Прямые методы анализа данных малоуглового рассеяния и определение строения биополимеров в растворе тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

Г'То

\ о Ш

Российская Академия Наук Институт кристаллографии им. А.В.Шубникова

На правах рукописи Свергун Дмитрий Иванович

Прямые методы анализа данных малоуглового рассеяния и определение строения биополимеров в растворе

Специальность 01.04.18 - кристаллография, физика кристаллов

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 1997

Официальные оппоненты:

Академик РАН Богданов A.A.

Член-корреспондент РАН Хохлов А.Р.

Доктор химических наук, профессор Арутюнян Э.Г.

Ведущая организация: Институт Белка РАН, г. Пущино

Защита состоится "26" среврослх 1997 года в 10 — часов на заседании диссертационного Совета Д.002.58.01 при Институте кристаллографии им. А.В.Шубникова РАН по адресу: 117333, Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана skm Soip^t 1997 года

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д.002.58.01 кандидат физико-математических наук

<

В.М.Каневский

Содержание

Общая характеристика работы 2

Глава 1. Обработка экспериментальных данных малоуглового

рассеяния 8

1.1. Последовательное устранение приборных искажений 9

1.2. Общий метод обработки с использованием регуляризации 10

1.3. Разложения по ортогональным функциям 13

Глава 2. Прямые методы определения структуры частиц

в монодисперсных системах 15

2.1. Разделение бесселевых функций 16

2.2. Восстановление формы частиц 18

2.3. Вариация контраста и структура рибосомы 22

Глава 3. Использование кристаллографических моделей

в интерпретации малоугловых данных 27

3.1. Расчет малоуглового рассеяния атомными моделями 27

3.2. Структура макромолекулярных комплексов 30

3.3. Система трехмерной графики для малоуглового рассеяния 33

Основные результаты и выводы Цитируемая литература Публикации по теме диссертации

36

37 39

Актуальность темы. Малоугловое рассеяние (МУР) рентгеновских лучей и нейтронов является одним из наиболее эффективных методов изучения надатомпой структуры вещества при разрешении 1-100 им. Главным достоинством метода является его общность: МУР может быть использовано для исследования неупорядоченных объектов и не требует специальной подготовки образцов. Основные формулы, связывающие интенсивность рассеяния со структурой объекта, определяются только контрастом рассеивающих неоднородностей по отношению к основной матрице. Таким образом, МУР позволяет исследовать объекты различной физической природы и агрегатного состояния, в частности, макромолекулы в растворе, кластеры дефектов в монокристаллах, эффекты разделения фаз в сплавах, стеклах и полимерных материалах и др.

Уровень структурной информации, заключенной в данных МУР, определяется типом рассеивающей системы. Для объектов без выраженной структуры типа "частицы в матрице" метод дает интегральные фазовые соотношения, для полидисперсных систем - информацию о распределении частиц по размерам. Для монодисперсных систем хаотически ориентированных идентичных частиц (важнейшим примером таких объектов являются растворы биополимеров) интенсивность МУР непосредственно связана со строением частицы, что дает уникальную возможность изучения четвертичной структуры нативных биологических макромолекул в физиологических растворах.

С появлением в последние десятилетия мощных синхротронных и нейтронных источников, а также новых типов регистрирующих устройств, малоугловые установки обеспечивают надежную регистрацию экспериментальных данных в широком диапазоне векторов рассеяния. В то же время, методы анализа малоугловых данных в основном используют

подходы, развитые еще в период становления метода МУР (1950е-60е годы), и зачастую оказываются неадекватными. В результате интерпретация данных рассеяния нередко ограничивается вычислением одной-двух интегральных характеристик. Во многих случаях (особенно при исследованиях растворов биополимеров), такая интерпретация далеко не исчерпывает возможностей метода и, следовательно, существенно снижает эффективность малоугловых исследований. Весьма актуальной является поэтому задача разработки новых методов извлечения структурной информации из данных МУР.

Целью работы являлось развитие новых методов обработки и интерпретации данных МУР и их применение для исследования дисперсных систем, в частности, биологических макромолекул в растворе.

Научная новизна. Развиты новые методы обработки экспериментальных данных рассеяния, которые основываются на применении современных вычислительных методов (регуляризация, сингулярное разложение, системы ортогональных функций) и позволяют надежно устранять приборные искажения в малоугловом эксперименте.

Разработаны прямые методы определения структуры частиц в монодисперсных системах при разрешении 1-5 им с использованием математического аппарата сферических гармоник. Предложен н реализован новый метод восстановления структуры аксиально-симметричных частиц, и с его помощью определена структура бактериального вируса Т7 с разрешением 5 им. Разработан и успешно применен для изучения белковых структур прямой метод восстановления формы частиц в монодисперсных системах. Развит новый метод интерпретации данных вариации контраста и получена структура 70S рибосомы E.Coli при разрешении 3.5 им.

Предложен it реализован метод расчета кривых малоуглового рассеяния от биополимеров с известной атомной структурой, учитывающий влияние гидратпой оболочки. Развит метод определения взаимного расположения субчастиц (доменов) в комплексных структурах. Методы применены для исследования различий между белковыми структурами в кристалле и растворе. Получена структурная модель аллостерического T->R перехода аспартат транскарбамилазы в растворе и показано, что этот переход связан с существенно большей перестройкой доменной структуры, чем в кристалле.

Созданы программы графического отображения полученных трехмерных моделей низкого разрешения совместно с электронномикроскопическими и атомными моделями на IBM-PC и SUN графической рабочёй станции.

Научное значение работы. Развитые методы обработки данных малоуглового эксперимента позволяют рассчитывать интегральные параметры объекта и его характеристические функции непосредственно из экспериментальных данных с учетом приборных искажений, и применимы к системам различной физической природы (неорганические, полимерные, биологические).

Прямые методы определения структуры частиц в монодисперсных системах дают возможность определения трехмерной структуры низкого разрешения из данных МУР. Особое значение имеют эти методы для определения строения биологических макромолекул, поскольку МУР -один из немногих структурных методов, позволяющий изучать нативные биополимеры в физиологических растворах. Развитые методы показали свою эффективность при изучении строения ряда белков, бактериальных ¡зирусов и рибосомы. В частности, полученная модель формы и внутренней структуры рибосомы с разрешепем 3.5 им может служить основой для определения положения ее структурных фрагментов

(рибосоммые белки, транспортная РНК), а также для поиска фаз ннзкоугловых рефлексов в кристаллографических исследованиях.

Развитые подходы, позволяющие учитывать кристаллографические данные при анализе МУР растворами биополимеров, открывают новые возможности для изучения структуры и динамики макромолекул в растворе. Эти возможности включают определение доменной структуры, олигомерного состава, моделирование отличий кристалл-раствор, анализ изменений четвертичной структуры, вызванных внешними воздействиями. Полученные для ряда мультидоменных белков результаты свидетельствуют о том, что упаковка макромолекул в кристалле может существенно влиять на четвертичную структуру, и моделирование с помощью МУР позволяет предсказывать их строение в нативном состоянии.

Разработанный комплекс прямых методов позволяет достичь большей объективности и надежности при анализе малоугловых данных, нежели стандартное моделирование методом проб и ошибок. Алгоритмы обработки и интерпретации данных реализованы в виде программ для ЭВМ, используются более чем в 50 отечественных и зарубежных малоугловых лабораториях и включены в международные банки программ по порошковой дифракции (РЕВ, Лейденский университет) и по квантовой химии (ОСРЕ, Индианский Университет).

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982г.), V и VI Международных симпозиумах по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей и нейтронов (Фитгест, 1983г. и Пущино, 1985г.), VI, VII, VIII и X конференциях по малоугловому рассеянию (Гамбург, 1384г., Прага, 1987г., Левел, 1990г., Кампинас, 1996г.), XIV Всесоюзном совещании по применению рентгеновских лучен к исследованию материалов (Кишинев,

1985г.), Научной сессии ОЯФ АН СССР (Москва, 1986г.), Международной школе по структуре биологических макромолекул (Пущино, 1986г.), X н XII Европейских кристаллографических конференциях (Вроцлав, 1986г. и Москва, 1989г.), I Всесоюзной школе "Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов" (Звенигород, 1986г.), XIV и XV Школах по радиационной физике металлов и сплавов (Бакуриани, 1987 и 1988г.), IX Совещании по использованию рассеяния нейтронов в физике конденсированного состояния (Свердловск, 1987г.), Всесоюзном симпозиуме "Структура биологических макромолекул" (Звенигород, 1987г.), Международной конференции по использованию синхрогронного излучения (Новосибирск, 1988г.), I Международном симпозиуме "Рентгеновское, нейтронное и светорассеяние в изучении коллоидальных систем" (Бомбан, 1990г.), XV конференции по физике конденсированного состояния (Кашамбу, 1992г.), IV и V Международных конференциях "Биофизика и синхротронное излучение" (Цукуба, 1992г. и Гренобль, 1995г.), Международном симпозиуме по дифракции фибриллярными системами (Дарсбери, 1994г.), III Международной конференции "Нейтроны в биологии" (Санта Фе, 1994г.), IX Международном симпозиуме "Полиморфия и конформационная подвижность биомолекул" (Хюнфельд, 1995г.), IV Международном симпозиуме "Экспериментальные методы в изучении рибосомы" (Рингберг, 1995г.), Международной школе по методам молекулярного замещения (Йорк, 1996г.), Международном симпозиуме "Структурная характеризация полимеров методами рентгеновского рассеяния" (Сан Карлос, 1996г.), Международном симпозиуме по нейтронному рассеянию (Гайтерсбург, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 монографии, 3 обзора, 52 статьи в отечественных и международных журналах и тезисы 43 докладов.

Автор выражает свою искреннюю признательность академику Б.К.Вайшптейцу и профессору Л.А.Фейгину за постоянную поддержку в

работе н основополагающую постановку задач, профессорам И.Н.Сердюку, Б.М.Шедрину, X.Штурману и К.Нирхаузу, д-рам М.Коху, Я.Педерсену, С.Кеиигу, Н.Буркхардту, к.ф.-м.н. М.М.Агамаляну и

A.И.Рыскину за предоставление образцов, экспериментальных и компьютерных возможностей и стимулирующие обсуждения результатов,

B.В.Волкову, М.Б.Козину, Э. В. Штыковой, А.В.Семешоку, В.Н.Бехтереву, А.Ю.Тропину, Р.Л.Каюшиной, Т.Д.Изотовой, Ю.А.Рольбину, А.Т.Дембо, Л.Ю.Могилевскому, Ю.М.Львову, Х.С.Багдасарову, В.В.Березкину, З.Зайерс, К.Барберато, П.Бриллюэн, Г.Ронто, К.Тот, ОЛ<юнхольцу, М.Хючу и П.Вашету, за помощь и сотрудничество на разных стадиях данной работы, а также споим коллегам из Института кристаллографии РАН и Европейской Молекулярно-биологической Лаборатории.

Глава 1. Обработка экспериментальных данных малоуглового рассеяния

Рассеяние дисперсными системами, как правило, изотропно, и интенсивность МУР I(s) зависит только от модуля вектора рассеяния в обратном пространстве s=4n sinO/X, где 29 угол рассеяния и X длина волны излучения. В эксперименте вместо идеальной кривой I(s) определяется набор дискретных точек J(s;), содержащий приборные искажения (статистический шум и свертка идеального профиля кривой с приборными функциями установки). Аппаратурное устранение приборных искажений осуществляется достаточно редко (например, на синхротронных установках с фокусирующей оптикой). Для большинства лабораторных рентгеновских, а также реакторных нейтронных установок приборные эффекты приводят к заметным систематическим погрешностям в экспериментальных кривых рассеяния. Обработка данных эксперимента и устранение приборных погрешностей, т.е. переход от набора J(sj) к функции I(s), является первоочередной задачей при анализе данных МУР.

Основное уравнение, связывающее идеальную кривую МУР с экспериментальными данными, может быть записано в виде

J(s{)= \\\ww(u)Wi(t)Wx(À)I

- и)2 + t2

Я

dudtdX + f,- (D

где \\\у(и) н У/|(0 - нормированные весовые функции искажений па геометрию установки (ширину и высоту коллимирующих щелей, соответственно), - аналогичная функция для полихроматпчностп

излучения, а Е| обозначает статистический шум. Решение интегрального уравнения (1) по отношению к функции 1(з) представляет собой некорректно поставленную задачу, т.е. малые изменения в исходных

V

данных (например, статистический шум) приводят к значительным погрешностям в Ю). В настоящей главе описываются развитые нами алгоритмы получения устойчивого решения задачи обработки экспериментальных данных.

1.1. Последовательное устранение приборных искажений

Решение уравнения (1) может быть сведено к последовательному решению трех интегральных уравнений (поправки на ширину и высоту щелей и на полихроматичность излучения). Такой подход дает возможность использования специфических свойств ядра соответствующего уравнения и получения его аналитического решения. Например, как было показано ранее уравнение искажений на высоту щелей может быть

преобразовано к уравнению типа свертки для трансформант Лапласа. Нами был предложен метод, позволяющий свести уравнение искажений на полихроматичность излучения к уравнению свертки для трансформант Меллина [16]. Устойчивое решение этого уравнения, а также уравнения поправки на высоту (которое сводится к свертке трансформант Фурье) было реализовано в виде компьютерных программ [16, 20, 26] с использованием метода регуляризации по Тихонову [2Л]. Для повышения устойчивости решения к статистическим шумам, была разработана процедура полиномиальнго сглаживания экспериментальных данных с автоматическим выбором оптимального режима сглаживания [1]. На основе указанных программ, а также с использованием алгоритма поправки на высоту щелей, предложенного в [ЗЛ], был создан и внедрен более чем и 20 лабораториях СССР комплекс программ СИРЕНА, позволявший проводить полную обработку экспериментальных данных малоуглового рассеяния. При этом, благодаря надежному алгоритму учета

''Ссылки на публикации автора даны в квадратных скобках, на цитируемую литературу - в квадратных скобках с буквой Л.

иолихроматичности, комплекс СИРЕНА эффективно применялся также н для обработки данных нейтронного эксперимента [15].

Развитые подходы были использованы и для интерпретации данных рассеяния, в частности, для решения задачи полидисперсности

где формфактор ¡оСбЮ - интенсивность рассеяния частицей размера И, а - искомая функция распределения частиц по размерам. Уравнение (2) было также решено с применением преобразования Меллина, и соответствующий метод с успехом применялся в исследованиях ряда неорганических и полимерных объектов [15, 18, 20].

1.2. Общий метод обработки с использованием регуляризации

Последовательное устранение приборных искажений, хотя и позволяет в ряде случаев выразить аналитическое решение задачи, имеет свои недостатки. Основная трудность связана с тем, что набор .Кб^) всегда измерен лишь п конечном интервале [зт'1п, 5тах]. Чтобы избежать эффектов обрыва, приходится экстраполировать экспериментальные данные к 5->0 и процедура зачастую не совсем корректная [4].

Автоматическая экстраполяция достигается с применением так называемых косвенных методов (эта идея в малоугловом рассеянии предложена и [4Л]). Основная идея состоит в том, что интенсивность МУР, как правило, сиязана неким интегральным преобразованием с характеристической функцией в прямом пространстве. В частности, для монодпспсрсиых систем,

(2)

К>тп

где р(г) - функция распределения по расстояниям (сферически усредненная функция Паттерсопа) частицы, а Отах - ее максимальный размер. Представляя р(г) на [0, Отах] в виде линейной комбинации некоторых (ортогональных) функций ф|<(г)

к

р(г)= Хск1?к(г), (4)

А=1

подставляя (4) в (3) и далее в (1), получаем

К

J(s) = Ес^е^л (5)

к=1

где ^(э) суть функции <Рк(г), трансформированные в обратное пространство и искаженные приборными эффектами. Коэффициенты разложения С]< определяются из экспериментальных данных минимизацией регуляризированного функционала

2

+ а\[р'(г)]2с1г, (6)

где N - число экспериментальных точек, регуляризирующпн множитель а>0, а второе слагаемое (тихоновский стабилизатор, [2Л]) вводит требование гладкости функции р(г). Уравнение (6) может быть сведено к системе линейных уравнений относительно С),, и решение этой системы позволяет восстановить функцию р(г) [а тем самым и Кэ)] без предварительной экстраполяции экспериментальных данных.

N

фа = £

;=1

Кц)-

ш

Основной проблемой при использовании такого подхода является выбор регуляризирующего множителя: при малых а решение получается неустойчивым, слишком большие а ведут к систематическим отклонениям от экспериментальных данных. Методы оценки а, известные из теории регуляризации (например, метод невязки и метод точки перегиба) фукпционируют, как правило, только для достаточно хорошо обусловленных задач (малые экспериментальные погрешности, широкий интервал измерений). В результате, все "косвенные" алгоритмы фактически предлагают пользователю выбирать регулязирующий множитель методом проб и ошибок, путем визуального сравнения решений, полученных для разных значений а.

Нами был разработан и реализован в виде компьютерной программы ГНОМ косвенный алгоритм, позволяющий не только автоматически находить регуляркзирующий множитель, но 1! оценивать качество полученного решения [27, 29, 39, 40, 43, 46]. Функция р(г) задана в виде гистограммы (ее значениями в узлах сетки гь 05 ^ <Отах), что обеспечивает общность параметризации и дает возможность использовать экономичные методы решения системы (6) [5Л]. Для данного а решение характеризуется рядом параметров (невязка и наличие систематических отклонений в обратном пространстве, гладкость, компактность и положительность функции р(г), стабильность решения к малым изменениям а). Взвешенная сумма этих параметров дает оценку качества решения, которая и максимизируется при поиске а. Фактически, метод берет на себя "визуальный" поиск оптимального решения, руководствуясь математически выраженными критериями восприятия.

Программа ГНОМ реализована для обработки данных МУР как монодисперснымп (глобулярные, вытянутые и сплюснутые частицы), так и различными полидпсперсными системами (решение уравнения (2) при

различных формфакторах). "Визуальный" подход оказался весьма эффективным на практике: программа либо автоматически находит оптимальное решение, либо информирует пользователя о том, что выбранные предположения (тип частиц и/илн область определения функции р(г) или Оу(Ю неверны). ГНОМ был успешно использован для анализа экспериментальных данных рассеяния макромолекулами в растворе [32, 33, 35, 42, 44, 48-53], ядерными фильтрами [36, 41], монокристаллами [31]. В последнем случае, применение программы ГНОМ позволило провести совместный анализ рентгеновских и нейтронных кривых рассеяния монокристаллами лейкосапфира и получить информацию не только о размерах, но и о физическом составе кластеров дефектов в этих кристаллах. В настоящее время программа используется более чем в 30 лабораториях в России и за рубежом н включена в Международный обменный банк программ РЕВ по порошковой дифракции (Лейденский университет, Голландия).

1.3. Разложения по ортогональным функциям

Косвенные методы, ^использующие параметризацию характеристической функции в прямом пространстве, обеспечивают, вообще говоря, более надежную обработку малоугловых данных, чем "прямые" алгоритмы последовательной обработки. Применение косвенных методов, однако, требует предварительной информации об области определения характеристической функции (задание величины Е>ш;,х для монодисперспых систем, величии К|Ып и Г?т;1Х для полндпсперсиых). Помимо этого, выбор числа членов К ряда (4) в известной степени произволен и определяется в основном алгоритмическими соображениями. Нами разработан [45] так называемый "прямой косвенный" метод обработки данных, который совмещает в себе преимущества "прямых" и косвенных алгоритмов. Идея метода состоит и том, что характеристическая функция представляется в виде ряда (4) по функциям {ф^},

ортогональным на бесконечном интервале О S г < со (а именно, по полиномам Эрмита). Процедура начинается с К=1, затем число полиномов увеличивается до тех пор, пока это увеличение дает статистически значимое улучшение МНК-аппроксимации экспериментальных данных в обратном пространстве набором функций {ук)- Для каждого К используются приведенные координаты в прямом и обратном пространстве x=r/p.K, y=snK.i где цк =[3(K-2)]'/'2/sraax, что обеспечивает хорошую обусловленность системы нормальных уравнений для функционала (6) с а=0 (т.е. регуляризация решения не требуется). Предложенный метод позволяет без каких-либо предположений о размерах частиц определять диапазон представления характеристической функции и число

«

независимых параметров, необходимых для адекватного описания кривой рассеяния. Прямой косвенный метод реализован как для монодисперсных, так и для полидисперсных систем, и был успешно применен для анализа МУР растворами биополимеров [48-53]. Получаемые с его помощью характеристические функции могут быть уточнены с применением программы ГНОМ, которая в явном виде использует конечность диапазона их представления.

Выбор системы функций (ij/jj имеет особое значение для обработки данных МУР монодисперсными системами, поскольку интенсивность рассеяния I(s) в этом случае является аналитической функцией и может быть экстраполирована па всю числовую прямую, если известен

' непрерывный участок этой кривой (т.н. "сверхразрешение"-, [6Л]). На практке экстраполяция кривой рассеяния в область больших углов (s > sma.\) затруднена дискретностью измерений и наличием статистического шума в экспериментальных данных. Нами предложен метод обработки данных МУР монодисперсными системами, основанный на применении вытянутых сфероидальных волновых функций (ЛВСФ), которые обладают уникальным свойством двойной ортогональности: для заданного произведения c=smaxDmax, набор ЛВСФ {y^ic.s)} ортогонален на [0, smax]

и на »сей числовой прямой одновременно [7Л]. Теоретически это означает, что при разложении интенсивности рассеяния в ряд типа (5) по ЛВСФ, коэффициенты, вычисленные па интервале измерения, обеспечивают ее аналитическое продолжение до сколь угодно больших г. Практически, наличие экспериментальных погрешностей позволяет надежно восстанавливать лишь^ограниченное число коэффициентов Мс=5тахОтах/тс, отвечающее числу независимых параметров задачи в соответствии с теоремой Котелышкова [8Л), и участок аналитического продолжения также ограничен. Нами разработан эффективный алгоритм вычисления ЛВСФ и реализована программа обработки данных рассеяния, дающая возможность аналитической экстраполяции кривых МУР за пределы экспериментально измеренного участка вплоть до 5=(1.2-^-1 -5)этах [57].

Глава 2. Прямые методы определения структуры частиц в моноднсперсных системах

Одной из важнейших областей применения МУР является изучение монодисперсных систем, в частности, строения нативных биологических макромолекул в разбавленных растворах. Для таких систем экспериментальная интенсивность МУР пропорциональна усредненной по всем орнентациям интенсивности рассеяния одной частицей и, следовательно несет в себе информацию о ее падатомаой структуре. Хаотическая ориентация частиц в растворе, однако, приводит к существенной потере структурной информации по сравнению с изучением макромолекулярпых кристаллов. В результате, только некоторые интегральные параметры часгиц (инварианты) могут быть непосредственно рассчитаны из кривых МУР, а более детальная их интерпретация осуществляется методом проб и ошибок с применением моделирования.

Очевидно, что в общем случае однозначное восстановление структуры трехмерного объекта (частицы) но одномерной кривой МУР невозможно.

Неоднозначность интерпретации может быть существенно уменьшена наложением ограничений на искомую структуру (например, условия симметричности частицы или се однородности), а также выбором математического аппарата, позволяющего адекватно описывать строение объекта при низком разрешении как можно меньшим числом параметров. Это дает возможность разработки прямых методов анализа, которые и описываются в данной главе.

Интенсивность малоуглового рассеяния частицей Кб) = <1(з)>п = <|7[р(т)]>П| где У - преобразование Фурье, р(г) - эффективная

рассеивающая плотность частицы, <>п обозначает усреднение по телесному углу П в обратном пространстве, а вектор рассеяния 5=(5, П). Представляя р(г) в виде ряда

где У|т(со) - сферические гармоники, а а - телесный угол в прямом пространстве, можно показать [9Л], что интенсивность МУР выражается как

2.1. Разделение бесселевых функций

со /

I Р1т(г)УЬп(со)

/= 0 т=~1

(7)

» I

\2

¡(з) = 1п2% £ \л,т(Л

(8)

1=0 т=-1

где парциальные амплитуды А|1П(з) суть преобразования Ханкеля от* рад и ал ы I ы х фуикайй

со

О

где j|(sr) - сферические функции Гэесссля. Таким образом, мультнпольиые компоненты рассеивающей плотности вносят аддитивный вклад в интенсивность рассеяния и их разделение позволяет восстанавливать структуру частицы.

Нами разработан [5-8] метод, получивший название "разделение бссселевых функций", который использует условие симметричности структуры частицы для определения мультппольиых компонент. Метод основан на применении итерационного алгоритма

A^/(s) = A(l^)(3^I(3)flk(s) (10)

Р(ЫХ><Г>= Plm <'>*<"*> (11)

где A|n/k4s) и I<"(s) рассчитываются из радиальных функций Рь/^Чг) к-го приближения по формулам (8) и (9), pim(k''(r) связана с Aira(k)'(s)

ft ,r<R

преобразованием, обратным (9), = r > ^ где ^ " расстояние

от центра тяжести частицы до наиболее удаленной от него точки, а Р1т"Нг)=П(г-Ю. 'Поскольку, согласно (9), вклад от гармоник с различными m при одинаковых ! неразличим, метод применим для восстановления частиц, симметрия которых позволяет приписывать каждую 1-ю радиальную функцию данному т. Наиболее показательным является случай аксиально-симметричной частицы, для которой отличны от пуля только функции Р|0(г).

Развитый метод был применен для восстановления структуры бактериального вируса Т7 в аксиально-симметричном приближении (8, 22, 30]. Получена карта электронной плотности с разрешением 4 нм,

показывающая не только общую форму частицы, по н наличие белкового ядра в центре фага, а также секторнальпый характер упаковки внутрифаговой ДНК. Метод использован также для структурной интерпретации конформационных переходов в иммуноглобулине М [14,

17].

Важным частным случаем применения описанного метода является восстановление знаков амплитуд сферически-симметричных частиц, для которых 1(5)=2ге2[А00(5)]2. Нами было доказано [11,12], что описанная итерационная процедура в общем случае обеспечивает решение знаковой проблемы для одномерного Фурье-преобразования. Метод обобщен и использован также для поиска фаз структурных рефлексов при изучении несимметричных леигмюровских пленок [34].

2.2. Восстановление формы частиц

Одним из наиболее эффективных ограничений при поиске 'структуры частиц при низком разрешении является однородное приближение. Стандартное моделирование в однородном приближении использует представление частицы в виде совокупности шаров малого диаметра. Количество параметров, необходимых для описания модели, исчисляется сотнями и моделирование осуществляется методом проб и ошибок. Нами развиты подходы, которые основаны на экономичном описании формы частицы с помощью сферических гармоник и осуществляют ее автоматический поиск.

Форма частицы может быть с достаточной общностью представлена в виде двумерной функции оболочки г=Р(со), где каждому угловому направлению ставится в соответствие расстояние от центра до границы частицы (это описание впервые предложено и [ЮЛ]). Распределение плотности внутри частицы

[ 1, О < 7- < F(a>) - Д

p(r) = \[F(a)~ г]/Д, F((ú)-A <r < F(<a) (12)

[O, r> Fía)

учитывает возможную размытость границ в реальных объектах (Д -ширина переходного слоя частица-матрица). Функция оболочки параметризуется с помощью сферических гармоник

L I

F(a)*FL(a)= 2 Z fiAM (13)

í=0 m=-l

где f)m - комплексные числа, а пространственное разрешение характеризуется параметром обрыва ряда L: 5r=nR0/(L+l), где R0 -радиус эквивалентной сферы. Структура частицы представляется таким образом с помощью (L+l)2-5 независимых параметров (уменьшение на шесть параметров обусловлено произвольностью положения частицы). .

Нами разработаны [38, 39, 47] методы быстрого расчета парциальных амплитуд A|m(s) и далее интенсивности МУР I(s) от частиц, структура которых описывается представлением (12-13). Это дает возможность прямого определения формы частицы путем минимизации невязки между экспериментальной и модельной кривой рассеяния. В работе [55] исследована проблема единственности определения формы и показано па модельных примерах, что однозначное и устойчивое к случайным ошибкам восстановление достигается, если число независимых параметров, описывающих модель не превышает 1.5NC. На практике это означает, что структуры до L=4 (20 параметров) могут быть определены из экспериментальных данных, что обеспечивает удовлетворительное описание основных деталей формы частицы. Разрешение может быть улучшено при наличии априорной информации о структуре частицы. Так,

ограничения на ее симметрию приводят к правилам отбора для коэффициентов ^„1 в разложении (13), которые могут быть отличны от пуля. Более того, для комплексных частиц, которые состоят из идентичных субъедиинц, связанных операциями симметрии (например, для димеров, обладающих осью 2-го порядка) оказывается возможным одновременное определение формы мономера и расстояния между центрами мономеров в комплексе [39, 53].

Разработанные методы были реализованы в виде компьютерной программы прямого определения формы частиц. Стартуя с некоего начального приближения (как правило, сфера с объемом, примерно рапным объему частицы), программа ищет набор коэффициентов Г|т, минимизирующих отклонение расчетной кривой от экспериментальной с использованием метода нелинейной оптимизации, реализованного в программном пакете N1.2801. [ИЛ]. Дополнительные условия включают ограничения на смещение центра тяжести частицы, а также

положительность и гладкость функции формы Р(со). Программа была опробована [58, 59] на восстановлении но экспериментальным данным формы ряда белков с известной структурой в кристалле (лизоцим, гексогеназа, рибопуклеотид редуктаза, обратная транскрпптаза, тиоредокспп редуктаза, миозин Б1, энопирувнл трансфераза). Во всех случаях метод обеспечивал удовлетворительное восстановление четвертичной структуры белковых частиц с разрешением 1-2 им.

у 2 ПГП

2 *

Рисунок 2.

Сравнение восстановленной формы гексогеназы (прозрачная оболочка, разрешение Ь=4) с атомной структурой из белкового банка данных (точки). Нижняя форма повернута вокруг оси X на 90°.

Рис. 1 и 2 иллюстрируют тестовое определение формы гексогеназы и дают представление о разрешении, которое достигается прямым восстановлением формы по данным МУР. Программа успешно использована для определения формы белков с неизвестной пространственной структурой: семейства ппруват декарбоксплаз [42, 44, 50j, FKBP25mem из Legionella pneumonia [53], амилазы, бактериального а54-трапскрпптора, каталазы-пероксидазы, н других.

2.3. Вариация контраста и структура рибосомы Однородное приближение допустимо при исследовании одиокомпонептпых частиц (например, белков в водных растворах), однако, недостаточно обосновано при изучении объектов, состоящих из двух или нескольких компонент с существенно различной рассеивающей плотностью. Классическим объектом такого рода является рибосома - сложный биологический комплекс, ответственный за синтез белка в клетке. Прокариотические (70S) рибосомы имеют молекулярную массу 2.3х106 дальтон и состоят из малой (30S) и большой (50S) субчастиц, каждая из которых представляет собой'комплекс белков (21 белок в 30S и 34 белка в 50S) с рибосомной РНК (16S рРНК в 30S и 5S+23S рРНК в 50S). Механизм функционирования рибосомы уже более 30 лет является предметом многочисленных исследований с применением различных структурных методов. В последнее время, криогенная электронная микроскопия позволила достичь разрешения 2.5 нм при изучении общей формы рибосомы [12Л, 13Л], однако многие вопросы, в частности, вопрос о взаимном расположении белков и РНК в субчастицах, остаются открытыми.

Наиболее эффективным методом изучения многокомпонентных систем в растворе является метод вариации контраста (разности между усредненной рассеивающей плотностью частицы/компонента и плотностью растворителя [14Л]). Рассеивающие плотности рРНК и рибосомных белков существенно отличаются друг от друга, и вариация контраста с помощью изменения рассеивающей плотности растворителя пли селективной маркировки рибосомных компонент дает информацию как о форме, так и о внутренней структуре рибосомы. Интерпретация этой информации, однако, в подавляющем большинстве малоугловых исследовании сводилась к анализу интегральных параметров, и только в единичных случаях [15Л, 16Л] была доведена до уровня трехмерных моделей. Нами предложен и применен для исследования рибосом прямой метод интерпретации данных вариации контраста многокомпонентными

частицами [47]. Основная идея метода состоит в том, что структура каждого компонента представляется функцией формы (13). Это позволяет быстро расссчитыиать парциальные амплитуды произвольно расположепых компонентов и далее интенсивности МУР всей частицей при данных контрастах компонентов. Параметры, характеризующие структуру частицы, определяются минимизацией отклонения расчетных кривых от экспериментальных по всему набору измеренных данных, аналогично алгоритму восстановления формы, описанному выше. В [47] развиты алгоритмы быстрого вращения и сдвига компонентов, а также учета рассеяния от неоднородностей внутри каждого компонента.

Предложенный прямой метод применен для анализа данных рассеяния 50S субчастицей рибосомы E.Coli [48, 49, 51, 56]. Структура 50S субчастицы была представлена с помощью двух функций оболочки, одна из которых описывала внешнюю форму субчастицы, а другая - форму области, занятой рРНК. Параметры обеих функций формы были определены до разрешения L=5 (5г=4 им) путем одновременного приближения шести экспериментальных кривых (рентгеновское рассеяние в воде и нейтронное рассеяние в 0%, 14%, 40%, 67% и 98% D20). Полученная модель позволила разрешить противоречие между ранее предложенными электропномнкроскопическими моделями формы 50S субчастицы [17Л, 18Л], показав, что модель [18Л] фактически описывает форму рРНК, а не всей субчастпцы.

Разработанный подход был далее расширен и использован для исследования структуры всей 70S рибосомы, которая была представлена четырехкомпонентпой моделью, описывающей распределение рпбосомиых белков п рРНК каждой из субчастиц (61). Интенсивность МУР четырех фазной системой i

ii=1 п>к

где Лр„ и I„(s) - контраст и интенсивность рассеяния п-й фазой, a Ink(s) -перекрестные члены. Формула (14) содержит таким образом десять базисных функций, т.е. вариация контраста на такой системе способна дать в десять раз больше информации, чем содержится в одной кривой рассеяния.

Для того, чтобы различить белки и рРНК, принадлежащие разным субчастицам, было проведено несколько серий нейтронных экспериментов на гибридных рибосомах, синтезированных из специфически дейтерированных субчастиц. Всего было использовано семь типов 70S рибосом E.Coli: 1) и 2) рибосома полностью протонирована и полностью дейтерирована; 3) и 4) 30S протонирована, 50S дейтерирована и наоборот; 5) и 6) белки в 30S (50S) дейтерированы, остальные компоненты протонировапы, 7) РНК протонирована, белки дейтерированы. МУР от каждого образца было измерено в 4-5 растворах с разной концентрацией D2O (типичные кривые рассеяния представлены на Рис. 3). Структурная идентичность гибридных частиц контролировалась параллельными рентгеновскими измерениями, поскольку дейтерирование не должно менять картину рентгеновского рассеяния. В общей сложности 42 нейтронных и рентгеновских кривых рассеяния от гибридных рибосом и свободных субчастиц были интерпретированы в рамках четырехкомлонентной модели, описывающей формы 30S и 50S субчастиц и областей в них, занятых рРНК.

Анализ расчетного рассеяния от элсктроппомикроскопичсских моделей показал, что развитая система тоннелей в рибосоме [13Л] не согласуется с

12

11

10

9

8

7

6 0.0

Рисунок 3. Экспериментальные данные нейтронного МУР полностью протонированиой (НН) 70Б рибосомой в растворах с различным процентным содержанием тяжелой воды (указано в правом верхнем углу рисунка) и рассеяние восстановленной четырехфазпои моделью (сплошные линии). Показаны данные для двух расстояний образец-детектор, теоретические кривые включают соответствующие приборные искажения. Каждая кривая сдвинута вниз па один порядок по осп ординат относительно предыдущей.

экспериментальными данными, и начальное приближение для формы субчастпа (т.е. для двух компонентов из четырех) было взято из модели |12Л]. Стартовыми формами для оболочек рРНК служили сферы соответствующего объема. Восстановленная путем одновременного приближения всех 42 экспериментальных кривых четырехфазпая модель 703 рибосомы представлена на Рис. 4, а пример согласия модельных и экспериментальных данных - на Рис. 3. Полученная прямым методом модель впервые описывает как форму, так и внутреннюю структуру натнинон рибосомы при разрешении 3.5 им. Она может служить основой для определения положения структурных фрагментов рибосомы (отдельные белки, транспортная РНК) методом [47], а также для поиска фаз низкоугловых рефлексов в кристаллографических исследованиях рибосом.

Рисунок 4. Четырехфазпая модель 70S рибосомы. Оболочки субчастнц изображены каркасными моделями, оболочки PIIK - сплошными телами. Левый рисунок - 30S ближе к наблюдателю, правый повернут на 45° вокруг оси Y.

Z

Глава 3. Использование кристаллографических моделей в интерпретации малоугловых данных

Привлечение дополнительной информации об объекте, полученной другими структурными методами (кристаллография, электронная микроскопия) всегда широко использовалось при анализе данных МУР, как правило, в виде ограничений на возможную модель, уменьшающих неоднозначность интерпретации малоугловых данных. Использование атомных моделей при исследованиях биологических макромолекул позволяет прежде всего анализировать возможные структурные отличия кристалл-раствор. Методы, описанные в данной главе, дают возможность как надежно рассчитывать кривые МУР атомными моделями, так и интерпретировать кривые рассеяния комплексами биополимеров, структура субъединиц в которых известна, на уровне движения этих структурных доменов. Таким образом, использование кристаллографической информации позволяет оперировать в МУР моделями высокого разрешения.

3.1. Расчет малоуглового рассеяния атомными моделями

Расчет кривой МУР монодисперсным раствором макромолекул с известной атомной структурой не сводится к простому сферическому усреднению дифракционной картины, а требует строгого учета влияния рассеяния растворителем. Предложенные различными авторамп алгоритмы отличались в основном способом учета исключенного объема частицы (т.е. объема, недоступного растворителю) и наиболее падежные из них (например, [19Л]), позволяли рассчитывать МУР макромолекулой в весьма широком диапазоне векторон рассеяния (вплоть до области так называемых средних углов). Эти методы, однако, не принимали во внимание рассеяния ее гндратной оболочкой, что могло приводить (и в

ряде случаен приводило) к систематическим погрешностям уже при самых малых углах рассеяния (так, экспериментальные радиусы инерции частиц в растворе оказывались систематически выше рассчитанных из атомных координат). Предложеный нами метод [54] представляет гндратную оболочку в виде окружающего частицу слоя толщиной 0.3 им с плотностью рь, которая может отличаться от плотности растворителя р0. Интенсивность МУР записывается в виде

где АаЫ - амплитуда рассеяния частицей в вакууме, Ас(з) и А^Сб) -амплитуды рассеяния исключенным объемом и приграничным слоем, обе

приграничного слоя описывается с помощью функции оболочки частицы (13), а амплитуды рассеяния рассчитываются с использованием мультнпольного разложения (7-9), что существенно упрощает сферическое усреднение. Расчетная интенсивность (15) зависит от двух параметров: исключенного объема частицы V и контраста в приграничном слое 5р. Программа СПУБОЬ, реализующая предложеный алгоритм, читает атомную структуру в формате белкового банка данных [20Л], вычисляет необходимые парциальные амплитуды рентгеновского рассеяния, и далее либо предсказывает кривую МУР со значениями V ц 5р, задаваемыми пользователем, либо находит оптимальные значения этих параметров, обеспечивающие наилучшее приближение к экспериментальным данным.

П

(15)

отвечают единичной плотности рассеяния, а 5р=рь-ро- Форма

э, пт

Рисунок 5. Теоретические и экспериментальные кривые рассеяния Т и 1\ формами ЛТСазы. (1) - экспериментальные данные, (2) - кривые рассеяния атомными моделями с учетом гидратпой оболочки, (3) - рассеяние атомной моделью Т-формы без учета оболочки, (4) - рассеяние моделью Г1-формы в растворе.

Программа СКУЗОЬ была применена для анализа данных рассеяния более чем 20 различными белками с известной атомной структурой (в частности, трипсин, лнзоцпм, гексогепаза, аннексии, обратная транскршггаза, тпоредоксин редуктаза, миозин Б1, энопнрувил трансфераза, аспартат тралскарбамплаза). Во всех случаях, учет гидратпой оболочки

существенно улучшал согласие между теоретическими и экспериментальными кривыми (см. пример использования метода для Т-формы аспартат транскарбамилазы на Рис. 5). Величина 6р, как правило, составляла 30-60 электронов/им3, что отвечает плотности структурированного растворителя в гидратной оболочке 1.1-1.2 г/см3 и гидратации 0.2-0.4 г растворителя/г белка. Полученные результаты показывают необходимость учета гидратной оболочки для адекватного описания рассеяния макромолекулами в растворе. Программа СИУБОЬ используется для расчета МУР растворами макромолекул более чем в 15 лабораториях в России и за рубежом и включена в состав международного банка программ по квантовой химии <ЭСРЕ (Индианский университет, США).

3.2. Структура макромолекулярных комплексов

'»У

Малоугловые исследования играют особо важную роль при изучении комплексов биологических макромолекул. Часто встречаются случаи, когда комплекс не кристаллизуется, но удается закристаллизовать и определить атомную структуру отдельных его составляющих (субъединиц). Тогда информацию о взаимном расположении субъедшшц в комплексе можно получить из малоугловых экспериментов.

Нами разработан [39, 47] общий метод определения взаимного расположения субъедишщ в комплексных частицах по данным МУР. Основная идея метода иллюстрируется ниже для двухкомпонеитнон частицы. Пусть частица состоит из субъедиипц А и В с известной структурой, т.е. их амплитуды рассеяния А(б) и В(х), а значит и парциальные амплитуды А]т(5) и В1т(э) известны. Произвольное расположение субъедшшц описывается поворотом субъедниицы В па эилеровекпе углы а, (3, у, с последующим ее сдвигом на вектор и = (и,0,ф). В работе [39] выведена формула, аналитически выражающая

Рисунок 6. Четвертичная структура АТСазы: Т-форма (Т), Р-форма в кристалле (Г1с), И-форма в растворе (Из). Показан вид вдоль одной из осей 2-го порядка, более темным изображены каталитические домены, более светлым - регуляторные домены.

парциальные амплитуды повернутой и сдвинутой частицы С|ш(5) через ее исходные амплитуды В^Сб) и позиционные параметры: С|т(5)= С|т(В|т,а,р,у,иД(|>). Интенсивность МУР комплексом записывается как

ОЭ I

1(*,а,/3,г,и) = 1а(5) + Гь(з) + 4л2ч£ Е ЩА1т(')С*1т(5)\ (16)~

/=0 т=-1

где интенсивности Г^Сэ) и It.Cs) рассчитываются по (8). Параметры, описывающие положение второй субчастицы, определяются минимизацией невязки между экспериментальной и расчетной кривой рассеяния комплексом. Эта идея легко обобщается на случаи произвольного числа субчастпц, при этом дополнительные ограничения, например, на

симметрию комплекса, уменьшают число варьируемых позиционных параметров. Метод успешно использован при исследовании ппруват декарбоксилазы [44], гексогеназы, каталазы-пероксидазы и других мультидомеицых белков.

Разработанный подход в сочетании с программой CRYSOL позволяет также анализировать возможные отличия между доменной структурой белков в кристалле и растворе. Примером является малоугловос исследование четвертичной структуры аспартат транскарбамплазы (А'ГСазы) - мультидоменного фермента, служащего классической иллюстрацией аллостерических свойств белков [60]. АТСаза E.Coli представляет собой додекамер с квази-Dj симметрией, состоящий из двух каталитических тримеров и трех регуляторных димеров, и се атомные модели в обоих (Т и R) функциональных состояниях получены ранее рентгеноструктурпым анализом кристаллов [21Л]. T->R переход сопровождался увеличением расстояния между каталитическими трнмерами по осп третьего порядка (ось У на Рис. 6), их вращением вокруг этой оси, а также вращением регуляторных димеров вокруг соответствующих осей второго порядка. Для более компактной Т-формы, рассеяние кристаллографической моделью с учетом гидратпои оболочки дает хорошее согласие с экспериментальными данными МУР в растворе. В то же время, расчетное рассеяние от кристаллической R-формы существенно отличается от соответствующей малоугловой кривой, что свидетельствует о значительном различии между четвертичной структурой R-формы АТСазы в кристалле и в растворе (Рис.5).

Модель R-формы, согласующаяся с малоугловыми данными, была получена продолженном движения доменов по траектории T->R перехода от кристаллической R-формы в направлении удаления от Т-формы. R-форма АТСазы в растворе имеет существенно более открытую копформацшо и удалена от компактной Т-формы на 50% больше, чем R-

форма в кристаллографической модели (Рис. 6). Наиболее вероятным объяснениям этого эффекта является то, что Т—>Г? переход в кристалле ограничен силами межмолекуляриого кристаллического взаимодействия.

Исследование АТСазы показывает важность совместного использования кристаллографической и малоугловой информации при изучении биологических макромолекул. Сравнение расчетного рассеяния кристаллографическими моделями с экспериментальными данными МУР для ряда белков [58, 60] показало, что отличия, свидетельствующие о возможных перестройках четвертичной структуры, наблюдаются, как правило, для мультидоменных белков (в частности, тетрамер пируват декарбоксилазы дрожжей, димер рибонуклеотид редуктазы Ш, димер гексогеназы). Это демонстрирует возможность влияния упаковки макромолекул в кристалле на их доменную структуру. Моделирование с помощью МУР, подобно описанному выше для АТСазы, • способно предсказывать доменное строение белковых комплексов в натнвном состоянии.

3.3. Система трехмерной графики для малоуглового рассеяния

Рассмотренные выше методы интерпретации данных МУР позволяют получать трехмерные модели частиц по кривым рассеяния и требуют развития адекватных средств графического отображения этих моделей. Программы, разработанные для визуализации кристаллографических моделей (например, широко применяемая программа "О" [22Л]) плохо подходят для изображения моделей низкого разрешения, которые удобно представлять сплошными телами (затененными поверхностями). Более того, немаловажным фактором в МУР является возможность интерактивного уточнения моделей, т.е. графическая программа должна уметь обмениваться информацией с программами расчета кривых рассеяния. Поэтому параллельно с развитием методов интерпретации

данных нами пелась работа по созданию системы трехмерной графики для МУР.

Прототип системы, программа РН, написанная па Фортране для IBM-PC, была способна манипулировать в пространстве несколькими (до 10) телами, представленными согласно (13), изображать оболочки тел как в виде каркаса, так и с помощью поверхностей, затененных по методу Гуро, а также отображать атомные структуры в виде Са-цепей. Принципы этой программы были перенесены в графическую систему ASSA, реализованную па SUN графической рабочей станции [59]. ASSA позволяет отображать и манипулировать одновременно до 50 объектов, представленных как функциями оболочки, так и совокупностью атомов (программа читает данные либо в виде совокупности коэффициентов fjm, либо в формате белкового банка данных [20Л]). Возможности программы включают представление тел с помощью каркасных оболочек или затененных поверхностей с различной степенью прозрачности, изображение атомных структур в виде совокупности символов или как цепи Сс, атомов. Представление об этих возможностях дается иллюстрациями к дайной работе (Рис. 2, 4 и 6), которые подготовлены с помощью программы ASSA. Текущая конфигурация объектов может быть записана на дисковый файл и далее при необходимости загружена из этого файла, а графический образ может быть сохранен в формате PostScript. Управление программой осуществляется с помощью системы меню, а также нажатием "горячих" клавиш. ASSA способна вызывать программы анализа данных, в частности, программу расчета интенсивности рассеяния выбранной моделью, а также программу прямого определения формы. В последнем случае осуществляется своего рода определение формы в реальном времени: в процессе уточнения формы последовательные приближения отображаются на экране в виде трехмерных тел, н одновременно показывается график согласия между экспериментальной н расчетной кривой. Программа ASSA написана на языке С, причем

трехмерная графика реализована в индустриальном стандарте РНЮЗ, а двумерная графика и система меню используют стандартную библиотеку ХНЬ. Это позволяет переносить данную программу па любую рабочую станцию, использующую стандарт Х-\Утс1о\Уз.

Разработанная графическая система ориентирована на интерпретацию данных МУР, но может также использоваться для отображения кристаллографических и электронномикроскопических моделей. Способность вести диалог с программами обработки и интерпретации позволяет рассматривать программу АББА как ключевую часть макета автоматизированной системы анализа данных МУР.

Основные результаты и выводы

1. На основе использования современных теоретических и вычислительных методов (регуляризация, сингулярные и ортогональные разложения, сферические гармоники, нелинейная минимизация) создана система прямых методов анализа данных МУР конденсированными средами.

2. Развитые алгоритмы обработки данных позволяют надежно устранять приборные искажения в малоугловом эксперименте, рассчитывать характеристические функции объектов и применимы к дисперсным системам различной физической природы.

3. Разработанные методы интерпретации рассеяния монодисперсными системами открывают возможности ab initio определения формы и внутренней структуры частиц при разрешении 1-5 им, а также анализа доменной структуры, динамики и олигомерного состава макромолекул в растворе.

4. Применение прямых методов позволило определить надатомную структуру ряда объектов, в частности, бактериофага Т7, иммуноглобулина М, монокристаллов лейкосапфира, ппруват декарбоксилазы и аспартат грапскарбамплазы. Получена структурная модель нативной 70S рибосомы П.coli и ее РНК с разрешением 3.5 нм.

5. Разработанные методы реализованы и виде компьютерных программ н используются более чем в 50 лабораториях в России и за рубежом. В совокупности с модулем трехмерной графики н управления эти программы представляют собой макет автоматизированной системы анализа данных МУР.

Цитируемая литература

1Л. Deutch М., LubanM. //J. Appl. Cryst. - 1978. - V. 11. -P.87-101.

2Л. Тихонов A.H., Арсении В.Я. Методы решения некорректных задач. М.: Наука, 1985.

ЗЛ. Щедрин Б.М., Фейгин Л.А. // Кристаллография - 1966. - Т. 11 -С.159-163.

4Л. Glatter О. // J. Appl. Cryst. - 1977. - V.10. - Р.415-421.

5Л. Тихонов А.Н., Гончарский A.B., Степанов В.В., Ягола А.Г. Регуляризирующие алгоритмы и априорная информация. М.: Наука, 1983.

6Л. Василенко Г.И., Тараторкин A.M. Восстановление изображений. М.: Радио и связь, 1986.

7Л. Фламмер К. Таблицы волновых сфероидальных чисел. М.: ВЦ АН СССР, 1962.

8Л. Котельников В.А., Николаев A.M. Основы радиотехники. М.: Связьтехиздат, 1950.

9Л. Stuhmann H.B. // Acta Cryst. - 1970. - V.A26. - P.297-306.

ЮЛ. Stuhmann H.B. // Z. Phys. Chem. Frankfurt - 1970. - V.72. - P.177-198.

11Л. Dennis J., Gay D., Welsh R. //ACM Trans. Math. Soft. - 1981. -V.7.- P.348-368, 369-383.

12Л. Frank J., Zliu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R. Lata R.K., Agrawal R.K. // Nature (London) - 1995 - V.376. - P.441-444.

13Л. Stark H., Mueller F., Orlova E. V., Schatz M., Dubc P., Erdemir Т., Zemlin F., Brimacombe R., van Heel, M. // Structure - 1995 - V.3. -P.815-821.

14Л. Stuhmann H.B., Kirste R.G. // Z. Phys. Chem. Frankfurt - 1965. -V.46. - P.247-250.

15JI. Capcl M.S., Engelman D.M., Freeborn B.R., Kjeeldgaard M., Langer J.A., Ramakrishnan V., Schindler D.G., Schneider D.K., Schoenborn B.P., Sillers I.-Y., Yabuki S., Moore P.B. // Science - 1987 - V.238. -P.1403-1406.

16Л. Спирин А.С., Сердюк И.Н., Шпунгин И.Л., Васильев В.Д. // Молекулярная биология - 1979 - т. 13 .- С.409-425.

17Л. Vasiliev V.D., Selivanova О.М., Ryazantcev S.N. // J. Mol. Biol. -1983 - V. 171. - P.561-569.

18Л. Yonath A., Leonard ICR., Wittmann H.G. // Science - 1987 - V.236. - P.813-816.

19Л. Pavlov M.Yu., Fedorov B.A. // Biopolymers - 1983 - V.22. - P.1507-1522.

20Л. Bernstein F.C., Koetzle T.F., Williams G.J.B., Meyer E.F. Jr., Brice M.D., Rodgers J.R., Kennard O., Shimanouchi T. & Tasumi M. // J. Mol. Biol. - 1977. - V.112.- P.535-542.

21Л. ICantrowitz, E.R., Lipscomb, W.N. //Science - 1988.- V.241.- P.669-674.

22Л. Jones T.A., Zou J.-Y., Covan S.W., Kjeigaard M. // Acta Cryst. -1991. - V.A47. - P.110-119.

Публикации по теме диссертации

1. Рольбии Ю.А., Свергун Д.И., Щедрин Б.М. О сглаживании экспериментальных кривых малоуглового рассеяния / / Кристаллография - 1980. -Т. 25, №2. - С.231-239.

2. Рольбии Ю.А., "Свергун Д.И., Фейгин Л.А., Щедрин Б.М. Об устранении эффектов обрыва при интегральных преобразованиях, используемых в малоугловом рассеянии // Кристаллография - 1980. -Т. 25, №6. - С. 1125-1128.

3. Рольбин Ю.А., Свергун Д.И., Фейгин Л.А., Гашпар Ш., Ронто Д. Строение бактериофага Т7 по данным малоуглового рентгеновского рассеяния // ДАН СССР. - 1980. -Т. 255, №6. - С. 1497-1500.

4. Рольбин Ю.А., Свергун Д.И., Фейгин Л.А., Щедрин Б.М. К вопросу о

введении коллимционной поправки на высоту в малоугловом рассеянии // Кристаллография - 1981. тТ. 26, №3. - С.592-595.

5. Свергун Д.И., Фейгнн Л.А., Щедрин Б.М. Определение структуры биологических макромолекул методом малоуглового рассеяния // Кристаллография - 1981. -Т. 26, №6. - С. 1163-1172.

6. Свергун Д.И., Фейгин Л.А., Щедрин Б.М. Прямой метод интерпретации данных малоуглового рассеяния системами идентичных частиц // ДАН СССР. - 1981. -Т. 261, №4. - С.878-882.

7. Svergun D.I., Feigin L.A., Schedrin В.М. The direct method of interpretation of small-angle scattering by the solutions of biological macromolccules // Studia biophysica. - 1982. - V.87, N 2-3. - P.277-278.

8. Svergun D.I., Feigin L.A., Schedrin B.M. Small-angle scattering: direct

structure analysis // Acta Cryst. - 1982. - V.A38, N 6. - P.827-835.

9. Свергун Д.11. Методы обработки и интерпретации данных малоуглового

рассеяния. В сб. Физика конденсированного состояния. Л.:ЛИЯФ АН СССР, 1982. С.151-197.

10. Vainshtcin В.К., Svergun D.I., Fcigin L.A. The investigation of the structure of biomolecules by means of small-angle scattering //Acta Physica Academiae Scienarium Hungaricae. - 1982~- V.53, N 1-2 - P.105-119.

11. Свергуи Д.И., Фейгин Л.А., Щедрин Б.М. Востаиовлеиие сферически-симметричного распределения плотности по кривой малоугловго рассеяния//Кристаллография - 1983. -Т. 28, №2. -С.252-259.

12. Svergun D.I., Feigin L.A., Schedrin В.М. The solution of the one-dimensional sign problem for Fourier transform // Acta Cryst. - 1984. -V.A40. N2.- P.137-142.

13. Могилевсклй Л.Ю., Дембо А.Т., Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Малоугловой рентгеновский дифрактометр с координатным детектором//Кристаллография - 1984. -Т. 29, №3. - С.587-591.

14. Свергун Д.И., Каюшина Р.Л., Изотова Т.Д., Хургин Ю.И. Прямой анализ строения молекулы иммуноглобулина М по данным рентгеновского малоуглового рассеяния. //ДАН СССР. - 1985. - Т. 282. - №1. - С.103-108.

15. Агамалян М.М., Крившич Т.И., Свергун Д.И., Семенюк А.В. Устранение приборных искажений в нейтронном малоугловом эксперименте (дифрактометр "Мембрана-2") // Препринт ЛИЯФ АН СССР - 1985 - № 1081 С.1-20.

16. Свергун Д.И., Семенюк А.В. Учет немонохроматичиостп излучения в малоугловом эксперименте//ДАН СССР. - 1985. -Т. 284, №3 -С.621-626.

17. Svergun D.I., Kayushina R.L., Izotova T.D., Mogilevsky L.Yu., Shmakova F.V., Khurgin Yu.I. Modelling and direct restoration of the immunoglobulin M structure by means of X-ray small-angle scattering //Studia biophysica. - 1986. - V.112, N 2-3. - P. 189-196.

18. Svergun D.I., Shtykova E.V., Dembo А.Т., Semenyuk A.V., Matvceva E.G. The investigation of the particle size distribution for the inverted

micelles systems //Studia biopliysica. - 1986. - V.112, N 2-3. - P. 225230.

19. Svergun D.I. Direct methods of structure analysis in small-angle scattering //Studia biophysica. - 1986. - V.112, N 2-3. - P. 243-254.

20. Svergun D.I., Semenyuk A.V. Application of the'regularization technique to the small-angle scattering data processing //Studia biophysica. -

1986. - V.112, N 2-3. - P. 255-262.

21. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.:Наука, 1986, 278 С.

22. Вайнштейн Б.К., Фейгин' Л.А., Свергун Д.И., Вагин А.А. Использование симметрии в структурном анализе биологических макромолекул. В сб. Кристаллография и кристаллохимия., ред. Б.К.Вайнштейн и В.И.Симонов. М.'.Наука, 1986, С.91-104.

23. Свергун Д.И. Прямые методы востановления распределения плотности по данным малоуглового рассеяния. В сб. Применение рентгеновских лучей к исследованию материалов. Кишинев: Штиинца, 1986, С. 127140.

24. Serdyuk I.N., Tsalkova T.N., Svergun D.I., Izotova T.D. Determination of radii of gyration of particles by small-angle neutron scattering: calculation of the effects of aggregates//J. Mol. Biol. - 1987. - V.194, N 1. - P. 126-128.

25. Feigin L.A., Svergun D.I. Structure analysis by small-angle X-ray and neutron scattering. NY: Plenum Press, 1987, 335 P. •

26. Свергун Д.И., Семсшок А.В. Решение уравпвннй типа свертки при обработке данных малоуглового эксперимента //Кристаллография -

1987. -Т. 32, №6. - С.1365-1372.

27. Свергун Д.И., Семенюк А.В. Обший метод обработки данных малоуглового рассеяния //ДАН СССР. - 1987. -Т. 297, №3 - С.1373-1378.

28. Svergun D.I. Direct methods in small-angle scattering //Macromol. Chem. Macromol. Symp. - 1988. - V.15 - P. 51-78.

29.Svcrgun D.I., Semenyuk A.V., Feigin L.A. Small-angle scattering data treatment by the regularization method // Acta Cryst. - 1988. - V.A44, N 3,-P.244-250.

30. Ronto Gy., Toth K., Feigin L.A., Svergun D.I., Dembo A.T. Symmetry and structure of bacteriophage T7// Comput. Math. Applic. - 1988. -V.16, N5-8. - P.617-628.

31. Агамалян M.M., Багдасаров X.C., Лазарев В.А., Свергун Д.И., Семенюк А. В. Изучение кластерной структуры монокристаллов лейкосалфира методами рентгеновского и нейтронного малоуглового рассеяния // Препринт ЛИЯФ АН СССР. - 1988 -№ 1382.- С. 1-9.

32. Ronto Gy., Toth К., Csik G., Feigin L.A., Svergun D.I., Dembo A.T., Shtikova E.V. Loosening of the phage structure in a low ionic strength environment // Eur. Biophys. J. - 1988. - V.15, N 5. - P.293-298.

33. Feigin L.A., Svergun D.I., Dembo A.T., Tardieu A., Vachette P., Ronto Gy., Toth K. A small-angle scattering study of bacteriophage T7 using synchrotron radiation// Nucl. Instrum. Meth. - 1989. - V.A282, N 2-3. -P.486-489.

34. Lvov Yu.M., Svergun D.I., Feigin L.A., Pearson C.^Petty M.C. Small-angle X-ray analysis of alternate-layer Langmuir-Blodgett films. // Philos. Mag. Lett. - 1989. - V.59, N 6. - P.317-323.

35. Ребров А.В., Озерин A.H., Свергун Д.И., Боброва Л.П., Бакеев Н.Ф. Исследование агрегации макромолекул перфлюоросульфонированных нономеров в растворе методом малоуглового рентгеновского рассеяния //Высокомолекулярные соединения - 1990. -Т. А32, №8 - С. 15931599.

36. Свергун Д.И., Семенюк А.В., Могнлевскнй Л.Ю., Бсрезкнн В.В., Нечаев А.Н., Мчедлишвилп Б.В. Исследование поровой структуры ядерных фильтров методом малоуглового рассеяния //Коллоидный Ж. - 1991. -Т. 297, №3 - С.1373-1378.

37. Svergun D.I. General theorems of small-angle scattering by disperse systems. In "Neutron, X-ray and light scattering", Eds P.Lindner, T.Zemb. 1991. Notrh Holland: Amsterdam, P.83-98.

38. Svergun D.I. & Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering. 1. Theory and model calculations // Acta Cryst. -1991.- V.A47, N 6,- P.736-744.

39. Svergun D.I. Mathematical methods in small-angle scattering data analysis // J Appl. Cryst.- 1991,- V24, N 5,- P.485-492.

40. Semenyuk A.V., Svergun D.I. GNOM - a program package for small-angle scattering data processing // J. Appl. Cryst. -1991.- V.24, N 5,-P.537-540.

41. Semenyuk A.V., Svergun D.I., Mogilevsky L.Yu., Berezkin V.V., Mchedlishvili B.V., Vasilev A.B. Small-angle scattering investigation of the pore structure of nuclear filters //J. Appl. Cryst. -1991.- V.24, N 5.- P.809-810.

42. Koenig S., Svergun D.I., Koch M.H.J., Huebner G., Schellenberger A. Synchrotron radiation solution x-ray study of the ph dependence of the quarternary structure of yeast pyruvate decarboxylase // Biochemistry -1992,- V.31, N 37,- P.8726-8731.

43. Svergun D.I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria //J. Appl. Cryst. -1992.-V.25, N 4,- P.495-503.

44. Koenig S., Svergun D.I., Koch M.H.J., Huebner G., Schellenberger A. The influence of the effectors of yeast pyruvate decarboxylase (PDC) on the conformation of the dimers and tetramers and their pH-dependent equilibrium.// Eur. Biophys. J. -1993,- V.22 N 3,- P.185-194.

45. Svergun D.I. A direct indirect method of small-angle scattering data treatment // J. Appl. Cryst. -1993.- V.26, N 2,- P.258-267.

46. Svergun D.I., Pedersen J.Skov. Propagating errors in small-angle scattering data treatment // J. Appl. Cryst. -1994,- V.27, N 3,- P.241-248.

47. Svergun D.I. Solution scattering from biopolymers: advanced contrast variation data analysis // Acta Cryst. -1994,- V.A50, N 3.- P.391-402.

48. Svergun D.I., Koch M.H.J., Serdyuk I.N. Structural model of the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes from solution scattering. I. X-ray synchrotron radiation study // J. Mol. Biol. -1994,- V.240, N 1,- P.66-77.

49. Svergun D.I., Koch M.H.J., Pedersen J.Skov, Serdyuk I.N. Structural model of the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes from solution scattering. II. Neutron scattering study // J. Mol. Biol. -1994.- V.240, N 1,- P.78-86.

50. Koenig S., Svergun D.I., Koch M.H.J., Huebner G., Schellenberger A. The influence of the effectors of yeast pyruvate decarboxylase (PDC) on the conformation of the dimers and tetramers and their pH-dependent equilibrium // J. de Physique -1994,- V. C9, N 4.- P.303-307.

51. Svergun D.I., Pedersen J.Skov, Serdyuk I.N., Koch M.H.J. Solution scattering from 50S'ribosomal subunit resolves inconsistency between electron microscopic models // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1994.- V. 91, N 25.- 11826-11830.

52. Koch M.H.J., Sayers Z., Sicre P., Svergun D.I. A synchrotron radiation electric field X-ray solution scattering study of DNA at very low ionic strength // Macromolecules -1995.- V28, N 14,- P.4904-4907.

53. Schmidt B., Koenig S., Svergun D., Volkov V., Fischer G., Koch M.H.J. Small-angle X-ray solution scattering study of the dimerization of the FKBP25mem from Legionella pneumonia // FEBS Letters -1995.-V.372, N 2-3,- P.169-172.

54.-Svergun D.I., Barberato C., Koch M.H.J. CRYSOL - a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates // J. Appl. Cryst. -1995,- V.28, N 6.- P.768-773.

55. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B., Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering. 2. Uniqueness // Acta Cryst. -1996.- A52, N 3.- P.419-426.

56. Svergun D.I., ICoch M.H.J., Pedersen J.Skov, Serdyuk I.N. (1996). Structural model of the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes from solution scattering. ln:"Neutrons in Biology", B.Schoenborn, R.Knott, Eds. NY.: Plenum Press, P.149-174.

57. Козин М.Б., Свергун Д.И. Обработка данных малоуглового рассеяния с помощью линейных вытянутых сфероидальных функций // Кристаллография -1996. - Т.41, №3 - С. 817-825.

58. Svergun D.I. Restoring three-dimensional structure of biopolymers from solution scattering // X' International Conference on Small-Angle Scattering. LNLS: Campinas, 1996, P.34.

59. Kozin M.B., Volkov V.V., Svergun D.I. Real time shape determination from solution scattering data //X International Conference on Small-Angle Scattering. LNLS: Campinas, 1996, P. 105.

60. Barberato C., Svergun D.I., Koch M.H.J., Fetler L., Vachette P. Solution scattering from atomic coordinates: accounting for hydration shell and modelling structural differences //X International Conference on Small-Angle Scattering. LNLS: Campinas, 1996, P.219.

61. Svergun D.I., Koch M.H.J., Volkov V.V., Kozin M.B., Meerwink W., Stuhrmann H.B., Pedersen J.Skov, Burkhardt N., Diedrich G., Nierhaus K.H. Contrast variation study of the 70S E.coli ribosome // X International Conference on Small-Angle Scattering. LNLS: Campinas, 1996, P.226.