Молекулярный дизайн потенциальных ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Химический факультет

Осолодкин Дмитрий Иванович

Молекулярный дизайн потенциальных ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3

02.00.03 — Органическая химия 02.00.16 — Медицинская химия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

ни г^/иосм

Москва 2011

2 ' 011 "ГЛ

4855809

Работа выполнена в лаборатории органического синтеза кафедры органической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: кандидат химических наук,

ведущий научный сотрудник Палюлин Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Балакин Константин Валерьевич

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Кост Ольга Алексеевна

Ведущая организация: НИИ фармакологии РАМН

Защита состоится «02» марта 2011 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.69 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет МГУ, ауд. 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «31» января 2011 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 501.001.69, доктор химических наук, профессор

Магдесиева Татьяна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одним из важнейших направлений современной химической науки является создание новых органических соединений, применимых в качестве лекарственных средств.

К числу важных многофункциональных биологических мишеней относится киназа гликогенсинтазы 3 (ОБК-З) — фермент, отвечающий за процесс фосфо-рилирования остатков серина и треонина в различных белках. Она участвует во множестве сигнальных путей, опосредующих целый ряд расстройств: болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, диабет II типа, рак простаты, недифференцированный лейкоз, биполярные расстройства, униполярную депрессию, воспалительные процессы, гипертрофию сердца и др. Аналогичные киназы паразитов могут быть мишенями при борьбе с малярией, трипаносомозом и другими протозойными инфекциями.

В настоящее время единственным ингибитором вБК-З, разрешённым к применению в медицинской практике, является ион лития, однако его терапевтический индекс невысок; несколько других ингибиторов проходят клинические испытания. Несомненно актуальной проблемой медицинской химии остаётся молекулярный дизайн новых низкомолекулярных ингибиторов человеческой СБК-З и аналогичных киназ паразитов. Наличие таких малых молекул позволит создать высокоэффективные инновационные лекарственные средства.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлся компьютерный поиск и дизайн новых потенциальных ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3 человека и паразитических организмов, а также выяснение критериев селективности ингибирования этих ферментов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• Провести детальный анализ пространственной структуры киназы глико-генсинтазы 3 человека;

• Провести анализ количественных соотношений «структура — активность» для ингибиторов ОБК-З человека;

• Предложить схему поиска новых ингибиторов ОБК-З, провести компьютерный поиск и дизайн новых ингибиторов вБК-З;

• Построить модели пространственной структуры вБК-З паразитов и провести молекулярный дизайн селективных ингибиторов киназ паразитов на основе новых потенциальных ингибиторов, предложенных для вБК-З человека.

Научная новизна

На основе анализа структур известных конкурентных по отношению к АТФ ингибиторов построены модели количественной связи «пространственная структура — активность» (ЗБ-(28АК) (СоМБА и СоМБГА), фармакофорные гипотезы и нейросетевой одноклассовый классификатор, позволяющие отличить ингибиторы вБК-З от соединений, не являющихся ингибиторами. Для методов СоМБА и СоМ81А проведён анализ применимости различных схем расчёта частичных атомных зарядов.

На основе выборки структур истинно активных и истинно неактивных по отношению к вБК-З соединений построена система виртуального скрининга, основанная на молекулярном докинге, фармакофорной гипотезе и одноклассовой классификации. Идентифицированы соединения, для которых ингибирование вБК-З предсказывается всеми использованными классификаторами.

На основе динамической модели взаимодействия киназы гликогенсинта-зы 3 человека с неконкурентными ингибиторами предложен механизм неконку-

рентного ингибирования и проведён поиск новых потенциальных неконкурентных ингибиторов в базах данных. Предложены способы модификации найденных структур, приводящие к увеличению их предсказанной аффинности.

Построены модели структуры GSK-3 эукариотических паразитов 21 различного вида, из них 17 — впервые. На основе сравнительного анализа структур GSK-3 человека и паразитов сформулированы критерии селективности ингибиторов GSK-3 паразитов по отношению к GSK-3 человека. Впервые проведён молекулярный дизайн ингибиторов киназ паразитов и виртуальный скрининг по отношению к GSK-3 Plasmodium falciparum; впервые предложены структуры потенциальных селективных ингибиторов GSK-3 Leishmania major, Candida dubli-niensis и Chaetomium globosum.

Практическая значимость работы

Разработана схема проведения виртуального скрининга конкурентных по отношению к АТФ ингибиторов GSK-3 человека с использованием молекулярного докинга, фармакофорных гипотез, нейросетевых одноклассовых классификаторов, а также фильтров по наличию подструктуры и электростатическому подобию в качестве инструментов первичного отсева неактивных соединений.

С использованием метода моделирования молекулярной динамики сформулирован вероятный механизм неконкурентного ингибирования GSK-3. На основе механизма предложены структуры потенциальных неконкурентных ингибиторов.

Сформулированы критерии селективности ингибиторов GSK-3 паразитов по отношению к GSK-3 человека. На основе моделей проведён молекулярный дизайн и виртуальный скрининг потенциальных селективных ингибиторов.

Сформированы списки соединений для проведения биологических испытаний. Соединения сгруппированы по предполагаемому механизму действия: конкурентное ингибирование GSK-3 человека, неконкурентное ингибирование

вБК-З человека, конкурентное ингибирование С8К-3 паразитов. Списки состоят как из коммерчески доступных соединений, так и из новых соединений, доступных синтетическим путём.

Апробация работы

Материалы работы были доложены на XXVIII Европейской школе-конференции по медицинской химии (Урбино, Италия, 2008), XVI и XVII Национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2009 и 2010), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009), 2-м Международном Конгрессе по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010» (Москва), семинаре еСИегшпй) по разработке лекарств (Оксфорд, Великобритания, 2010), 18-м Европейском симпозиуме по количественным соотношениям «структура — активность» (Родос, Греция, 2010), 6-й Германской конференции по хемоинформатике (Гослар, Германия, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в российских и зарубежных журналах.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 205 страницах, содержит 70 рисунков и 39 таблиц. Список литературы включает 295 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко изложена актуальность темы диссертации, сформулированы цели работы, отражены научная новизна и практическая значимость.

В главе 1 показана важность выбора биологической мишени — киназы гликогенсинтазы 3 — в качестве основного объекта исследования. Проведён анализ литературных данных о роли киназы в организме и известных к настоящему

времени ингибиторах киназы, а также о наличии родственных киназ в паразитических организмах. Описаны важнейшие методы поиска новых ингибиторов киназ и сделан выбор наиболее подходящих методов для целей данного исследования. Особый акцент сделан на методах и направлениях, не получивших пока достаточного применения, как, например, поиск неконкурентных ингибиторов или селективных ингибиторов киназ паразитов.

Глава 2 посвящена анализу, поиску и дизайну конкурентных ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3 человека методами виртуального скрининга и 3D-QSAR (CoMFA, CoMSIA).

В разделе 2.1 описана выборка соединений, для которых была определена ингибиторная активность по отношению к киназе GSK-3. Она состоит из 1685 соединений, относящихся к различным классам, из которых 280 являются истинно неактивными, то есть не обладают ингибиторной способностью в максимальной использованной при испытаниях концентрации. Выборка собрана по литературным данным.

В разделе 2.2 описывается построение системы консервативного виртуального скрининга на основе выборок истинных и ложных ингибиторов, а также статистическая валидация предложенной системы. В качестве выборки ложных ингибиторов были использованы разнообразная выборка Национального института рака США (NCI Diversity Set, 1884 соединения), выборка ложных ингибиторов CDK2 из Каталога полезных ложных лигандов DUD (2073 соединения), а также выборка истинно неактивных соединений (раздел 2.1). Были использованы три принципиально различных метода построения системы виртуального скрининга: (1) докинг пространственных структур соединений в область связывания АТФ GSK-3; (2) построение фармакофорной гипотезы на основе кристаллических структур комплексов ингибиторов с GSK-3; (3) построение одноклассового классификатора на основе выборки истинных ингибиторов GSK-3.

При подготовке системы, основанной на докинге, ключевой стадией явля-

ется выбор подходящей кристаллической структуры фермента и правильных ограничений на наличие определённых лиганд-белковых взаимодействий. Исследование структуры киназы было неоднократно описано в литературе, в том числе проводились исследования по выбору оптимальной структуры для проведения виртуального скрининга ингибиторов С8К-3. Было показано1, что ни одна структура киназы не имеет значительных преимуществ перед другими. Нами была выбрана структура ШОЕ (код доступа в банке белковых структур РОВ (http://pdb.org)), характеризующаяся высоким разрешением (2.25 А). При докин-ге были наложены ограничения на обязательное присутствие водородных связей между лигандом и карбонильным атомом кислорода основной цепи АБрИЗ2, а также между лигандом и атомом водорода аминогруппы основной цепи Уа1135 (рис. 1).

Рис. 1. а) Общий вид структуры комплекса ШОЕ; б) Увеличенное изображение области связывания в том же ракурсе; в) структура лиганда. Ограничения на наличие водородных связей показаны зелёным пунктиром.

Качество генерации структур комплексов оценивали путём докинга лиган-дов, кристаллизованных совместно с киназой. Представленная выше комбинация структуры и ограничений на водородные связи приводит к наилучшему качеству воспроизведения кристаллических структур комплексов, хотя для некоторых истинных ингибиторов, образующих с киназой водородные связи типа СН—О, сге-

1 Mishra N. et al. Bioorg. Med. Chera. Lett. 2009. V. 19. P. 5582-5585.

2 Здесь и далее нумерация аминокислотных остатков соответствует последовательности GSK-3ß человека.

нерировать структуры комплексов не удаётся. Тем не менее, число таких ошибок достаточно невелико, что позволяет считать предложенный набор ограничений приемлемым для целей виртуального скрининга.

Фармакофорная гипотеза (рис. 2) была построена на основе наложения 15 кристаллических структур комплексов различных ингибиторов с киназой (минимизировали среднеквадратичное отклонение остатков 131—137 (шарнирной области)). Предварительно было построено 9 гипотез, каждая из которых базировалась не более чем на 5 ингибиторах, из которых выбрана наиболее специфичная — содержащая гидрофобный элемент, соответствующий взаимодействию с Ьеи132. Гипотеза была оптимизирована путём увеличения относительного веса критически важных элементов фармакофора, соответствующих водородным связям с Авр133 и Уа1135, и удаления излишних элементов, характерных лишь для отдельных ингибиторов.

Рис. 2. Оптимизированная фармакофорная гипотеза и структуры ингибиторов, использованных для её построения. Атомы углерода ингибиторов окрашены зелёным, молекулярная форма в виде серого облака, цветные шары соответствуют фар-макофорным элементам: синий — донор водородной связи, красный — акцептор, зелёный — цикл, жёлтый — гидрофобный элемент.

Нейросетевой одноклассовый классификатор3 основан на предположении, что потенциальные ингибиторы должны быть похожи на уже известные ингибиторы. Набор нейронных сетей с тремя и четырьмя нейронами в скрытом слое был обучен таким образом, чтобы воспроизводить молекулярный отпечаток (то1еси-

3 Построение одноклассового классификатора выполнено совместно с м. н. с. кафедры органической химии Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Карповым П. В.

lar fingerprint) истинно активных соединений. Оценка подобия отпечатков производилась с помощью индекса Танимото: чем выше значение индекса Танимото между воспроизведённым молекулярным отпечатком и исходным, тем выше вероятность, что данное соединение будет ингибитором GSK-3.

В ходе докинга были использованы оценочные функции различных типов: гауссовы (Chemgauss3 и Shapegauss), эмпирические (Chemscore, OEChemscore, Screenscore, PLP), потенциал средней силы (PMF_score), функции, основанные на силовых полях (D_score, G_score). Для оценочных функций, реализованных в составе SYBYL (Chemscore, D_score, G_score, PMF_score) проводилась также оптимизация структуры комплекса с последующей повторной оценкой (Chem-scoreR, DR_score, GR_score, PMFR_score). Оценка подобия молекулы фармако-фору проводилась с помощью функции TanimotoCombo, сочетающей в себе химическое подобие и подобие молекулярной формы. В качестве нулевой гипотезы использовались случайные числа в диапазоне (0; 1).

Статистическую валидацию системы виртуального скрининга проводили с помощью методов ROC (receiver operating characteristic, техническая характеристика приёмника) и BEDROC (Boltzmann-enhanced discrimination of ROC, разделение ROC по распределению Больцмана), первый из которых позволяет определить вероятность ранжирования истинно активных соединений выше истинно либо предположительно неактивных, которая равна площади под кривой ROC, а второй — оценить степень раннего обогащения выборки, то есть долю извлечённых истинно активных соединений в части выборки, получившей оптимальные оценки. Выборки истинных и ложных ингибиторов фильтровали через каждый из классификаторов, после чего оценивали параметры обогащения. На рис. 3 приведены кривые ROC для описанных выше классификаторов. Видно, что в случае докинга наилучшее обогащение достигается с помощью оценочных функций Chemscore (площадь под кривой 0.824), ChemscoreR (0.816) и Chemgauss3 (0.800), а фармакофорное подобие (0.867) и одноклассовый классификатор (0.892) приводят к заметно большему обогащению.

0.8

а

a

о

£ | 0.6 s к Z

X X

V g04

m S R С

3

0.2

0

0 0.2 0.4 0.6 0.S 1

доля извлечённых лоямых лигандов

Рис. 3. Кривые ROC для систем виртуального скрининга.

На основе анализа кривых ROC можно определить оптимальные пороговые значения оценочных функций, приводящие к максимальной точности предсказания с помощью данного классификатора. Отношение доли извлечённых истинных ингибиторов к доле извлечённых ложных ингибиторов при оптимальном пороговом значении (tp/fp), а также значения BEDROC приведены в таблице 1. Наиболее раннее распознавание истинно активных соединений гарантируется оценочными функциями Chemgauss3 и Shapegauss при докинге, а также фармако-форной гипотезой и одноклассовым классификатором.

Таблица 1. Раннее распознавание истинных ингибиторов.

Оценочная функция tp/fp BEDROC Оценочная функция tp/fp BEDROC

Chemscore 5.421 0.662 DR_score 6.270 0.652

ChemscoreR 5.917 0.690 GR_score 6.892 0.633

Chemgauss3 7.928 : 0.757 G_score 5.378 0.572

Screenscore 5.310 0.646 PMF_score 3.696 0.445

Shapegauss 8.305 0.700 PMFR_score 4.171 0.455

OEChemscore 6.529 0.657 TanimotoCombo (фармакофор) 12.76 0.957

PLP 6.390 0.639 Tanimoto (одноклассовый) 15.12 0.894

D_score 5.870 0.610

Далее с использованием оптимальных параметров был проведён широкомасштабный виртуальный скрининг библиотеки из 1 204 522 структур, отобранных из базы данных ZINC согласно критериям подобия соединениям-лидерам (табл. 2). С целью оптимизации вычислительных затрат докинг проводился поэтапно: из результатов докинга отбирались 6 выборок по 1000 лучших соединений согласно значениям оценочных функций Chemgauss3, OEChemScore, PLP, Scre-enScore, Shapegauss, а также консенсусной оценки. Для каждой оценочной функции списки хитов были объединены, итогом чего стали 6 выборок по 170 000 соединений, для каждой из которых был проведён повторный докинг и отбор 6 выборок по 1000 лучших соединений согласно значениям тех же оценочных функций.

Таблица 2. Критерии отбора соединений для виртуального скрининга.

Параметр Минимум Максимум

Молекулярная масса 150 ! 500

Число неводородных атомов 10 30

Число циклических систем 1 4

Число доноров водородной связи 1 4

Число акцепторов водородной связи 1 6

Число вращаемых связей 0 10

Число жёстких связей 0 ; 25

Число гетероатомов 2 12

Рассчитанная липофильность -5 4

Формальный заряд -2 2

Для отобранных соединений был проведён визуальный анализ предсказанных структур комплексов, в ходе которого исключены соединения, обладающие неприемлемыми конформациями или способами связывания. Оставшиеся соединения сгруппированы по подобию. Всего с помощью докинга отобрано 2565 соединений, пригодных для дальнейшей оптимизации. Виртуальный скрининг по фармакофорной гипотезе (отобрано 5000 соединений) и одноклассовой модели (отобрано 8757 соединений) проводили путём простого фильтрования всей библиотеки с учётом оптимального порогового значения, определённого в ходе ва-

лидации. Для всех хитлистов проведено также перекрёстное фильтрование с использованием моделей, не использованных при построении хитлиста: например, для соединений, идентифицированных с помощью одноклассовой модели, проведены докинг и наложение на фармакофор. На рис. 4 показано количество соединений, преодолевших оптимальное пороговое значение более чем одним методом. Из этих соедине-наибольший интерес представляют те два соединения, которые получили высокие оценки всеми тремя использованными методами (табл. 3). Несмотря на значительное структурное сходство с некоторыми известными ингибиторами СБК-З,

Рис. 4. Число соединений, по- данные конкретные соединения не были предло-лучивших высокие оценки

различными методами. жены в качестве ингибиторов ранее.

Таблица 3. Соединения, получившие высокие оценки тремя методами. Структура ТаштоЮ Наложение на фарма- Способ связывания

кофорную гипотезу

0.417

0.409

Раздел 2.3 посвящен неконсервативному виртуальному скринингу (без статистической валидации), который осуществлялся двумя различными метода-

ми. Первый из них заключался в отборе соединений, содержащих характерный глицинамидный фрагмент [Н]1ч[([*])СС(=0)1^([Н])[*], который может образовать необходимый набор водородных связей в области шарнира ввК-З (рис. 5а-б). Поскольку никаких других структурных ограничений в данном случае не было использовано, поиск осуществлялся лишь в библиотеке соединений компании Автех (372187 соединений), а окончательная фильтрация полученного хитлиста проводилась с помощью докинга. Было идентифицировано 834 соединения, для которых можно найти приемлемый способ связывания с киназой (например, 1 и 2).

Рис. 5. Химениальдизин: а) структура молекулы (выделен глицинамидный фрагмент); б) способ связывания; в) электростатическое поле молекулы.

Второй метод неконсервативного поиска ингибиторов состоял в создании фармакофорной гипотезы на основе молекулы химениальдизина, фильтрования через неё библиотеки ZINC и последующего отбора по электростатическому подобию молекуле химениальдизина (электростатическое поле молекулы на рис. 5в). Статистическая валидация такого метода нерациональна, поскольку большинство известных ингибиторов значительно крупнее химениальдизина и не будут идентифицированы в качестве хитов. Всего при скрининге было найдено 1830 структур, из них для 831 (например, 3) были обнаружены приемлемые ориентации в области связывания АТФ GSK-3.

Раздел 2.4 посвящён анализу количественных соотношений между пространственной структурой и активностью ингибиторов СЗК-З с помощью методов сравнительного анализа молекулярных полей (СоМРА) и сравнительного анализа индексов молекулярного подобия (СоМ81А). Моделирование проводилось для пяти классов ингибиторов СБК-З: алоизинов (4), индирубинов (5), бис-арилмалеимидов (6), пауллонов (7) и /У-фенил-4-пиразоло[1,5-6]пиридазин-3-ил-пиримидин-2-аминов (ФППП, 8). Для моделирования были использованы стандартные параметры методов, за исключением схемы расчёта частичных атомных зарядов, которые варьировались с целью достижения максимальной предсказательной способности моделей: использовались методы, основанные на неэмпирическом квантовохимическом расчёте (ЯЕЗР, МК-ЕБР, схемы Лёвдина и Малли-кена), полуэмпирическом квантовохимическом расчёте (АМ1-ВСС), а также эмпирические схемы расчёта Гастайгера — Хюккеля (Г-Х), Пюльман, ММРР94, ОЕИЯ и КСМ. Статистические параметры оптимальных моделей приведены в табл. 4 и 5.

Таблица 4. Статистические параметры оптимальных моделей СоМБА.

Выборка N Заряды ч1 г2 « пх; п2

алоизины 34 ЯЕ8Р 0.483 0.897 0.205 65.111 4; 30

индирубины 84 Г-Х 0.492 0.848 0.419 40.185 10; 72

малеимиды 104 МК-Е8Р 0.661 0.933 0.314 115.577 11; 92

пауллоны 75 ММРР94 0.566 0.873 0.422 95.051 5; 69

ФППП 70 Г-Х 0.776 0.983 0.153 186.894 16; 53

Таблица 5. Статистические параметры оптимальных моделей СоМ51А.

Выборка Заряды ч1 г2 X п,; п2

алоизины 35 АМ1-ВСС 0.369 0.930 0.185 33.439 7; 28

индирубины 84 БЕЖ 0.533 0.809 0.466 38.609 8; 73

малеимиды 105 Пульман 0.644 0.857 0.446 82.998 7; 97

пауллоны 75 1Ж5Р 0.654 0.924 0.338 110.552 7; 64

ФППП 70 кем 0.740 0.971 0.200 96.101 18; 51

Рис. 6. Молекулярные поля оптимальных моделей 31) 0$АИ ингибиторов СЭК-З. а) Алоизины (КЕвР, СоМРА); б) и в) индирубины (БЕЖ, СоМвГА); г) малеи-миды (МК-ЕБР, СоМРА); д) и е) пауллоны (КЕБР, СоМ81А); ж) ФППП (Г-Х, СоМРА). Зелёным цветом окрашены поля благоприятных стерических взаимодействий, жёлтым — неблагоприятных (а, б, г, д, ж); красным цветом окрашены поля благоприятного наличия отрицательного заряда в молекуле лиганда, синим — положительного (а, б, г, д, ж); серым цветом — поля благоприятной гидрофобное™, сине-зелёным — неблагоприятной гидрофобности (в, е); пурпурным — благоприятного наличия акцептора водородной связи, оранжевым — неблагоприятного (в, е); фиолетовым цветом окрашены поля благоприятного отсутствия донора водородной связи (в, е).

Внутренняя предсказательная способность моделей, оцененная как коэффициент корреляции скользящего контроля q1, имеет приемлемые значения для всех исследованных классов соединений, за исключением алоизинов. На основе анализа построенных моделей и молекулярных полей (рис. 6) было проведено предсказание активности для новых соединений, принадлежащих данным классам. Значения предсказанной активности находятся в диапазоне от 6 до 7 единиц

pIC».

Раздел 2.5 посвящён автоматизированному дизайну ингибиторов de novo на основе пауллонового (7) и индирубинового (5) каркасов. В ходе дизайна были сконструированы структуры новых молекул, содержащие не исследованные ранее комбинации функциональных групп. В качестве примера такой молекулы можно привести пауллон 9, который содержит алифатический заместитель в положении 8.

9

В главе 3 изложены результаты поиска новых неконкурентных ингибиторов GSK-3, включая идентификацию области связывания неконкурентного ингибитора манзамина А и поиск потенциальных неконкурентных ингибиторов путём виртуального скрининга базы данных ZINC.

В разделе 3.1 кратко изложена методология исследования.

Раздел 3.2 посвящён анализу взаимодействия манзамина А (рис. 7а) с GSK-Зр. В ходе конформационного анализа структуры манзамина А была идентифицирована конформация молекулы, соответствующая глобальному минимуму энергии, а также исследовано динамическое поведение молекулы в водном растворе. Информация о структуре киназы в активированном состоянии была извлечена из банка данных РОВ (код доступа 1GNG, разрешение 2.60 А). На следующей стадии был проведён исчерпывающий поиск потенциальных областей свя-

зывания неконкурентного ингибитора на поверхности киназы методом докинга. Некоторые результаты докинга приведены на рис. 7. На основании литературных данных и визуального анализа можно выделить 5 кластеров результатов, так или иначе соотносящихся с экспериментальными данными. Кластер I расположен в области взаимодействия с аксином и ингибиторными пептидами; кластер II расположен в ключевой области распознавания субстрата между глициновой петлёй, активационной петлёй и гетлёй С; кластер III расположен рядом с петлёй С, как предсказано методом докинга в работе Ибрахима с соавт.4; кластер IV расположен в области, гомологичной области взаимодействия киназы СЬк1; кластер V расположен в области связывания АТФ. Дальнейшее исследование проводилось для репрезентативных структур из кластеров I—IV.

Рис. 7. а) Структура манзамина А; б) комплексы манзамина А и GSK-3, выбранные для моделирования МД; в) предлагаемый способ связывания манзамина А.

Методом моделирования молекулярной динамики и анализа траекторий было установлено, что наиболее вероятным механизмом неконкурентного инги-бирования киназы является нарушение взаимодействия с субстратом, к которому приводит связывание ингибитора в области II. Кроме того, при взаимодействии в области II наблюдаются конформационные изменения в структуре киназы, потенциально приводящие к ухудшению взаимодействия киназы с АТФ. Ранжирование областей связывания проводилось с использованием визуального анализа (наличие либо отсутствие критических взаимодействий и (или) конформацион-

4 Ibrahim M. А. et al. Bioorg. Med. Chem. 2008. V. 16. P. 6702-6706.

a

ных изменений), оценки энергии связывания методом ММ-РВБА, анализа корреляционных матриц, а также сопоставления конформации лиганда в комплексе с конформацией лиганда в свободном состоянии.

В разделе 3.3 описан поиск новых потенциальных неконкурентных ингибиторов методом виртуального скрининга на основе одной из типичных структур комплекса, полученных при анализе траектории для области II (рис. 7в). Для результатов скрининга проведены фильтрация по подобию и визуальный анализ; исключены соединения, идентичные идентифицированным при поиске конкурентных ингибиторов, а также соединения, обладающие в комплексе неприемлемыми конформациями или способами связывания. Сформирована фокусированная библиотека потенциальных неконкурентных ингибиторов киназы гликоген-синтазы 3. Пример соединения, у которого значения всех оценочных функций предпочтительны для связывания в неконкурентной области, приведён на рис. 8. Соединение образует водородные связи с карбонильным атомом кислорода Ьеи88, амидным ИН2 Абп95 и СН-тс-взаимодействия с РЬе67. Метилциклогек-сильный фрагмент данного соединения может быть заменён на адамантильный, что приводит к увеличению предсказанной аффинности.

а ?, 6

с^-ло

Л—ин ;

о н3с

Рис. 8. Один из предлагаемых потенциальных неконкурентных ингибиторов: а) структура; б) способ связывания.

В главе 4 обсуждается возможность создания противопаразитических лекарств на основе ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3 различных паразитов. Раздел 4.1 посвящён биоинформационному анализу различных гомологов

GSK-3. Путём анализа базы данных PubMed Protein выявлены организмы, вызывающие заболевания человека либо животных и имеющие в своём геноме белки, аннотированные как GSK-3 (табл. 6). Исследованы киназы организмов, относящихся к группам насекомых, нематод, трематод, грибков и простейших. Все исследованные каталитические домены имеют высокую идентичность с человеческой киназой (не менее 44%), что позволяет использовать её в качестве шаблона для моделирования структуры данных доменов. Важнейшие функциональные элементы киназы (сайт взаимодействия с фосфатной группой субстрата, остаток Туг216 и взаимодействующие с ним остатки аргинина) также высоко консервативны во всех исследованных киназах.

Таблица 6. Подобие аминокислотных последовательностей каталитичес-

ких доменов GSK-3 человека и паразитов.

Код доступа Название киназы Организм Длина последовательности Идентичность HsGSK-3ß Подобие HsGSK-3f

Р49840.2 HsGSK-3a Homo sapiens 285 89% 95%

Q6FI27 HsGSK-3ß^ Homo sapiens 292 100% 100%

АВ061882.1 RmGSK-3 Rhipicephalus microplus 285 84% 93%

QIHRP9 AaGSK-3 Aedes aegypti 285 83% 93%

AAN09082.1 SHAGGY Drosophila melanogaster 285 83% 93%

ХР_001897721.1 BmGSK-3 Brugia malayi 277 66% 75%

ХР_002572305.1 SmGSK-3 Schistosoma mansoni 285 77% 88%

EEQ85886.1 AdGSK-3 J Ajellomyces dermatitidis 284 72% 84%

ЕЕН21342.1 PbrGSK-3 Paracoccidioides brasiliensis 284 71% 83%

QOCKX1 AtGSK-3 Aspergillus terreus 268 68% 77%

AFUAJ)G05120 AfGSK-3 [ Aspergillus fumigatus Af293 284 72% 83%

CHGG_07166 CgGSK-3 Chaetomium globosum CBS 148.51 284 71% 81%

CNB00720 CnGSK-3 Cryptococcus neoformans 332 66% 75%

XP_002418374.1 CdGSK-3 Candida dubliniensis 283 59% 79%

CIMG_02613 CiGSK-3 Coccidioides immitis RS 284 71% 83%

077344 i PfGSK-3 Plasmodium falciparum 3D7 287 56% 75%

Q4Z6R7 PbGSK-3 Plasmodium berghei 287 55% 73%

CAM67080.1 LiGSK-3 Leishmania infantum 330 44% 63%

3E3P_B LmGSK-3 Leishmania major 330 44% 63%

ABRI8737.1 LdGSK-3 Leishmania donovani 330 44% 63%

Q0PKV3 LmxGSK-3 Leishmania mexieana 330 44% 63%

XP_001563953.1 LbGSK-3 Leishmania braziliensis 327 45% 63%

P49841 TbGSK-3 Trypanosoma brucei 327 47% 64%

AF042826 TPK3 Toxoplasma gondii 298 54% 73%

В разделе 4.2 обсуждается моделирование структуры киназ паразитов и критерии возможной селективности их ингибиторов по отношению к HsGSK-3. При поиске селективных конкурентных ингибиторов киназ наиболее важны структурные различия в области связывания АТФ. Идентификация таких различий позволяет проводить рациональную модификацию известных ингибиторов для достижения селективности. На рис. 9 приводится анализ консервативности аминокислотных остатков области связывания АТФ GSK-3 различных организмов. Наиболее просто создание селективных лигандов для Chaetomium globosum, Candida dubliniensis, а также лейшманий и других простейших, имеющих наиболее специфические замены по сравнению с GSK-3 человека (рис. 96).

HsGSK-ЗЪ MmGSK-ЗЬ RnGSK-ЗЬ SsGSK-ЗЬ HsGSK-3a MmGSK-3a RllGSK-3a RmGSK-3

D200

PbrGSK-3

TPK3

N186

Variable

Conserved,

Рис. 9. Консервативность аминокислотных остатков АТФ-связывакнцей области С8К-3. а) Остатки окрашены в соответствии с консервативностью генной последовательности; Ь) Выравнивание вариабельных остатков, окрашенное в соответствии с физико-химическими свойствами боковых цепей.

Выявленные различия позволяют объяснить немногочисленные доступные сведения о профиле селективности различных лигандов. Ранее было установлено, что пауллоны менее эффективны в качестве ингибиторов 'ГЬСЯК-З, ЬсЮБК-З

и PfGSK-3 — от 10 до 30 раз по сравнению с ингибированием HsGSK-3p. Объяснением данного факта может служить наличие в позиции 132 более подвижного и объёмистого остатка метионина вместо лейцина, характерного для ки-наз млекопитающих.

GSK-3 грибков отличаются относительным разнообразием и наличием специфических замен. В частности, в позиции 132 CgGSK-3 находится остаток глу-тамина, позволяющий создать селективные ингибиторы, вступающие с ним в водородную связь. Остаток аланина в позиции 110 CdGSK-3 открывает доступ более объёмистым молекулам, чем ингибиторы HsGSK-3.

В случае паразитов, относящихся к типам споровиков и трипаносоматид, возможность создания селективных ингибиторов становится ещё более очевидной. В частности, имеются специфические замены в позиции 132 (Leu—»Met), 62 (Не—>Ala), 186 (Gin—»His) и т.д., которые могут быть использованы для дизайна селективных ингибиторов.

В разделе 4.3 описывается дизайн селективных ингибиторов CdGSK-3, CgGSK-3 и LmGSK-З на основе моделей структуры (табл. 7). Ключевой идеей дизайна было использование спироциклических соеднений, представляющих собой новый хемотип ингибиторов киназ. Достоинством данного класса соединений является возможность введения дополнительных алифатических заместителей, расположенных в областях АТФ-связывающего кармана над либо под плоскостью взаимодействующего с шарниром элемента, которые имеются у отдельных исследованных киназ. Подавляющее большинство ингибиторов киназ, известных к настоящему времени, представляют собой плоские либо уплощённые структуры, вследствие чего наличие специфичных полостей над либо под плоскостью ингибитора не может быть использовано для создания селективных молекул.

СсЮЭК-З

ЬтС8К-3

н,с

Также мы провели виртуальный скрининг библиотеки противомалярийных соединений ТСАМБ с целью идентификации в ней потенциальных ингибиторов PfGSK-3, поскольку для большинства соединений данной библиотеки отсутствует информация об их молекулярных мишенях. Примеры некоторых вероятных ингибиторов PfGSK-3, идентифицированных нами, приведены ниже.

Таблица 7. Предлагаемые ингибиторы киназ паразитов. Мишень Структура Способ связывания

CgGSK-3

В главе 5 перечислены программные вычислительные средства, использованные в настоящей работе. Докинг соединений проводился с помощью Auto-Dock4.01, высокопроизводительный докинг — с помощью FRED 2.2.5. Подготовку баз данных осуществляли с помощью InstantJChem 5.3 (стандартизация), FILTER (фильтрование), Omega2 (генерация конформеров), QuacPac (расчёт частичных атомных зарядов). Фармакофорный поиск проводили с помощью ROCS 3.0. Анализ ROC проводили с помощью сервера StAR, BEDROC рассчитывали с помощью программы, предоставленной разработчиками метода. Визуальный анализ результатов докинга проводили с помощью программы VIDA 4.0. Анализ 3D-QSAR и подготовку белковых структур осуществляли в SYBYL 8.0, частичные атомные заряды для 3D-QSAR рассчитывали с помощью SYBYL (схемы Гастайгера—Хюккеля, MMFF94, Пюльман), AnteChamber (АМ1-ВСС), resp (RESP, MK-ESP), PC-GAMESS/Firefly (схемы Малликена и Лёвдина). Программы, разработанные в нашей научной группе, применялись для расчёта зарядов КСМ и DENR, а также при построении одноклассовой модели. Моделирование молекулярной динамики, конформационный поиск и анализ траекторий проводили в AMBER 10 с использованием суперкомпьютера СКИФ МГУ «Чебышёв». Визуальный анализ траекторий проводили в программном комплексе VMD. Выравнивание аминокислотных последовательностей строили с помощью ClustalX2, моделирование структуры — Modeller 9v7, анализ консервативности — ConSurf 3.0.0.

выводы

1. Разработана система консервативного виртуального скрининга, нацеленная на поиск конкурентных по отношению к АТФ ингибиторов киназы гликоген-синтазы 3 (GSK-3) человека и основанная на трёх взаимодополняющих методах: молекулярном докинге, фармакофорном поиске и одноклассовой классификации. Надёжность системы подтверждена статистическими методами. С использованием системы предложены структуры новых потенциальных ингибиторов GSK-3.

2. С помощью неконсервативного виртуального скрининга, основанного на наличии подструктуры и электростатическом подобии, предложены структуры потенциальных ингибиторов GSK-3, принадлежащие к не исследованным ранее структурным классам.

3. Впервые построены модели количественных соотношений «пространственная структура — активность» для конкурентных ингибиторов GSK-3 человека методами CoMFA и CoMSIA с использованием новых схем расчёта частичных атомных зарядов КСМ и DENR, приводящих к моделям с более высокой предсказательной способностью.

4. На основе систематического анализа механизма взаимодействия манза-мина А с GSK-3 установлено наиболее вероятное место связывания неконкурентных ингибиторов. Впервые идентифицированы потенциальные неконкурентные ингибиторы GSK-3 путём виртуального скрининга библиотеки коммерчески доступных соединений ZINC, включающей 13 млн структур.

5. Впервые построены модели структуры GSK-3 паразитических организмов, вызывающих социально значимые заболевания. Сформулированы рекомендации по поиску потенциальных антипаразитарных лекарств, действующих на эти киназы; на основе молекулярного дизайна впервые предложены потенциальные ингибиторы GSK-3 Candida dubliniensis, Chaetomium globosum и Leishmania major. Для ряда соединений из библиотеки TCAMS, обладающих общей противомалярийной активностью, предложен потенциальный механизм действия — ингибирование GSK-3 малярийного плазмодия.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Осолодкин Д.И., Шульга Д.А., Царева Д.А., Олиференко А.А., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Выбор атомных зарядов при моделировании количественных соотношений пространственная структура — активность на примере пауллонов — ингибиторов киназы гликогенсинтазы Зр. // Доклады Академии Наук. 2010. Т. 434. №5. С. 692-696.

2. Осолодкин Д.И., Шульга Д.А., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Моделирование методом молекулярной динамики взаимодействия манзамина А и киназы гликогенсинтазы 3|3. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2010. №10. С. 1932-1943.

3. Palyulin V.A., Osolodkin D.I., Zefirov N.S. Virtual Screening Workflow for Glycogen Synthase Kinase 3p Inhibitors. // Drugs of the Future. 2010. V. 35 (Suppl. A). P. 176.

4. Osolodkin D.I. Molecular design of new selective and non-selective inhibitors of glycogen synthase kinase 3. // Proceedings of PhD Students Poster Session at European School of Medicinal Chemistry (XXVIII edition). Urbino. 2008. P. 85-86.

5. Осолодкин Д.И., Шульга Д.А., Палюлин B.A., Зефиров Н.С. Исследование взаимодействия манзамина А с киназой гликогенсинтазы 3. И Материалы XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. 2009. С. 553.

6. Осолодкин Д.И. Исследование взаимодействия манзамина А с киназой гликогенсинтазы 3 методом молекулярной динамики. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва. 2009.

7. Палюлин В.А., Осолодкин Д.И., Зефиров Н.С. Виртуальный скрининг ингибиторов киназы гликогенсинтазы Зр: подходы, основанные на структурах лигандов и биомишени. // 2-й Международный Конгресс по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010». Сборник тезисов. Москва. 2010. С. 141-143.

8. Царева Д.А., Осолодкин Д.И., Шульга Д.А., Олиференко А.А., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Роль частичных атомных зарядов в моделировании 3D QSAR. // Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. 2009. С. 740.

9. Tsareva D.A., Osolodkin D.I., Shulga D.A., Oliferenko A.A., Palyulin V.A., Zefirov N.S. Validation of Two Novel Schemes of Partial Atomic Charges Calculation in 3D QSAR. // 18'h European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships. Abstract Book. Rhodes, 2010, P. 155.

10. Palyulin V.A., Osolodkin D.I., Zefirov N.S. Virtual Screening Workflow for Glycogen Synthase Kinase 3p Inhibitors: Convergence of Ligand-based and Structure-based Approaches. // 6lh German Conference on Chemoinformatics. Abstract Book. Goslar. 2010. P. 73.

Заказ № 184-а-01/02/2011 Подписано в печать 01.02.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 'V), www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@с/г.ги

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Роль киназы гликогенсинтазы 3 в организме человека.

1.2. Гомологи киназы гликогенсинтазы 3.

1.3. Структура и регуляция киназы гликогенсинтазы 3.

1.4. Ингибиторы киназы гликогенсинтазы 3.

1.4.1. Конкурентные ингибиторы киназы гликогенсинтазы 3.

1.4.2. Неконкурентные ингибиторы киназы гликогенсинтазы 3.

1.5. Соотношения «структура-активность» для ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3.

1.6. Поиск ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3 с помощью виртуального скрининга.

Глава 2. Поиск и дизайн конкурентных ингибиторов GSK-3.

2.1. Выборка ингибиторов GSK-3. Представление ингибиторной активности.

2.2. Консервативный виртуальный скрининг.

2.2.1. Система консервативного виртуального скрининга.

2.2.2. Построение системы виртуального скрининга.

2.2.2.1. Выборки.

2.2.2.2. Выбор структуры киназы для докинга.

2.2.2.3. Фармакофорный поиск.

2.2.2.4. Моделирование с помощью одноклассового классификатора.

2.2.3. Валидация системы виртуального скрининга.

2.2.3.1. Докинг: воспроизведение кристаллической структуры.

2.2.3.2. Статистическая валидация систем виртуального скрининга.

2.2.4. Виртуальный скрининг библиотеки ZINC.

2.2.4.1. Библиотека соединений.

2.2.4.2. Виртуальный скрининг методом докинга.

2.2.4.3. Виртуальный скрининг по фармакофорной гипотезе.

2.2.4.4. Виртуальный скрининг методом одноклассовой классификации.

2.2.4.5. Перекрёстный виртуальный скрининг.

2.3. Неконсервативный виртуальный скрининг.

2.3.1. Поиск по наличию подструктуры.

2.3.2. Фармакофорный поиск по электростатическому подобию.

2.4. Количественные соотношения «пространственная структура — активность» для конкурентных ингибиторов GSK-3.

2.4.1. Моделирование 3D-QSAR для серии алоизинов.

2.4.2. Моделирование 3D-QSAR для серии индирубинов.

2.4.3. Моделирование 3D-QSAR для серии малеимидов.

2.4.4. Моделирование 3D-QSAR для серии пауллонов.

2.4.5. Моделирование 3D-QSAR для серии 1М-фенил-4-пиразоло[1,5-Ь]пиридазин-3-илпиримидин-2-аминов.

2.4.6. Прогноз активности на основе моделей 3D-QSAR.

2.5. Дизайн ингибиторов GSK-3 de novo.

Глава 3. Неконкурентные ингибиторы: анализ места связывания и виртуальный скрининг.

3.1. Методология исследования.

3.2. Результаты моделирования.

3.2.1. Поиск области связывания манзамина А на поверхности киназы.

3.2.2. Конформационный анализ молекулы манзамина А.

3.2.2.1. Конформационный анализ молекулы манзамина А.

3.2.2.2. Конформационное поведение лиганда в комплексах.

3.2.2.3. Поведение лиганда в водном растворе.

3.2.3. Моделирование молекулярной динамики комплексов.

3.2.3.1. Траектория молекулярной динамики апо-формы киназы.

3.2.3.2. Траектория молекулярной динамики для области 1.

3.2.3.3. Траектория молекулярной динамики для области П.

3.2.3.4. Траектория молекулярной динамики для области Ш.

3.2.3.5. Траектория молекулярной динамики для области IV.

3.2.4. Анализ корреляционных карт.

3.2.5. Оценка энергии связывания.

3.2.6. Ранжирование областей связывания.

3.3. Виртуальный скрининг и дизайн неконкурентных ингибиторов.

Глава 4. Киназа гликогенсинтазы 3 у паразитических организмов как мишень потенциальных антипаразитарных препаратов.

4.1. Анализ аминокислотных последовательностей GSK-3.

4.2. Моделирование пространственной структуры GSK-3 паразитов.

4.3. Виртуальный скрининг и дизайн ингибиторов GSK-3 паразитов.

4.3.1. Дизайн ингибиторов GSK-3 паразитов.

4.3.1.1. Дизайн ингибитора GSK-3 Leishmania major.

4.3.1.2. Дизайн ингибитора GSK-3 Chaetomium globosum.

4.3.1.3. Дизайн ингибитора GSK-3 Candida dubliniensis.

4.3.2. Поиск потенциальных ингибиторов PfGSK-3 в библиотеке TCAMS.

Глава 5. Методы исследования.

5.1. Методы исследования количественных соотношений «пространственная структура — активность».

5.2. Виртуальный скрининг.

5.2.1. Подготовка библиотек соединений.

5.2.2. Подготовка к докингу и генерация предполагаемых структур комплексов ингибиторов и киназы.

5.2.3. Валидация системы виртуального скрининга.

5.2.4. Докинг библиотеки ZINC.

5.2.5. Фармакофорный поиск.

5.2.6. Одноклассовая классификация.

5.2.7. Виртуальный скрининг по наличию подструктуры.

5.2.8. Виртуальный скрининг по электростатическому подобию.

5.3. Дизайн ингибиторов de novo.

5.4. Анализ механизма неконкурентного ингибирования манзаминами.

5.4.1. Молекулярный докинг.

5.4.2. Анализ результатов докинга.

5.4.3. Моделирование молекулярной динамики.

5.4.4. Конформационный поиск.

5.4.5. Анализ результатов молекулярной динамики и конформационного поиска.

5.4.6. Методология MM-PBSA.

5.5. Биоинформационный анализ.

5.5.1. Филогенетический анализ.

5.5.2. Построение моделей структуры киназы.

Выводы.

Одним из важнейших направлений современной химической науки является создание новых органических соединений, применимых в качестве лекарственных средств. Основной способ создания таких соединений заключается в идентификации интересующей исследователя биологической мишени или группы мишеней, после чего проводится поиск модуляторов этой мишени методами теоретической и экспериментальной медицинской химии.

Фосфорилирование белков — важнейший регуляторный механизм, использующийся в подавляющем большинстве клеточных сигнальных путей. Многие белки способны выполнять свою функцию лишь в определённом состоянии фосфорилирова-ния, и нарушение этого механизма регуляции может приводить к различным патологиям. Протеинкиназы — семейство ферментов, осуществляющих реакцию фосфори-лирования белковых субстратов, то есть перенос фосфатной группы от молекулы аде-нозинтрифосфата (АТФ) к молекуле белка. При этом образуется сложноэфирная связь, между фосфатной группой и боковой цепью аминокислотного остатка серина, треонина или тирозина. Тирозиновые киназы представляют собой отдельное подсемейство, а остальные киназы способны фосфорилировать как остатки серина, так и остатки треонина.

Дизайн ингибиторов протеинкиназ — бурно развивающаяся область современной медицинской химии. Толчком к развитию этого направления послужило внедрение в медицинскую практику иматиниба — ингибитора тирозиновой киназы ВСЯ-АВЬ, ключевого фактора формирования хронического миелогенного лейкоза, которое произошло в США в 2001 году. Ингибирование протеинкиназ является наиболее эффективным способом их низкомолекулярной регуляции, поскольку активация киназы обычно осуществляется путём фосфорилирования или дефосфорилирования. Наиболее распространены ингибиторы киназ, конкурентные по отношению к АТФ, поскольку их дизайн наиболее прост и эффективен. Конструирование новых ингибиторов киназ стало одним из основных направлений развития медицинской химии первого десятилетия XXI века, поскольку в геноме человека имеется более 500 генов различных протеинкиназ, обладающих относительно высокой степенью консервативности. Как следствие, аналогичная методология может быть использована для создания лекарств, действующих на практически любой интересующий исследователя сигнальный путь.

Биологические мишени семейства протеинкиназ отличаются значительным функциональным разнообразием. Некоторые ферменты этого семейства отличаются высокой субстратной специфичностью, в то время как остальные представители могут участвовать в различных сигнальных путях и, как следствие, быть интересными мишенями при терапии различных заболеваний. Интерес для медицинской химии представляют оба варианта, поскольку в первом случае возможно создание чрезвычайно селективных лекарств, практически не обладающих побочным действием, а во втором случае нарушение одной из функций фермента может быть мало связано с другими его функциями. Как следствие, становится возможным создание универсальных лекарственных веществ, действующих на мишени, отвечающие различным заболеваниям, либо средств, действующих лишь в определённой области организма, связанной с конкретной патологией. Различные способы направленной доставки универсальных лекарств также могут быть использованы для борьбы с конкретными патологиями, опосредованными многофункциональными мишенями.

К числу важных многофункциональных биологических мишеней семейства протеинкиназ относится киназа гликогенсинтазы 3 (С8К-3). Она участвует во множестве сигнальных путей, опосредующих целый ряд расстройств: болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, диабет II типа, рак простаты, недифференцированный лейкоз, биполярные расстройства, униполярную депрессию, воспалительные процессы, гипертрофию сердца и др. Аналогичные киназы паразитов могут быть мишенями при борьбе с малярией, трипаносомозом и другими протозойными инфекциями.

В настоящее время единственным ингибитором ОБК-З, разрешённым к применению в медицинской практике, является ион лития, однако его терапевтический индекс невысок; несколько других ингибиторов в настоящее время проходят клинические испытания. Несомненно актуальной проблемой остаётся молекулярный дизайн новых низкомолекулярных ингибиторов как человеческой ОБК-З, так и аналогичных киназ паразитических организмов. Наличие таких малых молекул позволит создать высокоэффективные инновационные лекарственные средства.

Целью настоящей работы являлись дизайн и компьютерный поиск молекул, способных ингибировать С8К-3. В диссертационной работе рассмотрено как конкурентное, так и неконкурентное ингибирование и предложены молекулы, способные действовать по каждому из этих механизмов. Для конкурентных ингибиторов создана система виртуального скрининга, основанная на структурах фермента и известных ингибиторов и позволяющая получать статистически достоверные результаты. На основе обширных серий ингибиторов построены модели количественных соотношений «пространственная структура — активность» (ЗВ-С)8АК), позволяющие предсказывать величину ингибиторной активности для их новых аналогов. Вероятный механизм неконкурентного ингибирования был установлен путём моделирования молекулярной динамики комплекса фермента и неконкурентного ингибитора. Кроме того, был проведён биоинформационный анализ аминокислотных последовательностей 08К-3 различных паразитических организмов, построены модели пространственной структуры этих белковых молекул и осуществлён дизайн ингибиторов для тех из них, которые имеют наиболее специфичные аминокислотные замены.

Выводы

1. Разработана система консервативного виртуального скрининга, нацеленная на поиск конкурентных по отношению к АТФ ингибиторов киназы гликогенсинта-зы 3 (GSK-3) человека и основанная на трёх взаимодополняющих методах: молекулярном докинге, фармакофорном поиске и одноклассовой классификации. Надёжность системы подтверждена статистическими методами. С использованием системы предложены структуры новых потенциальных ингибиторов GSK-3.

2. С помощью неконсервативного виртуального скрининга, основанного на наличии подструктуры и электростатическом подобии, предложены структуры потенциальных ингибиторов GSK-3, принадлежащие к не исследованным ранее структурным классам.

3. Впервые построены модели количественных соотношений «пространственная структура — активность» для конкурентных ингибиторов GSK-3 человека методами CoMFA и CoMSIA с использованием новых схем расчёта частичных атомных зарядов КСМ и DENR, приводящих к моделям с более высокой предсказательной способностью.

4. На основе систематического анализа механизма взаимодействия манзами-на А с GSK-3 установлено наиболее вероятное место связывания неконкурентных ингибиторов. Впервые идентифицированы потенциальные неконкурентные ингибиторы GSK-3 путём виртуального скрининга библиотеки коммерчески доступных соединений ZINC, включающей 13 млн структур.

5. Впервые построены модели структуры GSK-3 паразитических организмов, вызывающих социально значимые заболевания. Сформулированы рекомендации по поиску потенциальных антипаразитарных лекарств, действующих на эти киназы; на основе молекулярного дизайна впервые предложены потенциальные ингибиторы GSK-3 Candida dubliniensis, Chaetomium globosum и Leishmania major. Для ряда соединений из библиотеки TCAMS, обладающих общей противомалярийной активностью, предложен потенциальный механизм действия — ингибирование GSK-3 малярийного плазмодия.

1. Embi N., Rylatt D. В., Cohen P. Glycogen synthase kinase-3 from rabbit skeletal muscle. Separation from cyclic-AMP-dependent protein kinase and phosphorylase kinase. //Eur. J. Biochem. 1980. V. 107. P. 519-527.

2. Mazanetz M. P., Fischer P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. //Nat. Rev. Drug Disc. 2007. V. 6. P. 464-479.

3. Phiel C. J., Wilson C. A., Lee V. M.-Y., Klein P. S. GSK-3a regulates production of Alzheimer's disease amyloid-p peptides. //Nature. 2003. V. 423. P. 435-439.

4. Van Noort M., Meeldijk J., van der Zee R., Destree O., Clevers H. Wnt Signaling Controls the Phosphorylation Status of (3-Catenin. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 17901-17905.

5. Doble B. W., Woodgett J. R. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. // J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 1175-1186.

6. Woodgett J. R. Molecular cloning and expression of glycogen synthase kinase-3/Factor A. //EMBO J. 1990. V. 9. P. 2431-2438.

7. Lau K.-F., Miller С. C. J., Anderton В. H., Shaw P.-C. Expression analysis of glycogen synthase kinase-3 in human tissues. // J. Peptide Res. 1999. V. 54. P. 85-91.

8. Wood-Kaczmar A., Kraus M., Ishiguro K., Philpott K. L., Gordon-Weeks P. R. An alternatively spliced form of glycogen synthase kinase-3 P is targeted to growing neurites and growth cones. // Mol. Cell. Neurosci. 2009. V. 42. P. 184-194.

9. Patel S., Woodgett J. Glycogen Synthase Kinase-3 and Cancer: Good Cop, Bad Cop? // Cancer Cell. 2008. V. 14. P. 351-353.

10. Rayasam G. V., Tulasi V. K., Sodhi R., Davis J. A., Ray A. Glycogen synthase kinase 3: more than a namesake. // Br. J. Pharm. 2009. V. 156. P. 885-898.

11. Cross D. A. E., Alessi D. R., Cohen P., Andjelkovich M., Hemmings B. A. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. // Nature. 1995. V. 378. P. 785-789.

12. Henriksen E. J., Dokken В. B. Role of Glycogen Synthase Kinase-3 in Insulin Resistance and Type 2 Diabetes. // Current Drug Targets. 2006. V. 7. P. 1435-1441.

13. Wagman A. S., Johnson K. W., Bussiere D. E. Discovery and Development of GSK3 Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes. // Curr. Pharm. Des. 2004. V. 10. P.1105-1137.

14. Frame S., Zheleva D. Targeting glycogen synthase kinase-3 in insulin signalling. // Expert Opin. Ther. Targets. 2006. V. 10. P. 429-444.

15. Eldar-Finkelman H. Glycogen synthase kinase 3: an emerging therapeutic target. // TRENDS in Molecular Medicine. 2002. V. 8. P. 126-132.

16. Jope R. S., Yuskaitis C. J., Beurel E. Glycogen Synthase Kinase-3 (GSK3): Inflammation, Diseases, and Therapeutics. // Neurochem. Res. 2007. V. 32. P. 577595.

17. Ougolkov A. V., Billadeau D. D. Targeting GSK-3: a promising approach for cancer therapy? // Future Oncol. 2006. V. 2. P. 91-100.

18. Martinez A. Preclinical Efficacy on GSK-3 InhibitorsrTowards a Future Generation of Powerful Drugs. // Med. Res. Rev. 2008. V. 28. P. 773-796.

19. Peineau S., Bradley C.5 Taghibiglou C., Doherty A., Bortolotto Z. A., Wang Y. T., Collingridge G. L., The role of GSK-3 in synaptic plasticity. // Br. J. Pharm. 2008. V. 153. P. S428-S437.

20. Giese K. P. GSK-3: A Key Player in Neurodegeneration and Memory. // IUBMB Life. 2009. V. 61. P. 516-521.

21. Hooper C., Killick R., Lovestone S. The GSK3 hypothesis of Alzheimer's disease. // J. Neurochem. 2008. V. 104. P. 1433-1439.

22. Huang H.-C., Klein, P. S. Multiple Roles for Glycogen Synthase Kinase-3 as a Drug Target in Alzheimer's Disease. // Current Drug Targets. 2006. V. 7. P. 1389-1397.

23. Blankesteijn W. M., van de Schans V. A. M., ter Horst P., Smits J. F. M. The Wnt/frizzled/GSK-3ß pathway: a novel therapeutic target for cardiac hypertrophy. // Trends Pharm. Sei. 2008. V. 29. P. 175-180.

24. Rowe M. K., Wiest C., Chuang D.M. GSK-3 is a viable potential target for therapeutic intervention in bipolar disorder. //Neurosci. Biobehav. Rev. 2007. V. 31. P. 920-931.

25. Woodgett J. R. Glycogen Synthase Kinase 3: An Introductory Synopsis. // Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK-3) And Its Inhibitors. Eds.: Martinez A., Castro A., Medina M. Wiley-VCH. Hoboken, NJ, USA. 2006. P. 3-23.

26. Kassir Y., Rubin-Bejerano I., Mandel-Gutfreund Y. The Saccharomyces cerevisiae GSK-3ß homologs. // Current Drug Targets. 2006. V. 7. P. 1455-1465.

27. Qin C., Tang J., Kim K. Cloning and in vitro expression of TPK3, a Toxoplasma gondii homologue of shaggy/glycogen synthase kinase-3 kinases. // Mol. Biochem. Parasitol. 1998. V. 93. P. 278-283.

28. Kruggel A., Lemcke T. Comparative investigation of the ATP-binding site of human and plasmodial glycogen synthase kinase-3. // QSAR Comb. Sci. 2009. V. 28. P. 885890.

29. Kruggel A., Lemcke T. Generation and evaluation of a homology model of i^GSK-3. // Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2009. V. 342. P. 327-332.

30. Xiao J.-F., Li Z.-S., Sun M., Zhang Y., Sun C.-C. Homology modeling and molecular dynamics study of GSK3/SHAGGY-like kinase. // Comp. Biol. Chem. 2004. V. 28. P. 179-188.

31. Berman H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T. N., Weissig H., Shindyalov I. N., Bourne P. E., The Protein Data Bank. // Nucleic Acids Research. 2000. V. 28. P. 235-242.

32. Biochem. Parasitai. 2011. In Press. DOI: 10.1016/j.molbiopara.2010.12.009.

33. Dajani R., Fraser E., Roe S. M., Yeo M., Good V. M., Thompson V., Dale T. C., Pearl L. H., Structural basis for recruitment of glycogen synthase kinase 3p to the axin-APC scaffold complex. // EMBO J. 2003. V. 22. P. 494-501.

34. Dajani R., Fraser E., Roe S. M., Young N., Good V. M., Dale T. C., Pearl L. H., Crystal Structure of Glycogen Synthase Kinase 3p: Structural Basis for Phosphate-Primed Substrate Specificity and Autoinhibition. // Cell. 2001. V. 105. P. 721-732.

35. Haar T. E., Coll J.T., Austen D.A. Structure of GSK3beta Reveals a Primed Phosphorylation Mechanism. //Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 593-596.

36. Gong L., Hirschfeld D„ Tan Y.-C., Hogg J. H., Peltz G., Avnur Z., Dunten P. Discovery of potent and bioavailable GSK-3P inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010. V. 20. P. 1693-1696.

37. Atilla-Gokcumen G. E., Pagano N., Streu C., Maksimoska J., Filippakopoulos P., Knapp S., Meggers E. Extremely Tight Binding of a Ruthenium Complex to Glycogen Synthase Kinase 3. // ChemBioChem. 2008. V. 9. P. 2933-2936.

38. Zhang H.-C., Bonaga L. V. R., Ye H., Derian C. K., Damiano B. P., Maryanoff B. E. Novel bis(indolyl)maleimide pyridinophanes that are potent, selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. V. 17. P. 2863-2868.

39. Extracellular Signal-Regulated Kinase (ERK) Using Conformational Control. // J. Med. Chem. 2009. V. 52. P. 6362-6368.

40. Arnost M., Pierce A., ter Haar E., Lauffer D., Madden J., Tanner K., Green J. 3-AryI-4-(arylhydrazono)-lH-pyrazol-5-ones: Highly ligand efficient and potent inhibitors of GSK3p. //Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010. V. 20. P. 1661-1664.

41. Cho J.-H., Johnson G. V. W. Glycogen Synthase Kinase 3p Phosphorylates Tau at Both Primed and Unprimed Sites: Ddifferential Impact on Microtubule Binding. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 187-193.

42. Frame S., Cohen P. GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery. // Biochem. J. 2001. V. 359. P. 1-16.

43. Ilouz R., Pietrokovski S., Eisenstein M., Eldar-Finkelman H. New Insights into the Autoinhibition Mechanism of Glycogen Synthase Kinase-3|3. // J. Mol. Biol. 2008. V. 383. P. 999-1007.

44. Cole A., Frame S., Cohen P. Further evidence that the tyrosine phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 (GSK3) in mammalian cells is an autophosphorylation event. // Biochem. J. 2004. V. 377. P. 249-255.

45. Kaku S., Chaki S., Muramatsu M. GSK-3 Inhibitors: Recent Developments and Therapeutic Potential. // Current Signal Transduction Therapy. 2008. V. 3. P. 195-205.

46. Obligado S. H., Ibraghimov-Beskrovnaya O., Zuk A., Meijer L., Nelson P. J. CDK/GSK-3 inhibitors as therapeutic agents for parenchymal renal diseases. // Kidney1.t. 2008. V. 73. P. 684-690.

47. Wang Z., Smith K. S., Murphy M., Piloto O., Somervaille T. C. P., Cleaiy M. L. Glycogen synthase kinase 3 in MLL leukaemia maintenance and targeted therapy // Nature. 2008. V. 455. P. 1205-1209.

48. Stambolic V., Ruel L., Woodgett J. R. Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 activity and mimics wingless signalling in intact cells. // Curr. Biol. 1996. V. 6. P. 1664-1668.

49. Ryves W. J., Harwood, A. J. Lithium Inhibits Glycogen Synthase Kinase-3 by Competition for Magnesium. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2001. V. 280. P. 720725.

50. Medina M., Castro A. Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) inhibitors reach the clinic. // Current Opinion in Drug Discovery & Development. 2008. V. 11. P. 533-543.

51. Dokken B. B., Henriksen E. J. Chronic selective glycogen synthase kinase-3 inhibition enhances glucose disposal and muscle insulin action in prediabetic obese Zucker rats. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2006. V. 291. P. E207-E213.

52. Trowbridge J. J., Xenocostas A., Moon R. T., Bhatia M. Glycogen synthase kinase-3 is an in vivo regulator of hematopoietic stem cell repopulation. //Nat. Med. 2006. V. 12. P. 89-98.

53. Kaidanovich-Beilin O., Eldar-Finkelman H. Long-term treatment with novel glycogen synthase kinase-3 inhibitor improves glucose homeostasis in ob/ob mice: Molecular characterization in liver and muscle. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2006. V. 316. P. 1724.

54. Gross E. R., Hsu A. K., Gross G. J. Diabetes abolishes morphine-induced cardioprotection via multiple pathways upstream of glycogen synthase kinase 3p. // Diabetes. 2007. V. 56. P. 127-136.

55. Eldar-Finkelman H., Eisenstein M. Peptide inhibitors targeting protein kinases. // Curr. Pharm. Des. 2009. V. 15. P. 2463-2470.

56. Davis P. D., Hill C. H., Lawton G., Nixon J. S., Wilkinson S. E., Hurst S. A., Keech E., Turner S.E. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-bisarylmaleimides. // J. Med. Chem. 1992. V. 35. P. 177-184.

57. Hers I., Tavare J. M., Denton R. M. The Protein Kinase C Inhibitors Bisindolylmale-imide I (GF 109203x) and IX (Ro 31-8220) Are Potent Inhibitors of Glycogen Synthase Kinase-3 Activity. // FEBS Lett. 1999. V. 460. P. 433-436.

58. Kozikowski A. P., Gaisina I. N., Yuan H., Petukhov P. A., Blond S. Y., Fedolak A.,

59. Caldarone B., McGonigle P. Structure-Based Design Leads to the Identification of Lithium Mimetics That Block Mania-like Effects in Rodents. Possible New GSK-3ß Therapies for Bipolar Disorders. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 8328-8332.

60. Med. Chem. 2004. V. 12. P. 1239-1255.

61. Ye Q., Xu G., Lv D., Cheng Z., Li J., Hu Y. Synthesis and biological evaluation of novel 4-azaindolyl-indolyl-maleimides as glycogen synthase kinase-3p (GSK-3P) inhibitors. //Bioorg. Med. Chem. 2009. V. 17. P. 4302-4312.

62. Routier S., Peixoto P., Mérour J.-Y., Coudert G., Dias N., Bailly C., Pierré A., Léonce S., Caignard D.-H. Synthesis and Biological Evaluation of Novel Naphthocarbazoles as Potential Anticancer Agents. //J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 1401-1413.

63. Bregman H., Williams D. S., Atilla G. E., Carroll P. J., Meggers E. An Organometallic Inhibitor for Glycogen Synthase Kinase 3. //J. Amer. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 13594-13595.

64. Williams D. S., Atilla G. E., Bregman H., Arzoumanian A., Klein P. S., Meggers E. Switching on a Signaling Pathway with an Organoruthenium Complex. // Angew.

65. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 1984-1987.

66. Bregman H., Carroll P. J., Meggers E. Rapid Access to Unexplored Chemical Space by Ligand Scanning around a Ruthenium Center: Discovery of Potent and Selective Protein Kinase Inhibitors. // J. Amer. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 877-884.

67. Bregman H., Meggers E. Ruthenium Half-Sandwich Complexes as Protein Kinase Inhibitors: An N-Succinimidyl Ester for Rapid Derivatizations of the Cyclopentadienyl Moiety. // Org. Lett. 2006. V. 8. P. 5465-5468.

68. Williams D. S., Carroll P. J., Meggers E. Platinum Complex as a Nanomolar Protein Kinase Inhibitor. // Inorg. Chem. 2007. V. 46. P. 2944-2946.

69. Anand R., Maksimoska J., Pagano N., Wong E. Y., Gimotty P.A., Diamond S. L., Meggers E., Marmorstein R. Toward the Development of a Potent and Selective Organoruthenium Mammalian Sterile 20 Kinase Inhibitor. // J. Med. Chem. 2009. V. 52. P. 1602-1611.

70. Zhong H., Zou H., Semenov M. V., Moshinsky D., He X., Huang H., Li S., Quan J., Yang Z., Lin S. Characterization and development of novel small-molecules inhibiting GSK3 and activating Wnt signaling. // Mol. BioSyst. 2009. V. 5. P. 1356-1360.

71. Guengerich F. P., Sorrells J. L., Schmitt S., Krauser J. A., Aryal P., Meijer L. Generation of New Protein Kinase Inhibitors Utilizing Cytochrome P450 Mutant Enzymes for Indigoid Synthesis. // J. Med. Chem. 2004. V. 47. P. 3236-3241.

72. Polychronopoulos P., Magiatis P., Skaltsounis A.-L., Myrianthopoulos V., Mikros E.,

73. Wu Z.-L., Aryal P., Lozach O., Meijer L., Guengerich F. P. Biosynthesis of New Indigoid Inhibitors of Protein Kinases Using Recombinant Cytichrome P450 2A6. // Chemistry & Biodiversity. 2005. V. 2. P. 51.

74. Beauchard A., Ferandin Y., Frère S., Lozach O., Blairvacq M., Meijer L., Thiéry V., Besson T. Synthesis of Novel 5-substituted Indirubins as Protein Kinases Inhibitors. // Bioorg Med Chem. 2006. V. 14. P. 6434-6443.

75. Beauchard A., Laborie H., Rouillard H., Lozach O., Ferandin Y., Guével R. L., Guguen-Guillouzo C., Meijer L., Besson T., Thiéry V. Synthesis and kinase inhibitory activity of novel substituted indigoids. // Bioorg. Med. Chem. 2009. V. 17. P. 62576263.

76. Hamann M. T., Hill R., Roggo S. Marine Natural Products. Key Advances to the Practical Application of this Resource in Drug Development. // CHIMIA International Journal for Chemistry. 2007. V. 61. P. 313-321.

77. Laport M. S., Santos O. C., Muricy G. Marine sponges: potential sources of new antimicrobial drugs. // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2009. V. 10. P. 86-105.

78. Gompel M., Leost M., DeKierJoffe E. B., Puricelli L., Franco L. H., Palermo J., Meijer L. Meridianins, a new family of protein kinase inhibitors isolated from the Ascidian Aplidium meridianum. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 17031707.

79. Echalier A., Bettayeb K., Ferandin Y., Lozach O., Clement M., Valette A., Liger F.,

80. Akue-Gedu R., Debiton E., Ferandin Y., Meijer L., Prudhomme M., Anizon F., Moreau P. Synthesis and biological activities of aminopyrimidyl-indoles structurally related to meridianins. // Bioorg. Med. Chem. 2009. V. 17. P. 4420-4424.

81. Baunbaek D., Trinkler N., Ferandin Y., Lozach O., Ploypradith P., Rucirawat S., Ishibashi F., Iwao M., Meijer L. Anticancer alkaloid lamellarins inhibit protein kinases. // Mar. Drugs. 2008. V. 6. P. 514-527.

82. Lu H., Chang D. J., Baratte B., Meijer L., Schulze-Gahmen U. Crystal Structure of a Human Cyclin-Dependent Kinase 6 Complex with a Flavonol Inhibitor, Fisetin. // J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 737-743.

83. Zhai S., Senderowicz A. M., Sausville E. A., Figg W. D. Flavopiridol, a novel cyclin-dependent kinase inhibitor, in clinical development. // Ann. Pharmacother. 2002. V. 36. P. 905-911.

84. Schultz C., Link A., Leost M., Zaharevitz D. W., Gussio R., Sausville E. A., Meijer L., Kunick C. Paullones, a Series of Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors: Synthesis, Evaluation of CDKl/Cyclin B Inhibition, and in Vitro Antitumor Activity. // J. Med.

85. Chem. 1999. V. 42. P. 2909-2919.

86. Wieking K., Knockaert M., Leost M., Zaharevitz D. W., Meijer L., Kunick C. Synthesis of paullones with aminoalkyl side chains. // Archiv der Pharmazie. 2002. V. 335. P. 311-317.

87. Pies T., Schaper K.-J. J., Leost M., Zaharevitz D. W., Gussio R., Meijer L., Kunick C. CDK1-inhibitory activity of paullones depends on electronic properties of 9-substituents. //Archiv der Pharmazie 2004. V. 337. P. 486-492.

88. Kunick C., Lauenroth K., Leost M., Meijer L., Lemcke T. 1-Azakenpaullone Is a Selective Inhibitor of Glycogen Synthase Kinase-3 beta. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 413-416.

89. Kunick C., Zeng Z., Gussio R., Zaharevitz D., Leost M., Totzke F., Schächtele C., Kubbutat M. H. G., Meijer L., Lemcke T. Structure-Aided Optimization of Kinase Inhibitors Derived from Alsterpaullone. // ChemBioChem. 2005. V. 6. P. 541-549.

90. Xie X., Lemcke T., Gussio R., Zaharevitz D. W., Leost M., Meijer L., Kunick C. Epoxide-Containing Side Chains Enhance Antiproliferative Activity of Paullones. // Eur. J. Med. Chem. 2005. V. 40. P. 655-661.

91. Chioua M., Samadi A., Soriano E., Lozach O., Meijer L., Marco-Contelles J. Synthesis and biological evaluation of 3,6-diamino-lH-pyrazolo3,4-b.pyridine derivatives as protein kinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009 V. 19. P. 4566-4569.

92. Peat A. J., Garrido D., Boucheron J. A., Schweiker S. L., Dickerson S. H., Wilson J. R., Wang T. Y., Thomson S. A. Novel GSK-3 Inhibitors with Improved Cellular Activity. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 2127-2130.

93. Stevens K. L., Reno M. J., Alberti J. B., Price D. J., Kane-Carson L. S., Knick V. B.,

94. Shewchuk L. M., Hassell A. M., Veal J. M., Davis S. T., Griffin R. J., Peel M. R. Synthesis and evaluation of pyrazolol,5-b.pyridazines as selective cyclin dependent kinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. P. 5758-5762.

95. Ha H.-H., Kim J. S., Kim В. M. Novel heterocycle-substituted pyrimidines as inhibitors of NF-кВ transcription regulation related to TNF-a cytokine release. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. P. 653-656.

96. Maeda Y., Nakano M., Sato H., Miyazaki Y., Schweiker S. L., Smith J. L., Truesdale A. T. 4-Acylamino-6-arylfuro2,3-d.pyrimidines: potent and selective glycogen synthase kinase-3 inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 3907-3911.

97. Miyazaki Y., Maeda Y., Sato H., Nakano M., Mellor G. W. Rational design of 4-amino-5,6-diaryl-furo2,3-d.pyrimidines as potent glycogen synthase kinase-3 inhibitors. //Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. P. 1967-1971.

98. Pierce A. C., ter Haar E., Binch H. M., Kay D. P., Patel S. R., Li P. CH-O and CH-N Hydrogen Bonds in Ligand Design: A Novel Quinazolin-4-ylthiazol-2-ylamine Protein Kinase Inhibitor. // J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 1278-1281.

99. Ibrahim M. A., Shilabin A. G., Prasanna S., Jacob M., Khan S. I., Doerksen R. J., Hamann M. T., 2-N-Methyl modifications and SAR studies of manzamine A. // Bioorg. Med. Chem. 2008. V. 16. P. 6702-6706.

100. Sakai R., Higa T., Jefford C. W., Bernardinelli G. Manzamine A, a novel antitumor alkaloid from a sponge. // J. Amer. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 6404-6405.

101. Kobayashi J., Tsuda M. Structures and Biogenesis of Manzamines and Related Alkaloids. //Heterocycles. 1997. V. 46. P. 765-794.

102. El Sayed K. A., Kelly M., Kara U. A. K., Ang K. K. H., Katsuyama I., Dunbar D. C.,

103. Khan A. A., Hamann M. T. New Manzamine Alkaloids with Potent Activity against Infectious Diseases. // J. Amer. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 1804-1808.

104. Shilabin A. G. G., Kasanah N., Tekwani B. L., Hamann M. T. Kinetic studies and bioactivity of potential manzamine prodrugs. // J. Nat. Prod. 2008. V. 71. P. 12181221.

105. Plotkin B., Kaidanovich O., Talior I., Eldar-Finkelman H. Insulin mimetic action of synthetic phosphorylated peptide inhibitors of glycogen synthase kinase-3. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. V. 305. P. 974-980.

106. Conde S., Pérez D. I., Martinez A., Perez C., Moreno F. J. Thienyl and Phenyl a-Halomethyl Ketones: New Inhibitors of Glycogen Synthase Kinase (GSK-3p) from a Library of Compound Searching. // J. Med. Chem. 2003. V. 46. P. 4631-4633.

107. Cramer III R. D., Patterson D. E., Bunce J. D. Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA). 1. Effect of Shape on Binding of Steroids to Carrier Proteins. // J. Am. Chem. Soc. 1988. V. 110. P. 5959-5967.

108. Klebe G., Abraham U., Mietzner T. Molecular Similarity Indices in a Comparative Analysis (CoMSIA) of Drug Molecules to Correlate and Predict Their Biological Activity. // J. Med. Chem. 1994. V. 37. P. 4130-4146.

109. Zeng M., Jiang Y., Zhang B., Zheng K., Zhang N., Yu Q., 3D QSAR studies on GSK-3 inhibition by aloisines. //Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. V. 15. P. 395-399.

110. Xiao J., Guo Z., Guo Y., Chu F., Sun P., Inhibitory mode of N-phenyl-4-pyrazolol,5pyridazin-3-ylpyrimidin-2-amine series derivatives against GSK-3: molecular docking and 3D-QSAR analyses. //Prot. Eng. Des. Sel. 2006. V. 19. P. 47-54.

111. Zhang N., Jiang Y., Zou J., Zhang B, Jin H., Wang Y., Yu Q. 3D QSAR for GSK-3p inhibition by indirubin analogues. // Eur. J. Med. Chem. 2006. V. 41. P. 373-378.

112. Dessalew N., Patel D. S., Bharatam P. V., 3D-QSAR and molecular docking studies on pyrazolopyrimidine derivatives as glycogen synthase kinase-3P inhibitors. // J. Mol. Graph. Model. 2007. V. 25. P. 885-895.

113. Patel D. S., Bharatam P. V., Selectivity criterion for pyrazolo3,4-6.pyrid[az]ine derivatives as GSK-3 inhibitors: CoMFA and molecular docking studies. // Eur. J. Med. Chem. 2008. V. 43. P. 949-957.

114. Wei Z., Zhang H., Cui W., Ji M.-J., Molecular Docking and 3D-QSAR on Maleimide Derivatives as Glycogen Synthase Kinase-3p Inhibitors. // Acta Phys.-Chim. Sin. 2009. V. 25. P. 890-896.

115. Prasanna S., Daga P. R., Xie A., Doerksen R. J., Glycogen synthase kinase-3 inhibition by 3-anilino-4-phenylmaleimides: insights from 3D-QSAR and docking. // J. Comput. Aided Mol. Des. 2009. V. 23. P. 113-127.

116. Lather V., Kristam R., Saini J. S., Kristam R., Karthikeyan N. A., Balaji V. N., QSAR Models for Prediction of Glycogen Synthase Kinase-3 P Inhibitory Activity of Indirubin Derivatives. // QSAR Comb. Sci. 2008. V. 27. P. 718 728.

117. Katritzky A. R., Pacureanu L. M., Dobchev D. A., Fara D. C., Duchowicz P. R., Karelson M., QSAR modeling of the inhibition of Glycogen Synthase Kinase-3. // Bioorg. Med. Chem. 2006. V. 14. P. 4987-5002.

118. Sivaprakasam P., Xie A., Doerksen R. J., Probing the physicochemical and structural requirements for glycogen synthase kinase-3a inhibition: 2D-QSAR for 3-anilino-4-phenylmaleimides. //Bioorg. Med. Chem. 2006. V. 14. P. 8210-8218.

119. Freitas M. P., A 2D image-based approach for modelling some glycogen synthase kinase 3 inhibitors. // Med. Chem. Res. 2007. V. 16. P. 461-467.

120. Prasanna S., Doerksen R. J., Topological Polar Surface Area: A Useful Descriptor in2D-QSAR. // Curr. Med. Chem. 2009. V. 16. P. 21-41.

121. Goodarzi M., Freitas M. P., Jensen R., Feature Selection and Linear/Nonlinear Regression Methods for the Accurate Prediction of Glycogen Synthase Kinase-3 p Inhibitory Activities. // J. Chem. Inf. Model. 2009. V. 49. P. 824-832.

122. Kumar V., Madan A. K., Application of graph theory: prediction of glycogen synthase kinase-3 inhibitory activity of thiadiazolidinones as potential drugs for the treatment of Alzheimer's disease. // Eur. J. Pharm. Sci. 2005. V. 24. P. 213-218.

123. Dessalew N., Bharatam P. V. Investigation of Potential Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Using Pharmacophore Mapping and Virtual Screening. // Chem. Biol. Drug Des. 2006. V. 68. P. 154-165.

124. Dessalew N., Bharatam P. V. Identification of potential glycogen kinase-3 inhibitors by structure based virtual screening. // Biophys. Chem. 2007. V. 128. P. 165-175.

125. Liu L., Zhang L.-N., Jiang F.-C. Construction of the Pharmacophore Model of Glycogen Synthase Kinase-3 Inhibitors. // Chin. J. Chem. 2007. V. 25. P. 892-897.

126. Kim H.-J., Choo H., Cho Y. S., No K. T., Pae A. N. Novel GSK-3p inhibitors from sequential virtual screening. //Bioorg. Med. Chem. 2008. V. 16. P. 636-643.

127. Vadivelan S., Sinha B. N., Tajne S., Jagarlapudi S. A. R. P. Fragment and knowledge-based design of selective GSK-3P inhibitors using virtual screening models. // Eur. J. Med. Chem. 2009. V. 44. P. 2361-2371.

128. Gadakar P. K., Phukan S., Dattatreya P. M., Balaji V. N., Enrichment of potent GSK-3P inhibitors from docking studies in the enzyme active site. // Curr. Sci. 2007. V. 93. P. 1100-1107.

129. Gadakar P. K., Phukan S., Dattatreya P., Balaji V. N., Pose Prediction Accuracy in Docking Studies and Enrichment of Actives in the Active Site of GSK-3p. // J. Chem. Inf. Model. 2007. V. 47. P. 1446-1459.

130. Polgar T., Baki A., Szendrei G. I., Keseru G. M., Comparative Virtual and Experimental High-Throughput Screening for Glycogen Synthase Kinase-3 p1.hibitors. //J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 7946-7959.

131. Mishra N., Basu A., Jayaprakash V., Sharon A., Basu M., Patnaik К. K., Structure based virtual screening of GSK-3P: Importance of protein flexibility and induced fit. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009. V. 19. P. 5582-5585.

132. Kang N. S., Lee G. N., Kim С. H., Bae M. A., Kim I., Cho Y. S., Identification of small molecules that inhibit GSK-3P through virtual screening. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009. V. 19. P. 533-537.

133. Ventimila N., Dupont P.-Y., Laguerre M., Dessolin J. Description and assessment of a model for GSK-Зр database virtual screening. // J. Enz. Inhib. Med. Chem. 2010. V. 25. P. 152-157.

134. Cheng Y., Prusoff W. H. Relationship Between the Inhibition Constant (Kl) and the Concentration of Inhibitor Which Causes 50 per cent Inhibition (150) of an Enzymatic Reaction. // Biochem. Pharmacol. 1973. V. 22. P. 3099-3108.

135. Cohen N. C. The Molecular Modeling Perspective in Drug Design. // Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design. Ed.: Cohen N. C. Academic Press. Burlington, MS, USA. 1996. P. 1-17.

136. Kuntz I. D., Blaney J. M., Oatley S. J., Langridge R., Ferrin Т. E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. // J. Mol. Biol. 1982. V. 161. P.269-288.

137. OpenEye Scientific Software. 9 Bisbee Court, Suite D. Santa Fe. New Mexico. 87508. USA.

138. Wolber G., Langer T. LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived from Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters. // J. Chem. Inf. Model. 2005. V. 45. P. 160-169.

139. Rush T. S., Grant J. A., Mosyak L., Nicholls A. A Shape-Based 3-D Scaffold Hopping Method and Its Application to a Bacterial Protein-Protein Interaction. // J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 1489-1495.

140. Peltason L., Bajorath J. Molecular Similarity Analysis in Virtual Screening. // Chemoinformatics Approaches to Virtual Screening. Eds.: Varnek A., Tropsha A. RSC Publishing. Cambridge, UK. 2008. P. 120-149.

141. Holtje H.-D., Sippl W., Rognan D., Folkers G. Molecular Modeling. Wiley-VCH. 2008. P. 233-263.

142. Карпов П. В., Баскин И. И., Палюлин В. А., Зефиров Н. С. Виртуальныйскрининг на основе одноклассовой классификации. // Докл. Акад. наук. 2011. В печати.

143. Huang N., Shoichet В. К., Irwin J. J. Benchmarking Sets for Molecular Docking. // J. Med. Chem. 2006. V. 49. P. 6789-6801.

144. Международный патент №2003/068932 на имя Chiron Corporation (США), опубликован 21 августа 2003 года.

145. SYBYL 8.0. Tripos International. 1699 South Hanley Rd. St. Louis. Missouri. 63144. USA.

146. Osolodkin D. I., Palyulin V. A., Zefirov N. S. Structure-based virtual screening of glycogen synthase kinase 3(3 inhibitors: Analysis of scoring functions applied to large true actives and decoy sets. // Chem. Biol. Drug Des. 2011. Submitted.

147. Hinton G. E., Salakhutdinov R. R. Reducing the Dimensionality of Data with Neural Networks. // Science. 2006. V. 313. P. 504-507.

148. Pierce A. C., Sandretto K. L., Bemis G. W. Kinase inhibitors and the case for CH"0 hydrogen bonds in protein-ligand binding. // Proteins. 2002. V. 49. P. 567-576.

149. Truchon J.-F., Bayly C.I. Evaluating Virtual Screening Methods: Good and Bad Metrics for the "Early Recognition" Problem. // J. Chem. Inf. Model. 2007. V. 47. P. 488508.

150. Irwin J. J., Shoichet В. K. ZINC-a free database of commercially available compounds for virtual screening. // J. Chem. Inf. Model. 2005. V. 45. P. 177-182.

151. Oprea Т. I. Property distribution of drug-related chemical databases. // J. Comput. Aided Mol. Des. 2000. V. 14. P. 251-264.

152. Wang R., Wang S. How Does Consensus Scoring Work for Virtual Library Screening? An Idealized Computer Experiment. // J. Chem. Inf. Сотр. Sci. 2001. V. 41. P. 14221426.

153. ChemAxon Inc. http://chemaxon.com.

154. Wang R., Gao Y., Lai L. LigBuilder: A Multi-Purpose Program for Structure-Based Drug Design. // J. Mol. Model. 2000. V. 6. P. 498-516.

155. Connolly M. L. Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. // Science. 1983. V. 221. P. 709-713.

156. Zhang N., Jiang Y., Zou J., Yu Q., Zhao W. Structural basis for the complete loss of GSK3p catalytic activity due to R96 mutation investigated by molecular dynamics study. // Proteins. 2009. V. 75. P. 671-681.

157. Jones G., Willett P., Glen R., Leach A.R., Taylor R. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking. // J. Mol. Biol. 1997. V. 267. P. 727-748.

158. Kolossvary I., Guida W. C. Low Mode Search. An Efficient, Automated Computational Method for Conformational Analysis: Application to Cyclic and Acyclic Alkanes and Cyclic Peptides.//J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 5011-5019.

159. Осолодкин Д.И., Шульга Д.А., Палюлин B.A., Зефиров Н.С. Моделирование методом молекулярной динамики взаимодействия манзамина А и киназы гликогенсинтазы Зр. //Изв. АН. Сер. хим. 2010. №10. С. 1932-1943.

160. McCammon J. A. Protein dynamics. // Rep. Progr. Phys. 1984. V. 47. P. 1-46.

161. Cheng Y., Zhang Y., McCammon J. A. How does activation loop phosphorylation modulate catalytic activity in the cAMP-dependent protein kinase: A theoretical study. //Protein Sci. 2006. V. 15. P. 672-683.

162. Pubmed Protein, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein.

163. Gasteiger J., Marsili M. Iterative Partial Equalization of Orbital Electronegativity—A Rapid Access to Atomic Charges. // Tetrahedron. 1980. V. 36. P. 3219-3228.

164. Purcell W. P., Singer J. A. A brief review and table of semiempirical parameters used in the Hueckel molecular orbital method. // J. Chem. Eng. Data. 1967. V. 12. P. 235246.

165. Halgren T. A. Merck Molecular Force Field. II. MMFF94 Van Der Waals and Electrostatic Parameters for Intermolecular Interactions. // J. Сотр. Chem. 1996. V. 17. P. 520-552.

166. Yakovenko O., Oliferenko A. A., Bdzhola V. G., Palyulin V. A., Zefirov N. S. Kirchhoff Atomic Charges Fitted to Multipole Moments: Implementation for a Virtual Screening System. // J. Сотр. Chem. 2008. V. 29. P. 1332-1343.

167. Шульга Д. A. Разработка и параметризация топологически симметричных атомных зарядов для целей молекулярного моделирования. // Дисс. . канд. хим. наук. Москва. 2009.

168. Shulga D. A., Oliferenko A. A., Pisarev S. A., Palyulin V. A., Zefirov N. S. Fast Tools for Calculation of Atomic Charges Well Suited for Drug Design. // SAR QSAR Env.

169. Res. 2008. V. 19. P. 153-165

170. Jakalian A., Jack D. B., Bayly C. I. Fast, Efficient Generation of High-Quality Atomic Charges. AM1-BCC Model: II. Parameterization and Validation. // J. Comp. Chem. 2002. V. 23. P. 1623-1641.

171. Wang J., Wang W., Kollman P., Case D. Automatic atom type and bond type perception in molecular mechanical calculations. // J. Mol. Graph. Model. 2006. V. 25. P. 247260.

172. Besler B.H., Merz Jr. K. M., Kollman P. A. Atomic charges derived from semiempirical methods. // J. Comput. Chem. 1990. V. 11. P. 431-439.

173. Lôwdin P.-O. Approximate Formulas for Many-Center Integrals in the Theoiy of Molecules and Crystals. // J. Chem. Phys. 1953. V. 21. P. 374-382.

174. Mulliken R. S. Electronic Population Analysis on LCAOMO Molecular Wave Functions. I. //J. Chem. Phys. 1955. V. 23. P. 1833- 1840.

175. Granovsky A. A. PC GAMESS version 7.0. http://classic.chem.msu.su/gran/gamess/index.html.

176. Clark M., Cramer III R. D., Van Opdenbosch N. Validation of the general purpose Tripos 5.2 force field. // J. Comput. Chem. 1989. V. 10. P. 982-1012.

177. McGann M. R., Almond H. R., Nicholls A., Grant J. A., Brown F. K. Gaussian docking functions. // Biopolymers. 2003. V. 68. P. 76-90.

178. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: Visual molecular dynamics. // J. Mol. Graph. 1996. V. 14. P. 33-38.

179. Stahl M., Rarey M. Detailed Analysis of Scoring Functions for Virtual Screening. // J. Med. Chem. 2001. V. 44. P. 1035-1042.

180. Clark R., Strizhev A., Leonard J. M., Blake J. F., Matthew J. B. Consensus scoring for ligand/protein interactions. // J. Mol. Graph. Model. 2002. V. 20. P. 281-295.

181. Muegge I., Martin Y. C. A General and Fast Scoring Function for Protein-Ligand Interactions: A Simplified Potential Approach. // J. Med. Chem. 1999. V. 42. P. 791-804.

182. Weiner S. J., Kollman P. A., Case D. A., Singh U. C., Ghio C., Alagona G., Profeta Jr. S., Weiner P. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. //J. Amer. Chem. Soc. 1984. V. 106. P. 765-784.

183. Vergara I. A., Norambuena T., Ferrada E., Slater A. W., Melo F. StAR: a simple tool for the statistical comparison of ROC curves. // BMC Bioinformatics. 2008. V. 9. P. 265.

184. Baskin 1.1., Kireeva N., Varnek A. The One-Class Classification Approach to Data Description and to Models Applicability Domain. // Mol. Inf. 2010. V. 29. P. 581-587.

185. Guha R., Howard M. T., Hutchison G. R., Murray-Rust P., Rzepa H., Steinbeck C., Wegner J., Willighagen E. L. The Blue Obelisk — Interoperability in Chemical Informatics. // J. Chem. Inf. Model. 2006. V. 46. P. 991-998.

186. Wang T., Zhou J. 3DFS: 3D Flexible Searching System for Lead Discovery New Version 1.2. //J. Mol. Model. 1999. V. 5. P. 231-251.

187. Grant J. A., Pickup B. T., Nicholls A. A smooth permittivity function for Poisson-Boltzmann solvation methods. // J. Comput. Chem. 2001. V. 22. P. 608-640.

188. Morris G. M., Goodsell D. S., Halliday R. S., Huey R., Hart W. E., Belew R. K., Olson A. J. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. // J. Comput. Chem. 1998. V. 19. P. 1639-1662.

189. Huey R., Morris G. M., Olson A. J., Goodsell D. S. A semiempirical free energy force field with charge-based desolvation. // J. Comput. Chem. 2007. V. 28. P. 1145-1152.

190. Sanner M. F. Python: A Programming Language for Software Integration and

191. Development. // J. Mol. Graph. Mod. 1999. V. 17. P. 57-61.

192. Hornak V., Abel R., Okur A., Strockbine B., Roitberg A., Simmerling C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. //Proteins. 2006. V. 65. P. 712-725.

193. Wang J., Wolf R. M., Caldwell J. W., Kollman P. A., Case D. A. Development and testing of a general amber force field. // J. Comput. Chem. 2004. V. 25. P. 1157-1174.

194. Ryckaert J., Ciccotti G., Berendsen H. Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of n-alkanes. // J. Comp. Phys. 1977. V. 23. P. 327-341.

195. Jorgensen W. L., Chandrasekhar J., Madura J. D., Impey R. W., Klein M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. // J. Chem. Phys. 1983. V. 79. P. 926-935.

196. Onufriev A., Bashford D., Case D. A. Exploring protein native states and large-scale conformational changes with a modified generalized born model. // Proteins. 2004. V. 55. P. 383-394.

197. Hawkins G. D., Cramer C. J., Truhlar D. G. Parametrized Models of Aqueous Free Energies of Solvation Based on Pairwise Descreening of Solute Atomic Charges from a Dielectric Medium. // J. Phys. Chem. V. 100. P. 19824-19839.

198. Gerlach S. LabPlot: Data analysis and visualisation. 2009. http://labplot.sourceforge.net.

199. Luo R., David L., Gilson M. K. Accelerated Poisson-Boltzmann calculations for static and dynamic systems. // J. Comput. Chem. 2002. V. 23. P. 1244-1253.

200. Tsui V., Case D. A. Theory and applications of the generalized born solvation model in macromolecular simulations. //Biopolymers. 2000. V. 56. P. 275-291.

201. Srinivasan J., Cheatham T. E., Cieplak P., Kollman P. A., Case D. A. Continuum Solvent Studies of the Stability of DNA, RNA, and Phosphoramidate-DNA Helices. // J. Amer. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 9401-9409.

202. Nicholas K. B., Nicholas Jr. H. B., Deerfield II D. W. GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation. //EMBnet.news. 1997. V. 4. P. 14-17.

203. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. V. 24. P. 1596-1599.

204. Ashkenazy H., Erez E., Martz E., Pupko T., Ben-Tal N. ConSurf 2010: calculating evolutionary conservation in sequence and structure of proteins and nucleic acids. // Nucleic Acids Research. 2010. V. 38 (Web Server issue). P. W529-W533.

205. Glaser F., Pupko T., Paz I., Bell R. E., Bechor D., Martz E., Ben-Tal N. ConSurf: Identification of Functional Regions in Proteins by Surface-Mapping of Phylogenetic Information. //Bioinformatics. 2003. V. 19. P. 163-164.

206. Sali A., Blundell T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. // J. Mol. Biol. 1993. V. 234. P. 779-815

207. Laskowski R. A., MacArthur M. W., Moss D. S., Thornton J. M. PROCHECK a program to check the stereochemical quality of protein structures. // J. Appl. Cryst. 1993. V. 26. P. 283-291.

208. Sippl M. J. Recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. // Proteins. 1993. V. 17. P. 355-362.