Разработка методов быстрой классификации белков по данным малоуглового рассеяния и анализ строения белковых комплексов в растворе тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

СОКОЛОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БЫСТРОЙ КЛАССИФИКАЦИИ БЕЛКОВ ПО ДАННЫМ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ И АНАЛИЗ СТРОЕНИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В РАСТВОРЕ

01.04.07 - физика конденсированного состояния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математическихнаук

Москва 2004

Работа выполнена в Институте кристаллографии им. А.В.Шубникова Российской академии наук

Научные руководители:

доктор физико-математических наук

кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, чл.корр. РАН

кандидат физико-математических наук

Свергун Дмитрий Иванович Волков Владимир Владимирович

Озерин Александр Никифорович Михайлов Альберт Михайлович

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "УУ" апреля 2004 года в 4.0т ^Фт на заседании Диссертационного совета Д002.114.01 в Институте кристаллографии им. А.В.Шубникова РАН по адресу: 119333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии им. А.В.Шубникова РАН

Автореферат разослан марта 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д002.114.01 кандидат физико-математических на;

В.М.Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. История современной физики показывает, что рентгеновское излучение является эффективным средством для физической, химической, биологической и структурной характеризации вещества. Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУР), представляющее собой центральную часть дифракционной картины, позволяет исследовать вещества самой разнообразной структуры, в которых характерные размеры неоднородностей электронной плотности лежат в диапазоне 1-5-103 нм.

Метод малоуглового рентгеновского рассеяния применяется в изучении объектов разнообразных классов. Существенный прорыв в развитии и использовании метода малоуглового рассеяния произошел в 1970-е годы благодаря появлению источников синхротронного излучения. Одной из наиболее перспективных областей применения малоуглового рассеяния рентгеновского синхротронного излучения является изучение молекул биополимеров в растворе. Актуальность таких исследований обусловлена тем, что строение биомакромолекул и механизм их функционирования изучаются в условиях, максимально приближенных к физиологическим, тогда как методы электронной микроскопии и электронной дифракции требуют специальной подготовки образцов. Кроме того, МУР позволяет исследовать структурные перестройки, вызванные изменениями условий эксперимента.

В связи с появлением в 1990-е годы нового научного направления, называемого структурная геномика, одной из главных задач которого является определение структуры всех биомакромолекул, синтезируемых данным исследуемым геном, важным вопросом остается быстрый анализ структуры большого числа белков, получение кристаллов которых затруднено. Несмотря на все увеличивающееся число научных работ, посвященных определению структуры отдельных белков и комплексов, остается много неисследованных сложных биологических систем, изучение компонент которых возможно только с помощью метода малоуглового рассеяния.

Определение связи между функцией и структурой биологических макромолекул является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии. Изучение структурных аналогий позволяет получить больше информации о возможных функциях белков, чем анализ сходства только первичных последовательностей, но, очевидно, такой подход не может применяться для молекул, атомная структура которых неизвестна. Быстрая оценка структурных особенностей частицы может стать важным дополнительным этапом изучения белков с использованием метода малоуглового рассеяния.

Таким образом, развитие новых методов анализа и обработки экспериментальных данных, исследование структуры биологических макромолекул методом МУР и развитие теоретических аспектов методов интерпретации данных малоуглового рентгеновского синхротронного рассеяния являются актуальнойзадачей.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА |

09 100 у«т/^ }

Цель и задачи работы

В методической части настоящей диссертационной работы представлены разработка и способ реализации метода быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния, оригинальность и простота использования которого показаны на ряде проведённых тестов.

В экспериментальной части работы описывается построение модели вертексного комплекса бактериофага PRD1, а также детальный анализ зависимости олигомеризации промежуточного филамента виментина в растворах от величин рН, концентрации белка и ионной силы растворителя.

Таким образом, в настоящей диссертационной работе поставлены. следующие задачи:

• определение критериев связи между формой среднеугловых частей кривых малоуглового рассеяния и внутренней структурой биомакромолекулы;

• создание метода быстрой классификации белков по внешней форме и доменной архитектуре на основе независимого анализа малоугловой и среднеугловой частей кривых рассеяния;

• реализация метода быстрой классификации белков;

• определение формы вертексного комплекса бактериофага PRD1, построение моделей его компонент и сравнение данных с результатами, полученными ранее с помощью других методов;

• анализ процесса олигомеризации виментина в растворах в различных внешних условиях и построение моделей его комплексов с учётом дополнительной информации, полученной ранее биохимическими методами и методом электронной микроскопии.

Научная новизна работы определяется тем, что впервые разработан и реализован метод быстрой классификации молекул белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния. Впервые предложена модель полного вертексного комплекса бактериофага PRD1 и проведен детальный анализ динамики взаимодействия молекул промежуточного филамента виментина в растворе в разных внешних условиях.

Проведённая работа имеет практическое значение, так как открывает возможности быстрого поиска непосредственно по экспериментальным кривым малоуглового рассеяния биологических макромолекул, схожих по внешней форме и доменной архитектуре с неизвестной структурой. Новый метод может быть использован для быстрой характеризации белков в задачах нового научного направления — структурной геномики. Результаты, полученные в экспериментальной части настоящей работы, дают новую информацию о бактериофаге PRD1, который принадлежит к классу вирусов с внутренней мембраной и является структурным аналогом человеческого аденовируса, и также о кинетике и динамике взаимодействия молекул промежуточного филамента виментина в растворе. Последнее имеет важное значение в понимании механизмов заболеваний, связанных с нарушениями процесса самосборки филаментов в клетках живых организмов.

Основные положения, выносимые на защиту:

• проанализировано информационное содержание среднеугловой части малоугловой кривой рассеяния, форма которой определяется доменной архитектурой биомакромолекулы.

• разработан метод быстрой классификации белков по данным малоуглового рассеяния, основанный на независимом анализе участков кривых, которые содержат информацию о внешней форме и внутренней структуре биомакромолекулы;

• разработанный метод реализован в виде пакета компьютерных программ, который позволяет проводить через Интернет поиск структур, похожих на неизвестный белок по внешней форме и доменной архитектуре;

• построены модели вертексного комплекса бактериофага PRD1 с использованием структур низкого разрешения его компонент, которые были восстановлены по данным рентгеновского малоуглового рассеяния;

• определена зависимость формирования олигомеров разных степеней промежуточного филамента виментина от величин концентрации белка в растворе, значений рН и ионной силы растворов;

• построены модели виментинового филамента единичной длины по данным малоуглового рентгеновского рассеяния.

Личный вклад автора

Автором дополнены и модифицированы программы обработки экспериментальных данных рентгеновского малоуглового рассеяния (OLIGOMER, PRIMUS).

Автором разработан ряд компьютерных программ для реализации метода быстрой классификации белков, который основан на анализе данных, полученных методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Создана база данных белковых структур, разработана и реализована WEB-версия базы данных. Автором проведено тестирование базы данных с использованием нескольких рассчитанных и экспериментальных кривых малоуглового рассеяния.

Автором получены на станции ХЗЗ синхротрона DESY (Гамбург, Германия) используемые в работе экспериментальные данные, а также проведены их первичная обработка, анализ и интерпретация. Построены модели белков вертексного комплекса бактериофага PRD1 и пяти основных олигомеров промежуточного филамента виментина. Автором проведен детальный анализ зависимости степени олигомеризации димеров виментина от различных внешних условий.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались: • на лекциях и практических занятиях Школы по малоугловому рассеянию растворами биологических макромолекул (EMBO Practical Course on Solution Scattering from Biological Macromolecules, Гамбург, Германия, сентябрь 2001);

• на конференции HASYLAB (HASYLAB Users Meeting, Гамбург, Германия, февраль 2003);

• на общем семинаре Биоцентра г. Базеля, Швейцария (приглашенный докладчик; июнь 2003);

• на конкурсе научных работ Института кристаллографии РАН в 2003 году (работа удостоена первой премии).

На международных и национальных конференциях:

• Конференция студентов и аспирантов по химии и физике биополимеров (Пущино, Россия, июнь 1999)

• Второй Биофизический съезд (Москва, Россия, август 1999)

• «Ломоносов-2001» — Международная Конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва; Россия, 2001; работа удостоена второй премии)

• Третья национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2001» (Москва, Россия, май 2001)

• «SAS 2002» (XII International conference on Small-Angle Scattering, Венеция, Италия, август 2002)

• Четвёртая национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов1 и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2003» (Москва, Россия, ноябрь 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи и 8 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит, из введения, пяти глав, выводов, заключения и списка литературы. Объём диссертации составляет 148 страниц, включая 37 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 161 наименование.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во Введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность темы, сформулирована цель и определены основные задачи исследования, кратко изложены научная новизна и практическая ценность работы.

Первая глава представляет собой обзор литературы по теме малоуглового рассеяния и его применения к анализу структуры биологических объектов. Рассмотрены общие методики и конкретные алгоритмы, используемые в данной диссертационной работе.

Изложены основные литературные данные об использовании различных методов структурной интерпретации (вариация контраста, прямые методы, анализ характеристических функций), позволяющие исследовать особенности строения, определять весовые и геометрические характеристики, а также

трехмерную структуру биологических макромолекул и их комплексов в растворах по данным МУР (интентивности I{s), s=4rcsin9A., где 0 — половина угла рассеяния и X — длина волны падающего излучения). Особое внимание уделено определению геометрических параметров сильно вытянутых частиц.

Рассмотрен вопрос об информационном содержании данных малоуглового рассеяния.

Описаны методы ab , initio (т.е. не требующие привлечения дополнительной информации) определения формы частиц, в частности, подход, использующий представление функции оболочки в виде разложения по сферическим гармоникам, а также разработанные недавно методы восстановления формы, основанные на алгоритме метода отжига, которые используют модели конечных объемных элементов (алгоритм реализован в программе DAMMIN [2]) и модели виртуальных остатков (программа GASBOR [3]).

Приведён алгоритм расчета кривых малоуглового рассеяния от известных атомных структур с учетом рассеяния гидратной оболочкой (реализован в программах CRYSOL [4] и CRYDAM), применение которого позволяет сравнивать экспериментальные и рассчитанные интенсивности рассеяния, определять структурные различия молекул в растворе и в кристалле и предсказывать возможные изменения четвертичной структуры биомакромолекул при изменении внешних условий.

Также рассмотрен метод молекулярной тектоники для построения по данным малоуглового рассеяния растворами моделей макромолекулярных комплексов, состоящих из субъединиц с известной структурой (соответствующий алгоритм реализован в программе MAS SHA [5]).

Описаны возможности обработки и анализа данных малоуглового рассеяния смесями невзаимодействующих биомакромолекул с помощью методов сингулярного разложения и представления кривой рассеяния смесью в виде линейной комбинации кривых рассеяния компонентами.

В заключение описаны новые направления исследований структурных процессов, происходящих в растворах биомакромолекул (таких, например, как сворачивание-разворачивание белков), в режиме реального времени.

Во второй главе приведено описание экспериментальной станции ХЗЗ, расположенной на накопительном кольце DORIS III с энергией 4.5 ГэВ синхротрона DESY (Гамбург, Германия), принадлежащей Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL), на которой были проведены измерения, описанные в настоящей работе.

Описаны методы первичной обработки данных МУР и способы обработки и интерпретации полученной информации с помощью программы PRIMUS и программного комплекса ATSAS 2.0, разработанных в лаборатории малоуголового рассеяния Института кристаллографии РАН (Москва) и в Европейской лаборатории молекулярной биологии (Гамбург, Германия).

Станция ХЗЗ использует монохроматический рентгеновский пучок с длиной волны 0.15 нм и оборудована линейным пропорциональным позиционно-чувствительным газовым детектором. Данные рассеяния одним образцом записываются в отдельные 1-минутные блоки в течение 15-20 минут, что позволяет регистрировать статистически достаточное количество информации и одновременно отслеживать возможные эффекты радиационных повреждений.

Первичная обработка данных включает в себя четыре последовательных этапа. Первый — нормировка экспериментальных данных на так называемую функцию отклика детектора для исключения влияния на полученные данные систематических ошибок, вызванных неидеальностью детектора. Второй — калибровка данных с использованием кривых рассеяния эталонных веществ, имеющих известную периодическую структуру. Третий — проверка статистической независимости полученных данных, их усреднение и нормировка. Программа SAPOKO позволяет проводить все операции третьего этапа обработи данных. На четвертом этапе данные, изначально записанные в бинарном формате ОТОКО, переводятся в текстовый формат ASCII для удобства проведения дальнейшего анализа.

Программа PRIMUS позволяет проводить первичный анализ экспериментальных данных МУР, полную обработку (вычет фонового рассеяния, вычетание и деление данных на заданное число, расчет интегральных параметров, приближение трехпараметрическими моделями и т. д.) и детальную интерпретацию данных МУР. PRIMUS имеет удобный графический интерфейс, позволяющий также вызывать независимые программы с помощью рабочего меню. На рис. 1 показан вид интерфейса программы PRIMUS, который включает в себя графическую панель для изображения файлов, интерактивно выбранных из списка в основном рабочем окне программы (показано внизу справа). На рис.1 (вверху справа) также показано окно для запуска программы SAPOKO, открытое с помощью верхнего меню.

Анализ пиков для данных рассеяния от частично упорядоченных систем позволяет проводить программа PEAK. Расчет характеристических функций с использованием косвенного Фурье-преобразования возможен, с помощью программы GNOM (рабочее окно программы показано на рис. 1 внизу в центре).

В случае рассеяния смесями информация о количестве компонент может быть получена с использованием сингулярного разложения. Объемные доли компонент могут быть рассчитаны с помощью программ OLIGOMER, которая использует алгоритм поиска неотрицательных решений системы линейных уравнений методом наименьших квадратов [6]. Алгоритм программы MIXTURE позволяет дать количественную характеристику (распределение по размерам) смеси взаимодействующих частиц, представленных простыми геометрическими формами.

Практически все модули, которые запускаются из оболочки PRIMUS, могут использоваться независимо.

Система ATSAS 2.0 включает в себя программу PRIMUS и все его независимые блоки, а также содержит пакет программ для моделирования

структуры биологических макромолекул, который включает в себя программы восстановления формы частиц, атомная структура которых неизвестна (DAMMIN, GASBOR); программы расчета рентгеновского и нейтронного рассеяния» атомными моделями* (CRYSOL, CRYSON); программы для трехмерного графического изображения объектов и моделирования строения комплексов методом молекулярной тектоники (ASSA, MASSHA, GLOBSYMM); программы для добавления недостающих доменов и участков цепей к моделям высокого разрешения (CREDO), программа автоматического совмещения, моделей высокого и низкого разрешения (SUPCOMB). ATSAS 2.0 находится в свободном доступе в Интернет (http://www.embl-hamburg.de/ExternalInfo/ Research/Sax).

Рис. 1 Вид основной панели программы PRIMUS, которая включает в себя основное рабочее окно программы, графическое и текстовое окна. Голубая кривая — рассеяние раствором бычьего альбумина, красная — рассеяние буфером, а сиреневая представляет собой разность между ними. В верхнем правом углу расположено рабочее окно программы SAPOKO, внизу в центре показано окно программы GNOM; оба открыты с помощью основного меню

В третьей главе описан новый метод классификации белков с неизвестной атомной структурой, основанный на сравнении экспериментальных данных малоуглового рассеяния с кривыми рассеяния, рассчитанными для белков с известной кристаллографической структурой. Разработанный метод даёт возможность получить набор структур биомакромолекул, т. е. выделить класс белков, похожих на исследуемый белок по внешней форме или/и доменной архитектуре.

Пространственное разрешение Б экспериментальных данных МУР связано с величиной 8 соотношением: в = 2л/0. Информация о четвертичной структуре молекулы (разрешение примерно до 4 нм) содержится в диапазоне 8 от О до 1.5 нм"1, информация о внутренней структуре (разрешение от 1.5 до 0.7 нм)

г

программы.

— в диапазоне величин вектора рассеяния s от 4 до 9 нм-1. Для классификации белков в кривых расеяния МУР было выделено два участка, которые можно назвать «малоугловой» (0 < S < 1.5 нм"1) и «среднеугловой» (4 < S < 9 нм"1) частями (рис. 2). Такой подход позволяет независимо анализировать информацию о форме и внутренней структуре частицы.

Для реализации предложенного метода создана база данных, названная DaRa (Database for Rapid protein characterization), которая на сегодняшний день содержит около 10 тысяч моделей атомного разрешения биологически активных олигомеров, взятых их архивов двух крупнейших баз данных белковых структур: Брукхевенской базы данных белков (PDB) и Базы данных молекулярных структур (MSD). Были выбраны модели биомакромолекул, полученные методом рентгеновской кристаллографии, длины последовательностей аминокислотных остатков которых лежат в интервале от 50 до 3000. Поскольку в отличие от файлов из архива базы данных MSD стандартные файлы PDB часто содержат лишь координаты атомов независимой части кристаллической ячейки и матрицы преобразований, необходимых для построения структуры целой биологически активной молекулы, были написаны компьютерные программы, анализирующие и применяющие описанные в PDB файлах операции симметрии. В MSD собраны структуры реальных белков,и поэтому файлы из этой базы данных никакой дополнительной коррекции не требовали. При выборе белковых моделей из PDB исключались структурные гомологи в соответствии с критериями, определенными в поисковой системе этой базы данных. Таким образом из архивов обеих баз данных (MSD и PDB) было собрано порядка 23 тысяч структур, и очевидно, что такой набор содержит большое количество гомологичных белков.

Чтобы уменьшить число последних, с сервера базы данных MSD в Интернет (http://www.ebi.ac.uk/msd/) был взят список пар белков с указанием их степени гомологии по последовательности между собой. Была написана программа, с помощью которой среди имеющихся белковых структур были выбраны те, аминокислотные последовательности которых негомологичны.

log/(s), отн ед

Рис. 2 Восемь кривых рассеяния белками, молекулярные массы которых лежат в интервале от 100 до 300 кДа. Малоугловые части кривых рассеяния показаны штрихами, среднеугловые — точками.

В ходе реализации метода классификации был разработан и написан набор программ на языке программирования Фортран, который можно условно разделить на две группы. Одна группа использовалась для создания базы данных, вторая — непосредственно для работы с ней. К первой группе относится, в частности, программа для составления списка структур, содержащихся в заданном каталоге с указанием длины последовательности белка и количества независимых цепей в структуре. В эту группу также входят программы для автоматического запуска программ CRYSOL, OLIGOMER и некоторых других. С помощью программ второй группы из созданной базы данных собственно и выбирается класс структур, похожих по внешней форме и/или доменной архитектуре на неизвестный исследуемый белок.

Очевидно, характер поведения кривых МУР определяется в первую очередь общим размером белка, в частности, его молекулярной массой. Поэтому численные тесты и эксперименты проводились на парах белков, разница молекулярной массы которых была не больше 7 % от величины её среднего значения. Все модельные расчеты велись с использованием интенсивностей рассеяния, рассчитанных от структур атомного разрешения с помощью программы CRYSOL с использованием стандартных значений исключённого объема и толщины гидратной оболочки частицы.

Для сравнения как малоугловых, так и среднеугловых частей кривых рассеяния был выбран R-фактор, который в общем виде записывается как

Z с*'со-(У-л (о-/.с*,»)1 1-1

где Sf— шкалирующий множитель:

s/=-&-

.-I

и W(s,) — весовая функция, выбор которой зависит от типа задачи. Были проанализированы несколько функциональных зависимостей а также сравнение в логарифмической шкале). Оказалось, что R-фактор со значением весовой функции, равным s (соответствующем значению весовой функции, используемому в теореме Котельникова об информационном содержании данных МУР), наиболее чувствителен к изменениям хода зависимости и может быть использован для анализа как внутренней, так и внешней частей кривых малоуглового рассеяния.

Практика показывает, что экспериментальные данные рассеяния белками с известной кристаллографической структурой иногда отклоняются от теоретических кривых, рассчитанных с помощью программы CRYSOL на среднеугловом интервале. Это различие связано как с возможным остаточным фоновым рассеянием в экспериментальных данных, так и с тем, что теоретические кривые рассеяния в базе данных рассчитываются для

усредненных значений исключенного объема частицы и плотности её гидратной оболочки (программа CRYSOL). Для реальных белков эти значения часто варьируются и, следовательно, приводят к систематическим отклонениям рассчитанных кривых от экспериментальных. Эти отклонения на среднеугловом интервале могут быть с достаточной точностью учтены путем добавления постоянного члена к данным рассеяния. Поэтому расчеты Л-фактора для среднеугловых частей кривых проводились с автоматическим добавлением константы к одному из сравниваемых наборов данных, а значение принималось равным единице.

Я-факторы для двух интервалов будут в дальнейшем обозначаться Rfl и соответственно.

При анализе малоугловой части данных МУР первым шагом был расчет величин Rfl для каждой пары кривых рассеяния от тысячи произвольно выбранных белков с близкими значениями молекулярной массы. Одновременно с этим с помощью программы SUPCOMB [8] для каждой пары молекул рассчитывался количественный критерий совпадения формы, называемый нормированной пространственной невязкой (normalized spacial discrepancy — NSD). SUPCOMB минимизирует значение NSD, подбирая соответствующее расположение в пространстве двух произвольных трёхмерных структур, представленных набором координат точек. NSD для близких структур принимает значения близкие или меньшие единицы.

Полученная корреляция между значениями и NSD позволяет сделать следующие выводы:

1. Максимальное значение Rfl, соответствующее определенно близким структурам низкого разрешения (NSD < 0.8), равно 0.02;

2. Значения Rfl, превышающие 0.05, соответствуют существенно разным внешним формам молекул белков.

При анализе среднеугловой части данных МУР вначале был определен интервал значений соответствующий кривым рассеяния белками с похожей внутренней структурой. По аналогии с процедурой, описанной выше, были рассчитаны значения RfM для каждой из тысячи тестовых пар структур. Было найдено, что кривые рассеяния белками с существенно разной внутренней структурой дают значение RfM, большее 0.15, вследствие чего такие пары были исключены из дальнейшего рассмотрения. Молекулы белков, внешние части кривых рассеяния от которых близки друг к другу как правило,

действительно выглядят похожими при низком разрешении, но для описания этого сходства необходимы количественные или статистические критерии, конкретный вид которых зависит от конечной задачи (получение информации для процедур восстановления формы, уточнения доменной структуры и т.д.). Однозначной корреляции между значениями для пары кривых и степенью гомологии сответствующих им биомакромолекул в существующих системах классификации структур белков высокого разрешения обнаружено не было. Нами рассматривались системы САТН (основанная на разделении структур по относительному содержанию определеных элементов вторичной структуры) и

DALI (оценивающая сходство в пространственном распределении атомов в независимости от того, какой элемент вторичной структуры они формируют). Тем не менее, совпадение среднеугловых частей кривых является индикатором похожей общей организации белка на низком разрешении, т.е. закономерностей в относительном расположении структурных элементов, образованных аминокислотной цепью, а не в сходстве третичной или вторичной структуры. В дальнейшем планируется разработка количественных критериев сходства на этом уровне белковой организации для классификационных задач различного типа.

На основе описанных алгоритмов разработан и написан на языках HTML (язык гипертекстовой разметки) и PHP (Personal homepage Hypertext Processor) Интернет сайт базы данных DaRa http://dacha.embl-hamburg.de/dara.html.

В качестве одного из тестовых примеров использования метода быстрой классификации белков были взяты экспериментальные данные рассеяния от монодисперсного раствора двухдоменного фрагмента из Z-диска белка титина (zlz2; zlz2.pdb), измеренные в диапазоне величин вектора рассеяния s от 0 до 10 нм*1 [9].

В базе данных ОаЯа для г1г2 среди 506 молекул с величинами молекулярной массы, близких к массе г\т2 (22 кДа) не найдено структур, одинаковых по внешней форме (/?/7для которых меньше 0.02).

Хорошие приближения к экспериментальным данным ( Ц/1 < 0.05) дали три кривые рассеяния из архива базы данных. Соответствующие этим кривым структуры так же, как х\г2, представляют собой сильно вытянутые молекулы, но с несколько различными геометрическими параметрами. Для среднеугловой части экспериментальных данных рассеяния раствором среди 506

упомянутых выше структур было найдено 147 близких (Ц/М меньше 0.07) кривых рассеяния. На рис. 3 показана структура белка г1г2 и четырёх типичных структур, аналогичных 21т2 по доменной архитектуре. Видно, что найденные аналоги имеют одинаковую, так называемую иммуноглобулиновую, упаковку бета-листов.

В четвёртой главе описано восстановление формы низкого разрешения вертексных белков бактериофага РК01 и построена модель всего вертексного комплекса с использованием данных МУР и других структурных методов.

РК01 - типичный представитель семейства Tectiviridae, члены которого характеризуются тем, что имеют липидную мембрану, расположеную под икосаэдральной белковой оболочкой (капсидом). Вертекс представляет собой белковый комплекс, связывающий вирус и бактериальную клетку в процессе заражения последней, составленный из трех белков — пентамера Р31¡, закрепленного в оболочке, прикрепленного к нему тримера и соединенного с Р5з третьего белка Р2. Структура высокого разрешения Р5¡, Р2 и Р31; до настоящего времени неизвестна. Строение основного белка оболочки бактериофага РКБ1 похоже на строение аналогичного белка человеческого аденовируса. Хотя РКБ1 и аденовирусы поражают организмы абсолютно разных эволюционных групп, они оба имеют внутреннюю мембрану и икосаэдральную оболочку, в которой закреплены вертексы, выполняющие похожие функции.

Несмотря на то, что принципиальная схема взаимодействия белков в вертексе бактериофага РКБ1 известна (рис.4), модель полного вертексного комплекса бактериофага РКБ1 ранее не была построена.

Рис. 4 Схема сборки вертексного комплекса бактерофага РК01

Главной проблемой при моделировании служил недостаток информации о структурных параметрах и форме вертексных белков. Полученные данные

вертексный комплекс

электронной микроскопии, хроматографии и генетических исследований давали лишь косвенную, хотя и очень ценную структурную информацию о белках in vitro. В настоящей работе модели белковых комплексов Р5з, Р5зС, Р2, Р31 ¡, Р5б'.Р31 и (Р5з)з были построены с помощью метода МУР с учетом данных, полученных гидродинамическими методами. Такие исследования' дали возможность построить модель полного вертексного комплекса бактериофага PRD1.

Кривые малоуглового рассеяния-были измерены для монодисперсных растворов Р5з, его С-концевого домена Р5зС, мономера Р2, пентамера Р31} и для смесей Р5з+(Р5з)з и Р5е:Р31+Р5з+Р31. Получение монодисперсных растворов комплексов (Р5з)з и Р5е:Р31 было невозможно вследствие их нестабильности.

Структуры низкого разрешения белками Р5з, Р5зС И Р2 были построены. ab initio с помощью программы DAMMIN по экспериментальным кривым рассеяния соответствующими монодисперсными растворами. Форма P31s была восстановлена также ab initio программами DAMMIN и GASBOR. На рис.5 показаны независимо построенные с помощью программы DAMMIN модели Р5з и и соответствующие рассчитанные кривые рассеяния, приближающие

экспериментальные данные. Как видно, полученные структуры хорошо согласуются друг с другом, что еще раз подтверждает эффективность восстановления формы биомакромолекул в растворе по данным МУР с помощью программы DAMMIN, в которой реализован алгоритм метода отжига.

Рнс. 5 (а) модели низкого разрешения комплексов Р5з (зеленый) и Р5зС (оранжевый). Справа внизу показаны те же структуры, развернутые на 90 ° вокруг оси х. (б) экспериментальные кривые рассеяния (точки) и приближенные кривые, полученные с помощью пограммы БАММШ (сплошные линии) для Р5з (1), Р5зС (2).

Получение информации о структуре возможно только следующим

способом. Известно, что кривая рассеяния смесью невзаимодействующих компонент является линейной комбинацией их интенсивностей рассеяния. Поэтому, располагая данными рассеяния от компонент, мы можем определить их объемные доли и приблизить экспериментальные данные рассеяния смесью с помощью программы OLIGOMER, в которой реализован соответствующий алгоритм. В качестве набора форм-факторов рассеяния были взяты три кривые: экспериментальная интенсивность рассеяния Р5з и рассчитанные с помощью программы CRYSOL интенсивности рассеяния мономером Р31 и комплексом Для получения хорошего приближения рассчитанной (с помощью программы OLIGOMER) интенсивности к экспериментальным данным было протестировано несколько десятков моделей построенных с помощью

программы MASSHA следующим образом. Две модели Р5з соединялись между собой N-концевыми доменами и к полученной структуре добавлялись один или два мономера Р31. Мономерный белок Р31 составляет лишь небольшую объемную долю в комплексе Р5б'.Р31, и его расположение в комплексе слабо влияет на кривую рассеяния. Тем не менее, также был включен в

рассмотрение, поскольку данные, полученные методом хроматографии, четко указывают на его присутствие в комплексе Р5б'.Р31. Модели комплексов Р5б'.Р31 различались расстоянием между двумя молекулами P5j и положением мономера Для каждой модели была рассчитана интенсивность рассеяния

программой CRYSOL, которая затем записывалась в файл форм-факторов и программой OLIGOMER оценивалось сходство рассчитанной и экспериментальной кривыми рассеяния смесью

Величины объемных долей компонент смеси, полученные по данным МУР (51% (Р5е:Р31) + 49% (Р5з+Р31 ¡)), хорошо согласуются с результатами, полученными независимо методом хроматографии (объемные доли

43%). Такое соответствие данных, полученных различными методами, и тот факт, что величины объемных долей сильно зависят от расстояний между двумя Р5з в P5s:P31, позволяют исключить возможность существования моделей, интенсивность рассеяния которыми позволила бы лучше приблизить экспериментальные данные.

Модель структуры нонамера (Р5з)з была построена тем же способом, что и модель Р5б'-Р31. С помощью программы MASSHA были построены тестовые модели (Р5з)з путем добавления модели тримера Р5з к двум моделям Р5з, расположенным так же, как в и затем данные рассеяния смесями были

приближены с помощью программы OLIGOMER. Исследование различных тестовых моделей (Р5з)з показало, что при изменении расположения тримеров значительно изменяются величины объемных долей компонент смеси, при том что значение отклонения экспериментальной кривой от рассчитанной остается практически постоянным. Построенная нами наилучшая модель нонамера состоит из тримеров расположенных в одной плоскости.

Такое их расположение дает возможность согласовать значения объемных долей компонент рассчитанных программой OLIGOMER ((58±11)% для Р5з и (42± 11)%

для (Р5з)з) и определенных с помощью хроматографии ((50+10)% для Р5з и (50±10)%для (Р5з)з)•

Для всех белков был проведен анализ гидродинамических параметров, полученных in vitro как в численных экспериментах, проведенных ранее, так и для моделей, полученных методом малоуглового рассеяния.

Полученные модели позволили подтвердить данные биохимических экспериментов и существенно уточнить предварительные гидродинамические модели структуры вертексного комплекса.

На последнем этапе работы на основе данных, полученных методом МУР, и дополнительной информации, полученной другими методами, была построена модель полного вертекса бактериофага PRD1.

В заключение следует сказать, что данные, полученные с помощью МУР, подтверждают наличие значительного сходства между структурой обычных вертексных комплексов PRD1 и строением аденовирусных вертексов, что подтверждает гипотезу об общем эволюционном предке этих вирусов.

Пятая глава посвящена анализу олигомеризации промежуточного филамента виментина при различных внешних условиях и построению моделей возможных комплексов виментина, в том числе так называемого филамента единичной длины, по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием информации, полученной ранее биохимическими методами.

Промежуточные филаменты вместе с микротрубочками и микрофиламентами образуют три разветвленные жесткие и прочные сети белковых волокон в цитоплазме различных клеток. Название «промежуточные филаменты» связано с тем, что значение размера их поперечного сечения (11-12 нм) лежит между величинами диаметров микротрубочек (25 нм) и микрофиламентов (7-10 нм). Промежуточные филаменты имеют особенности, четко отличающие их от двух других филаментных систем. Виментин — промежуточный филамент второго из четырех известных классов, широко распространенный в клетках мезенхимного происхождения, в том числе в фибробластах, клетках эндотелия кровеносных сосудов и лейкоцитах. Наименьшей стабильной формой виментина в растворе является димер (рис. 6).

"головной" домен

"хвостовой" домен

9 т

10 нм

Рис. 6 Структура димера виментина

Для различных ПФ только недавно были получены кристаллографические данные о некоторых фрагментах димера, что позволило построить модели тетрамера и олигомеров более высоких степеней, но так и не дало возможности определить варианты укладки димеров в олигомерах. Получение кристаллов

целого мономера и тем более олигомеров более высоких степеней пока остается невозможным вследствие их высокой гибкости и подвижности.

Ранее процесс самоассоциации димеров виментина в растворе детально не изучался, а вопрос об архитектуре виментина единичной длины в растворе оставался открытым. Использование метода рентгеновского малоуглового рассеяния позволило исследовать процесс формирования различных олигомеров виментина в растворах различной ионной силы и кислотности и построить детальные модели тетрамера, октамера, гексадекамера и филамента единичной длины (32-мера) с использованием модели димера атомного разрешения. Полученные в настоящей работе данные об особенностях архитектуры промежуточного филамента виментина и динамики его поведения в различных растворах имеют значение для более глубокого понимания процессов, протекающих в живых клеточных системах.

Теоретически определить величины концентации соли и рН растворов, в которых виментин формирует те или иные олигомеры практически невозможно, поэтому были исследованы растворы различной кислотности и ионной силы виментина дикого типа и двух его мутантов Delta30 и LIC. Delta30 — виментин дикого типа без тридцати первых аминокислотных остатков N-концов мономера, образовывающая в растворе только димеры и тетрамеры; L1C — точечный мутант виментина дикого типа который может собираться в любые

олигомеры вплоть до 32-меров, но при комнатной температуре практически лишенный способности образовывать филаментную сеть.

В настоящей работе методом рентгеновского малоуглового рассеяния было проведено две серии экспериментов. Первая серия состоит из 24 кривых рассеяния от растворов нескольких концентраций виментина и двух его мутантов с различным количеством добавленной соли NaCl (от 0 до 75 мМ) при двух значениях рН (7.0 и 8.4), вторая - из 14 кривых рассеяния растворами виментина дикого типа и мутанта L1C в других условиях ([NaCl] > 75 мМ, рН=7.0, 7.5, 8.4). По результатам обработки первой серии были построены модели основных структурных единиц и выяснены некоторые закономерности процесса олигомеризации виментина. Данные второй серии позволили провести более детальный анализ динамики образования олигомеров виментина и тем самым подтвердить результаты, полученные при обработке данных первой серии.

Почти во всех случаях, кроме образцов с высоким (более 75 мМ) содержанием соли, увеличение концентрации белка примерно на 2 мг/мл при неизменных кислотности и ионной силы раствора приводило к появлению в растворах олигомеров все более высоких степеней.

Для того, чтобы определить степень монодисперсности и тип преобладающих олигомеров в каждом растворе, для каждой кривой было рассчитано значение эффективной молекулярной массы. Анализ распределения полученных величин позволил выделить кривые рассеяния монодисперсными растворами тетрамера, октамера и 32-мера, с помощью которых были затем построены модели соответствующих олигомеров. Модели тетрамера и октамера

были построены с помощью программы MASSHA с использованием кривых рассеяния растворами ЫС при рН=8.4 без добавления соли и при рН=8.4 и [NaCl]=24 мМ, соответственно. При построении моделей учетывалась дополнительная информация о возможном расположении димеров в более сложных олигомерах.

В работах разных авторов, посвященных изучению архитектуры промежуточных филаментов, предлагалось несколько вариантов структуры филамента единичной длины, т.е. 32-мера. В частности, высказывались предположения, что октамеры расположены параллельно друг другу так, что образуют структуру с осью симметрии четвертого порядка с параллельно уложенными или немного развернутыми (на угол до 10°) друг относительно друга октамерами. Также не исключалась возможность, что в растворах in vitro октамеры образуют плоскую структуру. Как показали проведённые нами тестовые расчеты, интенсивность рассеяния ни одной из ранее описанных моделей не позволяет приблизить кривую рассеяния монодисперсным раствором 32-мера (раствор L1C при рН=8.4 и [NaCl]=75 мМ). Предложенная в настоящей работе модель, составленая из четырех повернутых друг относительно друга на угол 7° октамеров (рис. 7) и не имеющая оси симметрии четвертого порядка, наилучшим образом приближает соответствующую экспериментальную кривую.

Рис. 7 (а) модель 32-мера (филамента единичной длины), построенная с помощью программы МАЭБИА;

(б) пунктирная кривая — интенсивность рассеяния раствором мутанта ЫС при [ЫаС1] = 75 мМ и рН = 8.4 с указанными экспериментальными ошибками;

сплошная линия —интенсивность рассеяния моделью, рассчитанная с помощью программы С1Ш)АМ.

С одной стороны, такая архитектура филамента несколько неожиданна, поскольку все предлагаемые ранее модели представляли собой симметричные структуры с круглым сечением, но с другой - этот результат не противоречит полученным ранее данным. Интерпретация результатов, полученных ранее с помощью метода электронной микроскопии неоднозначна, и допускает представление формы 32-мера как в виде длинного цилиндра, так и в виде параллелепипеда.

С помощью программы MASSHA методом, аналогичным описанному в Главе 4 для построения модели комплекса P5¿P31 белков бактериофага PRD1, по данным рассеяния смесями была восстановлена форма ещё одного олигомера, который может существовать в растворе — гексадекамера.

Анализ кривых рассеяния смесями проводился тремя способами. Во-первых, с помощью программы OLIGOMER для каждой экспериментальной кривой рассеяния смесями были рассчитаны объемные доли каждой из компонент — димера, тетрамера, октамера, гексадекамера и 32-мера. Линейная комбинация кривых рассеяния компонентами позволила приблизить все экспериментальные кривые рассеяния. Во-вторых для того, чтобы подтвердить полученные результаты, с помощью метода сингулярного разложения (алгоритм реализован в программе SVDPLOT) было рассчитано число основных компонент для каждой смеси. Было получено, что число фракций смесей, полученное с помощью OLIGOMER, совпадает с числом компонент соответствующей смеси, оцененное программой SVDPLOT. В третьих, был проведен качественный анализ кривых распределения расстояний в поперечном сечении частицы [1]), рассчитанных с помощью косвенного преобразования Фурье (программа GNOM) для всех экспериментальных кривых рассеяния. Форма кривых рС1(г) позволяет определить степень анизометрии частицы в растворе и оценить эффективную толщину частицы в растворе, равную такому значению r, при котороpc¿r) янимает максимальное значение, и ширину частицы, т.е. г, при котором РсАг) эбращается в ноль. Таким образом, сравнительный анализ формы кривых позволяет проанализировать динамику сборки олигомеров

различных степеней в зависимости от внешних условий.

Полученные данные хорошо согласуются друг с другом и позволяют заключить, что увеличение концентрации белка, понижение pH и повышение концентрации соли способствует взаимодействию димеров и образованию всех возможных структурных единиц промежуточного филамента виментина -от тетрамера до филамента единичной длины (32-мера).

Заключение содержит краткий обзор полученных результатов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния от растворов, основанный на независимом сравнении собственно малоугловой и среднеугловой частей

кривых рассеяния (диапазоны величин вектора рассеяния s от 0 до 1.5 нм*1 и 4.0 до 9.0 нм-1, соответственно).

2. Разработан алгоритм быстрого поиска структурных аналогов по форме и доменной архитектуре белков с неизвестной структурой и написаны компьютерные программы, реализующие этот алгоритм.

3. Создана база данных белковых структур, взятых из архивов баз данных PDB (Protein Data Bank) и MSD (Molecular Structure Database) и их интенсивностей, рассчитанных программой CRYSOL. Для использования метода быстрой классификации широким кругом пользователей создан портал в Интернет (http://dacha.embl-hamburg.de/dara.litinl).

4. Построены модели низкого разрешения белков и комплексов Р2, P5j, Р31¡,

входящих в вертексный комплекс бактериофага PRD1, по данным рентгеновского малоуглового рассеяния их монодисперсными растворами и смесями. Предложена модель полного вертексного комплекса, которая хорошо коррелируют с данными, полученными ранее другими методами.

5. Исследована зависимость самоассоциации наименьших стабильных олигомеров (димеров) промежуточного филамента виментина в растворе от внешних условий. Построены модели комплексов, разных степеней олигомеризации виментина: тетрамера, октамера, гексадекамера и 32-мера.\ Показано, что добавление к раствору более 75 мМ соли NaCl и понижение рН раствора до 7.0 приводит к образованию 32-меров (филаментов единичной длины).

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Свергун Д. И., Фейгин Л. А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. 1986, Москва, Наука.

2. Svergun D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophys J. 1999. 76(6):

2879-86.

3. Svergun D. I., Petoukhov M. V. and Koch M. H. J. Determination of domain structure ofproteins from X-ray solution scattering Biophys J. 2001. 80: 294653.

4. Svergun D. I., Barberato C. and Koch M. H. J. CRYSOL — a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J.Appl.Crystallogr. 1995.28: 768-773.

5. Konarev P. V., Petoukhov M. V. and Svergun D. I. MASSHA — a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution

scattering data. J.Appl.Crystallogr. 2001.34:527-532.

6. Svergun D. I. Determination of the regularization parameter in indirect transform methods usingperceptualcriteria. J. Appl. Crystallogr. 1992. 25:495503.

7. Lawson C. L. and Hanson R. J. Solving Least Squares Problems Englewood Cliffs, J: Prentice-Hall 1974.

8. Kozin M. В. and Svergun D. I. Automated matching ofhigh- and low resolution structural models. J. Appl. Crystallogr. 2001.34:33-41.

9. Zou P., Gautel M., Geerlof M, Wilmanns M., Koch M. H. J. and Svergun D. I. Solution scattering suggests cross-linking function of telethonin in the complex with titin. J. Biol. Chem. 2003. 278:2636-44.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sokolova A. V., Malfois М., Caldentey J., Svergun D. I., Koch M. H. J., Bamford D. H. and Tuma R. Solution structure of bacteriophage PRD1 vertex complex, J.Biol.Chem. 2001, № 49, Issue ofDecember, 276:46187-46195;

2. Sokolova A. V., Volkov V. V. and Svergun D. I. Prototype of a database for rapidprotein classification based on solution scattering data J.Appl.Cryst. 2003. 36: 865-868;

3. Соколова А. В., Волков В. В., Свергун Д. И. База данных для быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоулового рассеяния Кристаллография2003. № 6, 49:959-964;

4. Konarev P. V., Volkov V. V., Sokolova A. V., Koch M. H. J. and Svergun D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis J.Appl.Cryst. 2003.36:1277-1282;

5. Соколова А. В. Тезисы докладов Конференции студентов и аспирантов по химии и физике биополимеров (Пущино, Россия) июнь, 1999, с. 30;

6. Свергун Д. И., Волков В. В., Кёниг С, Козин М. Б., Кох М., Петухов М. В., Мелик-Адамян В. Р., Соколова А. В. Тезисы докладов Второго биофизического съезда (Москва) август 1999, с. 20;

7. Соколова А. В., Свергун Д. И., Тума Р. Тезисы докладов Третьей национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2001» (Москва) май 2001, с. 277;

8. Sokolova А. V., Volkov V. V., Svergun D. I. Proceedings ofXIIInternational conference on Small-Angle Scattering «SAS 2002» (Venice, Italy) August 2002, p.176;

9. Соколова А. В, Стрелков С. В, Свергун Д. И. Тезисы докладов Четвертой национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2003» (Москва) ноябрь2003, с. 304;

10. Соколова А. В., Волков В. В., Свергун Д. И. Тезисы докладов конференции «РСНЭ-2003» (Москва) ноябрь2003, с. 322;

11. Конарев П. В., Волков В. В., Соколова А. В., Кох М., Свергун Д. И. Тезисы докладов конференции «РСНЭ-2003» (Москва) ноябрь2003, с. 341;

12. Петухов М. В., Соколова А. В., Конарев П. В., Козин М. Б., Волков В. В., Свергун Д. И. Тезисы докладов конференции «РСНЕ-2003» (Москва) ноябрь 2003, с. 348.

S

m-4351

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1 Традиционные методы анализа кривых рентгеновского малоуглового рассеяния.

1.1.1 Определение структурных инвариантов.

1.1.2 Расчет структурных характеристик сильно вытянутых частиц

1.2 Информационное содержание данных малоуглового рассеяния.

1.3 Методы восстановления формы частиц при отсутствии дополнительной информации.

1.4 Расчет кривых малоуглового рассеяния частицами с известной кристаллографической структурой.

1.5 Анализ структуры белков и комплексов. Метод молекулярной тектоники.

1.6 Кривые малоуглового рассеяния смесями: исследование формы и количества компонент.

1.7 Новые задачи рентгеновского малоуглового рассеяния.

ГЛАВА 2. Получение, обработка и интерпретация данных рентгеновского малоуглового рассеяния.

2.1 Сбор данных синхротронного рассеяния: установка ХЗЗ кольца DORIS III (DESY).

2.2 Первичная обработка данных.

2.3 Анализ и интерпретация данных. Программа PRIMUS.

Система ATSAS 2.0.

ГЛАВА 3. База данных для быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния.

3.1 Атомные модели и критерии сравнения кривых.

3.2 Малоугловая часть малоугловых данных и аналоги по внешней форме.

3.3 Среднеугловая часть кривой и аналоги по доменной архитектуре

3.4 Алгоритм и пользовательский интерфейс разработанной базы данных

DaRa.

3.5 Примеры использования базы данных.

ГЛАВА 4. Определение структуры вертексного комплекса бактериофага PRD1 в растворе.

4.1 Бактериофаг PRD1 как структурный аналог аденовируса.

4.2 Экспериментальные данные.

4.3 Учет дополнительной информации.

4.4 Построение моделей.

ГЛАВА 5. Исследование процесса олигомеризации промежуточного филамента виментина в различных внешних условиях.

5.1 Промежуточные филаменты: компонента цитоскелета.

5.2 Экспериментальные данные и алгоритм их обработки.

5.3 Построение моделей олигомеров виментина.

5.4 Олигомеризация виментина в различных внешних условиях.

Актуальность темы. История современной физики показывает, что рентгеновское излучение является эффективным средством для физической, химической, биологической и структурной характеризации вещества. Например, рентгеновская флюоресценция широко используется для качественного и количественного анализа вещества, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия может использоваться для изучения электронной структуры вещества. Рентгеновская кристаллография позволяет определять трехмерные структуры на атомном разрешении, а различные методики малоуглового рентгеновского рассеяния дают структурную информацию для аморфных материалов с разной степенью разрешения. Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУР), представляющее собой центральную часть дифракционной картины, также позволяет исследовать вещества самой разнообразной структуры, в которых характерные размеры неоднородностей электронной плотности лежат в диапазоне 1-й О3 нм. Чем больше размер рассеивающего объекта, тем в меньшем угловом интервале сосредоточено рассеянное излучение, и рассеяние на малые углы (меньше нескольких градусов) несет информацию о "крупномасштабном" (по отношению к длине волны излучения X) рассеивающем ансамбле. В структурном анализе вещества с помощью рентгеновского и нейтронного рассеяния X ~ 0.1 -г 1 нм, что по порядку величины совпадает с межатомными расстояниями. Таким образом, МУР дает информацию о надатомной структуре вещества.

Метод малоуглового рассеяния применяется в изучении объектов разнообразных классов: металлов и металлических сплавов, синтетических полимеров в растворе и сухом виде, эмульсий, пористых материалов, наночастиц и биологических макромолекул в растворе. Первые эксперименты с использованием МУР проводились уже в 1930х годах, когда появились первые фундаментальные работы, посвященные теоретическим основам метода, в которых было продемонстрировано, что с помощью МУР можно получать информацию не только о структуре неупорядоченных или частично упорядоченных систем, но также и о размерах и форме частиц. В 1960х годы метод начал использоваться также в изучении биомакромолекул в растворах. Существенный прорыв в развитии и использовании метода МУР произошел в 1970е годы благодаря появлению источников синхротронного излучения (СИ). Использование синхротронного рентгеновского излучения значительно расширило применение малоуглового рассеяния в структурных исследованиях. Его преимущество по сравнению с излучением рентгеновских трубок определяется значительно более высокой интенсивностью непрерывного рентгеновского спектра и отсутствием характеристических линий, которые затрудняют вариацию длин волн при исследовании рентгеновских спектров поглощения и аномального рассеяния с использованием рентгеновских трубок. Излучение в рентгеновских трубках образуется при резком торможении электронов, летящих со скоростью порядка 104 м/с в тонком слое металла, и при этом практически вся энергия электронов превращается в тепло, что и ограничивает мощность рентгеновского пучка. В случае синхротронного ускорителя коротковолновое электромагнитное излучение возникает при ускоренном движении электрона на релятивистских скоростях.

Эффективность СИ вызвана сочетанием указанных особенностей и следующими важнейшими для структурных исследований свойств: очень широкий спектральный интервал малая угловая расходимость малый размер источника высокая степень поляризации периодическое прерывание пучка во времени.

Каждое из этих свойств и комбинация ряда из них позволили проводить исследования фундаментального и прикладного направлений, немыслимые без использования синхротронного излучения. Для малоуглового рассеяния главным образом пока используется высокая интенсивность пучка, его малая угловая расходимость и широкий спектральный интервал. Область длин волн в синхротронных источниках охватывает интервал от жесткого рентгеновского излучения до инфракрасного диапазона, что позволяет исследовать структуру вещества с учётом аномального рассеяния на некоторых атомах. Одной из наиболее перспективных областей применения малоуглового рассеяния рентгеновского синхротронного излучения является изучение молекул биополимеров в растворе. В последние десятилетия быстрое развитие экспериментальных методов и способов обработки и интерпретации данных рассеяния растворами биомакромолекул привело к значительному прогрессу в двух направлениях: в области структурных исследований равновесных систем, анализе кинетики процессов межмолекулярных взаимодействий, изучения свертки белков и перестроек в расположении субъединиц (которыми часто обусловлены биологические функции белков), в реальном времени.

Актуальность таких исследований обусловлена тем, что строение макромолекул и механизм их функционирования изучаются в условиях, максимально приближенных к физиологическим, тогда как белковая кристаллография применима лишь к кристаллическим объектам, а методы электронной микроскопии и электронной дифракции требуют специальной обработки образцов. Последнее может приводить к неконтролируемым изменениям структуры и делать невозможным исследования конформационных изменений в структуре молекулы (которые происходят под влиянием эффекторов или изменения физико-химических условий), а также сборки или процессов свертки белков. Кроме того, МУР позволяет исследовать структурные перестройки, вызванные изменением условий эксперимента.

В связи с появлением в 1990-е годы нового научного направления, называемого структурная геномика, одной из главных задач которого является определение структуры всех биомакромолекул, синтезируемых данным исследуемым геном, важным вопросом остается быстрая характеризация массы биомолекул, получение кристаллов которых затруднено. Для решения этой проблемы хотя бы на низком разрешении может быть успешно применен метод малоуглового рассеяния при условии создания метода быстрой автоматической характеризации белков. Также, несмотря на все увеличивающееся число научных работ, посвященных определению структуры отдельных белков и комплексов, остается много неисследованных сложных биологических систем, изучение компонент которых возможно только с помощью метода МУР.

Таким образом, развитие новых методов обработки и интерпретации экспериментальных данных, исследование структуры биологических макромолекул методом МУР и, самое главное, развитие фундаментальных аспектов принципов интерпретации данных малоуглового рассеяния с использованием синхротронного излучения являются актуальной задачей.

Цель работы.

В методической части настоящей диссертационной работы представлены разработка и способ реализации метода быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния, оригинальность и простота использования которого показаны на ряде проведённых тестов.

В экспериментальной части работы описывается построение модели вертексного комплекса бактериофага PRD1, а также детальный анализ зависимости олигомеризации промежуточного филамента виментина в растворах от величин рН, концентрации белка и ионной силы растворителя.

Таким образом, в настоящей диссертационной работе поставлены следующие задачи:

•определение критериев связи между формой среднеугловых частей кривых малоуглового рассеяния и внутренней структурой биомакромолекулы;

•создание метода быстрой классификации белков по внешней форме и доменной архитектуре на основе независимого анализа малоугловой и среднеугловой частей кривых рассеяния; •реализация метода быстрой классификации белков;

•определение формы вертексного комплекса бактериофага PRD1, построение моделей его компонент и сравнение данных с результатами, полученными ранее с помощью других методов;

•анализ процесса олигомеризации виментина в растворах в различных внешних условиях и построение моделей его комплексов с учётом дополнительной информации, полученной ранее биохимическими методами и методом электронной микроскопии.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Научная новизна работы определяется тем, что впервые разработан и реализован метод быстрой классификации молекул белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния. Впервые предложена модель полного вертексного комплекса бактериофага PRD1 и проведен детальный анализ динамики взаимодействия молекул промежуточного филамента виментина в растворе в разных внешних условиях.

Проведённая работа имеет практическое значение, так как открывает возможности быстрого поиска непосредственно по экспериментальным кривым малоуглового рассеяния биологических макромолекул, схожих по внешней форме и доменной архитектуре с неизвестной структурой. Новый метод может быть использован для быстрой характеризации белков в задачах нового научного направления — структурной геномики.

Результаты, полученные в экспериментальной части настоящей работы, дают новую информацию о бактериофаге PRD1, который принадлежит к классу вирусов с внутренней мембраной и является структурным аналогом человеческого аденовируса, и также о кинетике и динамике взаимодействия молекул промежуточного филамента виментина в растворе. Последнее имеет важное значение в понимании механизмов заболеваний, связанных с нарушениями процесса самосборки филаментов в клетках живых организмов.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения и списка литературы. Объём диссертации составляет 149 страниц, включая 37 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 161 наименование.

выводы.

1. Разработан метод быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоуглового рассеяния от растворов, основанный на независимом сравнении собственно малоугловой и среднеугловой частей кривых рассеяния (диапазоны величин вектора рассеяния s от 0 до 1.5 нм"1 и от 4.0 до 9.0 нм*1, соответственно).

2. Разработан алгоритм быстрого поиска структурных аналогов по форме и доменной архитектуре белков с неизвестной структурой и написаны компьютерные программы, реализующие этот алгоритм.

3. Создана база данных белковых структур, взятых из архивов баз данных PDB (Protein Data Bank) и MSD (Molecular Structure Database) и их интенсивностей, рассчитанных программой CRYSOL. Для использования метода быстрой классификации широким кругом пользователей создан портал в Интернет (http://dacha.embl-hamburg.de/dara.html).

4. Построены модели низкого разрешения белков и комплексов Р2, Р5з, Р315, (Р5з)2:Р31, (Р5з)з, входящих в вертексный комплекс бактериофага PRD1, по данным рентгеновского малоуглового рассеяния их монодисперсными растворами и смесями. Предложена модель полного вертексного комплекса, которая хорошо коррелируют с данными, полученными ранее другими методами.

5. Исследована зависимость самоассоциации наименьших стабильных олигомеров (димеров) промежуточного филамента виментина в растворе от внешних условий. Построены модели комплексов разных степеней олигомеризации виментина: тетрамера, октамера, гексадекамера и 32-мера. Показано, что добавление к раствору более 75 мМ соли NaCl и понижение рН раствора до 7.0 приводит к образованию 32-меров (филаментов единичной длины).

В заключение, считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность моим научным руководителям д.ф.-м.н. Дмитрию Ивановичу Свергуну и к.х.н. Владимиру Владимировичу Волкову. Большой опыт, обширные знания и эрудиция Дмитрия Ивановича и Владимира Владимировича оказали огромную помощь при выполнении работы.

Также хочу поблагодарить руководителя группы Малоуглового рассеяния Европейской лаборатории Молекулярной биологии (EMBL с/о DESY, Гамбург, Германия) Мишеля Коха и ведущего научного сотрудника лаборатории малоуглового рассеяния Института кристаллографии РАН д.ф. - м.н. Льва Абрамовича Фейгина за полезные дискуссии и обсуждение некоторых результатов работы.

Выражаю искреннюю благодарность к.ф.-м.н. Людмиле Германовне Янусовой, к.ф.-м.н. Светлане Федоровне Борисовой, к.ф.-м.н. Максиму Владимировичу Петухову, к.ф.-м.н. Петру Валерьевичу Конареву, а также всем коллегам и друзьям за помощь и поддержку при выполнении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей диссертационной работе были проведены систематические исследования структуры белков в растворе.

В настоящей работе предложен и реализован метод быстрой классификации белков с неизвестной структурой высокого разрешения, основанный на сравнении экспериментальных данных малоуглового рассеяния с кривыми рассеяния, рассчитанными для белков с известной структурой. Основная особенность метода заключается в возможности независимого анализа так называемых малоугловой и среднеугловой частей кривых малоуглового рассеяния, форма первой из которых определяется внешней формой белка, а вид второй - в значительной степени его внутренней структурой, что позволяет отыскать среди большого количества структур такие, которые аналогичны неизвестной по структуре. В работе выбран критерий сравнения кривых рассеяния, создана база данных, которая содержит в настоящее время около 12000 кривых рассеяния, рассчитанных для известных структур (взятые из архивов баз данных PDB и MSD)), и написан ряд компьютерных программ, которые реализуют алгоритм поиска похожих структур и дают возможность использовать новый метод быстрой классификации через Интернет, что делает доступным его использование широкому кругу исследователей в других лабораториях. Метод опробован на ряде экспериментальных кривых рассеяния белками с известной структурой.

По данным малоуглового рентгеновского рассеяния от растворов были исследованы структуры вертексного комплекса бактериофага PRD1, который является мембранным ДКН-содержащим вирусом семейства Tectiviridae. В отличие от изученных ранее представителей данного семейства, PRD1 имеет специфический механизм распознавания и заражения бактерий, который в большой степени обусловлен строением его вертексных комплексов. Кроме всего прочего, изучение структурных особенностей PRD1 представляет большой интерес потому, что структура основного белка поверхности и биохимические функции его основного белка оболочки очень схожи с аналогичными в аденовирусе человека. И поэтому анализ строения PRD1 с помощью различных методов, в том числе методом малоуглового рассеяния, позволяет глубже понять эволюционные связи между бактериальными и человеческими вирусами. Долгое время форма, размеры и укладка отдельных белков в вертексном комплексе были неизвестны, потому что кристаллографические данные о структуре белков не были получены, а информации, собранной с помощью других методов, было недостаточно. Метод малоуглового рассеяния в растворе впервые позволил изучить архитектуру отдельных белков, составляющих вертекс, и их комплексов, получить результаты, которые находятся в хорошем согласии с данными, полученными ранее гидродинамическими, биохимическими и ЭМ методами, и построить модель целого вертексного комплекса, закрепленного на поверхности бактериофага.

Проведен анализ процесса олигомеризации молекул одной из компонент цитоскелета - промежуточного филамента (ПФ) виментина. ПФ играют роль в важных процессах, таких как перемещение и сопротивление клеток внешнему механическому воздействию, и поэтому очень часто нарушения процессов олигомеризации виментина in vivo приводит к серьезному повреждению тканей целого организма. Наименьшей структурной единицей виментина является димер, длина которого составляет 52 нм, сечение - 3 нм. Модели виментина на разных этапах олигомеризации были построены из димерных ПФ, которые, в свою очередь, были сформированы из ивестных фрагментов структуры, полученных методами рентгеноструктурного анализа. Были получены кривые МУР от растворов виментина нескольких концентраций при различных значения рН и концентраций добавленной соли. Такие вариации внешних условий дали * возможность получить образцы с различным содержанием олигомеров. По полученным экспериментальным данным монодисперсными растворами тетрамера, октамера и 32-мера, впервые построены модели этих олигомеров.

Анализ кривых рассеяния смесями позволил также построить модель гексадекамера и определить, какие внешние условия способствуют взаимодействию димеров и образованию структурных единиц промежуточных филаментов.

1. Свергун Д.И., Фейгин J1. А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. 1986, Москва, Наука.

2. Muller J.J., G. Damaschun and Hubner G., Acta Biol. Med. Germ., 1979. 38: p. 1-10.

3. Debye P. Zerstreuung von Roentgenstrahlen. Ann. Physik, 1915. 46: p. 809-823.

4. Muller J.J. Calculation of scattering curves for macromolecules in solution and comparaison with results of methods using effective atomic scattering factors.

5. J. Appl. Cryst., 1983.16: p. 74-82.

6. Svergun D.I. Solution scattering from biopolymers: advanced contrast variation data analysis. Acta Crystallogr., 1994. A50: p. 391-402.

7. Stuhrmann H.B., et al., New low resolution model for 50S subunit of Escherichia coli ribosomes. ProcNatl Acad Sci USA, 1976. 73(7): p. 2379- 2383.

8. Stuhrmann H.B. et al. Determination of the distribution of protein and nucleic acid in the 70 S ribosomes of Escherichia coli and their 30 S subunits by neutron scattering. J Mol Biol, 1978. 119(2): p. 203-12.

9. Koch, M.H. et al. A contrast variation study of Escherichia coli ribosomes reassembled from protonated and deuterated subunits. Biophys Struct Mech, 1978. 4(3): p. 251-62.

10. Porod, G. Die Rontgenkleinwinkelstreuung von dichtgepackten kolloiden Systemen. I. Kolloid-Z., 1951.124: p. 83-114.

11. Guinier A., Ann. Phys. (Paris), 1939.12: p. 161-237.

12. Glatter O. A new method for the evaluation of small-angle scattering data. Journal of Applied Crystallographica. 1977.10: p.415-421.

13. Svergun D.I. Determination of the regularization parameter in indirect transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 1992. 25:p. 495-503.

14. Svergun D.I., A.V. Semenyuk and L.A. Feigin, Small-angle scattering datatreatment by the regularization method. Acta Crystallgr. 1988. A44: p. 244-250.

15. Glatter О. and Kratky О. Small Angle X-ray Scattering. 1982. London: Academic Press.

16. Shannon C.E. and Weaver W. 1949. University of Illinois Press, Urbana, IL

17. Frieden B. R. Evaluation, design and extrapolation methods for optical signals, based on the use of the prolate functions (ed. E. Wolf). In Progress in Optics. Amsterdam: North Holland. 1971. 9: p. 312-407.

18. Damaschun G., Puerschel H. V. and Mueller J. J. Ueber die Messstrategie bei der Untersuchung der Roentgen-Kleinwinkelstreuung von verduennten monodispersen Loesungen von Makromolekuelen. Monatshefte fuer Chemie. 1968. 99: p. 2343-2348.

19. Moore P. B. Small-angle scattering : information content and error analysis. Journal of Applied Crystallography. 1980.13: p. 168-175.

20. Taupin D. and Luzatti V. Informational content and retrieval in solution scattering studies I Degrees of freedom and data reduction. Journal of Applied Crystallography. 1982.15: p.289-300.

21. Stuhrmann H.B. Interpretation of small-angle scattering of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering functions. Acta Cryst. 1970. A26: p. 297-306.

22. Svergun, D.I., Volkov, V.V., Kozin, M.B., Stuhrmann, H.B., Barberato, C. & Koch, M.H.J. Shape determination from solution scattering of biopolymers. J. Appl. Crystallogr. 1997 30, p. 798-802.

23. Svergun D.I. and Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering 1. Theory and model calculations. Acta Crystallogr. 1991. A47: p. 736-744.

24. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B. and Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering 2. Uniqueness. Acta Crystallogr. 1996. A52: p. 419 426.

25. Svergun D.I. Restoring three-dimensional structure of biopolymers from solution scattering. J. Appl. Crystallogr. 1997. 30: p. 792-797.

26. Svergun D.I. et al. Shape determination from solution scattering of biopolymers. J. Appl. Crystallogr. 1997. 30: p. 798-802.

27. Chacon P. et al. Low-resolution structures of proteins in solution retrieved from X-ray scattering with a genetic algorithm. Biophys J. 1998. 74(6): p.2760-2775.

28. Svergun D.I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophys J. 1999. 76(6): p. 2879-2886.

29. Walther D., Cohen F.E. and Doniach S., Reconstruction of low-resolution three-dimensional density maps from one-dimensional small-angle X-ray solution scattering data for biomolecules. J. Appl. Crystallogr. 2000. 33: p.350-363.

30. Kirkpatrick S., Gelatt Jr.C.D. and Vecci M.P., Optimization by simulated annealing. Science. 1983. 220: p. 671-680.

31. Bada M., Walther D., Arcangioli В., Doniach S. and Delarue M. Solution structural studies and low-resolution model of the Schizosaccharomyces pombesapl protein. Journal of Molecular Biology. 2000. 300: p.563-574.

32. Vigil D., Gallagher S. C., Trewhella J. and Garcia A. E. Functional dynamics of the hydrophobic cleft in the N-domain of calmodulin. Biophysical Journal. 2001. 80: p.2082-2092.

33. Svergun D.I. A direct indirect method of small-angle scattering data treatment. J. Appl. Crystallogr. 1993. 26: p. 258-267.

34. Press W.H. et al. Numerical Recipes. 1992, Cambridge: University Press.

35. Ingber L. Simulated annealing: practice versus theory. Math. Computer Modeling. 1993. 18: p. 29-57.

36. Kozin M.B. and D.I. Svergun Automated matching of high- and low resolution structural models. J. Appl. Crystallogr., 2001. 34: p. 33-41.

37. Volkov V.V. and Svergun D.I. Uniqueness of ab initio shape determination in * small angle scattering. J. Appl. Crystallogr., 2003. 36: p. 860-864.

38. Svergun D. I., Petoukhov M.V. and Koch M.H. J. Determination of domain structure of proteins from X-ray solution scattering. Biophysical Journal. 2001. 80: p.2946-2953.

39. Petoukhov M.V. and Svergun D.I. New methods for domain structure determination of proteins from solution scattering data. J. Appl. Cryst. 2003. 36: p.540-544.

40. Petoukhov M. V., Eady N. A. J., Brown K.A. and Svergun D. I. Addition of missing loops and domains to protein models using X-ray solution scattering. Biophysical Journal. 2002. 83: p.3113-3125.

41. Svergun D.I., Barberato C. and M.H.J. Koch CRYSOL a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J. Appl. Crystallogr. 1995. 28: p. 768-773.

42. Fedorov B.A., Voronin L.A. and Ptitsyn O.B. X-ray diffuse scattering by polypeptides and proteins in solution. IV. Consideration of the solvent effect for globular protein solutions. Mol Biol. 1974. 8(5): p. 693-702.

43. Fedorov B.A. and Denisyuk Large scale X-ray diffuse scattering, a new method for investigating changes in the conformation of globular protein in solution. A.I. J. Appl. Cryst. 1978.11: p. 473-477.

44. Svergun D.I. et al., Large differences are observed between the crystal and solution quaternary structures of allosteric aspartate transcarbamylase in the Rstate. Proteins. 1997. 27(1): p. 110-117.

45. Schoenbrunn E. et al., Studies on the conformational changes in the bacterial cell wall biosynthetic enzyme UDP-N-acetyIglucosamine enolpyruvyltransferase (MurA). Eur J Biochem. 1998. 253(2): p. 406-412.

46. Svergun D.I. et al. Protein hydration in solution: experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. 95(5): p.2267-2272.

47. Lattman E.E. Rapid calculation of the solution scattering profile from a macromolecule of known structure. Proteins. 1989. 5(2): p. 149-155.

48. Edmonds A.R., Angular momentum in quantum mechanics. Investigations in physics. 1957. Princeton, N.J.: Princeton University Press. 4: p. 146.

49. Stuhrmann H.B., Ein neues Verfahren zur Bestimmung der Oberflaechenform und der inneren Struktur von geloesten globularen Proteinen aus

50. Roentgenkleinwinkelmessungen. Zeitschr. Physik. Chem. Neue Folge. 1970. 72:p. 177-198.

51. Bernstein F.C. et al. The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J Mol Biol. 1977.112(3): p. 535-42.

52. Svergun D.I. et al. A model of the quaternary structure of the Escherichia coli F1 ATPase from X-ray solution scattering and evidence for structural changes in the delta subunit during ATP hydrolysis. Biophys J. 1998. 75(5): p. 2212-2219.

53. Ashton A.W. et al. Pentameric and decameric structures in solution of serum amyloid P component by X-ray and neutron scattering and molecular modelling analyses. J Mol Biol, 1997. 272(3): p. 408-22.

54. Krueger J.K. et al. Structures of calmodulin and a functional myosin light chain kinase in the activated complex: a neutron scattering study. Biochemistry. 1997. 36(20): p. 6017-6023.t

55. Svergun D.I. Mathematical methods in small-angle scattering data analysis.J. Appl. Crystallogr. 1991. 24: p. 485-492.

56. Svergun D.I. et al. Solution scattering from SOS ribosomal subunit resolves inconsistency between electron microscopic models. Proc Natl Acad Sci USA. 1994.91(25): p. 11826-11830.

57. Koenig S. et al. Small-angle X-ray solution-scattering studies on ligand induced subunit interactions of the thiamine diphosphate dependent enzyme pyruvate decarboxylase from different organisms. Biochemistry. 1998. 37(15): p.5329-5334.

58. Kozin M.B., Volkov V.V. and Svergun D.I. ASSA: a program for three dimensional rendering in solution scattering from biopolymers. J. Appl. Crystallogr. 1997. 30: p. 811-815.

59. Kozin M.B. and Svergun D.I. A software system for automated and interactiverigid body modeling of solution scattering data. J. Appl. Crystallogr. 2000. 33: p.775-777.

60. Konarev P.V., Petoukhov M.V. and Svergun D.I. MASSHA a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering data. J. Appl. Crystallogr. 2001. 34: p. 527-532.

61. Lawson C.L. and Hanson R.J. Solving Least Squares Problems Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall 1974.

62. Koenig S., Svergun D., Koch M. H. J., Huebner G. and Schellenberger A. Synchrotron radiation solution X-ray scattering study of the pH dependence of the quaternary structure of yeast pyruvate decarboxylase№\oc\\Qm\s\.ry. 1992. 31: p.8726-8731.

63. Golub G.H. and Reinsh C. Numer. Math. 1970. 14: p.403-20.

64. Konarev P.V., Volkov V.V., Sokolova A.V., Koch M.H.J, and Svergun, D.I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J. Appl. Cryst. 2003. 36: p. 1277-1282.

65. Chen L. L., Hodgson K.O. and Doniach S. A lysozyme folding intermediate revealed by X-ray solution scattering. Journal of Molecular Biology. 1996. 261: p.65 8-671.

66. Perez J., Vachette P., Russo D., Desmadril M. and Durand D. Heat-induced unfolding of neocarzinostatin, a small all-b protein investigated by small angle X-ray scattering. Journal of Molecular Biology. 2001. 308: p.721-743.

67. Laughlin R. B. et al Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2000. 97: p.32-37.

68. Akiyama S., Takahashi S., Kimura Т., Ishimori K., Morishima I.x Nishikawa Y., Fujisawa T. Conformational landscape of cytochrome с folding studied by microsecond-resolved smallangle X-ray scattering. Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99:p. 1329-1334.

69. Segel D.J., Eliezer D., Uversky V., Fink A.L., Hodgson K.O., Doniach S. Transient dimer in the refolding kinetics of cytochrome с characterized by small-angle X-ray scattering. Biochemistry. 1999, 38: p.l5352-15359.

70. Levinthal C. Mossbauer Spectroscopy in Biological Systems ed P DeBrunner et al (Urbana, IL: University of Illinois Press). 1969. p. 22-24.

71. Brooks C.L. Viewing protein folding from many perspectives. Proc Natl Acad Sci USA. 2002. 99: p. 1099-1100.

72. Rochet J-C. and Lansbury P.T.Jr. Amiloid fibrillogenesis: themes and variations. Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. 10: p.60-68.

73. Svergun D.I. and Koch M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Rep. Prog. Phys. 2003. 66: p. 1735-1782.

74. Koch M.H. J., Vachette P. and Svergun D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution Quarterly Reviews of Biophysics. 2003. 36,2: p. 147-227.

75. Svergun D. I. and Koch M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Cur. Opin. Struct. Biol. 2002.12: p.654-660.

76. Petrascu A.M., Koch M.H.J, and Gabriel A. A beginners' guide to gas-filled proportional detectors with delay line readout J. Macromol. Sci. Phys. 1998. B37(4): p.463-483.

77. Rindl A., Perez-Mendez V.and R.I. Wallace, Nuclear Instrum. and Methods. 1970. 77: p.325.

78. Gabriel A. Position sensitive X-ray detector. Rev. Sci. Instrum. 1977. 48: p.1303

79. Golding F., 2002 Personal communication.

80. Bordas J., Koch M.H.J., Clout P.N., Dorrington E., Boulin C. and Gabriel A. A synchrotron radiation camera and data acquisition system for time resolved x-ray scattering studies. J. Phys. E: Sci. Instrum. 1980. 3: p.938-944.

81. Strunz P., Saroun J., Keiderling U.,Wiedenmann A. and Przenioslo R. General formula for determination of cross-section from measured SANS intensities J.Appl. Cryst. 2000. 33: p.829-833.

82. Bevington P. B. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. 1969. New York: McGraw-Hill.

83. Porod G. General Theory, in Small-Angle X-ray Scattering, edited by O.Glatter and O. Kratky. 1982. London: Academic Press.

84. Dennis J., Gay D. and Welsch R. ACM Trans. Math. Soft. 1981. 7: p.348-383.

85. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard T. and Chothia C. J. Mol. Biol. 1995. 247: p.536-540.

86. Pearl F.M.G., Lee D., Bray J.E., Sillitoe I., Todd A.E., Harrison A.P., Thornton J.M. and Orengo C.A. Nucleic Acids Research. 2000. 28(1): p.277-282.

87. Sokolova A.V., Volkov V.V. and Svergun D.I. Prototype of a database for rapid protein classification based on solution scattering data. J. Appl. Cryst. 2003. 36: p.865-868.

88. Соколова A.B., Волков B.B., Свергун Д.И. База данных для быстрой классификации белков по данным рентгеновского малоулового рассеяния. Кристаллография (2003) №6, 49: 959-964

89. Henrick K., Newman R., Tagari M., Chagoyen M. EMDepia web-based system for the deposition and validation of high-resolution electron microscopy macromolecular structure information. J Struct Biol. 2003. 144: p.228-237.

90. Krissnel, E. and Henrick K. Structure recognition based on a new algorithm for common subgraph isomorphism. Bioinformatics. 2003. in press

91. Krissinel E. and Henrick K. Common subgraph isomorphism detection by backtracking search. Software Practics and Experience, 2004. in press.

92. Holm L. and Sander C. Protein structure comparison by alignment of distance matrices. J. Mol. Biol. 1993. 233: p.123-138.

93. Olsen R. H., Siak J. and Gray R. H. Characteristics of PRD1, a plasmid-ц dependent broad host range DNA bacteriophage. J. Virol. 1974. 14: p.689-699.

94. Bamford D.H. and Mindich L. Structure of the Lipid-Containing Bacteriophage PRD1: Disruption of Wild-Type and Nonsense Mutant Phage

95. Particles with Guanidine Hydrochloride Journal of virology, Dec. 1982, p. 1031-1038.

96. Bamford D.H., Caldentey J. and Bamford J.K.H. Bacteriophage PRDI: a broad host range dsDNA tectivirus with an internal membrane. Adv. Virus Res. 1995.45: p.281-319.

97. Benson S.D., Bamford J.K.H., Bamford D.H. and Burnett R.M. Viral evolution revealed by bacteriophage PRDI and human adenovirus coat protein structures. Cell. 1999. 98: p.825-833.

98. Athappilly F.K., Murali R., Rux J.J., Cai Z. and Burnett R.M. The refined crystal structure ofhexon, the major coat protein of adenovirus type 2, at 2.9 Л resolution. J. Mol. Biol. 1994. 242: p.430-455.

99. Bamford D.H., Caldentey J. and Bamford J.K.H. Bacteriophage PRDI: a broad host range dsDNA tectivirus with an internal membrane. Adv. Virus Res. 1995. 45: p.281-319.

100. Rydman P.S., Caldentey J., Butcher S.J., Fuller S.D., Rutten T. and Bamford D.H. Bacteriophage PRDI contains a labile receptor-binding structure at each vertex. J. Mol. Biol. 1999. 291: p.575-587.

101. Grahn A.M., Caldentey J., Bamford J.K.H. and Bamford D.H. Stable packaging of phage PRDI DNA requires adsorption protein P2, which binds to the IncP plasmid-encoded conjugative transfer complex. J. Bacteriol. 1999. 181: p.6689-6696.

102. Chiu C.Y., Mathias P., Nemerow G.R. and Stewart P.L. Structure of adenovirus complexes with its internalization receptor, integrin. Journal of Virology. August 1999. No. 8, 73: p.6759-6768.

103. Rux J.J. and Burnett R.M. Type-specific epitope locations revealed by X-ray crystallographic study of adenovirus type 5 hexon. Mol. Ther. 2000.1: p. 18-30.

104. Shayakhmetov D.M. and Lieber A. Dependence of Adenovirus Infectivity on Length of the Fiber Shaft Domain. Journal of Virology. November 2000, No. 22. 74: p. 10274-10286.

105. Wu E., Pache L., Von Seggern D.J., Mullen T.-M., Mikyas Y., Stewart P.L. and Nemerow G.R. Flexibility of the Adenovirus Fiber Is Required for Efficient Receptor Interaction. Journal of Virology. July 2003, No. 13, 77: p. 7225-7235

106. Stromsten N.J., Bamford D.H. and Bamford J.K. H. The Unique Vertex of Bacterial Virus PRD1 Is Connected to the Viral Internal Membrane. Journal of Virology. June 2003, No. 11. 77: p. 6314-6321.

107. Caldentey J., Tuma R., Bamford D.H. Assembly of bacteriophage PRD1 spike complex: role of the multidomain protein P5 Biochemistry. 2000. 39: p. 10566 -10573.

108. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. 1998. Москва, "Высшая школа".

109. Bloomfield V.A., Dalton W.O. and Van Holde K.E. Frictional coefficients of multisubunit structures. I. Theory. Biopolymers. 1967. 5: p.135-148.

110. Garcia de la Torre J., Building hydrodynamic bead-shell models for rigid bioparticles of arbitrary shape. Biophys. Chem. 2001. 94: p. 265-274.

111. Garcia de la Torre J., Navarro S., Lopez Martinez M.C., Diaz F.G. and Lopez Cascales J.J. HYDRO: a computer software for the prediction of hydrodynamic properties of macromolecules. Biophysical Journal. 1994. 67 (5): p. 530-521.

112. Sokolova A.V., Malfois M., Caldentey J., Svergun D.I., Koch M.H.J, Bamford D.H. and Tuma R. Solution structure of bacteriophage PRDI vertex complex, J. Biol. Chem. No 49, Issue of December, 276: p. 46187 46195.

113. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. 1994. Москва, Мир.

114. Strelkov S.V., Herrmann Н. and Aebi U. Molecular architecture of intermediate fdaments BioEssays. 2003. 25: p. 243-251.

115. Herrmann H, Aebi U. Intermediate filaments and their associates: multitalented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr Opin Cell Biol. 2000.12: p.79-90.

116. Yoon K.H., Yoon M., Moir R.D., Khuon S., Flitney F.W., Goldman R.D. Insights into the dynamic properties of keratin intermediate filaments in living epithelial cells. J Cell Biol. 2001. 153: p.503-516.

117. Steinmetz M.O., Hoenger A., Tittmann P., Fuchs K.H., Gross H., Aebi U. An atomic model of crystalline actin tubes: combining electron microscopy with X-ray crystallography. J. Mol. Biol. 1998. 278: p.703-711.

118. Nogales E., Wolf S.G., Downing K.H. Structure of the alpha beta tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 1998. 391: p. 199-203.

119. Gigant В., Curmi P.A., Martin-Barbey C., Charbaut E., Lachkar S., Lebeau L., Siavoshian S., Sobel A., Knossow M. The 4 Angstroms X-ray structure of a tubulin: stathmin-like domain complex. Cell. 2000. 102: p.809-816.

120. Parry D.A.D. and Steinert P.M. Intermediate filament structure. 1995. Springer, Berlin.

121. Fuchs E., Weber K. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. Annu Rev Biochem. 1994. 63: p.345-382.

122. Geisler N., Weber K. The amino acid sequence of chicken muscle desmin provides a common structural model for intermediate filament proteins. EMBO J. 1982. 1: p.1649-1656.

123. Sasse В., Aebi U. and Stuurman N. A tailless Drosophila lamin Dmo fragment reveals lateral associations of dimmers. J.Structural Biology. 1998.123: p.56-66.

124. Parry D.A.D., Steinert P.M. Intermediate filaments: molecular architecture, assembly, dynamics and polymorphism. Q Rev Biophys. 1999. 32: p. 99-187.

125. Heins S., Aebi U. Making heads and tails of intermediate filament assembly, dynamics and networks. Curr Opin Cell Biol. 1994. 6: p. 25-33.

126. Lupas A. Coiled coils: new structures and new functions. Trends Biochem Sci. 1996. 21: p.375-382.

127. Burkhard P., Stetefeld J., Strelkov S.V. Coiled coils: a highly versatile protein folding motif. Trends Cell Biol. 2001.11: p.82-88.

128. Crick F.H.C. Is alpha-keratin a coiled coil. Nature. 1952. 170: p.882-883.

129. Strelkov S.V., Herrmann H., Geisler N., Wedig Т., Zimbelmann R., Aebi U., Burkhard P. Conserved segments IA and 2 В of the intermediate filament dimer: their atomic structures and role in filament assembly. EMBO J. 2002. 21: p. 12551266.

130. Herrmann H. et al. The intermediate filament protein consensus motif of helix 2B: its atomic structure and contribution to assembly. J Mol Biol. 2000. 298: p.817-832.

131. Strelkov S.V., Herrmann H., Geisler N., Lustig A., Ivaninskii S., Zimbelmann R., Burkhard P., Aebi U. Divide-and-conquer crystallographic approach towards an atomic structure of intermediate filaments. J Mol Biol. 2001. 306: p.773-781.

132. Soellner P., Quinlan R.A., Franke W.W. Identification of a distinct soluble subunit of an intermediate filament protein: tetrameric vimentin from living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1985. 82: p.7929-7933.

133. Herrmann H., Aebi U. Intermediate filament assembly: temperature sensitivity and polymorphism. Cell Mol Life Sci. 1999. 55: p. 1416-1431.

134. Hermann H., Hesse M., Reichenzeller M., Aebi U., Magin T.M. Functional Complexity of Intermediate Filament Cytoskeletons: from structure to assembly to gene ablation. International review of cytology. 2003. 233, p.83-175

135. Parry D.A., Marekov L.N., Steinert P.M. Subfilamentous profibril structures in fibrous proteins. J Biol Chem. 2002. 276: p. 39253-39258.

136. Aebi U., Fowler W.E., Rew P., Sun T.T. The fibrillar substructure of keratin filaments unraveled. J Cell Biol. 1983. 97: p. 1131-1143.

137. Herrmann H., Aebi U. Intermediate filament assembly: fibrillogenesis is driven by decisive dimer-dimer interactions. Curr Opin Struct Biol. 1998. 8: p. 177-185.

138. Geisler N., Schunemann J., Weber K. Chemical cross-linking indicates a staggered and antiparallel protofilament of desmin intermediate filaments and characterizes one higher-level complex between protofilaments. Eur J Biochem. 1992. 206: p.841-852.

139. Steinert P.M., Marekov L.N., Parry D.A. Diversity of intermediate filament structure. Evidence that the alignment of coiled-coil molecules in vimentin is different from that in keratin intermediate filaments. J Biol Chem. 1993. 268: p.24916-24925.

140. Sali A., Glaeser R., Earnest Т., Baumeister W. From words to literature in structuralproteomics. Nature. 13 march 2003. 422: p.216 224.

141. Sanchez R., Pieper U., Melo F., Eswar N., Marti-Renom M.A., Madhusundhan M.S.,Mirkovic N., Sali A. Protein structure modeling for structural genomics. Nature. November 2000. p. 986 990.

142. Jones D.T. Protein structure prediction in the postgenomic era. Current opinion in structural biology. 2000.10: p.371 379.

143. Brenner S.E., Levitt M. Expectations from structural genomics. Protein Science. 2000. 9: p.197 200.154. Соколова A.B.

144. Тезисы Конференции студентов и аспирантов по химии и физике биополимеров. (Пущино, Россия) Июнь 1999, с.30

145. Свергун Д.И., Волков В.В., Кёниг С., Козин М.Б., Кох М., Мелик-Адамян В.Р., Петухов М.В., Соколова А.В.

146. Тезисы Второго биофизического съезда (Москва) Август 1999, с.20-21

147. Соколова А.В., Свергун Д.И., Тума Р.

148. Тезисы Третьей национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2001» (Москва) май, 2001, с.277

149. Sokolova A.V., Volkov V.V., Svergun D.I.

150. Тезисы конференции "SAS 2002": XII International conference on Small-Angle Scattering. August 2002, Venice, Italy, p. 176

151. Соколова A.B, Стрелков C.B, Свергун Д.И.

152. Тезисы Четвертой национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2003» (Москва) ноябрь 2003, с. 304

153. Соколова А.В., Волков В.В., Свергун Д.И.

154. Тезисы Четвертой национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЭ-2003». (Москва) ноябрь 2003, с. 322

155. Петухов М.В., Соколова А.В., Конарев П.В., Козин М.Б., Волков В.В., Свергун Д.И.

156. Тезисы Четвертой национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов «РСНЕ-2003» (Москва) ноябрь 2003, с. 348

157. Zou P., Gautel М., Geerlof М., Wilmanns М., Koch М. Н. J. and Svergun D. I. Solution scattering suggests cross-linking function of telethonin in the complex with titin. J. Biol. Chem. 2003. 278: 2636-44.