Выделение и изучение свойств фосфозид...4-4-фосфоркиназы из мозга человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

2 г РЕВ 1393

Московский ордена Трудовото Краевого Знамени институт тонкой химической технологии им. М.В.Ломовосова

Специализированный совет Д 063.41.01

На оравах рукописи

Тусупвз Оггардгя Кумпрспач

УДК 547,053.872.7:577.352.27

Выделеове п шуюю сеяРап «5и2С^.п>5дчлт:лагя—4-4'ос,5ч;т

02.00.10 Бноорганическля хинин, химгш г,рпро,\пих п физиологически активных веществ

Автореферат

диссертация не соискание ученой степени кандидата химичес;:пч

наук

Москва 1993 г.

Работа выполнена на кафедре виотокцологии Московского ордена Трудопого Красного Знамени института тонкой химической технологии вн. М.ВЛоионосова '

Научные руководителя:

«

доктор химических наук, профессор В.И.Шеоц кандидат хим'^чоских паук С.Е.Сскерпн

Офицнолышо опеоцееты.

доктор химических наук А.Г.ГаСцбсп доктор химических паук Б.А.Клящнцки£

Ведущее предприятие — Идствтут биооргапэдоской хкхшя им. М.М. Шемякина

Защита диссертации состоится 'ЛЛ^Х^Мл^ ЮОЗг.в

,,асов иа заседании Специалмирогашюго совета Д.033 41.01 нри МИТХТ им. М.Б. Ломоносова (»7571, Москва. В-571, 1Х2П пр.Вернадского д.66)

С. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ пл. М.В.Ломоносова (119931, Москва, ул. М.Пироговская д1)

Автореферат разослав 1993г.

Ученый секретарь Специализнровишого совета

Кандидат химических наук, с.и.р. А-ИЛютик , ' .

Общая харакгерястака работы.

Актуальность работы. Значение минорных компонентов Отологических мембран, фосфатнддлнноэнт—4 — фосфата и фосфатидклииозит - 4,5 - днфосфата ■ регуляция клеточных функций, интенсивно исследовялось в последнее десятилетие. Основное внимание было уделено рецептор — зависимому гидролизу фосфагидилинозит—4,5—днфосфата, при активация

фосфоинозитид—специфичной фосфолипазы С в ответ на действие многих гормонов, пейротрансмнттеров, факторов роста , а результате которого генерируются два вторичных посредника. 1,4,5— Ивозитгрифосфат вызывает увеличение знутриклеточной концентрации Сл~+. а 1,2—дяацнлгляцернн активирует оротеннквназу С. В то же время слабое внимание уделено другим процессам н ферментам, принимающим участив я обмене фосфояпоэнтидов. В частности, мало изучены фосфатндилинозит— киназы, важнейшие фермепты, обесвечивакщпе накопление фосфатнднлпнозит— 4,5—днфосфата , предшественника вторичных иоервдппко». я его воспаляете в процессах клеточного ответа. Ресннтеэ фосфатндялинозит—4,5—дяфосфата п поддержании его физиологического уровня, представляет собой лимитирующее звено в обмена фосфоппозитндоп. Этот процесс контролируется ферментом, называемым фосфатиднлакозвт—4—фосфат хипазой. Изучение регуляция я свойств этого фермента является актуальной задачей. Особый интерес вызывает поаск эффективных регуляторов аэтязпосш фосфлтпднлйпозит—4—фосфат киназы, которые позволяли бы целенаправлен!!» влиять па клеточные' функции, связанные с метаболизмом фосфоинознтпдоз. *

Цель работы. Целью настоящей диссертационной работы япляется характеристика, пзучэгпя функциональных, свойств а клеточной регуляции фермента. — фосфатцдалпнозит—4—фосфат кнназ и из мозга человека, а также разработка, препаративного способа получения |РИ| — меченого фосфатидилнноант —4,5—днфосфата с использованием этого фермента. Выполнение работы состояло в решения следующих задач:

1) Выделение и очистка фосфатндилинозит—4—фосфат киназы из мозга человека.

2) Исследование кинетических параметров й свойств фермента.

3)Поиск активаторов и ингибиторов фермента.

4) Разработка ферментативного синтеза [Р32)—меченого фосфатидилинозит — 4,5—ди фосфата ■ препаративном масштабе.

5) Исследование путей внутриклеточной регуляции активности фосфатидилинозит—4-фосфат киназы.

Научная новизна работы:

Разработав быстрый, высокоэффективный метод выделения фосфатидилинозит—4—фосфат кяназы из мозга человека. Впервые получен препарат фермента, очищенного до состояния близкого к гомогенному (М.м. 45 кДа). Изучены кинетические характеристики фермента.

Проведен скрининг эффективных активаторов и ингибиторов фосфатидилинозит—4—фосфат княазы.

Разработан способ получения изотопно—меченого

фосфатидилинозит—4,(5— Р32}—дифосфата путем ферментативного синтеза с использованием фосфатидилинозит — 4—фосфат кяназы из мозга крысы.

Установлена взаимосвязь между синтезом полифосфоннозитидов в протеолитической активацией протеянкиказы С. Показано, что протеолитический фрагмент протеинышаэы С (кнназа М), способен выступать в определенных условиях >каК фосфатидилино гит—4— фосфат кииаза ^

Предложена гипотетическая схема , развитая собьжмгй • процессах ■клеточного ответа, связанных «с рецептор—зависимым «вдххлизои 'фосфатидилинозит—4,5—днфосфета.

"Иракмчеокое эвяченяе (работы определяйся тем, что полученные данные о характеристиках, . свойствах -и клеточной регуляция 'фосфатаднлинозвг—4—фосфат киназы, являются ««ладом в (развитие ^представлений о 'механизмах переда« аисмембранного' сигнала. ЧЧолученяые данные открывают «дни возможности целенацравленного 'воядействия >на 1ряд бввмхжч«ских процессов, • •норме « «атологин, черев ¡регуляцво «бмеяа фосфоикозитидов. Изотопно --меченый фосфатидилинозит—4, [5—Р32)—дн фосфат

может применяться .в 'научных исследованиях в области биохимия, •молекулярной 'биологии и медицины. Препарат был использован для 'исследовательских целей в ВКНЦ РАМН.

Апробация. 'Результаты исследований были доложены на:

. — VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов вторичных посредников в регуляция ферментативных реакций", Петрозаводск, 1988 т.

J

— Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевых клеток", Минск, 1990 г.

— Симпозиуме СССР—ФРГ "Химия белкой и пептидов", Аахен, 1991г.

Публикация. Результаты исследований опубликованы а 5 печатных работах.

Объем работ. Диссертация содержит_страниц машинописного

текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (' ссылок).

Содеряагав работы 1. Материалы к методы.

Для выдолепкя фосфатцднлииоэит— 4—фосфат кяиазн использовали роловтгай мозг человека, полученный при ранних вскрытиях ( через 2—3 часа после смерти ) здоровых лиц мужского пола в роз растя 20—65 лат, скончавшихся or автомобильной катастрофы, бытотеЯ вля производственной травмы.

В исследованиях были использованы препараты полифосфоинознтндзв, аолучешше нами по описанной методике с вехоторымв модификациями ( Шрагнп я др., 1967). Чистота полученных фосфатпдплнпознт-4-фосфата и фосфатндвлинозчт— 4,5—дифосфата контролировала«» высокоэффективной тонкослойной хроматографией на импрегнировапиом оксалатом калия силикагеля ( nano — HPTLC Kleselgel 60. "Merck" ) в системах : и —пропанол — 4N аммиак (2:1) я хлороформ — ацетон — метанол — уксусная кислота — вода (40:15:13:12:8, все по объему). В качестве см'деа-елей использовались полп<' сфоилозитнды от фирмы "Sigma" (США). В экспериментах по фосфорялвровакио фосфатпддлиноэит— 4 — фосфата использовалась. малые одполамелляряые везикулы, содержащие этот ляп ид иля его смесь с другими лнпидами, полученные по методу Баигхема, предусматривающем получение J липпдпой пленки оря упарававии в органическом растворителе, диспергирование ее в водной среде и последующее ультразвуковое озвучивание.

При очистке ферментов использовались следующие сорбенты: днзтиламиноэтил — целлюлоза { DEAE — Sepbacel, "Pharmacia", Швеция ), фосфо — целлюлоза Р-23 ("Serva", ФРГ), эпоксн -активированная Сефароза — 6В я фенил — Сефароза ("Phannacla"),

сорбенты ад* высокоэффективной жидкостной хроматографии 'Г5К - 3000SW ("LKB", Швеция) я Superóse 12 ("Pharmacia").

В экспериментах использовались следующие препараты: мно— инозит, трипсин, ингибитор трипсина, калмидазолнум, трнфтораеразив, церамид Ш—типа, 1,2-дволеоилглицерин, тетрадеканоилфорболацегат, цАМФ, Н7, W7, октвл—Ь—D— глюкоиираиозид, АТФ, ГГФ, фосфатидмлсерни ("Sigma", США).

Белок иейромодулии предоставлен АН.Губиным (каф.биохимт'и, МГУ вм.М.ВЛомоносова). Пептид Р—11 синтезирован в лаборатории В.Т.Иваг'ова (ИБХ вм.М.М.Шемякина).

Протевнхяваэу С получали во известным методикам ( Kikkawa, 1984, Huater, 1987). Ее иатнвность ароверяшп, электрофорезом в имкуноблотннгом с монокловальвымн антителами (клон MC—5, "Ameraham", Англия).

Диск - электрофоре» в градиентном 7-20% полялкрнллмидиом геле в присутствии додвцылсульфата натрия проводили по методу Лаэммля (LeemmU, 1970). ,

Кокцвнтрацию белха определяли по связыванию красителя кумасси "голубого G -250 ( Bradford, 197в).

Концентрацию фосфалипцдов взмерялв во

модифицироводному методу Бартлета (Bartlett, 1957).

2. Выделение в очистка фосфатядиАИпозвт-4-фосфат кшвды вэ ыои л человека.

В рана их исследованиях било'" установлено, что фосфатиАИЛинознт—4 - фосфат кияаза существует • мемСранносвязанной и растворимой форме (Kai, 1968) в отличается нестабильностью в процессе выделения. Позтему подбор быстрых и . селективных способов выделения явился важной задачей. Для исследований била выбрана растворимая форма фермента, как менее изученная. Из анализа вемиогвх взпестных ме-годнк выделения фосфатидилииозит—4—фосфат пшазы следует, что наиболее эффективным приемом ' очистки фермента, является последовательная комбинация аввояообменной в катиоаообмешюй хромате- фий. Разработанная намн процедура выделения состоит из трех этапов: первый — аниовообмеиная хроматография »Ва ДЭАЭ—целлюлозе, второй — к.йтиочоо6».еннйЯ хроматография в<ч ж фосфо -целлюлозе, и . наконец последний аффикнаг

хроматография на синтезироваином сЬрбентё~ф0сфатиАИЛиноз1ГТ— 4—фосфат—сефарозе (рис.1 а,б,в).

б)

ЫаС) А28о .5 I 2

10 20 Номер фракции

10 20 Ном зр фракции

Рнс.1 Профиль элюцив фосфатидилинозит—4—фосфат ышазы. а) ДЭАЭ—целлюлоза, в) фосфо—целлюлоза, в) Фосфатцдилииозит —

А — фосфат — сефароэа. (•--•) профиль элюдии белка А280, (,.......)

активность фосфатидилиноэит — 4 - фосфат кянази.

Использование фосфо — целлюлозы ■ данной методике обусловлено ее некоторой аффинностью к ферментам, имеющим иухлеотид— связывающий центр, благодаря которой достигается существенная очистка от примасних белков после данной стадни(рис.2).

Рис.2 Элвктрофореграммд препарата фосфатидилянозит-4-фосфат киназы:

1. Маркеры

2. После хроматография на фосфо— целлюлозе .

3. Посла хроматографии па фосфатвдиляноэят - 4—фосфат сефарозе

На цосАеднем этапе . очистки мы пытались использовать хроматофокусироваиие, аффинную хроматографию па , голубой сефарозе, гель - фильтрацию ыа ТЭК-3000 БДО в Биреги8а12, однако применепие данных подходов не позволило добиться разделения белков с сохранением ферментативной активности. Поэтому мы применяли аффинную хроматографию. Сорбент фосфатнднлнноЛнт—4—фосфат—сефарозу получала путем иммобилизации полученного нами фосфатидилинозит—4—фосфата • из мозга крыси па зпокси—активированную сефарозу 6В (рис.3) по методике, рекомендованной фирмой ' производителем данного сорбента с некоторыми кодификациями.

ОНОН О №НСО

о-р-о- сн, ——V

он

сн2-оссж2

[™<Н^2 /рн •2О?РО

о-р-о-сн2 о* нс-осок

I

1

- остхткм ■¡шип жирных кислот в ЦМрОА>МИ

фосф«гндкл>моя"т-4-фосф*г* ш нот >ф*|см

СН2-ОСОК3

Рис.3 Схема иммобилизации фосфатидилинозкт—<—фосфата на »покси—активированную сефарозу 9В.'

Иммобилизацию осущесилма в течетги 48 часов при 30°С, предварительно озвучив в ул»тра*«уко4ом дезинтеграторе суспензию ляганда фосфатядпличоэягт'- 4—фосфата в бтгкарбсиатном буфере рН 9,5. Непрореагнрова«бп«а' уяоксн— группы блокировали не трпэтаноламином, а мио —ипоэитом, что» «к> йайгему мнению придает сорбенту дополнительную вэбирателагоет» к «наделяемому ферменту. При эмоции буфером, содержащим 50 вМ фоефатвдтиноэнт — 4 — фосфата и 0.1% октил—(} — О—глюкопираиозпд» выявляется фермент, который при анализ« в диск —электрофорезе' с додецилсульфптом патрия содержит основную валковую Волосу с М.н. 45 кДа (рис.2). Минорные следы других белков с Мм. 52 кД» и 30 кДп. по-видимому, принадлежат гсльзоляну ( белок цтггоскелэта, способный взаимодействовать с фосфатиднлшгоэят-Ф- фосфатом и фосфагидилинознт—4,5—дифосфатон ) пг еииексинам (Са, фосфолипид—связывающие белки), соответственно. Специальных исследований по этому поводу ны не проводили. Полученный препарат фермента обладает высоко» устойчивостью и при хранения при +4°С (после концентрирования ультрафильтрацней) соярапзгт ак—гпость а течении 2—3 педель. Характерной особенностью разработанной процедуры является использование одного буфера,' в точение всего выделения, что исключает продолгаптельпио стадия диализа между стадиями, н соответственно весь процесс занимает короткое время (39 часов). Характеристики типичного выдзлети фермента пэ 100т мозк» приведены а Табл. 1.

Табл.1 Выделение фосфатаднлипознт—4—фосфат—киназы из мозга человека.

Стадия Общ. белок нг Общ. актив и. Еа Выход % Уд. активи. Ед./мг Степень очист — ки

Гомогенат 2795 31657 100 11.3 1

Цитозол. фракция 1120 26518 03 23.7 2.1

РЕАН — целлюлоза 146 2120« 87 145 12.8

Фосфо — целлюлоза 6.75 4833 ¡5 716 63.4 .

ФИФ — сефароза 0.18 1033 3.2 5614 497

За единицу активности фермента принято количество фермента, которое катализирует включение I пмоль Р32 в фосфатидплинозит — 4,5—дифосфат за I мня.

Активность очищенного препарата фосфатндилннознт- 4—фосфат киназы составляет 5,в мкмоль И/мин ~'« мг валка. Выход фермента из 1г растворимых белков мозга с оставляет О,18 — 0,2 мг.

2. Изучение квиетических характеристик фермеата.

Был проведен анализ кинетических параметров активности полученного фермента по отношению к АТФ, ГТФ ■ фосфатидилмнозит—4—фосфату. Полученные данные представлены на рнс. 4. \л* обработки данных использовалась компьютерная программа НЫгРПТ.

Рис. 3 Зависимость активности фосфатидилннозит-4— фосфат— киназы от концентрации субстрате в координатах Лайнуивера-

Берка.

Кажущаяся константа Михаэлис» - Ментен для АТФ и ГТФ.. составила 25 мкМ и 177 мкМ, соответственно А зависимость

активности фосфатядиляноэет— 4—фосфат киназы от концентрации фосфатндилияознт —4—фосфата ■ координатах Лайнуивера — Берна представляет два линейных участка, дм одного аз которых значение кажущейся константы равно 50 мкМ, а для другого 8 мкМ. Подобное свойство, по-видимому, объясняется наличием двух центров связывании липидяого субстрата или эффектом отрицательной кооперативвостя. Кроме того в недавней работе (Anderson, I'>91) ■ охарактеризованы две формы фермента с одинаковой молекулярной массой, во имеющие различные кинетические свойства. 1. Ажтяваторы в ингибиторы. '

Имеется весьма незначительное число данных в вопросах регуляция активности фосфатндилинозит—4—фосфат—кнназы. Но поскольку этот фермент обеспечивает синтез фосфатидЯлннознт— 4.5-днфосфата. который подвержен быстрому обороту в процессах клеточного метаболизма, можно предположить наличие сложных механизмов регуляция его активности с участием различных факторов. Одни нэ них, жокформационное состояние фермента, которое определяется рН я ионной силой среды, а также присутствием каких—либо селективно связывающихся с этим ферментом - веществ. Поскольку реакция синтеза фосфаТ1!ддлнпоз!гг- 4,5—дифосфата _ двух субстратная, с участием молекул фосфатнднляяозят—4 — фосфата я АТФ, то предполагаемые эффекторы должны быть связаны с тем пли другим участком связывания этик субстратов па ферменте, что не исключает и аллостернческой регуляции. Другпм фа гором может выступать изменение физико—химических свойств субстрата. Принимая во внимания этя расеуждеивя, мы заключили, что при первичном пояска активаторов я апгвбнторов, исследуемого фермента, спектр веществ должен Сыть достаточно широк. Для скрининга нами были выбраны различные вещества наиболее часто используемые для изучения процессов фосфорвлнрования. Это — антагояисты кальмодулииа (калмддазолгум и W7), тетрадекапондфорболацетат, производные фенотиазина я изохяяолина ( трифторпераэнн н Н7), ляпиды (1,2—дполеоилгляцеряя я церамяд), а также ряд известных и литературы природных клеточных модуляторов, в числе которых белок — яейромодулян (В—50), фосфатндклсер ин я цАМФ. Подобный выбор веществ объясняется тем, что в литературе накоплено множество данных об их влияния па ряд Процессов, происходящих при траясдукцяя клеточных сигналов. К ним относятся активация различных прогеиякиназ, изменения проницаемости я структуры мембрая я др. Представлялось интересным установить их влияние иа активность

фосфатидилянознт-4-фосфат киназы в условиях In vitro, с

использование»« очищенного фермент«.. Полученные данные представлены на Рис.4 (и.бя.г^,*)'

Контр. Н7

В-50 ЦЕР

«s

о

МО

до

100

Контр. N7

Ц*Р-

оЛМР

а)

«м

i

{ 10 . <»0

о

wr Цо0.

Рис 4 (а,б,в) Влияние различных веществ на активность фосфатидилинозит—4—фосфат—кипазы в условиях использования в качестве субстрата чистого фосфатидилинозит—4—фосфата.

'Список сокращений используемых » схемах: КМ - шлмидезолнум, ТФ -трифторперазин, Н7 — (I — (итохинолинсульфонил) —2 — мегилпиаеразин 2Н£11> .!'■' VV7 - (N- (в-аминогвкскл)-5-»лоро- t - нафталннсульфоамид] HCl. Цер. -церамид из мозга быка, ФС — фосфатиднАсернч.

Д)

о контр. КМ Н7 МП ТФ оАМР

Рис 4 (г, д. в) Влияние разливших веществ иа активность фосфатидилияозит — 4- фосфат— киназы в условиях использования в качестве субстрата смеси фосфатидилянозит—4—фосфата и фосфатидклсерина. при соотношении (3:7), обеспечивающем максимальную активацию фермента.

п

Анализируя ) полученные результаты можно заключить, что фосфатидиликозит — 4 — фосфат — киназа - содержит регуляторный участок гидрофобной природы, ответственный за связывание с поверхностью липндных мембран. Так, мембраио—активные вещества, \У7 н трифторперазиы в отсутствие фосфатндмлсерина вызывают активацию фермента, во а присутствии этого липнда ингибируют фос<1х>рплированна фбсфатндилииознт—4—фосфата. Вещества действующие на АТФ—связывающий центр - Ш » алкалоид кверцетии (ипшюу,1990) нигнбируют фосфатидилииозит— 4 - фосфат—квнаэу. подобно другим киназам. Среди потенциальных естественных клеточных эффекторов, интересные данные получены для быстрометаболязируемого н клетке вещества — цАМФ. При максимально достижимой физиологической коицентрации 20 мкМ, ои оказыиает активирующее влияние на фосфорилнроваииа фосфатидилииозит—4—фосфата, а при более низкой концентрации 10 мкМ нигибирует. Два короткожнвущих компонента биомембраи, 1,2 -диаднлглицерин (Табл. 2) и церамид также проявляли подобный эффект. При высоких концентрациях они активировали фосфаткдвлииозжт— ч— фосфат — кгиазу, а при чзких иигабировали

Концентрация 1,2-ДМ", М 0 ю-« Ю-5 ю-» Ю-' 10-е

X включения Р32 * ФИФ0 100 223 124 95 63 58 '

Табл. 2. - Влияние 1,2—диолеоилглицерива иа активность фосфатндилинознт—4 — фосфат киназы.

Тетрадеканоилфорболацетат ■ том же диапазоне исследованных концентраций (10~® — Ю-* М) ие оказывал влияния на активность фосфатидилхиоэягт—4 ~ фосфат киназы

Сильными активаторами показали себя вещества поли кати он ной природы - спермин, спермидия я антибиотики аламеггацин и неомиции (0ии1,1990). По-видимому, влияние этих веществ обусловлено снижением аффективной концентрации ионов до

физиологических значений, благодаря нейтрализации зарядов фосфатидилииозит—4—фосфата я фосфатидилииозит-4,5—

и

дн фосфата. При этом уменьшается электростатическое отталкивание везикул субстрата и соответственно происходит увеличение скорости ферментативной реакция. Обобщая полученные нами данные и опубликованные • литературе, можно заключить, что одним из определяющих факторов активности фосфатядилинозит—4—фосфат киназы является модуляция физико-химических свойств поверхности субстрата, к числу которых относится заряд, текучесть, кривизна поверхности и пр.

4. Препарат явный синтез 32Р-мечеяого фосфат» лилино зит-4,5-ди фосфата.

О последние годы интенсивно развиваются исследования , связанные с изучением на молекулярном уровне роли фосфоинозитядов в продуктов их метаболизма в процессах нормального функционирования живой клетки, а также выясняется участие этих ляг V» ■ механизмах возникновения и развития некоторых патологических явлений в организме. Особую ценность для таких есследоганий представляет применение радиоактивно— меченых фосфоинозитядов, позволяющих получать быструю информацию о метаболизме этих веществ. Синтетически* подходы не позволяют решить эту задачу, «виду сложности и многостадийное™ получения подобных соединений. Известные коммерческие препараты, содержащие тритневую метку в остатке мио—инозита мало доступны, ввиду их высокой стоимости. Кроме того, обладающая низкой энергией излучения тритневая метка неудобна для регистрации. Все вышесказанное, подтверждает актуальность разработки способа получения ■ меченого радиоактивным фосфором аналога фосфатидиливознт—4,5-днфосфаг*. Для этих целей, был выделен и счищен, в препаративном масштабе фосфатядялниоэнт— 4—фосфат из мозга крысы. Также из мозга крысы был получен ■ две стадия, включающие осаждение сульфатом аммония и гель —фильтрацию иа сефадексе частично - очищенный, активный препарат фосфатилнлнноэят—4 — фосфат кинази. Реакция фосфорилированйя фосфатидилиноэит — 4 —фосфата, полученным ферментом ■ присутствии (у —Р32|АТФ, приводит к образованию фосфатидилииозит — 4,(5—Р*2) — дифосфата (рис.бА).

. -ФИ

ОМОН о OHOir О л

chj-ocoil, chj-ocokj 'crtf,

OH OH

- 01 гки высших жирнui «»слот ■ природном фосфвтндилмнашп—4-фосфат* из мозга крысы

Рис.6 Схема синтеза фосфатндялинозит — 4,|5' — 32PJ— дифосфата (а) и авторадиограмма Т СХ продуктов реакции (б).

Условия ферментативного синтеза были оптимизированы, па основании изучения свойств фосфатидилннозит—4—фосфат кпнаэи. Онн включают г себя следующие моменты; а) в качестве субстрата используется смесь фосфатидилинознт—4 — фосфат в Ф С, пря соотношении 3:7. Конечная концентрация фосфатидялнкоэит—4 — фосфата о г акцнонной смеси 100 мкМ, б) концентрация АТФ с реакционной смеси 50 мкМ , в) концентрация «оно» Мд2 + 20 мМ, г) время реакции 30 мни, при температуре 30°С. В этих условиях пс происходит дефлдациц образуемого липида и в тоже время достаточно полно протекает реакция фосфорилированся фосфатидилннозит — 4- Ъосфата. При этом чея включеппоя радиоактивность соответствует по данным ааторадпографип тонкослойной хроматографии продуктов реакция

фосфатидилннозит — 4,5—дпфосфлту (Рис.бб). После экстрагирования реакционной смосп по методу фолча, фосфолвпнды . разделяли на индивидуальные компоненты хроматографией на сорСекто. а четвертичной аммониеоой группой QMA-ACCEL ("МШ1рог",США) нлм его аналоге аминосилохроме. Выход реакции, в пересчете па включенный в фосфатвдалмноэит-4,5—дп фосфат |5' — Р32) — фосфат, составил 10% от использоваиого [у — Р^АТФ. Химический гиход реакции синтеза фосфатидилннозит - , —ди фосфата составляет 5075%, в зависимости от активности фермента. Идентичность полученного препарата фосфатидилннозит—4,(5 — р32| — дифосфата н природного аналога подтверждалась данными тонкослойной хроматографии на гмпрегяировавном оксалатом калия силикагеле . Для подтверждения структуры и биологической активности, и лаборатории эндохрииологии ВКНЦММН (завлаб, проф.

В.А.Ткачук) проводились эксперименты но гидролизу меченого препарата фосфатидшшиозит—4,5—дифосфата фосфолипазой С из тромбопитов человека и разделению водорастворимых продуктов гидролиза с помощью ВЭЖХ яа колонке Partlsyl — SAX

/

"Beckman'.CIUA). Бым> показано, что среди продуктов гидролиза , 1СЛ радиоактивность сопутствует пику, принадлежащему 1,4,5— тозпттрнфосфату. Полученные данные полностью подтверждали идентичность структуры и свойств меченого препарата природному (юсфатвдилянозит—4,5—дифосфату. Удельная радиоактивность грепарата составляла 5 мг.С1/ммоль. Радиохимическая чистота по даным высокоэффективной тонкослойной хроматографии 99%.

I. Взавмосаязь ягам фосфатидилвпозит-4,5-ди фосфат» в ij отеолнтачесхой ажтявацвв вротевюипаэы С.

шаляз литературных данных, позволяет выявить прямую :орреляцню между уровнем обмена фосфопнозпт—содержащих япядоэ в функционированием протеннкяназ. Ряд данных видетельствуют о том что, активация фосфатидилинозит— 4— >осфат киназы в протеннкиназы С каким —то образом связаны. Tax ри обработке нитактных к\еток фосфоляпаэой С, форболовымп фврамн, хемоаттракгавтами, вызывающими транслокацию ротеинкнназы на мембрану в последующей активации, роисходит накопление протеолитпческого фрагмента этого >ермента (киназы М). В то же время перечисленные вещества ызывакт в другой эффект в клетке, а именно увеличение ,, юсфорилпрован'ия авозат—содержащих липидов. Исследованные , амн свойства фосфатидилинозит-4—фосфат киназы и их сходство известными характеристиками киназы М позволили предположить, го между этими двумя ферментами существует функциональная эаимосвязь в выполняемых клгточиых функциях. Доказательства в ' ользу этого предположения представлены ниже. На рис.7 показаны бзультаты In vitro эксперимента, который состоял'в следующем: ксокоочищеяный препарат протеннкиназы С -''подвергался граннченпону протеолизу вод действием трипсина, в результате его образовывалась протеолвтнческяе фрагменты с молекулярной ассой 45—50 кДа и 35 — 38 кДа . Этот процесс мноЬжратно описай ь ператури и продукты трипсннолкза детально охарактеризован»!, ¡осле остаиовкн реакции ингибитором трипсина, я системе./ задавали оптимальные условия для проявления фосфатндилннозву— —фосфат кяназиой активности, т.е. связывала ионы Са2+ . в , 1еличивалн концентрацию Mgi+ . Затем добавляли в систему »нкулы, приготовленные из очищенного из мозга крысы осфатидилпнозит—4—фосфата,; , и инициировали реакцию ' осфорилировапия добавлением" АТФ: 'Гакяе же манипул ии »раллельно проводили для иативной протеннкиназы С. Как видно ' к рис, 7а), нативная протеинкиндза С не способна фосфорнлировать

фосфатидилинозиг — 4 — фосфат, однако фермент обработанный трипсином, приобретает такую способность. Причем максимальный уровень включения в фосфатидилинозиг-4,5- дн фосфат

достигаете уже к 3 мин. Дальнейшее снижение включения меткя хорошо объясняется известным фактом расщепления протеинкиназы С трипсином на более мелкие фрагменты утрачивающие ферментативную ктив кость. В параллельном опыта (рис. 76)) измеряли включение Э2Р о гостов Ш—в иатнвьой в обработанной трипсином протеинкиназы С. Результаты эксперимента наглядно показывают, что в результата трипсинолнза происходит снижение Са — фосфслип \ зависимой активности фосфорилироваиия гветоиа .

&

6) *

я! щ

и ,¡1

У

I

Контр.Натиен. 1 мин. 3 мин. 5 мин. ферм.

100 ! £0 {. 60

\ 40 ' 20

0

Нативн. 1 мин. 3 мин. ферм.

Рис. 7. Включение ИР в фосфатнднлынозвт-4 — фосфат (а) и гистон III—в (б) из |у—КР]АГФ различными формами протеипхинаэы С. Для подтверждения полученных результатов, нами использовался следующий экспериментальный прием. Поскольку известно, что протеинкииаза С ие способна, а фосфатмднляиозит—4—фосфат киназа может использовать ГТФ в качестве донора фосфата, был проведен эксперимент аналогичный вышеописанному, за тем исключением что АТФ был заменен на ГТФ. Полученные результаты (рис.8) показывают, что нативная форма протеинкиназы С ■ присутствии ГТФ и« способна фосфорилировать

фосфатядкликозят— 4 —фосфат, но расщепление трнаснном вызывает проявление такой функция (ряс.Ба)). В то же время, ни натиапая протеинкнназа С, ни обработанная трипсином не способны фасфоряляровать гистон используя для этого ГТФ (ряс. 86)).

Контр. Наги вн. 1 мин. 3 мин, ферм.

Нативн. 1 ммн. ферм.

.на?..

Змии.

Рис. 0. Включение 3-Р в фосфатидилияозят-4-фосфат (а) я гистон П—в (б) яз (у- ^РЦТФ различными формами протеиикиназы С.

Представленные данные позволяют сделать заключение о том, что гаталятяческнй фрагмент протеинкиназы С (кипдеа М) способен наполнять функцию фосфатндилннозпг—4—фосфат ~ киназы. Тоскальху процесс взаимопревращений фосфонпозитцдо» гроасходит на плазматических мембрап&х клеток, нами , был гроведея эксперимент по влиянию экзогенной киназы М на ¡юсфорнлнрованпё фосфатиднлкнсзит—4—фосфата я препарате рубой мембранной фракции, полученной центрифугированием омогената и» мозга крысы при 105000д. На рнс.9 показано, что [нхубацня мембран с препаратом кинази М, полученным

расщеплением гомогенной протеинкинаэы С трипсином я последующей очисткой каталитического фрагмента хроматографией на ДЭАЭ—целлюлозе, вызывает усиление включения фосфата из АТФ в фосфатиднлинояит—4,5—дифосфаг, как в присутствии экэогенно—добавленного фосфатидилпнознт—4—фосфата, так и в •го отсутствие.

250

* 20Г 5 I 150 # f 100

* 50

о

ФИФ

ПК м - + +

Pec. 9. Включения 32Р из |у-иР]АТФ в фосфатидплинозит—4— , фосфат грубой мембранной фракции мозга хрысы очищениой кииалой М.

Для подтверждения идентичности структур и свойств фосфатидилиноэит—4—фосфат ккназы и протеинкинаэы М были проведен дополнительный эксперимент. Для очищенного препарата фосфатндцлянозит—4—фосфат—кинаэы из мозга человека проверили его способность фосфорклировать уникальный пептидный субстрат Р—U ( TyrLysLyiAxgPro'TVrSerI.ysArgThrAU ), который фосфорилируется только протеникииазой Си не фосфорилируется цАМФ — зависимой и Са2+,калмодулин-Зависимой {II—типа) протеквкина^ами. Анализ радиоактивности, яключенней в пептид при осаждении на фосфоцеллюлозный фильтр продуктов реакции, а также радиоавтограмма разделения этих продуктов в 20% диск— электрофорезе в присутствии додецилсульфата патрич, ясао показали способность фосфатидилипозит—4—фосфат—киназы катализировать фосфорнлированне этого пептида.

^сновывглсь на полученных результатах, а также на известных фактах, что и протеивкиназа С, и проггеаза кальпв- и в присутствии

»

ионов С«24" в основном локализованы на мембране и, более тоги кальпанн может быть ассоциирован с протеннкннаэой С , мы можем предположить следующую гипотетическую схему взаимосвязи протеолитнческой актгиацяи протеинкиназы С и фосфатидилинознт—4—фосфат мшазы (Рис.10),

'нс.М2 Гипотетическая схема передачи трансмембранного сигнала гри рецептор—зависимом гидролизе фосфатцдклинозит—4.5т кИ фосфата. Цифрами 1 — 4 обозначены следующие' -события: 1) (эанмодействые лиганда с рецептором. Ахтявация фосфолишэы С и идроляз фосфатиднлияозит—4.5—дифосфлта .с образованием ггоричных посредников; 2) Увеличение внутриклеточной :онцеитрации кальция, вызванное 1,4,5—ннознтгрифосфатом; 3) ■^анслокацня >на мембрану д активация протеинкиназы с, и ротеазы кальпаина; Й) . щротеолиэ щротеинкиназы С я юсфор'илярование фосфатидилянозит—фоефота.

Список используемых сокращений а схеме: ОН - фосфатвдгешноэит.'фиф -осфаткдилиноэит—4-фосфаг, ФИФ2 - фосфатидиллноает -4,5-дифосфэт,1ПК — протеинкинам С, ПК М - протеолитичесхий фрагмент протеинкиназы С, Р - серкопламютический регикулум.

Активация фЗсфатиднлинтит—специфической фосфолипазы С, через соответствующий клеточный рецептор будет приводить х резкому уменьшению концентрации фосфатидилннозит—4,5— ди фосфат« и последующему увеличению концентрации Са3 , которое, в свою очередь, вызовет траяслокацию протеинкииазы С на мембранные структуры н активацию фосфорилировапия. Одновременно будет происходить транслокация на мембрану я, соответствующая активация кальпанна, который, расщепляя иативяую пр< еинкяназу С будет увеличивать я прнмембраняом пространстве концентрацию киназы М. Данный же фермент через фосфорилироваяие фосфатидилннозит —4 —фосфата будет восстанавливать уровень фосфатидилинозит—4,5—дифосфата. Т.е. протеолитический фрагмент вротеинкиназы С может выступать в качество обратной связи при рецептор—зависийом гидролизе фосфатидилииозит—4,5—дифосфата .

ЕЫБОДЫ

1. Разработан метод выделения фосфаТЕДНЛивознт—4 — фосфат киназы из мозга 4i.: >века.

2. Исследованы физико-химические свойства и Кинетические параметры фермента. Проведен скрлиапг возможных активаторов н ингибиторов. Показано, что существует возможность коррекции обмена фосфоинознтндов веществами ляпофильноб природы.

3. Разработан способ получеаия фосфатидилииозит— 4,|5 —Р32] — дифосфата .

4. Установлена взаимосвязь между прстеолитнчвской активацией протеин киназы С и синтезом полпфосфоинозигкдов, Показало, что протеолитический фрагмент (кнназа М) способен в определенных условиях in vitro выполнять функцию фосфатидилииозит - 4—фосфат киназы.

5. Предложена гипотетическая схема развития событий в процессе трансмембранной передачи сигнала при рецептор—зависимом п ролизе фосфатидилннозит—4,5—дифосфата.

Слисок работ, опубАЕЕКОваиных по тане диссертации.

1. О.К.Туеупов, C.Ii.Северян, "Ферментативный синтез — меченного фосфатидилииозит—4,5—днфосфата н его применение для изучения метаболизма поляфосфоинозитидов," Материалы симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников а регуляции ферментативных реакций", Петрозаводск, 1080, стр. 55—59.

2. О.К.Туеупов, А-Л.Гаврилов, С.Е.Северви, В.П.Швец. 'Выделение фосфатидилянозит—4—фосфат хниазы из мозга человека," Симпозиум "Биохимия опухолевых клеток", Минск, 1990, стр.6? —

ез. ,

3. O.K.Tusupov, S.E.Soverln, V.I.Shvcls, "Proteolytic fiagment of protein Ыпагэ С (hibbss m) pho:phorylatei In vitro phosphatldyllnobttol—4 — pboiphste," Blochem.Blophys.Rea.Commua., 1S91, v.176, p.1007-1013.

4. S.E.Sevcji.1, YN.Gubin, O.K.Tusupov., "Pbosphoiylatlon and dffphoiphorylati >n of neuronal proteins — pivotal route In Eeuroi^crftlon", Abstracts of Symposium on Chemistry ot Peptides end Proteins FRG — USSR, p.33, Aachen, 1991.

5. O.K. Tusupov, S.B.Severln, V.I.Shvets, "Purification and enzymatic properties of phosphatldylinosltol—4—phosphate kinase from human brain", FEBS Lett., 1093 (In press). y^.-----

■ fyr*.

Зак.вЗЭ тар. 80 экз.Ротапрздт t.iHTCT M.lluporoEQKaii ул.,дл