Высокоэффективные электрохимические сенсоры на основе наноразмерных пленок и нано-структур электрокатализатора тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ь—

КУРИЦЫНА ЕЛЕНА АНДРЕЕВНА

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ ПЛЕНОК И НАНО СТРУКТУР ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗАТОРА

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Карякин А.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ярополов А.И.

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

кандидат химических наук Ефимов О.Н.

Институт проблем химической физики РАН

Ведущая организация: Институт Физической химии и электрохимии

им. А.Н. Фрумкина РАН

Защита состоится «/8» апреля 2006 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «/$» марта 2006года

Ученый секретарь диссертационного совета, '

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Требования современного анализа - это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессносгь. Электрохимические сенсоры как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. Они удобны в применении, а также позволяют осуществлять непрерывный контроль ключевых аналитов, что является важным для клинической диагностики, контроля промышленного производства и состояния окружающей среды. Кроме того, для современной медицины становится необходимым анализ крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе, поскольку анализ, проводимый при использовании современных экспериментальных методов (при отборе кусочка ткани и доставке его к аналитическому прибору), в ряде случаев становится неинформативным из-за разложения некоторых ключевых метаболитов, в частности, активных форм кислорода. Очевидно, такой клинический анализ может быть осуществлен только с использованием химических или биологических сенсоров.

Более 90% всех коммерчески значимых биосенсоров и аналитических наборов на основе ферментов основаны на действии оксидаз. Эти ферменты катализируют окисление специфического субстрата кислородом воздуха. При этом кислород восстанавливается до пероксида водорода. Таким образом, для создания биосенсоров необходим чувствительный датчик на пероксид водорода.

Важным маркером для современной медицины, экологии и различных областей промышленности является пероксид водорода. В клинической диагностике в последнее десятилетие большое внимание уделяется проблеме окислительного стресса, который заключается в дисбалансе окислительной и восстановительной систем организма. Пероксид водорода может служить маркером окислительного стресса и степени воспалительного процесса.

Накопление пероксида водорода в грунтовых и дождевых водах в качестве отходов производства и атомных станций негативно сказывается на экологии и здоровье людей. Пероксид водорода используется для дезинфекции воды и тары пищевых продуктов, что делает важным определение его остаточных концентраций.

Наиболее чувствительным и селективным методом определения концентрации

пероксида водорода является амперометрическая детекция с использованием

электродов, модифицированных Берлинской Лазурью i CM hl мима^гчакие датчики

•I rut. НАЦИОНАЛЬНАЯ библиотека j

I iinntfp

1 1II II I»««1 ^

позволяют осуществлять анализ только до концентраций 10"7 М. Однако, для целей клинической диагностики и при экологическом мониторинге требуется дальнейшее понижение предела определения.

Понизить предел обнаружения электрохимического датчика можно при уменьшении размеров электрода за счет увеличения соотношения сигнал/шум. В случае микроэлектродов большую роль играют краевые эффекты, связанные с полусферической диффузией определяемого вещества к поверхности электрода. При этом уменьшение радиуса электрода приводит к возрастанию плотности регистрируемого тока. Миниатюризация сенсоров также необходима для проведения анализа крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе.

В настоящей работе предложно создание высокоэффективных микросенсоров на основе Берлинской лазури для определения пероксида водорода.

Однако отдельные микроэлектроды трудно использовать, так как величина регистрируемого тока очень мала. С целью увеличения общего тока используют системы микроэлектродов, состоящие из множества отдельных электродов, вмонтироваттых в общую изолирующую основу и соединенных с одним общим токоотводом. Для получения систем микроэлектродов используются методы микроэлектроники, электронно-лучевые и ионно-лучевые технологии, рентгеновская литография, высокотемпературная литография, фотолитография. Следует отметить, что физические методы изготовления систем микроэлекгродов довольно дороги и трудоемки и, кроме того, не всегда пригодны.

В данной работе в качестве альтернативы физическим методам предложено создание систем наноэлектродов путем наноструктурирования высокоэффективного электрокатализатора на относительно инертной поверхности электрода.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы было создание высокоэффективных сенсоров для определения пероксида водорода на основе наноразмерных пленок и нано-структур элекгрокатализатора.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать и исследовать аналитические характеристики микросенсоров для определения пероксида водорода на основе Берлинской лазури.

•Показать возможность создания систем наноэлектродов наноструктурированием электрокатализатора на относительно инертной поверхности

электрода путем электроосаждения через жидко-кристаллические матрицы.

4

•Разработать новые подходы к наноструктурированию.

•Изучить аналитические характеристики полученных систем наноэлектродов на основе Берлинской лазури в отношении определения пероксида водорода.

•Показать возможность применения созданных сенсоров для анализа реальных объектов.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработаны микроэлектроды, модифицированные Берлинской лазурью, позволяющие осуществлять определение пероксида водорода вплоть до концентраций 10"8 М. При этом чувствительность микроэлектродов с диаметром 0,125 мм составляет 2,5 А/Мсм2, что в 5 раз выше по сравнению с дисковыми электродами миллиметрового размера. Показана возможность использования полученных микроэлектродов для определения пероксида водорода в физиологических жидкостях.

Впервые осуществлено наноструктурирование Берлинской лазури (высокоэффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода) на относительно инертной поверхности электрода путем электроосаждения через жидкокристаллические матрицы. Методом атомно-силовой микроскопии подтверждено, что полученные покрытия представляют собой отдельные образования элекгрокатализатора субмикронного размера. Предложены новые пути нанострукгурирования электрокатализатора ну1ем осаждения через силоксановые матрицы, а также путем остановки электросинтеза на стадии нуклеации.

Электроды, модифицированные наноструюгурированной Берлинской лазурью, представляют собой системы наноэлектродов с рекордными аналитическими характеристиками. Предел обнаружения пероксида водорода составляет 10'9 М, что на два порядка ниже по сравнению с электродами, модифицированными сплошной пленкой Берлинской лазури. Диапазон определяемых концентраций линеен на протяжении 7 порядков концентрации пероксида водорода. Это является абсолютным рекордом в электроанализе в настоящее время.

Клиническая применимость датчиков на основе Берлинской лазури показана на примере анализа конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ). Уровень пероксида водорода в КВВ может быть использован для оценки активности воспаления в дыхательных путях при пневмонии, бронхоэкгазах, бронхиальной астме и ХОБЛ и определения эффективности противовоспалительного лечения.

Апробапия работы.

Основные результаты работы представлены на конференциях: XIIй1 International symposium on Bioelectrochemistry and bioenergetics (Florence, Italy, 2003), NATO ASI "Smart sensors and MEMS" (Povoa de Varzim, Portugal, 2003), European Materials Research Society 2004 Fall Meeting (Warsaw, Poland, 2004), 14-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания (Москва, Россия, 2004), Всероссийская конференция «Аналитические приборы», (Санкт-Петербург, Росси, 2005), International conference "Analytical chemistry and chemical analysis" (AC&CA-05) (Kyiv, Ukraine, 2005), Surface Modification for Chemical and Biochemical Sensing 2005 Workshop (Kazaimierz Dolny, Poland, 2005), 15-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания (Москва, Россия, 2005), 47 Kongress der Deutschen Gesellschaft Pneumologie (Nürnberg, Germany, 2006).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 13 работ, в том числе 5 статей в международных и отечественных журналах и 8 тезисов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, а также изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 188 ссылок. Работа изложена на 149 страницах, содержит 37 рисунков и 12 таблиц.

Список сокращений

АОТ - 2-этилгексил сульфоксинат натрия

АСМ - атомно-силовая микроскопия

БА - бронхиальная астма

БЛ - Берлинская лазурь

ЖК - жидко-кристаллический

ЖКМ - жидко-кристаллические матрицы

КВВ - конденсат выдыхаемого воздуха

ПАВ - поверхностно активное вещество

ХОБЛ - хроническая обструкгивная болезнь легких

Х.с.э. - хлорсеребряный электрод.

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цели и задачи.

В главе 1 дано описание трансдьюсеров пероксида водорода, их физико-химические характеристики и аналитические приложения.

Глава 2 посвящена улучшению аналитических характеристик электрохимических сенсоров путем минимизации размеров электродов. Приводятся методы получения систем микро- и наноэлеюродов Описываются методы наносгруктурирования материалов.

В главах 3-5 описываются экспериментальные методы исследования, методики модификации поверхности электродов, наносгруктурирования электрокатализатора, приготовления сенсоров и микросенсоров и их тестирования.

В работе в качестве рабочих электродов использовались дисковые стеклоуглеродные электроды, запрессованные в тефлон и золотые микроэлектроды в медицинских катетерах

Все электрохимические измерения проводились в трехэлектродной ячейке с разделенным пространством всех электродов. В качестве электрода сравнения использовался хлорсеребряный электрод в 1 М KCl (х.с.э.), в качестве вспомогательного - платиновая сетка или стеклоуглеродный электрод.

Электроосаждение Берлинской лазури проводили в гальваностатическом режиме, при значении плотности постоянного тока 40 - 100 мкА/см2 в течение 60 секунд, потенциостатически при значении потенциала +0,4 - +0,5 В (х.с.э.) или потенциодипамически при значениях потенциала рабочего электрода от +0,4 - +0,5 до +0,7 - +0,8 В (х.с.э.) при скоростях развертки потенциала от 20 мВ/с до 100 мВ/с. Ростовой раствор содержал Кз[Ре(С1Ч)б] и FeCb в фоновом электролите в равных концентрациях. Наноструктурирование Берлинской лазури осуществляли элекгроосаждением через различные матрицы на поверхности электрода с их последующим удалением или путем остановки электросинтеза на стадии нуклеации.

Исследование электродов, модифицированных Берлинской лазурью, проводили в проточно-инжекционном режиме в отношении определения пероксида водорода. Проточно-инжекционная система состояла из перистальтического насоса и инжектора с объемом петли 50 мкл, соединенного с проточной амперометрической ячейкой типа wall-jet, в которую монтировался электрод. Входное отверстие ячейки было снабжено хлорсеребряным электродом сравнения в 1 М KCl. В качестве вспомогательного электрода использовалась трубка из нержавеющей стали, служащая выходным отверстием ячейки. Расстояние между рабочим электродом и соплом ячейки

7

составляло примерно 2 мм. Для тестирования амперометрического сенсора ячейка подсоединялась к потенциостату, снабженному самописцем, или к электрохимической системе, соединенной с персональным компьютером IBM.

В главах 6-9 изложены результаты работы и их обсуждение.

Глава 6. Берлинская лазурь как наилучший электрокатализатор восстановления пероксида водорода

Наиболее широко используемые амперометрические датчики на пероксид водорода представлены в таблице 1. Видно, что электроды на основе Берлинской лазури обладают наилучшей селективностью и максимальной электрохимической константой. Кроме того, по сравнению с пероксидазными электродами, датчики на основе Берлинской лазури гораздо стабильнее.

Таблица 1. Сравнение амперометрических датчиков на пероксид водорода.

Сенсор Селективность, jmo2/jo2 Электрохимическая константа, см/с

Платиновый электрод 0,1 410"6

Пероксидазный электрод 30-40 1 10'3

Электрод на основе БЛ 400-600 1 10"'

Аналитические характеристики электродов, модифицированных БЛ, изучались в проточно-инжекционном режиме. В качестве характеристик были выбраны следующие:

1. Линейный диапазон определяемых концентраций.

2. Предел обнаружения пероксида водорода (нижний предел линейного диапазона определяемых концентрация).

3. Отношение тока пика восстановления пероксида водорода с концентрацией к значению фонового тока в проточно-инжекционном режиме.

4. Чувствительность анализа, определяемая как тангенс угла наклона линейного участка градуировочного графика.

5. Воспроизводимость получаемых сенсоров.

6. Стабильность сенсоров.

При использовании электродов, модифицированных Берлинской лазурью, в проточно-инжекционной системе при потенциале рабочего электрода 0 мВ, удается достичь чувствительности равной 0,5 А/Мсм2. Среднее квадратичное отклонение для

чувствительностей электродов, модифицированных сплошным покрытием БЛ составляет около 8%. В режиме постоянного потока субстрата или при измерении в замкнутом объеме с постоянным перемешиванием (batch-mode) чувствительность анализа равна 1 А/Мсм2. Предел обнаружения пероксида водорода при использовании электродов с обычным покрытием Берлинской Лазури составляет 10"7 М. При измерении пероксида водорода меньших концентраций отклика не наблюдается. Значение отклика на пероксид водорода с концентрацией 10"6 М оказывается равным примерно 12 нА, что составляет 50% от значения фона.

Операционная стабильность данных датчиков исследовалась при инжектировании 10"4 М пероксида водорода. Стопроцентная стабильность сохраняется в течение более 1000 измерений. При хранении сенсоров при комнатной температуре на воздухе с течение года, не происходит потери чувствительности.

Уменьшить значение фонового тока можно, проводя измерения при большем потенциале. С целью увеличения отношения сигнал/фон измерения проводили при потенциале 50 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения. В данных условиях фоновый ток для электродов, модифицированных БЛ, составил 8-11 нА, что в 2 - 2,5 раза ниже, чем при потенциале 0 мВ (х.с.э.).

Отношение сигнала на 10"4 М пероксида водорода к фону составило 0,9 при 50 мВ, по сравнению с 0,5 для измерения при 0 мВ. Однако предел обнаружения пероксида водорода таким образом понизить не удалось, и он остался на уровне 10"7 М. Чувствительность анализа при повышении потенциала рабочего электрода несколько уменьшилась и составила около 0,4 А/Мсм2.

Глава 7. Получение и исследование микроэлектродов, модифицированных Берлинской Лазурью

Понизить предел обнаружения электрохимического датчика можно при уменьшении размера электрода.

В случае микроэлектродов, становятся значительными краевые эффекты, связанные с полусферической диффузией определяемого вещества к поверхности электрода. В результате перехода к полусферической диффузии достигаются большие значения плотности регистрируемого тока и соответственно более высокая чувствительность. А также при минимизации размера электродов увеличивается соотношение сигнал/шум. Все это позволяет достигать более низкого предела обнаружения.

При выведении системы из состояния равновесия, диффузионный ток описывается уравнением Коттрелла.

где I - ток, I - время, К - радиус электрода, С - концентрация определяемого вещества, п - количество электронов, принимающих участие в реакции, Б -постоянная Фарадея коэффициент диффузии.

Это уравнение выведено для линейной диффузии и не учитывает краевые эффекты. Линган вывел корректирующий член уравнения, учитывающий краевые эффекты.

Иш/ тсЯ2С = птш1 (1 + 2,12 (ЕНЛ12)1/2),

В случае микроэлектродов, то есть при уменьшении радиуса, корректирующий член для уравнения Котрелла, становится преобладающим, что приводит к пропорциональности тока радиусу электрода.

I = 4пБСОЯ

В то же время емкостной ток, приводящий к шуму фонового тока, остается пропорционален квадрату радиуса, то есть отношение регистрируемого и емкостного тока обратно пропорционально радиусу электрода. Таким образом, при уменьшении размеров электрода, соотношение сигнал/шум возрастает. Кроме того, в случае микроэлекгродов ток перестает зависеть от времени. То есть установление стационарного состояния происходит очень быстро.

Для того чтобы эти эффекты были заметны, необходимо, чтобы реакция протекала в диффузионном режиме. Примером такой реакции может быть электрокатализ восстановления пероксида водорода на электродах, модифицированных Берлинской лазурью. Использование БЛ в качестве электрокатализатора открывает возможность создания сенсоров на ее основе с низким пределом обнаружения и высокой чувствительностью путем использования наноразмерных покрытий.

С целью создания сенсоров с низким пределом обнаружения пероксида водорода было осуществлено электроосаждение Берлинской Лазури на золотые микроэлектроды с диаметрами 125 и 50 мкм.

5 ОхЮ"4

4 0x10"

3 0x10"

N 8

5 2 0x10

б

1 ОхЮ"4

00-^—

00

5 0x10''

1 0x1о"

[Н2О2], М

Рис. 1 Градуировочные графики определения пероксида водорода при помощи электродов, модифицированных Берлинской лазурыо, с диаметром (а) 0,05 мм, (б) 0,125 мм, (в) 2 мм.

При использовании микроэлектродов, модифицированных БЛ, чувствительность определения пероксида водорода в проточно-инжекционном режиме повысилась до 2,5 А/Мсм2 для микроэлектрода с радиусом 125 мкм и до 4,5 А/Мсм2 для 50 мкм (потенциал рабочего электрода 0 мВ) по сравнению с чувствительностью 0,5 А/Мсм2 для макроэлектрода (рис. 1). Среднее квадратичное отклонение для чувствительностей микроэлектродов, модифицированных Берлинской лазурью составило около 7,5 %.

Уровень шума ^модифицированных микроэлектродов составлял от 0,5 до 1 пА (1*10"12 А). После электроосаждения Берлинской лазури значения шума увеличивались до 2 пА. Шум фонового тока для микроэлектрода с диаметром 0,125 мм, модифицированного Берлинской лазурью при постоянном перемешивании составил 4 пА. Увеличение стационарного тока в ответ на добавление минимально определяемой концентрации пероксида водорода 10"8 М составляет 3-4 пА. При добавлении 2*10"8 М пероксида водорода 9,5 пА (рис. 24).

Для микроэлектрода с диаметром 0,05 мм, модифицированного Берлинской лазурью, токовый отклик на минимально определяемую концентрацию пероксида водорода 5*10"8 М составлял около 5 пА. Отношение отклика на 10"° М к фону для микроэлектродов с диаметром 0,125 мм составил около 4, с диаметром 0,05 мм -около 3.

время, с

Рис. 2 Увеличение стационарного тока микроэлектрода диаметром 0,125 мм, модифицированного Берлинской лазурью в ответ на добавление 2*10' М пероксида

водорода.

10'-, «•

10*

104%

- 10" 10" 10'

X

1Е8 1Е-8 1Е7 1Е-6 1Е-5 1Е-4 1Е-Э 001 0 1 [НД]. М

Рис. 3. Градуировочный график определения пероксида водорода при помощи микроэлектрода диаметром 0,125 мм, модифицированного Берлинской лазурью, при постоянном перемешивании.

Линейный диапазон определяемых концентраций пероксида водорода при использовании микроэлектродов, модифицированных Берлинской лазурью, составил пять порядков концентрации. Предел обнаружения оказался равным 10"8 М (рис. 3). Отклонения от линейности наблюдаются только при концентрациях пероксида водорода 10 "3 М. Предел обнаружения микроэлекгродов с диаметром 0,125 мм на порядок ниже, а чувствительность в 5 раз выше по сравнению с дисковыми электродами диаметром 2 мм. По стабильности микроэлектроды, модифицированные

Берлинской лазурью, не отличались от обычных дисковых электродов миллиметрового размера.

Таким образом, впервые созданы микроэлектроды для определения пероксида водорода с чувствительностью и пределом обнаружения, удовлетворительными для клинических исследований.

Глава 8. Получение и исследование систем наноэлектродов на основе БЛ

Наноструктурирование БЛ путем электроосаждения через жидкокристаллические матрицы Однако регистрируемый ток при определении низких концентраций пероксида водорода очень мал (отклик микроэлектрода с диаметром 0,125 мм на 10 "8 М составляет 4пА). Чтобы повысить общий регистрируемый ток, используют системы микроэлеюгродов. Токовые отклики при этом заметно возрастают, в то время как аналитические характеристики соответствуют таковым для микроэлекгродов.

Для получения систем наноэлектродов на основе Берлинской лазури нами было предложено наноструктурировать электрокатализатор на инертной поверхности электрода. В то время как Берлинская лазурь является высокоэффективным электрокатализатором восстановления пероксида водорода, позволяющим проводить реакцию в диффузионном режиме, используемые электроды в данной области потенциалов инертны. Таким образом, потоки анализируемого вещества будут направлены исключительно к нано-структурам элсктрокатализатора. Это позволяет рассматривать полученное наноструктурированное покрытие БЛ на углероде как систему наноэлектродов в отношении восстановления пероксида водорода.

Получение наноструктурированных материалов возможно путем электроосаждения через лиотропные жидко-кристаллические фазы на поверхности электрода. В качестве жидко-кристаллических матриц мы использовали трехкомпонентную систему для анионного ПАВ, содержащую ЛОТ, октан и водный раствор фонового электролита (IM KCl и IM HCl), и две двухкомпонентные системы для неионных ПАВ, содержащие Brij-56 или Tween-60 и водный фоновый электролит. Для подтверждения того, что полученные покрьиия электродов представляют собой наноструктурированную БЛ, было проведено изучение морфологии полученных пленок методом атомно-силовой микроскопии. Для сравнения изучали сплошное покрытие БЛ (рис. 4а). Видно, что в данном случае пленка электроосажденной Берлинской Лазури на поверхности электрода представляет собой поликристалл.

Берлинская лазурь, элекгроосажденная таким образом, полностью покрывает поверхность электрода.

Рис. 4 АСМ изображение монокристаллического графита модифицированного Берлинской лазурью, (а) сплошной пленкой, (б) электроосажденной через жидкокристаллические матрицы на основе неионного ПАВ Brij-56.

Когда БЛ выращена через ЖК матрицы на основе ПАВ, на соответствующем АСМ-изображении видны отдельные образования, которые могут быть отнесены только к гексацианоферрату железа (рис. 46). Данные структуры субмикронного размера окружены гладкой поверхностью монокристаллического графита.

Аналитические характеристики электродов, модифицированных Берлинской лазурью, электроосажденной через жидко-]фисталлические матрицы, изучали в проточно-инжекционном режиме. Потенциал рабочего электрода составлял 50 мВ.

Использование электродов, модифицированных нанострукгурированной БЛ, приводит к дальнейшему увеличению соотношения сигнал/фон. По сравнению с электродами, модифицированными сплошной пленкой БЛ, это соотношение увеличивается приблизительно в пять раз. Нанострукгурирование приводит также к понижению предела определения. Последний, выбранный как нижний предел линейного диапазона концентраций, составил 10'8 М, что на порядок ниже по сравнению с электродами, модифицированными сплошной пленкой Берлинской лазури. Линейный диапазон концентраций составляет более шести порядков величины концентрации пероксида водорода (108 4- Ю"2 М). Значительное отклонение от линейности наблюдается только при децимолярном (0,1 М) содержании пероксида водорода.

Таким образом, нанострукгурирование Берлинской лазури приводит к созданию систем наноэлектродов с пониженным пределом обнаружения.

Однако, электроды, получаемые путем электросинтеза катализатора через жидко- 1фисталлические матрицы на поверхности электрода обладали довольно

низкой воспроизводимостью. Среднее квадратичное отклонение для чувствительностей электродов, модифицированных БЛ осажденной через ЖК матрицы на поверхности электродо, составило около 50 %. Более того, чувствительность определения пероксида водорода, снизилась в 4 раза по сравнению с электродами, модифицированными сплошной БЛ, и составила 0,1 А/Мсм2

Наноструктурирование БЛ путем остановки электроосаждения на стадии

нуклеашм.

В качестве альтернативного пути наноструктурорования может быть использована остановка электросинтеза на стадии нуклеации. Электросинтез покрытия начинается с образования отдельных островков, которые затем разрастаются и занимают всю поверхность. То есть, Берлинская лазурь на начальных стадиях осаждения наноструктурирована (рис. 5).

Рис. 5 АСМ изображения начальных стадий электросинтеза Берлинской лазури на монокристаллическом графите

Для сенсоров на основе наноструктурированной таким образом БЛ происходит увеличение отношения сигнал/шум (примерно в 4 раза) по сравнению с обычными электродами. Наноструктурирование покрытий БЛ путем остановки элеюросинтеза на стадии нуклеации улучшает также и другие аналитические характеристики модифицированных электродов. Линейный диапазон определяемых концентраций достигает шести порядков величины концентрации пероксида водорода (110"84- МО"2 М), а предел обнаружения - 10"8М, что на порядок меньше по сравнению с электродами, модифицированными сплошной БЛ.

Таким образом, Берлинская лазурь, наноструктурированная путем остановки электросинтеза на стадии нуклеации, также может рассматриваться как системы наноэлекгродов в отношении определения пероксида водорода.

Кроме заметного упрощения процедуры создания системы наноэлектродов на основе Берлинской лазури по сравнению с использованием жидко-кристаллических матриц, удалось повысить воспроизводимость приготовления сенсоров (вг = 15 %) и в два раза повысить их чувствительность. Эта величина составила 0,2 А/Мсм2 в расчете на площадь видимой поверхности электрода.

Использование силоксановых матриц для электроосаждения наноструктурированной Берлинской лазури В работе также исследовали возможность наноструктурирования БЛ путем электросинтеза через матрицы на основе различных алкоксисиланов и циклосилоксанов.

Для поиска оптимальной системы изучали соотношение сигнала на 10"6 М пероксида водорода к фону. Зависимость отношения сигнал/фон от общего количества электроосажденной Берлинской лазури (вычисленного из циклических вольтамперограмм при активации электродов) приведена на рисунке 6.

ш

<Н-'—I—--1—1—1—■-1—1-1—1-1—1-1---1---1

0 2 4 6 8 10 12 14 1в 16

Г„, нмоль/см2

БЛ'

Рис. 10. Отношение отклика на 10"6 М пероксида водорода к фоновому току электродов, модифицированных сплошной (неструктурированной) Берлинской лазурью (Ж,#), потенциал рабочего электрода 0 мВ (Ж), 50 мВ (•), и наноструктурированной Берлинской лазурью (■,*,!!?,♦, Ж), электроосажденной (■) - через матрицы на основе винилтриэтоксисилана, (♦.В) - через жидкокристаллические матрицы на основе Вгу-56 (*) и АОТ (Н), (♦, ▲) - из разбавленных в 8 раз ростовых растворов, скорость развертки потенциалов 40 мВ/с (♦) ,20 мВ/с (А).

Из рисунка видно, что электроосаждение Берлинской лазури через жидкокристаллические матрицы, а также наноструктурирование путем остановки

в*/

электроосаждения на начальной стадии роста приводит к малому количеству осажденного электрокатализатора на поверхности электрода. Электроосаждение Берлинской лазури через силоксановые матрицы позволяет получить большее количество электрокатализатора на поверхности электрода. Наибольшие значения соотношения сигнала к фону наблюдаются при средних значениях количества электроосажденной Берлинской лазури.

Оптимальными условиями для электроосаждения наноструктурированной Берлинской лазури оказалось ее нанесение через матрицу, полученную из 0,79 % раствора винилтриэтоксисилана в ацетонитриле (табл. 2) при содержании воды 7,5 %.

Таблица 2. Сравнение аналитических характеристик электродов, модифицированных Берлинской лазурью, электроосажденной через матрицы на основе различных силанов._

Силан Чувствительность, Предел Соотношение

А/Мсм2 обнаружения Н202, М сигнал/фон

[СбН5ОН Si (0)0Н]12 0,4 ±0,1 3*10-" 2,7 ± 1,6

[СбН30Н Si (0)0Н]6 0,2 ±0,18 10" 0,4 ±0,3

[CaHjOH Si (0)0Н]4 0,2 ± 0,2 ю-7 0,4 ± 0,5

метилтриэтоксисилан 0,5 ±0,7 10 s 1,9 ±2,6

фенилтриэтоксисилан 0,7 ±0,4 10"" 1,8 ±0,9

винилтриэтоксисилан 0,65 ± 0,2 Ю-4 2,7 ±1,1

у-аминопропилтриэтоксисилан 0,7 ± 0,3 10" 0,3 ± 0,2

Берлинскую лазурь, электроосажденную в оптимальных условиях через матрицы на основе винилтриэтоксисилана на монокристаллический графит, исследовали методом атомно-силовой микроскопии. На соответствующем АСМ изображении (рис. 7) видны отдельные образования Берлинской лазури, окруженные немодифицированным графитом.

Если сравнить полученные изображения с Берлинской лазурью, электроосажденной через жидко-кристаллические матрицы, видно, что при элекгроосаждении через матрицы на основе винилтриэтоксисилана получается более тонкое структурирование и большее заполнение поверхности электрода электрокатализатором. Все это позволяет ожидать низкий предел обнаружения пероксида водорода.

a see 1ВВ8 isee 'ли

Рис. 7 ACM изображение Берлинской лазури электроосажденной через матрицу на основе винилтриэтоксисилана.

Определение пероксида водорода при помощи электродов, модифицированных наноструктурированной Берлинской лазурью проводили в проточно-инжекционном режиме при потенциале рабочего электрода 50 мВ. На рис. 8 представлен типичный градуировочный график для определения пероксида водорода с использованием Берлинской лазури, электроосажденной через матрицы на основе винилтриэтоксисилана.

0,01

1Е-4

1Е-6

1Е-8

1Е-10

IE-в

[н 2о2], М

0,01

Рис. 8 Градуировочный график определения пероксида водорода в проточно-инжекционном режиме с использованием электродов, модифицированных Берлинской лазурью, электроосажденной через матрицы на основе винилтриэтоксисилана.

Более тонкое структурирование электрокатализатора действительно приводит к низкому пределу обнаружения соответствующего сенсора на пероксид водорода. Нижний предел линейного диапазона определяемых концентраций равен 10'9 М пероксида водорода, что на два порядка ниже по сравнению с обычной (неструктурированной) Берлинской лазурью.

Так как общее количество Берлинской лазури, осажденной через матрицы на основе винилтриэтоксисилана, выше по сравнению с осажденной через жидкокристаллические матрицы (рис. 6), мы ожидали более высокую чувствительность соответствующего сенсора на пероксид водорода. В самом деле, наклон линейною участка градуировочного 1рафика составил 0,65 А/Мсм2, что не меньше, и даже несколько больше по сравнению с обычной (неструктурированной) Берлинской лазурью (0,4 А/Мсм2). Увеличение чувствительности связано с одной стороны с уменьшением размеров отдельных образований Берлинской лазури на поверхности электрода, и с другой с достаточно большим процентом занятой электрокатализатором поверхности.

Таким образом, использование предложенных систем наноэлектродов позволяет достичь значительного понижения предела определения без потери чувствительности сенсора.

Воспроизводимость электродов, модифицированных Берлинской лазурью, электроосажденной через матрицы на основе винилтриэтоксисилана была значительно улучшена по сравнению с использованием жидко-кристаллических матриц (табл. 3). Стандартное квадратичное отклонение (вг) для чувствительности сенсоров полученных наноструктурированием Берлинской лазури не превышало 10 %, и оказалась почти такой же как для сенсоров на основе обычной (неструктурированной) Берлинской лазури (Эг около 8 %).

Стабильность данных датчиков оказалась такой же как и для сенсоров с неструктурированной Берлинской лазурью. При инжектировании Ю-4 М псроксида водорода стопроцентная стабильность сохраняется в течение более 1000 измерений. При хранении сенсоров при комнатной температуре на воздухе с течение года, не происходит потери чувствительности.

Важным аналитическим параметром является динамический диапазон сенсора. Как видно, электроды на основе наноструктурированной Берлинской лазури в проточно-инжекционном режиме демонстрируют линейный диапазон определяемых концентраций более 7 порядков величины концентрации пероксида водорода. Это является абсолютным рекордом в электроанализе в настоящее время. Для сравнения, нижний предел 10"8 М заявлялся только для электродов на основе генно-инженерной пероксидазы (линейный диапазон определяемых концентраций 10"8 М - 10"6 М) при постоянном потоке (более чувствительный режим по сравнению с проточно-инжекционным), а успешное определение санти- и децимолярных концентраций

возможно только при использовании мезопористых платиновых микроэлектродов (линейный диапазон определяемых концентраций 2* 10"5 М - 4* 10"2 М).

Таблица 3. Сравнение аналитических характеристик сенсоров на основе Берлинской лазури для определения пероксида водорода. __

Сенсор Линейный диапазон определяемых концентраций н2о2, М Предел обнаружения, М Чувствительность А/Мсм2 Воспроизводимость

Дисковый электрод (0=2 мм), модифицированный сплошной БЛ 10"7 -10'3 10"7 0,5 8

Микроэлектрод (0=0,125 мм), модифицированный сплошной БЛ 10"8-10'3 10"8 2,5 7,5

Система наноэлектродов на основе БЛ, осажденной через ЖКМ 10*8-10'2 10'8 0,1 50

Система наноэлектродов на основе БЛ, полученная остановкой электросинтеза на стадии нуклеации Ю-8 -10'2 10"8 0,2 15

Система наноэлектродов на основе БЛ, осажденной через матрицу на основе У181(ОЕ03 10'9- 10"2 Ю-9 0,65 10

Таким образом, система наноэлектродов на основе Берлинской лазури превосходит по аналитическим характеристикам лучшие сенсоры на пероксид водорода в отношении как нижнего, так и верхнего пределов обнаружения.

Таким образом, в данной работе были созданы высокоэффективные микросенсоры и сенсоры на основе Берлинской лазури для определения пероксида водорода с рекордными аналитическими характеристиками (табл. 3). Достигнуты предел обнаружения пероксида водорода 10"9 М и линейность диапазона определяемых концентраций на протяжении 7 порядков концетрации.

Глава 9. Анализ образцов конденсата выдыхаемого воздуха

Клиническая применимость датчиков на основе Берлинской лазури показана на примере оценки активности воспалительного процесса в органах дыхания путем анализа конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ).

Анализ КВВ является ценным неинвазивным методом для диагностики различных легочных заболеваний и степени их тяжести. А также может быгь использован для определения эффективности лечения. Определение пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха дает важную информацию об активности воспалительного процесса и степени оксидативного стресса в дыхательных путях при патологии легких.

Значения содержания пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха у здоровых людей по литературным данным варьируют от 10"и М до 10"3 М. То есть при постановке задачи необходимо было определить реальное содержание пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха.

Образцы КВВ были предоставлены НИИ Пульмонологии. Определение концентрации пероксида водорода в КВВ проводилось у здоровых добровольцев и пациентов с различными заболеваниями органов дыхания с использованием электродов, модифицированных Берлинской лазурью в проточно-инжекционном режиме. Содержание пероксида водорода определяли по заранее построенному градуировочному графику. Иногда проверяли по методу добавок.

Концентрация пероксида водорода в КВВ у здоровых людей составила в среднем 1,7±0,4 мкМ. У курильщиков с нормальной функцией легких отмечена тенденция к повышению концентрации пероксида водорода в КВВ по сравнению со здоровыми некурящими субъектами (1,8±0,3 мкМ и 1,6±0,4 мкМ соответственно; р=0,07)

Во всех обследованных группах больных с заболеваниями органов дыхания содержание пероксида водорода в КВВ было значимо выше по сравнению со здоровым контролем (р<0,05) (рис. 9).

У больных ХОБЛ концентрация пероксида водорода в КВВ была достоверно повышена по сравнению со здоровыми некурящими и курильщиками (2,2±1,1 мкМ напротив 1,6±0,4 и 1,8±0,3 мкМ, соответственно; р<0,05) (рис. 9).

У пациентов с бронхиальной астмой содержание пероксида водорода в КВВ также было значимо повышено по сравнению со здоровыми некурящими и курильщиками (рис. 9). У пациентов с обострением бронхиальной астмы концентрация пероксида водорода была достоверно выше, чем у больных в стадии ремиссии.

Рис. 9 Концентрация пероксида водорода в КВВ у здоровых людей и больных с различными заболеваниями легких.

Наибольшая концентрация пероксида водорода в КВВ обнаружена у больных с пневмонией (5,0±2,2 мкМ, р<0,0001; по сравнению со здоровым контролем) (рис. 9). У больных с госпитальной пневмонией наблюдалось повышение концентрации пероксида водорода в КВВ в 3-5 раз, по сравнению со здоровым контролем, и обнаружено уменьшение его уровня в процессе лечения. Это позволяет сделать вывод, что пневмония сопровождается оксидативным стрессом в дыхательных путях и определение пероксида водорода в КВВ можно использовать для неинвазивного мониторинга уровня оксидантов при лечении инфекции нижних дыхательных путей.

Высокая концентрация пероксида водорода в КВВ обнаружена также у пациентов с бронхоэктазами (4,6+1,7 мкМ, р<0,0001; по сравнению со здоровым контролем) (рис. 9).

Таким образом, уровень пероксида водорода в КВВ отражает степень активности воспалительных клеток с увеличением его продукции при пневмонии, бронхоэктазах, бронхиальной астме и ХОБЛ, и может быть использован для оценки активности воспаления в дыхательных путях и эффективности противовоспалительного лечения.

Выводы

1. Разработаны микросенсоры для определения пероксида водорода на основе наноразмерных покрытий Берлинской лазури. Чувствительность микроэлектродов с диаметром 0,125 мм в 5 раз выше (2,5 А/Мсм2), а предел обнаружения на порядок ниже (10"8 М), по сравнению с дисковыми электродами миллиметровых размеров.

2. Осуществлено наноструктурирование Берлинской лазури на поверхности электрода путем электроосаждения через жидко-кристаллические и силоксановые матрицы, а также путем остановки осаждения на стадии нуклеации. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что получаемые покрытия представляют собой наноразмерные образования на поверхности электрода.

3. Электроды, модифицированные нанострукгурированной Берлинской лазурью, представляют собой системы наноэлектродов с рекордными аналитическими характеристиками. Предел обнаружения пероксида водорода составляет Ю-9 М, что на два порядка ниже по сравнению с электродами, модифицированными сплошной пленкой Берлинской лазури. Диапазон определяемых концентраций линеен на протяжении 7 порядков концентрации пероксида водорода.

4. Клиническая применимость датчиков на основе Берлинской лазури показана на

примере анализа конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ). Уровень пероксида

водорода в КВВ может быть использован для оценки активности воспаления в

дыхательных путях при пневмонии, бронхоэктазах, бронхиальной астме и ХОБЛ и

определения эффективности противовоспалительного лечения.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. Левченко В.А., Матвеенко В.Н., Карякин А.А, Пуганова (Курицына) Е.А., Будашов И.А, Курочкин И.Н. Использование лиотропных жидких кристаллов для получения наноструктурированных материалов. // Жидкие кристаллы и их практическое использование, 2003, Вып. 3. с. 79-87.

2. Karyakin А.А., Puganova Е.А., Budashov I.A., Kurochkin I.N., Kaiyakina E.E., Levchenko V.A., Matveenko V.N., Varfolomeev S.D. Prussian Blue Based Nanoelectrode Arrays for H202 Detection // Anaytical. Chemistry, 2004, v. 76 p. 474-476.

3. Пуганова E.A., Комаров A.B., Вагин М.Ю., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Использование микроэлектродов, модифицированных Берлинской лазурью для определения псроксида водорода в физиологических жидкостях. // Микросистемная техника, 2004, т. 12.

4. Puganova Е.А., Karyakin А.А. New materials based on nanostructured Prussian blue for development of hydrogen peroxide sensors II Sensors & Actuators B, 2005, v. 109 p. 167-170.

5. Курицына (Пуганова) E.A., Корнеева Л.Х., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Электроды, модифицированные наноструктурированной Берлинской лазурью -высокоэффективные сенсоры для определения пероксида водорода // Сенсор, 2005, 2. с. 2-8.

6. Puganova Е.А., Budashov I.A., Karyakin А.А. Nanostructured Prussian Blue based sensor for flow-injection analysis of sub-ppb levels of hydrogen peroxide // XIIth International symposium on Bioelectrochemistry and bioenergetics, June 19-24, 2003, Florence, Italy, p. 136.

7. Puganova E.A., Budashov I.A., Karyakin A.A. Nanostructured Prussian Blue based sensor for flow-injection analysis of sub-ppb levels of hydrogen peroxide // NATO ASI "Smart sensors and MEMS", September 8-19, 2003, Povoa de Varzim, Portugal p. 293.

8. Puganova E., Vaguine M., Karyakin A., Vadgama P. New materials based on nanostructured Prussian blue for development of hydrogen peroxide sensors for biomedical applications // European Materials Research Society 2004 Fall Meeting, September 6-10, 2004, Warsaw, Poland p. 38.

9. Морозов C.B., Вагин М.Ю., Лукачева Л.В., Иванова ЮН., Курицына Е.А., Карякина Е.Е., Карякин А.А., Заболоцкий А.В., Яшин И.В. Новые аналитические системы определения пероксида водорода и глюкозы для целей клинической

диагностики // Всероссийская конференция «Аналитические приборы», 27 июня - 1 июля, 2005, Санкт-Петербург, Россия, с. 192.

10. Kuritsyna (Puganova) Е.А., Karyakin A.A. Hydrogen peroxide sensor with advanced analytical performances // International conference "Analytical chemistry and chemical analysis" (AC&CA-05), September 12-18, 2005, Kyiv, Ukraine p. 321.

11. Puganova E.A., Karyakin A.A. Prussian Blue based nano-electrode arrays for detection of H202 with advanced analytical performances // Surface Modification for Chemical and Biochemical Sensing 2005 Workshop, November 6-10, 2005, Kazaimierz Dolny, Poland p. 5.

12. Курицына E.A., Анаев Э.Х., Карякин A.A., Чучалин А.Г. Сенсорное определение пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха // 15-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 29 ноября - 2 декабря, 2005, Москва, Россия с. 55.

13. Anaev Е., Chuchalin A., Kuritsyna Е., Karyakin A. Sensorbestimmung von Wasserstoffperoxidgchalt im Atemkondensat bei Lungenerkrankungen. // 47 Kongress der Deutschen Gesellschaft Pneumologie, 29March -1 April, 2006, Nürnberg, Germany.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stprint ru e-mail zakaz@stprint ru тел ■ 939-33-38 Тираж 120 экз. Подписано в печать 15 03.2006 г

/О06А ¿>f7/

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Электрокатализатор восстановления пероксида водорода.

1.1 Пероксид водорода как важный аналит для современного анализа.

1.2 Физико-химические характеристики электрокатализаторов восстановления пероксида водорода.

1.3 Аналитическое приложение сенсоров на основе Берлинской лазури и ее аналогов

1.4 Проточно-инжекционный анализ.

Глава 2. Микроэлектроды и системы микроэлектродов.

2.1 Микроэлектроды.

2.2 Системы микроэлектродов.

2.3 Методы наноструктурирования.

2.3.1 Использование лиотропных жидких кристаллов для наноструктурирования.

2.3.1.1 Электронанесение наноструктурированных материалов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. Материалы.

Глава 4. Оборудование.

4.1 Электроды.

4.2 Электрохимические измерения.

4.3 Проточно-инжекционный анализ.

4.4 Спектрофотометрические измерения.

4.5 Сбор конденсата выдыхаемого воздуха.

Глава 5. Методы.

5.1 Электрохимическая предобработка золотых рабочих электродов.

5.2 Модификация рабочего электрода Берлинской лазурью.

5.3 Модификация золотых микроэлектродов Берлинской лазурью.

5.4 Модификация рабочего электрода наноструктурированной Берлинской лазурью с помощью жидкокристаллических матриц.

5.5 Модификация рабочего электрода наноструктурированной Берлинской лазурью с помощью этоксисилановых и силоксановых матриц.

5.6 Модификация рабочего электрода наноструктурированной БЛ путем остановки электроосаждения на начальной стадии.

5.7 Исследование пленок Берлинской лазури методом атомно-силовой микроскопии.

5.8 Спектрофотометрическое определение концентрации пероксида водорода.

5.9 Амперометрическое определение пероксида водорода.

5.9.1 Определения пероксида водорода с использованием микроэлектродов.

5.10 Электрохимическое определение пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха с использованием электродов, модифицированных Берлинской лазурью.

5.11 Спектрофотометрическое определение пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха с использованием пероксидазы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 6. Берлинская лазурь как наилучший электрокатализатор восстановления пероксида водорода.

6.1 Электроосаждение пленок Берлинской лазури и свойства полученных покрытий.59 6.1.1 Электроосаждение Берлинской Лазури.

6.1.2 Исследование покрытий Берлинской лазури методом атомно-силовой микроскопии.

6.1.3 Проточно-инжекционное определение пероксида водорода с использованием электродов, модифицированных Берлинской лазурью.

6.1.4 Аналитические характеристики электродов, модифицированных Берлинской лазурью.

6.2 Понижение предела обнаружения.

6.2.1 Увеличение потенциала рабочего электрода при измерении концентрации пероксида водорода.

Глава 7. Получение и исследование микроэлектродов, модифицированных Берлинской Лазурью.

7.1 Электроосаждение Берлинской Лазури на микроэлектроды.

7.2 Аналитические характеристики микроэлектродов, модифицированных БЛ.

Глава 8. Получение и исследование систем наноэлектродов на основе Берлинской лазури.

8.1 Наноструктурирование Берлинской лазури путем электроосаждения через жидкокристаллические матрицы.

8.1.1 Электроосаждение Берлинской лазури через жидко-кристаллические матрицы.

8.1.2 Исследование покрытий Берлинской лазури, электроосажденной через жидкокристаллические матрицы методом атомно-силовой микроскопии.

8.1.3 Аналитические характеристики систем наноэлектродов, полученных электроосаждением Берлинской лазури через жидко-кристаллические матрицы.

8.2 Наноструктурирование Берлинской лазури путем остановки электроосаждения на начальной стадии.

8.2.1 Остановка электроосаждения Берлинской лазури на стадии нуклеации.

8.2.2 Исследование покрытий Берлинской лазури, полученных остановкой электроосаждения на стадии нуклеации методом атомно-силовой микроскопии.

8.2.3 Аналитические характеристики электродов, модифицированных наноструктурированной БЛ при остановке электроосаждения на стадии нуклеации

8.3 Использование силоксановых матриц для электроосаждения наноструктурированной Берлинской лазури.

8.3.1 Электроосаждение Берлинской лазури через матрицы на основе этоксисиланов и силоксанов.

8.3.1.1 Изучение различных силанов и силоксанов для получения наноструктурированной Берлинской лазури.

8.3.1.2 Влияние концентрации винилтриэтоксисилана в исходном растворе на аналитические характеристики получаемых покрытий.

8.3.1.3 Исследование условий для гидролиза этоксисилана в исходном растворе на аналитические характеристики получаемых покрытий Берлинской лазури.

8.3.2 Исследование пленок наноструктурированной Берлинской лазури, полученных электроосаждением через матрицы на основе винилтриэтоксисилана в оптимальных условиях, методом атомно-силовой микроскопии.

8.3.3 Аналитические характеристики систем наноэлектродов на основе Берлинской лазури, полученных путем электроосаждения через матрицы на основе винилтриэтоксисилана.

Глава 9. Анализ образцов конденсата выдыхаемого воздуха.

9.1 Электрохимическое определение концентрации пероксида водорода в образцах конденсата выдыхаемого воздуха у здоровых людей.

9.2 Спектрофотометрическое определение пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха здоровых людей с использованием пероксидазы.

9.3 Электрохимическое определение концентрации пероксида водорода в образцах конденсата выдыхаемого воздуха у людей с различными заболеваниями органов дыхания.

Требования современного анализа - это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Электрохимические сенсоры как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. Они просты, удобны в применении, а также позволяют осуществлять непрерывный контроль ключевых аналитов, что является важным для клинической диагностики, контроля промышленного производства и состояния окружающей среды. Кроме того, требования современной медицины делают необходимым анализ крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе, поскольку анализ, проводимый при использовании современных экспериментальных методов (при отборе кусочка ткани и доставке его к аналитическому прибору), в ряде случаев становится неинформативным из-за разложения некоторых ключевых метаболитов, в частности, активных форм кислорода. Очевидно, такой клинический анализ может быть осуществлен только с использованием химических или биологических сенсоров.

Важным маркером для современной медицины, контроля экологии и различных областей промышленности является пероксид водорода. В клинической диагностике в последнее десятилетие большое внимание уделяется проблеме окислительного стресса, который заключается в дисбалансе окислительной и восстановительной систем организма [1-5]. Пероксид водорода может служить маркером окислительного стресса и при определении степени воспалительного процесса.

Более 90% всех коммерчески значимых биосенсоров и аналитических наборов на основе ферментов основаны на действии оксидаз. Эти ферменты катализируют окисление специфического субстрата кислородом воздуха. При этом кислород восстанавливается до пероксида водорода. Таким образом, для создания биосенсоров необходим чувствительный датчик на пероксид водорода [6].

Накопление пероксида водорода в грунтовых и дождевых водах в качестве отходов производства и атомных станций негативно сказывается на экологии и здоровье людей [7, 8]. Также пероксид водорода используется для дезинфекции воды и тары пищевых продуктов [9, 10], что делает важным определение его остаточных концентраций.

Наиболее чувствительным и селективным методом определения концентрации пероксида водорода является амперометрическая детекция с использованием электродов, модифицированных Берлинской Лазурью [11-14]. Тем не менее, такие датчики позволяют осуществлять анализ только до концентраций 10"7 М. Однако, для целей клинической диагностики и при экологическом мониторинге требуется дальнейшее понижение предела определения.

Понизить предел определения электрохимического датчика можно за счет увеличения соотношения сигнал/шум при минимизации размера электрода. В случае микроэлектродов большую роль играют краевые эффекты, связанные с полусферической диффузией определяемого вещества к поверхности электрода. При этом уменьшение радиуса электрода приводит к возрастанию плотности регистрируемого тока. Миниатюризация сенсоров также необходима для проведения анализа крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе.

В настоящей работе предложно создание высокоэффективных микросенсоров на основе Берлинской лазури для определения пероксида водорода.

Однако отдельные микроэлектроды трудно использовать, так как величина регистрируемого тока очень мала. С целью увеличения общего тока используют системы микроэлектродов, состоящие из множества отдельных электродов, вмонтированных в общую изолирующую основу и соединенных с одним общим токоотводом. Для получения систем микроэлектродов используются методы микроэлектроники [15], электроннолучевые и ионно-лучевые технологии [16, 17], рентгеновская литография [18], высокотемпературная литография [19-22], фотолитография [23-27]. Следует отметить, что физические методы изготовления систем микроэлектродов довольно дороги и трудоемки и кроме того не всегда пригодны.

Целью работы было создание высокоэффективных сенсоров для определения пероксида водорода на основе наноразмерных пленок и нано-структур электрокатализатора. В данной работе, в качестве альтернативы физическим методам, предложено создание систем наноэлектродов путем наноструктурирования высокоэффективного электрокатализатора на относительно инертной поверхности электрода. Создание наноструктур электрокатализатора на инертной поверхности электрода позволяет рассматривать отдельные образования Берлинской лазури как систему наноэлектродов в отношении определения пероксида водорода.

Список сокращений

ABTS - 2,2-азинодиЗ-этилбензтиазолинсульфоновая кислота

АОТ - 2-этилгексил сульфоксинат натрия

АСМ - атомно-силовая микроскопия

БА - бронхиальная астма

БЛ - Берлинская лазурь

ЖК - жидко-кристаллический

ЖКМ - жидко-кристаллические матрицы

КВВ - конденсат выдыхаемого воздуха

ОДН - острая дыхательная недостаточность

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПАВ - поверхностно активное вещество

РДСВ - респираторный дистресс-синдром у взрослых

ХБ - хронический бронхит

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких ХПН - хроническая почечная недостаточность Х.с.э. - хлорсеребряный электрод.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Выводы

1. Разработаны микросенсоры для определения пероксида водорода на основе наноразмерных покрытий Берлинской лазури. Чувствительность микроэлектродов с диаметром 0.125 мм в 5 раз выше (2.5 А/Мсм2), а предел обнаружения на порядок g ниже (10" М), по сравнению с дисковыми электродами миллиметровых размеров.

2. Осуществлено наноструктурирование Берлинской лазури на поверхности электрода путем электроосаждения через жидко-кристаллические и силоксановые матрицы, а также путем остановки осаждения на стадии нуклеации. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что получаемые покрытия представляют собой наноразмерные образования на поверхности электрода.

3. Электроды, модифицированные наноструктурированной Берлинской лазурью, представляют собой системы наноэлектродов с рекордными аналитическими характеристиками. Предел обнаружения пероксида водорода составляет 10'9 М, что на два порядка ниже по сравнению с электродами, модифицированными сплошной пленкой Берлинской лазури. Диапазон определяемых концентраций линеен на протяжении 7 порядков концентрации пероксида водорода.

4. Клиническая применимость датчиков на основе Берлинской лазури показана на примере анализа конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ). Уровень пероксида водорода в КВВ может быть использован для оценки активности воспаления в дыхательных путях при пневмонии, бронхоэктазах, бронхиальной астме и ХОБЛ и определения эффективности противовоспалительного лечения.

1. MacCarthy P.A., Shah A.M. Oxidative stress and heart failure. // Coronary Artery Disease. 2003. - V. 14. P. 109-113.

2. Rodrigo R., Rivera G. Renal damage mediated by oxidative stress: a hypothesis of protective effects of red wine. // Free Radical Biology and Medicine. 2002. - V. 33. P. 409-422.

3. Sohal R.S., Mockett R.J., Orr W.C. Mechanisms of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis. // Free Radical Biology and Medicine. 2002. - V. 33. P. 575-586.

4. Yorek M.A. The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease. // Free Radical Research. 2003. - V. 37. P. 471-480.

5. Yang T.T.C., Devaraj S., Jialal I. Oxidative stress and atherosclerosis. // Journal of Clinical Ligand Assay. 2001. - V. 24. P.

6. Guilbault G.G., Lubrano G.J. An enzyme electrode for amperometric determination of glucose. // Analytica Chimica Acta. 1973. - V. 64. P. 439-455.

7. Wang Y., Huang J., Zhang C., Wei J., Zhou X. Determination of hydrogen peroxide in rainwater by using a polyaniline film and platinum particles co-modified carbon fiber microelectrode. //Electroanalysis. 1998. - V. 10. P. 776-778.

8. Nowall W.B., Kuhr W.G. Detection of hydrogen peroxide and other molecules of biological importance at an electrocatalytic surface on a carbon fiber microelectrode. // Electroanalysis. 1997. - V. 9. P. 102-109.

9. Schwake A., Ross В., Cammann K. Chrono amperometric determination of hydrogen peroxide in swimming pool water using ultramicroelectrode array. // Sensors and Actuators, B. 1998. - V. В 46. P. 242-248.

10. Strausak В., Schoch W., in European patent application. 1985, EP 0136973: European patent application.

11. Karyakin A.A., Gitelmacher O.V., Karyakina E.E. A High-Sensitive Glucose Amperometric Biosensor Based on Prussian Blue Modified Electrodes. // Analytical Letters. 1994. - V. 27. P. 2861-2869.

12. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. Prussian Blue based amperometric biosensors in flow-injection analysis. // Talanta. 1996. - V. 43. P. 1597-1606.

13. Karyakin A.A., Karyakina E.E. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors. // Sensors and Actuators, B. -1999.-V. B57. P. 268-273.

14. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. Amperometric biosensor for glutamate using Prussian Blue-based "artificial peroxidase" as a transducer for hydrogen peroxide. // Analytical Chemistry. 2000. - V. 72. P. 1720-1723.

15. Schliebe T. S.G., Aschoff H. Nanostructuring High Resolution Phase Zone Plates in Nickel and Germanium using Cross-Linked Polymers. // Microelectronic Engineering. -1996.-V.30. P. 513-516.

16. Kalbitzer S. W.C., Miller Th., Knoblauch A. Ion beam modification for submicron technology. // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 1996. - V. 113. P. 154-160.

17. Park Sunggook P.C., Schift Helmut, Gobrecht Jens. Nanostructuring of anti-adhesive layers by hot embossing lithograthy. // Microelectronic Engineering. 2003. - V. 67-68. P. 252-258.

18. Schift H. J.R.W., David C., Gobrecht J. Nanostructuring of polymers and fabrication of interdigitated electrodes by hot embossing lithograthy. // Microelectronic Engineering. -1999.-V. 46. P. 121-124.

19. Жданов С.И. // Жидкие кристаллы. 1979. - 9-10, 249-253.

20. Lee D.S., Yang H., Chung K.H., Pyo H.B. Wafer-scale fabrication of polymer-based microdevices via injection molding and photolithographic micropatterning protocols. // Analytical Chemistry. 2005. - V. 77. P. 5414-5420.

21. Cai C.X., Ju H.X., Chen H.Y. Fabrication and Electrochemical Characterization of Interdigitated Array Microband Electrode. // Chemical Journal of Chinese Universities-Chinese. 1995. - V. 16. P. 854-858.

22. Tabei H., Morita M., Niwa O., Horiuchi T. Fabrication and Electrochemical Features of New Carbon Based Interdigitated Array Microelectrodes. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1992. - V. 334. P. 25-33.

23. Nagale M.P., Fritsch I. Individually addressable, submicrometer band electrode arrays. 1. Fabrication from multilayered materials. // Analytical Chemistry. 1998. - V. 70. P. 2902-2907.

24. Augelli M.A., Nascimento V.B., Pedrotti J.J., Gutz I.G.R., Angnes L. Flow-through cell based on an array of gold microelectrodes obtained from modified integrated circuit chips. //Analyst. 1997. - V. 122. P. 843-847.

25. Freeman B.A., Crapo J.D. Biology of disease: free radicals and tissue injury. // Laboratory Investigation. 1982. - V. 47. P. 412-426.

26. Dohlman A.W., Black H.R., Royall J. A. Expired breath hydrogen peroxide is a marker of acute airway inflammation in pediatric patients with asthma. // Am Rev Respir Dis. -1993.-V. 148. P. 955-60.

27. Jobsis Q., Raatgeep H.C., Schellekens S.L., Hop W.C., Hermans P.W., de Jongste J.C. Hydrogen peroxide in exhaled air of healthy children: reference values. // European Respiratory Journal. 1998. - V. 12(2). P. 483-5.

28. Nowak D., Antczak A., Krol M., Pietras Т., Shariati В., Bialasiewicz P., Jeczkowski K., Kula P. Increased content of hydrogen peroxide in the expired breath of cigarette smokers. // European Respiratory Journal. 1996. - V. 9(4). P. 652-7.

29. Guatura S.B., Martinez J.A., Santos Bueno P.C., Santos M.L. Increased exhalation of hydrogen peroxide in healthy subjects following cigarette consumption. // Sao Paulo Medical Journal. 2000. - V. 118(4). P. 93-8.

30. Nowak D., Kalucka S., Bialasiewicz P., Krol M. Exhalation of H202 and thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) by healthy subjects. // Free Radical Biology & Medicine. 2001. - V. 30(2). P. 178-86.

31. Emelyanov A., Fedoseev G., Abulimity A., Rudinski K., Fedoulov A., Karabanov A., Barnes P.J. Elevated concentrations of exhaled hydrogen peroxide in asthmatic patients. //Chest.-2001.-V. 120(4). P. 1136-9.

32. Loukides S B.D., Papatheodorou G, Panagou P, Siafakas NM. The relationships among hydrogen peroxide in expired breath condensate, airway inflammation, and asthma severity. // Chest. 2002. - V. 121(2). P. 338-46.

33. Ganas K., Loukides S., Papatheodorou G., Panagou P., Kalogeropoulos N. Total nitrite/nitrate in expired breath condensate of patients with asthma. // Respiratory Medicine. 2001. - V. 95(8). P. 649-54.

34. Jobsis Q., Raatgeep H.C., Hermans P.W., de Jongste J.C. Hydrogen peroxide in exhaled air is increased in stable asthmatic children. // European Respiratory Journal. 1997. - V. 10(3). P. 519-21.

35. Gerritsen W.B., Asin J., Zanen P., van den Bosch J.M., Haas F.J. Markers of inflammation and oxidative stress in exacerbated chronic obstructive pulmonary disease patients. // Respiratory Medicine. 2005. - V. 99(1). P. 84-90.

36. Nowak D., Kasielski M., Pietras Т., Bialasiewicz P., Antczak A. Cigarette smoking does not increase hydrogen peroxide levels in expired breath condensate of patients with stable COPD. // Monaldi archives for chest disease. 1998. - V. 53(3). P. 268-73.

37. De Benedetto F., Aceto A., Dragani В., Spacone A., Formisano S., Pela R., Donner C.F., Sanguinetti C.M. Long-term oral n-acetylcysteine reduces exhaled hydrogen peroxide in stable COPD. // Pulmonary Pharmacology Therapies. 2005. - V. 18(1). P. 41-7.

38. Loukides S., Bouros D., Papatheodorou G., Panagou P., Siafakas N.M. The relationships among hydrogen peroxide in expired breath condensate, airway inflammation, and asthma severity. // Chest. 2002. - V. 121(2). P. 338-46.

39. Loukides S., Horvath I., Wodehouse Т., Cole P.J., Barnes P.J. Elevated levels of expired breath hydrogen peroxide in bronchiectasis. // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 1998. - V. 158(3). P. 991-4.

40. Sznajder J.I., Fraiman A., Hall J.B., Sanders W., Schmidt G., Crawford G., Nahum A., Factor P., Wood L.D. Increased hydrogen peroxide in the expired breath of patients with acute hypoxemic respiratory failure. // Chest. 1989. - V. 96(3). P. 606-12.

41. Wilson W.C., Swetland J.F., Benumof J.L., Laborde P., Taylor R. General anesthesia and exhaled breath hydrogen peroxide. // Anesthesiology. 1992. - V. 76(5). P. 703-10.

42. Baldwin S.R., Simon R.H., Grum C.M., Ketai L.H., Boxer L.A., Devall L.J. Oxidant activity in expired breath of patients with adult respiratory distress syndrome. // Lancet. -1986.-V. 1(8471). P. 11-4.

43. Bruhn A., Liberona L., Lisboa C., Borzone G. Limitations of the Technique to Determine Hydrogen Peroxide Levels in Exhaled Breath Condensate From Patients With Adult Respiratory Distress Syndrome. // Arch Bronconeumol. 2005. - V. 41(10). P. 542-546.

44. Kietzmann D., Kahl R., Muller M., Burchardi H., Kettler D. Hydrogen peroxide in expired breath condensate of patients with acute respiratory failure and with ARDS. // Intensive Care Medicine. 1993. - V. 19(2). P. 78-81.

45. Lases E.C., Duurkens V.A., Gerritsen W.B., Haas F.J. Oxidative stress after lung resection therapy: A pilot study. // Chest. 2000. - V. 117(4). P. 999-1003.

46. Rysz J., Kasielski M., Apanasiewicz J., Krol M., Woznicki A., Luciak M., Nowak D. Increased hydrogen peroxide in the exhaled breath of uraemic patients unaffected by haemodialysis. //Nephrology Dialysis Transplantation. 2004. - V. 19(1). P. 158-63.

47. Doniec Z., Nowak D., Tomalak W., Pisiewicz K., Kurzawa R. Passive smoking does not increase hydrogen peroxide (H202) levels in exhaled breath condensate in 9-year-old healthy children. // Pediatr Pulmonology. 2005. - V. 39(1). P. 41-5.

48. Schleiss M.B., Holz O., Behnke M., Richter K., Magnussen H., Jorres R.A. The concentration of hydrogen peroxide in exhaled air depends on expiratory flow rate. // European Respiratory Journal. 2000. - V. 16(6). P. 1115-8.

49. Ho L.P., Faccenda J., Innes J.A., Greening A.P. Expired hydrogen peroxide in breath condensate of cystic fibrosis patients. // European Respiratory Journal. 1999. - V. 13(1). P. 103-6.

50. Jobsis R.Q., Schellekens S.L., Fakkel-Kroesbergen A., Raatgeep R.H., de Jongste J.C. Hydrogen peroxide in breath condensate during a common cold. // Mediators of Inflammation. 2001. - V. 10(6). P. 351-4.

51. Latzin P., Griese M. Exhaled hydrogen peroxide, nitrite and nitric oxide in healthy children: decrease of hydrogen peroxide by atmospheric nitric oxide. // European Journal of Medical Research. 2002. - V. 7(8). P. 353-8.

52. Zappacosta В., Persichilli S., Mormile F., Minucci A., Russo A., Giardina В., De Sole P. A fast chemiluminescent method for H(2)0(2) measurement in exhaled breath condensate. // Clinica Chimica Acta. 2001. - V. 310(2). P. 187-91.

53. Lehmann C., Rothe M., Becher G. Breathing pattern and exhaled breath condensate sampling. // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2003. - V. 167 (9). P. 50.

54. Tirado-Conde G., Barnes P. J., Kharitonov S. A. Exhaled H202 in subjects with a common cold. // Selected Abstracts Exhaled Breath Condensate Recherched by Gunther Becher. 2005. - 20.

55. Becher G., Rothe M., Decker M. Exhaled breath condensate (EBC): an alternative or additional diagnostic? // Breath analysis for clinical and herapeutic monitoring. 2005. -421-428.

56. Becher G. Entzndungsmarker im Exhalat. 11 Aerosole in der Inhalationstherapie. 2005. -122-130.

57. Gerritsen W.B., Zanen P., Bauwens A.A., van den Bosch J.M., Haas F.J. Validation of a new method to measure hydrogen peroxide in exhaled breath condensate. // Respiratory Medicine. 2005. - V. 99(9). P. 1132-1137.

58. Lehmann C., Becher GuntherBorkenhagen, Jantina ,Rothe Michael. Parameters of oxidation in exhaled breath condensate. // ERS International Conference. 2004. - 15.

59. Becher G., Rothe M., Lehmann C., Smith H.J., Eichler R. Influence of Lung Function Pattern on Collection of Exhaled Breath Condensate (EBC). // ATS/ALA International Meeting Orlando 2004. 2004. - 17-18.

60. Тернер Э., Карубе, И., Уилсон, Д. Биосенсоры: основы и приложения. // "Мир" : Москва. 1992.

61. Evans S.A.G., Elliott J.M., Andrews L.M., Bartlett P.N., Doyle P.J., Denuault G. Detection of Hydrogen Peroxide at Mesoporous Platinum Microelectrodes. // Analytical Chemistry. 2002. - V. 74. P. 1322-1326.

62. Kulys J., Schmid R.D. // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1990. - V. 24. P. 305.

63. Karyakin A.A., Karyakina, E.E. Electroanalitical applications Prussian Blue and its analogs. // Russian Chemical Bulletin, International Edition. 2001. - V. 50. P. 1-7.

64. Daly D.J., O'Sullivan C.K., G.G. G. The use of polymers coupled with metallised electrodes to allow H202 detection in the presense of electrochemical interferences. // Talanta. 1999. - V. 49. P. 667-678.

65. Yaropolov A.I., Malovik V., Varfolomeev S.D., Berezin I.V. Electroreduction of hydrogen peroxide on an electrode with immobilized peroxidase. // Dokl.Akad.Nauk SSSR. 1979. - V. 249. P. 1399-1401.

66. Sanchez P.D., Blanco P.T., Alvarez F.J.M., Smyth M.R., O'Kennedy R. // Electroanalysis. 1990. - V. 2. P. 303.

67. Miscellanea. // Berolinensia ad Incrementium Scientiarum Berlin. -1710.

68. Neff V.D. Electrochemical Oxidation and Reduction of Thin Films of Prussian Blue. // Journal of the Electrochemical Society. 1978. - V. 128. P. 886-887.

69. Duncan J.F., Wrigley P.W.R. The electronic structure of the iron atoms in complex iron cyanides. // Journal of Chemical Society. 1963. - 1120-1125.

70. Keggin J.F., Miles F.D. Structure and formulae of the Prussian Blue and related compounds. //Nature. 1936. - V. 137. P. 577-578.

71. Herren F., Fisher P., Ludi A., Halg W. Neutron difraction study of Prussian Blue, Fe4Fe(CN)6.3 хНгО. Location of water molecules and long-range magnetic order. // Inorganic Chemistry. 1980. - V. 19. P. 956-959.

72. Yang R., Qian Z.B., Deng J.Q. Electrochemical deposition of prussian blue from a single ferricyanide solution. // Journal of the Electrochemical Society. 1998. - V. 145. P. 22312236.

73. Itaya K., Ataka Т., Toshima S. Spectroelectrochemistry and electrochemical preparation method of Prussian blue modified electrodes. // Journal of the American Chemical Society. 1982. - V. 104. P. 4767-72.

74. Ellis D., Eckhoff M., Neff V.D. Electrochromism in the mixed-valence hexacyanides. 1. Voltammetric and spectral studies of the oxidation and reduction of thin films of Prussian Blue. //Journal of Physical Chemistry. -1981. V. 85. P. 1225-1231.

75. Шкерин E.A. Электросинтез и свойства трансдьюсера пероксида водорода на основе Берлинской лазури. // Дипломная работа. Москва. 2002.

76. Crumbliss A.L., Lugg P.S., Morosoff N. Alkali metal cation effects in a Prussian blue surface modified electrode. // Inorganic Chemistry. 1984. - V. 23. P. 4701-8.

77. Itaya K., Shoji N., Uchida I. Catalysis of the reduction of molecular oxygen to water at Prussian blue modified electrodes. // Journal of the American Chemical Society. 1984. -V. 106. P. 3423-9.

78. Jaffari S.A., Pickup J.C. Novel hexacyanoferrate(III)-modified carbon electrodes: application in miniturized biosensors with potential for in vivo glucose sensing. // Biosensors & Bioelectronics. 1996. - V. 11. P. 1167-1175.

79. Jaffari S.A., Turner A.P.F. Novel hexacyanoferrate(III) modified graphite disc electrodes and their application in enzyme electrodes .1. // Biosensors & Bioelectronics. 1997. - V. 12. P. 1-9.

80. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. The electrocatalytic activity of Prussian blue in hydrogen peroxide reduction studied using a wall-jet electrode with continuous flow. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1998. - V. 456. P. 97-104.

81. Zhang Y., Wilson G.S. Electrochemical oxidation of H2O2 on Pt and Pt+Ir electrodes in physiological buffer and its applicability to H2O2 -based biosensors. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1993. - V. 345. P. 253-271.

82. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. On the mechanism of H202 reduction at Prussian blue modified electrodes. // Electrochemistry Communications. 1999. - V. l.P. 78-82.

83. Ruzgas Т., Csijregi E., Emnfius J., Gorton L., Marko-Varga G. Peroxidase-Modified Electrodes. Fundamentals and Applications. // Analytica Chimica Acta. 1996. - V. 330. P. 123-138.

84. Chi Q.J., Dong S.J. Amperometric biosensors based on the immobilization of oxidases in a Prussian blue film by electrochemical codeposition. // Analytica Chimica Acta. 1995. -V. 310. P. 429-436.

85. Karyakin A.A., Gitelmacher O.V., Karyakina E.E. Prussian Blue-Based First-Generation Biosensor. A Sensitive Amperometric Electrode for Glucose. // Analytical Chemistry. -1995.-V. 67. P. 2419-2423.

86. Lin M.S., Shih W.C. Chromium hexacyanoferrate based glucose biosensor. // Analytica ChimicaActa.- 1999. -V. 381. P. 183-189.

87. Zhang J.Z., Dong S.J. Cobalt(II)hexacyanoferrate film modified glassy carbon electrode for construction of a glucose biosensor. // Analytical Letters. 1999. - V. 32. P. 29252936.

88. Wang J., Zhang X.J., Prakash M. Glucose microsensors based on carbon paste enzyme electrodes modified with cupric hexacyanoferrate. // Analytica Chimica Acta. 1999. - V. 395. P. 11-16.

89. Karyakin A.A., Puganova E.A., Budashov I.A., Kurochkin I.N., Karyakina E.E., Levchenko V.A., Matveyenko V.N., Varfolomeyev S.D. Prussian Blue based nano-electrode arrays for H2O2 detection. // Analytical Chemistry. 2004. - V. 76. P. 474-8.

90. Wang J., Zhang X. Screen printed cupric-hexacyanoferrate modified carbon enzyme electrode for single-use glucose measurements. // Anal. Lett. 1999. - V. 32. P. 17391749.

91. Lingane P. J. Chronopotentiometry and Chronoamperometry with Unshielded Planar Electrodes. // Analytical Chemistry. 1964. - V. 36. P. 1723-6.

92. Soos Z.G., Lingane P. J. Derivation of the Chronoamperometric Constant for Unshielded,. //Journal of Physical Chemistry. 1964. - V. 68. P. 3821-8.

93. Aoki K., Osteryoung J. Diffusion-controled current at the stationary finite disk electrode. //Journal of Electroanalytical Chemistry. -1981. V. 122. P. 19-35.

94. Heinze J. Diffusion processes at finite (micro) disk electrodes solved by digital simulation. // Journal of Electroanalytical Chemistry. -1981. V. 124. P. 73-86.

95. Aoki K. Theory of ultramicroelectrodes. // Electroanalysis. 1993. - V. 5. P. 627-39.

96. Oldham K.B. EDGE EFFECTS IN SEMIINFINITE DIFFUSION. // Journal of electroanalytical Chemistry. -1981. V. 122. P. 1-17.

97. Augelli M.A. N.V.B., Pedrotti J.J., Gutz G.R., Angnes L. Flow-through Cell Based on an Array of Gold Microelectodes Obtained From Modified Integrated Circuit Chips. // Analyst. 1997. - V. 122. P. 843-847.

98. Дамаскин Д.Д., Петрий O.A., Цирлина Г.А. // Электрохимия Москва Изд. Химия. -2001.-412,433-442.

99. Cohen А.Е. K.R.R. Large-area interdigitated microelectrodes for electrochemical sensing. // Sensors and Actuators. 2000. - V. 62. P. 23-29.

100. Chen J. C.C. Detection of dopamines in the presence of a large excess of ascorbic acid by using the powder microelectrode technique. // Journal of Electroanalytical Chemistry. -1999.-V. 463. P. 93-99.

101. Morita M. N.O., Horiuchi T. Interdigitated array microelectrodes as electrochemical sensors. // Electrochemica Acta. 1997. - V. 42. P. 3177-3183.

102. Wehrens R. L.W.E. Calibration pf array of voltammetric microelectrodes. // Analytical Chimica Acta. 1996. - V. 334. P. 93-101.

103. Schindler W., Hofmann D., Kirschner J. Nanoscale electrodeposition: A new route to magnetic nanostructures? // Journal of Applied Physics. 2000. - V. 87. P. 7007-7009.

104. Ziegler J.C., Engelmann G.E., Kolb D.M. Tip-induced formation of nanometer-sized metal clusters. // Zeitschrift Fur Physikalische Chemie-International Journal of Research in Physical Chemistry & Chemical Physics. 1999. - V. 208. P. 151-166.

105. Kolb D.M., Engelmann G.E., Ziegler J.C. Nanoscale decoration of electrode surfaces with an STM. // Solid State Ionics. 2000. - V. 131. P. 69-78.

106. Xiao X.Y., Nielinger M., Baltruschat H. Local and global electrochemical nanostructuring of Pt and Au single crystal electrodes. // Electrochimica Acta. 2003. -V. 48. P. 3093-3105.

107. Kolb D.M., Ullmann R., Ziegler J.C. Electrochemical nanostructuring. // Electrochimica Acta. 1998. - V. 43. P. 2751-2760.

108. Potzschke R.T., Staikov G., Lorenz W.J., Wiesbeck W. Electrochemical nanostructuring of n-Si(lll) single-crystal faces. // Journal of the Electrochemical Society. 1999. - V. 146. P. 141-149.

109. Riepl M., Mirsky V.M., Wolfbeis O.S. Electrical control of alkanethiols self-assembly on a gold surface as an approach for preparation of microelectrode arrays. // Mikrochimica Acta. 1999.-V. 131. P. 29-34.

110. Не Н.Х., Li Q.G., Zhou Z.Y., Zhang H., Li S.F.Y., Liu Z.F. Fabrication of microelectrode arrays using microcontact printing. // Langmuir. 2000. - V. 16. P. 96839686.

111. Basnar В., Madera M., Friedbacher G., Valiant Th., Mayer U., Hoffmann H. Fabrication of Nanostructured Surfaces Using Self-Assembled Monolayers. // Microchimica Acta. 2000. - V. 133. P. 325-329.

112. Basnar В., Madera M., Friedbacher G., Valiant Th., Mayer U., Hoffmann H. Colloid monolayer lithography-A flexible approach for nanostructuring of surfaces. // Applied Surface Science. 1999. - V. 144-145. P. 461^166.

113. Kim Y.H., Lee C.K., Kim Y.J., Lee M. Fabrication and evaluation of a flexible sieve-type microelectrode array for monitoring the regenerating state of peripheral nerves. // Sensors and Materials. 2005. - V. 17. P. 139-153.

114. Fofonoff T.A., Martel S.M., Hatsopoulos N.G., Donoghue J.P., Hunter I.W. Microelectrode array fabrication by electrical discharge machining and chemical etching. // Ieee Transactions on Biomedical Engineering. 2004. - V. 51. P. 890-895.

115. Baker W.S., Crooks R.M. Independent geometrical and electrochemical characterization of arrays of nanometer-scale electrodes. // Journal of Physical Chemistry B. 1998. - V. 102. P. 10041-10046.

116. Valbusa U. B.C., de Mongeot Buatier F. Nanostructuring surfaces by ion sputtering. // Journal of Physics: Condensed Matter. 2002. - V. 14. P. 8153-8175.

117. Bao J.C., Xu Z. Template synthesis of ordered nano-system and their applications. // Chinese Journal of Inorganic Chemistry. 2002. - V. 18. P. 965-975.

118. Merritt C.D., Justus B.L. Fabrication of microelectrode arrays having high-aspect-ratio microwires. // Chemistry of Materials. 2003. - V. 15. P. 2520-2526.

119. Forrer P., Schlottig F., Siegenthaler H., Textor M. Electrochemical preparation and surface properties of gold nanowire arrays formed by the template technique. // Journal of Applied Electrochemistry. 2000. - V. 30. P. 533-541.

120. Hulteen J.C., Menon V.P., Martin C.R. Template preparation of nanoelectrode ensembles Achieving the 'pure-radial' electrochemical-response limiting case. // Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. - 1996. - V. 92. P. 4029-4032.

121. Gollas В., Elliott J. M., Bartlett Ph. N. Electrodeposition and properties of nanostructured platinum films studied by quartz crystal impedance measurements at 10 MHz. // Electrochimica Acta. 2000. - V. 45. P. 3711-3724.

122. CAMPBELL ROGER B.M.G. Electrodeposition of Mesoporous Nickel onto Foamed Metals Using Surfactant and Polymer Templates. // Journal of Porous Materials. 2004. -V. 11. P. 63-69.

123. Bartlett P.N., Ghanem M. A., El Hallag Ibrahim S., de Grootb Peter, Zhukov A. Electrochemical deposition of macroporous magnetic networks using colloidal templates. // Journal of Materials Chemistry. 2003. - V. 13. P. 2596-2602.

124. Burmeister F., Badowsky W. , Braun Т., Wieprich S., Boneberg J., Leiderer P. Colloid monolayer lithography-A flexible approach for nanostructuring of surfaces. // Applied Surface Science. 1999. - V. 144-145. P. 461-466.

125. Kutsay О., Bello I., Lifshitz Y.,Lam C., Luk W.Y., Lee S.T., Meng X., Kremnican V. Nanostructuring of tetrahedral carbon films by carbon ion implantation. // Diamond and Related Materials. 2003. - V. 12. P. 2051-2056.

126. Ritter M., Stindtmann M., Farle M., Baberschke K. Nanostructuring of the Cu(001) surface by ion bombardment: a STM study. // Surface Science. 1996. - V. 348. P. 243252.

127. Krok F. K.J.J., Such B. ,Piatkowski P. , Szymonski M., Ion beam-induced nanostructuring of InSb(0 0 1) surfaces studied with atomic force microscopy, in Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2003. p. 264-269.

128. Krok F. K.J., Such В., Piatkowski P., Szymonski M., Ion beam-induced nanostructuring of AIIIBV semiconductor surfaces studied with dynamic force microscopy and Kelvin probe force spectroscopy, in Applied Surface Science. 2003. p. 112-116.

129. Frost F. R.B., Nanostructuring of solid surfaces by ion-beam erosion, in Applied Physics A Materials Science & Processing. 2003.

130. Kirchner V., Xia X.H., Schuster R. Electrochemical nanostructuring with ultrashort voltage pulses. // Accounts of Chemical Research. 2001. - V. 34. P. 371-377.

131. Lia M., Ishizukaa Makoto, Liua Xinbing,Sugimotob Yoshimasa, Ikedab Naoki, Asakawa Kiyoshi. Nanostructuring in submicron-level waveguides with femtosecond laser pulses. // Optics Communications. 2002. - V. 212. P. 159-163.

132. Wang J., Brennsteiner A., Sylwester A.P., Renschler C.L. Preparation and Characterization of Band Nanoelectrodes Made of Carbonized Polyacrylonitrile Films. // Electroanalysis. -1991. V. 3. P. 505-509.

133. Seddon B.J., Eddowes M.J., Firth A., Owen A.E., Girault H.H.J. Thin-Film Electrode a New Method for the Fabrication of Submicrometer Band Electrodes. // Electrochimica Acta. -1991. -V. 36. P. 763-771.

134. Усольцева H.B. Химическая характеристика, биологическое и медицинское значение лиотропных жидких кристаллов. // Журнал Всесоюзного Химического Общества им. Д.И. Менделеева. 1983. - V. 27. Р. 156-165.

135. Attard G.S., Glyde J.C., Goltner C.G. Liquid-crystalline phase as template for synthesis ofmesoporous silica. //Nature. 1995. - V. 378. P. 366-368.

136. Attard G.S., Goltner C.G., Corcer J.M., Henke S., Templer R.H. Liquid-Crystal Template for Nanostructured Metals. // Angewandte Chemie International Edition. 1997. - V. 36. P. 1315-1317.

137. Attard G.S., Bartlett P.N., Coleman N.R.B., Elliott J.M., Ouen J.R., Wang J.H. Mesoporous Platinum films from Lyotrotic Liquid Crystalline Phases. // Science. 1997. - V. 278. P. 838-840.

138. Jiang J., Kucemak A. Nanistuctured platinum as an electrolcatalyst for the electrooxidation of formic acid. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2002. - V. 520. P. 64-70.

139. Whitehead A.H., Elliott J.M., Owen J.R. Nanostructured tin for use as a negative electrode material in Li-ion batteries. // Journal of Power Sources. 1999. - V. 81-82. P. 33-38.

140. Whitehead A.H., Elliot J.M., Owen J.R., Attard G.S. Electrodeposition of mesoporous tin films. // Chemical Communications. 1999. - 331-332.

141. Attard G.S., Leclerc S.A.A., Maniguet S., Russell A.E., Nadhakumar I., Gollas B.R., Bartlett P.N. Liquid crystal phase templated mesoporous platinum alloy. // Microporous and Mesoporous Materials. 2001. - V. 44-45. P. 159-163.

142. Attard G.S., Leclerc S.A.A., Maniguet S., Russell A.E., Nandhakumar I., Bartlett P.N. Mesoporous Pt/Ru Alloy from the Hexagonal Lyeotropic Liquid Crystalline Phase of a Nonionic Surfactant. // Chemistry of Materials. 2001. - V. 13. P. 1444-1446.

143. Elliott J.M., Birkin P.R., Bartlett P.N., Attard J.S. Platinum Microelectrodes with Unique High Surfase Areas. // Langmuir. 1999. - V. 15. P. 7411-7415.

144. Elliott J.M., Attard G.S., Bartlett P.N., Coleman N.R.B., Merckel D.A.S., Owen J.R. Nanostructured Platinum (Hl-ePt) Films: Effects of Electrodeposition Conditions on Film Properties. // Chemistry of Materials. 1999. - V. 11. P. 3602-3609.

145. Elliott J.M., Owen J.R. Electrochemical impedance characterisation of a nanostructured (mesoporous) platinum film. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. - V. 2. P. 5653-5659.

146. Gollas В., Elliott J.M., Bartlett P.N. Electrodeposition and properties of nanostructured platinum films studied by quartz crystal impedance measurements at 10 Hz. // Electrochimica Acta. 2000. - V. 45. P. 3711-3724.

147. Bartlett P.N., Birkin P.N., Ghanem M.A., Groot P., Sawicki M. The Electrochemical Deposition of Nanostructured Cobalt Films from Lyotropic Liquid Crystalline Media. // Journal of The Electrochemical Society. 2001. - V. 148. P. 119-123.

148. Attard G.S., Elliott J.M., Bartlett P.N., Whitehead A., Owen J.R. Nanostructured materials for batteries. // Macromolecular Symposia. 2000. - V. 156. P. 179-186.

149. Leroux F., Koene B.E., Nazar L.F. Electrochemical lithium intercalation into a polyaniline/V205 nanocomposite. // Journal of The Electrochemical Society. 1996. - V. 143. P. 181.

150. Nandhakumar I., Elliott J.M., Attard G.S. Electrodeposition of Nanostructured Mesoporous Selenium Films (Hl-eSe). // Chemistry of Materials. 2001. - V. 13. P. 3840-3842.

151. Elliot J.M., Cabuche L.M., Bartlett P.N. Electrochemical Characterization of a Templated Insulating Polymer-Modified Electrode. // Analytical Chemistry. 2001. - V. 73. P. 28552861.

152. Attard G.S., ColemanN.R.B., ElliottJ.M. The preparation of mesoporous metals from preformed surfactant assemblies. // Stud. Surf. Sci. Catal. 1998. - V. 117. P. 89-94.

153. Ye S., Vijh A.K., Dao L.H. A new fuel cell electrocatalyst based on highly porous carbonized polyacrylonitrile foam with very low platinum loading. // Journal of The Electrochemical Society. 1996. - V. 143. P. 7.

154. Pell W.G., Conway B.E. Quantitative modeling of factors determining Ragone plots for batteries and electrochemical capacitors. // Journal of Power Sources. 1996. - V. 63. P. 255-266.

155. Wang J., Agnes L. Miniaturizated glucose sensors based on electrochemical codeposition of rhodium and glucose-oxidase onto carbon-fibre electrodes. // Analytical Chemistry. -1992.-V. 64. P. 456-459.

156. Birkin P.R., Elliott J.M., Watson Y.E. Electrochemical reduction of oxygen on mesoporous platinum microelectrodes. // Journal of Chemical Society and Chemical Communications. 2000. - 1693-1694.

157. Forster R.J. Microelectrodes-new dimensions in electrochemistry. // Chemical Society Reviews. 1994. - V. 23. P. 289-297.

158. Elliott J.M.A., G. S.; Bartlett, P. N.; Coleman, N. R. В.; Merckel, D. A. S.; Owen, J. R. // Chemistry of Materials. 1999. - V. 11. P. 3602-9.

159. Karyakin A.A. Prussian Blue and its analogues: electrochemistry and analytical applications. // Electroanalysis. 2001. - accepted.