Моделирование координации биологически активных соединений с терапевтическими мишенями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Учреждение Российской академии наук Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Стройлов Виктор Сергеевич

Моделирование координации биологически активных соединений с терапевтическими мишенями

02.00.15 кинетика и катализ 02.00.04 физическая химия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата химических наук

на правах рукописи

004616463

Москва 2010

- 9 ДЕК 2010

004616463

Работа выполнена в отделе №58 Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук, с.н.с. Чилов Гермес Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Кустов Леонид Модестович

кандидат химических наук, с.н.с. Лакатош Сергей Александрович

Ведущая организация:

Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова

Защита состоится 21 декабря 2010 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 02.222.02 при Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН по адресу: 119992 Москва, Ленинский пр-т, д. 47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН.

Автореферат разослан ■/^ ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Елисеев О.Л.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Помимо традиционного подхода к поиску новых биологически активных соединений, на сегодняшний день большое распространение получил направленный поиск ингибиторов, действующих на заранее определенную терапевтическую мишень. Для успешного поиска соединений, обладающих заданными качествами, необходимо существенное развитие целых областей научного знания на стыке химии, физики и биологии.

Благодаря развитию экспериментальных методов структурной биологии, в настоящее время известны трехмерные структуры многих белков, в том числе являющихся терапевтическими мишенями различных заболеваний. Располагая структурной информацией, можно с помощью методов теоретической химии моделировать свободную энергию и геометрию координации химических соединений в активных центрах белков и рассчитывать специфичность их действия по отношению к мишени выбранного заболевания, а также профиль селективности по отношению к остальным мишеням. В настоящее время существует множество методов молекулярного моделирования, однако тот факт, что во многих случаях их точность оказывается неудовлетворительной, демонстрирует необходимость в ее повышении.

Настоящая работа посвящена исследованию особенностей применения методов моделирования свободной энергии и геометрии координации низкомолекулярных соединений с терапевтическими мишенями в направленном поиске новых биологически активных молекул.

Цель работы. В работе преследовались следующие основные цели:

1. Моделирование структур и свободных энергий образования комплексов киназ с их ингибиторами методом молекулярного докинга для предсказания селективности киназных ингибиторов.

2. Исследование факторов, влияющих на точность моделирования координации органических соединений с белками методом докинга применительно к поиску новых соединений, в особенности -фрагментных соединений, связывающихся с заданным белком -терапевтической мишенью.

3. Направленный поиск новых соединений, способных к координации и ингибированию каталитической активности ферментов киназ.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Проведено исследование точности моделирования профилей термодинамической и конформационной совместимости ряда лекарств и лекарственных кандидатов с протеинкиназами - терапевтическими мишенями

онкологических заболеваний - методом молекулярного докинга. Показана высокая точность данного метода (77%), делающая его пригодным для решения широкого спектра задач направленного поиска новых биологически активных соединений.

Показано, что использование информации о консервативных направленных взаимодействиях между ферментом и его ингибиторами позволяет повысить эффективность поиска новых активных ингибиторов ферментативной активности в среднем в 1,5 раза.

Методом виртуального скрининга обнаружены новые производные 2-гидроксифенола, способные к координации в активном центре и ингибированию ферментативной активности протеинкиназ EphA2 и АСК1, а также 18 других тирозинкиназ.

Предложена методика направленного поиска молекулярных фрагментов, способных к координации в активных центрах белков. С использованием разработанной методики найдено 4 соединения, ингибирующих ферментативную активность протеинкиназы CDK2 - терапевтической мишени онкологических заболеваний - в микромолярной концентрации.

Полученные результаты могут служить основой для дальнейшей разработки методов направленного поиска низкомолекулярных ингибиторов, способных к координации с терапевтическими мишенями различных заболеваний.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Московском международном конгрессе "БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009), IV Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, 2009), международной конференции ACS Fall 2010 (Бостон, США, 2010) и IV молодежной конференции ИОХ РАН (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объем работы. Работа изложена на -/Ж страницах машинописного текста, содержит рисунков, 25'таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Библиография насчитывает -/^{наименований.

Основное содержание работы 1. Использованные методы и подходы Методы молекулярного моделирования

Для моделирования координации соединений в активных центрах белков -терапевтических мишеней использовался метод молекулярного докинга, реализованный в программном комплексе Lead Finder1. Основой метода молекулярного докинга является поиск минимума энергии в фазовом пространстве системы белок-лиганд, проводимый с помощью генетического алгоритма. Последний состоит в том, что над начальным множеством состояний лиганда многократно проводятся операции кроссовера и мутаций с последующим отбором лучших состояний для следующего этапа. Для оптимизации работы алгоритма используется группировка состояний в кластеры ограниченного размера, не позволяющая близким состояниям заполнить собой всю популяцию.

Для расчета энергии взаимодействия в комплексах .. лиганд-терапевтическая мишень использовалось полуэмпирическое силовое поле. Вклад каждой из молекулярно-механических функций в общую энергию масштабировался с помощью трех наборов эмпирических коэффициентов, подобранных таким образом, чтобы а) максимально точно воспроизводить экспериментально измеренную энергию взаимодействия в системе химическое соединение-терапевтическая мишень; б) ранжировать различные положения связывания лиганда, таким образом находя наиболее вероятное, и в) правильно ранжировать активные и неактивные молекулы в экспериментах по виртуальному скринингу. Использование по сути трех различных скоринговых функций в сочетании с модифицированным генетическим алгоритмом позволяет обеспечить высокую точность расчетов.

При расчете свободной энергии взаимодействия в системе белок-лиганд используются следующие энергетические компоненты:

• Ван-дер-Ваальсова энергия, рассчитываемая с помощью потенциала Леннарда-Джонса в форме 6-12.

• Энергия взаимодействия с металлами, рассчитываемая в виде потенциала Леннарда-Джонса в форме 10-12.

• Энергия электростатического взаимодействия, рассчитываемая с помощью экранированного кулоновского потенциала с диэлектрической проницаемостью, зависящей от расстояния и микроокружения.

1 J. Chem. Inf. Model. - 2008. - 48. - 12. - P. 2371-85.

5

• Электростатическая составляющая энергии десольватации лиганда при связывании с белком, рассчитываемая с использованием адаптированной модели Борна.

• Энергия образования водородных связей при взаимодействии лиганда с терапевтической мишенью, рассчитываемая как произведение потенциала Леннарда-Джонса в форме 10-12 и квадратов косинусов угла донор-протон-акцептор и угла между векторами акцептор-протон и акцептор-электронная пара. Дополнительно учитывается количество водородных связей белка с водой, экранированных при связывании лиганда.

• Энергия неспецифической гидрофобной сольватации рассчитывается с помощью потенциала, зависящего от объема, занимаемого лигандом в активном центре белка. Для описания более специфических контактов используются площади полярных и неполярных контактов лиганда с белком.

• Потери внутренней энергии лиганда при связывании с белком рассчитываются в виде разности энергий нековалентного взаимодействия атомов внутри лиганда в растворе и в связанном состоянии.

• Торсионная энергия лиганда оценивается с помощью модифицированного потенциала Рикерта-Беллманса.

• Энтропийные потери лиганда при связывании с белком учитываются линейной функцией, зависящей от числа вращательных степеней свободы лиганда.

Для повышения надежности результатов поиска активных ингибиторов, проводимого методом виртуального скрининга, использовался метод структурной фильтрации, разработанный в нашей лаборатории. Основная идея данного метода состоит в консервативности наборов направленных взаимодействий в комплексах терапевтическая мишень-ингибитор. Можно утверждать, что один из таких наборов взаимодействий должен также реализовываться в комплексах белка с потенциальными ингибиторами. На основании этого утверждения возможно проводить отбор соединений, для которых наиболее высока вероятность проявления активности, по образованию ими определенных водородных связей с белком. Геометрическими критериями наличия водородной связи между белком и лигандом является расстояние менее 3,5 А между донором и акцептором водородной связи, и угол донор-водород-акцептор, больший 150°.

В ходе выполнения данной работы был разработан ряд программ на языке Perl, автоматизирующих подготовку задач и управление расчетами, анализ результатов и их представление в удобном для дальнейшей обработки формате, а также многие другие процессы.

Исследование биологической активности

Экспериментальное определение ингибиторной способности соединений на панели из 20 протеинкиназ человека, включающей в себя киназы EphA2 и АСК1, было любезно проведено Татьяной Ракитиной (Институт биоорганической химии РАН). Для измерений использовались человеческие белки, экспрессированные в клеточной линии SF9. Ферментативная активность определялась по интенсивности флуоресценции с использованием набора для определения концентрации АТФ Kinase-Glo Plus (Promega, США). Измерения проводились при концентрации АТФ, равной 1 мкМ, в качестве ингибитора сравнения использовался стауроспорин.

Экспериментальное определение ингибиторной способности соединений по отношению к протеинкиназе CDK2 проводилось Caliper Discovery Alliances and Services (США). Для измерений использовался человеческий фермент, субстратами являлись меченый флуоресцеином пептид (1,5 мкМ) и АТФ (35 мкМ). Процент ферментативной активности определялся по интенсивности сигнала флуоресценции фосфорилированного пептида после электрофоретического разделения реакционной смеси. В качестве ингибитора сравнения использовался стауроспорин (1С50 6,7 нМ).

2. Результаты и обсуждение

Виртуальное профилирование ингибиторов протеинкиназ

Одной из задач настоящей работы являлось исследование применимости метода молекулярного докинга к моделированию структур и свободных, энергий образования комплексов киназ с их ингибиторами для предсказания профилей активности лекарств и лекарственных кандидатов, действующих на протеинкиназы, и спектров восприимчивости протеинкиназ, представляющих собой важные терапевтические мишени, к различным ингибиторам. В качестве исходных данных для моделирования были использованы экспериментально определенные профили активности 42 соединений, часть из которых является зарегистрированными лекарственными препаратами, остальные же находятся на различных этапах клинических испытаний. Моделирование проводилось с использованием 196 экспериментально определенных трехмерных структур 86 протеинкиназ человека, и представляло собой расчет геометрии комплекса белка с предполагаемым ингибитором.

Анализ доступных трехмерных структур комплексов ингибитор-протеинкиназа показал, что ингибиторы протеинкиназ могут быть условно разделены на два типа в соответствии с занимаемым сайтом связывания (рисунок 1). Координация лигандов первого типа происходит в области шарнирного фрагмента киназного домена, что характерно для связывания

7

Рисунок 1. Положения координации, характерные для лигандов первого (А, РБВ ГО 2о}§) и второго (Б, РОВ ГО 1Ь/2) типов.

нативного субстрата всех киназ - АТФ. В координации лигандов второго типа помимо шарнирного фрагмента принимает участие область связывания пептидных субстратов, называемая ОРв-петлей.

Набор моделей протеинкиназ, моделирование координации с которыми проводилось в рамках настоящей работы, также можно условно разделить на четыре группы в зависимости от доступности для взаимодействия с лигандом и относительного объема каждого из двух центров связывания (рисунок 2). Наиболее распространенной является конформация с открытым центром связывания АТФ и закрытым ЭРО-сайтом (АТФо-ЭРСз); для 76% протеинкиназ имеется как минимум одна модель с такой конформацией. Второй по распространенности является конформация АТФз-БРОз, в которой ОРв-сайт также недоступен, а центр связывания АТФ имеет небольшой объем. Модели, в которых БРС-сайт доступен для связывания лиганда, немногочисленны - их суммарное количество составляет 15% от полного числа подготовленных моделей.

Анализ результатов моделирования проводился в два этапа. На первом этапе предсказанные трехмерные структуры комплексов были подвергнуты экспертной оценке с целью выявления пар киназа-ингибитор, для которых рассчитанная геометрия координации соответствует комплексу протеинкиназы с активным ингибиторам. В общем случае характерной особенностью подобных комплексов является образование лигандом одной или более водородных связей с шарнирным фрагментом протеинкиназы, причем со стороны лиганда в образовании этих водородных связей участвуют атомы, входящие или расположенные на расстоянии одной или двух связей от ароматического или гетероароматического кольца. Кроме того, в случае киназных ингибиторов второго типа между белком и ингибитором образуются

Рисунок 2. Конформации активного центра протеинкиназ. Красными и синими

окружностями выделены области, соответствующие АТФ- и DFG-сайтам, соответственно. Белым показаны неполярные остатки белка, зеленым - незаряженные полярные остатки, синим и красным - положительно и отрицательно заряженные

остатки, соответственно. А - АТФо-ОРСз (PDB ID 1 ml 7) Б - АТФз-ОРОз (PDB ID 2Юу) В - АТФо-DFGo (PDB ID 2b2w, сечение)

Г - АТФз-DFGo (PDB ID 2hiw, сечение).

дополнительные водородные связи и/или гидрофобные контакты в области БРО-петли. На втором этапе результаты моделирования сравнивались с экспериментальными данными и классифицировались в соответствии со схемой 1.

Статистические параметры, характеризующие среднюю точность моделирования координации набора из 86 киназ с 42 ингибиторами, рассчитывались путем суммирования количеств истинно положительных, истинно отрицательных, ложноположительных и ложноотрицательных результатов моделирования по всем киназам (таблица 1). Из представленных данных следует, что общая точность моделирования структурной совместимости киназ с различными ингибиторами составляет 77% и характеризуется достаточно низким разбросом (БВ = 11%). Таким образом, полная вероятность правильного предсказания активности ингибитора по отношению к одной из киназ лежит в диапазоне от 66% до 88%, что показывает применимость метода молекулярного докинга для моделирования профилей активности ингибиторов протеинкиназ и характеризует точность метода как достаточно высокую.

Эксперимент

+ -

Моделирование + Истинно-положит. ил Ложно-положит. лл PPV ИП/(ИП+ЛП)

- Ложно-отр. ло Истинно-отр. ИО NPV ИО/(ИО+ЛО)

Чувствительность ' ИП/(ИП+ЛО) Специфичность ИО/(ЛП+ИО) Точность (ИП+И0)/(П+0)

Схема 1.

Классификация результатов моделирования профилей активности киназных ингибиторов

Средние значения специфичности и ЫРУ - параметров, характеризующих надежность отрицательного предсказания, полученные в результате моделирования, составляют 84% и 85%, соответственно. В то же время, средние значения параметров, характеризующих надежность положительных предсказаний - чувствительности и РРУ, заметно ниже, и находятся на уровне 50%. Таким образом, отрицательные предсказания имеют большую достоверность по сравнению с положительными. Основной причиной этого является недостаточное количество трехмерных структур киназ, совместимых с координацией некоторых ингибиторов. Это подтверждается тем, что чувствительность моделирования активности небольших по размерам ингибиторов 1 типа более чем в 2 раза превосходит аналогичный параметр для ингибиторов 2 типа.

Таблица 1. Параметры, характеризующие точность моделирования спектра восприимчивости набора из 86 протеинкиназ к ингибиторам методом молекулярного докинга, и формулы для их расчета.

./ II------Г.......... И______^-------

Формула

Параметр Все киназы/ все ингибиторы Ингибиторы 1 типа Ингибиторы 2 типа

Чувствительность 0,52 0,67 0,28

РРУ 0,50 0,52 0,44

Специфичность 0,84 0,79 0,90

0,85 0,88 0,82

Точность 0,77 0,76 0,77

1к„„ИП

£кин ,ИП + 1кинЛО Ек„„ип

Хкни |ИП + Ек,,нЛП 1„,иИО

¡ио + Е^лп

Еки» Икни ,ио + Хки»ло ип + £К1,„ио

1™„П + 1КИН0

Исследование подходов к повышению точности виртуального скрининга

Виртуальный скрининг библиотек химических соединений с помощью молекулярного докинга широко используется для поиска соединений, способных координироваться с белками-терапевтическими мишенями и ингибировать их активность. Критерием, по которому оценивается успешность виртуального скрининга, в общем виде является обогащение известными активными молекулами большого набора предположительно неактивных лигандов. За обогащение принимается отношение концентрации активных лигандов в порции библиотеки с наивысшими оценками к их концентрации в исходной библиотеке. Таким образом, эффективность виртуального скрининга оценивается с точки зрения его способности обогащать небольшой набор молекул действительно активными лигандами исходя из намного большей библиотеки соединений.

Для исследования точности метода виртуального скрининга,

реализованного в программном комплексе Lead Finder, был использован неоднократно описанный в литературе набор из 40 белков, для каждого из которых имеются наборы активных и неактивных низкомолекулярных лигандов. Кроме индивидуальных для каждой мишени наборов неактивных лигандов, также использовался общий набор неактивных молекул, полученный объединением индивидуальных наборов.

Кроме стандартной методологии виртуального скрининга, в рамках которой оценка точности происходит по результатам ранжирования активных и неактивных молекул в соответствии с предсказанной энергией взаимодействия с терапевтической мишенью, в настоящей работе была также исследована методология повышения точности моделирования, использующая структурную фильтрацию положений координации лигандов, предсказанных методом молекулярного докинга. Ранее в наших работах было показано2, что дополнительный учет консервативных направленных взаимодействий позволяет существенно повысить эффективность виртуального скрининга, уменьшая долю ложноположительных предсказаний.

Результаты исследования точности виртуального скрининга, проведенного с использованием как индивидуальных библиотек неактивных молекул, так и общего для всех мишеней набора неактивных молекул, содержащего свыше 90 тысяч соединений, представлены в таблице 2. Из представленных данных следует, что применение структурной фильтрации для обработки результатов виртуального скрининга с использованием индивидуальных наборов неактивных соединений приводит к увеличению параметра раннего обогащения REI в среднем в полтора раза. При переходе к более позднему обогащению, определяемому параметром RE5, наблюдаемая эффективность фильтрации падает, выражаясь в незначительном повышении данного параметра. Такой эффект является следствием того, что активные молекулы, выведенные фильтрацией в начало списка, составляют очень небольшую его долю. По той же причине наблюдается стабильность средних площадей под кривыми обогащения (ROC AUC), являющихся интегральным параметром. Аналогично, в случае виртуального скрининга с использованием общего набора неактивных молекул применение структурной фильтрации приводит к увеличению параметра раннего обогащения RE0.1 в среднем в полтора раза, и параметра REO.5 в среднем в 1,6 раза. Среднее значение площади под кривой обогащения (ROC AUC) изменяется незначительно.

Таким образом, использование структурной фильтрации докинговых решений для обработки виртуального скрининга позволяет повысить начальное

2 J. Mol. Model. - 2010. - 16. - P. 1223-30

обогащение библиотеки соединений активными молекулами в среднем в 1,5 раза. Кроме того, из приведенной таблицы следует, что начальное обогащение библиотеки активными соединениями повышается с ростом размера и химического разнообразия соединений. Это означает, что при переходе от модельных экспериментов к поиску новых биологически активных соединений методом виртуального скрининга больших библиотек коммерчески доступных соединений ожидается высокая эффективность. Таблица 2. Влияние структурной фильтрации на усредненные параметры точности

виртуального скрининга

Индивидуальные наборы неактивных соединений

Без фильтрации С фильтрацией

Класс белков 1*Е1 ИЕ5 иос лис ЛЕ1 КЕ5 иос АиС

Ядерные рецепторы 15.7 7.5 0.80 20.1 7.7 0.80

Киназы 7.3 3.9 0.61 8.1 4.1 0.63

Сериновые протеазы Металлоферменты Фолатные ферменты 6.3 9.8 10.5 6.0 5.7 13.9 0.83 0.61 0.94 9.5 13.9 47.8 7.6 5.3 18.2 0.80 0.61 0.97

Прочие ферменты 8.3 5.7 0.67 12.7 5.2 0.68

Все белки 10.1 6.1 0.70 15.3 6.4 0.71

Общий набор неактивных соединений

Без фильтрации С фильтрацией

Класс белков ИЕОЛ ИЕ0.5 КОС лис КЕ0.1 ИЕ0.5 иос лис

Ядерные рецепторы 52.0 19.3 0.83 61.5 30.5 0.80

Киназы 30.0 20.3 0.67 42.6 31.3 0.69

Сериновые протеазы 30.5 33.9 0.94 76.3 73.9 0.92

Металлоферменты 0.0 5.3 0.61 32.4 17.9 0.69

Фолатные ферменты 492.0 50.1 0.95 642.4 185.4 0.99

Прочие ферменты 25.0 25.3 0.66 63.4 34.0 0.73

Все белки 60.4 25.3 0.73 90.1 41.5 0.76

Факторы, влияющие на эффективность структурной фильтрации

Структурная фильтрация результатов моделирования комплексов белок-лиганд, основанная на консервативности взаимодействий, имеющих место в известных комплексах белков с низкомолекулярными соединениями, позволяет повысить точность виртуального скрининга за счет снижения количества ошибок первого рода, то есть ложноположительных предсказаний. Поскольку в данной работе была использована фильтрация по водородным связям, необходимо дополнительно обсудить влияние количества консервативных водородных связей и их взаимного расположения на эффективность структурной фильтрации.

Количество и взаимное расположение сайтов образования консервативных

водородных связей оказывают существенное влияние на прирост начального обогащения, получаемый при использовании структурной фильтрации. В общем случае результативность структурной фильтрации тем выше, чем больше консервативных водородных связей образуется между лигандом и белком, и чем дальше друг от друга расположены сайты их образования. Очевидно, что наличие в белке только одного сайта образования консервативной водородной связи может привести к тому, что эта водородная связь будет образована произвольной молекулой, донор или акцептор водородной связи у которой будет размещен правильным образом. В случае же, когда сайтов образования водородных связей несколько, и они разнесены в пространстве на небольшое (порядка нескольких ангстрем) расстояние, вероятность того, что неактивный лиганд будет участвовать в нужных взаимодействиях, существенно снижается.

Кроме того, в ряде белков при координации лигандов реализуются так называемые коррелированные, или согласованные, водородные связи. Данный тип взаимодействия реализуется при образовании двух водородных связей между парами различных атомов белка и лиганда, расположенных так, что в области взаимодействия образуется цикл. В частности, такой тип взаимодействий наблюдается при связывании лигандов с поли-(АДФ-рибозо)-полимеразой и фосфодиэстеразой 5 (рисунок 3). На предсказываемую свободную энергию образования комплекса белок-лиганд образование согласованных водородных связей влияет слабо, однако применение структурной фильтрации в этом случае позволяет получать высокие обогащения виртуальных библиотек активными ингибиторами за счет того, что вероятность случайного образования неактивным лигандом данного вида взаимодействий очень низка.

А

Б

Рисунок 3. Согласованные водородные связи в активном центре поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы (А) и фосфодиэстеразы 5 (Б)

Поиск новых фрагментных ингибиторов ЕрИА2 и АСК1

Метод молекулярного докинга продемонстрировал многообещающие результаты в задаче моделирования структур и свободных энергий комплексов протеинкиназ с ингибиторами. Следующим разумным шагом представляется применение данного метода для поиска новых молекул, способных координироваться в активном центре и ингибировать ферментативную активность протеинкиназ.

Поиск новых фрагментных ингибиторов киназ ЕрЬА2 и АСК1 проводился в библиотеке КШАБе! компании С1тетЬпс^е, содержащей более 12000 низкомолекулярных веществ, отобранных методом ЗО С^АЯ по похожести на АТФ - нативный субстрат всех протеинкиназ. Первый этап поиска заключался в расчете положений связывания и соответствующих им значений энергетической функции для каждого соединения из библиотеки КПЧАБе! с использованием всех полноатомных моделей трехмерной структуры, подготовленных для протеинкиназ ЕрИА2 и АСК1. На следующем этапе среди рассчитанных для каждого соединения положений связывания отбирались докинговые решения, удовлетворяющие критериям структурной фильтрации. На завершающем этапе поиска проводилась визуальная экспертная оценка предсказанных положений связывания.

В ходе визуального анализа рассчитанных положений связывания в случае обеих киназ было обнаружено 6 соединений, способных координироваться в области шарнирного фрагмента, отличающихся от типичных ингибиторов протеинкиназ. Последние, как правило, содержат фармакофорный фрагмент, состоящий из ароматической аминогруппы - донора водородной связи, и соседнего с ней ароматического атома азота или же карбонильного кислорода -акцепторов водородной связи. Данный фрагмент способен координироваться с шарнирным фрагментом киназы, образуя при этом две водородные связи. В отличие от подобного типичного фрагмента, обнаруженные соединения являлись производными 2-гидроксифенола (таблица 3).

Таблица 3. Фрагментные ингибиторы протеинкиназ ЕрЬА2 и АСК1, обнаруженные в ходе виртуального скрининга.

но

но

но

НО

НО

О

щ

Рисунок 4. Координация нативного лиганда (А) и соединения 1 (Б) в активном центре протеинкиназы EphA2 (PDB ID Imqb).

Положения координации данных соединений, предсказанные в ходе виртуального скрининга, показали, что 2-гидроксифенольный фрагмент предположительно также способен координироваться в шарнирном фрагменте протеинкиназ с образованием вышеописанных водородных связей (рисунок 4). Для получения дополнительных свидетельств в пользу предсказанного способа координации был проведен поиск аналогичных паттернов связывания киназ с их ингибиторами в базе данных рентгеновских структур Protein Data Bank. Анализ результатов поиска позволил обнаружить трехмерную структуру комплекса фосфатидилинозитол-3 киназы (Р13К) с флавоноидом мирицитином, в которой 2,5-дигидроксифенольный фрагмент флавоноида координируется с шарнирным фрагментом киназы образом, подобным предсказанному для ингибиторов, найденных в ходе виртуального скрининга (рисунок 5).

Г—ч

А

Б

Рисунок 5. (А) Предсказанное для соединения 1 положение связывания в активном центре протеинкиназы ЕрЬА2.

2-гидроксифенольный

V

фрагмент образует водородные связи с остатками Е693 и М695 шарнирного фрагмента

(нумерация остатков

соответствует РОВ ГО 1шцЬ). (Б) Связывание мирицитина в активном центре Р13-киназы (РОВ ГО 1е90, атомы водорода лиганда не показаны).

В дополнение к протеинкиназам EphA2 и АСК1, было проведено моделирование координации найденных соединений с рядом других протеинкиназ человека, а именно с ABL1, CSK, EGFR, FGFR1, FGFR2, KDR, KIT, Lyn, PYK и Syk. Предсказанные положения координации в ряде случаев практически не отличались от найденных для киназ EphA2 и АСК1, таким образом свидетельствуя о том, что найденные фрагментные ингибиторы могут быть активны по отношению к широкому спектру других протеинкиназ человека. Кроме того, поиск в базах данных Chemical Abstracts Service и PubChem Bioassay показал, что для обнаруженных соединений на данный момент не описана противокиназная активность. Таким образом, следующим логическим шагом была экспериментальная проверка активности данных соединений.

Биологическая активность найденных соединений

Экспериментальная проверка активности предсказанных фрагментных ингибиторов на панели из 20 протеинкиназ человека показала, что данные соединения в концентрации ЮмкМ снижают ферментативную активность протеинкиназ EphA2 и АСК1. Исключение составляют пары соединение 6 -EphA2 и соединение 2 - АСК1, в которых ингибирование ферментативной активности не было зарегистрировано. В случае протеинкиназы EphA2 для соединений 1-5 также были экспериментально определены кривые доза-эффект, исходя из которых были получены значения IC50 - концентрации ингибитора, снижающей активность фермента вдвое. Результаты экспериментального измерения активности соединений 1-6 представлены в таблице 4.

Соединение EphA2 аск1

ic50, мкМ К| выч, мкМ kl, мкМ Kj выч, мкМ

1 2.2±0.3 8.4 50 21.8

2 0.6±0.2 5.1 - -

3 1.2±0.2 1.9 72 42.0

4 1.0±0.3 0.3 15 4.0

5 1.0±0.2 1.4 53 6.8

6 - - 41 5.2

Таблица 4. Результаты экспериментального измерения активности новых ингибиторов протеинкиназ EphA2 и АСК1. Концентрация соединений в экспериментах с АСК1 составляла 10 мкМ. Расчетные константы ингибирования были получены исходя из свободной энергии связывания, рассчитанной программным комплексом Lead Finder.

Таким образом, было показано, что найденные соединения значительно подавляют ферментативную активность протеинкиназы ЕрЬА2, при этом экспериментально определенные для них значения Ю50 колеблются от 0.6 до 2.2 мкМ и хорошо согласуются с предсказанными значениями свободной энергии образования комплексов. По отношению к протеинкиназе АСК1 активность новых ингибиторов оказалась ниже - ЮмкМ этих соединений подавляют от 10 до 30% каталитической активности, что также согласуется с результатами моделирования.

Результаты измерения активности по отношению к остальным 18 протеинкиназам человека, приведенные в таблице 5, свидетельствуют о достаточно широком профиле активности новых ингибиторов, предположение о котором также было сделано на основании результатов моделирования.

Таблица 5. Результаты измерения активности соединений 1-6 в концентрации 10 мкМ на панели из 18 протеинкиназ человека._

Соединение 1 2 3 4 5 6

Syk 6 ± 4 9 ± 4 13 ± 5 8 ± 1 3 ± 1 5 ± 3

CSK 48 ± 12 90 ± 16 81 ± 13 39 ± 5 14 ± 14 32 ± 5

IGF1R 4 ± 3 4 ± 4 64 ± 11 26 ± 3 2 ± 5 3 ± 3

EGFR 60 ± 11 57 ± 13 44 ± 12 48 ± 7 27 ± 13 41 ± 4

InsR 35 ± 21 48 ± 12 35 ± 9 4 ± 1 7 ± 10 19 ± 4

Lyn 68 ± 10 80 ± 16 65 ± 29 55 ± 5 39 ± 19 23 ± 12

FGFR1 80 ± 20 91 ± 15 58 ± 30 62 ± 12 54 ± 14 62 ± 11

FGFR2 76 ± 20 85 ± 17 64 ± 24 67 ± 18 54 ± 11 47 ± 4

Alk 28 ± 14 28 ± 15 36 ± 11 22 ± 6 7 ± 9 26 ± 12

Abi 77 ± 12 10 ± 9 64 ± 24 68 ± 10 64 ± 15 72 ± 14

BLK 60 ± 19 0 ± 0 58 28 74 ± 13 0 ± 0 51 ± 7

CSFR 30 ± 19 0 ± 0 34 ± 14 34 ± 16 14 ± 14 25 ± 3

CTK 31 ± 7 39 15 24 ± 12 63 ± 33 30 ± 20 31 ± 14

PDGFRa 84 ± 28 18 ± 7 103 ± 13 104 ± 3 77 ± 36 58 ± 29

PYK 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 63 ± 27 24 ± 25 9 ± 8

KIT 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 32 ± 33

KDR 12 ± 4 13 ± 4 29 ± 17 93 ± 14 0 ± 0 91 ± 5

YES 0 ± 0 10 ± 2 14 ± 6 46 ± 4 0 ± 0 68 ± 16

Из приведенных данных следует, что найденные фрагментные ингибиторы наиболее активны по отношению к таким протеинкиназам, как EGFR, FGFR1, FGFR2, АЫ и PDGFRa. Результаты, полученные методом молекулярного докинга, свидетельствуют о том, что координация новых ингибиторов с этими киназами происходит таким же образом, как и с протеинкиназами EphA2 и АСК1. Таким образом, 2-гидроксифенольный фрагмент, присутствующий во всех обнаруженных соединениях, представляет собой новый общий фармакофор, пригодный для разработки новых ингибиторов протеинкиназ, целенаправленно действующих на несколько мишеней, например на EphA2 и EGFR.

Разработка и валидирование фрагментного подхода к поиску ингибиторов т ьШсо

Результаты, описанные в предыдущем разделе, показывают применимость метода молекулярного докинга к поиску фрагментных ингибиторов. Однако, для целенаправленного поиска фрагментов, способных к координации с заданной терапевтической мишенью и пригодных к дальнейшей оптимизации, представляется целесообразной разработка более специализированного подхода.

Для расчёта свободной энергии связывания и, соответственно, константы ингибирования, необходимо правильно определить геометрию координации исследуемого соединения. Поэтому в первую очередь необходимо проверить, насколько корректно метод молекулярного докинга позволяет предсказывать геометрию связывания фрагментов. По результатам анализа базы данных лекарств, для которых известна трёхмерная структура комплекса с белком-мишенью, было отобрано 39 соединений. Из них 34 полных лекарственных молекулы локируются корректно (предсказанное положение связывания совпадает с данными РСА, ИМЗЭ < 1,5 А). Причина некорректного молекулярного докинга оставшихся 5 соединений, судя по всему, состоит в их большом размере и, как следствие, большом количестве степеней свободы.

Лекарства, докинг которых прошёл корректно, разбили на фрагменты и локировали в белок-мишень. Для каждого фрагмента определили корректность локирования, а также долю занимаемого соединением сайта связывания (визуально). Затем эти данные были проанализированы следующим образом: для каждого возможного значения характеристик связывания определялось общее количество соединений, удовлетворяющих этому значению, а среди них -число корректно и некорректно локированных фрагментов (таблица 6).

Таблица 6. Факторы, влияющие на корректность фрагментного докинга. Приведено общее количество фрагментов, удовлетворяющее условию («Всего»), количество корректно (+) и некорректно (-) локированных фрагментов, а также процент корректно локированных фрагментов.

Фактор Значение + . Всего +,%

НВ 0 2 13 15 13

1 7 4 И 64

>1 35 7 42 83

Ме + 41 3 23 1 64 4 64 75

У,% 15 1 6 7 14

25 19 11 30 63

50 22 7 29 75

75 2 0 2 100

- - 44 24 68 65

Таким образом, образование более чем одной водородной связи между фрагментом и белком-мишенью существенно повышает надёжность молекулярного докинга фрагментов, поскольку образование водородной связи с одной стороны энергетически весьма выгодно, а с другой - наличие нескольких водородных связей существенно ограничивает спектр возможных положений соединения в пространстве. Надёжность фрагментного докинга также повышается при взаимодействии лиганда с ионом металла: координация металла весьма выгодна энергетически, и в органическом соединении обычно присутствует сравнительно небольшое количество групп, способных участвовать в таком взаимодействии, и таким образом количество возможных поз резко сокращается. Наконец, чем большую долю сайта связывания занимает фрагмент, тем выше вероятность корректного предсказания геометрии координации, так как при увеличении доли занимаемого фрагментом сайта связывания уменьшается количество возможных геометрий связывания, а, следовательно, повышается надёжность докинга.

Экспериментально определённые энергии связывания фрагментных ингибиторов согласуются со значениями, предсказанными на основании молекулярного моделирования (рисунок 6). Среднеквадратичное отклонение составило 1,35 ккал/моль, что соответствует отличию констант связывания примерно на один порядок. Такая ошибка является вполне приемлемой для молекулярного моделирования, особенно если учесть, что цель виртуального фрагментного скрининга состоит не в том, чтобы точно рассчитать свободную энергию связывания, а в том, чтобы отобрать соединения, активные в разумной концентрации, и лишь затем провести оптимизацию их связывания.

9,00

8,00

I 7,00

о

£

| 6,00 эе

» 5,00 4,00 3,00

<1 ккал/моль ♦ ► <2ккал/моль ♦

♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

♦ ♦ ♦ ♦

0,00 0,50 1,00

1,50 2,00 2,50 |йс16|, ккал/моль

3,00 3,50 4,00

Рисунок 6. Точность предсказания свободной энергии связывания фрагментов. Показана экспериментальная энергия связывания фрагмента (<Югар) и абсолютное значение ошибки её предсказания (|ДсЮ|).

Поиск: новых биологически активных соединений методом виртуального фрагментного скрининга

На основании изложенного в предыдущих разделах можно заключить, что молекулярный докинг позволяет адекватно моделировать структуру и свободную энергию взаимодействия фрагментов с мишенью, особенно в тех случаях, когда они участвуют в направленных взаимодействиях с белком, или же занимают значительную часть активного центра. Однако простое применение виртуального скрининга фрагментной библиотеки недостаточно эффективно при направленном поиске новых фрагментных ингибиторов, так как при этом даже после структурной фильтрации остаётся несколько сотен соединений, экспериментальная проверка активности которых нецелесообразна. После нескольких попыток воспроизвести in silico поиск известных фрагментных ингибиторов была предложена общая методика для фрагментного скрининга in silico, позволяющая сократить количество фрагментных соединений для экспериментальных измерений, и состоящая из следующих этапов:

• поиск трёхмерной структуры белка-мишени в комплексе с ингибитором

• подготовка полноатомной трёхмерной модели белка-мишени и выявление консервативных взаимодействий в комплексах мишень-ингибитор (т.е. критериев структурной фильтрации)

• виртуальный скрининг фрагментной библиотеки и структурная фильтрация результатов

• ранжирование соединений, удовлетворяющих критериям структурной фильтрации по удельной энергии взаимодействия с мишенью

• кластеризация лучших соединений по структурным мотивам, взаимодействующим с белком

Мишенью для поиска новых фрагментных ингибиторов была выбрана протеинкиназа CDK2, участвующая в регуляции клеточного деления. Выбор данной мишени был обусловлен рядом факторов, таких как подтвержденная вовлеченность в патологические процессы, наличие большого числа экспериментально разрешенных трехмерных структур и ингибиторов, действующих на мишень, а также доступность in vitro моделей для проведения экспериментальных измерений.

Поиск новых фрагментных ингибиторов CDK2 проводился с использованием библиотеки фрагментных соединений, полученной путем отбора молекул, удовлетворяющих усеченному «правилу пяти» Липинского, из библиотек компаний Enamine и Vitas-M Laboratory. В результате виртуального скрининга библиотеки, содержавшей 31869 молекул, для протеинкиназы CDK2

было найдено 1438 лигандов, удовлетворяющих критериям структурной фильтрации. При кластеризации лучших соединений по скаффолду, взаимодействующему с белком, для протеинкиназы СОК2 было получено 13 кластеров (рисунок 7).

Для определения достоверности полученных результатов был проведён поиск выявленных структурных мотивов (ядер кластеров) среди известных нефрагментных ингибиторов, поскольку число известных ингибиторов СБК2 достаточно велико, и они принадлежат к разным классам органических веществ. Кроме того, для данного белка удалось обнаружить также некоторые данные по имеющимся фрагментным ингибиторам. Проведенный поиск показал, что 10 из 13 структурных мотивов встречается в реальных ингибиторах СБК2. Таким образом, из 13 обнаруженных ядер фрагментов 3 являются новыми.

Аг-^

О

Н. А

25

17

NH-H

16

Н

i

X

о

н

9 л. I

fY Лг» п гу°

Н о

7 7 6 6

JL, rV ¿, ^

rvnh "nh

6 111

н /

N—О -(

NH-H 1

Рисунок 7. Найденные кластеры фрагментов для протеинкиназы CDK2. Под формулами фрагментов указана их встречаемость среди 100 лучших по удельной энергии взаимодействия с белком соединений. А=С(Н)„, N(H), О; Any - одинарная или двойная связь.

На следующем этапе работы на основе анализа положений координации и предсказанной энергии связывания было решено отобрать из каждого кластера по 1-2 наиболее хорошо связывающихся соединения и проводить дальнейшие эксперименты именно с ними.

Среди ингибиторов СЭК2 было отобрано 15 соединений, однако доступно для измерений оказалось лишь 4 соединения. Определенное для них понижение каталитической активности фермента составило 21-58% в концентрации 0,5 мМ (рисунок 8А). Этих данных недостаточно для расчёта точного значения константы ингибирования, однако они показывают активность трёх ингибиторов в субмиллимолярной, а одного - в миллимолярной концентрации, что является приемлемым результатом для фрагментных ингибиторов.

Таким образом, эффективность методики виртуального фрагментного скрининга была подтверждена как встречаемостью найденных фрагментов в структурах существующих ингибиторов, так и экспериментально обнаруженной активностью найденных с её помощью 4 фрагментных

Б

%

¿^Ь .............УЩГ

яг

|______. V

3 /

{ м

я т 1§

Рисунок 8. Результаты экспериментального определения активности ингибиторов протеинкиназы СБК2 (А) и предсказанное положение координации для одного из них (Б). Приведены молярные массы соединений и процент ингибирования фермента при заданной концентрации вещества.

ингибиторов протеинкиназы СОК2.

МИ/ 171 52% @ 0.5 мМ

М\А/ 180,6

1\№ 178 38% @ 0.5 мМ

КТО 161

58% @ 0.5 мМ 21% @ 0.5 мМ

Основные результаты и выводы

1. Моделирование термодинамических и структурных параметров координации набора 86 терапевтически значимых ферментов киназ и их 42 ингибиторов с помощью метода молекулярного докинга дало общую точность 77% в отношении предсказания пар фермент-ингибитор.

2. Недостаточность экспериментальных данных о структурах активных центров киназ и их подвижности обусловливает большую достоверность отрицательных предсказаний (85%) по сравнению с положительными (52%) для моделирования координации пар фермент-ингибитор методом докинга.

3. Применение метода структурной фильтрации позволяет снизить начальный процент ложноположительных предсказаний координации пар белок-лиганд в 1,5 раза, как было показано на наборе 40 структурно и функционально различных белков.

4. Обнаружена способность производных 2-гидроксифенола координироваться в активном центре тирозинкиназ ЕрЬА2 и АСК1 и ингибировать их ферментативную активность в микромолярном диапазоне концентраций. Экспериментально установлена ингибирующая активность найденных соединений в ряду 20 тирозинкиназ человека.

5. Наибольшая точность моделирования структуры комплексов белков с фрагментными органическими соединениями методом докинга составляет 83% и достигается для соединений, участвующих в направленных взаимодействиях (водородные связи, координация с металлом и т.д.) и образующих комплементарный гидрофобный контакт с белком. Точность расчета свободной энергии образования комплексов фрагментных соединений с белками, исследованная на наборе 30 комплексов, составляет 1,35 ккал/моль.

6. Применение структурной фильтрации и кластеризации позволило повысить точность методов докинга для моделирования координации и свободной энергии образования комплексов фрагментных соединений с белками, и найти 4 новых ингибитора протеинкиназы СОК2 с константами ингибирования, лежащими в микромолярном диапазоне концентраций.

Список публикаций

1. Stroylov, V.S. Novel fragment-like inhibitors of EphA2 obtained by experimental screening and modeling / V.S. Stroylov, T.V. Rakitina, F.N. Novikov, O.V. Stroganov, G.G. Chilov, A.V. Lipkin // Mendeleev Commun. — 2010. — 20. — P. 263-265.

2. Novikov, F.N. Improving performance of docking-based virtual screening by structural filtration / F.N. Novikov,V.S. Stroylov, O.V. Stroganov, G.G. Chilov // J. Mol. Model. — 2010. — 16. — 7. —P. 1223-30.

3. Stroganov, O.V. Lead finder: an approach to improve accuracy ofprotein-ligand docking, binding energy estimation, and virtual screening /

O.V. Stroganov, F.N. Novikov, V.S. Stroylov, V. Kulkov, G.G. Chilov // J. Chem. Inf. Model. — 2008. — 48. — P. 2371-85.

4. Novikov, F.N. Developing novel approaches to improve binding energy estimation and virtual screening: a PARP case study / F.N. Novikov, V.S. Stroylov, O.V. Stroganov, V. Kulkov, G.G. Chilov //J. Mol. Model.

— 2009,— 15,—11. — P. 1337-47.

5. Stroganov, O.V. Lead Finder - software for drug discovery applications / O.V. Stroganov, F.N. Novikov, V.S. Stroylov, G.G. Chilov // Сборник тезисов докладов VII Московского международного конгресса "БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития".— 2009.

— Москва, Россия. — Том 1. — С. 236.

6. Стройлов, B.C. Lead Finder — программный продукт для поиска новых лекарственных препаратов / B.C. Стройлов, О.В. Строганов,

Ф.Н. Новиков, Г.Г. Чилов // Сборник тезисов IV Российского симпозиума "Белки и пептиды". — 2009. — Казань, Россия. — С. 393.

7. Зейфман, А.А. Фрагментный подход к поиску лекарств in silico / А.А. Зейфман, B.C. Стройлов//Тезисы докладов IV молодежной конференции ИОХ РАН. — 2010. — Москва, Россия.

8. Stroylov, V. Lead Finder in the CSAR scoring challenge / Victor Stroylov, Ghermes Chilov, Oleg Stroganov, Fedor Novikov, Val Kulkov // Тезисы докладов международной конференции «ACS Fall 2010». — 2010.

— Бостон, США. — СОМР 145.

9. Chilov, G. Key directions of mastering docking and scoring approaches / Ghermes Chilov, Oleg Stroganov, Fedor Novikov,Victor Stroylov, Val Kulkov // Тезисы докладов международной конференции «ACS Fall 2010».

— 2010. — Бостон, США. — СОМР 24

Заказ № 169-1/11/2010 Подписано в печать 18.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

х;:—-^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

!. '.^У/ Mww.cfr.ru ; е-таН:info@cfr.ru

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Строение и функции протеинкиназ.

1.1.1. Общие сведения о протеинкиназах.

1.1.2. Структура протеинкиназ.

1.1.3. Ингибирование киназ.

1.1.4. АТФ-конкурентные ингибиторы протеинкиназ и их селективность.

1.2. Метод молекулярного докинга.

1.2.1. Теоретические основы метода.

1.2.2. Методы сканирования поверхности потенциальной энергии.

1.3. Расчет свободной энергии связывания.

1.3.1. Метод возмущений свободной энергии.

1.3.2. Методы линейной корреляции свободной энергии.

1.3.3. Приближения аддитивных вкладов в свободную энергию связывания.

1.3.4. Использование эмпирических функций.

1.4. Виртуальный скрининг.

1.4.1. Введение.

1.4.2. Метод структурной фильтрации.

1.5. Фрагментами подход к поиску новых лекарств.

1.5.1. Создание лекарств на основе механизма действия.

1.5.2. Примеры поиска лекарств с помощью фрагментного подхода.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Компьютерные программы, использованные в работе.

2.2. Построение моделей трехмерной структуры белков.

2.3. Построение моделей трехмерных структур лигандов.

2.4. Разбиение молекул известных лекарств на фрагменты.

2.5. Докинг и виртуальный скрининг.

2.6. Оценка свободной энергии образования комплексов белок-лиганд.

2.7. Расчет параметров точности моделирования координации ингибиторов протеинкиназ.

2.8. Структурная фильтрация результатов виртуального скрининга.

2.9. Ранжирование результатов виртуального скрининга.

2.10. Расчет параметров обогащения виртуального скрининга.

2.11. Визуальный анализ геометрии комплексов белок-лиганд.

2.12. Выделение фармакофоров фрагментных ингибиторов.

2.13. Экспериментальное определение эффективности связывания соединений с белками-мишенями.

2.13.1. Протеинкиназы ЕрЬА2 и АСК1.

2.13.2. Протеинкиназа СОК2.

2.13.3. Мутантная форма протеинкиназы ABL1 T3151.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Моделирование координации протеинкиназ с ингибиторами.

3.1.1. Построение полноатомных моделей белков.

3.1.1. Построение трехмерных моделей лигандов.

3.1.3. Моделирование профилей активности ингибиторов протеинкиназ.

3.1.4. Моделирование спектра восприимчивости киназ к ингибиторам.

3.1.5. Уточнение конформаций боковых радикалов.

3.1.6. Моделирование профиля активности киназных ингибиторов.

3.1.7. Зависимость надежности моделирования активности ингибитора от его типа и конформации активного центра киназы.

3.2. Исследование точности виртуального скрининга.

3.2.1. Описание тестового набора DUD.

3.2.2. Подготовка полноатомных моделей белков.

3.2.3. Критерии структурной фильтрации результатов виртуального скрининга.

3.2.4. Подготовка библиотек лигандов.

3.2.5. Исследование точности виртуального скрининга.

3.2.6. Влияние свойств белков на точность виртуального скрининга.

3.2.7. Структурная фильтрация результатов виртуального скрининга.

3.3. Поиск новых фрагментных ингибиторов EphA2 и АСК1.

3.3.1. Построение полноатомных моделей белков.

3.3.2. Построение моделей трехмерных структур лигандов.

3.3.3. Анализ существующих ингибиторов EphA2 и АСК1.

3.3.4. Поиск новых ингибиторов АСК1 и EphA2 методом виртуального скрининга.

3.4. Валидирование фрагментного подхода к поиску ингибиторов in silico.

3.4.1. Факторы, влияющие на точность молекулярного докинга фрагментов лекарств.

3.4.2. Сравнение экспериментальной и расчетной энергии связывания фрагментов.

3.4.3. Поиск новых фрагментных ингибиторов протеинкиназ CDK2 и ABL.

3.4.4. Экспериментальная проверка предсказанных ингибиторов.

Помимо традиционного подхода к поиску новых биологически активных соединений, основанного на фенотипическом скрининге, на сегодняшний день большое распространение получил направленный поиск ингибиторов, действующих на заранее определенную белковую (фермент, рецептор, .) терапевтическую мишень. Для успешного поиска соединений, обладающих заданными качествами, необходимо существенное развитие целых областей научного знания на стыке химии, физики и биологии.

Благодаря развитию экспериментальных методов структурной биологии, в настоящее время известны трехмерные структуры многих белков, в том числе являющихся терапевтическими мишенями различных заболеваний. Располагая структурной информацией, можно с помощью методов теоретической химии моделировать свободную энергию и геометрию координации химических соединений в активных центрах белков, и рассчитывать специфичность их действия по отношению к мишени выбранного заболевания, а также профиль селективности по отношению к остальным терапевтическим мишеням. В настоящее время существует множество методов молекулярного моделирования, однако тот факт, что во многих случаях их точность оказывается неудовлетворительной, демонстрирует необходимость улучшения методов.

Настоящая работа посвящена исследованию особенностей применения методов моделирования свободной энергии и геометрии координации низкомолекулярных соединений с терапевтическими мишенями в направленном поиске новых биологически активных молекул.

В работе преследовались следующие основные цели:

• Моделирование структур и свободных энергий образования комплексов киназ с их ингибиторами методом молекулярного докинга для предсказания селективности киназных ингибиторов.

• Исследование факторов, влияющих на точность моделирования координации органических соединений с белками методом докинга применительно к поиску новых соединений, в особенности - фрагментных соединений, связывающихся с заданным белком — терапевтической мишенью.

• Направленный поиск новых соединений, способных к координации и ингибированию каталитической активности ферментов киназ.

1. Литературный обзор

4. Основные результаты и выводы

1. Моделирование термодинамических и структурных параметров координации набора 86 терапевтически значимых ферментов киназ и их 42 ингибиторов с помощью метода молекулярного докинга дало общую точность 77% в отношении предсказания пар фермент-ингибитор.

2. Недостаточность экспериментальных данных о структурах активных центров киназ и их подвижности обусловливает большую достоверность отрицательных предсказаний (85%) по сравнению с положительными (52%) для моделирования координации пар фермент-ингибитор методом докинга.

3. Применение метода структурной фильтрации позволяет снизить начальный процент ложноположительных предсказаний координации пар белок-лиганд в 1.5 раза, как было показано на наборе 40 структурно и функционально различных белков.

4. Обнаружена способность производных 2-гидроксифенола координироваться в активном центре тирозинкиназ ЕрЬА2 и АСК1 и ингибировать их ферментативную активность в микромолярном диапазоне концентраций. Экспериментально установлена ингибирующая активность найденных соединений в ряду 20 тирозинкиназ человека.

5. Наибольшая точность моделирования структуры комплексов белков с фрагментными органическими соединениями методом докинга составляет 83% и достигается для соединений, участвующих в направленных взаимодействиях (водородные связи, координация с металлом и т.д.) и образующих комплементарный гидрофобный контакт с белком. Точность расчета свободной энергии образования комплексов фрагментных соединений с белками, исследованная на наборе 68 комплексов, составляет 1,35 ккал/моль.

6. Применение структурной фильтрации и кластеризации позволило повысить точность методов докинга для моделирования координации и свободной энергии образования комплексов фрагментных соединений с белками, и найти 4 новых ингибитора протеинкиназы СЭК2 с константами ингибирования, лежащими в микромолярном диапазоне концентраций.

1. Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling / T. Hunter // Cell. — 1995. — Vol. 80, № 2. — P. 225-36.

2. Johnson, L. N. Structural basis for control by phosphorylation / L. N. Johnson, R. J. Lewis // Chem. Rev. — 2001. — Vol. 101, № 8. — P. 2209-42.

3. Neel, B. G. Protein tyrosine phosphatases in signal transduction / B. G. Neel, N. K. Tonks // Curr. Opin. Cell Biol. — 1997. — Vol. 9, № 2. — P. 193-204.

4. Saito, H. Histidine phosphorylation and two-component signaling in eukaryotic cells / H. Saito // Chem. Rev. — 2001. — Vol. 101, № 8. — P. 2497-509.

5. Schlessinger, J. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases / J. Schlessinger, A. Ullrich//Neuron. — 1992. — Vol. 9, № 3. — P. 383-91.

6. Hubbard, S. R. Protein tyrosine kinase structure and function / S. R. Hubbard, J. H. Till // Annu. Rev. Biochem. — 2000. — Vol. 69. — P. 373-98.

7. Chen, Z. MAP kinases / Z. Chen, T. B. Gibson, F. Robinson et al. // Chem. Rev. — 2001.

8. Vol. 101, № 8. — P. 2449-76.

9. Knighton, D. R. Structure of a peptide inhibitor bound to the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase / D. R. Knighton, J. H. Zheng, L. F. Ten Eyck et al. // Science. — 1991. — Vol. 253, № 5018. — P. 414-20.

10. Hanks, S. K. Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification / S. K. Hanks, T. Hunter // FASEB J. — 1995. — Vol. 9, №8. —P. 576-96.

11. Johnson, L. N. Active and inactive protein kinases: structural basis for regulation / L. N. Johnson, M. E. Noble, and D. J. Owen// Cell. — 1996. — Vol. 85, № 2. — P. 149-58.

12. Adams, J. A. Kinetic and catalytic mechanisms of protein kinases / J. A. Adams // Chem. Rev. —2001. — Vol. 101, № 8. — P. 2271-90.

13. Robertson, S. C. RTK mutations and human syndromes: when good receptors turn bad / S. C. Robertson, J. Tynan, and D. J. Donoghue // Trends Genet. — 2000. — Vol. 16, № 8.1. P. 368.

14. Muller-Ladner, U. Molecular and cellular interactions in rheumatoid synovium / U. MullerLadner // Curr. Opin. Rheumatol. — 1996. — Vol. 8, № 3. — P. 210-20.

15. Taylor, S. S. Protein kinase inhibition: natural and synthetic variations on a theme / S. S. Taylor, E. Radzio-Andzelm // Curr. Opin. Chem. Biol. — 1997. — Vol. 1, № 2. — P. 21926.

16. Toledo, L. M. The structure-based design of ATP-site directed protein kinase inhibitors / L. M. Toledo, N. B. Lydon, and D. Elbaum // Curr. Med. Chem. — 1999. — Vol. 6, № 9. — P. 775-805.

17. Broadbridge, R. J. The Src homology-2 domains (SH2 domains) of the protein tyrosine kinase p561ck: structure, mechanism and drug design / R. J. Broadbridge, R. P. Sharma //178

18. Curr. Drug Targets. — 2000. — Vol. 1, № 4. — P. 365-86.

19. Lawrence, D. S. Protein kinase inhibitors: the tyrosine-specific protein kinases / D. S. Lawrence, J. Niu // Pharmacol. Ther. — 1998. — Vol. 77, № 2. — P. 81-114.

20. Blum, G. Substrate competitive inhibitors of IGF-1 receptor kinase / G. Blum, A. Gazit, and A. Levitzki // Biochemistry. — 2000. — Vol. 39, № 51. — P. 15705-12.

21. Bridges, A. J. Chemical inhibitors of protein kinases / A. J. Bridges // Chem. Rev. — 2001. — Vol. 101, №8, —P. 2541-72.

22. Sausville, E. A. Protein kinase antagonists: interim challenges and issues / E. A. Sausville // Anticancer Drug Des. — 2000. — Vol. 15, № 1. — P. 1-2.

23. Wang, Z. Structural basis of inhibitor selectivity in MAP kinases / Z. Wang, B. J. Canagarajah, J. C. Boehm et al. // Structure. — 1998. — Vol. 6, № 9. — P. 1117-28.

24. Zhu, X. Structural analysis of the lymphocyte-specific kinase Lck in complex with nonselective and Src family selective kinase inhibitors / X. Zhu, J. L. Kim, J. R. Newcomb et al. // Structure. — 1999. — Vol. 7, № 6. — P. 651-61.

25. Brooks, G. The cell cycle and drug discovery: the promise and the hope / G. Brooks, N. B. La Thangue // Drug Discov. Today. — 1999. — Vol. 4, № 10. — P. 455-464.

26. Lapenna, S. Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer / S. Lapenna, A. Giordano // Nat. Rev. Drug Discov. — 2009. — Vol. 8, № 7. — P. 547-566.

27. Furet, P. Structure-based design of potent CDK1 inhibitors derived from olomoucine / P. Furet, J. Zimmermann, H. G. Capraro et al. // J. Comput. Aided Mol. Des. — 2000. — Vol. 14, №5. —P. 403-9.

28. Krause, D. S. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy / D. S. Krause, R. A. Van Etten // N. Engl. J. Med. — 2005. — Vol. 353, № 2. — P. 172-87.

29. Salih, J. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity / J. Salih, J. Hilpert, T. Placke et al. // Int. J. Cancer. — 2010. — Vol. 127, №9. —P. 2119-28.

30. Traxler, P. Strategies toward the design of novel and selective protein tyrosine kinase inhibitors / P. Traxler, P. Furet // Pharmacol. Ther. — 1999. — Vol. 82, № 2-3. — P. 195206.

31. Schindler, T. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase / T. Schindler, W. Bornmann, P. Pellicena et al. // Science. — 2000. — Vol. 289, № 5486. — P. 1938-42.

32. Totrov, M. Flexible protein-ligand docking by global energy optimization in internal coordinates / M. Totrov, R. Abagyan // Proteins. — 1997. — Vol. Suppl 1, №. — P. 215-20.

33. Tietze, S. GlamDock: Development and Validation of a New Docking Tool on Several Thousand Protein-Ligand Complexes / S. Tietze, J. Apostolakis // J. Chem. Inf. Model. — 2007. — Vol. 47, № 4. — P. 1657-1672.

34. Morris, G. M. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function / G. M. Morris, D. S. Goodsell, R. S. Halliday et al. // Journal of Computational Chemistry. — 1998. — Vol. 19, № 14. — P. 1639-1662.

35. Huey, R. A semiempirical free energy force field with charge-based desolvation / R. Huey, G. M. Morris, A. J. Olson et al. // J. Comput. Chem. — 2007. — Vol. 28, № 6. — P. 114552.

36. Jones, G. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking / G. Jones, P. Willett, R. C. Glen et al. // J. Mol. Biol. — 1997. — Vol. 267, № 3. — P. 727-48.

37. Hartshorn, M. J. Diverse, high-quality test set for the validation of protein-ligand docking performance / M. J. Hartshorn, M. L. Verdonk, G. Chessari et al. // J. Med. Chem. — 2007. — Vol. 50, № 4. — P. 726-41.

38. Thomsen, R. MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking / R. Thomsen, M. H. Christensen//J. Med. Chem. — 2006. — Vol. 49, № 11. —P. 3315-21.

39. Oshiro, C. M. Flexible ligand docking using a genetic algorithm / C. M. Oshiro, I. D. Kuntz, and J. S. Dixon // J. Comput. Aided Mol. Des. — 1995. — Vol. 9, № 2. — P. 113-30.

40. Rarey, M. Multiple automatic base selection: protein-ligand docking based on incremental construction without manual intervention / M. Rarey, B. Kramer, and T. Lengauer // J. Comput. Aided Mol. Des. — 1997. — Vol. 11, № 4. — P. 369-84.

41. Kramer, B. Evaluation of the FLEXX incremental construction algorithm for protein-ligand docking / B. Kramer, M. Rarey, and T. Lengauer // Proteins. — 1999. — Vol. 37, № 2. — P. 228-41.

42. Jain, A. N. Surflex: fully automatic flexible molecular docking using a molecular similarity-based search engine / A. N. Jain // J. Med. Chem. — 2003. — Vol. 46, № 4. — P. 499-511.

43. Goodsell, D. S. Automated docking of substrates to proteins by simulated annealing / D. S. Goodsell, A. J. Olson // Proteins. — 1990. — Vol. 8, № 3. — P. 195-202.

44. Solis, F. J. Minimization by Random Search Techniques / F. J. Solis, R. J. B. Wets // Math. Oper. Res. — 1981. — Vol. 6, № 1. — P. 19-30.

45. Gohlke, H. Approaches to the description and prediction of the binding affinity of small-molecule ligands to macromolecular receptors / H. Gohlke, G. Klebe // Angew. Chem. Int. Edit. — 2002. — Vol. 41, № 15. — P. 2645-2676.

46. Reddy, M. R. Free energy calculations in rational drug design / M. R. Reddy, M. D. Erion. — New York : Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2001. 384 p. - ISBN 0306466767.

47. Shirts, M. R. Comparison of efficiency and bias of free energies computed by exponential averaging, the Bennett acceptance ratio, and thermodynamic integration / M. R. Shirts, V. S.

48. Pande // J. Chem. Phys. — 2005. — Vol. 122, № 14. — P. 144107.

49. Pearlman, D. A. The lag between the Hamiltonian and the system configuration in free energy perturbation calculations / D. A. Pearlman, P. A. Kollman // J. Chem. Phys. — 1989. — Vol. 91, № 12, —P. 7831-7839.

50. Straatsma, T. P. Multiconfiguration thermodynamic integration / T. P. Straatsma, J. A. McCammon // J. Chem. Phys. — 1991. — Vol. 95, № 2. — P. 1175-1188.

51. Hendrix, D. A. A "fast growth" method of computing free energy differences / D. A. Hendrix, C. Jarzynski // J. Chem. Phys. —2001. — Vol. 114, № 14. — P. 5974-5981.

52. Warshel, A. Dynamics of reactions in polar solvents. Semiclassical trajectory studies of electron-transfer and proton-transfer reactions / A. Warshel // J. Phys. Chem. — 1982. — Vol. 86, № 12. — P. 2218-2224.

53. Sham, Y. Y. Examining methods for calculations of binding free energies: LRA, LIE, PDLD-LRA, and PDLD/S-LRA calculations of ligands binding to an HIV protease / Y. Y. Sham, Z. T. Chu, H. Tao et al. // Proteins. — 2000. — Vol. 39, № 4. — P. 393-407.

54. Aqvist, J. A new method for predicting binding affinity in computer-aided drug design / J. Aqvist, C. Medina, and J. E. Samuelsson // Protein Eng. — 1994. — Vol. 7, № 3. — P. 38591.

55. Hansson, T. Ligand binding affinity prediction by linear interaction energy methods / T. Hansson, J. Marelius, and J. Aqvist // Journal of Computer-Aided Molecular Design. —1998. — Vol. 12, № 1. —P. 27-35.

56. Wall, I. D. Binding constants of neuraminidase inhibitors: An investigation of the linear interaction energy method / I. D. Wall, A. R. Leach, D. W. Salt et al. // J. Med. Chem. —1999. — Vol. 42, № 25. — P. 5142-52.

57. Carlson, H. A. An Extended Linear Response Method for Determining Free Energies of Hydration / H. A. Carlson, W. L. Jorgensen // J. Phys. Chem. — 1995. — Vol. 99, № 26. — P. 10667-10673.

58. Lee, B. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility / B. Lee, F. M. Richards // J. Mol. Biol. — 1971. — Vol. 55, № 3. — P. 379-400.

59. Hermann, R. B. Theory of hydrophobic bonding. II. Correlation of hydrocarbon solubility in181water with solvent cavity surface area / R. B. Hermann // J. Phys. Chem. — 1972. — Vol. 76, № 19. — P. 2754-2759.

60. Sitkoff, D. Accurate Calculation of Hydration Free Energies Using Macroscopic Solvent Models / D. Sitkoff, K. A. Sharp, and B. Honig // J. Phys. Chem. — 1994. — Vol. 98, № 7.1. P. 1978-1988.

61. Lavigne, P. Structure-based thermodynamic analysis of the dissociation of protein phosphatase-1 catalytic subunit and microcystin-LR docked complexes / P. Lavigne, J. R. Bagu, R. Boyko et al. // Protein Sci. — 2000. — Vol. 9, № 2. — P. 252-64.

62. Stouten, P. F. W. An Effective Solvation Term Based on Atomic Occupancies for Use in Protein Simulations / P. F. W. Stouten, C. Frommel, H. Nakamura etal. // Molecular Simulation. — 1993. — Vol. 10, № 2. — P. 97-120.

63. Baker, N. A. Poisson-Boltzmann methods for biomolecular electrostatics / N. A. Baker // Methods Enzymol. — 2004. — Vol. 383, №. — P. 94-118.

64. Bashford, D. Generalized born models of macromolecular solvation effects / D. Bashford,

65. D. A. Case // Annu. Rev. Phys. Chem. — 2000. — Vol. 51, №. — P. 129-52.

66. Mehler, E. L. Electrostatic effects in proteins: comparison of dielectric and charge models /

67. E. L. Mehler, T. Solmajer // Protein Eng. — 1991. — Vol. 4, № 8. — P. 903-10.

68. Mehler, E. L. The role of hydrophobic microenvironments in modulating pKa shifts in proteins / E. L. Mehler, M. Fuxreiter, I. Simon et al. // Proteins. — 2002. — Vol. 48, № 2.1. P. 283-92.

69. Bohm, H. J. The development of a simple empirical scoring function to estimate the binding constant for a protein-ligand complex of known three-dimensional structure / H. J. Bohm // J. Comput. Aided Mol. Des. — 1994. — Vol. 8, № 3. — P. 243-56.

70. Gohlke, H. Knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions / H. Gohlke, M. Hendlich, and G. Klebe // J. Mol. Biol. — 2000. — Vol. 295, № 2. — P. 337-56.

71. Friesner, R. A. Extra precision glide: docking and scoring incorporating a model of hydrophobic enclosure for protein-ligand complexes / R. A. Friesner, R. B. Murphy, M. P. Repasky et al. // J. Med. Chem. — 2006. — Vol. 49, № 21. — P. 6177-96.

72. Brooks, B. CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations / B. Brooks, R. Bruccoleri, B. Olafson et al. // J. Comput. Chem. — 1983. — Vol. 4, №2. —P. 187-217.

73. Mehler, E. L. A self-consistent, microenvironment modulated screened coulomb potential approximation to calculate pH-dependent electrostatic effects in proteins / E. L. Mehler, F.182

74. Guarnieri // Biophys. J. — 1999. — Vol. 77, № 1. — P. 3-22.

75. Shoichet, B. K. Virtual screening of chemical libraries / B. K. Shoichet // Nature. — 2004.

76. Vol. 432, № 7019. — P. 862-5.

77. Rester, U. From virtuality to reality Virtual screening in lead discovery and lead optimization: a medicinal chemistry perspective / U. Rester // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. —2008.—Vol. 11,№4, —P. 559-68.

78. Rollinger, J. M. Virtual screening for the discovery of bioactive natural products / J. M. Rollinger, H. Stuppner, and T. Langer // Prog. Drug Res. — 2008. — Vol. 65, №. — P. 211, 213-49.

79. Waszkowycz, B. Large-scale virtual screening for discovering leads in the postgenomic era / B. Waszkowycz, T. D. J. Perkins, R. A. Sykes et al. // IBM Syst. J. — 2001. — Vol. 40, №.1. P. 360-376.

80. Berman, H. M. The Protein Data Bank / H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng et al. // Nucleic Acids Res. — 2000. — Vol. 28, № 1. — P. 235-42.

81. Reiss, T. Drug discovery of the future: the implications of the human genome project / T. Reiss // Trends Biotechnol. — 2001. — Vol. 19, № 12. — P. 496-9.

82. Stahura, F. L. Virtual screening methods that complement HTS / F. L. Stahura, J. Bajorath // Comb. Chem. High Throughput Screen. — 2004. — Vol. 7, № 4. — P. 259-69.

83. Schneider, G. Virtual screening and fast automated docking methods / G. Schneider, H. J. Bohm // Drug Discov. Today. — 2002. — Vol. 7, № 1. — P. 64-70.

84. Koppen, H. Virtual screening what does it give us? / H. Koppen // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. — 2009. — Vol. 12, № 3. — P. 397-407.

85. Leach, A. R. An Introduction to Chemoinformatics. / A. R. Leach, V. J. Gillet. Springer, 2003.-255 p. - ISBN 978-1-4020-1347-8.

86. Cross, J. B. Comparison of several molecular docking programs: pose prediction and virtual screening accuracy / J. B. Cross, D. C. Thompson, B. K. Rai et al. // J. Chem. Inf. Model.2009. — Vol. 49, № 6. — P. 1455-74.

87. Novikov, F. N. Improving performance of docking-based virtual screening by structural filtration / F. N. Novikov, V. S. Stroylov, O. V. Stroganov et al. // J. Mol. Model. — 2010.

88. Vol. 16, № 7. — P. 1223-30.

89. Krogsgaard-Larsen, P. Textbook of Drug Design and Discovery, 3rdEdition. London and New York: Tayor and Francis, 2002 / P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors, and U. Madsen // Journal of Pharmacy and Pharmacology. — 2003. — Vol. 55, № 10. — P. 1449-1449.

90. Warr, W. Fragment-based drug discovery / W. Warr // Journal of Computer-Aided Molecular Design. — 2009. — Vol. 23, № 8. — P. 453-458.

91. Hajduk, P. J. A decade of fragment-based drug design: strategic advances and lessons learned / P. J. Hajduk, J. Greer // Nat. Rev. Drug Discov. — 2007. — Vol. 6, № 3. — P. 2119.

92. Hann, M. M. Pursuing the leadlikeness concept in pharmaceutical research / M. M. Hann, T.

93. Oprea // Curr. Opin. Chem. Biol. — 2004. — Vol. 8, № 3. — P. 255-63.

94. Congreve, M. Recent developments in fragment-based drug discovery / M. Congreve, G. Chessari, D. Tisi et al. // J. Med. Chem. — 2008. — Vol. 51, № 13. — P. 3661-80.

95. Hajduk, P. J. Puzzling through fragment-based drug design / P. J. Hajduk // Nat. Chem. Biol.2006. — Vol. 2, № 12. — P. 658-9.

96. Murray, C. W. Application of fragment screening by X-ray crystallography to beta-secretase / C. W. Murray, O. Callaghan, G. Chessari et al. // J. Med. Chem. — 2007. — Vol. 50, №6, —P. 1116-23.

97. Congreve, M. Application of fragment screening by X-ray crystallography to the discovery of aminopyridines as inhibitors of beta-secretase / M. Congreve, D. Aharony, J. Albert et al. // J. Med. Chem. — 2007. — Vol. 50, № 6. — P. 1124-32.

98. Nienaber, V. L. Discovering novel ligands for macromolecules using X-ray crystallographic screening / V. L. Nienaber, P. L. Richardson, V. Klighofer et al. // Nat. Biotechnol. — 2000.—Vol. 18, № 10, —P. 1105-8.

99. Jhoti, H. Fragment-based screening using X-ray crystallography and NMR spectroscopy / H. Jhoti, A. Cleasby, M. Verdonk et al. // Curr. Opin. Chem. Biol. — 2007. — Vol. 11, № 5.1. P. 485-93.

100. Poulsen, S.-A. In Situ Fragment-Based Medicinal Chemistry: Screening by Mass Spectrometry. Fragment-Based Drug Discovery. / S.-A. Poulsen, G. H. Kruppa. Chichester, UK : John Wiley & Sons, Ltd., 2008. P. 159-198. - ISBN 9780470721551.

101. Ciulli, A. Probing hot spots at protein-ligand binding sites: a fragment-based approach using biophysical methods / A. Ciulli, G. Williams, A. G. Smith et al. // J. Med. Chem. — 2006.

102. Vol. 49, № 16. — P. 4992-5000.

103. Neumann, T. SPR-based fragment screening: advantages and applications / T. Neumann, H. D. Junker, K. Schmidt et al. // Curr. Top. Med. Chem. — 2007. — Vol. 7, № 16. — P. 1630-42.

104. Miura, T. Fragment screening using surface plasmon resonance optical biosensor technology / T. Miura // Yakugaku Zasshi. — 2010. — Vol. 130, № 3. — P. 341-8.

105. Kuntz, I. D. The maximal affinity of ligands / I. D. Kuntz, K. Chen, K. A. Sharp etal. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96, № 18. — P. 9997-10002.

106. Bembenek, S. Ligand efficiency and fragment-based drug discovery / S. Bembenek, B. Tounge, and C. Reynolds // Drug Discov. Today. — 2009. — Vol. 14, № 5-6. — P. 278-283.

107. Chessari, G. From fragment to clinical candidate—a historical perspective / G. Chessari, A. J. Woodhead // Drug Discov. Today. — 2009. — Vol. 14, № 13-14. — P. 668-75.

108. Abad-Zapatero, C. Ligand efficiency indices as guideposts for drug discovery / C. Abad-Zapatero, J. T. Metz // Drug Discov. Today. — 2005. — Vol. 10, № 7. — P. 464-9.

109. Hubbard, R. Fragment approaches in structure-based drug discovery / R. Hubbard // Journal of Synchrotron Radiation. — 2008. — Vol. 15, № 3. — P. 227-230.

110. Congreve, M. A 'rule of three' for fragment-based lead discovery? / M. Congreve, R. Carr,

111. C. Murray et al. // Drug Discov. Today. — 2003. — Vol. 8, № 19. — P. 876-7.

112. Schade, M. NMR fragment screening: Advantages and applications / M. Schade // IDrugs.2006. — Vol. 9, № 2. — P. 110-3.

113. Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography / M. J. Hartshorn, C. W. Murray, A. Cleasby et al. // J. Med. Chem. — 2005. — Vol. 48, № 2. — P. 403-13.

114. Huber, W. A new strategy for improved secondary screening and lead optimization using high-resolution SPR characterization of compound-target interactions / W. Huber // J. Mol. Recognit. — 2005. — Vol. 18, № 4. — P. 273-81.

115. Mercier, K. A. Design and characterization of a functional library for NMR screening against novel protein targets / K. A. Mercier, K. Germer, and R. Powers // Comb. Chem. High Throughput Screen. — 2006. — Vol. 9, № 7. — P. 515-34.

116. Hajduk, P. J. Integration of NMR and high-throughput screening / P. J. Hajduk, D. J. Burns // Comb. Chem. High Throughput Screen. — 2002. — Vol. 5, № 8. — P. 613-21.

117. Bayley, D. Fragment-based drug design: why it's so important? Электронный ресурс. /

118. D. Bayley, S. Boyd. 2009. - Режим доступа:http://www.iotanharma.com/data2/FBDDOverview.pdf, свободный. — Загл. с экрана.

119. Artis, D. R. Scaffold-based discovery of indeglitazar, a PPAR pan-active anti-diabetic agent / D. R. Artis, J. J. Lin, C. Zhang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2009. — Vol. 106, № 1. —P. 262-7.

120. Calderwood, S. K. Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis / S. K. Calderwood, M. A. Khaleque, D. B. Sawyer et al. // Trends Biochem. Sci. — 2006. — Vol. 31, №3. —P. 164-72.

121. Huth, J. R. Discovery and design of novel HSP90 inhibitors using multiple fragment-based design strategies / J. R. Huth, C. Park, A. M. Petros et al. // Chem. Biol. Drug Des. — 2007.—Vol. 70,№ 1. —P. 1-12.

122. ACD ChemSketch Freeware Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch, свободный. — Загл. с экрана.

123. CORINA Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.molecular-networks.com/products/corina, свободный. - Загл. с экрана.

124. GAUSSIAN Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.gaussian.com, свободный. - Загл. с экрана.

125. Humphrey, W. VMD: visual molecular dynamics / W. Humphrey, A. Dalke, and K. Schulten // J. Mol. Graph. — 1996. — Vol. 14, № 1. — P. 33-8,27-8.

126. Schrodinger. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3 Электронный ресурс.

127. Режим доступа: http://www.pymol.org/pvmoL свободный. — Загл. с экрана.

128. PerlMol Perl Modules for Molecular Chemistry Электронный ресурс. / I. Tubert-Brohman. - Режим доступа: http://www.perlmol.org, свободный. — Загл. с экрана.

129. Guha, R. The Blue Obelisk-interoperability in chemical informatics / R. Guha, M. T. Howard, G. R. Hutchison et al. // J. Chem. Inf. Model. — 2006. — Vol. 46, № 3. — P. 991-8.

130. VitasM Laboratory Электронный ресурс. Режим доступа: http://vitasmlab.com, свободный. - Загл. с экрана.

131. Enamine Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.enamine.net свободный.1. Загл. с экрана.

132. Neria, Е. Simulation of activation free energies in molecular systems / E. Neria, S. Fischer, and M. Karplus // J. Chem. Phys. — 1996. — Vol. 105, № 5. — P. 1902-1921."

133. Mehler, E. L. Self-Consistent, Free Energy Based Approximation To Calculate pll Dependent Electrostatic Effects in Proteins / E. L. Mehler // J. Phys. Chem. — 1996. — Vol. 100, №39. —P. 16006-16018.

134. Gasteiger, J. Empirical approaches to the calculation of properties, in Chemoinformatics: a textbook. / J. Gasteiger, T. Engel. Darmstadt, Germany: Wiley-VCH, 2003. - 680 p. -ISBN 978-3-527-30681-7.

135. Caliper LifeSciences Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.caliperls.com/products/contract-research/in-vitro/kinases/cdk2cyclina-h.htm, свободный. - Загл. с экрана.

136. Reaction Biology Corp. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.reactionbiologv.com/Kinases/Invitrogenl00114/ABLl T315I.pdf, свободный.1. Загл. с экрана.

137. Zarrinkar, P. P. АС220 is a uniquely potent and selective inhibitor of FLT3 for the treatment of acute myeloid leukemia (AML) / P. P. Zarrinkar, R. N. Gunawardane, M. D. Cramer et al. // Blood. — 2009. — Vol. 114, № 14. — P. 2984-92.

138. Fabian, M. A. A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors / M. A. Fabian, W. H. Biggs, 3rd, D. K. Treiber et al. // Nat. Biotechnol. — 2005. — Vol. 23, № 3.1. P. 329-36.

139. Karaman, M. W. A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity / M. W. Karaman, S. Herrgard, D. K. Treiber et al. // Nat. Biotechnol. — 2008. — Vol. 26, № 1. — P. 127-32.

140. DesJarlais, R. L. Structure-based design of nonpeptide inhibitors specific for the human immunodeficiency virus 1 protease / R. L. DesJarlais, G. L. Seibel, I. D. Kuntz et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1990. — Vol. 87, № 17. — P. 6644-8.

141. Shoichet, В. K. Structure-based discovery of inhibitors of thymidylate synthase / В. K. Shoichet, R. M. Stroud, D. V. Santi et al. // Science. — 1993. — Vol. 259, № 5100. — P.1861445-50.

142. Gruneberg, S. Successful virtual screening for novel inhibitors of human carbonic anhydrase: strategy and experimental confirmation / S. Gruneberg, M. T. Stubbs, and G. Klebe // J. Med. Chem. — 2002. — Vol. 45, № 17. — P. 3588-602.

143. Powers, R. A. Structure-based discovery of a novel, noncovalent inhibitor of AmpC beta-lactamase / R. A. Powers, F. Morandi, and B. K. Shoichet // Structure. — 2002. — Vol. 10, №7. —P. 1013-23.

144. Stahl, M. Detailed analysis of scoring functions for virtual screening / M. Stahl, M. Rarey // J. Med. Chem. — 2001. — Vol. 44, № 7. p. 1035-42.

145. Huang, N. Benchmarking Sets for Molecular Docking /N. Huang, B. K. Shoichet, and J. J. Irwin// J. Med. Chem. — 2006. — Vol. 49, № 23. — P. 6789-6801.

146. Verdonk, M. L. Virtual screening using protein-ligand docking: avoiding artificial enrichment / M. L. Verdonk, V. Berdini, M. J. Hartshorn et al. // J. Chem. Inf. Comput. Sci. — 2004. — Vol. 44, № 3. — P. 793-806.

147. Novikov, F. N. Developing novel approaches to improve binding energy estimation and virtual screening: a PARP case study / F. N. Novikov, V. S. Stroylov, O. V. Stroganov et al. //J. Mol. Model. —2009.—Vol. 15, № 11. — P. 1337-47.

148. Xiao, S. H. An ultrasensitive high-throughput electrochemiluminescence immunoassay for the Cdc42-associated protein tyrosine kinase ACK1 / S. H. Xiao, E. Farrelly, J. Anzola et al. //Anal. Biochem. — 2007. — Vol. 367, № 2. — P. 179-89.

149. Korkina, L. The chemical defensive system in the pathobiology of idiopathic environment-associated diseases / L. Korkina, M. G. Scordo, I. Deeva et al. // Curr. Drug Metab. — 2009.—Vol. 10,№8.— P. 914-31.

150. Kohyama, N. Inhibition of arachidonate lipoxygenase activities by 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethanol, a phenolic compound from olives / N. Kohyama, T. Nagata, S.

151. Fujimoto et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1997. — Vol. 61, № 2. — P. 347-50.

152. Pevarello, P. 3-Aminopyrazole inhibitors of CDK2/cyclin A as antitumor agents. 1. Lead finding / P. Pevarello, M. G. Brasca, R. Amici et al. // J. Med. Chem. — 2004. — Vol. 47, № 13. —P. 3367-80.

153. Congreve, M. S. Detection of ligands from a dynamic combinatorial library by X-ray crystallography / M. S. Congreve, D. J. Davis, L. Devine et al. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. — 2003. — Vol. 42, № 37. — P. 4479-82.

154. Aronov, A. M. Flipped out: structure-guided design of selective pyrazolylpyrrole ERK inhibitors / A. M. Aronov, C. Baker, G. W. Bemis et al. // J. Med. Chem. — 2007. — Vol. 50, №6. —P. 1280-7.

155. Gill, A. L. Identification of novel p38alpha MAP kinase inhibitors using fragment-based lead generation / A. L. Gill, M. Frederickson, A. Cleasby et al. // J. Med. Chem. — 2005. — Vol. 48, № 2. — P. 414-26.

156. Howard, S. Fragment-based discovery of the pyrazol-4-yl urea (AT9283), a multitargeted kinase inhibitor with potent aurora kinase activity / S. Howard, V. Berdini, J. A. Boulstridge et al. // J. Med. Chem. — 2009. — Vol. 52, № 2. — P. 379-88.

157. Hajduk, P. J. Identification of novel inhibitors of urokinase viaNMR-based screening / P. J. Hajduk, S. Boyd, D. Nettesheim et al. // J. Med. Chem. — 2000. — Vol. 43, № 21. — P. 3862-6.

158. Frederickson, M. Fragment-based discovery of mexiletine derivatives as orally bioavailable inhibitors of urokinase-type plasminogen activator / M. Frederickson, O. Callaghan, G. Chessari etal. //J. Med. Chem. — 2008. — Vol. 51, № 2. — P. 183-6.

159. Agnelli, G. A phase II study of the oral factor Xa inhibitor LY517717 for the prevention of venous thromboembolism after hip or knee replacement / G. Agnelli, S. Haas, J. S. Ginsberg et al. // J. Thromb. Haemost. — 2007. — Vol. 5, № 4. p. 746-53.

160. Pang, Y.-P. Highly Potent, Selective, and Low Cost Bis-tetrahydroaminacrine Inhibitors of Acetylcholinesterase / Y.-P. Pang, P. Quiram, T. Jelacic et al. // Journal of Biological Chemistry. — 1996. — Vol. 271, № 39. — P. 23646-23649.

161. Murray, C. W. Application of Fragment Screening by X-ray Crystallography to p-Secretase / C. W. Murray, O. Callaghan, G. Chessari et al. // J. Med. Chem. — 2007. — Vol. 50, № 6.1. P. 1116-1123.

162. Hochgurtel, M. Target-induced formation of neuraminidase inhibitors from in vitro virtual combinatorial libraries / M. Hochgurtel, H. Kroth, D. Piecha et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2002. — Vol. 99, № 6. — P. 3382-7.

163. Rath, V. L. Human liver glycogen phosphorylase inhibitors bind at a new allosteric site / V. L. Rath, M. Ammirati, D. E. Danley et al. // Chem. Biol. — 2000. — Vol. 7, № 9. — P. 677-82.

164. Card, G. L. A family of phosphodiesterase inhibitors discovered by cocrystallography and scaffold-based drug design / G. L. Card, L. Blasdel, B. P. England et al. // Nat. Biotechnol.2005. — Vol. 23, № 2. — P. 201-7.

165. Burgess, L. E. Potent selective nonpeptidic inhibitors of human lung tryptase / L. E. Burgess, B. J. Newhouse, P. Ibrahim etal. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96, № 15. — P. 8348-52.

166. Dymock, B. W. Novel, potent small-molecule inhibitors of the molecular chaperone Hsp90 discovered through structure-based design / B. W. Dymock, X. Barril, P. A. Brough et al. //

167. J. Med. Chem. — 2005. — Vol. 48, № 13. — P. 4212-5.

168. Hohwy, M. Novel prostaglandin D synthase inhibitors generated by fragment-based drug design / M. Hohwy, L. Spadola, B. Lundquist et al. // J. Med. Chem. — 2008. — Vol. 51, №7. —P. 2178-86.

169. Liu, T. BindingDB: a web-accessible database of experimentally determined protein-ligand binding affinities / T. Liu, Y. Lin, X. Wen et al. // Nucleic Acids Res. — 2007. — Vol. 35, № Database issue. — P. D198-201.

170. Pevarello, P. 3-Aminopyrazole inhibitors of CDK2/cyclin A as antitumor agents. 2. Lead optimization / P. Pevarello, M. G. Brasca, P. Orsini et al. // J. Med. Chem. — 2005. — Vol. 48, №8, —P. 2944-56.

171. Kim, K. S. Discovery of aminothiazole inhibitors of cyclin-dependent kinase 2: synthesis, X-ray crystallographic analysis, and biological activities / K. S. Kim, S. D. Kimball, R. N. Misra et al. // J. Med. Chem. — 2002. — Vol. 45, № 18. — P. 3905-27.

172. Thompson, J. E. Photochemical preparation of a pyridone containing tetracycle: a Jak protein kinase inhibitor / J. E. Thompson, R. M. Cubbon, R. T. Cummings et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 2002. — Vol. 12, № 8. — P. 1219-23.

173. Schlapbach, A. Pyrrolo-pyrimidones: a novel class of MK2 inhibitors with potent cellular activity / A. Schlapbach, R. Feifel, S. Hawtin et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 2008. — Vol. 18, №23. — P. 6142-6.

174. Furet, P. Structure-based design and protein X-ray analysis of a protein kinase inhibitor / P. Furet, T. Meyer, A. Strauss et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 2002. — Vol. 12, № 2. — P. 221-4.