Моделирование формы белков шаперонинов в растворе по решению прямой и обратной задачи малоуглового рассеяния с использованием формфактора тора тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

Амарантов Сергей Владимирович

МОДЕЛИРОВАНИЕ ФОРМЫ БЕЛКОВ ШАПЕРОНИНОВ В РАСТВОРЕ ПО РЕШЕНИЮ ПРЯМОЙ И ОБРАТНОЙ ЗАДАЧИ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОРМФАКТОРА ТОРА.

01.04.07-физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 1 ОКТ 2012

Москва 2012

005053208

005053208

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова Российской академии наук (Ж РАН).

Научный руководитель: Волков Владимир Владимирович,

кандидат химических наук, ИК РАН

Официальные оппоненты: Клечковская Вера Всеволодовна,

доктор физико-математических наук, заведующая лабораторией, профессор, ИК РАН

Ерухимович Игорь Яковлевич, доктор физико-математических наук, профессор, ведущий научный сотрудник, институт элементо-органических соединений им. А.Н.Несмеянова Российской академии наук

Ведущая организация: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова, физический факультет

Защита состоится "«£_" октября 2012 года в /I ч. мин. на заседании диссертационного совета Д 002.114.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова Российской академии наук, по адресу: 119333, Москва, Ленинский проспект 59, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИК РАН Автореферат разослан:" " августа 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.114.01 кандидат физико-математических наук

/ / )

() В. М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Определение формы и структурных параметров белковых макромолекул, находящихся в условиях, близких к естественным, представляет собой чрезвычайно важную задачу в исследовании связей структура-свойство таких объектов, так как многие функции белков и их комплексов зависят от их конформации. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУР) и тепловых нейтронов в этом случае предоставляет уникальную возможность изучать структуру биологических наночастиц в растворе при размерах, существенно превышающих возможности метода ядерного магнитного резонанса и при этом не требует какой-либо специальной подготовки образцов, которая часто требуется в других методах исследования. С другой стороны, развитые в последнее время методы интерпретации данных малоуглового рассеяния в состоянии эффективно учитывать разнообразную априорную информацию о структуре наночастиц, что может существенно повышать надежность получаемых результатов. Особенно актуальным метод малоуглового рассеяния оказываются в случае изучения новых белковых объектов, когда они имеют большие размеры, а получение монокристаллов затруднительно или невозможно. Однако, задача определения трехмерной формы частиц по одномерным данным рассеяния оказывается плохо обусловленной и преодолеть неустойчивость определения структурных характеристик можно с помощью построения моделей формы, описываемых небольшим числом параметров. Этим определяется высокая актуальность теоретической части работы в данном направлении.

Малоугловое рассеяние - упругое рассеяние электромагнитного излучения или пучка частиц (нейтронов, электронов) на неоднородностях вещества, размеры которых существенно превышают длину волны излучения. С помощью МУР изучают строение биологических молекул в растворе, объёмные дефекты в кристаллических веществах, кластерную структуру жидкостей и аморфных тел, поры в различных пористых материалах, а также можно получить ценную информацию об изменениях ряда параметров структуры при деформации и разрушении. К этим параметрам, в частности относятся размер, форма ориентация и концентрация рассеивающих частиц, распределение частиц по размерам. Значение МУР особенно велико для исследования биологических объектов, например белков, нуклеиновых кислот, вирусов. Метод МУР позволяет изучать структуру нативных биополимеров в физиологических растворах, где образец представляет собой раствор идентичных частиц (монодисперсную систему), а экспериментальная интенсивность рассеяния пропорциональна произведению концентрации частиц в растворе и интенсивности рассеяния одной частицей. Интерпретация экспериментальных данных в этом случае заключается в создании модели низкого разрешения рассеивающей частицы. В данном случае это модель трёхмерной формы частицы в однородном приближении. Несмотря на заметный прогресс в области компьютерного моделирования для обработки данных малоуглового

эксперимента, описание формы тела минимально возможным набором параметров и дальнейшим поиском этих параметров представляет собой довольно сложную задачу. При этом число используемых формфакторов для описания форм частиц ограничивается классическими работами середины прошлого века Гинье (Сшшег) и Порода (Рогоё) [Рогос! 1948]. Некоторые формфакторы представлены в работе [1]. В связи с этим в данной работе для параметризации задачи рассеяния от белка бактериального шаперанина ОгоЕЬ [2] и вирусного (фагового) шаперонина продукта гена 146 ^146), выведены формфакторы моделей частиц в виде двойного симметричного и несимметричного эллиптических торов, как функции их геометрических параметров и модуля вектора рассеяния. Полученные выражения применены для определения по данным МУР параметров формы белковых комплексов шаперонинов, один из которых изучен впервые. Таким образом, актуальность экспериментальной части работы определяется не только решением задачи оптимальной параметризации предполагаемой формы макромолекулы и сопоставлении полученных различными способами структурных моделей, но и исследованием новых белковых объектов. Основные цели и задачи работы.

Получить в аналитическом виде формфакторы эллиптических одиночного и двойного симметричного и несимметричного тора, как функцию параметров формы и модуля вектора рассеяния.

Провести моделирование формы молекул белков шаперонинов с известной структурой по полученным экспериментальным данным малоуглового рассеяния, с применением полученных выражений для формфакторов и другими известными программами определения формы. Сравнить модели, полученные этими методами между собой.

Получить экспериментальные данные малоуглового рассеяния от растворов белка вирусного шаперонина pgl46 и найти параметры модели формы молекулы с помощью полученных аналитических выражений формфакторов и традиционных методов моделирования.

Получить экспериментальные данные рассеяния для растворов белка §р146 в присутствии АТФ и с помощью разработанных подходов определить изменения параметров формы молекулы белка при АТФ-зависимом конформационном переходе. Научная новизна

Впервые методом малоуглового рентгеновского рассеяния проведен анализ конформаций формы макромолекул в растворе имеющих центрально симметричное отверстие путем определения геометрических параметров модели в виде однородного двойного эллиптического тора. Объектами исследования были макромалекулы вирусных и бактериальных шаперонинов, формы которых можно описать формфаторами одиночного и двойного эллиптических торов. А именно, были определены геометрические параметры следующих макромолекул: 1. Хорошо изученный бактериальный шаперонин СгоЕЬ;

2. Малоизученный вирусный (фаговый) шаперонин, кодируемый геном 146 (gene product, gpl46) бактериофага EL Pseudomonas aeruginosa [3]; С этой целью одной из подзадач данной работы явилось возможность показать для простейшей двусвязной поверхности вращения - тора устойчивое восстановление формы трёхмерного однородного тела заданного внутри своего объёма единичным потенциалом, по пространственно усреднённой кривой малоуглового рассеяния. Поскольку все шаперонины являются АТФ-азами, использующими энергию, получаемую при связывании и гидролизе АТФ, то для определения конформационных перестроек малоугловым методом впервые определялись параметры изменения формы щаперонина от состава буфера, как параметрическое описание формы частицы через кривую интенсивности малоуглового рассеяния. Практическая значимость.

Используя метод малоуглового рентгеновского рассеяния была получена пространственная модель малоизученного вирусного шаперонина gpl46. С целью ускорения компьютерной обработки экспериментальных данных для бактериальных и вирусных шаперонинов на основе полученных автором тороидальных формфакторов была написана компьютерная программа, существенно ускоряющая поиск формы белков шаперонинов не прибегая к методу случайного перебора конфигураций частицы. Разработанный подход расширяет банк методов анализа систем содержащих наночастицы, имеющие центрально-симметричное отверстие.

На основе малоугловых экспериментальных данных был обнаружен АТФ — зависимый конформационный переход шаперонина gpl46 из закрытого в более функционально активное - открытое состояние. На защиту выносятся следующие положения.

1. Приближённое аналитическое выражение для малоуглового формфактора тора, с трёмя геометрическими параметрами и соответствующая асимптотика Порода. С целью моделирования формы молекул олигомерных белков -шаперонинов в рамках однородного приближения выведены аналитические выражения для малоугловых формфакторов двойного симметричного и несимметричного эллиптических торов.

2. По экспериментальным данным малоуглового рентгеновского рассеяния от растворов бактериального (GroEL) и вирусного (gpl46) шаперонинов сделан сравнительный анализ размеров и формы белков в растворе. Для бактериального GroEL проведено сравнение полученных по данным рассеяния параметров формы с параметрами известной кристаллической структуры.

3. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния был найден АТФ -зависимый конформационный переход белка вирусного шаперонина gpl46 в растворе. Было показано, что в присутствии АТФ происходит конформационный переход из открытого состояния - двойной несимметричный тор, в закрытое - двойной симметричный тор.

Личный вклад автора. Автором был сделан аналитический вывод приближённого выражения для формфактора тора, получены выражения для

асимптотик Гинье и Порода. Автором были проведены эксперименты по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей на растворах бактериального (GroEL) и вирусного (gpl46) шаперонинов. Были проведены эксперименты по исследованию белков на монодисперсность методами динамического светорассеяния и аналитического ультрацентрифугирования. Автором была проведена вся первичная обработка кривых малоуглового рассеяния и расчет моделей по известной методике комплекса программ пакета ATSAS, написаны программы для поиска геометрических параметров структурных моделей с тороидальными формфакторами. Апробация результатов диссертации

Результаты исследований, включенных в диссертационную работу, докладывались на следующих научных конференциях:

1. VI Международная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007), Москва, 12-17ноября, 2007 г..

2.1 Всероссийская конференция «Многомасштабное моделирование процессов и структур в нанотехнологиях» (ММПСН-2008) Москва, Московский инженерно-физический институт (государственный университет) 12-14 марта 2008 г.

3. XVIII Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" г. Казань (Яльчик) 4-9 июля 2011.

4. V Российский симпозиум "Белки и пептиды" г. Петрозаводск, 8-12 августа, 2011.

5. VIII Национальная конференция « Рентгеновское Синхротронное излучение, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано -Био -Инфо - Когнетивные технологии». РСНЭ - НБИК, 2011, г. Москва.

6. XIX Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" г. Казань (Яльчик) 25-30 июля 2012.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ из них 6 тезисов докладов конференций и 3 статьи в рецензируемых журналах. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Объём диссертации составляет 103 страницы, включая 38 рисунков, 6 таблиц и более 100 формул.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Во введении излагаются возможные области применения метода малоуглового рассеяния и обосновывается актуальность применения данного метода для исследования белковых растворов, а также указывается необходимость дополнительной информации о структуре частицы при интерпретации малоуглоглового эксперимента. Там же рассматривается актуальность задачи параметризации для описании формы частицы при построении её модели низкого разрешения.

Первая глава представляет собой литературный обзор о макромолекулах шаперонинов их строении и свойствах. Шаперонины, белки теплового шока (hsp60), представляют собой класс молекулярных шаперонов, которые помогают

правильно сворачиваться как новосинтезированным полипептидным цепям, так и денатурированным под воздействием стресса белкам. В отличие от других классов белков-шаперонов, шаперонииы незаменимы.

Все белки класса шаперонинов представляют собой массивные комплексы из множества субъединиц, внешне похожие на бочонок. Комплексы имеют внутреннюю полость, способную закрываться и изолировать захваченный субстрат. В качестве субстрата выступают белки, имеющие ненативную структуру, нарушенную, например, при тепловой денатурации. В полости происходит фолдинг белков-субстратов. Для осуществления фолдинга шаперонины используют энергию, выделяющуюся при гидролизе АТР.

Шаперонины делят на две группы. Это разделение связано со специфичностью их строения и с характером вторичной структуры субстрата. Представители первой группы шаперонинов были обнаружены у бактерий, а также внутри пластид и митохондрий. Шаперонины второй группы найдены в эукариотических клетках и в организмах архей.

На сегодняшний день наиболее изученным шаперонином первой группы является GroEL, выделенный из клеток Е. coli. GroEL функционирует в паре с другим белком - ко-шаперонином GroES [4]. Одна из основных функций комплекса GroEL/GroES заключается в связывании развернутых полипептидных цепей. Таким образом GroEL/GroES защищает пептиды от агрегации и осуществляет их правильное сворачивание внутри полости [5]. Шаперонины группы II, в отличие от представителей первой группы, функционируют без кофакторов. Одной из задач данной работы является изучение вирусного шаперонина gpl46. Далее отдельно описывается строение шаперонинов первой и второй группы. Множество экспериментальных работ подтвердили классическую модель шаперонинов I группы см. рис.la,b [6, 7]. Однако более детальные исследования выявили новые особенности работы комплекса, представив ещё одну модель функционирования, названную Football-cycle из-за сходства формы выявленного комплекса с мячом для регби. Комплексы, соответствующие модели Football-cycle (рис. 1с), были обнаружены при помощи электронного микроскопа. Вместо ко-шаперонина у шаперонинов II группы на апикальных доменах каждой субъединицы находятся петли, или винтовые выступы, закрывающие вход во внутреннюю полость. Вследствие этого шаперонины второй группы способны принимать как открытую, так и закрытую конформацию (рис. 2). Субъединицы шаперонинов группы II подобно представителям группы I состоят из трех доменов: экваториального, промежуточного и апикального. Точно также экваториальный домен выполняет АТФ-азную функцию. Движение апикального домена вызывает конформационные изменения в комплексе. Отсутствие ко-шаперонина обуславливает иной способ ассоциации шаперонина с субстратом по сравнению с шаперонинами группы I. Шаперонины группы I не способны сворачивать эукариотические белки, такие как актин [3], а представители второй группы не взаимодействуют с прокариотическими белками.

Рис.2.

Изменения, происходящие с ССТ при добавлении АТР.Происходит изменение конформации доменов, и комплекс из открытой формы переходит в закрытую[8].

Рис.1.

Сравнение структурных форм комплексов GroEL, ассоциированных с ко-шаперонином. Модели получены методом электронной микроскопии.

Свойства шаперонинов II группы до настоящего времени мало изучены. В присутствии АТР и ионов Mg2+, Мп2 и Со2+ конформация этих комплексов менялась с «открытой» на «закрытую». Работу эукариотических комплексов можно рассмотреть на примере человеческого белка ССТ см. рис.2. Комплексы ССТ (и все комплексы группы II) находятся в открытой конформации в отсутствие АТР, и закрываются при добавлении трифосфата . Вторая глава представляет собой введение в теорию малоуглового рассеяния. Треугольник упругого рассеяния см. Рис.3 построен на тройке волновых векторов ко, кь S для обратного пространства, и для переданного импульса А р (p=h-k) в прямом пространстве. Схема сканирования при постоянной энергии падающего излучения E-const реализуется на монохроматическом источнике, например, рентгеновской трубке.

/(*) = t^jjj^ = I. ■ (N) ■ (Ф(*. П)Ф* is, П))с

s(Ap)

1 r_

ФО) = —7 J pe(r)exp(i(s,r))dr

ко СРо)

Рис.3

Треугольник упругого рассеяния.

V

(2.1)

(2.2)

Интенсивность малоуглового рассеяния определяется выражениием (2.1) где Ф(в, 0, ср)- амплитуда рассеянной волны от одной частицы, О,- телесный угол, с образующей от оси прямого не рассеянного луча. N - число - молекул или наночастиц в «разбавленном растворе» рассеивающих независимо друг от друга, при |к!|=|ко| рассеяние упругое.Ф* - комплексно - сопряжённая амплитуда

рассеянной волны от одной частицы, <Ю - элемент телесного угла, Р' ~~ средняя рассеивающая плотность частицы. Величина 1е - представляет собой «томсоновское» рассеяние или рассеяние на «свободном электроне» [10]. 10-интенсивность падающего на образец излучения, ге=е£'/т0с2=2,818- 10'в см -классический радиус электрона. Ь - расстояние образец - детектор. Выражение

интенсивности рассеяния через функцию распределения по расстояниям р(г) имеет вид (2.3). В частности для разбавленной системы идентичных невзаимодействующих частиц, например раствора белковых молекул, выражение для интенсивности рассеяния, приходящейся на одну молекулу можно записать в виде [1]:

'Ы=-1г0(г)Мг= /(,.) = і-| І ¡Р(г)е"-в віп всівсігскр =

V-*) = 177 ] Р(П-^сіг.

(2.4)

(2.3)

V " с»-

Соотношение между интенсивностью рассеяния Цз) и функцией распределения по расстояниям определяет связь между обратным и прямым пространствами, выражаемую через преобразование Фурье для следующих трансформант:

А.-ГГ •> г

F

/(5) = 7(0)

1

4 л

2 (2-5) 0

/Кг)—

2"2 0 ^ (2.6) Таким образом, соотношение между интенсивностью рассеяния Цб) и функцией р(г) для молекулы, имеющей максимальный размер Отах, связаны через интегральное уравнение Фредгольма I рода. Переход из обратного пространства в прямое и вычисление функции распределения по расстояниям внутри частицы р(г) осуществляли с помощью программы косвенного Фурье преобразования. В которой использован метод а - регуляризации Тихонова [11,12].

~/(0)-е~ 3 1/0(г)г4с/г ]р(г)г2с1г

1 (2.7) -= ^5-

или 3 (2.9) при 0 0 (2.8)

Взяв логарифм от левой и правой частей равенства (2.8) получим важное для практики определения радиуса инерции «приближение Гинье» (2.9). В этом случае, график начального участка кривой рассеяния в координатах Гинье:!«® от 52 - это прямая с тангенсом угла наклона ¡¿(л-а) =/??2/3 откуда, зная из графика а , можно найти электронный радиус инерции частицы. Под прямой задачей понимается расчет интенсивности рассеяния по формуле Дебая от атомной структуры молекулы или шариковой модели молекулы заполняющей её объём. Данный алгоритм реализован в программе СЯУБОЬ [13]

в третьей главе представлен литературный обзор о источниках излучения и первичной обработке экспериментальных данных, как решение задачи редукции к «идеальному прибору». Изучение рассеяния под малыми углами к первичному пучку связано со специфическими экспериментальными трудностями и с применением специальных установок. Диафрагменное устройство должно

обеспечить получение очень тонкого первичного пучка. Такие пучки необходимы для получения минимальных углов рассеяния и уменьшения погрешностей при их измерении. Кроме того, отделить малоугловое рассеяние от первичного возможно лишь при узких коллимирующих щелях. С целью уменьшения паразитного рассеяния в коллимационной системе по Кратки пучок формируется двумя блоками В, и В2, а также входной щелью Е. Форма проекции первичного пучка на плоскость детектора - ассиметричный треугольник, угол 20,- определяет минимальный угол расходимости падающего на образец пучка рис.4.

Е РЯ

'Л Г) М вг н */огкірасе

в, V є Вї \ ;

Рис.4.

Схема блок коллиматора по Кратки. Е, Ві, В2- блоки формирования первичного пучка, Н- нулевая плоскость, Рі , Тг- рабочие плоскости блоков облучаемые входящим пучком, 8- образец, В8-стопор прямого пучка, РЯ - плоскость регистрации, Р - профиль прямого пучка прошедшего через образец (е). Если плоскости коллиматора Кратки Е, и ¥2 удалось совместить, то выше плоскости Н (измерения проводятся только в этом направлении) паразитное рассеяние будет отсутствовать, так как рассеяние от ребра М и плоскости Р2 проявляются лишь ниже Н. Такие коллиматоры Кратки позволяют исследовать неоднородности до ЮОнм. В данном случае задача редукции к идеальному прибору сводится к введению коллимационной поправки на неточечность пучка. В четвёртой главе проведено вычисление формфактора тора и его приложение к решению обратной задачи рассеяния шаперонинов.

В разделе 4.1.1 приводится расчет Фурье амплитуды для эллиптического тора в цилиндрической системе координат согласно работе [14]:

.У

Ь-а<г<Ь+а; :и=+г0,

Ф(і, в) = — Л|ехр(; (СОБОГ + гз. ))г сігсіа =

V у,

2л 2я1аЬс

і-, і-*,

(4.1)

1 ь+а [ 2 1 —— | ■ЯвС^П./Дге,,) гс1г =

лаЬс І .ї

1 2 ЬУ„.( Г (г~Ь)

Рис.5.

I Ял 5-с М- ■ Созв ГСІГ

каЬс .уСоу(9 ь

Эллиптический тор, и его главная плоскость выражение для фурье амплитуды эллиптического сечения. тора

Усреднив (4.1) по всем ориентациям получим выражение для формфактора:

/(5) =

п abcs

L і о+а

г-U г si

sej 1-(Г Ь)2 CosÛ

J0(s ■ rSinO) rdr !> s'mOdO

(4.2)

Интенсивность рассеяния от кругового тора получается как частный случай, при с ~ а . Результаты моделирования для конкретных значений параметров тора по формуле (4.4) (4.2) приведены на рис. 7а (кривая 1).В этой же главе автором получено приближённое выражение Фурье трансформанты тора. Запишем параметрическое уравнение тора

г\^Ь + агсо5а))со5<р-1, (Ь + а гсовй^вт^- у, сг5\псо-к\

(О < г < 1, 0 < <р < 2тг, 0 < а < 2/г).

и вектор рассеяния в уже используемой цилиндрической системе координат.

Тогда амплитуда рассеяния согласно выражению (2.1) при ~ ^ примет вид (4.3):

V

ІЯІ яги

I(s)„

■ J | \e's^-!o)acr(b + arCosa)drdada ; 2x-abc 0 0 0 (4 3)

У„-| у Біпв

4 ]jl(bsSine)x

о

Jt (es Cos в)

es Cos в

Sin0 de.

(4.4)

g(r,co) = ,<>ху (Ь + агСо$(і))Со5а + ГСБ2 БІГКО

Исходя из (4.3) в малоугловой области при ограничениях на параметры тора а, Ь, с (в единицах длины): 0 < а^ < 1, 0 < с-5 < 1, 0 < а• 5< 1, и модуля вектора рассеяния б (в единицах обратной длины): приближённое выражение для формфактора тора имеет вид (4.4) [15]. Это «нулевое приближение» можно уточнить, используя первый член в сумме для действительной части в разложении (4.3). Обозначим поправку к (4.4) через Д тогда:

/(«)„« =4}yo2(b5sin0) А

о V

-БІП в

Jx (С5 COS в)

+ Д

sin в de:

(4.5)

где

А = J\ [ -^-sin t

2 ■ (l - J() (se cosO)) Jj (se cosO) (se cosff)2 se œsû

(4.6)

Для наглядного сравнения точного выражения кривой малоуглового рассеяния рассчитанной по (4.2) с приближенными выражениями (4.4, 4.5) на рис.7а, Ь они графически представлены для тора с параметрами а=с=13А, Ь=38А. Из него видно, что на первых 3,5 порядков спада кривой интенсивности от «рассеяния в нулевой угол» все три кривые совпадают друг с другом. Поскольку в эксперименте по рассеянию рентгеновского излучения в разбавленном растворе, например растворе белка, после вычитания рассеяния от раствора максимальное

отношение сигнал/шум на кривой МУР обычно не превышает трёх порядков, то в практических целях достаточно использовать соотношение (4.4,4.5). Асимптотики: область Гинье и область Порода.

Для области Гинье разложим приближённое выражение (4.4) в степенной ряд

00 со 00

(—1)к+1+т [(2/)!]2 (2(/я +1))!

А=0/=0т=0 (А:!)4(/!)6(т!)3((т + 1)!)2

(4.7 а)

х_{2т)\ {к + /)! (к + 1 + т + \)\_^2/^2* {с8)2т

(т + \){т + 2)[2(к+1+т +1))! 22(/+отН и выписывая слагаемые до квадратичных

получим приближение Гинье (2.7) (аз)(Ъ8)(с$)<1: и электронный инерции частицы (2.8) в виде:

радиус

„ Л , з2(а2+Ь2 с2

Л»г її---+ —

V >0 3 2 4

' ехр

К

а +Ъ

(4.7Ь)

Для приближения Порода (Рогос!) при (.Ъа)(зЬ)(зс)»1 также воспользуемся полученным нами приближённым выражением (4.4), и известными асимптотиками для функций Бесселя при больших значениях аргумента

2~ 4

(4.8) [15].

(¿5)(а^)2(м)3

Юд{1, отн.ед.}

Б, А

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Рис.6.

Кривые МУР от кругового тора с параметрами: а=с=13А, Ь= 38А, полученные через Фурье трансформанту: 1-по точному выражению (4.2); 2 -по приближённому выражению (4.4); 3 - по приближённому выражению, с поправкой Д см. (4.5); 4 - породовская асимптотика по (4.8).

Рис.7

"""Кривая 1(в) расчет по ф-ле (4.2) с = 38А при а = с = 13 А. Асимптотики Порода: — для шара 1(э) = 1/(Отахз)4 для тора см. (4.8)

Это важный для экспериментальной практики результат поскольку, часто не вдаваясь в тонкие особенности кривой рассеяния, по характеру спада можно сказать к какой форме ближе наш рассеивающий объект: глобулярной частице (шар, эллипсоид), сильно вытянутая (стержень) или сплюснутая частица (диск). К тому же если вспомнить Породовские асимптотики от диска ОД ~ я"2 и

цилиндра 1(э) ~ ї"3, то полученная асимптотика для тора не лишена некоторой физической интерпретации.

В разделе 4.3 представлено обобщение формфактора тора на формфактор двойного тора. Молекула шаперонина СгоЕЬ [16, 17] представлена рис.9а,(см.ниже) вид сбоку и вид сверху. Для использования формфактора тора для моделирования молекулы белка шаперонина вгоБЬ в виде двух торов лежащих друг над друге, обобщим выражения (4.1), (4.2).

Ф(в, 0) (4.9)

1 „ 1 (4-Ю)

|2і| = с(1 + (у) § = і (г - Ь)2 +8ІП(ІС(1-<У)сО8Є)}У0(^8ШЙ) гаг}- \sindae .

где 1*21 " V а2

Общий вид такого двойного тора представлен на рис.8а. Для сравнения второй моделью этого белка может служить полый цилиндр с внешним г,„ах = Ъ + а, внутренним гтЫ = (Ъ - а) радиусами и высотой Н=2Ь=4с и объёма У'=л(гтах2-Гщт2)Н. Таким образом, мы получили формфакторы шаперонина СгоЕЬ в двух аппроксимациях: двойным тором и полым цилиндром. На рис.86 кривая 2 рассчитывалась при параметрах а=22А, Ь=45А, с=36А по формуле (4.10), кривая 3 вычисленная от формфактора полого цилиндра при значениях гтах=67 А, гтЫ=22А, Ь= 146А.

2(а+Ь) Рис. 8б.

Рис8а. 1-кривая рассеяния рассчитана по формуле

Поверхность двойного эллиптического тора, как Дебая программа CRYSOL, от атомной модель молекулы GroEL с указанными структуры молекулы белка GroEL; 2-геометрическими параметрами (a,b,с). кривая от двойного тора (4.10) Рис.8а, 3 -

кривая рассеяние от полого цилиндра. В разделе 4.6. описывается восстановление формы модели молекулы белка шаперонина GroEL. Решение обратной задачи рассеяния по известной кристаллической структуре на примере макромолекулы шаперонина GroEL представлены на рис.9. На рис.9а представлена известная структура шаперонина GroEL (Protein Data Bank (PDB) с Digital Object Identifier (DOI): lkpo) который

является олигомерным белком, состоящим из 14 идентичных субъёдиниц (57 кДа каждая), образующих два тороидальных кольца (по 7субъединиц в каждом), лежащих друг на друге. По формуле Дебая, с помощью программы СЛУЗОЬ была рассчитана кривая рассеяния представленная на рис.9б и далее из неё, используя программу ОЖЖ [12, 18] была получена функция парных расстояний рис.9в._

Pdb структура

45 а,

Рис. 9а

Рис. 96

Кривая малоуглового рассеяния ¡(э) рассчитанная из кристаллической структуры см. Рис.9а программой СЮ^ОЬ

70 Ы 60

11)0 120 140 160 1

Рис. 9в

Функция парных расстояний Р(г) вычисленная из кривой рассеяния рис.9Ь с помощью программы GNOM.

Шариковая модель, восстановление формы частицы, как решение обратной задачи

рассеяния

а

Рис.9г

Восстановленная форма молекулы шаперона GroEL, с помощью прогрпаммы DAMMIN.

Восстановленная пространственная форма шаперона GroEL, как решение обратной задачи рассеяния по кривой рассеяния I(s), рис.9б, и функции парных расстояний Р(г),рис.9в, представлена на рис.9г. В пятой главе представлена экспериментальная часть работы. В параграфе 5.1 описана методика выделения растворов белков шаперонинов. Выделение шаперонина GroEL и ко-шаперонина GroES из клеток Е. coli штамма W3110, трансформированных плазмидой pOF39, содержавшей гены, кодирующие GroEL и GroES, проводилось по методике Корралеса и Фершта [19] с описанными ранее модификациями [20]. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм, принимая коэффициент А28о°'1% равным для GroEL - 0,18 [21]. Молекулярную массу GroEL14 считали равной 840 кДа (субьединица 60 кДа).

В лаборатории молекулярной биоинженерии института биоорганической химии был создан плазмидный вектор для экспрессии гена 146 фага EL,

кодирующего шаперонин, в клетках Е. coli. Рекомбинантный белок продуцировался клетками Е. coli в растворимой форме. Далее по отрабортанной методике проводилась хроматографическая очистка gpl46 на Q-сефарозе. Для концентрирования gpl46 использовали концентраторы «Amicon» (США) с размером пор 100 и 30 кДа, соответственно. Образцы центрифугировали при 2500 об/мин («Jouan») в течение 20-30 мин. Конечную концентрацию белков определяли спектрофотометрически при 280 нм, используя расчетные коэффициенты экстинкции: 35870 М_1см"' для gpl46.

В параграфе 5.2. проведена проверка растворов белков на монодисперсность. Монодисперсность растворов белков - бактериального шаперонина GroEL и вирусного шаперонина (gpl46) - была предварительно проверена методом аналитического ультрацентрифугирования и динамического светорассеяния. Измерения коэффициента седиментации этим методом проводили при помощи аналитической ультрацентрифуги Beckman Spinco Е, оснащённой фотоэлектрической сканирующей приставкой. Скорость вращения ротора составляла 56000 об/мин.; оптическую плотность определяли при длине волны источника излучения равной 280 нм. Из рис.10 видно, что кроме исследуемого белка в растворе присутствует небольшое количество примесей.

В параграфе 5.3. описывается проведение малоуглового эксперимента на растворах белков.

Кривые малоуглового рассеяния были получены от растворов белков -шаперонина ОгоЕЕ и вирусного шаперонина gpl46 - на лабораторной малоугловой установке, методика проведения и обработки результатов эксперимента на «разбавленных» растворах белков описана в работе [22]. Источник излучения - рентгеновская трубка с медным анодом с длиной волны характеристического излучения л(Сик„) = 1,54 А. Рабочее напряжение 11= 50кВ, ток 1=40мА. Для отсечки р - линии характеристического излучения использовался фильтр (фольга № 50мкм). Формирование падающего на образец пучка осуществлялось «коллиматором Кратки (Кгаїку)» см. рис.12; высота пучка на образце (длина штриха) 5мм; расстояние образец-детектор 267 мм; рассеянное

1.0 -

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Рис.10.

Результат эксперимента по скоростному аналитическому ультрацентрифугированию.

Рис.11.

Результат эксперимента по динамическому светорассеянию

излучение регистрировалось «одномерным» позиционно чувствительным газовым детектором. Схема эксперимента представлена на рис.12.

Рис.12

Схема малоуглового эксперимента, установки при сканировании по углу при постоянной энергии падающего на образец монохроматического рентгеновского излучения. 1-источник рентгеновского излучения; 2 -фильтр №; 3 - формирователь рентгеновского луча "по Кратки";4 - Падающий на образец рентгеновский луч: (10 х 0.1) мм; 5 - образец; 6 - рассеянное излучение;7 - стопор прямого пучка; 8 -линейный позиционно чувствительный детектор. Образец помещался в стеклянный капилляр диаметром 1 мм с облучаемым объёмом У~30мкл. Для выделения рассеяния от исследуемого белка из полученной кривой рассеяния от белка в растворе вычиталась отдельно снятая кривая рассеяния от буфера. В связи с неточечным размером рентгеновского пучка на образце (штрих 5мм) использовалось введение коллимационной поправки [23]. Коллимационная поправка вводилась специальными программными средствами. Переход к шкале модуля вектора рассеяния и введение коллимационной поправки выполнялось по образцу - "бегенат серебра".

ю*

>в5.<°Я 10

10

l(s)

Ln(¡)

i ■ I 1 I \Ln(l(»)hLn{l(0)HR, i 6.2-S 6.1 -1 6.0-

4 s'. A' ^ i 5.9 g

DM IOUI 9 MIO «Mil 1Ю

i V 1

1 , G ^ ; i ® : V 5.5-

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

S, А-1

Рис.13а

1-Экспериментальные точки МУР от раствора gpl46 с концентрацией с= 18 мг/мл в буфере с ADP, 2-сглаженная по РМНК кривая 1 с аппроксимацией в нулевой угол рассеяния; 3- Экспериментальные точки МУР от раствора Бычьего сывороточного альбумина (BSA) с = 1 мг/мл; 4-сглаженная по РМНК кривая 3 с аппроксимацией в нулевой угол рассеяния; На вставке представлена кривая 1 в области Гинье (G) в координатах Ln(I(s2)).

Рис. 136

Представлен концентрационный эффект в область Гинье для белка gpl46:

* -1,4 мг/мл; О - 3,8 мг/мл; А -8,8 мг/мл, # -17,6 мг/мл.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00

в, пт'1

Рис.15

Экспериментальные кривые рассеяния: 1 - pgl46 с~20ш§/ш1; 2 - СгоЕЬ с~10пц>/т1. Точки -эксперимент, сплошная линия - сглаженная регуляризованным методом наименьших квадратов (РМНК).

г. пт

Рис.16

Функция парных расстояний внутри молекулы Рассчитанные из

экспериментальной кривых с помощью программа GNOM функция парных расстояний P(r). 1 - gpl46: Dmax=(18,0-18,5)nm,

2-GroEL: Dmax=(17,5 - 18.0)nm

С целью поиска устойчивого решения для функции парных расстояний р(г), вычисленной с помощью программы GNOM, кривая МУР (см. кривые 1 и 2, рис.15) многократно подвергалась Фурье преобразованию (2.6) с различными значениями параметров регуляризации [24] с целью найти наилучшее решение для р(г). Из р(г)=0 были найдены максимальные размеры молекул, оказалось, что шаперонин gpl46 имеет максимальный размер Dmax=(18.0 - 18.5)нм, что на ~5 А больше чем шаперонин GroEL, Dmax=(17.5 - 18.0)нм. В результате было выявлено, что несмотря на низкую степень гомологии, ниже(21%), между

Рис.14

1-Экспериментальные точки МУР от раствора GroEL с концентрацией с s 9 мг/мл, 2-сглаженная по РМНК кривая 1 с аппроксимацией в нулевой угол рассеяния Uxp(O); 3 -рассчитанная ,по формуле Дебая, программа CRYSOL, кривая МУР от кристаллической структуры шаперонина GroEL; 4- сглаженная экспериментальные точки МУР от раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) с = 1 мг/мл, аппроксимацией в нулевой угол рассеяния Ibsa(O);

1(Я)......

Оценка радиуса инерции для gp 146 с™ ,, /(0),

Ма„ = ^■ Мш ■ = (8304-900) кД,

и радиуса эквивалентной сферы которую можно описать вокруг белка:

Hs) = (, sin (s RnJ-sR^ cos (s R^rf = Q

l (sKJ3 J

sin(iÄmin)-s'-cos(jÄmin) = 0 | : cos(j/?min) транс1!ендентное yp-e\ tg^sR^) = sRmin его корень:

sm:„Rmin =4.4934 и зная из графика

min min

найдем минимальный радиус описаннои вокруг макромолекулы белка gpl46 сферы: _ 4.49

П_0.05ЛЧ _

бактериальным СгоЕЬ и фаговым '¿р\46 шаперонинами габаритные размеры передающие внешнюю форму молекулы близки друг к другу [25]. Если сравнить кривые малоуглового рассеяния для шаперонина ОгоЕЬ в кристалле и в растворе (см. рис.17), то можно заметить существенное отличие, прежде всего в размере молекулы. А именно, уже в области Гинье видно, что как для отдельного белка ОгоЕЕ, кривые 2 и 4, так и комплекса ОгоЕЕ/ОгоЕБ, кривые 1 и 3, кривые, рассчитанные от кристаллической структуры, кривые 1 и 2, идут ниже, чем экспериментальные кривые 3 и 4, снятые от раствора белков. Следовательно, по области Еинье уже сразу можно сказать, что максимальные размеры молекул рассчитанные из кристаллической структуры больше, чем в растворе. Не ограничиваясь качественным анализом в области Еинье см. рис.136, был проведен расчет функций парных расстояний Р(г) см. рис.18, по всему диапазону (0 < в < 0.2) А"' кривых рассеяния представленных на рис.17. В сводной Таблице представлены основные параметры малоуглового эксперимента белков-шаперонинов. Для состояния "раствор" кривые БАХБ получены из эксперимента, для состояния "кристалл" кривые БАХБ вычислены по формуле Дебая с помощью программы СКУБОЕ [13].

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200

Рис. 17.

1 -расчёт от кристаллической структуры комплекса GroEL/GroES взятой из Protein Data Bank (PDB) (laon.pdb). 2-расчёт от кристаллической структуры GroEL (PDB, lkpo.pdb); 3- экспериментальная кривая рассеяния от комплекса GroEL/GroES. 4- экспериментальная кривая рассеяния от раствора GroEL см.рис. 15 (кривая2) сглаженная по РМНК с аппроксимацией к 1(0).

100 120 140 160 180 200 220 R, А

Рис. 18.

Функции парных расстояний, расчет программой GNOM [18],

1 - от кристалл, структуры комплекса GroEL/GroES (laon.pdb), Dmax=(215±5)Ä.

2 -от кристалл.структуры

GroEL.(lkpo.pdb), Dmax=(190-200)Ä; 3-от раствора комплекса GroEL-GroES, Dmm=(180±5)Ä, 4 - от раствора шаперонина GroEL Dmax=( 170-175)Ä;

Следовательно, уже только по области Еинье (см. рис.17) можно сказать, что максимальные размеры молекул, рассчитанные из кристаллической структуры больше, чем в растворе. Не ограничиваясь качественным анализом в области Еинье, был проведен расчет функций парных расстояний Р(г) для определения максимального размера по кривым рассеяния, см. рис.18

Таблица

Параметры молекул белков, вычисленные из кривых малоуглового рассеяния.

белок состояние R А О А ^тах >

gpl46 раствор (c~18mg/ml) 67 ±2 175 - 185

GroEL кристалл 68 ±2 190 -200

раствор (с~1 lmg/ml) 62 ±2 170 - 175

GroEIVGroES кристалл 83 ±3 210-220

раствор (c~15mg/ml) 64 ±2 175 - 185

В разделе 5.5.3. был проведен поиск наилучших параметров модели двойного эллиптического тора и полого цилиндра описывающих экспериментальные кривые рассеяния от растворов фагового (gpl46) и бактериального (GroEL) шаперонинов. В качестве второй модели для описания формы молекулы в однородном приближении, мы используем модель полого цилиндра. Одним из методов нелинейных наименьших квадратов, Бройдена - Флетчера - Гольдфарба - Шанно B-F-G-S [25], алгоритм NL2SOL [26] на языке программирования ФОРТРАН, была осуществлена подгонка всех экспериментальных кривых рассеяния к аналитическому выражению для формфактора двойного тора (4.10), путём независимого варьирования трёх параметров: образующей (Ь) и полуосей двух эллипсоидов (а) и (с). Аналогичная процедура была проделана для модели полого цилиндра (5.1)

т^ТГ (5Л)

('■»,-'•»■») о 1 ¿5COS0 )

где D(X,e) = J^-s{ae)

x-sinö

и одиночного тора (4.2). В результате были найдены параметры для всех моделей, причем для каждого случая из экспериментальной кривой предварительно вычиталась постоянная фона. Степень близости при варьировании геометрических параметров моделей (rmin, rmax, Н); (а, Ь, с); (а„ b, q i=l, 2) численно оценивалось величиной R-фактора {Щ)\

j=1

Поскольку кривая рассеяния имеет высокую скорость спада, для уравнивания вклада всех точек на кривой рассеяния при вычислении R-фактора по формуле

T(s) = з/Ты

(5.1) проводилось взвешивание кривой рассеяния по закону v ' v v . Наилучшие, по min Rß подгоночные кривые от этих моделей к экспериментальным кривым рассеяния от шаперонинов представлены на рис. 1920. Поиск параметров для каждой модели осуществлялся циклически. Из ряда предложенных моделей (одиночный тор, полый цилиндр, двойной тор) оказалось, что форма двойного тора наилучшим образом, по Rf , моделирует форму исследованных шаперонинов в растворе.

образом условие N < выполнено. При моделировании аминокислотными остатками программой ОАБВСЖ [27]. Из расчёта функциир(г) для кривых МУР от раствора белка gpl46 находящегося в «исходном» буфере и буфере содержащем АТФ можно сделать вывод, что при добавлении в раствор АТФ максимальный размер частицы сохраняется. Более определённые выводы о форме белковых комплексов можно сделать по результатам моделирования пространственной формы макромолекулы.

10'-.

ю1

^—Г т" 1 ' 1 ' 1 ' -др146 1

-др146+АТР :

У

0.00 0.05 0.10

, 0.25 0.30 0.35 0.40

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 5, Л"'

Рис. 21а,Ь.

а) экспериментальные кривые малоуглового рассеяния раствора gpl46, черная кривая от раствора gpl46 в «исходном» буфере: 50 тМ Тпв-На рН 7,5, 10 тМ М§С12,100 тМ КС1,; красная кривая - от раствора 146 в «исходном» буфере с добавлением 3 тМ АТФ; концентрация белка в растворе 10 мг/мл, Ь) эти же экспериментальные кривые малоуглового рассеяния раствора §р146 в координатах Порода.

Рис.22. Моделирование белка §р146 в «исходном» буфере

(рис.21), с помощью программы ОА5В(Ж [27], вид А в разрезе, В-вид сбоку, С - вид сверху, О - вид снизу.

а) 16

2(а+Ь)

Рис. 23.

Моделирование конформационного перехода а), б), г), д) моделирование аминокислотными остатками (а.к.о.) программа САЗВСЖ [27] с осью симметрии Р7 и модель макромолекулы в виде двойного эллиптического тора; а), б) gpl46 в «исходном» буфере; в) модель - не симметричные торы ф-ла (5.2) рассчитано по кривой рассеяния, представленной на рис.21 г), д) gpl46 в буфере с АТФ, е) модель - симметричные торы рассчитано по кривой рассеяния, представленной на рис.21, красная кривая.

Выводы

1.Получено приближённое аналитическое выражение для формфактора эллиптического тора как функции модуля вектора рассеяния. Из приближённого выражения для формфактора тора были выведены приближение Гинье для радиуса инерции частицы и асимптотика Порода показывающая закон спада со степенью -6.

Известное ранее точное выражение формфактора тора впервые обобщено для случая двойного симметричного и несимметричного торов.

Разработаны компьютерные программы для расчета кривой МУР при заданных параметрах тора на основе полученных автором выражений.

2. Разработанные автором программы применены для определения параметров структурных моделей молекул ряда шаперонинов. Для шаперонина GroEL по данным малоуглового рассеяния показано, что максимальный размер частицы в растворе на 2-3 нм больше, чем известные по данным рентгеноструктурного анализа.

3. Впервые методом малоуглового рентгеновского рассеяния проведено изучение макромолекулы вирусного шаперонина PG146. Полученные автором экспериментальные результаты подтверждают изменение конформации макромолекулы в зависимости от внешних условий.

Моделирование строения данных макромолекул шаперонинов с использованием полученных в работе теоретических выражений показывает, что в процессе конформационного перехода происходит изменение формы макромолекулы gpl46 от симметричной формы, описываемой двойным эллиптическим тором с параметрами: a =ai=a2=(20±l)A; b=(50±2)A; c=c1=c2=(34±1)A, к несимметричному: а!=(11±1,5)А, а2=(30±2)А, Ь=(50±2)А, с,=(40±2)А, с2=(30±1)А

4. Предложенный подход с использованием приближённых аналитических выражений для тороидальных формфакторов позволяет быстро и устойчиво описывать конформационные изменения в макромолекулах шаперонинов, пользуясь при этом небольшим числом структурных параметров.

Цитируемая литература

1.Glatter, Kratky, 1982. Glatter О. and Kratky О. Small angle X-ray scattering. ACADEMIC PRESS INC. (London), 1982.

2. Марченков B.B., Марченко Н.Ю., Марченкова С.Ю., Семисотнов Г.В. Молекулярные шаперонины прокариотичееких и эукариотических клеток.// Успехи биологической химии, т. 46, 2006, с.279-302.

3. Filchikov M.V., Osmakov D.I. Pseudomonas Aeruginosa bacteriophage SN: 3D-reconstruction of the capsid and identification of surface proteins by electron microscopy Л Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 35, No. 6. 2009, pp. 728-733.

4. Hartl, F. U. and Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. // Science. 2002. V. 295 P. 1852-58.

5. Mayhew, M., A. C. R. Da Silva, Martin J., Erdjument-Bromage H., Tempst P. and Hartl F. U.. Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex. // Nature. 1996. V. 379. P. 420-426.

6. Roseman, A. M., Chen S., White H., Braig, K. and Saibil, H. R. The chaperonin ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL. II Cell. 1996. V. 87. P. 241-251.

7. Marchenkov V. V. and Semisotnov G. V. GroEL-Assisted Protein Folding: Does It Occur Within the Chaperonin Inner Cavity? II Int J Mol Sci. 2009. V. 10. P. 2066-2083.

8. Banach M., Stapor K. and Roterman I. Chaperonin Structure - The Large Multi-Subunit Protein Complex. И Int. J. Mol. Sci. 2009. V. 10. P. 844-861.

9. Booth С. R„ Meyer A. S., Cong Y„ Topf M„ Sali A., Ludtke S. J., Chiu W. and Frydman J. Mechanism of lid closure in the eukaryotic chaperonin TRiC/CCT. II Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V.15. P. 746-753.

10. Иверонова В.И., Ревкевич Г.П. Теория рассеяния рентгеновских лучей. МГУ, 1972 П.Тихонов, Арсенин, 1986. Тихонов А.Н., Арсенин В.Я. Методы решения некорректных задач. Учебное пособие для вузов. Изд. 3-е, исправленное,- М.: Гл. ред. Физ.-мат. лит., 1986,-288с.

12. Svergun D.I., Semenyuk A.V., Feigin L.A., Small-angle scattering data treatment by the regularization method. //Acta Crystallogr. 1988. A44, P.244-250.

13. Svergun D., Barberato C. and Koch J. H. CRYSOL - a program to evalate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates.il Appl. Cyst. 1995. V.28. P.768 - 773.

14.Takeshi Kawaguchi. Radii of gyration and scattering functions of a torus and its derivatives.// J. Apple. Cyst. 2001. V.34, P.580 - 584.

15. Амарантов C.B. Восстановление формы наночастицы no решению прямой и обратной задач малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного в объёме тора.// ЖЭТФ, 2009, т. 135, вып.4, с. 721-737.

16. Braig К., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D. С., Joachimiak A., Horwich A.L. and Sigler, P.B. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. // Nature. 1994. V. 371. P. 578-586.

17. Braig, K., Adams, P.D., and Brunger, A.T. Conformational variability in the refined structure of the chaperonin GroEL at 2.8 A resolution. //Nat. Sruct. Biol., 1995. 2, 10831094.

18. Svergun D.I., Determination of the regularization parameter in indirect transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 1992.V.25. P.495 — 503.

19. Corrales F.J., Fersht A.R. Kinetic significance of GroEL14.(GroES7)2 complexes in molecular chaperone activity.// Fold. Des. 1996. 1, 265-273.

20. Naletova I.N., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. Unfolded, oxidized, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways./IB\och\m. Biophys. Acta (2006) 1764, 831-838.

21. Walters C., Errington N., Rowe A. J., Harding S.E. Hydrolysable ATP is a requirement for the correct interaction of molecular chaperonins српбО and cpnlO.H Biochem. J. 2002. 364:849855.

22. Волков В.В., Лапук В.А., Штыкова Э.В., Дембо К.А., Соколова А.В., Амарантов С.В., и др. Особенности структуры Fab -фрагментов имуноглобулина IgM-RF в растворе.!! Кристаллография,- 2008.- Том53, №3, с.499-506.

23. Фёдоров Б.А., Фейгин Л.А., Дембо А.Т. Учёт коллимационной поправки при рассеянии рентгеновских лучей под малыми углами. Случай «бесконечно» высокой /¿(елг;.//Кристаллография, 1966, т.11, №2, с. 159-163.

24. Амарантов С.В., Налётова И.Н., Курочкина Л.П., Моделирование формы шаперонинов по кривым малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием формфактора тораЛ ЖЭТФ, 2011,т.140, вып.2(8), с.368-386

25. Гилл и др. 1985. Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. Практическая оптимизация. М.: Мир, 1985.

26. Dennis J.E., Gay D.M., Welsch R. E. An Adaptive Nonlinear Least-Squares Algorithm; ALGORITM 573, NL2SOL - An Adaptive Nonlinear Least - Squares Algorithm [E4] II ACM Transactions on Matematical Software, 1981, V.7, N3, p.348 - 383;

27. Petoukhov M.V., Svergun D.I. New methods for domain structure determination ofproteins from solution scattering data.// J. Appl.Cryst., 2003, V.36, P.540-544.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. В.В.Волков, В.А. Лапук, Э.В. Штыкова, К.А. Дембо, A.B. Соколова, C.B. Амарантов, и др. Особенности структуры Fab -фрагментов имуноглобулина IgM-RF в растворе. Ill Кристаллография.- 2008.- Том53, №3, с.499-506.

2.Амарантов C.B. Восстановление формы наночастицы по решению прямой и обратной задач малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного в объёме тора.//ЖЭТФ, 2009, т.135, вып.4, с. 721-737.

3. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Курочкина Л.П., Моделирование формы шаперонинов по кривым малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием формфактора тора.П ЖЭТФ, 2011, т.140, вып.2(8), с.368-386

4. Амарантов C.B., Волков В.В. Аналитический расчет интенсивности малоуглового рассеяния и расчет функции Паттерсона для единичного потенциала, заданного на торе II VI Международная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007), Москва, 12-17ноября, 2007 г.Сб.тезисов, С.400.

5. Амарантов C.B., Волков В.В. Восстановление формы наночастицы по решению обратной задачи малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного вобъёме тора.П I Всероссийская конференция «Многомасштабное моделирование процессов и структур в нанотехнологиях» (ММПСН-2008) Москва, Московский инженерно-физический институт (государственный университет) 12-14 марта2008 г. Сборник тезисов докладов с.22.

6. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Муронец В.И., Курочкина Л.П. Моделирование формы белков-шаперонинов по кривым малоуглового рентгеновского рассеяния.// XVIII Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" г. Казань (Яльчик) 4-9 июля 2011.

7. Курочкина Л. П., Семенюк П. И., Орлов В.Н., Амарантов C.B., Сыкилинда H.H.// Вирусные шапероны: структура, свойства и механизм функционирования. II V Российский симпозиум "Белки и пептиды" г. Петрозаводск, 8-12 августа, 2011. Сборник тезисов с.119.

8. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Курочкина Л.П. Исследование методом малоуглового рентгеновского рассеяния белков - шаперонинов в различных конформациях. II VIII Национальная конференция « Рентгеновское Синхротронное излучение, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано -Био - Инфо - Когнетивные технологии». РСНЭ - НБИК, 2011, г. Москва. Сб. тезисов с.425.

9. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Волков В.В.// Приближение формы белков -шаперонинов по кривым малоуглового рассеяния однородным тором.II XIX Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" г. Казань (Яльчик) 25-30 июля 2012. Сб. Тезисов с.1.

Подписано в печать:

25.07.2012

Заказ № 7496 Тираж - 80 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Шаперонины их строение и свойства, литературный обзор

1.1. Строение шаперонинов группы 1.

1.2. Строение шаперонинов группы II.

1.3Свойства шаперонинов группы II.

1.4. Шаперонин бактериофага ЕЬ Р. Aeroginosa.

ГЛАВА II. Обзор теории малоуглового упругого рассеяния.

2.1. Однократное рассеяние на частице с однородной плотностью, дифракция Фраунгофера и первое борновское приближение.

2.2. Некоторые известные малоугловые формфакторы тел вращения.

2.3. Прямая и обратная задачи рассеяния, преобразование Фурье.

2.4. Теорема Котельникова-Шеннона.

2.5. Понятие корректной и некорректной задачи.

2.6. Регуляризованный метода наименьших квадратов (РМНК).

2.7 Расчет инвариантов из кривой малоуглового рассеяния.

2.8 Формула Дебая для прямой задачи малоуглового рассеяния.

2.9. Решение обратной задачи рассеяния путём моделирования в «прямом пространстве».

2.10. Решение обратная задача рассеяния «методом отжига».

ГЛАВА III. Первичная обработка экспериментальных данных - решение задачи редукции к идеальному прибору, литературный обзор.

3.1. Источники излучения и система коллимации.

3.2. Оценка погрешности по оси модуля вектора рассеяния.

3.3. Введение коллимационных поправок.

ГЛАВА IV. Вычисление формфактора тора и его приложение к решению обратной задаче рассеяния шаперонинов.

4.1. Расчет интенсивности МУР для эллиптического тора.

4.1.1 Точное выражение для формфактора тора.

4.1.2. Приближённое выражение для формфактора тора.

4.2. Асимптотики: область Гинье и область Порода для формфактора тора.

4.3 Обобщение формфактора эллиптического тора на формфактор двойного эллиптического тора.

4.4. Прямая задача малоуглового рассеяния для частицы в форме тора, а также восстановление формы частицы по неполным данным.

4.5. Решение обратной задачи рассеяния для тора «методом отжига».

4.6. Восстановление формы модели молекулы белка шаперонина ОгоЕЬ.

ГЛАВА V. Экспериментальная часть, получение и обработка экспериментальных данных.

5.1 Методика выделения и растворов белков шаперонинов.

5.2. Проверка раствора белка на монодисперсность.

5.3. Проведение малоуглового эксперимента на растворе белков.

5.4. Обработка экспериментальных данных, от растворов белков шаперонина вгоЕЬ и продукта гена

§р\46).

5.5. Математическое моделирование.

5.5.1. Восстановление формы шаперонина вгоБЬ методом оболочек.

5.5.2. Поиск наилучших параметров модели двойного эллиптического тора и полого цилиндра описывающих экспериментальные кривые рассеяния от растворов фагового ^р146) и бактериального (ОгоЕЬ) шаперонинов.

5.6. Поиск различных конформаций вирусного шаперонина в растворе.

Выводы.

Малоугловое рассеяние - упругое рассеяние электромагнитного излучения или пучка частиц (нейтронов, электронов) на неоднородностях вещества, размеры которых существенно превышают длину волны излучения (или дебройлевскую длину волны частиц); направления рассеянных лучей при этом лишь незначительно (на малые углы) отклоняются от направления падающего луча. В структурных исследованиях вещества используют, как правило, рентгеновское излучение или тепловые нейтроны с длиной волны ~1-10А (Ю'Мнм). С их помощью изучают неоднородности коллоидных размеров (10-Ю4 А). В отличие от других дифракционных методов с помощью малоуглового рассеяния исследуют структуру разупорядоченных объектов. С помощью МУР изучают строение биологических молекул в растворе, объёмные дефекты в кристаллических веществах, кластерную структуру жидкостей и аморфных тел, поры в различных пористых материалах [ФЭ, т.З, с.41, 1992;], а также можно получить ценную информацию об изменениях ряда параметров структуры при деформации и разрушении. К этим параметрам, в частности относятся размер, форма ориентация и концентрация рассеивающих частиц, распределение частиц по размерам. Значение МУР особенно велико для исследования биологических объектов, например белков, нуклеиновых кислот, вирусов. Метод МУР позволяет изучать структуру нативных биополимеров в физиологических растворах, где образец представляет собой раствор идентичных частиц (монодисперсную систему), а экспериментальная интенсивность рассеяния пропорциональна произведению концентрации частиц в растворе и интенсивности рассеяния одной частицей. Интерпретация экспериментальных данных в этом случае заключается в создании модели низкого разрешения рассеивающей частицы. В данном случае это модель трёхмерной формы частицы в однородном приближении. Построение такой модели осложняется потерей информации при сферическом усреднении - в отличие от рентгеноструктурного анализа монокристаллов. Поэтому оптимальное использование информации заключенной в экспериментальных данных, а также привлечение дополнительных характеристик, например наличие оси симметрии у частицы, её вытянутости или сплюснутости, оказывается важным при обработке экспериментальных данных. Несмотря на заметный прогресс в области компьютерного моделирования для обработки данных малоуглового эксперимента, описание формы тела минимально возможным набором параметров и дальнейшим поиском этих параметров представляет собой довольно сложную задачу. При этом число используемых формфакторов для описания форм частиц ограничивается классическими работами середины прошлого века Гинье (Ошшег) и Порода (Рогоё) [Рогоё 1948]. Сводная таблица формфакторов представлена также в работах [Бекренёв, Миркин, 1991] и [Свергун, Фейгин, 1986].

Физико-механические свойства таких дисперсных систем, как стёкла, полимеры, керамика и т.п., определяются размерами, формой и взаимным расположением частиц, которые образуют так называемую надмолекулярную структуру. По изменению дифракционной картины под малыми углами можно судить об эволюции надмолекулярной структуры. Актуальность темы

Определение формы и структурных параметров белковых макромолекул, находящихся в условиях, близких к естественным, представляет собой чрезвычайно важную задачу в исследовании связей структура-свойство таких объектов, так как многие функции белков и их комплексов зависят от их конформации. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУР) и тепловых нейтронов в этом случае предоставляет уникальную возможность изучать структуру биологических наночастиц в растворе при размерах, существенно превышающих возможности ядерного магнитного резонанса и при этом не требует какой-либо специальной подготовки образцов, которая часто требуется в других методах исследования. С другой стороны, развитые в последнее время методы интерпретации данных малоуглового рассеяния в состоянии эффективно учитывать разнообразную априорную информацию о структуре наночастиц, что может существенно повышать надежность получаемых результатов. Особенно актуальным метод малоуглового рассеяния оказываются в случае изучения новых белковых объектов, когда они имеют большие размеры, а получение монокристаллов затруднительно или невозможно. Однако, задача определения трехмерной формы частиц по одномерным данным рассеяния оказывается плохо обусловленной и преодолеть неустойчивость определения структурных характеристик можно с помощью построения моделей формы, описываемых небольшим числом параметров. Этим определяется высокая актуальность теоретической части работы в данном направлении.

В данной работе для параметризации задачи рассеяния от белка бактериального шаперанина вгоЕЬ [Марченков и др., 2006] и вирусного (фагового) шаперонина продукта гена 146 (р§146), выведены формфакторы моделей частиц в виде двойного симметричного и несимметричного эллиптических торов, как функции их геометрических параметров и модуля вектора рассеяния. Полученные выражения применены для определения по данным МУР параметров формы белковых комплексов шаперонинов, один из которых изучен впервые. Таким образом, актуальность экспериментальной части работы определяется не только решением задачи оптимальной параметризации предполагаемой формы макромолекулы и сопоставлении полученных различными способами структурных моделей, но и исследованием новых белковых объектов. Основные цели и задачи работы.

Получить в аналитическом виде формфакторы эллиптических одиночного и двойного симметричного и несимметричного тора, как функцию параметров формы и модуля вектора рассеяния. Провести моделирование формы молекул белков шаперонинов с известной структурой по полученным экспериментальным данным малоуглового рассеяния, с применением полученных выражений для формфакторов и другими известными программами определения формы. Сравнить модели, полученные этими методами между собой.

Получить экспериментальные данные малоуглового рассеяния от растворов белка вирусного шаперонина pgl46 и найти параметры модели формы молекулы с помощью полученных аналитических выражений формфакторов и традиционных методов моделирования.

Получить экспериментальные данные рассеяния для растворов белка gpl46 в присутствии АТФ и с помощью разработанных подходов определить изменения параметров формы молекулы белка при АТФ-зависимом конформационном переходе. Научная новизна

Впервые методом малоуглового рентгеновского рассеяния проведен анализ конформаций формы макромолекул в растворе имеющих центрально симметричное отверстие путем определения геометрических параметров модели в виде однородного двойного эллиптического тора. Объектами исследования были макромолекулы вирусных и бактериальных шаперонинов, формы которых можно описать формфаторами одиночного и двойного эллиптических торов. А именно, были определены геометрические параметры следующих макромолекул:

1. Хорошо изученный бактериальный шаперонин GroEL;

2. Малоизученный вирусный (фаговый) шаперонин, кодируемый геном 146 (gene product, gpl46) бактериофага EL Pseudomonas aeruginosa [Filchikov M.V, 2009]; С этой целью одной из подзадач данной работы явилось возможность показать для простейшей двусвязной поверхности вращения -тора устойчивое восстановление формы трёхмерного однородного тела заданного внутри своего объёма единичным потенциалом, по пространственно усреднённой кривой малоуглового рассеяния. Поскольку все шаперонины являются АТФ-азами, использующими энергию, получаемую при связывании и гидролизе АТФ, то для определения конформационных перестроек малоугловым методом впервые определялись параметры изменения формы шаперонина от состава буфера, как параметрическое описание формы частицы через кривую интенсивности малоуглового рассеяния. Практическая значимость.

Используя метод малоуглового рентгеновского рассеяния была получена пространственная модель малоизученного вирусного шаперонина ёр146. С целью ускорения компьютерной обработки экспериментальных данных для бактериальных и вирусных шаперонинов на основе полученных автором тороидальных формфакторов была написана компьютерная программа, существенно ускоряющая поиск формы белков шаперонинов не прибегая к методу случайного перебора конфигураций частицы. Разработанный подход расширяет банк методов анализа систем содержащих наночастицы, имеющие центрально-симметричное отверстие. На основе малоугловых экспериментальных данных был обнаружен АТФ -зависимый конформационный переход шаперонина яр 146 из закрытого в более функционально активное - открытое состояние.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка

выводы

1. Получено приближённое аналитическое выражение для ФФ эллиптического тора как функции модуля вектора рассеяния. Из приближённого выражения для формфактор тора были выведены приближение Гинье для радиуса инерции частицы и асимптотика Порода показывающая закон спада со степенью -6.

Известное ранее точное выражение формфактора тора впервые обобщено для случая двойного симметричного и не симметричного торов. Разработаны компьютерные программы для расчета кривой МУР при заданных параметрах тора на основе полученных автором выражений.

2. Данные программы применены для определения параметров структурных моделей молекул ряда шаперонинов. Для шаперонина вгоБЬ по данным малоуглового рассеяния показано, что максимальный размер частицы в растворе на 2-3 нм больше, чем известные по данным рентгеноструктурного анализа.

3. Впервые методом малоуглового рентгеновского рассеяния проведено изучение макромолекулы вирусного шаперонина Рв146. Полученные автором экспериментальные результаты подтверждают изменение конформации макромолекулы в зависимости от внешних условий.

Моделирование строения молекулы с использованием полученных в работе теоретических выражений демонстрирует, что в процессе конформационного перехода происходит изменение формы макромолекулы ёр146 от симметричной формы, описываемой двойным эллиптическим тором с параметрами а = а1=а2=(20±1)А, Ь = (50±2)А с = сх=с2 = (34 ± 1 )А несимметричному ахФа2, Ь, сх &с2а1=(5 ± 0.5) А а2=(30±1)А Ъ = (50±2)Асх =(40±1)Дс2=(30±1)Л

4. В отличии от метода случайного перебора конфигураций ( с временем поиска - часы), предложенный подход с использованием приближённых аналитических выражений для тороидальных формфакторов позволяет быстро (минуты) описывать конформационные изменения в макромолекулах, пользуясь при этом небольшим числом параметров.

В заключение хочу поблагодарить своего научного руководителя к.х.н. Волкова Владимира Владимировича. Список работ автора по теме диссертации.

1. Волков В.В., Лапук В.А., Штыкова Э.В., Дембо К.А., Соколова A.B., Амарантов C.B., и др. Особенности структуры Fab -фрагментов имуноглобулина IgM-RF в растворе. II Кристаллография, 2008, Том53, №3, с.499-506.

2.Амарантов C.B. Восстановление формы наночастицы по решению прямой и обратной задач малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного в объёме тора.//ЖЭТФ, 2009, т.135, вып.4, с. 721-737.

3. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Курочкина Л.П., Моделирование формы шаперонинов по кривым малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием формфактора тора.И ЖЭТФ, 2011, т.140, вып.2(8), с.368-386

4. Амарантов C.B., Волков В.В. Аналитический расчет интенсивности малоуглового рассеяния и расчет функции Паттерсона для единичного потенциала, заданного на торе II VI Международная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007), Москва, 12-17ноября, 2007 г.Сб.тезисов, С.400.

5. Амарантов C.B., Волков В.В. Восстановление формы наночастицы по решению обратной задачи малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного вобъёме тора.И I Всероссийская конференция «Многомасштабное моделирование процессов и структур в нанотехнологиях» (ММПСН-2008) Москва, Московский инженерно-физический институт (государственный университет) 12-14 марта2008 г. Сборник тезисов докладов с.22.

6. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Муронец В.И., Курочкина Л.П. Моделирование формы белков-шаперонинов по кривым малоуглового рентгеновского рассеяния.// XVIII Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" г. Казань (Яльчик) 4-9 июля 2011, Сб. тезисов С.7.

7. Курочкина Л. П., Семенюк П. И., Орлов В.Н., Амарантов C.B., Сыкилинда H.H.// Вирусные шапероны: структура, свойства и механизм функционирования. // V Российский симпозиум "Белки и пептиды" г. Петрозаводск, 8-12 августа, 2011. Сборник тезисов с.119.

8. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Курочкина Л.П. Исследование методом малоуглового рентгеновского рассеяния белков — шаперонинов в различных конформациях. II VIII Национальная конференция « Рентгеновское Синхротронное излучение, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано -Био - Инфо - Когнетивные технологии». РСНЭ - НБИК, 2011, г. Москва. Сб. тезисов с.425.

9. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Волков В.В.// Приближение формы белков — шаперонинов по кривым малоуглового рассеяния однородным тором.!7 XIX Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" г. Казань (Яльчик) 25-30 июля 2012. Сб. тезисов с.7.

1. Адамар Ж. Задача Коши для линейных уравнений с частными производными гиперболического типа. М. Наука, 1978.

2. Амарантов C.B. Восстановление формы наночастицы по решению прямой и обратной задач малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного в объёме тора. ЖЭТФ, 2009. т. 135, вып.4, с. 721-737.

3. Амарантов C.B., Налётова И.Н., Курочкина Л.П., Моделирование формы шаперонинов по кривым малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием формфактора тора. ЖЭТФ, 2011. т.140, вып.2(8), с.368-386.

4. Бекренёв А.Н., Миркин Л.И., Малоугловая рентгенография деформации и разрушения материалов. -М.: Изд-во МГУ. 1991.

5. Борн М., Вольф Э. Основы оптики. М., « Наука», 1970.

6. Ватсон Г.Н. Теория бесселевых функций. Перев. с англ. 4.1, M., HJI, 1949.

7. Винклер Г. Анализ изображений, случайные поля и динамические методы Монте-Карло. Математические основы. Новосибирск, Изд-во СО РАН филиал «ГЕО» 2002.

8. Воеводин В.В. О методе регуляризации. ЖВМ и МФ, 1969. т.2, №3.

9. Волков В.В., Лапук В.А., Штыкова Э.В., Дембо К.А., Соколова A.B.,

10. Амарантов C.B., и др. Особенности структуры Fab -фрагментов имуноглобулина IgM-RF в растворе.!I Кристаллография. 2008. Том53, №3, с.499-506.

11. Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. Практическая оптимизация. М.: Мир, 1985.

12. Голуб Дж., Ван Лоун Ч. Матричные вычисления. М. Мир, 1999.

13. Гончарский A.B., Леонов A.C., Ягола А.Г. О принципе невязки при решении нелинейных некорректных задач. ДАН СССР, 1974. т.214, №3.

14. Гончарский A.B., Черепащук М.М., Ягола А.Г., Численные методы решения обратных задач астрофизики. М.: Наука, 1978.

15. Гордонова В.И. Морозов В.А. Численные алгоритмы выбора параметра в методе регуляризации.- ЖВМ и МФ, 1973. т. 13, №3.

16. Горелик С.С., Скаков Ю.А., Расторгуев Л.Н. Рентгенографический и электронно-оптический анализ. Учеб. Пособие для вузов. 4-е изд. М. «МИСИС», 2002.

17. Градштейн И.С., Рыжик И.М. Таблицы интегралов, сумм, рядов и произведений. Физматлит. Москва, 1962.

18. Жиглявский A.A., Жлинскас А.Г. Методы поиска глобального экстремума. М. Наука, 1991.

19. Иванов В.К. О приближённом решении операторных уравнений первого рода. ЖВМ и МФ 1966. т.6(6), с.1089-1094.

20. Иверонова В.И., Ревкевич Г.П. Теория рассеяния рентгеновских лучей. МГУ, 1972.

21. Котельников В.А., Николаев А.М. Основы радиотехники. М.: Связьиздат, 1950.

22. Леонов A.C. К обоснованию выбора параметра регуляризации по критериям квазиоптимальности и отношения. ЖВМ и МФ, 1978.18(6) с.1363-1376,

23. Леонов A.C. О решении линейных некорректных задач на основе модифицированного критерия квазиоптимальности. Матем. Сборник, 1983. 122(3), с. 405-415

24. Лоусен Ч., Хенсон Р. Численное решение задач метода наименьших квадратов. М. Наука, 1986. с.41.

25. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М., Теория поля. "Теоретическая физика", том II. М.: Наука, 1988.

26. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М., Квантовая механика. Нерелятивисткая теория "Теоретическая физика", том III. М.: Наука, 1989.

27. Марченков В.В., Марченко Н.Ю., Марченкова С.Ю., Семисотнов Г.В. Молекулярные шаперонины прокариотических и эукариотических клеток. Успехи биологической химии, 2006. т. 46, с.279-302.

28. Миркин Л.И. Справочник по рентгено-структурному анализу поликристаллов. Москва 1961. Глава 10.

29. Петров Ю.П., Сизиков B.C. Корректные, некорректные и промежуточные задачи с приложениями: Учебное пособие для вузов. СПб: Политехника, 2003.

30. Рольбин Ю.А., Фейгин Л.А., Щедрин Б.М., Решение коллимационной задачи для случая конечной ширины щели в малоугловом рассеянии.// Кристаллография. 1977. т.22, вып.6, с.1166-1175.

31. Савельев И.В. Основы теоретической физики. Учебное руководство, т.2 М. Наука, 1991.

32. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986.

33. Семисотнов Г.В. Исследование равновесных и кинетических промежуточных состояний на пути самоорганизации глобулярных белков.-Дисс.докт.физ.-мат.наук. 1995, Пущино.

34. Сивухин Д.В. Общий курс физики т. IV. Оптика. Учеб. Пособие. М. «Наука» 1985. Глава IV.

35. Скрышевский А.Ф Структурный анализ жидкостей и амофных тел. Москва «высшая школа» 1980.

36. Соколов A.A., Тернов И.М. Релятивистский электрон. М.:Наука 1974.

37. Сурин А.К. Конформационные изменения молекулярного шаперонина GroEL в растворе. Дисс. на к.ф.-м.н. Пущино, 1996.

38. Тернов И.М., Михайлин B.B. Синхротронное излучение. Теория и эксперимент. М.: Энергоатомиздат, 1986.

39. Тихонов А.Н. О регуляризации некорректно поставленных задач. ДАН СССР, 1963. т.153(1), с.49-52.

40. Тихонов А.Н. О регуляризации некорректно поставленных задач. ДАН СССР, 1963. т.151(3), с.501-504.

41. Тихонов А.Н., Арсенин В.Я. Методы решения некорректных задач. Учебное пособие для вузов. Изд. 3-е, исправленное.- М.: Гл. ред. Физ.-мат. лит., 1986. 288с.

42. Тихонов А.Н., Гончарский A.B., Степанов В.В. Ягола А.Г. Численные методы решения некорректных задач. М.: Наука, 1990.

43. Тихонов А.Н., Гласко В.Б. Применение метода регуляризации в нелинейных задачах. Журн. Вычисл. Матем. и мат. физ. 1965. т.5(3), с.463-473.

44. Тихонов А.Н., Леонов A.C. Ягола А.Г. Нелинейные некорректные задачи. М.Наука, 1995.

45. Фёдоров Б.А., Фейгин J1.A., Дембо А.Т. Учёт коллимационной поправки при рассеянии рентгеновских лучей под малыми углами. Случай «бесконечно» высокой и/е/ш./ЛСристаллография, 1966. т.11, №2, с.159-163.

46. Фёдоров Б.А. Учет коллимационных искажений при малоугловом рассеянии рентгеновских лучей. Поправка на высоту щели. // Кристаллография,1968. т.13, вып.5, с.763-769.

47. Федоров Б.А., Андреева H.A., Волкова JI.A., Воронин RA.J/Учет коллимационных искажений при малоугловом рассеянии рентгеновских лучей. Программа для ЭВМ и экспериментальная проверка теории, там же с.770-775.

48. Физическая Энциклопедия, т.З, с.41. М.: Научное издательство « Большая Российская энциклопедия», 1992.

49. Филиппович В.Н. О коллимационной поправке в теории рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами.//Журнал технической физики ЖТФ. 1957. т.27, №6. с. 1029-1044.

50. Хорн Р. Джонсон Ч., Матричный анализ. М.: Мир, 1989.

51. Шеннон Клод Эльвуд (Shannon С. Е.). Работы по теории информации и кибернетике. Сб. Статей. М. Изд. иностр. лит. 1963. с.433-460.

52. Banach М., Stapor К. and Roterman I. Chaperonin Structure The Large Multi-SubunitProtein Complex. //Int. J. Mol. Sci. 2009. V.10. P.844-861.

53. Bochkareva E.S., Lissin N.M. & Girshovich A.S. Transient association of newly synthesized unfolded proteins with the heat-shock GroEL. II Nature, 1988. V.336, P.254-257.

54. Buchner, J., Schmidt, M, Fuchs, M., Jaenicke, R., Rudolph, R., Schmid, F. X & Kiefhaber, Т. GroEL facilitates refolding of citrate synthase by suppressing aggregation.// Biochemistry, 1991. V.30. P.1586-1591.

55. Burston S.G., Ranson N.A. & Clarse A.R. The origins and consequences of asymmetry in the chaperonin reaction cycle. J. Biol. Chcm., 1995. V.249, P. 138152.

56. Booth C. R., Meyer A. S., Cong Y., Topf M., Sali A., Ludtke S. J., Chiu W. and Frydman J. Mechanism of lid closure in the eukaryotic chaperonin TRiC/CCT/. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V.l5, P.746-753.

57. Braig K., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L. and Sigler, P.B. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8A. //Nature. 1994. V.371. P.578-586.

58. Braig, K., Adams, P.D., and Brunger, A.T. Conformational variability in the refined structure of the chaperonin GroEL at 2.8 A resolution. Nature Structural Biology 1995. V.2, P.1083-1094.

59. Center for X-ray optics X-ray data booklet. Lawrence Berkeley Laboratory University of California. Berkeley California 94720. Second printing, with corrections, April 1986.

60. Chandrasekhar G.N., Tilly K., Woolford C, Hendrix R. & Gcorgopoulos C. Purification and properties of the GroES morphogenctic protein of E. coli. II J. Biol. Chcm., 1986. V.261, P.12414-12419.

61. Chen Sh., Roseman A.M., Hunter A.S., Wood S.P., Burston S.G., Ranson N.A., Clarke A.G. & Saibil H.R. Location of a folding protein and shape chages in

62. GroEL-GroES complexes imaged by cryo-electrorv microscopy. Nature, 1994. V.371, P.261-264.

63. Corrales F.J., Fersht A.R. Kinetic significance of GroEL14.(GroES7)2 complexes in molecular chaperone activity. 1996. Fold. Des. 1, P.265-273.

64. Dennis J.E., Gay D.M., Welsch R. E. An Adaptive Nonlinear Least-Squares Algorithm // ACM Transactions on Matematical Software, 1981, V.7, N3, p.348 -368.

65. Dennis J.E., Gay D.M., Welsch R. E. ALGORITM 573, NL2SOL An Adaptive Nonlinear Least - Squares Algorithm E4.H ACM Transactions on Matematical Software, 1981, V.7, N3, p.369 - 383.

66. Ditzel L., Lowe J., Stock D., Stetter K., Huber, H., Huber R., and Steinbacher S. Crystal Structure of the Thermosome, the Archaeal Chaperonin and Homolog of CCTJ/CeW, 1998. Vol. 93, April 3, P.125-138.

67. Fenton W.A., Kashi Y., Furtak K. & Horwich A.L. Residues in chaperonin GroEL required for polypeptide binding and release. Nature, 1994. V.371, P.614-619.

68. Filchikov M.V., Osmakov D.I. Pseudomonas Aeruginosa bacteriophage SN: SD-reconstruction of the capsid and identification of surface proteins by electron microscopy.!I Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 35, No. 6. 2009, pp. 728-733.

69. Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.ll Annu Rev Biochem. 2001.V.70, P.603-47.

70. Fräser R.D.B., Macrae T.P. Suzuki E. An improved method for calculating the contribution of solvent to the X-ray diffraction pattern of biological molecules. J. Appl. Cryst. 1978.V.11, P. 693-694.

71. Gorovits B.M. & Horowitz P.M. The chaperonin GroEL is destabilized by binding of ADP. J. Biol. Chem., 1995. V.270, P.28551-28556.

72. Glatter O. and Kratky O. Small angle X-ray scattering. ACADEMIC PRESS INC. London, 1982.

73. Gray, T.E., Fersht, A.R. Cooperativity in ATP hydrolysis by GroEL is increased by GroESJlFEBS Lett.-1991.v.292, P.254-258.

74. Guinier A., Fournet G. Small-angle Scattering of X-rays., New York, London 1955.

75. Hansen J.E. & Gafni A. Fluorescence detection of conformational changes in GroEL induced by thermal switching and nucleotide binding. J. Biol. Chem., 1994. V.269, P.6286-6289.

76. Hartl, F. U. and Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. II Science. 2002. V.295, P. 1852-58.

77. Hayer-Hartl M.K., Martin J. & Hartl F.U. Asymmetrical interaction of GroEL and GroES in the ATPase cycle of assisted protein folding. Science, 1995. V.269, P.836-840.

78. Hertveld K., Lavigne R., Pletneva E., Sernova N., Kurochkina L., Korchevskii R., Robben J., Mesyanzhinov V., Kiylov V. and Volckaert. Genome Comparison of Pseudomonas aeruginosa Large Phages. II J. Mol. Biol. 2005. V.354, P.536-545.

79. Hirai H., Noi K., Hongo K., Mizobata T., and Kawata Y. (2008) Functional Characterization of the Recombinant Group II Chaperonin from Thermoplasma acidophilum. II J. Biochem. 2008. V. 143, P.505-515.

80. Huang, By T.C., Toraya, H., Blanton, T.N., Wu Y., X-ray Powder Diffraction Analysis of Silver Behenate, a Possible Low-Angle Diffraction Standard. 1993. J. Appl. Cryst. V.26, p. 180-184.

81. Huang X., Zhang W., Han S., Yin Y., Xu G. and Wang X. The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. II Nature. 1997. V.388. P. 741-750.

82. Huang Y. S., Chuang D. T., Inobe T. Mechanisms for GroEL/GroES-mediated folding of a large 86-kDa fusion polypeptide in vitro. II J. Biol. Chem. 1999. V.274. P. 10405-10412.

83. Iizuka R., So S., Inobe T., Yoshida T., Zako T, Kuwajima K. and Yohda M. Role of the helical protrusion in the conformational change and molecular chaperone activity of the archaeal group II chaperonin. II J. Biol. Chem. 2004. V.279. P.18834-18839.

84. Ingber L. Simulated annealing: Practice versus Theory. Math. Computer Modeling. 1993. V.18, P.29-57.

85. Inobe, Т., Takahashi, К., Maki et al. Asymmetry of the GroEL-GroEs Complex under Physiological Conditions as Revealed by Small-Angle X-Ray Scattering. Biophysical J., 2008. V.94. P.1392-1402.

86. Ishii N., Taguchi H., Sumi M. & Yoshida M. Structure ofholo-chaperonin with electron microscopy. IIFEBS Letters, 1992. 299, P. 169-174

87. International Tables for X-ray Crystallography, 1973. Vol. IV. Birmingham: Kynoch Press.

88. Jerri Abdul J. // The Shannon Sampling Theorem — Its Various Extensions and Applications. A Tutorial Review. Proc. IEEE , 1977. V.65, P. 1565-1596, имеется перевод ТИИЭР, 1977. т. 65, №11, ,с.53-89.

89. Koike-Takeshita A., Yoshida М. and Taguchi Н. Revisiting the GroEL-GroES reaction cycle via the symmetric intermediate implied by novel aspects of the GroEL(D398A) mutant. II J. Biol. Chem., 2008. V.283, P.23774-23781.

90. Kubota H., Hynes G. and Willison K. The chaperonin containing t-complex polypeptide 1 (TCP-1). Multisubunit machinery assisting in protein folding and assembly in the eukaryotic cytosol. И Eur. J. Biochem., 1995. V. 230, P.3-16.

91. Kramer H.P., "A generalized sampling theorem" J. Math. Phys.,1959. V.38, P.68-72.

92. Kranic K. A Theoretical possibility of Correcting the Collimation Error in Small-Angle X-ray Scattering. //Acta crystallogr. 1954.V.7, N 8-9, P.709.

93. Kratky O., Porod G., Skala Z. Verschmierung und Entschmierung bei Rontgen-Kleinwinkeldiagrammen //Acta phys. Austriaca., 1960. Bd. 13, N 1. S.76-128.

94. Laminet A.A., Ziegelhoffer Т., Georgopoulos C. & Pluckthun A. The Escherichia coli heat shock proteins GroEL and GroES modulate the folding of the p-lactamase precursor.il EMBO J., 1990. V.9, P.2315-2319.

95. Lorimer G.H. GroEL structure: a new chapter on assisted folding. II Current Biology, 1994, V.2, P.l 125-1128.

96. Marchenkov V. V. and Semisotnov G. V. GroEL-Assisted Protein Folding: Does It Occur Within the Chaperonin Inner Cavity? II Int J Mol Sci. 2009. V.10, P. 2066-2083.

97. Martin J., Mayhew M., Langer Th. & Hartl F.U. The reaction cycle of GroEL and GroES in chaperonin-assistcd protein folding. Nature, 1993(6). V.366, P.228-233.

98. Mayhew, M., A. C. R. Da Silva, Martin J., Erdjument-Bromage H., Tempst P. and Hartl F. U. Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex. //Nature. 1996. V.379, P.420-426.

99. Metropolis N. et. al. // Equations of state calculations by fast computing machines. J. Chem. Phys.1953. V.21, P.1087-1091.

100. Naletova I.N., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. Unfolded, oxidized, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways. Biochim. Biophys. Acta, 2006. V.1764, P.831-838.

101. Noi K., Hirai H., Hongo K., Mizobata T. and Kawata Y. A potentially versatile nucleotide hydrolysis activity of group II chaperonin monomers from Thermoplasma acidophilum.//Biochemistry, 2010. V.48. P. 9405-9415.

102. Petoukhov , M. Svergun, D. New Methods for domain structure determination ofproteins from solution scattering data. J. Appl. Cyst., 1995. V.28, P.768 773.

103. Richardson A., van der Vies S.M., Keppel F., Taher A. and Landry S. J., Georgopoulos C. Compensatory changes in GroEL/Gp31 affinity as a mechanism for allele-specific genetic interaction. II J. Biol. Chem., 1999. V.274, P.52-58.

104. Ranson N. A., Clare D. K., Farr G. W., Houldershaw D., Horwich A. L. and Saibil H. R. Allosteric signaling of ATP hydrolysis in groel-groes complexes. II Nat Struct Mol Biol., 2006. P.13, P. 147-152.

105. Reissmann S., Parnot C., Booth C. R., Chiu W. and Frydman J. Essential function of the built-in lid in the allosteric regulation of eukaryotic and archaeal chaperonins. I I Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V.14, P. 432-440.

106. Roseman, A. M., Chen S., White H., Braig, K. and Saibil, H. R. The chaperonin ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL. //Cell, 1996. V.87, P. 241-251.

107. Sameshima T., Ueno T., Iizuka R., Ishii N., Terada N., Okabe K., and Funatsu T. Football- and Bullet-shaped GroEL-GroES Complexes Coexist during the Reaction Cycle. II J. Biol. Chem., 2008. V. 283, P.23765-23773.

108. Schmidt P.W. Collimation Corrections in Small Angle X-rey Scattering.// Acta crystallogr., 1965.V.19, N 6, P.938-942.

109. Schmidt P. W. Fedorov B.A. Use of the Slit Function for Slit-Length in Small-Angle X-ray Scattering.!II. Appi. Crystallogr. 1978. V.l 1, N5, P.411- 416.

110. Strobl G.R., Baldrian J. A simple algorithm for the numerical slit height correction of a low-angle scattering curvet I Acta crystallogr., 1970. A26, N 3, P.367-375.

111. Svergun D.I., Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria./1 J. Appl. Cyst. 1992. V.25, P.495 -503.

112. Svergun D., Barberato C. and Koch J. H. CRYSOL a program to evalateX-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Appl. Cyst., 1995. V.28, P.768 - 773.

113. Svergun, D. I., Volkov, V. V., Kozin, M. B. & Stuhrmann, H. B. (1996). New developments in direct shape determination from small-angle scattering 2. Uniqueness. Acta Crystallogr. A52, P.419-426.

114. Svergun, D.I. Restoring Low Resolution of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophys. J., 1999. V.76(6), P.2879-2886.

115. Tanford, C. Physical Chemistry of Macromolecules. 1961. John Wiley & Sons, New York.

116. Takeshi Kawaguchi Radii of gyration and scattering functions of a torus and its derivatives//J. Apple.Cyst. 2001. V.34, P.580 584.

117. Taylor T. R., Schmidt P.W. A computer program for slit-length collimation corrections for small angle X-ray scattering data obtained with the kratky camera. Hi. Appl. Crystallogr. 1969. V.2, N3, P.143-144.

118. Thiyagarajan P., Henderson S. and Joachimiak A. Solution structures of groel and its complex with rhodanese from small-angle neutron scattering. // Structure, 1996. V. 4, P.79-88.

119. Walters C., Errington N., Rowe A.J., Harding S.E. (2002) Hydrolysable ATP is a requirement for the correct interaction of molecular chaperonins cpn60 and cpnlO. Biochem. J. V.364, P.849-855.

120. Weissman, J. S., Hohl C. M., Kovalenko O., Kashi Y., Chen S., Braig K., Saibil H. R., Fenton W. A., and Horwich A. L. Mechanism of GroEL action: Productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES. H Cell. 1995. V. 83. P.577-587.

121. Young J. C., Agashe V. R., Siegers K. and Hartl F. U. Pathways of chaperone-mediated protein folding in the cytosol. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. V. 5. P. 781-791.

122. Zhang J., Ma B., Dimaio F., Douglas N. R., Joachimiak L. A., Baker D., Frydman J., Levitt M., Chiu W. Cryo-EM Structure of a Group II Chaperonin in the Prehydrolysis ATP-Bound State Leading to Lid Closure. // Structure, 2011. V.19, №5, P. 633-639.