. Bertone, K.S. Hwang, V.L. Colvin. Single-Crystal Colloidal Multilayers of Controlled Thickness. II Chemistry of Materials, 1999, V. 11(8), p. 2132-2140.

161. R. Szamocki, P. Masse, S. Ravaine, V. Ravaine, R. Hempelmann, A. Kuhn. Multicomponent macroporous materials with a controlled architecture. И Journal of Materials Chemistry, 2009, V. 19(3), p. 409-414.

162. T. Tsukihara, H. Aoyama, E. Yamashita, T. Tomizaki, H. Yamaguchi, K. Shinzawaltoh, R. Nakashima, R. Yaono, S. Yoshikawa. The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome с oxidase at 2.8 angstrom. И Science, 1996, V. 272(5265), p. 1136-1144.

163. T. Soulimane, G. Buse, G.P. Bourenkov, H.D. Bartunik, R. Huber, M.E. Than. Structure and mechanism of the aberrant ba(3)-cytochrome c oxidase from Thermits thermophilus. // Embo Journal, 2000, V. 19(8), p. 1766-1776.

164. Y. Orii, K. Okunuki. Studies on Cyochrome a. X. Effect of Hydrogen Peroxide on Absorption spectra of Cytochrome a. II J. Biochem., 1963, V. 54(3), p. 207-213.

165. D. Bickar, J. Bonaventura, C. Bonaventura. Cytochrome c Oxidase Binding of Hydrogen Peroxide. II Biochemistry, 1982, V. 21(21), p. 2661-2666.

166. A.C.F. Gorren, H. Dekker, R. Wever. The oxidation of cytochrome c oxidase by hydrogen peroxide. // Biochim. Biophys. Acta, 1985, V. 809(1), p. 90-96.

167. L.C. Weng, G.M. Baker. Reaction of hydrogen-peroxide with the rapid form of resting cytochrome-oxidase. //Biochemistry, 1991, V. 30(23),p. 5727-5733.

168. L. Qin, J. Liu, D.A. Mills, D.A. Proshlyakov, C. Hiser, S. Ferguson-Miller. Redox-Dependent Conformational Changes in Cytochrome a Oxidase Suggest a Gating Mechanism for Proton Uptake. //Biochemistry, 2009, V. 48(23), p. 5121-5130.

169. M.A. Sharpe, M.D. Krzyaniak, S.J. Xu, J. McCracken, S. Ferguson-Miller. EPR Evidence of Cyanide Binding to the Mn(Mg) Center of Cytochrome c Oxidase: Support for Cu-A-Mg Involvement in Proton Pumping. II Biochemistry, 2009, V. 48(2), p. 328335.

170. V.V. Barynin, M.M. Whittaker, S. Antonyuk, V.S. Lamzin, P.M. Harrison, P.J. Artymiuk, J.W. Whittaker. Crystal structure of manganese catalase from Lactobacillus plantarum. II Structure, 2001, V. 9, p. 725-738.

171. M. Ksenzenko, A.A. Konstantinov, G.B. Khomutov, A.N. Tikhonov, E.K. Ruuge. Effect of electron-transfer inhibitors on superoxide generation in the cytochrome-bcl site of the mitochondrial respiratory-chain. II Febs Letters, 1983, V. 155(1), p. 19-24.

172. A. Borek, M. Sarewicz, A. Osyczka. Movement of the Iron-Sulfur Head Domain of Cytochrome bc(l) Transiently Opens the Catalytic Q(o) Site for Reaction with Oxygen. II Biochemistry, 2008, V. 47(47), p. 12365-12370.

173. A. Boveris, B. Chance. Mitochondrial generation of hydrogen peroxide general properties and effect of hyperbaric-oxygen. // Biochemical Journal, 1973, V. 134(3), p. 707-716.