Молекулярное распознавание рибонуклеотидов на планарных матрицах дифильных металлокомплексов циклена тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Турыгин Дмитрий Сергеевич

МОЛЕКУЛЯРНОЕ РАСПОЗНАВАНИЕ РИБОНУКЛЕОТИДОВ НА ПЛАНАРНЫХМАТРИЦАХ ДИФИЛЬНЫХ МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ ЦИКЛЕНА

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003476543

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Научные руководители:

кандидат химических наук Калинина Мария Александровна

доктор химических наук, профессор Арсланов Владимир Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Вацадзе Сергей Зурабович

доктор физико-математических наук Долинный Анатолий Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Защита состоится «01» октября 2009 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д002.259.02 в конференц-зале ИФХЭ РАН по адресу: г. Москва, Ленинский проспект, д.31, к.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химической литературы РАН по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский пр., д.31, ИОНХ

Автореферат разослан «31» августа 2009 г.

Ученый секретарь Совета,

кандидат химических наук

Н.П.Платонова

Актуальность проблемы. Одна из важнейших задач современной физической химии супрамолекулярных систем состоит в получении биомиметических структур, имитирующих работу биологических объектов при физиологических условиях. Среди основных типов взаимодействий, использующихся в супрамолекулярной химии, особое место занимает образование комплементарных пар между пуриновыми и пиримидиновыми нуклеооснованиями за счет ароматического стекинга и водородных связей. Этот сравнительно простой структурный мотив является основой хранения и передачи генетической информации и многих других ключевых метаболических взаимодействий рецептор-субстрат, в том числе, и при передаче нервных импульсов. Специфичность и простота таких взаимодействий обуславливают интерес к организованным планарным ансамблям нуклеооснований для контролируемой сборки искусственных функциональных систем по принципу «снизу-вверх», создания биоподобных наноразмерных хранилищ информации, эффективных биосенсоров и пр.

Одной из двух главных проблем в этой области является преодоление конкурентной сольватации при сборке простых компонентов (нуклеооснований, нуклеотидов или их синтетических аналогов) в сложные структуры в присутствии воды. В планарных системах, контактирующих с водной фазой, эта проблема решается за счет резкого градиента свойств среды (в том числе, диэлектрической проницаемости) вблизи границы гидрофобная фаза/водный раствор, позволяющего многократно усилить эффективность образования водородных связей. Возможности этого подхода были продемонстрированы на большом числе примеров «планарных рецепторов» в монослоях Ленгмюра из дифильных производных нуклеооснований и сходных соединений, обеспечивающих связывание комплементарных субстратов из субфазы с исключительной селективностью. Вторая проблема заключается в обеспечении благоприятных стерических условий для комплементарных взаимодействий в ультратонкой пленке, поскольку стерический фактор играет ключевую роль в молекулярном распознавании с участием водородных связей, обладающих пространственной направленностью. Взаимодействия компонентов системы между собой, их разориентация и взаимодействия с подложкой неизбежно приводят к снижению эффективности взаимодействий с субстратом. В этом отношении метод монослоев Ленгмюра по сравнению с другими методами создания планарных систем (например, методом самоорганизованных монослоев, или САМ) обладает особой ценностью, так как позволяет настраивать стерические условия в молекулярном ансамбле за счет изменения плотности упаковки и взаимной ориентации молекул на поверхности жидкости.

Однако, создание комплементарных систем из таких монослоев-прекурсоров ла твердой поверхности (пленок Ленгмюра-Блоджетт, или ПЛБ) требует особого подхода, поскольку в традиционных полислойных ПЛБ молекулярному распознаванию препятствуют диффузионные и стерические ограничения, а получение монослойных ПЛБ Х-типа (т.е. таких, в которых функциональные гидрофильные группы были бы ориентированы в направлении от положки и доступны для взаимодействий) сопряжено со значительными трудностями в силу термодинамической нестабильности таких систем. Одной из возможных стратегий для решения этой задачи является иерархическая супрамолекулярпая сборка комплементарной системы на активной матрице, созданной из

предорганизованного монослоя-прекурсора синтетических рецепторов, стабилизированного САМ, на твердой поверхности. Активная матрица должна быть способна связывать соединения, несущие нуклеооснований, инициировать дальнейшую самоорганизацию системы за счет образования комплементарных пар и минимизировать влияние подложки и стерически неблагоприятных взаимодействий между нуклеооснованиями внутри планарного ансамбля. В качестве рецепторов для создания активной матрицы особый интерес представляют металлокомплексы макроциклических полиаминов (цикленов), обладающие сродством по отношению к ряду анионов, в том числе, имид- и фосфат-дианионам, являющимся компонентами простых рибо- и дезоксирибонуклеотидов. Поверхность, декорированная такими комплексами, может быть потенциально пригодна для контролируемой количественной иммобилизации нуклеотидов всех пяти семейств в любых соотношениях. Актуальность создания активных матриц на основе металлокомплексов циклена продиктована также и их способностью выступать в роли биомиметиков ряда металлопротеинов (транскрипционных факторов, карбангидразы и др.), а также активностью в отношении ряда протеинов вирусов, в том числе, вируса ВИЧ.

Цель работы состоит в создании предорганизованных матриц металлокомплексов циклена для самосборки рибонуклеотидов в комплементарные бислои из водных растворов, а также исследовании механизмов специфического молекулярного распознавания нуклеотидов и их фрагментов за счет последовательных нековалентных взаимодействий на межфазной границе.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1) изучение молекулярного распознавания фосфат-анионов и нуклеооснований (компонентов нуклеотидов) в монослоях Ленгмюра на основе дифильных цинк-содержащих металлокомплексов моно- и бис-цикленов;

2) создание активных композитных матриц на основе самоорганизованных монослоев и однослойных пленок Ленгмюра-Блоджетг Х-типа дифильных металлокомплексов циклена;

3) изучение молекулярного распознавания нуклеотидов и их компонентов из водных растворов активными матрицами, иммобилизованными на твердой подложке;

4) определение основных термодинамических и кинетических параметров связывания исследованных соединений с активными матрицами и выявление его механизма.

Научная новизна состоит в развитии физико-химических принципов формирования и функционирования активных двумерных матриц из синтетических рецепторов металлокомплексов дифильных макроциклических тетраминов для высокоспецифичного моно- и дивалентного связывания рибонуклеотидов и их фрагментов.

1. Впервые исследовано связывание нуклеооснований и фосфат-дианиона монослоями Ленгмюра из меггаллокомплекса дифильного циклена и продемонстрирован эволюционный характер процесса молекулярного распознавания в его монослоях на поверхности раздела воздух/вода. Выявлена взаимосвязь между эффективностью образования металлокомплексов и последующим имидным и фосфатным распознаванием в монослое; обнаружен

эффект ингибирования молекулярного распознавания в присутствии следовых количеств меди.

2. Впервые разработана оригинальная методика формирования чувствительных однослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт Х-типа на основе макроциклических соединений на твердых поверхностях, модифицированных самоорганизованными монослоями тиолов (композитные матрицы САМ/ПЛБ).

3. Подробно изучено молекулярное распознавание неорганических фосфатов, нуклеооснований и нуклеотидов на активных матрицах САМ/ПЛБ на основе макроциклических моно- и бис-цикленов.

4. Выявлена определяющая роль молекулярной структуры макроциклического меташгокомгогекса в многоцентровом имидном распознавании в композитных матрицах на твердых подложках.

5. Рассчитаны основные термодинамические и кинетические параметры связывания нуклеотидов и их компонентов с активными матрицами, предложен механизм взаимодействия исследованных соединений с планарным ансамблем металлорецептов. Показано, что иммобилизация металлокомплексов в САМ/ПЛБ увеличивает сродство металлорецептора по отношению к фосфат-анионам в 6 раз.

6. Впервые реализована сборка гомогенных комплементарных бислоев нуклеотидов групп аденина и урацила («двойные плоскости») на композитных матрицах моноциклического производного циклена в водной среде

7. Впервые продемонстрировано двухцентровое связывание уридинмонофосфата активными матрицами на основе бис-(2п2+-циклена).

Практическая значимость работы. Созданы ППР-чипы на основе монослоев цинксодержащих комплексов производных циклена для распознавания имидной группы биологически важных молекул, для неорганического фосфат-аниона и связывания нуклеотидов в водной среде. Чувствительность созданных сенсорных элементов на основе САМ/ПЛБ дицетилциклена составляет 5*10'9 М для фосфат-анионов и 10"4 М для нуклеооснований пиримидинового ряда.

На защиту выносятся

• экспериментальные данные по молекулярному распознаванию анионов и молекулярных фрагментов в монослоях Ленгмюра металлокомплексов Zn2+-

ДДЦ;

• способ формирования композитных матриц на основе самоорганизованных монослоев и пленок Ленгмюра-Блоджетт для селективного связывания компонентов нуклеотидов

• данные о молекулярном распознавании имидов и фосфатов активными матрицами металлокомплексов Zn^-ДЦЦ;

• результаты исследования моновалентного и бивалентного связывания нуклеотидов САМ/ПЛБ на основе 7п2+-ДЦЦ и Zn2+-BU,.

• результаты кинетической и термодинамической обработок процессов связывания нуклеотидов и их фрагментов на активных матрицах 2п2+-ДЦЦ

Личный вклад автора: Диссертантом получены основные экспериментальные результаты, рассчитаны кинетические и термодинамические

параметры изученных процессов, сформулированы положения, выносимые на защиту, и выводы.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных конференциях: International Conf, dedicated to the 60th anniversary of the IPC RAS, (Moscow, Russia, 2005), IVth International symposium "Design and synthesis of Supramolecular architectures (Kazan, Russia, 2006), IIId International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" (Tuapse, Russia, 2006), XIII Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, Марийская республика, Россия, 2006), XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Москва, Россия, 2007), XIV Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, Марийская республика, Россия, 2007), IVth International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" (Tuapse, Russia, 2008), Всероссийская школа-конференция «Супрамолекулярные системы на поверхности раздела» Супраз-2009 (Москва, 2009). По результатам работы опубликованы 11 статей и 15 тезисов докладов на научных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по молекулярному распознаванию в планарных биомиметических супрамолекулярных ансамблях, а также свойствам производных циклена в объеме раствора, монослоях Ленгмюра и пленках Ленгмюра-Блоджетт. Вторая глава работы посвящена описанию объектов и методов исследования. В третьей - шестой главах диссертации представлены и обсуждены результаты исследования. Работа изложена на 127 страницах, включая 32 рисунка, 2 таблицы и 120 литературных ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В литературном обзоре рассмотрены публикации, касающиеся закономерностей молекулярного распознавания за счет комплементарных нековалентных взаимодействий в монослоях Ленгмюра, пленках Ленгмюра-Блоджетт и самоорганизованных монослоях тиолов. Обсуждаются основные проблемы, связанные с созданием планарных биомиметических систем на основе синтетических рецепторов. Описаны свойства производных циклена и его металлокомплексов в водных растворах, монослоях Ленгмюра и пленках Ленгмюра-Блоджетт и их значение с точки зрения моделирования и изучения различных биологических процессов. Отмечается отсутствие комплексного подхода к созданию планарных супрамолекулярных систем для контролируемого связывания молекул и их фрагментов, основанного на контроле латеральных стерических условий в ансамбле синтетических рецепторов.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили монослои и ПЛБ дифильных 1,7-дицетилтетрааза-12-краун-4 (дицетилциклен, ДЦЦ) и [4,6-бис-(1,4,7,10-тетраазадоде-1-цил)-[1,3,5]-триазин-2-ил]-октадециламин-цинк(Н)-диперхлората

(ог/с-(1п2т-циклен), ¿п2~-ЪЦ)'. Монослои Ленгмюра формировали нанесением растворов производных циклена в хлороформе на. поверхность водных субфаз с различными значениями рН, концентрации солей металлов и нуклеооснований. Активные матрицы Zn-ДI]Д и 2п2+-БЦ получали переносом их монослоев на тиолированные золотые подложки для электрохимического и спектрального анализа. Связывание нуклеотидов и их компонентов активными матрицами САМ/ПЛБ исследовали в растворах различных концентраций с рН 7.5.

Исследование монослоев проводили с помощью автоматизированных поверхностных весов Ленгмюра. Для исследования ПЛБ и композитных пленок САМ/ПЛБ использовали методы пьезокварцевого микровзвешивания (ПКМ), спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР), ИК-фурье-спектроскопии, циклической вольтамперометрии (ЦВА).

Результаты и их обсуждение Молекулярное распознавание катионов, анионов и нуклеооснований в монослоях металлокомплексов 2п2+-ДЦЦ.

Создание активных матриц на основе ПЛБ комплексов макроциклических тетрааминов на твердой поверхности, способных связывать молекулярные фрагменты в организованные структуры, требует предварительного изучения молекулярного распознавания в монослоях-прекурсорах, то есть, монослоях Ленгмюра. Такое исследование предоставляет возможность «настраивать» характеристики создаваемого молекулярного ансамбля за счет изменения стерических условий (плотности упаковки и молекулярной ориентации), особенно важных в случае образования координационных и водородных связей, для которых взаимная ориентация и структурное соответствие реагирующих фрагментов являются лимитирующими факторами.

Комплекс циклена с ионом цинка(Н) представляет собой примитивный синтетический аналог активного центра металлоиротеинов, цинк-фингер домена, способного связывать концевую фосфатную (для любых нуклеотидов) и имидную группы нуклеотидов (семейств урацила и тимина) при физиологических условиях. К сожалению, исследование взаимодействий монослоев Ленгмюра ДЦЦ с нуклеотидами сопряжено со значительными экспериментальными трудностями (значительный расход дорогостоящих реагентов, быстрый гидролиз и т.д.). Тем не менее, активность монослоев ДЦЦ и его цинксодержащего комплекса по отношению к нуклеотидам можно приближенно оценить, исследовав связывание такими монослоями простых компонентов нуклеотидов, то есть, комплементарных нуклеооснований (аденина и урацила) и неорганических фосфатов (рис. 1а). Методом монослоев Ленгмюра была исследована адсорбция различных соединений на монослоях ДЦЦ из смешанных субфаз при рН 7.5. Наблюдаемые изменения в поведении монослоя зависят от природы взаимодействий между макроциклом-«хозяином» и адсорбированным веществом (рис.16).

Неспецифическая адсорбция аденина или урацила на монослое ДЦЦ приводит к незначительному уменьшению площади монослоя по сравнению с монослоем на поверхности чистой водной субфазы (кривая 1\ в то время как форма изотермы не изменяется (кривая 2). Образование комплекса гп2+-ДЦЦ в монослое на

* ДЦЦ и гп2+-БЦ синтезированы под руководством профессора Б. Кенига в лаборатории физической органической химии университета Регенсбурга, Германия

поверхности раствора 2пС12 проявляется в существенном увеличении площади монослоя с одновременным уменьшением его сжимаемости (кривая 3) за счет роста элеюростатического отталкивания между заряженными головными группами и увеличения их размера и жесткости при связывании ионов металлов. Площадь, занимаемая монослоем на поверхности эквимолярного раствора 2пСЬ и урацила (кривая 4), заметно уменьшается по сравнению с его площадью на поверхности раствора 2пС1г- Это уменьшение указывает на последовательное связывание ионов цинка и нуклеооснования, поскольку урацил не способен координироваться макроциклом, свободным от иона металла. Аналогичный эффект резкого уменьшения площади монослоя наблюдается и при введении фосфата натрия в субфазу, содержащую ионы цинка (кривая 5), при этом величина смещения изотермы сжатия приблизительно соответствует смещению изотермы в присутствии урацила.

Рис.1. (а) Изотермы сжатия тс (Л) монослоев ДЦЦ, сформированных на поверхности водной субфазы (1), а также водных растворов урацила (10'3 М) (2), 2пС12 (10"4 М) (5) и эквимолярных смесей (2x10"4 М) 2пС1г с урацилом (4) и с Ыа^НРО^ (5); для всех субфаз рН 7.5. Вставка - структурная формула дицетилциклена. (б) Строение комплекса гп2+-циклен с урацилом (1) и фосфатом (2)

Для независимого подтверждения последовательности актов молекулярного распознавания в монослое ДЦЦ и исследования факторов, влияющих на его эффективность, методом пьезокварцевого микровзвешивания были исследованы 15-слойные ПЛБ, сформированные на поверхности пьезокварцевых резонаторов с различных субфаз при поверхностном давлении 23 мН/м. Прирост массы Дт рассчитывали по уменьшению частоты колебаний резонаторов согласно уравнению Зауэрбрея, с учетом коэффициента переноса, варьировавшегося в пределах 0.86-0.97; массу ДЦЦ в полученных пленках (Лта) рассчитывали для каждой ПЛБ исходя из величины молекулярной площади, занимаемой лигандом в монослое Ленгмюра при данном поверхностном давлении. Для всех измеренных образцов частота колебаний резонаторов линейно уменьшалась с увеличением числа слоев ПЛБ. (ПЛБ, содержащие фосфат-анионы, не измерялись, поскольку с поверхности фосфат-содержащих субфаз удалось получить только ПЛБ Х-типа с коэффициентом переноса менее 0.5). Согласно полученным данным (табл. 1), неспецифическая адсорбция урацила и аденина из их индивидуальных растворов на монослое ДЦЦ приводит к незначительному приросту массы ПЛБ, который

приблизительно соответствует связыванию 1 молекулы нуклеооснования на 100 молекул лиганда (система /). В то же время, связывание ионов цинка монослоем ДЦЦ вызывает заметное увеличение массы ПЛБ, полученных с поверхности раствора гпСЬ (10"4 М) (система 2), а масса ПЛБ, полученной с поверхности смешанного эквимолярного раствора гпС12/урацил (2x10"4 М) (система 5), существенно выше массы пленки, сформированной с поверхности индивидуального раствора соли металла при рН субфазы 7.5. Наблюдаемый эффект указывает на специфическое распознавание урацила монослоем Ленгмюра, эффективность которого должна коррелировать с эффективностью образования в монослое комплексов 2п2+-ДЦЦ. Для подтверждения этого предположения монослой ДЦЦ был сформирован и выдержан в течение 2 ч на смешанной субфазе ЗпСЬ/урацил со значением рН 5.5, которое оптимально для связывания цикленом ионов цинка, но термодинамически невыгодно для координации урацила комплексом 2п2+-ДЦЦ. Затем рН субфазы увеличили до значения 7.5 путем добавления в субфазу необходимого количества щелочи, монослой сжали и перенесли на поверхность резонатора, сформировав 15-слойную ПЛБ. Пленка, полученная описанным способом, обладает значительно большей массой, чем ПЛБ, сформированная перенесением монослоев непосредственно с поверхности смешанной субфазы с рН 7.5 (система 4). Полученный результат указывает на то, что количество урацила, адсорбированного на монослое, пропорционально числу комплексов 2п2+-ДЦЦ, образующихся на межфазной границе. На эффективность распознавания имидной группы урацила монослоями ДЦЦ также влияет присутствие ионов меди, способных образовать с макроциклом прочный комплекс (константа устойчивости комплексов Си2+-циклен в растворе примерно на 10 порядков больше, чем константа устойчивости комплекса 2п2+-циклен), не обладающий сродством к урацилу. Введение в смешанную субфазу 2пС12/урацил даже следовых количеств ионов Си2+ (10'8 М), вызывает уменьшение массы ПЛБ (система 5), полученной с поверхности такой субфазы, до значения Дш, совпадающего с измеренным для ПЛБ, полученной с поверхности индивидуального раствора 2пС12. Такое снижение Дт в присутствии ионов меди(П) соответствует резкому уменьшению количества адсорбированного монослоем урацила и обусловлено образованием комплексов Си2+-ДЦЦ, которое приводит к практически полному ингибированию связывания урацила монослоем ДЦЦ. Различная активность ионофора по отношению к этим ионам металлов может быть использована для управления молекулярным распознаванием в планарных системах такого типа, и также имеет определенное значение с точки зрения моделирования некоторых биологических процессов с участием циклена и его производных.

Таблица 1. Относительное изменение массы 15-слойных ПЛБ, сформированных путем переноса монослоев ДЦЦ на поверхность пьезокварцевых резонаторов с

Номер системы Состав субфазы Прирост массы, нг

1 ДЦЦ + урацил/аденин 12/15

2 ДЦЦ + 2гЛ рН 7.5 89

3 ДЦЦ + 2п'+ + урацил, рН 7.5 151

4 ДЦЦ + Ъъ* + урацил, рН 5.5-7.5 ' 240

5 ДЦЦ + + урацил + Си2+ 97

Данные ИК-фурье-спектроскопии для 21-слойных ПЛБ, полученных перенесением монослоев с поверхности субфаз с рН 7.5 и содержащих ZnCl2 или эквимолярные смеси ZnCb/аденин и гпС12/урацил, соответственно, подтверждают специфическое молекулярное распознавание урацила монослоем металлокомплексов ДЦЦ. Спектр ПЛБ, полученной с поверхности смешанной субфазы соль металла/аденин, практически не отличается от спектра ПЛБ, содержащей металлокомплексы гп2+-ДЦЦ, что говорит об отсутствии взаимодействий между монослоем металлокомплексов 2п2+-ДЦЦ и аденином. В спектре ПЛБ, полученной с поверхности смешанной субфазы гпСУурацил наблюдали резкое смещение и уменьшение интенсивности полос в области 1200-1280 см"1, которые, согласно литературным данным, характерны для комплексов производных 2п2+-пиклена в объеме водных растворов. Замена молекулы воды, завершающей хелатную сферу металлокомплекса, на имидяую или фосфатную группы приводит к изменению спектральной картины, аналогичному обнаруженному в данной работе. Кроме того, в спектре такой ПЛБ появляется полоса 1716 см"1, соответствующая симметричным валентным колебаниям vs(C=0) имидных групп урацила.

На основании полученных данных можно заключить, что ДЦЦ в монослое Ленгмюра образует устойчивый металлокомплекс с ионами цинка в плоской квадратной конфигурации цикла, поскольку только в такой конфигурации достигается необходимое для связывания имидной группы увеличение льюисовской кислотности иона металла (от 9.8 для сольватированного иона цинка в объеме раствора до 7.9 для иона, координированного в полости макроцикла). Образование такого комплекса обеспечивает последующее связывание имидной групы урацила за счет образования сильной связи Zn2+-N" (имид), при этом образующаяся структура стабилизирована водородными связями между кислородными атомами симметрично расположенных карбонильных групп урацила и незамещенными NH-группами циклена. Таким образом, эффективность молекулярного распознавания прямо зависит от эффективности образования металлокомплексов в планарной системе. Высокоспецифичная координация имидной группы урацила на металлокомплексе обеспечивает селективнсть связывания по отношению к урацилу (по сравнению с аденином). Эта особенность комплексов Zn2+-UHKJieH потенциально позволяет системе "различать" пуриновые и пиримидиновые основания распознаваемого субстрата (например, раствора смеси нуклеотидов).

Молекулярное распознавание нуклеооснований и неорганических фосфатов активными матрицами металлокомплексов гп2+-ДЦЦ.

Формирование планарной системы из монослоя-прекурсора на твердой поверхности требует разработки особой методики. Диффузионные ограничения в полислойной ПЛБ на основе ДЦЦ являются лимитирующим фактором для связывания молекул и молекулярных фрагментов, обладающих существенно ббльшими размерами, чем, например, ионы металлов, и реализация стерически зависимого специфического связывания в такой системе представляется маловероятной. Очевидно, что для эффективного связывания молекулярных фрагментов такими ПЛБ, макроциклические группы должны быть доступны для распознавания субстрата, то есть, экспонированы в раствор и ориентированы параллельно поверхности подложки. Сохранение необходимой взаимной

ориентации циклена и реагирующей с ним молекулы может быть достигнуто в монослойной пленке Ленгмюра-Блоджетт Х-типа, т.е. в монослое с гидрофильными группами, обращенными в направлении от гидрофобной подложки. Однако, в силу термодинамических ограничений, монослойные пленки Х-типа чрезвычайно трудно получить, и даже в тех случаях, когда их удается сформировать путем специальной модификации составляющих их молекул и твердых подложек, такие системы, как правило, нестабильны и, с течением времени, меняют свою структуру на более энергетически выгодную за счет межмолекулярцой перестройки.

В данной работе эта проблема была решена с помощью новой методики. Пленку формировали путем медленного вертикального переноса монослоев производных циклена на разреженные самоорганизованные монослои алкантиолов, в которых количество тиола составляло половину и менее от величины, необходимой для формирования плотноупакованного САМ. После погружения подложки с перенесенным монослоем в субфазу, оставшийся на поверхности субфазы монослой тщательно удаляли, затем подложку извлекали, держа ее параллельно поверхности субфазы, Такая методика позволяет перенести монослой на поверхность САМ и избежать потери материала монослоя в процессе извлечения подложки из субфазы. Полученные экспериментальные данные позволяют с уверенностью утверждать, что максимальной стабильностью обладают пленки, сформированные на поверхности САМ октантиола с длиной цепи, равной половине дайны цепей гидрофобных заместителей в макроцикле. Можно обоснованно предположить, что при указанном оптимальном соотношении длин цепей формируется структура с взаимопроникающими гидрофобными субслоями тиола и замещенного макроцикла (САМ/ПЛБ), а сила совокупных гидрофобных взаимодействий между монослоями увеличивается до значений, характерных для одного плотноупакованного монослоя (рис.2а). Увеличение длины алкильного заместителя тиола, по-видимому, приводит к усилению межмолекулярных взаимодействий внутри САМ, что снижает эффективность взаимодействий с гирофобными цепями монослоя Ленгмюра при переносе, затрудняет его иммобилизацию и не позволяет сформировать наиболее упорядоченную структуру. В случае тиолов с более короткими цепями, сила аддитивных гидрофобных взаимодействий между алкильными радикалами монослоя ДЦЦ и октантиола САМ, скорее всего, недостаточна для прочного связывания ПЛБ с модифицированной поверхностью.

Стабильность композитных планарных матриц была подтверждена методом циклической вольтамперометрии (ДВА). Последовательное уменьшение величины тока в системе по мере увеличения числа слоев пленарной матрицы свидетельствует об эффективной иммобилизации на поверхности каждого слоя (рис.2б). По данным ЦВА была рассчитана степень заполнения поверхности 5 веществом пленки, которую определяли по уменьшению величины заряда, переносимого редокс-системой. Интегральную величину заряда рассчитывали из величины площади под электрохимической кривой. Степень заполнения поверхности рассчитывали по уравнению: 5~^золота Qп.^eшcиУQзoлoтa (1)

где СЬолои - суммарный заряд для реакции на чистой золотой подложке, С^нк,, -суммарный заряд для реакции на электроде, покрытом САМ или САМЛ1ЛБ. Значения Смолой. С?сам и (?сам/плб были получены интегрированием

соответствующих ЦВА-кривых в диапазоне напряжений 0.1-0.45 В и составили для САМ октантиола 0.48, для композитной пленки САМ/ПЛБ дицетилциклена 0.91 (рис.2б). Активные матрицы, полученные по описанной выше методике, стабильны в растворе электролита в течение не менее, чем 5 часов.

Таким образом, предложенный подход к созданию активных матриц позволяет одновременно решить две основные проблемы, препятствующие сохранению ее структуры. Прежде всего, такой монослой прочно удерживается на поверхности и не смывается при контакте с водными растворами. Кроме того, молекулярная организация макроциклов, заданная на межфазной границе в монослое Ленгмюра, сохраняется и закрепляется на твердой подложке при взаимодействии монослоев за счет исключения свободного объема, приходящегося на макроцикл, что, в свою очередь, должно препятствовать структурным и конформационным переходам в пленке на твердой подложке.

Рис.2, (а) Схематическое изображение структуры композитной матрицы из монослоя Ленгмюра-Блоджетт на основе 2п2+-ДЦЦ на разреженном самоорганизованном монослое октантиола на поверхности золота, (б) Вольтамперные характеристики системы (редокс 0.5 М КС1/1 мМ |Те(С1Ч)6]2~ /1 мМ [Ре(СЫ)6]3-) при формировании САМ/ПЛБ ДЦЦ. Номера кривых соответствуют поверхности чистого золота (]) и поверхности с последовательно нанесенными САМ октантиола (2) и монослоем ДЦЦ (3).

Связывание соединений, содержащих имидную группу, а также неорганических фосфат-анионов ЫагНРС^ и КаИ2Р04 из водных растворов активными матрицами САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ, полученными по описанной методике, было исследовано методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Этот метод позволяет получать кинетические кривые адсорбции, или связывания вещества с поверхностью ППР-пластины в режиме реального времени. Изменение угла поверхностного плазмонного резонанса (ППР) в общем случае пропорционально количеству адсорбировавшегося/десорбировавшего с поверхности вещества (при известном фиксированном показателе преломления среды), предел чувствительности метода, выраженный в относительных единицах (рефрактивных единицах, или ТШ) составляет ~ 1 пикограмм на мм2. Анализ результатов, полученных при кинетическом исследовании, с привлечением теоретических представлений о связывании веществ из раствора на твердых и жидких поверхностях позволяет не только провести более глубокую оценку механизмов взаимодействия активных центров искусственно созданных матриц с субстратами из раствора, но и рассчитать фундаментальные константы этих процессов связывания.

25 20 15 10

Ю

Для реализации связывания анионов матрицами САМ/ПЛБ их необходимо «активировать», то есть, перевести свободный лиганд в металлокомплекс. Формирование комплексов ДЦЦ с ионами цинка(Н) проводили двумя способами: (1) в монослое Ленгмюра путем выдержки монослоя-прекурсора на субфазе, содержащей хлорид цинка, в течение двух часов и (2) непосредственно в САМ/ПЛБ на поверхности ППР-пластины, также выдерживая ее в солевом растворе. Было установлено, что активность матрицы по отношению к имидным группам определяется способом активации матрицы. САМ/ПЛБ, содержащая комплексы ¿п2+-ДЦЦ, предварительно сформированные в монослое Ленгмюра на поверхности водного раствора ZnC\г (методика 1), способна к связыванию урацила из его водных растворов уже при рН 7.3. На рис.За представлены кинетические кривые изменения угла ППР, полученные в растворах урацила с концентрацией от 0.2 до 5 мМ. При этом, как видно из рисунка, матрица САМ/ПЛБ не обладает активностью по отношению к аденину (пуриновое основание) (рис.За, кривая 1). В то же время, металлокомплексы 2п2+-ДЦЦ, сформированные непосредственно в матрице САМ/ПЛБ, не способны связывать урацил. Согласно кинетической кривой (рис.3 б), САМ/ПЛБ ДЦЦ связывает ионы цинка(П) из раствора, однако, последующее введение в раствор урацила не приводит к росту ППР-сигнала, что говорит об отсутствии взаимодействий между металлокомплексом и нуклеооснованием.

8

7 ■

Н1° 1 Н,0 1

—гг ! 2пС1г < урацил

25 50 75 100 125 150

время, МИН.

2+

100

время, мин

Рис.3, (а) ППР-сенсограммы, полученные для САМ/ПЛБ 7.п^'-ДЦЦ в водном растворе аденина (/) и урацила с возрастающей концентрацией пиримидинового основания: 0.2 мМ (2); 0.5 мМ (5), 1 мМ (4) 3 мМ (5) и 5 мМ (б) рН 7.3. (б) Кинетическая кривая изменения угла ППР, полученная для САМ/ПЛБ ДЦЦ при последовательном введении в ячейку раствора гпСЬ (Ю-3 М) и урацила (1мМ); рН 7.3.

Можно предположить, что обнаруженный эффект является следствием зависимости структуры металлокомплекса циклена и его способности к связыванию имидной группы от конформации лиганда. Из литературы известно, что ДЦЦ меняет конформацию при сжатии монослоя вследствие внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Наибольшее искажение цикла достигается в конденсированном состоянии монослоя, в котором монослой лиганда, свободного от иона металла, переносят на твердую подложку. (Снижение давления переноса приводит к потере стабильности САМ/ПЛБ). Деформация цикла закрепляется, и, возможно, усиливается при образовании взаимопроникающей структуры на монослое тиола. Вероятнее всего, подобная «негативная» предорганизация лиганда

(«сжатие» цикла) в САМ/ПЛБ приводит к тому, что льюисовская кислотность слабо координированного иона 7п2+ не увеличивается достаточно для дальнейшей координации имидной группы. В растянутом монослое на поверхности жидкости связывание иона металла происходит при условиях, более благоприятных для соблюдения стерического соответствия; макроцикл принимает планарную конформацию с минимальными искажениями полости, в результате чего образуется комплекс с четырьмя равноценными координационными связями и жесткой структурой, не поддающейся деформации и предорганизованной для связывания молекул в конечной САМ/ПЛБ.

Таким образом, стерический фактор является ключевым с точки зрения эффективности связывания нуклеооснований, и даже незначительные стерические напряжения, не препятствующие связыванию ионов металла в пленке на твердой подложке, способны ингибировать стерически зависимое распознавание нуклеооснования.

Также было исследовано связывание фосфат-анионов матрицами САМ/ПЛБ, содержащими комплексы, сформированные на прекурсионнной стадии. Экспозиция САМ/ПЛБ в водном растворе натриевой соли, содержащей анионы Н2РО4", не приводит к росту ППР-сигнала, что свидетельствует об отсутствии взаимодействий моноосновного аниона с металлокомплексом ДЦЦ при рН раствора 4.8 (рис.4, кривая 1). В то же время, отклик на присутствие фосфат-дианионов при рН 7.5 наблюдется в широком диапазоне концентраций (рис.4, кривые 2-6), начиная уже с сильноразбавленных растворов Ка;НР04 (10'8 М).

время, мин.

__!__

Рис.4. ППР-сенсограммы, полученные для САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ в водном растворе №Н2Р04 (КГ4 М, рН 5.5) (1) и Ка2НР04 с концентрацией соли 1 мкМ (2), 10 мкМ (3), 0.1 мМ (-0,1 мМ (5), 10 мМ (б); рН 7.5.

Таким образом, САМ/ПЛБ обладают сродством по отношению к двухосновному аниону НР042- и не взаимодействуют с моноанионом фосфорной кислоты. Кроме того, было установлено, что САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ не чувствительны к присутствию ряда других анионов (С1~, К03', 8042~ и ацетат-анион) в водных растворах, содержащих вплоть до 0.1 М соответствующих солей. Поскольку САМ/ПЛБ способны распознавать фосфат-дианионы при физиологических условиях, эта особенность может быть использована для измерения и определения степени высвобождения фосфат-анионов органического происхождения из иуклеотидов, нуклеиновых кислот и некоторых протеинов и оценки активности соответствующих ферментов, катализирующих гидролиз указанных соединений или фосфорильный трансфер.

Результаты кинетических исследований позволили рассчитать константы связывания урацила и фосфат-дианинона активными матрицами 2п2+-ДЦЦ. На основании кинетических кривых связывания урацила и фосфата САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ (рис.За и 4) были определены максимальные значения изменения угла ППР для каждой концентрации (Авуакс) и построены зависимости этого параметра от концентрации указанных веществ (рис.5).

Для расчета максимально возможной адсорбции веществ на активной матрице 2п2+-ДЦЦ и соответствующих констант связывания использовали модель Ленгмюра в предположении о том, что адсорбционные центры и молекулы адсорбата в формирующемся слое не взаимодействуют между собой, а строение образующегося адсорбционного слоя урацила и фосфат-дианиона на активной матрице одинаково. Обозначим через А0макс наибольшее значение угла ППР для данной концентрации вещества в растворе и А®Прел ~ предельное значение угла ППР, соответствующее максимальной концентрации вещества на поверхности.

а) Ют- б)

© <

4*10~3 [урацил]

4*10"3 8*10'3 [^НРО,]

1.2*102

Рис.5. Зависимость максимального ППР-сигнала от концентрации урацила (а) и фосфат-аниона (б).

Уравнение Ленгмюра в традиционном варианте имеет вид: КС

(1 + КС)'

(2)

где <р - доля занятых мест на поверхности твердой подложки, К - константа связывания адсорбата с рецептором в САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ, С - концентрация адсорбата в растворе. Выразим <р через параметры, определяемые методом ППР:

Д0 „ (з)

д©

пред

Д0

Тогда уравнение Ленгмюра можно записать в следующем виде:

С 1 \ „

- (4)

-+ ■

А©,

макс

Зависимости С/А0ммс от С, построенные по данным рис.За и рис.4, имеют линейный характер, что подтверждает обоснованность описания изучаемой системы моделью Ленгмюра. На основании полученных данных были рассчитаны величины Д©„ред, составившие 8.6 и 8.1 угловых минут для адсорбции урацила и фосфата, соответственно. Правомочность использования предложенной модели также подтверждается значением соотношения Д0пред урщШ,а/'А0Пр<.д фосфата, равным 1.07, которое близко совпадает со значением отношения молекулярных масс урацила и фосфат-аниона Мгурац„ла/Мг фосфата=1-17.

Кроме того, были определены константы связывания урацила и фосфат-дианиона с поверхностью САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ, Рассчитанная величина константы связывания урацила с активной матрицей составляет 3.16 и близко

совпадает с константой связывания этого нуклеооснования незамещенным металлокомплексом в объеме растворе 3.2) Это означает, что иммобилизация дифильного производного на твердой подложке практически не влияет на способность металлокомплекса циклена связывать урацил. Однако, величина константы связывания активной матрицей фосфат-дианиона 1о£Кф<хф<№, составляющая 4.31, существенно превышает значение этого параметра для соответствующей реакции в объеме раствора (1о^ 3.5). Таким образом, сродство металлокомплекса циклена, закрепленного на твердой подложке, по отношению к фосфат-анионам не только не уменьшается в результате иммобилизации Хп2+-ДЦЦ в тонкой пленке, но и возрастает более чем в 6 раз. Полученные данные позволяют предположить, что созданные по предложенной методике САМ/ПЛБ могут быть использованы для формирования супрамолекулярной системы следующего иерархического уровня с помощью специфической иммобилизации нуклеотидов за счет координации концевых фосфатных групп на металлорецепторах. Можно также заключить, что правильное определение последовательности шагов в формировании планарной активной матрицы и выбор оптимальных условий для эффективной реализации каждого из актов распознавания в последовательной цепи превращений свободного лиганда в металлокомплекс и далее в более сложную супрамолекулярную структуру приобретают особую важность в построении планарных биомиметических моделей такого типа.

Самосборка бислоев нуклеотидов на САМ/ПЛБ гп2+-ДЦЦ.

Как следует из данных предыдущего раздела, активная матрица металлокомплексов ДЦЦ, сформированных в монослое Ленгмюра, проявляет бблыную чувствительность по отношению к фосфат-дианионам, чем к пиримидиновому основанию. Таким образом, САМ/ПЛБ гп2+-ДЦЦ предположительно должна выступать в качестве моновалентного темплата при связывании небольших мононуклеотидов за счет предпочтительной координации терминальных фосфатных групп на макроциклических металлокомплексах. Основания таких нуклеотидов при этом остаются экспонированными в раствор, то есть, доступными для образования комплементарных пар с основаниями из этого раствора.

Для проверки этого предположения методом ППР была исследована последовательная адсорбция комплементарных нуклеотидов (уридинфосфатов 5'-УХФ и аденозинфосфатов 5'-АХФ, где X - число фосфатных групп) на САМ/ПЛБ из 2пг+-ДЦЦ, сформированных на прекурсионной стадии (рис.ба и 66). Как видно из рисунков, форма кинетических кривых адсорбции одинакова на обеих стадиях связывания комплементарных нуклеозид-5'-трифосфатов с поверхностью САМ/ПЛБ, независимо от порядка введения нуклеотидов в контактный раствор. Аналогичные кинетические кривые были получены для других комбинаций нуклеотидов группы аденина и урацила с разным числом фосфатных групп (моно-и дифосфатов), при этом величина максимального изменения угла ППР Д© пропорциональна молекулярному весу адсорбированного нуклеотида на обеих стадиях связывания. После завершения 1-й и 2-й стадий последовательной адсорбции ППР-ячейку промывали чистой водой с соответствующим значением

рН; снижение ППР-сигнала по отношению к А®] и Д02 в результате незначительной десорбции вещества с поверхности для всех измеренных образцов составляло не более 10 угловых секунд.

На основании полученных данных был предложен механизм моновалентного ступенчатого связывания нуклеотидов на САМ/ПЛБ, содержащей комплексы 2п2+-ДЦЦ. Первый из комплементарных партнеров координируется на 2п2+-ДЦЦ за счет связывания концевой фосфатной группы, формируя темплатный монослой нуклеотидов (ТМ) с нуклеооснованиями, экспонированными в контактный раствор. Последующее связывание осуществляется за счет высокоспецифичного распознавания темплатом нуклеотидов из контактного раствора и образования комплементарных пар нуклеооснований (комплементарный монослой - КМ). В результате формируются гомогенные бислои нуклеотидов, в которых каждый монослой содержит нуклеооснования только одного типа (рис.бв и 6г). Важно подчеркнуть, что поверхность с предварительно связанным 5-УХФ остается активной для комплементарного распознавания 5-АХФ, независимо от числа фосфатных групп в пиримидиновом нуклеотиде, что подтверждает предположение о связывании 5'-УХФ с САМ/ПЛБ посредством координации концевой фосфатной группы нуклеотида на металлокомплексе, поскольку и одновалентная имидная координация, и двухвалентная (межмолекулярное) связывание 5'-УХФ приводили бы к ингибированию вторичного распознавания нуклеотидов группы аденина.

а)

5 • 4

а! |

I 2

i Н

о

2-я стадия

у = 0,008*+ 1.8825

1-я стадия

/=0.011х* 0.6303 ¡/^ I АТФ Д02

УТФ де,

100

200 300 время, мин

400

500

в)

б)

6 5 -4 3 2 1 -О

1 -я стадия у = 0.0111х* 0,9746

2-я стадия у = 0.0082х+2,1939

100

400

200 300 время, мин.

Рис.б. Сенсограмма ППР для темплатов гп2+-ДЦЦ (сформированных в монослое Ленгмюра) при последовательном добавлении в контактный раствор (а) уридин 5'-трифосфата и аденозин 5'-трифосфата; (б) аденозин 5'-трифосфата и уридин 5'-трифосфата; концентрации нуклеотидов 2 мМ, рН 7.5. Линейные участки кинетических кривых выделены жирными линиями, вертикальные линии

соответствуют моменту замены раствора. Схема структуры гомогенных комплементарных бислоев нуклеотидов 5'-УТФ-5'-АТФ (в) и 5'-АТФ-5'-УТФ (г), формирующихся в результате стадийной адсорбции на матрице САМ/ПЛБ Zn2+-циклена.

Активная матрица САМ/ПЛБ способна инициировать одностадийную самосборку гетерогенного бислоя из эквимоляркой смеси нуклеотидов, содержащей 2 мМ каждого из них, например 5'-АТФ и 5'-УТФ. В этом случае величина максимального ППР-сигнала Д0макс составляет 4.5 угловых минут. Это значение близко к величине суммы откликов (Л0,+ Два), равной 5.0 угловых минут и измеренной для последовательного связывания этой пары нуклеотидов. Тем не менее, разность значений ((Л0|+ Л©2) -Д0макс), составляющая около 0.5 угловых минут, вероятнее всего, указывает на некоторую незавершенность верхнего слоя нуклеотидов (КМ). Причиной этого эффекта могут быть взаимодействия комплементарных нуклеооснований в ТМ, закрепленном непосредственно на матрице. Этих взаимодействий не удается полностью избежать даже в системе со сравнительно большой молекулярной площадью металлорецептора.

Толщина двойного слоя нуклеотидов, формирующихся на матрице в процессе адсорбции по обеим методикам, была определена обработкой данных в программе Minimize-1 с помощью моделирования вторичных ГОТР-кривых. Эта величина, составившая 33±1.5 А, меньше суммы длин молекул (около 45 А), геометрические размеры которых известны из литературы. Тем не менее, полученные значения можно считать адекватными строению адсорбционного слоя, поскольку свободный объем, приходящийся на молекулу нуклеотида и определяющийся площадью металлоцентра в САМ/ПЛБ, достаточно велик для свободного вращения и наклона адсорбированных молекул относительно плоскости поверхности.

На основании полученных данных были рассчитаны кинетические параметры последовательной адсорбции нуклеотидов на поверхности. Расчет констант скорости изучаемых процессов проводили исходя из предположения о том, что изменение угла ППР обусловлено реакцией связывания нуклеотидов на поверхности активной матрицы, и при постоянной площади поверхности является аддитивной функцией его состава. Поскольку молекулярные массы, размеры и строение нуклеотидов весьма близки, а механизм связывания в обоих случаях одинаков (за счет координации концевых фосфатных групп), можно предположить, что адсорбционные слои 5'-АХФ и 5'-УХФ нуклеотидов будут иметь одинаковые коэффициенты преломления. Кроме того, монослой взаимодействует с компонентом раствора, концентрация которого практически неизменна и поэтому может быть включена в константу скорости реакции к в уравнении реакции псевдопервого порядка:

(®„-0)/(0=o-0o) = e-kl (5)

где ©о и 0„ - начальное и конечное значения угла ППР, t - время реакции.

Константу скорости первого порядка для последовательных интервалов времени можно рассчитать по формуле

где 0' и 0 - начальное и конечное значения угла ППР временного интервала 1-1', а 0„ - максимальное значение угла ППР для исследуемой кинетической зависимости &-1 Сохранение постоянства значений к/ в пределах ошибки опыта должно свидетельствовать о первом порядке реакции.

По данным соответствующей численной обработки кинетических кривых 04 начальные участки формирования темплатных монослоев УТФ (рис.ба) и АТФ (рис. 66) на САМ/ПЛБ 2п2*-ДЦЦ и комплементарноых им монослоев АТФ и УТФ, соответственно, удовлетворительно описываются уравнением реакции псевдопервого порядка - зависимости 1п(0„-0) от времени сохраняют линейный характер в течение некоторого периода (рис.7). Рассчитанные константы скорости процессов в этих областях составляют 2,2* 10"4 с"' для обеих стадий адсорбции. Однако, на обеих стадиях, после некоторого времени протекания реакции процесс переходит в область с нулевым порядком, чему соответствует появление на кривых, построенных в полулогарифмических координатах, нелинейных участков. Константы скорости для процесса с нулевым порядком определяются по тангенсу угла наклона соответствующих линейных участков на кинетических кривых 04 последовательной адсорбции (рис.ба) и составляют 1,8*10"4 М*с"' и 1,3* 10"4 М*с"' для первой (адсорбция УТФ) и второй стадий (АТФ), соответственно.

О 100 200 300 400 500

время, мин

Рис.7. Кинетика связывания нуклеотидов 5'-УТФ-5'-АТФ (соответствует рис.ба) на поверхности активной матрицы 2пг+-ДЦЦ в координатах 1(1(000 -©) - время. Области процесса первого порядка выделены жирными линиями, штрихпунктирная линия соответствует моменту замены раствора УТФ на раствор АТФ.

Следует отметить, что кинетика адсорбции нуклеотидов сходна с той, что наблюдается для адсорбции фрагментов нуклеотидов (урацила и фосфат-аниона) (ср. рис.ба и бб с рис.За и 4). На этих кинетических кривых также можно выделить два участка, отвечающих двум различным стадиям связывания компонентов нуклеотидов с активной матрицей. Это означает, что компоненты нуклеотидов взаимодействуют с металлокомплексами активной матрицы по сходному механизму.

Можно предположить, что два участка кинетических кривых адсорбции нуклеотидов отвечают различным областям процесса. Первый (нелинейный) участок стадии 1 соответствует диффузии нуклеотидов к межфазной границе. В течение этой стадии происходит образование адсорбционного слоя нуклеотидов, сопровождающееся разрушением упорядоченного водного слоя (сольватационного

слоя) на САМ/ПЛБ 2пг+-ДЦЦ и вытеснением молекул воды с поверхности. Этот процесс предположительно приводит к изменению свойств поверхности (увеличению ее липофильности), что, в свою очередь, промотирует образование координационных связей между металлокомплексом и нуклеотидом. (Известно, что стабильность и скорость образования таких комплексов в неводных растворителях возрастает). Поскольку адсорбционный слой, очевидно, формируется быстрее, чем образуется координационный комплекс на поверхности, то прочное связывание концевой фосфатной группы, которому отвечает второй линейный участок кинетической кривой, следует-после диффузионной стадии. Рассчитанные значения констант скорости связывания нуклеотидов, урацила и фосфата на поверхности активных матриц 2п2+-ДЦЦ, приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Константы первого (к]) и нулевого (ко) порядков реакций адсорбции нуклеотидов и их фрагментов при концентрации 2 мМ на поверхности активных матриц ___

1-я стадия 2-я стадия

Система кь 10"4 с'1 к0,10-4М*с-' к,, 10"4 с'1 ко, 10'4 М*с'

гп2+-ДЦЦ + урацил 2.7 1.5 —

гп^-ДЦЦ + фосфат 3.5 1.8 — —

2а2+-ДЦЦ + УТФ + АТФ 2.2 1.8 2.2 1.3

гп'ЧДЦЦ + АТФ + УТФ 2.2 1.8 2.2 1.3

Как видно из таблицы, скорость образования адсорбционного слоя фосфат-анионов существенно выше, чем скорость этого процесса для нуклеотидов, значительно больших по размеру и медленнее диффундирующих к поверхности. Однако, константы скорости, определенные из линейных участков, практически совпадают. Этот результат вполне закономерен, если принять, что линейные участки соответствуют процессу образования координационных связей между молекулами адсорбата и металлокомплексами, скорость которого в случае связывания неорганического фосфат-аниона и депротонированной концевой фосфатной группы нуклеотида не должна существенно различаться. Скорость формирования адсорбционного слоя комплементарного нуклеотида на темплатном слое нуклеотида (диффузионная стадия) также закономерно совпадает со скоростью этого процесса на первой стадии адсорбции, но константа скорости, определенная для линейного участка кинетической кривой второй стадии адсорбции, предположительно соответствующего образованию комплементарных пар нуклеооснований, несколько ниже. Скорость этого процесса в водной среде даже вблизи поверхности раздела действительно может быть довольно небольшой, тем не менее, само наличие такого линейного участка на кинетической кривой вторичной адсорбции указывает на специфический характер взаимодействий двух нуклеотидов, то есть, вероятное образование пары нуклеооснований по Уотсону-Крику. На основании полученных результатов можно заключить, что состав и строение созданных по разработанной методике активных матриц САМ/ПЛБ 7л1*-ДЦЦ оптимально соответствуют их назначению. Такие матрицы способны эффективно связывать 5'-рибонуклеотиды группы аденина и уридина из их водных

растворов при физиологических условиях в темплатные монослои, которые, в свою очередь, оказываются предорганизованы для взаимодействий с комплементарными партнерами. Структура матриц позволяет минимизировать негативное влияние стерического фактора на данный тип взаимодействий и решить проблему низкой эффективности связывания, характерную для аналогичных планарных систем, которые до настоящего времени использовались для этих целей. Кроме того, созданные активные матрицы способны одновременно связывать на поверхности нуклеотиды двух семейств (аденина и урацила), что потенциально позволяет расширить композицию формирующихся таким образом ансамблей нуклеотидов, варьируя их состав и соотношение.

Активные матрицы САМ/ПЛБ дифильного бис-(Хп2+-циклена) для двухцентрового распознавания уридин 5'-фосфата.

Заключительная часть данной работы посвящена созданию активной матрицы на основе быс-циклического производного 2п2+-циклена для реализации двухцентрового связывания нуклеотидов на ее поверхности. Важность такого исследования обусловлена необходимостью оценить применимость этой методики для соединений с иной структурой, чем у ДЦЦ, и ее эффективность с точки зрения обеспечения условий для более сложных координационных взаимодействий, чем были описаны в предыдущих разделах.

Для удобства сравнительного анализа в качестве рецептора, формирующего активную матрицу, был использован новый дифильный бис-циклический цинковый комплекс производного циклена (бис-(гп2+-циклен) или гп2+-БЦ). Объем бис-циклической головной группы в данном случае значительно больше, чем у ДЦЦ, при этом дифильность молекулы обеспечивается только одним алкильным заместителем той же длины, что и у двух гидрофобных цепей ДЦЦ. Столь сильные структурные различия исследованных производных циклена позволяют оценить потенциальные возможности методики формирования активных матриц для широко спектра допустимых молекулярных структур ее компонентов.

Из литературы известно, что бис-циклические комплексы циклена способны к одновременной внутримолекулярной координации нуклеооснования и концевой фосфатной группы определенных нуклеотидов на соседних макроциклах.. Такой тип координационного связывания отличается от одноцентровой координации нуклеотидов на матрицах комплексов ДЦЦ и еще более зависим от стерических условий на поверхности. Согласно предварительному молекулярному моделированию, расстояние между соседними циклами в молекуле 2п2+-БЦ соответствует геометрии 5'-УМФ, который, предположительно, должен давать с 2п2+-БЦ двухцентровой комплекс.

Были изучены монослои Ленгмюра этого соединения и получены САМ/ПЛБ гп2+-БЦ, сформированные по методике, использованной для получения активных матриц САМ/ПЛБ 2пг+-ДЦЦ. Стабильность активных матриц 2п2+-БЦ была также подтверждена методом циклической вольтамперометрии, эффективная степень заполнения поверхности ёсштлв ги2+.щ монослоем 2пг+-БЦ, перенесенным на САМ октантиола (5САМ = 0.32) с поверхности водной субфазы с рН 8.5 составляет 0.72. Связывание молекулярных фрагментов и нуклеотидов активными матрицами 2п2+-БЦ также было исследовано с привлечением метода спектроскопии ППР. Установлено, что 2п2+-БЦ, иммобилизованный в планарной матрице на твердой подложке, полностью сохраняет свою активность как по отношению к имидной

группе, так и по отношению к фосфат-дианиону при рН 7.5, при этом бис-циклический лиганд, иммобилизованный в САМ/ПЛБ, обладает еще более выраженным сродством по отношению к фосфат-аниону по сравнению с урацилом, чем моноциклическое производное циклена, в силу более низких значений рКа (7.3 и 7.9, соответственно), что облегчает связывание фосфат-аниона.

Для проверки предположения о способности матрицы 2п2+-БЦ связывать 5'-УМФ по дивалентному механизму, было проведено исследование его адсорбции на поверхности САМ/ПЛБ (рис.8а). Кинетика адсорбции 5'-УМФ на активной матрице 2п2+-БЦ сходна с кривой первичной адсорбции нуклеотидов из растворов той же концентрации на САМ/ПЛБ 2пг+-ДЦЦ. Максимальное значение ППР-отклика Д® практически совпадает с откликом САМ/ПЛБ гп2+-дцц на этот нуклеотид. Однако, как видно из рисунка, САМ/ПЛБ 2п2+-БЦ с адсорбированным 5'-УМФ не способна к дальнейшему связыванию комплементарного 5'-АТФ. Таким образом, при связывании уридинфосфата матрица инактивируется по отношению к нуклеотидам группы аденина, и добавление последних в контактный раствор не приводит к образованию КМ (рис.8б). Наблюдаемый эффект обусловлен функциональной и геометрической комплементарностью матрицы и нуклеотида. В результате внутримолекулярного двухцентрового связывания 5'-УМФ молекулами 2п2+-БЦ, при котором обе концевые группы нуклеотида одновременно координируются на соседних макроциклах (рис.86), нуклеооснование УМФ становится недоступным для взаимодействия с комплементарным АТФ из раствора. На основании кинетических кривых были рассчитаны константы скорости процесса для обеих стадий адсорбции УМФ (диффузионной и кинетической, расчет проводили по схеме, описанной выше). Константа скорости, определенная для линейного участка кривой и предположительно соответствующая образованию координационных .связей между нуклеотидом и металлорецептором, составляет 3.5х10'4 с'1. Эта величина почти в два раза превышает константу скорости, определенную для аналогичного участка кинетической кривой адсорбции нуклеотида на матрице моноциклического производного, что указывает на кооперативный характер двухцентрового связывания нуклеотида на бис-циклическом рецепторе.

Рис.8, (а) Сенсохраммы ППР для активной матрицы 2пг+-БЦ при последовательном добавлении в контактный раствор уридин 5'-фосфата и аденозин 5'-трифосфата, концентрации нуклеотидов 2 мМ, рН 7.35. (б) Схематическое изображение бивалентной координации уридин 5'-фосфата на 2п2+-БЦ.

Таким образом, стабильность и активность матриц 2п2+-БЦ по отношению к изученным субстратам свидетельствует о том, что предложенная методика создания активных матриц на основе САМ/ПЛБ может быть успешно использована для иммобилизации на поверхности дифильных молекул с различной молекулярной структурой (числом алкильных заместителей, объемом и строением головных групп и т.д.).

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследовано связывание монослоями Ленгмюра из металлокомплексов дифильного циклена нуклеооснований и фосфат-дианионов из водных субфаз. Установлено, что монослой металлокомплексов способен связывать урацил (в отличие от аденина), и выявлена взаимосвязь между эффективностью образования металлокомплексов и последующим имидным и фосфатным распознаванием в монослое.

2. Показано, что присутствие следовых количеств ионов меди(П) в субфазе полностью ингибирует связывание урацила монослоем ДЦЦ на поверхности раствора, содержащего ионы цинка и нуклеооснование.

3. Разработана новая методика создания активных матриц САМ/ПЛБ на основе монослоев металлокомплексов циклена, иммобилизованных на поверхности самоорганизованного монослоя тиола. Показано, что эта методика позволяет стабилизировать термодинамически неустойчивую ПЛБ Х-типа с сохранением ее структуры и свойств на твердой поверхности.

4. Впервые подробно изучено молекулярное распознавание неорганических фосфатов, нуклеооснований и нуклеотидов на композитных матрицах САМ/ПЛБ 7.п2+-ДЦЦ.

5. Установлено, что эффективность связывания имидной группы композитной матрицей определяется конформацией макроцикла, задаваемой в монослое Ленгмюра.

6. Обнаружено шестикратное увеличение устойчивости комплекса 2п2+-ДЦЦ с фосфат-дианионом, образующимся в САМ/ПЛБ, по сравнению с аналогичным комплексом циклена в объеме раствора.

7. Впервые осуществлена иммобилизация рибонуклеотидов семейств аденина и уридина (с разным числом фосфатных групп) на активных планарных матрицах 2п2+-ДЦЦ.

В. Установлено, что связывание нуклеотидов и их компонентов с активными матрицами протекает по двухстадийному механизму (стадии псевдо-первого и нулевого порядка), соответствующему формированию адсорбционного слоя нуклеотидов с последующим образованием координационных соединений на поверхности матрицы.

9. Показано, что связывание нуклеотидов активными матрицами происходит за счет координации концевых фосфатных групп нуклеотидов на макроциклических металлокомплексах, при этом нуклеооснования остаются экспонированными в раствор и доступными для взаимодействий с комплементарными партнерами.

10. Впервые реализована самосборка комплементарных бислоев нуклеотидов групп аденина и урацила («двойные плоскости») в присутствии водной фазы на твердой поверхности путем их последовательной или одновременной

адсорбции на САМ/ПЛБ 2п2+-ДЦЦ. Установлено, что взаимодействие нуклеотидов в бислоях носит специфический характер, отвечающий образованию комплементарных пар нуклеооснований.

11. Исследованы монослои Ленгмюра дифильного бис-циклического металлокомплекса Zn2+-EL( на различных субстратах и сформированы активные матрицы Zn2t-EI4 с высокой поверхностной концентрацией активных молекул. Таким образом показано, что предложенная методика формирования активных матриц САМ/ПЛБ может быть использована для соединений с различной структурой (размерами головных групп и числом алкильных заместителей).

12. Впервые реализовано специфическое внутримолекулярное двухцентровое связывание уридин-5'-фосфата активными матрицами Zn +-БЦ.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Kalinina М.А., Raitman O.A., Selector S.L., Turygin D.S, Arslanov V.V. // Conformational Tuning of Sensing Langmuir-Blodgett Membranes for Selective Determination of Metal Ions, Anions, and Molecular Fragments // IEEE Sensors Journal, 2006, V.6, N.2, P.450-457

2. Turygin D.S., Subat M., Raitman O.A., Arslanov V.V., König В., Kalinina M.A. // Cooperative Self-Assembly of Adenosine and Uridine Nucleotides on a 2D Synthetic Template // Angewandte Chemie Int. Ed. 2006, V.45, P.5340 - 5344.

3. Two-dimensional Arrays of Amphiphilic Zn2+"cyclens for Guided Molecular Recognition at Interfaces // D.S. Turygin, M. Subat, O.A. Raitman, S.L. Selector, V.V. Arslanov, B. König, M.A. Kalinina// Langmuir, 2007, V.23, P.2517-2524.

4. Lomova E.V., Turygin D.S., Arslanov V.V., Kalinina M.A.// Lateral 2D-3D phase segregation in fatty acid/fatty amine monolayers induced by Langmuir-Blodgett deposition// J. Phys. Chem. B, 2009, V.l 13, P.8581-8587.

5. Селектор СЛ., Турыгин Д.С., Тарасова H.A., Райтман O.A., Арсланов B.B. // Монослои и пленки Ленгмюра-Блоджетг краунированных олиготиофепов // Сборник статей "Структура и динамика молекулярных систем". Яльчик-2006. Уфа-Казань-Москва-Йошкар-Ола, часть II, С. 189-192.

6. Турыгин Д.С., Калшшиа М.А., Райтман O.A., Subat М., Konig В., Арсланов В.В. // Формирование бислоев нуклеотидов группы гуанина и цитозина на бис-циклических темплатах Zn2+-BIJ // XIV Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем". Яльчик-2007. Уфа-Казань-Москва-Йошкар-Ола, Сборник статей. С.595-598.

7. Калинина М.А., Арсланов В.В., Турыгин Д.С., Терещенко Е.Ю., Желудева С.И. // Влияние иммобилизации макроциклического тетрамина в монослоях Ленгмюра на селективность комплексообразования // Журнал физической химии. 2008, Т.82, N.4, С.725-731.

8. Калинина М.А., Райтман O.A., Турыгин Д.С., Селектор СЛ., Голубев Н.В., Арсланов

B.В. // Композитные пленки Ленгмюра-Блоджетг для селективного определения кальция в водных растворах // Журнал физической химии, 2008, Т.82, N.8, С.1501-1510.

9. М.А. Калинина, В.В. Арсланов, Д.С. Турыгин // Самосборка «двойных плоскостей» нуклеотидов на наноструктурированных матрицах макроциклических аминов // Сборник статей «Современные проблемы физической химии наиоматериалов», 2008,

C.91.

10. М.А. Калинина, В.В. Арсланов, Д. С. Турыгин, И. А. Гагина // Молекулярное распознавание нуклеооснований урацила и аденина монослоями ленгмюра на основе

металлокомплексов дифильного циклена // Коллоидный журнал, 2009, Т.71, N.5, C.609-61S.

П.Еленский А. А., Турыгин Д. С., Арсланов В.В., Калинина МА // Химическое паттернирование пленок Ленгмюра-Блоджетт методом мягкой гелевой литографии // Российские нанотехнологии, 2009, Т.4, N.5-6, С.50-53.

12. MA.Kalinina, S.L.Selector, D.S.Turygin, V.V. Arslanov, //A novel SPR-sensors based on Langmuir-Blodgett membranes for selective determination of cations, anions and molecular fragments // International Conf. dedicated to the 60lh anniversary of the IPC RAS, Moscow, 2005, P.341.

13. S.L.Selector, M.A.Kalinina, O.G.Tzelykh, D.S.Turygin, V.V. Arslanov,// Detection of transition metal ions by chemosensors based on Langmuir-Blodgett films of dicetylcyclen. Electrochemical impedance spectroscopy// International Conf. dedicated to the 60th anniversary of the IPC RAS, Moscow, 2005, P.374.

14. S.L.Selector, V.V. Arslanov, MA.Kalinina, D.S.Turygin // Electrochemical impedance spectroscopy application for detection of transition metal ions by chemosensors based on Langmuir-Blodgett films of dicetylcyclen // Moldavian-Polish-Ukrainian Symposium on Supramolecular Chemistry, Chisinau, R.Moldova, 2005, P.47-49.

15. Turygin D.S., Subat M„ Raitman O.A., Arslanov V.V., Konig В., Kalinina M.A. // Cooperative self-assembly of "small" nucleotides on planar syntetic template // IVth International symposium "Design and synthesis of Supramolecular architectures // Kazan, Russia, May 13-17,2006, P.45.

16. Turygin D.S., Subat M., Raitman O.A., Arslanov V.V,, Konig В., Kalinina M.A //Bottom-up self-assembly with Langmuir-Blodgett films: function vs geometry // International Summer School "Supramolecular Sysitems in Chemistry and Biology" // Tuapse, Russia, 2006, P.35.

17. Raitman O.A, Turygin D.S, Selector S.L, Kalinina M.A., Arslanov V.V.// Conformational tuning of supramolecular systems for selective determination of metal ions, molecules and molecular fragments // International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" //Tuapse, Russia, 2006, P.86.

18. Tarasova N.A, Turygin D.S., Raitman O.A., Selector S.L., Arslanov V.V. // Optoelectronic systems based on crown-thiophenes // International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" // Tuapse, Russia, 2006, P.94.

19. Kalinina M.A., Raitman O.A., Selector S.L., Turygin D.S., Arslanov V.V.// Molecular recognition of nucleotides and their constituents on Langmuir-Blodgett films of amphiphilic cyclens// International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" // Tuapse, Russia, 2006, C.96.

20. Турыгин Д.С., Тарасова H.A., Райтман O.A., Селектор С.Л., Арсланов В.В. // Монослои и пленки Ленгмюра-Блоджетт краунированных олиготиофенов // XII Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем". Яльчик-2006. Уфа-Казань-Москва-Йошкар-Ола, Сборник тезисов, 2006,'С,250.

21. Ломова Е.М., Турыгин Д.С., Калинина М.А. // Самоорганизация кислотно-основных пленок Леигмюра-Блоджегг как результат фазового разделения // XIV Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем". Яльчик-2007. Уфа-Казань-Москва-Йошкар-Ола, Сборник тезисов. С.121.

22. Турыгин Д.С., Калинина М.А., Райтман О.А., Subat М., Konig В., Арсланов В.В. // Формирование бислоев нуклеотидов группы гуанина и цитозина на бис-циклических темплатах гп2+-БЦ // XIV Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем". Яльчик-2007. Уфа-Казаиь-Москва-Йошкар-Ола, Сборник тезисов. С.236

23. Ломова Е.М., Турыгин Д.С., Калинина М.А., Арсланов В.В. // Самоорганизация двумерных кислотно-основных матриц на основе дифильных соединений,

индуцируемая фазовым разделением II XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Тезисы докладов. Москва. 2007, Т.2, С.366.

24. Турыгин Д.С., Subat М„ Райтмаи О.А., Арсланов В.В., Konig В., Калинина М.А. // Моновалентное и дивалентное распознавание нуклеотидов пленками Ленгмюра-Блоджетт на основе цинковых комплексов производных циклена // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Тезисы докладов. Москва. 2007, Т.2, С.561.

25. Turygin D.S., Subat М., Raitman О.А., Arslanov V.V., Konig В., Kalinina М.А. // Complementary and mismatch interactions between nucleotides at monolayers of amphiphilic bis-Zn2+ -cyclens // IV International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology". Book of Abstracts, 2008, Tuapse, Russia, P.31.

26. Д.С. Турыгин, И.А. Гагина, B.B. Арсланов, М.А. Калинина // Молекулярное распознавание монослоями Ленгмюра дицетилциклена // Всероссийская школа-конференция «Супрамолекулярные системы на поверхности раздела» Супраз-2009. Тезисы докладов. Москва. 2009, С.29.

Подписано в печать: 28.08.2009

Заказ № 2411 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Молекулярное распознавание с образованием водородных связей на межфазных границах

1.2. Молекулярное распознавание за счет водородных связей в водных средах на межфазной границе вода/твердое тело

1.3. Металлокомплексы производных циклена в объеме растворов и в монослоях Ленгмюра

1.4. Монослои Ленгмюра и пленки Ленгмюра-Блоджетт дицетилциклена

Актуальность проблемы. Одна из важнейших задач современной физической химии супрамолекулярных систем состоит в получении биомиметических структур, имитирующих работу биологических объектов при физиологических условиях. Среди основных типов взаимодействий, использующихся в супрамолекулярной химии, особое место занимает образование комплементарных пар между пуриновыми и пиримидиновыми нуклеооснованиями за счет ароматического стекинга и водородных связей. Этот сравнительно простой структурный мотив является основой хранения и передачи генетической информации и многих других ключевых метаболических взаимодействий рецептор-субстрат, в том числе, и при передаче нервных импульсов. Специфичность и простота таких взаимодействий обуславливают интерес к организованным планарным ансамблям нуклеооснований для контролируемой сборки искусственных функциональных систем по принципу «снизу-вверх», создания биоподобных наноразмерных хранилищ информации, эффективных биосенсоров и пр.

Одной из двух главных проблем в этой области является преодоление конкурентной сольватации при сборке простых компонентов (нуклеооснований, нуклеотидов или их синтетических аналогов) в сложные структуры в присутствии воды. В планарных системах, контактирующих с водной фазой, oia проблема решается за счет резкого градиента свойств среды (в том числе, диэлектрической проницаемости) вблизи границы гидрофобная фаза/водный раствор, позволяющего многократно усилить эффективность образования водородных связей. Возможности этого подхода были продемонстрированы на большом числё примеров «планарных рецепторов» в монослоях Ленгмюра из дифильных производных нуклеооснований и сходных соединений, обеспечивающих связывание комплементарных субстратов из субфазы с исключительной селективностью. Вторая проблема заключается в обеспечении благоприятных стерических условий для комплементарных взаимодействий в ультратонкой пленке, поскольку стерический фактор играет ключевую роль в молекулярном распознавании с участием водородных связей, обладающих пространственной 4 направленностью. Взаимодействия компонентов системы между собой, их разориентация и взаимодействия с подложкой неизбежно приводят к снижению эффективности взаимодействий с субстратом. В этом отношении метод монослоев Ленгмюра по сравнению с другими методами создания планарных систем (например, методом самоорганизованных монослоев, или САМ) обладает особой ценностью, так как позволяет настраивать стерические условия в молекулярном ансамбле за счет изменения плотности упаковки и взаимной ориентации молекул на поверхности жидкости.

Однако, создание комплементарных систем из таких монослоев-прекурсоров на твердой поверхности (пленок Ленгмюра-Блоджетт, или ПЛБ) требует особого подхода, поскольку в традиционных полислойных ПЛБ молекулярному распознаванию препятствуют диффузионные и стерические ограничения, а получение монослойных ПЛБ Х-типа (т.е. таких, в которых функциональные гидрофильные группы были бы ориентированы в направлении от положки и доступны для взаимодействий) сопряжено со значительными трудностями в силу термодинамической нестабильности таких систем. Одной из возможных стратегий для решения этой задачи является иерархическая супрамолекулярная сборка комплементарной системы на активной матрице, созданной из предорганизованного монослоя-прекурсора синтетических рецепторов, стабилизированного САМ, на твердой поверхности. Активная матрица должна быть способна связывать соединения, несущие нуклеооснования, инициировать дальнейшую самоорганизацию системы за счет образования комплементарных пар и минимизировать влияние подложки и стерически неблагоприятных взаимодействий между нуклеооснованиями внутри планарного ансамбля. В качестве рецепторов для создания активной матрицы особый интерес представляют металлокомплексы макроциклических полиаминов (цикленов), обладающие сродством по отношению к ряду анионов, в том числе имид- и фосфат-дианионам, являющимся компонентами простых рибо- и дезоксирибонуклеотидов. Поверхность, декорированная такими комплексами, может быть потенциально пригодна для контролируемой количественной 5 иммобилизации нуклеотидов всех пяти семейств в любых соотношениях. Актуальность создания активных матриц на основе металлокомплексов циклена продиктована также и их способностью выступать в роли биомиметиков ряда металлопротеинов (транскрипционных факторов, карбоангидразы и др.), а также активностью в отношении ряда протеинов вирусов, в том числе, вируса ВИЧ.

Цель работы состоит в создании предорганизованных матриц металлокомплексов циклена для самосборки рибонуклеотидов в комплементарные бислои из водных растворов, а также исследовании механизмов специфического молекулярного распознавания нуклеотидов и их фрагментов за счет последовательных нековалентных взаимодействий на межфазной границе.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1) изучение молекулярного распознавания фосфат-анионов и нуклеооснований (компонентов нуклеотидов) в монослоях Ленгмюра на основе дифильных цинк-содержащих металлокомплексов моно- и бис-цикленов;

2) создание активных композитных матриц на основе самоорганизованных монослоев и однослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт Х-типа дифильных металлокомплексов циклена;

3) изучение молекулярного распознавания нуклеотидов и их компонентов из водных растворов активными матрицами, иммобилизованными на твердой подложке;

4) определение основных термодинамических и кинетических параметров связывания исследованных соединений с активными матрицами и выявление его механизма.

Научная новизна состоит в развитии физико-химических принципов формирования и функционирования активных двумерных матриц из синтетических рецепторов металлокомплексов дифильных макроциклических тетрааминов для высокоспецифичного моно- и дивалентного связывания рибонуклеотидов и их фрагментов.

1. Впервые исследовано связывание нуклеооснований и фосфат-дианиона монослоями Ленгмюра из металлокомплекса дифильного циклена и продемонстрирован эволюционный характер процесса молекулярного распознавания в его монослоях на поверхности раздела воздух/вода. Выявлена взаимосвязь между эффективностью образования металлокомплексов и последующим имидным и фосфатным распознаванием в монослое; обнаружен эффект ингибирования молекулярного распознавания в присутствии следовых количеств меди.

2. Впервые разработана оригинальная методика формирования чувствительных однослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт Х-типа на основе макроциклических соединений на твердых поверхностях, модифицированных самоорганизованными монослоями тиолов (композитные матрицы САМ/ПЛБ).

3. Подробно изучено молекулярное распознавание неорганических фосфатов, нуклеооснований и нуклеотидов на активных матрицах САМ/ПЛБ на основе макроциклических моно- и бис-цикленов.

4. Выявлена определяющая роль молекулярной структуры макроциклического металлокомплекса в многоцентровом имидном распознавании в композитных матрицах на твердых подложках.

5. Рассчитаны основные термодинамические и кинетические параметры связывания нуклеотидов и их компонентов с активными матрицами, предложен механизм взаимодействия исследованных соединений с планарным ансамблем металлорецептов. Показано, что иммобилизация металлокомплексов в САМ/ПЛБ увеличивает сродство металлорецептора по отношению к фосфат-анионам в 6 раз.

6. Впервые реализована сборка гомогенных комплементарных бислоев нуклеотидов групп аденина и урацила («двойные плоскости») на композитных матрицах моноциклического производного циклена в водной среде

7. Впервые продемонстрировано двухцентровое связывание уридинмонофосфата активными матрицами на основе 6nc-(Zn~ -циклена).

Практическая значимость работы. Созданы ППР-чипы на основе монослоев цинксодержащих комплексов производных циклена для распознавания имидной группы биологически важных молекул, для неорганического фосфат-аниона и связывания нуклеотидов в водной среде. Чувствительность созданных сенсорных элементов на основе САМ/ПЛБ дицетилциклена составляет 5*10 М для фосфат-анионов и 10"4 М для нуклеооснований пиримидинового ряда.

На защиту выносятся

• экспериментальные данные по молекулярному распознаванию анионов и молекулярных фрагментов в монослоях Ленгмюра металлокомплексов Zn2+

ДЦЦ;

• способ формирования композитных матриц на основе самоорганизованных монослоев и пленок Ленгмюра-Блоджетт для селективного связывания компонентов нуклеотидов

• данные о молекулярном распознавании имидов и фосфатов активными матрицами металлокомплексов Zn^-ДЦЦ;

• результаты исследования моновалентного и бивалентного связывания нуклеотидов САМ/ПЛБ на основе

Zn'-ДЦЦигп^-БЦ.

• результаты кинетической и термодинамической обработок процессов связывания нуклеотидов и их фрагментов на активных матрицах Zn2,^UH

выводы

1. Впервые исследовано связывание монослоями Ленгмюра из металлокомплексов дифильного циклена нуклеооснований и фосфат-дианионов из водных субфаз. Установлено, что монослой металлокомплексов способен связывать урацил (в отличие от аденина), и выявлена взаимосвязь между эффективностью образования металлокомплексов и последующим имидным и фосфатным распознаванием в монослое.

2. Показано, что присутствие следовых количеств ионов меди(П) в субфазе полностью ингибирует связывание урацила монослоем ДЦЦ на поверхности раствора, содержащего ионы цинка и нуклеооснование.

3. Разработана новая методика создания активных матриц САМ/ПЛБ на основе монослоев металлокомплексов циклена, иммобилизованных на поверхности самоорганизованного монослоя тиола. Показано, что эта методика позволяет стабилизировать термодинамически неустойчивую ПЛБ Х-типа с сохранением ее структуры и свойств на твердой поверхности.

4. Впервые подробно изучено молекулярное распознавание неорганических фосфатов, нуклеооснований и нуклеотидов на композитных матрицах САМ/ПЛБ гп2+-ДЦЦ.

5. Установлено, что эффективность связывания имидной группы композитной матрицей определяется конформацией макроцикла, задаваемой в монослое Ленгмюра.

6. Обнаружено шестикратное увеличение устойчивости комплекса Zn -ДЦЦ с фосфат-дианионом, образующимся в САМ/ПЛБ, по сравнению с аналогичным комплексом циклена в объеме раствора.

7. Впервые осуществлена иммобилизация рибонуклеотидов семейств аденина и уридина (с разным числом фосфатных групп) на активных планарных

О 1 матрицах Zn -ДЦЦ.

8. Установлено, что связывание нуклеотидов и их компонентов с активными матрицами протекает по двухстадийному механизму (стадии псевдо-первого и нулевого порядка), соответствующему формированию адсорбционного слоя

111 нуклеотидов с последующим образованием координационных соединений на поверхности матрицы.

9. Показано, что связывание нуклеотидов активными матрицами происходит за счет координации концевых фосфатных групп нуклеотидов на макроциклических металлокомплексах, при этом нуклеооснования остаются экспонированными в раствор и доступными для взаимодействий с комплементарными партнерами.

10. Впервые реализована самосборка комплементарных бислоев нуклеотидов групп аденина и урацила («двойные плоскости») в присутствии водной фазы на твердой поверхности путем их последовательной или одновременной адсорбции на САМ/ПЛБ Zn -ДЦЦ. Установлено, что взаимодействие нуклеотидов в бислоях носит специфический характер, отвечающий образованию комплементарных пар нуклеооснований.

11. Исследованы монослои Ленгмюра дифильного бис-циклического металлокомплекса Zn -БЦ на различных субфазах и сформированы активные матрицы Zn2+-B4 с высокой поверхностной концентрацией активных молекул. Таким образом показано, что предложенная методика формирования активных матриц САМ/ПЛБ может быть использована для соединений с различной структурой (размерами головных групп и числом алкильных заместителей).

12. Впервые реализовано специфическое внутримолекулярное двухцентровое связывание уридин-5'-фосфата активными матрицами Zn -БЦ.

1. Prins L.J., Reinhoudt D.N., Timmerman P. // Noncovalent Synthesis Using Hydrogen Bonding // Angew. Chem. Int. Ed., 2001, V.40, P.2382 2426.

2. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. // Molecular Biology of the Cell, 2nd ed. // Garland Publishing: New York, 1989.

3. Hamilton A.D. // Advances in Supramolecular Chemistry // JAI Press: Greenwich, CT, 1990, V.l, PI.

4. Philip D., Stoddart J.F. // Self-Assembly in Natural and Unnatural Systems // Angew. Chem. Int. Ed., 1996, V.35, P.l 154.

5. Murakami Y., Kikuchi J., Hisaeda Y., Hayashida O. // Artificial Enzymes // Chem. Rev., 1996, V.96, P.721.

6. Willem V., Rudkevich D.N., Reinhoudt D.N. // Molecular recognition by artificial receptors //Pure Appl. Chem., 1994, V.66, P.679.

7. Zimmerman S.C. // Rigid Molecular Tweezers as Hosts for the Complexation of Neutral Guests // Top. Curr. Chem., 1993, V.l65, P.71.

8. Rebek Jr. J. // Molecular Recognition and Biophysical Organic Chemistry // Acc. Chem. Res., 1990, V.23, P.399.

9. Ts'o P.O.P. // Basic Principles in Mucleic Acid Chemistry // Academic: New York, 1974, V.I, Chap.6.

10. Kneeland D.M., Ariga K., Lynch V.M., Huang C.-Y., Anslyn E.V. // Bis(alkylguanidinium) Receptors for Phosphodiesters: Effect of Counterions, Solvent Mixtures, and Cavity Flexibility on Complexation // J. Am. Chem. Soc., 1993, V.115,P.10042.

11. Fan, E., Van Arman, S. A., Kincaid, S., Hamilton, A. D. // Molecular recognition: hydrogen-bonding receptors that function in highly competitive solvents // J. Am. Chem. Soc., 1993, V.l 15, P.369.

12. Ariga K., Kunitake T. // Molecular Recognition at Air-Water and Related Interfaces: Complementary Hydrogen Bonding and Multisite Interaction // Acc. Chem. Res., 1998, V.31, P.371-378

13. Rotello V.M., Viani E.A., Deslongchamps G., Murray B.A., Rebek Jr. J. // Molecular Recognition in Water: New Receptors for Adenine Derivatives // J. Am. Chem. Soc., 1993, V.l 15, P.797.

14. Torneiro M., Still W.C. // Sequence-Selective Binding of Peptides in Water by a Synthetic Receptor Molecule // J. Am. Chem, Soc., 1995, V.l 17, P.5887.

15. No wick J.S., Cao, Т., Noronha, G. // Molecular Recognition between Uncharged Molecules in Aqueous Micelles // J. Am. Chem. Soc., 1994, V.l 16, P.3285.

16. Aoyama Y., Tanaka Y., Sugahara S. // Molecular Recognition of Sugars via Hydrogen-Bonding Interaction with a Synthetic Polyhydroxy Macrocycle // J. Am. Chem. Soc., 1989, V.l 11, P.5397.

17. Asanuma H., Gotoh S., Ban Т., Komiyama M. // Absorption of Uric Acid Derivatives in Water by Poly(vinyldiaminotriazine) through Hydrogen Bonding // Chem. Lett., 1996, V.25, P.681-682.

18. Drost-Hansen W., Singleton J.L. // Fundamentals of Medical Cell Biology // V. ЗА, Chemistry of the Living Cell, JAI Press: Greenwich, CT, 1992, Chap.5.

19. Fuhrhop J.-H., Koning J. // Membrane and Molecular Assemblies. The Synthetic Approach // Royal Society of Chemistry: London, 1994.

20. Ulman A. // An Introduction to Ultrathin Organic Films from Langmuir-Blodgett to Self-Assembly // Academic Press: New York, 1991.

21. Sasaki D.Y., Kurihara K., Kunitake T. // Self-Assembled Multifunctional Receptors for Nucleotides at the Air-Water Interface // J. Am. Chem. Soc., 1992, V.l 14, P. 10994.

22. Sasaki D.Y., Yanagi M., Kurihara K., Kunitake T. // The Interaction of a Guanidinium Monolayer with ATP and AMP, as Revealed by Surface Potential and UV Absorption Measurements // Thin Solid Films, 1992, V.210/211, P.776.

23. Ikeura Y., Kurihara K., Kunitake T. // Molecular Recognition at the Air-Water Interface. Specific Binding of Nitrogen Aromatics and Amino Acids by Monolayers of Long-Chain Derivatives of Kemp's Acid // J. Am. Chem. Soc., 1991, V.113,P.7342.

24. Kurihara K., Ohto K., Honda Y., Kunitake T. // Efficient, Complementary Binding of Nucleic Acid Bases to Diaminotriazine-Functionalized Monolayers on Water// J. Am. Chem. Soc., 1991, V.l 13, P.5077.

25. Kawahara Т., Kurihara K., Kunitake T. // Cooperative Binding of Adenine via Complementary Hydrogen Bonding to an Imide Functionalized Monolayer at the Air-Water Interface // Chem. Lett., 1992, V.21, P. 1839.

26. Kurihara К., Ohto К., Tanaka Y., Aoyama Y., Kunitake T. // Molecular Recognition of Sugars by Monolayers of Resorcinol-Dodecanal Cyclotetramer // J. Am. Chem. Soc., 1991, V. 113, P.444.

27. Cha X., Ariga K., Kunitake T. // Molecular Recognition of Aqueous Dipeptides at Multiple Hydrogen-Bonding Sites of Mixed Peptide Monolayers // J. Am. Chem. Soc., 1996, V.118, P.9545.

28. Kitano H., Ringsdorf H. // Surface Behaviors of Nucleic Acid Base-Containing Lipids in Monolayer and Bilayer Systems // Bull. Chem. Soc. Jpn., 1985, V.58, P.2826-2828.

29. Shimomura M., Nakamura F., Ijiro K., Taketsuna H., Tanaka M., Nakamura H., Hasebe K. // Two-Dimensional DNA-Mimetic Molecular Organizations at the Air-Water Interface // J. Am. Chem. Soc., 1997, V.l 19, P.2341.

30. McConnell H.M. // Structures and Transitions in Lipid Monolayers at the Air-Water Interface // Annu. Rev. Phys. Chem., 1991, V.42, P.171-195.

31. Santacroce P.V., Basu A. // Studies of the Carbohydrate-Carbohydrate Interaction Between Lactose and GM3 Using Langmuir Monolayers and Glycolipid Micelles // Glycoconjugate Journal, 2004, V.21, P.89-95.

32. Ramakrishnan V., D'Costa M., Ganesh K.N., Sastry M. // PNA-DNA Hybridization at the Air-Water Interface in the Presence of Octadecylamine Langmuir Monolayers // Langmuir, 2002, V. 18, P.6307-6311.

33. Wang Y., Du X., Miao W., Liang Y. // Molecular Recognition of Cytosine- and Guanine-Functionalized Nucleolipids in the Mixed Monolayers at the Air-Water Interface and Langmuir-Blodgett Films // J. Phys. Chem. B, 2006, V.l 10, P.4914-4923.

34. Higuchi M., Wright J.P., Taguchi K., Kinoshita T. // Structure and Molecular Recognition Properties of a Poly(allylamine) Monolayer Containing Poly(L-alanine) Graft Chains // Langmuir, 2000, V.l6, P.7061-7065.

35. Molt О;, Schrader Th.// Highly Sensitive Recognition of Substrates of Adrenergic Receptors at the Air/Water Interface // Angew. Chem. Int. Ed., 2003, V.42, P.5509-5513.

36. Sessler J.L., Jayawickramarajah J. // Functionalized Base-Pairs: Versatile Scaffolds for Self-Assembly // Chem. Commun., 2005, P. 1939-1949.

37. Mulder A., Huskens J., Reinhoudt D:N. // Multivalency in Supramolecular Chemistry and Nanofabrication // Org. Biomol. Chem., 2004, Y.2, P.3409-3424.

38. Badjic J.D., Nelson A.,.Cantrill S.J., Turnbull W.B., Stoddart J.F. // Multivalency and.Cooperativity in Supramolecular Chemistry // Acc. Chem. Res., 2005, V,38' P.723-732.

39. Jiao Т., Liu M. // Supramolecular Assemblies and, Molecular Recognition of Amphiphilic Schiff Bases with Barbituric Acid in Organized .Molecular Films // J. Phys. Chem. B, 2005, V.109, P:2532-2539

40. Springs В., Haake P. // Equilibrium constants for association of guanidinium and ammonium ions with oxyanions. The effect of changing basicity of the oxyanion. //Bioorg. Chem. 1977, V.6, P.181-190.

41. Weber D:J., Serpersu E.H., Shortle D., Mildvan A.S. // Diverse Interactions Between the Individual Mutations in a Double Mutant at the. Active Site , of Staphylococcal Nuclease //Biochemistry 1990, V.29, P.8632-8642.

42. Shimomura M., Ando R., Kunitake T. Ber. Bunsenges. Phys. Chem., 1983, V.87, P.l 134-1143.

43. Taguchi K., Ariga K., Kunitake T. // Multi-site Recognition of Flavin Adenine Dinucleotide by Mixed Monolayers on Water // Chem. Lett., 1995, V.24, P.701

44. Ariga K., Kamino A., Koyano H., Kunitake T. // Recognition of aqueous flavin mononucleotide on the surface of binary monolayers of guanidinium and melamine amphiphiles // J. Mater. Chem., 1997, V.7, P.l 155-1161.

45. Oishi Y., Kato Т., Kuramori M., Suehiro K., Ariga K., Kamino A., Koyano H.,

46. Kunitake T. // Control of Molecular Ordering in Guanidinium-Functionalized116

47. Monolayer by Carboxylate Template Molecules // J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1997, P. 1357

48. Koyano H., Yoshihara K., Ariga K., Kunitake Т., Oishi Y., Kawano O., Kuramori M., Suehiro K. // Atomic Force Microscopic Observation of a Dialkylmelamine Monolayer on Barbituric Acid // J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1996, P. 1769.

49. D. Vollhardt // Supramolecular Organisation in Monolayers at the Air/Water Interface // Materials Science and Engineering C, 2002, V.22, P. 121-127.

50. Sakurai M., Tamagawa H., Furuki Т., Inoue Y., Ariga K., Kunitake Т. // A Theoretical Interpretation of Remarkable Enhancement of Intermolecular Binding at the Lipid-Water Interface // Chem. Lett., 1995, V.24, P. 1001.

51. Sakurai M., Tamagawa H., Inoue Y., Ariga K., Kunitake T. // Theoretical Study of Intermolecular Interaction at the Lipid-Water Interface. 1. Quantum Chemical Analysis Using a Reaction Field Theory // J. Phys. Chem. B, 1997, V.101, P.4810-4816.

52. Ariga K., Kamino A., Cha X., Kunitake T. // Multisite Recognition of Aqueous Dipeptides by Oligoglycine Arrays Mixed with Guanidinium and Other Receptor Units at the Air-Water Interface // Langmuir, 1999, V.15, P.3875-3885.

53. Kimizuka N., Baba A., Kunitake T. // Supramolecular Holoenzymes: Activity Modulation of Endonuclease by the Use of Synthetic Bilayer Membranes as Regulatory Cofactors // J. Am. Chem. Soc., 2001, V.123, P.1764-1765.

54. Sakai N., Matile S. // Anion-Mediated Transfer of Polyarginine across Liquid and Bilayer Membranes //J. Am. Chem. Soc., 2003, V.125, P.14348-14356.

55. Lee M., An W.G., Kim J.-H., Choi H.-J., Kim S.-H., Han M.-H., Koh К. // A model study of artificial linker system using self-assembled calix4.arene derivative monolayers for protein immobilization // Mater. Sci. Eng. C, 2004, V.24, P.123-126.

56. Zadmard R., Schrader T. // Nanomolar Protein Sensing with Embedded Receptor Molecules // J. Am. Chem. Soc., 2005, V.127, P.904-915,

57. Kolusheva S., Molt O., Herm M., Schrader Т., Jelinek R. // Selective Detection of Catecholamines by Synthetic Receptors Embedded in Chromatic Polydiacetylene Vesicles // J. Am. Chem. Soc., 2005, V.127, P.10000-10001.

58. Chartres J.D., Lindoy L.F., Meehan G.V. // Transition and post-transition metal systems incorporating linked synthetic macrocycles as structural elements // Coord. Chem. Rev., 2001, V.216-217, P.249-286.

59. Aoki S., Jikiba A., Takeda K., Kimura E. // A zinc(II) complex-conjugated polymer for selective recognition and separation of phosphates // J. Phys. Org. Chem., 2004, V.17, P.489-497.

60. Fix M., Lauter R., Lobbe Ch., Brezesinski G., Galla H.-J. // Hydrogen-Bond-Induced Chiral Discrimination in Monolayers of Bipolar Methyl Dihydroxyoctadecanoates // Langmuir, 2000, V.16, P.8937-8945

61. Furuki Т., Hosokawa F., Sakurai M., Inoue Y., Chujo R. // Microscopic Medium Effects on a Chemical Reaction. A Theoretical Study of Decarboxylation Catalyzed by Cyclodextrins as an Enzyme Model // J. Am. Chem. Soc., 1993, V.l 15, P.2903-2911.

62. Bernt P., Kurihara K., Kunitake T. // Measurement of Forces between Surfaces Composed of Two-Dimensionally Organized, Complementary and Noncomplementary Nucleobases // Langmuir, 1995, V.l 1, P.3083-3091.

63. Kurihara K., Abe Т., Nakashima N. // Direct Demonstration of Attraction for a Complementary Pair of Apposed Nucleic Acid Base Monolayers // Langmuir1996, V.12, P.4053-4056.

64. Love J.Ch., Estroff L.A., Kriebel J.K., Nuzzo R.G., Whitesides G.M. // Self-Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology // Chem. Rev., 2005, V.l05, P.l 103-1169.

65. Flink S., van Veggel F.C.J.M., Reinhoudt D.N. // Sensor Functionalities in Self-Assembled Monolayers // Adv. Mater., 2000, V.12, P.l315-1328.

66. Dynarowicz-Latka P., Dhanabalan A., Oliveira Jr. O.N. // Modern Physicochemical Research on Langmuir Monolayers // Advances in Colloid and Interface Science, 2001, V.91, P.221-293.

67. Schwartz D.K. // Langmuir-Blodgett Film Structure // Surface Science Reports,1997, V.27, P.241-334.

68. Voet D., Voet J.G., Pratt C.W. // Fundamentals of Biochemistry // Willey, New York, 1999.

69. Niemeyer C.M. // Nanoparticles, Proteins, and Nucleic Acids: Biotechnology Meets Materials Science // Angew. Chem. Int. Ed., 2001, V.40, P.4128-4158.

70. Elghanian R., Storhoff J.J., Mucic R.C., Letsinger R.L., Mirkin C.A. // Selective Colorimetric Detection of Polynucleotides Based on the Distance-Dependent Optical Properties of Gold Nanoparticles // Science, 1997, V.277, P. 1078-1080.

71. Smith S.S. // A Self-Assembling Nanoscale Camshaft: Implications for Nanoscale Materials and Devices Constructed from Proteins and Nucleic Acids // Nano. Lett., 2001, V.l, P.51-56.

72. Niemeyer C.M., Adler M., Gao S., Chi L. // Nanostructured DNA-Protein Aggregates Consisting of Covalent Oligonucleotide—Streptavidin Conjugates // Bioconjugate Chem., 2001, V.l2, P.364.

73. Marczak R., Hoang V., Noworyta K., Zandler M., Kutner W., De Sousa F. // Molecular recognition of adenine, adenosine and ATP at the air-water interface by a uracil appended fullerene // J. Mater. Chem., 2002, V.12, P.2123-2129.

74. Piscevic D., Lawall R., Veith M., Liley M., Okahata Y., Knoll W. // Oligonucleotide Hybridization Observed by Surface Plasmon Optical Techniques //Applied Surface Science, 1995, V.90, P.425.

75. Jaeger L., Leontis N. // Tecto-RNA: One-Dimensional Self-Assembly through Tertiary Interactions // Angew. Chem. Int. Ed., 2000, V.39, P.2521-2524.

76. Charidi M.R., Granja J.R., Milligan R.A., McRee D.R., Khazanovich N. // Self-assembling organic nanotubes based on a cyclic peptide architecture // Nature, 1993, V.366, P.324.

77. Devaraj N.K., Miller G.P., Ebina W., Kakaradov В., Collman J.P., Kool E.T., Chidsey Ch.E.D. // Chemoselective Covalent Coupling of Oligonucleotide Probes to Self-Assembled Monolayers //J. Am. Chem. Soc., 2005, V.127, P.8600-8601.

78. Padilla J.E., Colovos C., Yeates Т.О. // Nanohedra: Using symmetry to design self assembling protein cages, layers, crystals, and filaments // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001, V.98, P.2217.

79. Tanatani A., Mio M.J., Moore J.S. // Chain Length-Dependent Affinity of Helical Foldamers for a Rodlike Guest//J. Am. Chem. Soc. 2001, V.123, P.1792-1793.

80. Chen J., Berman A. // Formation of nucleotide base-pairs at the interface of a polydiacetylene cytosine derivatized monolayer // Nanotechnology, 2004, V.l5, P.S303-S315.

81. Weisser M., Kashammer J., Menges В., Matsumoto J., Nakamura F., Ijiro K., Shimomura M., Mittler S. // Adenine-Uridine Base Pairing at the Water-Solid-Interface // J. Am. Chem. Soc., 2000, V.122, P.87-95.

82. Matsuura К., Ebara Y., Okahata Y. // Gas Phase Molecular Recognition on Nucleobase Monolayers Immobilized on a Highly Sensitive Quartz-Crystal Microbalance // Langmuir, 1997, V.13, P.814-820.

83. Motesharei K., Myles D.C. // Molecular Recognition on Functionalized Self-Assembled Monolayers of Alkanethiols on Gold // J. Am. Chem. Soc., 1998, V.120, P.7328-7336.

84. Ulman A. // Formation and Structure of Self-Assembled Monolayers // Chem. Rev., 1996, V.96, P.1533-1554.

85. Solomons T.W.G. // Organic Chemistry // Wiley & Sons: New York, 1994.

86. Sastry M., Mayya K.S., Patil V. // Facile Surface Modification of Colloidal Particles Using Bilayer Surfactant Assemblies: A New Strategy for Electrostatic Complexation in Langmuir-Blodgett Films // Langmuir, 1998, V.14, P.5921-5928.

87. Sastry M., Patil V., Sainkar S.R. // Electrostatically Controlled Diffusion of Carboxylic Acid Derivatized Silver Colloidal Particles in Thermally Evaporated Fatty Amine Films // J. Phys. Chem. B, 1998, V.l02, P. 1404-1410.

88. Swami A., Kumar A., Selvakannan P.R., Mandal S., Sastry M. // Langmuir-Blodgett films of Laurylamine-Modified Hydrophobic Gold Nanoparticles Organized at the Air-Water Interface // J. Col. Int. Sci., 2003, V.260, P.367-373.

89. Sastry M., Rao M., Ganesh K. N. // Electrostatic Assembly of Nanoparticles and Biomacromolecules //Acc. Chem. Res., 2002, V.35, P.847-855.

90. Corbellini F., Mulder A., Sartori A., Ludden M.J.W., Casnati A., Ungaro R., Huskens J., Crego-Calama M., Reinhoudt D.N. // Assembly of a Supramolecular Capsule on a Molecular Printboard // J. Am. Chem. Soc., 2004, V.126, P.17050-17058.

91. Mulder A., Auletta Т., Sartori A., Del Ciotto S., Casnati A., Ungaro R., Huskens J., Reinhoudt D.N. // Divalent Binding of a Bis(adamantyl)-Functionalized

92. Calix4.arene to P-cyclodextrin-based Hosts: An Experimental and Theoretical Study on Multivalent Binding in Solution and at Self-Assembled Monolayers // J. Am. Chem. Soc. 2004, V.126, P.6627-6636.

93. Huskens J., Mulder A., Auletta Т., Nijhuis Ch.A., Ludden M.J.W., Reinhoudt D.N. // A Model for Describing the Thermodynamics of Multivalent Host-Guest Interactions at Interfaces // J. Am. Chem. Soc., 2004, V.126, P.6784-6797.

94. Onclin S., Mulder A., Huskens J., Jan Ravoo В., Reinhoudt D.N. // Molecular Printboards: Monolayers of P-Cyclodextrins on Silicon Oxide Surfaces // Langmuir, 2004, V.20, P.5460-5466.

95. Huskens J., Deij M.A., Reinhoudt D.N. // Attachment of Molecules at a Molecular Printboard by Multiple Host-Guest Interactions // Angew. Chem. Int. Ed., 2002, V.41, P.4467-4471.

96. Huisman B.-H., Rudkevich D.M., van Veggel F.C.J.M., Reinhoudt D.N. // Self-Assembled Monolayers of Carceplexes on Gold // J. Am. Chem. Soc., 1996, V.l 18, P.3523-3524.

97. Huisman B.H., Rudkevich D.M., Farran A., Verboom W., van Veggel F.C.J.M., Reinhoudt D.N. // Synthesis of (Hemi)Carceplex Adsorbates for Self-Assembly on Gold // Eur. J. Org. Chem., 2000, 269-274.

98. Fendler J.H. // Chemical Self-assembly for Electronic Applications // Chem. Mater., 2001, V. 13, P.3196-3210.

99. Gupta P., Loos K., Korniakov A., Spagnoli C., Cowman M., Ulman A. // Facile Route to Ultraflat SAM-Protected Gold Surfaces by "Amphiphile Splitting" // Angew. Chem. Int. Ed., 2004, V.43, P.520-523.

100. Lindoy L.F. // The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes. // Cambridge: Cambridge University Press, 1989.

101. Хираока M. // Краун-соединения. // M.: Мир, 1986.

102. Kimura E., Shiota Т., Koike Т., Shiro M., Kodama M. // A Zinc(II) Complex of 1,5,9-triazacyclododecane (12.aneN3) as a Model for Carbonic Anhydrase // J. Am. Chem. Soc., 1990, V.112, P.5805-5811.

103. Lehn J.-M. // Supramolecular Chemistry: Concept and Perspective // VCH, Weinheim, Germany, 1995.

104. Kimura E., Kikuta E. // Why zinc in zinc enzymes? From biological roles to DNA base-selective recognition. //J. Biol. Inorg. Chem., 2000, V.5, P.139-155.

105. Martell A.E., Smith R.M. // Critical Stability Constants // Plenum Press: New York, 1982, V.5, P.48.

106. Koiket Т., Kimura E. // Roles of Zinc(II) Ion in Phosphatases. A Model Study with Zinc(II)-Macrocyclic Polyamine Complexes // J. Am. Chem. Soc., 1991, V.l 13, P.8935-8941.

107. Shionoya M., Sugiyama M., Kimura E. // Uracil-Targeted Inhibition of Poly(A)-Poly(U) Hybridization by a Zinc(II)-Cyclen Complex // J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1994, P. 1747.

108. Kimura E., Ikeda Т., Shionoya M. // Macrocyclic Metal Complexes for Selective Recognition of Nucleic Acid Bases and Manipulation of Gene Expression // Pure Appl. Chem., 1997, V.69, P.2187.

109. Kimura E., Ikeda Т., Aoki S., Shionoya M. // Macrocyclic zinc(II) complexes for selective recognition of nucleobases in single- and double-stranded polynucleotides // J. Biol. Inorg. Chem., 1998, V.3, P.259-267.

110. Christianson D.W., Fierke C.A. // Carbonic Anhydrase: Evolution of the Zinc Binding Site by Nature and by Design // Acc. Chem. Res., 1996, V.29, P.331.

111. Bertini I., Gray H.B., Lippard S.J., Valentine J.S. // Bioinorganic Chemistry // University Science Books, Mill Valley, CA, 1994.

112. Berg J.M., Shi Y. // The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc // Science, 1996, V. 271, P.1081-1085.

113. Collman J.P., Zhang X. // Functional Analogs of the Oxygen Binding and Activating Heme Proteins // in Comprehensive Supramolecular Chemistry, V.5, ed. Suslick K.S., Elsevier, Oxford, 1996.

114. Traylor T.G. // Kinetics and Mechanism Studies in Biomimetic Chemistry: Metalloenzyme Model Systems // Pure Appl. Chem., 1991, V.63, P.265.

115. Harrison S.C. // A structural taxonomy of DNA-binding domains // Nature, 1991, V.353, P.715.

116. Schwabe J.W.R., Klug A. // Zinc Mining for Protein Domains // Nature Structural & Molecular Biology, 1994, V.l, P.345-349.

117. Koike Т., Takashige M., Kimura E., Fujioka H., Shiro M. // Bis(Znll-cyclen) Complex as a Novel Receptor of Barbiturates in Aqueous Solution // Chem. Eur. J., 1996, V.2,P.617-623.

118. Martin J.C. // Nucleotide Analogues as Antiviral Agents // American Chemical Society: Washington, DC, 1989.

119. Merigan Jr. T.C., Bartlett J.G., Bolognesi D. // Textbook of AIDS Medicine // 2nd ed., Williams & Williams: Baltimore, 1999.

120. Huryn D.M., Okabe M. // AIDS-driven nucleoside chemistry // Chem. Rev., 1992, V.92, P.1745-1768.

121. De Clercq E. // Toward improved anti-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for intervention with HIV infections // J. Med. Chem., 1995, V.38, P.2491-2517.

122. Zimmerman T.P., Mahony W.B., Prus K.L. // 3'-azido-3'-deoxythymidine. An unusual nucleoside analogue that permeates the membrane of human erythrocytes and lymphocytes by nonfacilitated diffusion // J. Biol. Chem., 1987, V.262, P.5748-5754.

123. Bourdais J., Biondi R., Sarfati S., Guerreiro C., Lascu I., Janin J., Veron M. // Cellular Phosphorylation of Anti-HIV Nucleosides // J. Biol. Chem., 1996, V.271, P.7887-7890.

124. Gosselin G., Imbach J.-L., Sommadossi J.-P. Bull. Inst. Pasteur,1994, V.92, P.181-196.

125. Inouye Y., Kanamori Т., Sugiyama M., Yoshida Т., Koike Т., Shionoya M., Enomoto K., Suehiro K., Kimura E. Antiviral Chemistry Chemotherapy, 1995, V.6, P.337-344.

126. Konig В., Pelka M., Zieg H., Ritter Т., Bouas-Laurent H., Bonneau R., Desvergne J.-P. // Photoinduced Electron Transfer in a Phenothiazine-Riboflavin Dyad Assembled by Zinc-Imide Coordination in Water // J. Am. Chem. Soc., 1999, V.121, P.1681-1687.

127. Konig В., Reichenbach-Klinke R., Leffler-Schuster H., Zabel M., unpublished 2001.

128. Kimura E. I I Model Studies for Molecular Recognition of Carbonic Anhydrase and Carboxypeptidase // Acc. Chem. Res., 2001, V.34, P. 171.

129. Koike Т., Takamura M., Kimura E. // Role of Zinc(II) in beta-Lactamase II: A Model Study with a Zinc(II)-MacrocycIic Tetraamine (1,4,7,10-Tetraazacyclododecane, Cyclen) Complex // J. Am. Chem. Soc., 1994, V.l 16, P.8443.

130. Kim D.H, Lee S.S. // Origin of rate-acceleration in ester hydrolysis with metalloprotease mimics // Bioorg. Med. Chem., 2000, V.8, P.647-652.

131. Kalinina M.A., Arslanov V.V., Tsar'kova L.A., Rakhnyanskaya A.A. // Langmuir Monolayers of Alkylated Tetraazacyclenes on the Water Surface // Colloid J., 2000, V.62, P.545-549.

132. Kalinina M.A., Arslanov V.V. // Kinetics of Complexation in the Monolayers of Amphiphilic Dicetylcyclen on the Surface of Aqueous Copper(II) Chloride Solutions // Colloid J., 2000, V.64, P.49-55.

133. Калинина M.A., Арсланов B.B. // Кинетика комплексообразования в монослоях дифильного дицетилциклена на поверхности водных растворов хлорида меди // Коллоид, журн., 2002, Т.64, С.56-62.

134. Kalinina М.А., Arslanov V.V., Zheludeva S.I., Tereschenko E.Y. // Inversion of Selective Binding of Transition Metal Ions by Langmuir Monolayers of Amphiphilic Cyclen // Thin Solid Films, 2005, V.472, P.232-237.

135. Калинина M.A., Арсланов B.B., Турыгин Д.С., Терещенко Е.Ю., Желудева С.И. // Влияние иммобилизации макроциклического тетрамина в монослоях Ленгмюра на селективность комплексообразования // Журнал физической химии, 2008, Т.82, N.4, С.725-731.

136. Turygin D.S., Subat M., Raitman O.A., Arslanov V.V., Konig В., Kalinina M.A. // Cooperative Self-Assembly of Adenosine and Uridine Nucleotides on a 2D Synthetic Template // Angewandte Chemie Int. Ed., 2006, V.45, P.5340 5344.

137. Sauerbrey G. // Verwendung von Schwingquarzen zur wagung dunner Schichten und zur Mikrowagung // Z. Phys. (Munich), 1959, V.l55, P.206-215.

138. Raether H. в кн.: // Surface plasmons on smooth and rough surfaces and on gratings // Springer-Verlag, Berlin, 1988.

139. Ordal M.A., Long L.L., Bell R.J., Bell S.E., Bell R.R., Alexander R.W., Ward J., Ward C.A. // Optical Properties of Metals Al, Co, Cu, Au, Fe, Pb, Ni, Pd, Pt, Ag, Ti, and W in the Infrared and Far Infrared // Appl. Opt., 1983, V.ll, P. 10991119.

140. Berger C.E.H., Greve J. // Differential SPR immunosensing // Sens. Actuators B, 2000, V.63, P.103-108.

141. Homola J., Yee S.S., Gauglitz G. // Surface plasmon resonance sensors: review // Sens. Actuators B, 1999, V.54, P.3-15

142. Князев Д.Г. Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук "Организация липид-белковых структур на примере вирусного белка Ml: электрохимический подход" ИФХЭ РАН, Москва, 2008.

143. Jung L.S., Campbell С.Т., Chinowsky Т.М., Mar M.N., Sinclair S.Y. // Quantitative Interpretation of the Response of Surface Plasmon Resonance Sensors to Adsorbed Films // Langmuir, 1998, V.14, P.5636-5648.

144. Wang H., Reinhard B.M. // Monitoring Simultaneous Distance and Orientation Changes in Discrete Dimers of DNA Linked Gold Nanoparticles // J. Phys. Chem. C, 2009, V.l 13, P.l 1215-11222.

145. Reichenbach-Klinke R., Koenig B. // Metal Complexes of Azacrown Ethers in Molecular Recognition and Catalysis // J. Chem. Soc. Dalton Trans., 2002, P.121-130.

146. Калинина M.A., Арсланов B.B // Ион-чувствительные монослои и пленки Ленгмюра- Блоджетт дифильного циклена: селективность и регенерация // Коллоид, журн., 2003, Т.65, С.201-210.

147. Li J., Yue Y., Zhang J., Lu Q.-S., Li K., Huang Y., Zhang Z.-W., Lin H.-H., Wang N., Yu X.-Q. // Arm effects of mononuclear armed cyclen copper complexes on DNA cleavage // Transition Met. Chem., 2008, V.33, P.759-765.

148. Gasser G., Belousoff M.J., Bond A.M., Kosowski Z., Spiccia L. // Recognition of Thymine and Related Nucleosides by a Znn-Cyclen Complex Bearing a Ferrocenyl Pendant // Inorg. Chem., 2007, V.46, P. 1665-1674.

149. Kinoshita-Kikuta E., Kinoshita E., Koike T. // A novel procedure for- simple and efficient genotyping of single nucleotide polymorphisms by using the Zn2+-cyclen complex //Nucleic Acids Res., 2002, V.30, Piel26.

150. Yamashita N., Murata M., Inoue S., Burkitt M.J., Milne L., Kawanishi S. // a-Tocopherol Induces Oxidative Damage to DNA in the Presence of Copper(II) Ions // Chem. Res. Toxicol., 1998, V.l 1, P.855-862.

151. Melvin M.S., Calcutt M.W., Noftle R.E., Manderville R.A. // Influence of the A-Ring on the Redox and Nuclease Properties of the Prodigiosins: Importance of the Bipyrrole Moiety in Oxidative DNA Cleavage // Chem. Res. Toxicol., 2002, V.15, P.742-748.

152. Tuiygin D.S., Subat M., Raitman O.A., Selector S.L., Arslanov V.V., Koenig В., Kalinina M.A. // Two-Dimensional Arrays of Amphiphilic Zn "cyclens for Guided Molecular Recognition at Interfaces // Langmuir, 2007, V.23, P.2517

153. Rosilio V., Boissonnade M.-M., Zhang J. // Penetration of Glucose Oxidase into Organized Phospholipid Monolayers Spread at the Solution/Air Interface // Langmuir, 1993, V.l3, P.4669-4675.

154. Subat M., Woinaroschy K., Gerstl C., Sarkar В., Kaim W., Koenig B. // 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane Metal Complexes as Potent Promoters of Phosphodiester Hydrolysis under Physiological Conditions // Inorg. Chem., 2008, V.47, P.4661-4668.2524.