Разработка и применение новых методов анализа третичной и четвертичной структуры белков по данным малоуглового рентгеновского рассеяния тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Традиционные методы анализа кривых малоуглового рассеяния.

1.2 Ab initio определение формы частиц.

1.3 Расчет кривых малоуглового рассеяния от известных атомных структур.

1.4 Метод молекулярной тектоники. Рассеяние гетеро- и гомодимерами.

Глава 2 Использование ограничений на симметрию и анизометрию частицы при ab initio определении формы программой DAMMIN.

2.1 Учет симметрии и анизометрии в программе DAMMIN.

2.2 Примеры использования симметрии и анизометрии при ab initio определении формы.

2.2.1 Восстановление формы димера пируват декарбоксилазы из пивных дрожжей.

2.2.2 Восстановление формы тетрамера пируват оксидазы из Lactobacillus plantarum.

2.2.3 Восстановление формы VI АТФазы из Manduca sexta.

Глава 3 Ab initio определение доменной структуры белков по данным рассеяния растворами.

3.1 Ограничения ab initio определения формы.

3.2 Модель свободных виртуальных аминокислотных остатков с ограничениями на локальную цепочечность.

3.3 Алгоритм минимизации.

3.4 Примеры применения техники виртуальных остатков.

3.4.1 Исследование структуры лизоцима из куриного яичного белка.

3.4.2 Исследование альбумина сыворотки крови.

3.4.3 Исследование гексокиназы из дрожжей.

3.4.4 Исследование пируват декарбоксилазы из пивных дрожжей.

3.4.5 Исследование структуры хитин-связывающего белка из Streptomyces

История современной физической науки показывает, что рентгеновское излучение является эффективным средством для физической, химической, биологической и структурной характеризации вещества. Например, рентгеновская флуоресценция широко используется для качественного и количественного анализа вещества, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия может использоваться для изучения электронной структуры вещества. Рентгеновская кристаллография позволяет определять трехмерные структуры на атомном разрешении, а различные методики рентгеновского рассеяния дают структурную информацию для аморфных материалов с разной степенью разрешения.

Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУР), представляющее собой центральную часть дифракционной картины, также позволяет исследовать вещества самой разнообразной структуры, в которых характерные размеры неоднородностей лежат в диапазоне 1-й О3 нм. Чем больше размер рассеивающего объекта, тем в меньшем угловом интервале сосредоточено рассеянное излучение, и рассеяние на малые углы (меньше нескольких градусов) несет информацию о "крупномасштабном" (по отношению к длине волны излучения А,) рассеивающем ансамбле. В структурном анализе вещества с помощью рентгеновского и нейтронного рассеяния А, ~ 0.1-И нм, что по порядку величины совпадает с межатомными расстояниями. Таким образом, МУР дает информацию о надатомной структуре вещества.

Метод малоуглового рассеяния применяется к следующим классам объектов: Биологически активные соединения. С помощью малоуглового рассеяния изучается строение биологических макромолекул и их комплексов (белков, нуклеиновых кислот, вирусов, мембран и др.) При этом удается исследовать строение частиц в водно-солевых растворах, то есть в условиях, приближенных к условиям их функционирования.

Жидкости, полидисперсные коллоидные системы и аморфные тела. Применение малоуглового рассеяния дает возможность анализа термодинамических характеристик и кластерной структуры жидкостей, флуктуации плотности и разделения фаз в стеклах и других аморфных телах.

Полимерные соединения. Малоугловым рассеянием исследуются особенности укладки и общие характеристики натуральных и синтетических полимеров, как в растворах, так и в твердом состоянии.

Поликристаллические и пористые вещества, сплавы, порошки. Малоугловое рассеяние позволяет исследовать различные характеристики дисперсной структуры твердых тел - пределы растворимости в твердых растворах, размеры зерен в порошках, пор в пористых веществах, кристаллитов в поликристаллах, дефекты в металлах.

Использование синхротронных источников рентгеновского излучения значительно расширило применение малоуглового рассеяния в структурных исследованиях. Преимущество синхротронного излучения (СИ) по сравнению с излучением рентгеновских трубок определяется значительно более высокой интенсивностью непрерывного рентгеновского спектра и отсутствием в СИ характеристических линий, которые затрудняют вариацию длин волн (например, при исследовании рентгеновских спектров поглощения и рассеяния с использованием рентгеновских трубок). Излучение в рентгеновских трубках происходит при резком торможении электронов, летящих со скоростью порядка 104 м/с, в тонком слое металла, и при этом практически вся энергия электронов превращается в тепло, что и ограничивает мощность рентгеновского пучка. В случае синхротронного ускорителя коротковолновое электромагнитное излучение возникает при движении электрона с ускорением при релятивистских скоростях. Эффективность СИ вызвана сочетанием следующих важнейших для структурных приложений свойств: очень высокая интенсивность рентгеновского излучения очень широкий спектральный интервал малая угловая расходимость малый размер фокуса высокая степень поляризации периодическое прерывание пучка во времени Каждое из этих свойств и комбинация ряда из них позволили ставить исследования фундаментального и прикладного плана, немыслимые до применения синхротронного излучения. Для малоуглового рассеяния пока используется главным образом высокая интенсивность пучка, его малая угловая расходимость, широкий спектральный интервал. Область длин волн в синхротронных источниках охватывает интервал от жесткого рентгеновского излучения до диапазона вакуумного ультрафиолетового излучения. Одной из наиболее перспективных областей применения малоуглового рассеяния (МУР) рентгеновского синхротронного излучения является изучение нативных биополимеров в растворе. Особое развитие в последние десятилетия получила методика исследования с помощью МУР белковых макромолекул. Актуальность таких исследований обусловлена тем обстоятельством, что строение макромолекул и структурный механизм их функционирования определяется в условиях, максимально приближенных к физиологическим, тогда как белковая кристаллография применима лишь к кристаллическим объектам, а методы электронной микроскопии и электронной дифракции требуют специальной обработки образцов, что может приводить к неконтролируемому изменению структуры. Кроме того, МУР позволяет исследовать структурные перестройки, вызванные изменением условий эксперимента. Несмотря на успехи в развитии экспериментальной аппаратной составляющей метода МУР остается много нерешенных проблем с вычислительно-интерпретационной стороной исследований. Таким образом, исследование структуры биологических макромолекул методом МУР, использующим синхротронное излучение и развитие новых методов моделирования является весьма актуальной задачей.

В настоящей диссертационной работе представлены новые методы анализа структуры белка по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием синхротронного излучения и результаты их применения для анализа третичной и четвертичной структуры белков в широком диапазоне молекулярных масс и принадлежащих различным семействам, что позволило наиболее полно оценить значимость развитых алгоритмов. Первая глава посвящена обзору литературы по теме малоуглового рассеяния и его применения к анализу структуры биологических объектов. Рассмотрены общие методики и конкретные алгоритмы, используемые в данной диссертационной работе, а также подходы, которые были модифицированы и усовершенствованы в рамках настоящего исследования.

Во второй главе описан метод аЪ initio определения формы белков по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием модели конечных объемных элементов. Показана необходимость учета дополнительной информации, о симметрии и/или анизометрии частицы, для получения более достоверных результатов анализа трехмерной структуры низкого разрешения. Приведены примеры определения формы нескольких белков без и с включением дополнительной информации. На основе полученных результатов сделан вывод о том, что использование симметрийных ограничений и анизометрии позволяет снизить количество независимых параметров, описывающих модель на данном уровне разрешения, и, в конечном счете, уменьшить неоднозначность восстановления формы. Немаловажным здесь также является ускорение вычислений, что приводит к существенному уменьшению времени расчета моделей.

В третьей главе представлен новый метод, разработанный для ab initio определения доменной структуры белков. Для этой цели предложена модель свободных виртуальных аминокислотных остатков, соответствующая более высокому разрешению, нежели в случае восстановления формы. Таким образом, для нахождения искомой модели используется более широкий диапазон экспериментальных данных рассеяния; кроме того, в алгоритм поиска включено требование выполнения условия локальной цепочечности модели. В данном методе также предусмотрена возможность учета симметрии. Эффективность предложенных методов проиллюстрирована на тестовых примерах для белков с известной структурой в кристалле и на примерах построения моделей белков с неизвестной кристаллической структурой по экспериментальным данным рассеяния растворами, полученным с использованием рентгеновского синхротронного излучения.

Четвертая глава посвящена дальнейшему развитию метода определения доменной структуры белка для дополнения структур высокого разрешения, полученных другими методами, например, с помощью белковой кристаллографии или ядерного магнитного резонанса (ЯМР), у которых не определен фрагмент полипептидной цепи или же не известна структура целого домена. Для данной цели модель аминокислотных остатков может быть дополнена информацией о первичной последовательности белка и наборе элементов вторичной структуры (а-спирали и р-листы), а также наложен ряд ограничений связанных с особенностями свертывания полипептидной цепи. Возможности данной методики продемонстрированы как на тестовых моделях, так и на применении к реальным белкам для определения конформации линкеров, подвижных периферийных участков цепи и структуры доменов в слитых белках.

Расширение возможностей описания структуры белка, которое достигается при исследовании дополняющими друг друга методами высокого и низкого разрешения: белковой кристаллографии, ЯМР и малоуглового рассеяния показано в пятой главе. Представлен метод молекулярной тектоники, позволяющий моделировать четвертичную структуру многочастичных белков в растворе с использованием известных структур высокого разрешения их субъединиц. Здесь же описаны свойства и возможности разработанного автором нового программного пакета MASSHA (аббревиатура от английского Manipulation of Atomic Structures and SHape Analysis), предназначенного для моделирования трехмерных макромолекулярных структур по данным малоуглового рассеяния, и описаны результаты исследований данным методом тиаминдифосфат-зависимых белков, давшие ценную информацию о четвертичной структуре исследуемых белков в растворе и характера различий кристалл-раствор.

Таким образом, в настоящей диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. Учет симметрии и анизометрии при восстановлении формы частиц по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с применением метода конечных объемных элементов.

2. Разработка нового подхода к ab initio определению доменной структуры белков в растворе, основанного на представлении белковой модели как совокупности виртуальных аминокислотных остатков.

3. Разработка методов уточнения и дополнения моделей белков высокого и низкого разрешения путем определения конформации их подвижных фрагментов и доменной структуры недостающих субъединиц.

4. Разработка программного пакета для уточнения четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники, предусматривающего возможность как интерактивного, так и автоматического моделирования.

5. Исследование с помощью предложенных методов широкого спектра белков как с известной (тиаминдифосфат-зависимые ферменты, лизоцим, альбумин, гексокиназа и др.), так и неизвестной или частично известной (VI АТФаза, хитин-связывающий белок СНВ1, S-трансфераза и др.) структурой в кристалле.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Учет априорной информации о симметрии и анизометрии частицы позволяет получать более достоверные результаты при анализе трехмерной структуры низкого разрешения.

2. Развит новый подход к моделированию экспериментальной интенсивности в области средних углов с помощью техники виртуальных остатков, позволяющий восстанавливать ab initio доменную структуру белков в растворе с разрешением до 1 нм.

3. Развиты методы определения конформации неизвестных фрагментов (в частности, подвижных периферийных участков цепи и структуры доменов в слитых белках) в неполных моделях белков высокого и низкого разрешения.

4. Разработано программное обеспечение для анализа данных рассеяния рентгеновского синхротронного излучения растворами белков, реализующего предложенные методы.

5. Разработан программный пакет MASSHA для уточнения четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники, обеспечивающего улучшенные возможности для комбинирования интерактивного и автоматического моделирования, а также учета симметрии второго порядка, для Wintel платформы.

6. Применение предложенных методов позволило получить ценную структурную информацию о строении ряда белковых макромолекул в растворе.

Основные результаты исследования тиаминдифосфат-зависимых ферментов

PDCZym POX TRK PDC (н) PDC (a)

М, кДа 244 261 148 236 245

Дг, нм 0.19 0.21 0.20 0.23 0.24

S, нм 44.05 42.68 43.90 13.44 19.20

Xcryst 0.88 1.63 2.10 1.68 3.50

Xsol - 1.43 1.57 0.94 1.17

Да - 3° 23° -20°

Дг, нм - 0.4 0.35 -0.77 r.m.s.d., нм 0.23 0.62 0.58 2.0

М - молекулярная масса

Дг - разрешение набора кристаллографических данных S - площадь взаимодействия между субъединицами Xcryst - значение невязки для кристаллографической модели Xsoi - значение невязки для уточненной модели в растворе Да - разворот доменов друг относительно друга вокруг оси Z Дг - изменение расстояния между доменами вдоль Z r.m.s.d. - среднеквадратичное отклонение между координатами атомов кристаллографической структуры и модели в растворе

Примечание: структурные изменения кристалл-раствор для активированной пируват декарбоксилазы не могут быть описаны двумя параметрами Да и Az.

Заключение

В настоящей диссертационной работе были проведены систематические исследования структуры белков. Для анализа данных малоуглового рассеяния были усовершенствованы уже имеющиеся и разработаны новые методы, позволяющие существенно улучшить достоверность результатов. Среди предложенных подходов для интерпретации экспериментальных данных рассеяния представлены как ab initio методы, позволяющие восстанавливать трехмерную структуру белка без какой-либо априорной информации об объекте, так и метод молекулярной тектоники для уточнения известных кристаллографических моделей многочастичных белков и проведения сравнительного анализа кристалл-раствор. Были разработаны программные пакеты для ab initio анализа данных малоуглового рассеяния (DAMMIN, GASBOR, CREDO, CHADD, GLOOPY, CHARGE). Все они работают на большинстве UNIX платформ, а также на Wintel платформе, что делает доступным анализ данных и моделирование для огромного количества пользователей персональных компьютеров.

В рамках диссертационной работы метод ab initio определения формы с использованием конечных объемных элементов был дополнен возможностью учета симметрии и анизометрии при моделировании трехмерной структуры, что важно для уменьшения неоднозначности восстановления формы. В данной диссертационной работе предложен общий подход для моделирования экспериментальной интенсивности в области средних углов с помощью техники виртуальных остатков. Проведенное исследование показало возможность определения не только формы белка, но и его доменной структуры по данным рентгеновского рассеяния растворами.

Проведенное в настоящей диссертационной работе моделирование при помощи специально разработанных методов дало возможность дополнить известные структуры ряда белков путем определения конформации их подвижных фрагментов и доменной структуры недостающих субъединиц. Для уточнения четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники разработан программный пакет MASSHA, работающий на IBM-PC. Программный пакет имеет ряд уникальных свойств. MASSHA обеспечивает улучшенные средства для комбинирования интерактивного и автоматического моделирования и практически очень важную возможность для учета симметрии второго порядка. Еще одним уникальным свойством программы MASSHA является автоматическое совмещение объектов. Данный программный пакет был применен для исследования методом малоуглового рассеяния четвертичной структуры тиаминдифосфат-зависимых ферментов. Были получены важные результаты, позволившие получить ценную информацию о взаимном расположении доменов белков в растворе. Анализ данных позволил объяснить изменение активности белков в растворе, а также возможность их участия в каталитических реакциях.

Во всех вышеописанных методах поиск оптимальных значений варьируемых параметров проводился путем минимизации нелинейного функционала среднеквадратичных отклонений. Варьируемыми параметрами в случае ab initio методов являются координаты конечных объемных элементов или остатков, в случае метода молекулярной тектоники этот набор дается тремя линейными и тремя угловыми координатами смещения.

Таким образом, краткий перечень основных результатов диссертационной работы выглядит следующим образом:

1. Установлено, что учет возможной симметрии и анизометрии белка позволяет уменьшить неоднозначность восстановления формы и значительно сократить время, необходимое для расчета моделей.

2. Предложен общий подход моделирования экспериментальной интенсивности в области средних углов с помощью техники виртуальных остатков. Проведенное исследование показало возможность определения не только формы белка, но и его доменной структуры по данным рентгеновского рассеяния растворами.

3. Разработан метод построения неизвестных фрагментов в частично определенных моделях белков высокого и низкого разрешения.

4. Предложена стратегия моделирования четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники по данным малоуглового рассеяния включающая автоматический и интерактивный поиск.

5. Получен ряд новых результатов о четвертичных структурах белковых макромолекул в растворе, в частности, показано, что отличия в четвертичной структуре между кристаллом и раствором зависят от площади поверхности взаимодействия субъединиц.

6. Предложенные методы реализованы в виде соответствующих компьютерных программ (Таблица 3) на платформах IBM-PC, LINUX и UNIX. Программы доступны на http://www.embl-hamburg.de/ExternalInfo/Research/Sax/program.html.

1. Д.И. Свергун, J1.A. Фейгин. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. 1986, Москва: Наука.

2. Guinier, A., Ann. Phys. (Paris), 1939. 12: p. 161-237.

3. Porod, G., Die Rontgenkleinwinkelstreuung von dichtgepackten kolloiden Systemen, I. Kolloid-Z., 1951. 124: p. 83-114.

4. Svergun, D.I., A.V. Semenyuk, and L.A. Feigin, Small-angle scattering data treatment by the regularization method. Acta Crystallgr., 1988. A44: p. 244250.

5. Svergun, D.I., Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr., 1992. 25: p. 495-503.

6. Muller, J.J., G. Damaschun, and G. Hubner, Acta Biol. Med. Germ., 1979. 38: p. 1-10.

7. Debye, P., Zerstreuung von Roentgenstrahlen. Ann. Physik, 1915. 46: p. 809823.

8. Muller, J.J., Calculation of scattering curves for macromolecules in solution and comparaison with results of methods using effective atomic scattering factors. J. Appl. Cryst., 1983.16: p. 74-82.

9. Svergun, D.I., Solution scattering from biopolymers: advanced contrast variation data analysis. Acta Crystallogr., 1994. A50: p. 391-402.

10. Ibel, K., Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. J Mol Biol, 1975. 93(2): p. 255-65.

11. Stuhrmann, H.B., et al., New low resolution model for 50S subunit of Escherichia coli ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA, 1976. 73(7): p. 237983.

12. Stuhrmann, H.B., et al., Determination of the distribution of protein and nucleic acid in the 70 S ribosomes of Escherichia coli and their 30 S submits by neutron scattering. J Mol Biol, 1978. 119(2): p. 203-12.

13. Koch, M.H., et al., A contrast variation study of Escherichia coli ribosomes reassembled from protonated and deuterated subunits. Biophys Struct Mech, 1978. 4(3): p. 251-62.

14. Stuhrmann, H.B., Interpretation of small-angle scattering of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering functions. ActaCryst., 1970. A26: p. 297-306.

15. Svergun, D.I. and H.B. Stuhrmann, New developments in direct shape determination from small-angle scattering 1. Theory and model calculations. Acta Crystallogr., 1991. A47: p. 736-744.

16. Svergun, D.I., et al., New developments in direct shape determination from small-angle scattering 2. Uniqueness. Acta Crystallogr., 1996. A52: p. 419426.

17. Svergun, D.I., Restoring three-dimensional structure of biopolymers from solution scattering. J. Appl. Crystallogr., 1997. 30: p. 792-797.

18. Svergun, D.I., et al., Shape determination from solution scattering of biopolymers. J. Appl. Crystallogr., 1997. 30: p. 798-802.

19. Walther, D., F.E. Cohen, and S. Doniach, Reconstruction of low-resolution three-dimensional density maps from one-dimensional small-angle X-ray solution scattering data for biomolecules. J. Appl. Crystallogr., 2000. 33: p. 350-363.

20. Kirkpatrick, S., C.D. Gelatt, Jr., and M.P. Vecci, Optimization by simulated annealing. Science, 1983. 220: p. 671-680.

21. Svergun, D.I., A direct indirect method of small-angle scattering data treatment. J. Appl. Crystallogr., 1993. 26: p. 258-267.

22. Press, W.H., et al., Numerical Recipes. 1992, Cambridge: University Press.

23. Ingber, L., Simulated annealing: practice versus theory. Math. Computer Modeling, 1993.18: p. 29-57.

24. Kozin, M.B. and D.I. Svergun, Automated matching of high- and low-resolution structural models. J. Appl. Crystallogr., 2001. 34: p. 33-41.

25. Svergun, D.I., С. Barberato, and M.H.J. Koch, CRYSOL a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J. Appl. Crystallogr., 1995. 28: p. 768-773.

26. Fedorov, B.A., L.A. Voronin, and O.B. Ptitsyn, X-ray diffuse scattering by polypeptides and proteins in solution. IV. Consideration of the solvent effect for globular protein solutions., Mol Biol, 1974. 8(5): p. 693-702.

27. Fedorov, B.A. and A.I. Denisyuk, J. Appl. Cryst., 1978. 11: p. 473-477.

28. Svergun, D.I., et al., Large differences are observed between the crystal and solution quaternary structures of allosteric aspartate transcarbamylase in the R state. Proteins, 1997. 27(1): p. 110-7.

29. Schoenbrunn, E., et al., Studies on the conformational changes in the bacterial cell wall biosynthetic enzyme UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyltransjerase (MurA). Eur J Biochem, 1998. 253(2): p. 406-12.

30. Svergun, D.I., et al., Protein hydration in solution: experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(5): p. 2267-72.

31. Lattman, E.E., Rapid calculation of the solution scattering profile from a macromolecule of known structure. Proteins, 1989. 5(2): p. 149-55.

32. Edmonds, A.R., Angular momentum in quantum mechanics. Investigations in physics ; 4. 1957, Princeton, N.J.: Princeton University Press. 146.

33. Stuhrmann, H.B., Ein neues Verfahren zur Bestimmung der Oberflaechenform und der inneren Struktur von geloesten globularen Proteinen aus Roentgenkleinwinkelmessungen. Zeitschr. Physik. Chem. Neue Folge, 1970. 72: p. 177-198.

34. Bernstein, F.C., et al., The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J Mol Biol, 1977.112(3): p. 535-42.

35. Burley, S.K., An overview of structural genomics. Nat Struct Biol, 2000. 7 Suppl: p. 932-934.

36. Edwards, A.M., et al., Protein production: feeding the crystallographers and NMR spectroscopists In Process Citation., Nat Struct Biol, 2000. 7 Suppl: p. 970-2.

37. Svergun, D.I., et al., A model of the quaternary structure of the Escherichia coli F1 ATPase from X-ray solution scattering and evidence for structuralchanges in the delta subunit during ATP hydrolysis. Biophys J, 1998. 75(5): p. 2212-9.

38. Ashton, A.W., et al., Pentameric and decameric structures in solution of serum amyloid P component by X-ray and neutron scattering and molecular modelling analyses. J Mol Biol, 1997. 272(3): p. 408-22.

39. Krueger, J.K., et al., Structures of calmodulin and a functional myosin light chain kinase in the activated complex: a neutron scattering study. Biochemistry, 1997. 36(20): p. 6017-23.

40. Svergun, D.I., Mathematical methods in small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr., 1991. 24: p. 485-492.

41. Svergun, D.I., et al., Solution scattering from 50S ribosomal subunit resolves inconsistency between electron microscopic models. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(25): p. 11826-30.

42. Koenig, S., et al., Small-angle X-ray solution-scattering studies on ligand-induced subunit interactions of the thiamine diphosphate dependent enzyme pyruvate decarboxylase from different organisms. Biochemistry, 1998. 37(15): p. 5329-34.

43. Bada, M., et al., Solution structural studies and low-resolution model of the Schizosaccharomyces pombe sapl protein. J Mol Biol, 2000. 300(3): p. 56374.

44. Chacon, P., et al., Reconstruction of protein form with X-ray solution scattering and a genetic algorithm. J Mol Biol, 2000. 299(5): p. 1289-302.

45. Svergun, D.I., et al., Solution structure and conformational changes of the Streptomyces chitin-binding protein (CHB1). Biochemistry, 2000. 39(35): p. 10677-83.

46. Svergun, D.I., et al., Low resolution structure of the sigma54 transcription factor revealed by X-ray solution scattering. J Biol Chem, 2000. 275(6): p. 4210-4.

47. Koch, M.H.J, and J. Bordas, X-ray diffraction and scattering on disordered systems using synchrotron radiation. Nucl. Instrum. Methods, 1983. 208: p. 461-469.

48. Boulin, C., et al., Data appraisal, evaluation and display for synchrotron radiation experiments: hardware and software. Nucl. Instrum. Meth. A, 1986. 249: p. 399-407.

49. Boulin, C.J., et al., Data acquisition systems for linear and area X-ray detectors using delay line readout. Nucl. Instrum. Meth. A, 1988. 269: p. 312320.

50. Gabriel, A. and F. Dauvergne, The localization method used at EMBL. Nucl. Instrum. Meth., 1982. 201: p. 223-224.

51. Koenig, S., et al., The influence of the effectors of yeast pyruvate decarboxylase (PDC) on the conformation of the dimers and tetramers and theirpH-dependent equilibrium. EurBiophys J, 1993. 22(3): p. 185-94.

52. Arjunan, P., et al., Crystal structure of the thiamin diphosphate-dependent enzyme pyruvate decarboxylase from the yeast Saccharomyces cerevisiae at 2.3 A resolution. J Mol Biol, 1996. 256(3): p. 590-600.

53. Muller, Y.A. and G.E. Schulz, Structure of the thiamine- and flavin-dependent enzyme pyruvate oxidase. Science, 1993. 259(5097): p. 965-7.

54. Muller, Y.A., et al., The refined structures of a stabilized mutant and of wild-type pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum. J Mol Biol, 1994. 237(3): p. 315-35.

55. Svergun, D.I., et al., Quaternary structure of VI and F1 ATPase: significance of structural homologies and diversities. Biochemistry, 1998. 37(51): p. 17659-63.

56. Grueber, G., et al., Evidence for major structural changes in the manduca sexta midgut VI ATPase due to redox modulation. A SMALL ANGLE X-RAY SCATTERING STUDY In Process Citation., J Biol Chem, 2000. 275(39): p. 30082-7.

57. Radermacher, M., et al., Molecular architecture of Manduca sexta midgut VI ATPase visualized by electron microscopy. FEBS Lett, 1999. 453(3): p. 383-6.

58. Svergun, D.I., M.V. Petoukhov, and M.H.J. Koch, Determination of domain structure ofproteins from X-ray solution scattering. Biophys J, 2001. 80(6): p. 2946-53.

59. Subbiah, S., Low-resolution real-space envelopes: an approach to the ab initio macromolecular phase problem. Science, 1991. 252(5002): p. 128-33.

60. Diamond, R., Real-space refinement of the structure of hen egg-white lysozyme. J Mol Biol, 1974. 82(3): p. 371-391.

61. Sugio, S., et al., Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution. Protein Eng, 1999.12(6): p. 439-46.

62. Curry, S., et al., Crystal structure of human serum albumin complexed with fatty acid reveals an asymmetric distribution of binding sites. Nat Struct Biol, 1998. 5(9): p. 827-35.

63. Bennett, W.S., Jr. and T.A, Steitz, Structure of a complex between yeast hexokinase A and glucose. I. Structure determination and refinement at 3.5 A resolution. J Mol Biol, 1980. 140(2): p. 183-209.

64. Steitz, T.A., et al., High resolution x-ray structure of yeast hexokinase, an allosteric protein exhibiting a non-symmetric arrangement of subunits. J Mol Biol, 1976. 104(1): p. 197-22.

65. Svergun, D.I., et al., Crystal versus solution structures of thiamine diphosphate-dependent enzymes. J Biol Chem, 2000. 275(1): p. 297-302.

66. Huang, E.S., S. Subbiah, and M. Levitt, Recognizing native folds by the arrangement of hydrophobic and polar residues. J Mol Biol, 1995. 252(5): p. 709-20.

67. Sippl, M.J., Calculation of conformational ensembles from potentials of mean force. An approach to the knowledge-based prediction of local structures in globular proteins. J Mol Biol, 1990. 213(4): p. 859-83.

68. Miyazawa, S. and R.L. Jernigan, Self-consistent estimation of inter-residue protein contact energies based on an equilibrium mixture approximation of residues. PROTEINS:Structure, Function, and Genetics, 1999. 34: p. 49-68.

69. Thomas, P.D. and K.A. Dill, An iterative method for extracting energy-like quantities from protein structures. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(21): p. 11628-33.

70. Aszodi, A., M.J. Gradwell, and W.R. Taylor, Global fold determination from a small number of distance restraints. J. Mol. Biol., 1995. 251(2): p. 308-326.

71. Levitt, M., A simplified representation of protein conformations for rapid simulation of protein folding. J Mol Biol, 1976. 104(1): p. 59-107.

72. Irbaeck, A., et al., Local interactions and protein foldig: A three-dimensional offlatice approach. J. Chem. Phys., 1997. 107(1): p. 273-282.

73. Kleywegt, G.J., Validation of protein models from Calpha coordinates alone. J Mol Biol, 1997. 273(2): p. 371-376.

74. Cuff, J.A., et al., JPred: a consensus secondary structure prediction server. Bioinformatics, 1998.14(10): p. 892-3.

75. Cuff, J.A. and G.J. Barton, Evaluation and improvement of multiple sequence methods for protein secondary structure prediction. Proteins, 1999. 34(4): p. 508-19.

76. Cuff, J.A. and G.J. Barton, Application of multiple sequence alignment profiles to improve protein secondary structure prediction. Proteins, 2000. 40(3): p. 502-11.

77. Marquart, M., et al., The geometry of the reactive site and of the peptide groups in trypsin, trypsinogen and its complex with inhibitors. Acta Crystallogr B, 1983. 39: p. 480-490.

78. Svergun, D.I., et al., Conformation of the Drosophila motor protein non-claret disjunctional in solution from X-ray and neutron scattering. J Biol Chem, 2001. 276(27): p. 24826-32.

79. Kozielski, F., et al., The crystal structure of the minus-end-directed microtubule motor protein ncd reveals variable dimer conformations. Structure Fold Des, 1999. 7(11): p. 1407-16.

80. Logan, D.T., et al., Crystal structure of reduced protein R2 of ribonucleotide reductase: the structural basis for oxygen activation at a dinuclear iron site. Structure, 1996. 4: p. 1053-1064.

81. Germino, J. and D. Bastia, Rapid purification of a cloned gene product by genetic fusion and site- specific proteolysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1984. 81: p. 4692-4696.

82. Toye, В., et al., Immunologic characterization of a cloned fragment containing the species-specific epitope from the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Infect Immun, 1990. 58: p. 3909-3913.

83. Fikrig, E., et al., Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA. Science, 1990. 250: p. 553-556.

84. Kaelin, W.G., Jr., et al., Identification of cellular proteins that can interact specifically with the T/EIA-binding region of the retinoblastoma gene product. Cell, 1991. 64: p. 521-532.

85. Lira, K., et al., Three-dimensional structure of Schistosoma japonicum glutathione S- transferase fused with a six-amino acid conserved neutralizing epitope of gp41 from HIV. Protein Sci, 1994. 3: p. 2233-2244.

86. Zhang, Z., et al., Structure of the ankyrin-binding domain of alpha-Na,K-ATPase. J Biol Chem, 1998. 273: p. 18681-18684.

87. Ware, S., et al., Structure of the fibrinogen gamma-chain integrin binding and factor XHIa cross-linking sites obtained through carrier protein driven crystallization. Protein Sci, 1999. 8: p. 2663-2671.

88. Nagai, K. and H.C. Thogersen, Generation of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli. Nature, 1984. 309: p. 810-812.

89. Parker, M.W., M. Lo Bello, and G. Federici, Crystallization of glutathione S-transferase from human placenta. J Mol Biol, 1990. 213: p. 221-222.

90. Ji, X., et al., The three-dimensional structure of a glutathione S-transferase from the mu gene class. Structural analysis of the binary complex of isoenzyme 3- 3 and glutathione at 2.2-A resolution. Biochemistry, 1992. 31: p. 10169-10184.

91. Smith, D.B. and K.S. Johnson, Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 1988. 67: p. 31-40.

92. Sawaya, M.R. and J. Kraut, Loop and subdomain movements in the mechanism of Escherichia coli dihydrofolate reductase: crystallographic evidence. Biochemistry, 1997. 36(3): p. 586-603.

93. Kozin, M.B., V.V. Volkov, and D.I. Svergun, ASSA: a program for three-dimensional rendering in solution scattering from biopolymers. J. Appl. Crystallogr., 1997. 30: p. 811-815.

94. Kozin, M.B. and D.I. Svergun, A software system for automated and interactive rigid body modeling of solution scattering data. J. Appl. Crystallogr., 2000. 33: p. 775-777.

95. Konarev, P.V., M.V. Petoukhov, and D.I. Svergun, MASSHA a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering data. J. Appl. Crystallogr., 2001. 34: p. 527-532.

96. Foley, J.D., et al., Computer Graphics. Principles and practice. Second edition ed. 1990, New York: Addison-Wesley Publishing Company. 1175.

97. Frank, J., et al., SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol, 1996. 116(1): p. 190199.

98. Jones, T.A., J.-Y. Zou, and S.W. Cowan, Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst., 1991. A47: p. 110-119.

99. Sayle, R.A. and E.J. Milner-White, RASMOL: biomolecular graphics for all. Trends Biochem Sci., 1995. 20(9): p. 374-376.

100. Horton, R.M., Scripting Wizards for Chime and RasMol. Biotechniques, 1999. 26(5): p. 874-876.

101. Payne, D.J., Metallo-beta-lactamases—a new therapeutic challenge. J Med Microbiol, 1993. 39(2): p. 93-99.

102. Carfi, A., et al., 1.85 A resolution structure of zinc(II) beta-lactamase from Bacillius Cereus. Acta Cryst., 1998. 54: p. 313-318.

103. Wriggers, W., R.A. Milligan, and J.A. McCammon, Situs: A package for docking crystal structures into low-resolution maps from electron microscopy. J Struct Biol, 1999.125(2-3): p. 185-195.

104. Kleywegt, G.J. and T.A. Jones, Software for handling macromolecular envelopes. Acta Cryst., 1999. D55: p. 941-944.

105. Schellenberger, A., Special Issue: Thiamine Diphosphate. Biochim Biophys Acta, 1998. 1385(2): p. 173-428.

106. Dyda, F., et al., Catalytic centers in the thiamin diphosphate dependent enzyme pyruvate decarboxylase at 2.4-A resolution. Biochemistry, 1993. 32: p. 6165-6170.

107. Koenig, S., et al., Synchrotron radiation solution X-ray scattering study of the pH dependence of the quaternary structure of yeast pyruvate decarboxylase. Biochemistry, 1992. 31(37): p. 8726-31.

108. Dobritzsch, D., et al., High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Implications for substrate activation in pyruvate decarboxylases. J Biol Chem, 1998. 273(32): p. 20196-204.

109. Lindqvist, Y., et al., Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution. Embo J, 1992. 11(7): p. 2373-9.

110. Nikkola, M., Y. Lindqvist, and G. Schneider, Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisiae at 2.0 A resolution. J Mol Biol, 1994. 238(3): p. 387-404.

111. Lu, G., et al., Novel tetramer assembly of pyruvate decarboxylase from brewer's yeast observed in a new crystal form. FEBS Lett, 1997. 403(3): p. 249-53.