Молекула адгезии нервных клеток из мозга быка: клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЕИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

РАКИТИНА Татьяна Владимировна

МОЛЕКУЛА АДГЕЗИИ НЕРВНЫХ КЛЕТОК ИЗ МОЗГА БЫКА: КЛОНИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ -НУКЛЕОТЩШОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ кДНК.

02.00.10 - Вкооргашческая химия, хтгая природных и физиологически активных веществ

Автсрофбрат диссертации на соискание ученой степени кандидата хигсгсвсккх наук

Москва - 1990

, (

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор В.М.Липкин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор С.Б.Аллахов кандидат химических наук М.А.Эльдаров

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии км. В.А. Энгельгарда РАН

Защита диссертации состоится " Ч " 1993 г. в

10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институт© биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биооргайической химии РАН.

Автореферат разослан " 4 " хЛЛ&р^й 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук / ' В.А. Несмеянов

Актуальность проблемы. Одной из важейших задач современной физико-химической биологии является изучение процесса межклеточных взаимодействий. Клеточная адгезия играет существенную роль как в морфогенезе и гистогенезе, так и в поддержании структуры ткани во взрослом организме. Установлено, что на молекулярном уровне процесс межклеточных взаимодействий зависит от присутствия специализированных белков клеточной поверхности, называемых молекулами клеточной адгезии (САМ). Одним из наиболее хорошо охарактеризованных представителей этой группы белков является молекула адгезии нервных клеток (NCAH).

Известно, что псам выполняет функции нейрон-нейронной, нейрон-астроцитнсй, .астроцит-астроцитной адгезии, участвует в нервно-мышзчном узнавании, в формировании нервно-мышечных синапсов и нервных связок. Он представляет собой мембранный' гликопротеин и экспрессируется в клетках нервной и мышечной ткани в виде нескольких близкородственных полипептидов. Молекулярные веса (М.в.) трЗх основных изоформ бежа незначительно различаются у разных видов и составляют приблизительно 180 140 и 120 кДа. Различные формы белка являются продуктами экспрессии одного гена и образуются за счбт альтернативного сплайсинга.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в изучении свойств и структурных особенностей молекулы адгезии нервных клеток, не до' конца понятной остаётся роль различных изо-форм бежа в адгезивных событиях и взаимосвязь NCAM (как и других белков клеточной адгезии) с ваянейашми регуляторными систе.'ла'л! клетки- Не идентифицирована такае полная структуре семейства KCAU, включая тканеспецифзческие варианты белка.

Для решения этих задач и для дальнейшего изучения связи между структурой и функцией молекул клеточной адгезии необходимо накопление знаний о первичных структурах белков этого семейства. •

Цель работы. Данная работа проводилась в лаборатории белков"гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в рамках комплексного исследования белков аденилатциклазной системы (АЦС). В ходе работы по выделению и определению первичной структуры кальмодулин-независимой аденилатциклазы (АЦ) были получены фрагменты кДНК, кодирующие одну из изоформ белка адгезии нервных-клеток (ЫСАМ-140).

Целью представленной работы являлось клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей молекулу адгезии нервных клеток из мозга быка, реконструкция полноразмерного структурного гена ггсаы для его экспрессии в различных системах с целью выявления предполагаемой нами взаимосвязи белка адгезии нервных клеток с АЦС.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе клонированы фрагменты кДНК, составлявдие полный- структурный ген (структурная часть длиной 2559 пары оснований (п.о.)', 5' и 3*-нетранслируемые области длиной 349 и 666 п.о., соответственно) 1гсам-140 из мозга быка и определена их нуклеотидная последовательность. Выведенная на основе нуклеотидной аминокислотная последовательность белка содержит 853 аминокислотных остатка, 19 из них входят в состав лидер-ного пептида. Вычисленная молекулярная масса белка без лидер-ного пептида составляет 91735 кДа.

Показана высокая степень гомологии ncam из мозга быка с молекулой адгезии нервных клеток из крысы, мыши, человека и с другими представителями белков клеточной адгезии.

Реконструированный структурный ген ксан-140 клонирован в плазмидном векторе и использован для получения экспрессии белка в бесклеточной система трансляции In vitro и в ооцитах Xoenopus Laevis.

Получены данные, позволяющие предположить существование определенной взаимосвязи системы клеточной адгезии и АЦС.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты исследований докладывались на Двустороннем советско-американском симпозиуме по молекулярной нейробиологии (Киев, 1991г.) и на 2 Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991 г.).

Объбм работы. Диссертация изложена на (Q& страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает US наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Введение.

Ранее в нашей лаборатории в рамках работы по структурно-функциональному изучению белков АЦС была разработана методика выделения кальмодулин-независимой АЦ, основанная на аффинной хроматографии солюбилизата мембран коры головн&го

мозга быка на иммуносорбенте. Моноклональные антитела (MAT-I) , испольгуеше в качестве литавда при. приготовлении ишуно-сорбента, проверялись на способность ингибировать активность аденилатциклазы и иялунопреципитировать фермент после иммобилизации их на белок А-сефарозе. Препарат, получаемый с имму-носорбента при использовании общепринятых методов элюции, аденилатциклазной активностью не обладал. Однако, незначительная АЦ активность наблюдалась в препарате, когда комплекс антиген-антитело разрушали путбм.восстановления дисульфидах связей в молекулах иммуноглобулинов. Электрофореграмма препарата показывала, что он содеркит преимущественно белок с М.в. 140 кЦа, в меньших количествах выявлялся белок с М.в. 180 кДа. Оба белка давали перекрбстную иммунологическую реакцию с политональной сывороткой, полученной на белок с М.в. 140 кДа, элюированный из геля. Эти поликлоналыше антитела также значительно подавляли аденилатциклазную активность и после иммобилизации на белок А-сефарозе обладали свойством связывать фермент из раствора. Белок с М.в. 140 кДа использовался в последующих структурных исследованиях, проводимых путбм параллельного анализа аминокислотной последовательности бел-ija и нуклеотидной последовательности соответствующей кДНК.

Сравнение установленной наш первичной структуры с последовательностями из EMBIr-башц показало высокую степень гомология исследуемого белка'с молекулами адгезии нервных клеток из мыши, крысы, человека и из других источников. Структура иолы из быка ранее определена не была. Это свидетельствовало, что выделенный нами белок представляет собой одну из изофоры белка адгезии нервных клоток, а именно, HCAli-140 из

мозга быка.

Исходя из использованного метода выделения белка мокло было выдвинуть несколько гипотез, объясняющих полученный результат: I) АЦ и NCAM имеют идентичные антигенные детерминанты и MAT-I взаимодействуют с обоими белками; 2) АЦ способна взаимодействовать с ncam и соочицаться с ним в процессе выделения; 3) ncam способен активировать АЦ непосредстЕешга или через другие белки. С целью проверки приведенных гипотез собранный из клонированных фрагментов кДНК полноразмерный структурный ген ncam-i40 был использован для получения экспрессии белка в различных системах'.

2. Выделение мРНК и синтез кДНК.

Выделение мРНК из мозга быка проводила стандартным методом с использованием на первой стадии буферного раствора на основе хлорида лития и мочевины. Для ингибирования РННаз и выделения недеградированной РНК был использован ванадилрибо-нуклеиновый комплекс. Отсутствие при выделении заметной деградации РНК определяли по наличию в электрофоре граммах ага-розного геля чЗтко Еыракенных полос 28s и I8s рРНК.

Дальнейшая очистка мРНК проводилась с помощью аффинной хроматографии полученного препарата тотальной РНК на олиго-(dT)-целлюлозе. Выделенная после 2-х циклов хроматографии поли (А )+-РНК составила 3,5% от общего содержания РНК в клетке, что согласуется с данными литературы.

Синтез первой цепи кДНК проводился с помощью РНК-зави-симой-ДНК-голимеразы (обратной транскриптазы из вируса нне-лобластоза птиц) в присутствии четырёх дезоксиргбонуклеозид-

трифосфатов. В качестве затравки синтеза использовали статистический набор олигодезоксирибонуклеотидов длиной от 8 до 20 п.о. (рассеянная затравка), олиго(с1Т)12_1а или олигодезо-ксирибонуклеотидные зонды, эффективность синтеза первой цепи кДНК составляла 30, 26 и 3%, соответственно. Синтез второй цепи кДНК проводился в той же реакционной смеси после термической дезактивации обратной транскриптазы и незначительного изменения состава буфера. Для синтеза использовали ДНК-поли-меразу I E.ooli и РНКазу н, выход продуктов реакции составлял 85%. Далее, реакционную смесь прогревали для инактивации ферментов и добавляли ДНК-полимеразу фага Т4 с целью получения молекул кДНК с тупыми концами.

3. Создание клонотек кДНК.

В качестве вектора для клонирования кДНК были использованы плазмиды рис 8 и pSP 64. Полученную кДНК встраивали в вектор путбм лигирования по тупым концам. Для этого плазмиды расщепляли по сайтам эндонуклеаз рестрикции Sma I или Hind II и дефосфорилировали, чтобы избежать самосшивания линейной плазмидной ДНК. Реакции лигирования проводили с помощью Т4 ДНК-лигазы, для уменьшения вероятности образования рекомби-нантов со вставками нескольких молекул кДНК вектор брали в десятикратном весовом избытке. Полученным набором рекомби-нантных молекул трансформировали компетентный клетки E.ooli (штамм ын-1). Выход рекомбинантов обычно составлял itf3 на I мкг кДНК. Количество нерекомбинантных клонов не превышало 15%. Полученные клонотеки рассовали на чашки Петри с ьв-ага-ром, содержащим ампициллин, с плотностью рассева от 3 до 5

тысяч колоний на чашку диаметром 90 мм. Выращенные колонии переносились на нитроцеллюлозные фильтры для последующего лизиса.

4. Поиск клонов, содержащих фрагменты кДНК ncam и определение их нуклеотидной последовательности.

Скрининг клонотек кДНК проводился путбм гибридизации колоний Е. Coli, лизированшх на нитроцеллюлозных фильтрах с олигодезоксирибонуклеотидными зондами, радиоактивно меченными при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4 и [7- Р]АТР, или фрагментами кДНК, меченными методом ник-транслдции. Олигоде-зоксирибонуклеотидные зонды были синтезированы (к.х.н. Быст-ров Н.С.) на автоматическом синтезаторе фирмы Applied Blosis-tem. Структура зондов выводилась из аминокислотной последовательности пептидов - фрагментов исследуемого белка или соответствовала определённой в процессе работы нуклеотидной последовательности кДНК. Из клонов, дащих положительные сигналы гибридизации, выделялась плазмидная ДНК, определялся размер содержащихся в плазмядах вставок кДНК и проводился их ре-стриктный анализ.

Для определения нуклеотидных последовательностей вставок кДНК плазюцщ расщеплялись соответствующими эндонуклеазаш рестрикции, в ростриктные фрагменты при помощи одного из [а-32P]dMTP и фрагмента Кл§нова ДНК-полимэразы I Е. ooli вводилась метка. Далее, меченные по двум концам фрагменты ДНК расщеплялись одной или несколькими подходящими рестриктазамя для получения гомогенно меченных укороченных фрагментов, которые после этого разделялись электрофорезом в 555 шлиакриламздном голе (ПААГ). Еыделенные после элюцни из ПААГ гоглогенно мечен-

ные фрагменты непосредственно использовали для определения их нуклеотидных последовательностей модифицированным методом Ма-ксама-Гилберта в твбрдофазном варианте, разработанном Чувпило и Кравченко (Чувпило и др. 1984).

Первоначально, на основе установленной аминокислотной последовательности пептида ((Iys)-T3T>-Tyr-Asp-Ala-Lys), полученного при расщеплении исследуемого белка лизилспецифичной протеиназой из Achromobacter lltlcus, был осуществлен синтез смеси 14-звенных олигодезоксирибонуклеотидных зондов I (5'-aa(a,g)tggta(c,t.)ga(c,t)gc-3'). Используя зонды I в качестве гибридизационной пробы, в клонотеке кДНК из мозга быка размером 2x10 клонов, полученной с помощью рассеянной затравки, был выявлен клон рАс III, содержащий вставку кДНК размером 450 п.о. Расположение ' фрагментов кДНК выделенных tклонов и олигодезоксирибонуклеотидных зондов,, используемых при клонировании кДНК, показано на рис. I. В выведенной из установленной структуры кДНК клона рАс III аминокислотной последовательности были найдены структуры пяти пептидов, прина-

пр '

длежащих исследуемому белку. С помощью Р-меченной методом ник-трансляции вставки кДНК клона pAo III в этой же клонотеке были обнаружены клоны рАо 3, рАо 4, рАо 73 и рАс 87. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК этих клонов подтвердил установленную структуру кДНК клона рАо III, но практически не дал новой информации.

Для поиска клонов, содержащих вставки кДНК, кодирующие другие области нсам, была создана новая клонотека с использованием в качестве затравки синтеза первой цепи кДНК олигоде-зоксирибону}слеотидных зондов III (5'-ggagccgccgtcgtcttgct-3' )

и IV (5'-gcgctgatctcgcccaggcc-3'), структуры которых соответствовали нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК клона рАс III. В этой клонотеке с помощью зондов I, II (5'-ссасасст cctcgcc0at-3') и V (5'-ctggtcgagtccacgaagcc-3') были обнаружены клоны рАс I, рАс 2.1, рАс.2.3, рАс 5, рАо 13, рАс 18 и рАс 32. Параллельно с этим, для поиска участков кДНК, кодирующих С-концевую область белка, была создана клонотека с использованием в качестве затравки синтеза первой цепи кДНК олиго(<Ш. В результате скрининга этой клонотеки с помощью олигодезоксирибонуклеотидных зондов III, IV и V был обнаружен

Pstt Clal BamHl MdJ ЛЬ/ Psll EcoRl I 500 I \a00 ^ ^ ¡500 ^ 2000

-!9f

200 VII. ~ VI pAc22

400

600

П.-I . IV . III

pAcIS <■

pAcÜ

pAc 2 1

pAc 5

pAc?3 pAc32 pAc4 pAct pAc 3 pAc 13 pAc Ш pAc211

pAcje pAc S7

0

2500

3000

с

.V

pAc П

йш. I. Частичная рестриктная карта кДНК нсам-140 из мозга быка и расположение фрагментов кДНК выделенных клонов. Заштрихована кодирующая исая область кДНК. ЧЭрными прямоугольниками обозначена олигодезоксирибонуклеотидные зонды 1-711, использованные при клонировании и скрининге.

клон pAc 22, размер вставки кДНК которого превышал 2700 и.о., затем с помощью радиоактивно меченного методом ник-трансляции фрагмента кДНК клона рАс 22 были выявлены клоны рАс 21Л и рАс 43.

Анализ установленной нами нуклеотидной последовательности вставки кДНК клора рАс 22 показал, что она содержит значительную часть структурного гена исследуемого белка (2109 и.о.), терминирующий кодон и фрагмент З'-нетранслируемой области размером 663 и.о.. Определение полных или частичных нуклеотидных последовательностей вставок кДНК других найденных клонов выявило, что все исслэдованные фрагменты кДНН лежат в структуре клона рАс 22, и их последовательности, в основном, совпадают со структурой этого клона.

Для клонирования фрагментов кДНК, кодирующих N-кондевой 'участок noam, была создана ещб одна специфическая клонотека. В качестве затравки при синтезе кДНК использовались "зонды VI (5'-g0actatqaatcggacatct-3') и VII (5'-tcaggatgacatctcggcct-3'), полученные по установленной структуре 5'-концевой области кДНК клона рАо 22. Скрининг. этой клонотеки проводился с помощью ник-транслированного фрагмента 5'-концевой области кДНК этого клона, в результате, были найдены клоны рАс 12, рАс 19.?, рАс 19.4. Анализ нуклеотидных ■ последовательностей вставок кДНН этих клонов позволил реконструировать полную

ч

структуру кодирующей области кДНК и фрагмента 5'-нетранслируемой области размером 349 п.о. Выведенная'из структуры кДНК (407-454) аминокислотная последовательность NCAM (I-I6) совпала а N-концевой последовательностью белка, определбнной методами белковой химии. Правильность установленной структуры

кДНК подтверждалась также еб. соответствием аминокислотным последовательностям 18 пептидов, выделенных из исследуемого белка.

•' 5. Анализ реконструированной нуклеотидной последователь- • ности кДНК, кодируицей NCAH-I40 из мозга быка, и соответствующей аминокислотной последовательности белка.

Таким образом, определение нуклеотидных последовательностей кДНК выделенных клонов позволило реконструировать структуру кДНК NCAM-I40 из мозга быка длиной 3574 п.о. (структурная часть 2559 п.о., 5' и 3'-нетранслируемые области 349 п.о. и 666 п.о., соответственно). 'Нуклеотидная последовательность кДНК и соответствующая аминокислотная поледовательность белка представлены на рис. 2.

Сравнение между собой фрагментов кДКК из разных клонов выявило ряд структурных отЛичий между ними. Для .реконструкции структуры кДНК NCAU-I40 использовались клоны, нуклеотид-ные последовательности которых в местах отличий соответствовали аминокислотным последовательностям пептидов, выделенных нами из исследуемого белка. Обнаруженные отличия представлены на рис. 3. I). 30 нуклеотидов (1405-1434), кодирующие аминокислотную последовательность одного' из проанализированных пептидов (334-341), присутствуют в кДНК клонов рАс 2.1 и рАс 13, и отсутствуют в кДНК клонов рАс 2.3 й рАс 22. 2). нуклеотидная последовательность, соответствующая' структуре пептида (585-595), сохраняется-В кДНК клонов рАс 13 и рАс 2.1, тогда как в клонах рАс 22 и рАс 2.3 между 2171 и 2172 нукле'отидами вставлен триплет AAG, что приводит к замене 589 аминокислоты Arg на дипептид (Gln-Qly). В клонэ pAo III в тон же месте

ТМТбГСМвСКТАтбТбСССЖбТМТМАеииШвТСКбПСТСАССССШССССи С». иг дСССАШСШ>ТаССМТТСЦТСААМСЬМСеСсгеСМСССАА№*ТСТССМСТТ«^

и "Г ЖЧгаНВИПИГ .УСУТТПУ УТГ8ТУ"ГУГ*Я'-

С1С АК ®Т* АМ АТС ТТГ ив АМ ОС АН ПС Мб АК КС ССА АСС ССА СМ (К ТТС Авв СМ СЕД СМ САТ ССС СТС АТС СТС 161 •»Г «Тв втс МС Т«£ ОС ССС си »а АТС АТС Твв АМ С* АМ «С С« САТ СТС АТС С!( Ш Ш № «тс си ТТС АТА стс СТС

мс ТТС мс МС АГТ СМ РС АТС 6ТС мт стс ССА ССС КС (тс см ис ам СМ МС атс ств иг КС АСС вес АК СТС ас СМ

тсс стс кс стаете тег мс есс ма вес ттсссАмвсссксбтскстевАЦАмсксмсмсмАмвммтмесмск

мсм<а«с «м'см МС 6« ТСС атс с* СТС ам «тс ПС вел ада ССС. ма АТС кс тк ста см ис см кт вСС атс см

сдд гс см тат есс со ам стс см ас ат ств ест стс тк аст тве см <гс мс см етв мс атс кс тсс мс стс тп вес

ТК СС МТ ССС КТ АТС та ти ТТС ОА ж «т см ств СТв ССС МС ТСС МС ТК АОС АК АТС МС АТС ТК АК КС СС» 1СС Т/|-»|»-Я»-АI• -Т*г-11»-4вг-Т /-С 1«ЧмЧм-*Т9*1«г-Мг-^^-Туг-|ег-Ав*»11*4/»-11 Ну*»-

СМ ТТС СТС СТТ СТС СМ вСА САТ АСТ ССА ТСС ТСА ССА ТСС АТС МС СМ «те «М КАТК ТСГ МС «А « ПТ САТ

«И СМ мт см АК ТСТ АП АМ СТС АМ СГС АТС М СМ МС мс кс ТСС ССС АТС СМ ис тк СШ ГС МА «с ш га

до

ЯП-»*»

Ш»>)и*

в»-мое ммю

КМ-Х74

СМ ССС МС ам

I ССА Ю АМ СТС СМ АСС стс ССС АК МТ (СС АСА СМ АТА АМ СТ» ЛЩ *» Ж Ш> ШХ Г

• ...... • • - к*

ТЯССТТТМАСММАМАСК ТААВСАбАТСААСАТААМТСТсСТТТТГОТМЙТТТД ТММАМСПК ТТ>УТ>СШ^ 11Ж П >1 АМ^вДТАМКАММСПЛСАК ССАСМССАААСТАШЬ<ТСЗПССГГ«^иДАтАММТС1>^М^СШАаП ОШШ И Ш1ПГ »11ГПИ

ТЦТШТМШАШТТТСТСГТСДСТТШАПТеПСМ»>тААМГЬТ>1Ш1ЛШСПА1СТ1МПСа1 КМСТТСТЮвСТАвАТСТСМТТТССМТ АТТСЯА? ГТСТТТТСТ

И1- «20

1МЫ7М «1- «»

М1- «»

пчж №• сев

(Я'-МЯ С*»- «о

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая исау-140 из мозга быка, и соответствующая аминокислотная после довательтельность белка. Подчёркнуты еминокислэтные последовательности, установленные путём анализа пептидов. Отмечены-остатки аспарагина, которые могут гликозшшрозаться.

присутствует вставка из 15 нуклеотидов (5'-catagccctcttcca-3' ), кодирующая пептид (Hi3-Ser-Pro-Leu-Pro).

Гетерогенность, обнаруженная нами в кДНК исследованных клонов, связана с одновременным присутствием в мозге позвоночных различных мРНК, кодирующих несколько структурных вариантов для каждой из 3-х основных изоформ NCAM. Рассматриваемые различия широко описаны в литературе для ксам из цышген-

клоны

I).

рАо 2.1 рАо 13

рАо 2.3 рАо 22

2Ь_

рАо 2.1

рАо 13

рАо 2.3 рАо 22

рАо 111

нуклеотидные последовательности

140^

экзон . тс

.AAG GOT TCG TGG ACT CGA CCA GAG AAG CAA GAG

334 343

» т

Ala-Ser-Trp-Thr-Arg-Pro-Glu-LyB-Gln-Glu

-Lys-

1435 ACC.

-Thr-

140^ 1435 '..AAG ACC.. -Lys-Thr-

2171^2172

..GTC CGG GAA..

588 590 » т

-Yal-Arg-Glu-

2171 ..GTC С -Yal-

AA G Oln-Oly

2172 GG GAA.. -Glu-

2171 ..GTC С -Val-

экзон a"

AT AGO CCT CTT CCA С His-Ser-Pro-Leu-Pro

2172 GG GAA.. -Arg-Glu-

Рис. 3. Отличия, присутствующие в кДНК найденных клонов. Прямоугольниками отмечены.встраивающиеся нуклеотидные и аминокислотные последовательности. Подчеркнуты аминокислотные последовательности, определённые путём анализа пептидов.

ка,-шши, крысы, ош связаны с существованием на определенных участках гена коам (интроны между 7 и 8, а также 12 и 13 эк-зонами) нескольких мест возможного сплайсинга, в результате которого образуются мРНК, содержащее дополнительные сегменты (экзон"и" (I).), экзон "а" или триплет AAG, или "cT+aag (2).) (H.J.Cantoni et al).

Инициирующим кодоном является триплет ATG (350-352), это первый ATG-кодон, расположенный в рамке трансляции за терминатором ТАА (224-226), а выведенная из последовательности кДНК, следующей за ATG, структура лидерного пептида (-19—I) .(Met-Leu- Glri-Thr-Lys-Asn-Leu-Ile-Trp-Tlir-Leu-Phe-Phß-Leu-Gly -Tbr-Ala-Val-Ser) соответствует обобщенной структуре для последовательностей данного типа (Лузиков, 1984.). Далее еле-• < *

дует аминокислотная последовательность (I-I6), совпадащая с ранее определенной структурой N-концевого пептида.

Терминирующий кодон TGA находится в положении 2909-2911. Установленная аминокислотная последовательность NCAM-140 содержит 834 аминокислотных остатка. Рассчитанная молекулярная масса белка без лидерного пептида составляет 91735 Да. В первичной структуре нсаы обнаружено 9 потенциальных участков н-гликозилирования, особенно часто они располагаются в центральной части белка.

Анализ профиля гидрофобности КСAM-140 по методу Кайта и Дуляттла позволил выявить один чбтко выраженный гидрофобный фрагмент (702-738 аминокислотные остатки)(рис. 4), соответствующий, вероятно, трансмембранной области белка, расчбт вторичной структуры ИСАИ по штоду Финкельштейна предсказал для этого фрагмента структуру а-еппрали.

Сравнение установленной наш аминокислотной последовательности NCAH-I40 из мозга быка со структурами адгезионных молекул из других источников выявило высокую степень гомологии между ними, наибольшую гомологию NOAM из мозга быка имеет -с белками адгезии нервных клеток из крысы (94%), человека (94%) и мыши (93J6).

Hl^btu

Рис. 4. Профиль гидрофобности NCAM-I40 из мозга быка, рассчитанный по методу Каита и Дулиттла.

В связи с предполагаемым нами существованием взаимосвязи системы клеточной адгезии с аденилатциклазной системой, интересно отметить наличие в структуре NCAM из мозга быка последовательности Ala-X-X-X-X-Gly-Lys-Ser (665-772), гомологичной последовательности Gly-x-x-x-x-Gly-Lys-Ser, харак-

терной для нуклеотид-связывающих центров (Moller, Amons, I98S). Известно, что эта последовательность присутствует в каталитических участках бактериальных АЦ, но отсутствует в установленных структурах аденилатциклаз млекопитающих I и II типа. Недавно было показано, что моноклональные антитела, полученные на пептид, синтезированный по первичной структуре АЦ из Bacillus Anthraois, содержащий нуклеотид связывающую последовательность, специфично ингибируют крысиную и кроличью синаптосомальные аденилатциклазы.

В нашей лаборатории были получены пэликлональные антитела К синтетическому пептиду Val-Ala-Clu-ABn-Gln-Oln-Gly-Lys-Ser-lys-Ala-Ala-His-Fhe-Yal (664-678 аминокислотные остатки бычьего ксам), включающему последовательность центра связывания нуклеотидов; Эти антитела эффективно, по сравнению с контрольными иммуноглобулинами, подавляли адэнилатцшслазную активность в солюбилизате мбмбран коры головного мозга, а после иммобилизации на белок А-сефарозе обладали способностью имму-нопреципитировать АЦ.

7. Реконструкция структурного гена ысам-140 для получения экспрессии белка в бесклеточной системе трансляции in vitro и в ооцитах Xoenopus Ьает1в.

С целью получения экспрессии NCAM в модельных системах был собран полный структурный ген бежа. Для этого были ис-

V

пользованы клоны рАо 19.4 и рАо 22, вставки кДНК которых полностью перекрывали структурную область бедка и имели общий фрагмент размером в 51 и.о., содержащий1 участок узнавания эдодуклэзза рестрикции Hinf I. Реконструированный-структурный ген КСАИ-140 из мозга бкка был клонирован в плазмидный вектор

pSP 64 под контроль промотора SP6 FHK-полимеразы. После расщепления эндонуклеазой рестриктазой Xba I рекомбинантная плазмида использовалась в качестве матрицы для. синтеза мРНК.

Первоначально в качестве системы экспрессии была использована бесклеточная система трансляции in vitro. При трансляции полученной мРНК в экстракте из зародышей пшеницы среди продуктов синтеза был обнаружен полипептид нужной молекулярной массы, специфически взаимодействующий с MAT-I, но не обладающий аденилатциклазной активностью. Использование альтернативной системы трансляции (лизата ретикулоцитов кролика) и ряд экспериментов по ^оживлению"' синтезированного бежа дали аналогичный результат.

Для получения экспрессии бежа в ооцитах Xenopus Laevis использовалась "кэпированная" мРНК, для чего реакцию in vitro транскрипции с SP6 РНК-полимеразой проводили в присутствии GppG. При введении -кодирующей NCAM мРНК в ооциты наблюдалось увеличение уровня аденилатциклазной активности в этих клетках по сравнению с контролями (интактные'роциты и ооциты "инъецированные водой или мРНК, кодирующей 7-субъединицу

I

ц1Ш-фосфодиэстеразы), причбм, степень увеличения зависела от количества инъецированной мРНК. На рис. 5 представлена зависят¡ость АЦ активности ооцитов от количества введенной мРНК.

Полученные данные' (увеличение уровня АЦ активности ооцитов после введения в них мРНК, кодирующей ncam-140, и ингиби-рованиэ АЦ активности солюбилизата мембран коры головного мозга поликлоналытга антителамп, полученными на полнораз-мерннй ncam-140 пли на один из его пептидов) позволили нам

АС асПуИу (%)

200 ---

«Шаг РОЕ Олд Юлд 2бкд Мпв

Рис.- 5. Зависимость аденилатциклазной активности ооцитов Хе-пориз 1ает1в от количества инъецированной мРНК, кодирущей 11САМ-140.

предположить, что существует определённая взаимосвязь между аденилатциклазной системой и системой клеточной адгезии. Интересно, что в своё время было показано, что одна из изоформ N00!, а именно псам-180, взаимодействует с цитоскелетом через мембранносвязанный белок-спектрин, а антитела- к спектрину ( фодрину) способны преципитировать АЦ активность. Кроме того, сущетвует гипотеза, что псам оказывает влияние на 01 (ГТФ-аза ингибирущая АЦ систему). Мы считаем, что дальнейшее работы по исследованию взаимосвязи АДС и системы клеточной адгезии позволят расширить знания о роли обеих систем в жиеой клетке.

-19-ВЫВОДЫ-

1. Созданы представительные клонотеки кДНК из мозга быка. В этих клонотеках найдены клоны, в совокупности содержащие полную последовательность структурного гена Г1слм~140.

2. Установлены нуклеотидные последовательности фрагментов кДНК выделенных клонов, что позволило реконструировать первичную структуру кДНК ИСАЦ-140 длиной' 3574 п.о., которая содержит.полный структурный ген,, состоящий из 2559 п.о. и кодирующий полипептидную цепь длиной 853 аминокислотных остатка (19 входят в состав лидерного пептида). Получены данные, свидетельствующие о существовании нескольких типов мРНК, кодирующих разные формы !,тСАМ-140.

3. Показано, что по перв'.1чной структуре 1ГСАМ-140 из мозга быка высоко гомологичен молекулам адгезии нервных клеток из мыли, крысы, человека и другим известным адгезионным молекулам.

4. Результаты экспрессии белка в ооцитах Хепбриз Ьает1з в совокупности с другими данными, полученными в лаборатории белков гормональной регуляции,, позволили предположить существование определенной взаимосвязи системы клеточной адгезии и АЦС.

Основше результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Каталитический компонент кальмодулиннезависимой аде-шлатциклазн из мозга быка. Аминокислотная последовательность белка е нуклеотидная последовательность соответствующей кДНК. Липгаш В.М., Храмцов Н.В., Андреева С.Г., Ищэнко К.А., Мошня-ков М.В., Петухова Г.В., Ракитина Т.В., Фэщенко Е.А., Мирзое-ва С.Ф., Драницына С.М., Петров В.М., Чэрнова М.Н., Сурина Е. А., Обухов А.Н., Соверцова И.В., Быстров И.О.-Доклады АН СССР 1989, JoY, I , 1502-1506. '

2. Calmodulin-independent bovine brain adenilate oyola-ве. Amino aoid'sequence and nucleotide sequence of corresponding oDNA. Lipkin V.M., Khraatsov N.Y., Andreeva S.G., Mosh-nyakov M.Y., Petukhova G.V., Rakitina rJ?.V., Fesholisnko E.A., Ishchenco K.A., Mirzoeva S.P., Chernova II.N., Dranytsyna S.li. FEBS Letters, 1989, 254, 1,2, 69-73.

3. Relationship of neural cell adhesion moleoules (H-CAlis) with adenylate cyolase. Lipkin V.M., Surina E.A., Petukhova G.V., Petrov V.J1., Ifirsoeva S.F., Rakitina Т.У. FEBS Letters, 1992, 304, 1, 9-11.

4. 1'40 MDa NCAM molekule from bovine brain aminoaoid sequence and oDNA nuoleotide sequcnoe. Petrov V.U., Khramtsov M.V., MoEhnyakov M.V., Petukhova G.Y., Rakitina T.Y., Fesh-sehko E.A., Mirzoeva S.P., Chernova M.N., Lipkin V.H. Abstracts of USSR-USA Symposium on Moleoular Neurobiology, Kiev, USSR, 1991, 8-9.

5. Молекула адгезии нервных клеток (n-cam). Аминокислотная последовательность полипептида 140 кДа и нуклеотидная по-следовательноть соответствущей кДНК. Фещенко Е.А., Мошняков М.В., Петухова Г.В., Ракитина -Т.В., Петров В.М., Хромцов Н.В. Млрзоева С.Ф., Липкин В.М. Сборник тезисов II Всесоюзного Симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991, 200.