Монослои коллагена на границе раздела вода-воздух: влияние pH, ионной силы и концентрации спиртов и денатурирующих агентов в субфазе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РГБ ОД

- з яня то

на правах рукописи

ФАДЕЕВ Алексей Сергеевич

МОНОСЛОИ КОЛЛАГЕНА НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ВОДА-ВОЗДУХ: ВЛИЯНИЕ рН, ИОННОЙ СИЛЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ СПИРТОВ И ДЕНАТУРИРУЮЩИХ АГЕНТОВ В СУБФАЗЕ.

специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре коллоидной химии Химического факультете Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Измайлова Виктория Николаевна

Научный консультант: кандидат химических наук Левачёв Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Зайцев Сергей Юрьевич доктор химических наук, профессор Симакова Галина Александровна

Ведущая организация: Российский химико-технологический

Защита состоится 2{ декабря 2000 г. на заседании диссертационного совет; Д 063.41.05 в Московской ^Государственной академии тонкой химическо? технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малш Пироговская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московско£ Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносов; по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Отзывы на автореферат можно направлять по адресу: 117571, Москва, пр Вернадского, 86, МГАТХТ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 ноября 2000 года. Учёный секретарь

университет им. Д. И. Менделеева

диссертационного совета, доктор химических наук, профессор

Грицкова И. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Вопрос о фолдинге (процесс сворачивания белковой глобулы за счёт нековалентных взаимодействий, приводящий к компактизации полипептидных цепей) белков на различных уровнях молекулярной организации является одним из важнейших в современном естествознании, причём одной из основных проблем является изучение нековалентных взаимодействий, определяющих специфичность формирующихся супрамолекулярных структур. Два подхода, развитые в современной химии высокомолекулярных соединений и коллоидной химии - оперирование с мономолекулярными плёнками с использованием техники Ленгмюра и прямое измерение сил взаимодействия с помощью силовой микроскопии - являются перспективными для исследований ассоциации и других специфических взаимодействий, характерных для белков.

Коллагены относятся к самому распространённому классу белков животного происхождения с ярко выраженной способностью к образованию надмолекулярных структур, заложеной в него природой. Этот процесс включает по крайней мере следующую иерархию структур: три полипептидные а-цепи (первичная структура), свёрнутые в левую спираль (вторичная структура), ассоциируются с образованием тройной правозакрученной спирали (супервторичная структура), образуя молекулу коллагена (называемую тропоколлагеном). Далее тропоколлаген (длина 300 нм, диаметр 1,4-1,5 нм) ассоциируется в фибриллы. В свою очередь фибриллы образуют супрамолекулярные ансамбли, играющие in vivo роль внеклеточного матрикса, выполняющего не только функции несущих конструкций, но и определённую роль в передаче информации клеткам, регулируя их адгезию, миграцию и др., а также специфические взаимодействия с белками, нуклеиновыми кислотами и неорганическими ионами. Нарушение специфической ассоциации приводит к тяжёлым патологиям, зачастую мало исследованным (так называемые "коллагеновые болезни").

Изучение мономолекулярных слоев позволяет экспериментально моделировать отдельные этапы ассоциации белков в двумерном (2D) пространстве. Актуальность исследований механизма ассоциации коллагена в 2D системах определяется также практическими задачами воспроизведения in vitro биосовместимых материалов, по механическим и функциональным свойствам аналогичных коллагеновым структурам in vivo.

Цель работы. Моделирование отдельных этапов образования надмолекулярных структур коллагена с использованием метода мономолекулярных слоев при широком варьировании состава водной субфазы.

Научная новизна.

• Впервые изучены свойства стабильных мономолекулярных слоев коллагена. Использованный подход позволил контролировать нековалентные взаимодействия при образовании надмолекулярных структур коллагена.

• Показано, что изотермы поверхностное давление - площадь, приходящаяся на молекулу (it-A) монослоёв коллагена характеризуются двумя близкими к линейным участками, разделёнными плато, условно названными жидко-растянутым и жидко-конденсированным. Жидко-растянутый участок отвечает мономолекулярному слою коллагена, в области плато образуются фибриллы. Жидко-конденсированный участок соответствует поверхностным плёнкам фибрилл коллагена. Плато разделяет ориентированные поверхностные слои: из ориентированных палочкообразных молекул тропоколлагена и ориентированных жёстких фибрилл коллагена. Точка коллапса связана с образованием неупорядоченных волокон.

• Показан вклад электростатических взаимодействий при образовании фибрилл и волокон коллагена. Отклонение рН субфазы от изоэлектрической точки в кислую и щелочную область препятствует образованию надмолекулярных структур коллагена.

• По изменению изотерм я-А монослоёв коллагена при варьировании природы и состава субфазы показано, что потеря устойчивости монослоёв коллагена может быть вызвана фазовыми переходами в смешанных монослоях (с н-гексанолом), изменением активности воды (mpem-бутанол) или денатурацией коллагена (мочевина и тиомочевина).

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют определить оптимальные условия для получения устойчивых многослойных ЛБ-плёнок коллагена определённой структуры и контролируемыми свойствами.

Автор защищает:

о Предложенную схему ориентационных и фазовых переходов в монослоях коллагена на границе раздела вода-воздух и уточнённую модель фибриллы коллагена.

о Наличие вклада электростатических взаимодействий в монослое с процессами

фибриллообразования и видом изотерм л-А. о Предложенные модели взаимодействия спиртов (н-гексанола и трет-бутанола) и денатурирующих агентов (мочевины и тиомочевины) с монослоями коллагена, ведущие к потере устойчивости монослоёв вследствие образования смешанного монослоя (с и-гексанолом), нарушения слоя структурированной воды вокруг молекулы коллагена {трет-бутанол) и частичной или полной денатурации (мочевина и тиомочевина).

Апробация работы. Отдельные части данной работы представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-97" (12-14 апреля 1997 года), "Ломоносов-98" (7-10 апреля 1998 года) и "Ломоносов-99" (20-23 апреля 1999 года); на International Conference on Colloid Chemistry and Physical-Chemical Mechanics, 4-8 October

1998, Moscow, Russia; на Научно-технических конференциях МГТУ: 8-й (1997 г.), 9-й (1998 г.) и 10-й (20-30 апреля 1999 г.); на XIX Symposium on Rheology, June 22-27, 1998, Lithuania, Klaipeda.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ (2 статьи, 1 методическая разработка и 9 тезисов докладов на конференциях), часть материалов готовится к публикации.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (347 наименований) и приложения. Работа изложена на 160 страницах, содержит 38 рисунков, 3 таблицы и приложение (6 страниц, 12 таблиц).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во Введении дано обоснование актуальности работы и сформулирована её цель.

I часть является обзором литературы, в котором рассмотрены основные свойства белковых монослоёв, а также биохимические и физико-химические свойства коллагена и его растворов.

II. Объекты и методы исследования.

Приведены характеристики использованных веществ. Описан метод выделения коллагена I из склеры глаза свиньи. Молекулярная масса коллагена определена с помощью ПААГ-электрофореза с додецилсульфатом Na и ВЭЖХ (хроматограф Hewlett-Packard 1090 M, колонка 300x7,5 мм, носитель TSK-GEL, объём образца 10 мкл, регистрация хроматограмм с помощью диодно-матричного детектора при длине волны 205 нм, скорость потока 0,5 мл/мин, время разделения около 25 мин при 25°, элюент - фосфатный буфер с рН 5) и составила! 285 kDa. Результаты обоих методов хорошо согласуются и свидетельствуют о гомогенности и высокой чистоте образца коллагена. Концентрация стандартного исходного раствора 8,6-10'6 M установлена методом Лоури.

Спирты - третичный бутиловый (СН3)3СОН и к-гексиловый СНз(СН2)4СН2ОН марки "РЕАХИМ", ч.д.а. Анализ спиртов методом газовой хроматографии (хроматограф "ЦВЕТ", длина колонки 3 м, носитель 6% ПЭГ-2000 и 1,5% КОН, 180°С) не обнаружил примесей в реактивах. Мочевина и тиомочевина (РЕАХИМ), ч.д.а. Все растворы готовили на дистиллированной воде.

Поверхность субфазы перед нанесением коллагена очищалась по стандартной методике Ленгмюра. Для формирования монослоёв коллагена на поверхность субфазы с помощью микропипетки наносили 20 мкл водного раствора коллагена. При больших площадях использован раствор 8,6-Ю"7 М, при малых - 8,6-10*6 М. Изотермы перекрывались на значительных участках,

что позволяло строить обобщённую изотерму я-А. Опыты проводили при 20°С. До начала измерений после нанесения раствора коллагена на поверхность обычно проходило 1 -2 мин.

Для исследования монослоёв использована ванна Ленгмюра кругового типа (рис. 1). Скорость сжатия (расширения) 1,59-10"' м2/с. Площадь монослоя менялась от 327 см' (3158 нм" на молекулу тропоколлагена или 0,15 мг/м") до 14 см2 (13,5 нм2 на молекулу или 35,1 мг/м2).

Ванна из фторопшста Вспомогательный ошеек Дчрм-атыь

Рис. 1. Общий вид ванны Ленгмюра кругового типа.

III. Результаты и их обсуждение.

Типичный вид изотермы л-А устойчивого монослоя, регистрируемый в условиях эксперимента, показан на рис. 2. При варьировании состава подложки следили за изменением характеристических параметров: площадей на молекулу А (Ац - площадь в начале подъёма кривой, обычно > 2000 нм~ на молекулу коллагена, что много больше площади молекулы тропоколлагена при ориентации большой осью параллельно плоскости поверхности; интервал А, отвечающих длине плато; Ас - площадь в точке коллапса) и давлений л (к плато и 7ic коллапса).

Коллапс фибриллярного / монослоя, Ас II

V /

60-W

50

40

30

:о

Фибриллярные слои.

присутствуют только фибриллы [

Плато, процесс фибриллообразованпя

разреженны» монослои

II - жидко-растянутое состояние

III - плато

IV - жидко-конденсированное

состояние

V - коллапс

Тропоколлагеновый монослой

/

■ I '

500

■ I "

1000

■ I ■

1500

Площадь начала

/ подъёма А„ ^ 1

wpopqoqootyooi

3000

2000 2500 Площадь на молекулу А, нм"

Рис. 2. Изотерма тг-А для монослоя коллагена на дистиллированной

воде при рН 6,0. Дано пояснение расположения различных поверхностных структур коллагена в процессе сжатия монослоя.

В начале подъёма к расстояние между молекулами составляет 40-50 нм, что в 6-7 раз меньше длины молекулы тропоколлагена, т. е. монослой оказывается уже в значительной степени ориентированным. При дальнейшем сжатии при п ~ 20 мН/м (область плато) инициируется интенсивная перестройка монослоя. Учитывая жёсткость и высокую стабильность тройной спирали, а также силы притяжения, действующие между ними на расстояниях ~ 1,6 нм, сделан вывод о том, что плато отвечает процессу образования фибрилл из отдельных ориентированных молекул тропоколлагена. Значение А в начале плато позволяет рассчитать расстояние между молекулами, которое близко к 1,6 нм. Характеристические значения А сравнивали с геометрическими параметрами молекулы и фибриллы коллагена (рис. 3). Сравнение полученных в разных

300 нм

Размеры молекулы троиоколлагена. Плошадь горизонтальной проекции молекулы коллагена на плоскость 450 нм .

ООО

оооо 00000 оооо

ООО

¡jteftpaíüfie». ^ГЙ^пШ«» «#№йййвйба»

Полеречное сечение фибрилл, образуемых молекулами коллагена в монослое. А., в такой фибрилле составляет

134,2 нм".

Схема строения фибрилл коллагена в продольном сечении.

Рис. 3. Размеры молекулы и структура фибрилл коллагена.

условиях данных и их сопоставление с рассчитанными площадями проекций молекулы приводит к выводу об образовании надмолекулярных структур в монослоях коллагена (рис. 2). На изотермах я-А обнаруживается два достаточно больших прямолинейных участка, условно отнесённые к жидко-растянутому и жидко-конденсированному состоянию поверхностных слоев. Для этих участков рассчитаны эффективные модули упругости (г0, мНУм, 1а), далее называемые модулем эластичности, и параметр у (Дж/моль, 16), представляющий собой свободную поверхностную энергию, нормированную на моль вещества, образующего монослой (Г - поверхностная концентрация):

Влияние рН подложки исследовано в интервале рН 3-12 (рис. 4). Интервал охватывает области рН выше и ниже изоэлектрической точки (р/ 5,7).

Расположение плато на изотермах зависит от рН субфазы, его протяжённость отражает особенности процесса фибриллообразования при разных рН. Протяжённость плато при уменьшении рН от 7,0 до 3,0 непрерывно уменьшается. Это разумно связать с увеличивающимся отталкиванием молекул тропоколлагена друг от друга, поэтому требуется всё более сильное сжатие для начала фибриллообразования. Ы vivo коллаген находится в среде, рН которой близок к нейтральной, так что вполне логично ожидать, что нейтральная среда будет наиболее благоприятной для фибриллообразования. При щелочных рН наблюдаются более глубокие изменения монослоя.

Свойства монослоёв коллагена при разных рН подложки.

500 1000 1500 2000 2500 3000 Площадь на молекулу А, нм"

Рис. 4. Изотермы сжатия монослоёв коллагена на водной подложке при различных рН.

рН 8.0 рН 9.0 рН 10.5 рН 11.0 —О— рН 12.0

500 1000 1500 2000 2500 3000 Площадь на молекулу А. нм"

В процессе фибриллообразования в монослое присутствуют как формирующиеся фибриллы, так и отдельные молекулы тропоколлагена. Только после полного исчерпания тропоколлагена л начинает подниматься. Монослой фибрилл можно далее сжать более чем в 2 раза. Коллапс монослоя из фибрилл наступает при значениях Ас, равных 130-140 нм2 на молекулу и практически не зависит от рН. При таком сжатии и в трёхмерных системах коллагена наблюдаются необратимые изменения. В то же время лс обнаруживает чёткую зависимость от рН - оно максимально при рН 6,0, наиболее близком к р/, и уменьшается при удалении от него в обе стороны.

Таблица 1.

Влияние рН субфазы на модуль эластичности (е0) и параметр у монослоёв

коллагена.

«ослои коллагена рН подложки 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,5 11,0 12,0

Молекулярный Ео, мН/м 13 13 21 20 12 19 24 25 24 19

ллаген (до плато) у, Дж/моль 20 29 46 45 25 43 56 61 57 49

Фибриллярный ео, мН/м 36 31 30 67 22 19 35 39 35 44

таген (после плато) у, Дж/моль 15 18 19 35 10 8 16 19 14 19

Особенности состояния монослоёв коллагена на поверхности водных растворов при разных рН подтверждаются расчётами модулей упругости для разных областей изотерм сжатия тг-А монослоя. В табл. 1 приведены значения £|) и параметра у. Для жидко-растянутого состояния £() и у рассчитывали как средние значения для спрямлённых участков, непосредственно прилегающих к

плато. Для жидко-конденсированного состояния эти параметры рассчитывали как средние значения для всей достаточно близкой к линейной области подъёма.

Для молекулярного моносдоя изотермы сжатия-растяжения обнаруживают гистерезис, связанный, по-видимому, с тем, что образовавшиеся при сжатии фибриллы коллагена не успевают дезагрегировать за время растяжения (рис. 5а). В данном случае время релаксации оказывается меньше времени растяжения. Из рис. 5 видно, что в области жидко-растянутого состояния, т. е. до плато (рис. 5а, первый цикл сжатия-растяжения) гистерезис меньше, чем в области жидко-конденсированного состояния (рис. 5Ь, первый цикл сжатия-растяжения). Для фибриллярного монослоя причиной гистерезиса может быть не только образование волокон при сжатии, но и барьерные явления (Malcolm В., 1985).

о С

О 500 1000 1500 2000 2500 3000 Плошадь на молекулу А, нм!

50 100 150 200 250 300 Плошадь на молекулу А, нм"

Рис. 5. Изотермы сжатия-растяжения я-А монослоя коллагена на дистиллированной воде. Циклический гистерезис для жидко-растянутого (а) и жидко-конденсированного (Ь) участков.

- первое сжатие-растяжение сразу после нанесения коллагена

- второе сжатие-растяжение спустя 1 мин после первого

- третье сжатие-растяжение спустя 5 мин после второго

Обоснованность утверждения подтверждается опытами по циклическому сжатию-растяжению монослоёв коллагена. На рис. 5а наряду с изотермами первого сжатия-растяжения приведены данные двух последующих измерений для монослоя тропоколлагена. При повторном сжатии через 1 мин гистерезис (оцениваемый по площади между кривыми сжатия и растяжения) уменьшается, но некоторая доля фибрилл остаётся в монослое после растяжения. Это было подтверждено опытами, в которых увеличено время релаксации монослоя при больших площадях, что приводило к заметному снижению гистерезиса (3-й цикл сжатия-растяжения) и свойства монослоя оказались достаточно близкими к исходным. Это подтверждает справедливость предположения, что гистерезис в первом цикле сжатия-растяжения для жидко-растянутого монослоя, в

основном, связан с образованием фибрилл на поверхности. Сопоставление изотерм, полученных в 1-3 циклах сжатия-растяжения жидко-конденсированного слоя (рис. 5Ь) показывает существенную неоратимость процесса объединения фибрилл в волокна. Об этом, в частности, свидетельствует тот факт, что при растяжении монослоя в 3-м цикле л падает практически до нулевого значения при А ~ 300-350 нм2.

Таким образом, все типы надмолекулярных структур, характерные для водных растворов ш vitro и тканей коллагена in vivo, реализуются в монослоях на границе вода-воздух. Первый участок изотерм сжатия монослоёв коллагена (до плато) отражает дальнодействие между молекулами белка, приводящее к установлению ориентационного порядка. Появление плато соответствует началу процесса фибриллообразования, вызванного возросшей поверхностной концентрацией (Г) молекул коллагена и уменьшением расстояния между ними, вследствие чего реализуется специфическая ассоциация. Фактически значение тс на плато изотермы является давлением коллапса монослоя из молекул коллагена. Монослой фибрилл коллагена обнаруживает коллапс при 60 мН/м, при этом изменение поверхностных плёнок носит необратимый характер.

Влияние ионной силы подложки на монослои коллагена.

Влияние ионной силы субфазы на монослои коллагена представлено на рис. бив табл. 2. При увеличении концентрации КС1 в водной субфазе (рН 6,0) начало подъёма изотермы сжатия тг-А, как и начало области плато, сдвигаются в сторону больших площадей, следовательно, первичные ориентационные явления в монослое, определяющиеся дальнодействующими силами притяжения и отталкивания, облегчаются.

s

К О) X

3

4 ш га Ч

о X X п.

U

п о

с

- вода

- 1,0 М KCl

- 2,0 М KCl

- 3,0 М KCl

- 4,0 М KCl

■^»ici^^^iisaaixjxror^

500 1000 1500 2000 2500 3000 Площадь на молекулу А, нм"

Рнс. 6. Изотермы сжатия тг-А монослоёв коллагена на поверхности водных растворов KCl.

А > 3150 им1, я = 0. Неупорядоченный монослой тропоколлагена.

А < 140 нм2. Формирование сплошного коллагенового волокна. Коллапс фибриллярного монослоя.

\

II

2000 > А > 500 нм2 Ориентация тропоколлагена. Двумерный жидкий кристалл.

IV

III ч ^

300>А> 140 нм2 Жидко-конденсированный участок на изотерме л-А.

500>А>300 нм2 Фибриллообразование.

Рис. 7. Схема последовательного упорядочения поверхностной структуры

ППП РУ/ОТИи илиппплп 1ГЛППОРа»ю 11 гъ плпи/ми. п/чпгт/ч«.,.,.^

Молекулы коллагена в фибрилле обнаруживают гексагональную упаковку (Baselt D. and Revel J., 1993). В рамках этой модели эффективная площадь, занимаемая одной молекулой коллагена в плотно упакованном монослое его фибрилл бесконечной длины, равна 134 нм2, что хорошо согласуется со значениями Ас — 130-140 нм". Схема переходов в монослое представлена на рис. 7.

Вклад электростатических взаимодействий в процессах упорядочения монослоя коллагена иллюстрируется данными, приведёнными на рис. 8. Подкисление соляной кислотой 1,0 М раствора КС1 до рН 3,0 приводит к заметным изменениям параметров монослоя. Введение КС1 нивелирует влияние рН как на участках жидко-растянутого, так и жидко-конденсированного состояния, хотя в молекулярном монослое эффект проявляется сильнее.

Таблица 2.

Влияние концентрации КС1 в субфазе при рН 6,0 на значения модуля эластичности е0 и параметра у монослоёв коллагена.

Монослои коллагена Концентрация KCl, моль/л 0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 (pH 3,0)

Молекулярный монослой Ео, мН/м 20 21 22 36 30 32

у, Дж/моль 45 52 56 105 93 112

Фибриллярный монослой ео, мН/м 67 33 37 43 42 27

у, Дж/моль 35 14 16 21 17 10

s

Ж

s

к

01 =

о

X н

о

0

1

х ¡X

о

с

вода, рН 6,0 1,0 М КС1, рН 3,0 вода, рН 3,0

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Площадь на молекулу А, нм"

Рис. 8. Изотермы сжатия к-А монослоёв коллагена на водной субфазе с различными рН и ионной силой.

Максимальные значения е0 и у для монослоёв молекулярного и фибриллярного коллагена обнаружены при концентрации соли 3,0 М (табл. 2). Интересно отметить, что при рН 3,0 введение КС1 в концентрации 1,0 М приводит к возрастанию £о и у. В целом, если субфаза содержит электролит, то

Со в молекулярном монослое всегда оказывается выше, чем на воде, что указывает на большую устойчивость монослоя коллагена на субфазе с электролитом. Таким образом, электростатические взаимодействия вносят определённый вклад в организацию коллагена. Уникальное распределение на поверхности коллагена положительно и отрицательно заряженных групп в изоэлектрической точке оптимально способствует этой организации. Увеличение сил отталкивания одноимённо заряженных функциональных групп нарушает оптимальную ориентацию молекул коллагена в плоскости монослоя и затрудняет образование фибрилл, в частности, вследствие электростатического отталкивания. Введение электролита (КС1) полностью подавляет эффект.

Действие различных спиртов на поверхностные свойства коллагена.

На рис. 9 и 10 представлены изотермы л-А для монослоёв коллагена на растворах спиртов, соответственно н-гексанола и шре/и-бутанола, при различных концентрациях спиртов в субфазе. Для удобства сравнения изотерм на растворах спиртов и на воде при представлении изотерм л-А на рис. 9 и 10 площади монослоя нормировались на молекулу коллагена (Аэф) независимо от поверхностной концентрации спирта так, что А является эффективным параметром.

Все изотермы гс-А (рис. 9) для монослоёв коллагена на поверхности растворов н-гексанола можно разделить на три типа: 1) изотермы с плато при л = 23-24 мН/м, после которого наблюдается ветвь резкого роста тс при малых изменениях площади до точки коллапса при высоких л; 2) изотермы с широким плато в области низких л = 1-6 мН/м и низкими значениями тгс (12-17 мН/м)

и

О 500 1000 1500 2000 2500 3000

Площадь на молекулу А, нм" Рис. 9. Изотермы сжатия л-А монослоя коллагена на водной субфазе с различной концентрацией н-гексилового спирта.

Смешанный монослой с н-гексанолом.

при малых А; и 3) изотермы промежуточного типа, характеризующиеся отсутствием плато при высоких я, но достаточно высокими значениями кс (3442 мН/м), наступающего при сжатии конденсированного поверхностного слоя.

Малые (до 2,5-10'3 М) концентрации н-гексанола (1-й тип изотерм д-А) не приводят к изменению я плато. В этих условиях фибриллы образуются скачком (всё или ничего). Поверхностное поведение коллагена в какой-то мере аналогично поведению на воде, до плато образуется гомогенный смешанный монослой, з котором молекулы коллагена равномерно распределены между молекулами н-гексанола (который определённым образом ориентируется на поверхности). Параметром, характеризующим степень ориентации н-гексанола, может служить величина равновесной адсорбции или площадь на молекулу спирта (табл. 3).

По мере увеличения концентрации «-гексанола начало плато смещается к меньшим площадям (А) и длина плато уменьшается (рис. 9). В ряду концентраций н-гексанола в субфазе 0, 10"3 и 2,5 10"3 М Азф коллагена уменьшаются соответственно 700-600, 600-500 и 550-500 нм2. Стерическое отталкивание, регистрируемое при сжатии монослоя, реализуется при сближении молекул коллагена, окруженных молекулами спирта, и может быть следствием ряда причин: осмотических явлений из-за локального повышения концентрации спирта между молекулами коллагена, затрудненности вытеснения н-гексанола вследствии гидрофобных взаимодействий между н-гексанолом и тропоколлагеном, невыгогодность отделения молекул воды при фибриллообразовании на поверхности с высокой концентрацией н-гексанола, а также предполагаемое уменьшение степени ориентации молекул коллагена в плоскости поверхности в присутствии н-гексанола. Наблюдается резкое падение эффективного модуля эластичности (ео) при изменении свойств субфазы при переходе от воды (so = 20 мН/м) к растворам н-гексанола низких концентраций (s0 - 10-13 мН/м). Ход зависимости у (табл. 4) аналогичен зависимости s0 и свидетельствует о резком уменьшении взаимодействия между молекулами коллагена в монослое на растворах н-гексанола по сравнению с монослоями на воде.

При высоких концентрациях н-гексанола (7,5-10'3-10 '2 М) смешанные поверхностные слои характеризуются низкими значениями п плато, е0 и у, переход к которым происходит в узком концентрационном интервале н-гексанола. Свойства поверхностной пленки кардинальным образом отличаются от свойств монослоев, сформированных на воде и растворах с более низкими концентрациями н-гексанола. При сжатии смешанного монослоя практически сразу (плато регистрируется при больших площадях) наблюдается его коллапс вследствии фазового разделения на области жидко-конденсированного монослоя н-гексанола и фибриллярного коллагена. Образование фибрилл в этом случае происходит, минуя стадию взаимной ориентации молекул коллагена, по гетерогенному орогенетическому механизму (Patrick A. et al, 1999). Другими словами, при высоких концентрациях н-гексанола в субфазе процесс растекания коллагена по поверхности ингибируется и превалирует

процесс фибриллообразования. Монослой разделяется на области, состоящие из фибрилл коллагена и молекул н-гексанола в конденсированном состоянии.

Таблица 3.

Моделирование параметров смешанного монослоя коллагена и н-гексанола.

Концентрация Адсорбция Число молекул Площадь на молекулу А (нм~),

н-гексанола н-гексанола спирта на 1 молекулу смешанный монослой

х10\ М хЮ1', моль/см2 коллагена, N А1ф Аспирта

1500 2,80

1,0 2,0 375 1000 600 500 1,50 0,40 0,27

1500 1,05

1000 0,55

2,5 9,0 1000 900 800 700 600 0,45 0,35 0,25 0,23

1500 0,55

3,17 10,0 1900 1000 900 0,29 0,23

1500 0,28

5,0 20 3750 1400 1300 0,27 0,23

7,5 30 6000 2000 1750 0,26 0,23

10,0 40 7500 1500 0,23

Таблица 4.

Параметры £о и у монослоёв коллагена, сформированных на поверхности водных растворов н-гексанола.

Концентрация н-гексанола, моль/л 0 1,0-10"3 2,5-10° 3,17-10"3 5,0-10"3 7,5-10"3 1,0-1

Молекулярный монослой Е<), мН/м 20 20 14 13 10 8 2

7, Дж/модь 45 49 30 27 17 11 3

Фибриллярный монослой во, мН/м 67 49 27 23 23 22 5

у, Дж/моль 35 21 10 9 9 9 1

Монослои на растворах трет-бутанола.

Изотермы сжатия к-А поверхностных слоёв коллагена на растворах трет-бутанола (рис. 10) обнаруживают ряд одинаковых особенностей с изотермами на растворах н-гексанола и в то же время имеют и некоторые принципиальные отличия. В общем виде повышение концентрации спиртов приводит к

уменьшению устойчивости поверхностных слоев, о чём свидетельствует падение давления коллапса яс.

вода

0,027 М /яретя-бутанола 0,054 М трет-бутанола 0,081 М трет-бутанола —О— 0,108 М трет-бутанола -<3— 0,135 М трети-бутанола 0,162 М тре/и-бутанола

500 1000 1500 2000 2500 Площадь на молекулу А, нм"

Рис. 10. Изотермы сжатия гс-А монослоёв коллагена на водных растворах гт-ВиОН.

Трет-бутанол является последним из простейших алифатических спиртов, смешивающимся с водой при всех соотношениях и всех температурах. Использованные нами концентрации даре/и-бутанола невелики и при комнатной температуре отвечают состоянию растворов, когда все молекулы трет-бутанола образуют с молекулами воды устойчивые клатраты состава (СНз)зС0Н-(Н20)2|. В исследованном интервале концентраций /яре/я-бутанола (0-0,162 М), охватывающем переход от устойчивых к полностью неустойчивым поверхностным пленкам, на изотермах сжатия не обнаружены плато при низких л, отвечающих фазовому разделению смешанного монослоя. Для растекания коллагена в монослой определяющую роль играет поверхностное натяжение (ст) субфазы, причём величина о ~ 35 мН/м является критической для процесса растекания коллагена с образованием устойчивого монослоя. При сжатии монослоев отчетливо обнаруживается сдвиг изотерм л-А к началу координат (в сторону меньших я и А) по мере увеличения концентрации трет-бутанола в субфазе. Несмотря на то, что значения А^ в точках перегиба, соответствующих окончанию фибриллообразования, не зависят от природы и концентрации спирта, ход изотерм сжатия свидетельствует, что механизм фибриллообразования при концентрациях тре/и-бутанола в субфазе более 0,027 М отличается от рассмотренных для н-гексанола. Скорее всего фибриллы образуются постепенно в процессе сжатия в слабо упорядоченных системах, £о и у до точки окончания фибриллообразования падают практически линейно (табл. 5), не обнаруживая признаков кооперативности в изменениях системы. Свойства поверхностных слоев определяются, по-видимому, компенсационным

эффектом баланса воды в поверхностном слое: потеря устойчивости максимально гидратированного клатрата /яре/и-бутанола из-за уменьшения концентрации воды при сжатии ингибируется выделением воды вследствие фибриллообразования. Интересно отметить, что при концентрациях трет-бутанола > 0,081 М на изотермах наблюдаются участки плато при А < 300 нм\ что указывает на фазовый переход в смешанном монослое, состоящем из фибрилл коллагена и максимально гидратированных молекул /ире/я-бутанола. В этом случае фазовое разделение, по-видимому, иницируется резким изменением состава и структуры гидрата трет-бутанола. Для водных растворов /яре/и-бутанола такое явление наблюдается при концентрации ~ 4%.

Таблица 5.

Влияние концентрации отре/я-бутанола в субфазе на значения модуля эластичности Во и параметра у монослоёв коллагена.

Монослои коллагена Концентрация трет-бутанола. моль/л 0 0,027 0,054 0,081 0,108 0,135 0,16:

Молекулярный го, мН/м 20,3 19,5 11,4 14,4 5,1 3,5 0

монослой у, Дж/моль 44,8 43,5 15,5 16,2 5,3 3,6 0

Фибриллярный £0, мН/м 66,7 25,7 19,7 20,9 11,4 4,1 2,9

монослой ■у, Дж/моль 34,8 10,5 5,4 4,9 2,3 0,3 0,2

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Плошадь на молекулу А, нм2

0 50 100 150 200 250 Плошадь на молекулу А, нм"

Рис. 11. Изотермы сжатия-растяжения л-А монослоёв коллагена на 0,054 М т/гет-бутаноле. Циклический гистерезис для жидко-растянутс (а) и жидко-конденсированного (Ь) участков монослоя.

■ первое сжатие-растяжение сразу после нанесения коллагена

■ второе сжатие-растяжение через 1 мин после первого - третье сжатие-растяжение через 5 мин после второго

Исследования гистерезиса сжатия-растяжения монослоёв коллагена на растворах юреот-бутанола при концентрации 0,054 М показали, что по мере старения монослоя (рис. 11а) изотермы сжатия-растяжения обнаруживают всё большие различия: при циклическом режиме измерений значительные изменения изотерм наблюдаются уже через 6 минут старения. На участке фибриллярной поверхностной плёнки изменения изотерм сжатия нарастают как с числом сжатий (рис. 11Ь), так и в случае измерений равновесных монослоёв. Так, при первом сжатии поверхностных слоев в динамическом режиме 7tc равно 45 мН/м, при повторном, через минуту, 15 мН/м и при третьем сжатии через 5 минут после второго - 10,5 мН/м, для равновесного монослоя - 25 мН/м. Гистерезис растяжения во всех случаях показывает необратимый характер изменений поверхностного слоя.

Взаимодействие денатурирующих агентов с коллагеном в монослоях.

Изотермы сжатия-растяжения мономолекулярных слоев коллагена на водных растворах мочевины NH2CONH2 {рис. 12) и тиомочевины NHiCSNH2 обнаруживают существенное различие изменений поверхностных свойств коллагена, происходящих при введении этих компонентов в субфазу. Хорошо известно, что введение мочевины или тиомочевины в водные растворы белков приводит к их денатурации. Механизм действия мочевины обсуждается в огромном числе работ, действие тиомочевины исследовано менее подробно. Обычно считается, что необратимые изменения в молекулах белков (данные для глобулярных белков) происходят при концентрациях > 8,0 М мочевины. Интересно отметить, что изменение поверхностных свойств коллагена на растворах мочевины в какой-то мере аналогично изменениям, наблюдаемым на растворах трет-%утанола при низких концентрациях, тогда как влияние тиомочевины феноменологически аналогично действию н-гексанола.

Влияние мочевины на монослои коллагена.

В рамках принятой модели поверхностной ассоциации коллагена на поверхности вода-воздух изменение свойств на растворах мочевины можно интерпретировать следующим образом (рис. 12): 1) во всем исследованном интервале концентраций мочевины в субфазе процесс фибриллообразования при уменьшении расстояния между молекулами при сжатии по-прежнему имеет место, 2) фибриллярный поверхностный слой поддаётся сжатию в 1,5-2 раза до постоянной площади на молекулу = 170-200 нм2, то-есть до таких малых расстояний между молекулами коллагена, которые из прямых измерений сил взаимодействия отвечают необратимым изменениям фибриллярной структуры. Анализ основных параметров изотерм сжатия (А0, л плато и jtQ) показывает, что основные изменения параметров наблюдаются при возрастании концентрации мочевины до 1,0 М. В области составов водной субфазы от воды до 1-2 М мочевины её воздействие на состояние коллагена на поверхности увеличивается по мере увеличения концентрации мочевины, достигая некоторого постоянста. Это свидетельствует о том, что содеражание мочевины в приповерхностном слое сначала увеличивается с ростом концентрации, а

= 4013

60

О 500 1000 1500 2000 2500 3000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Площадь на молекулу А, нм'

Площадь на молекулу А, нм"

Рис. 12. Изотермы сжатия к-А монослоёв коллагена на поверхности водных растворов мочевины разной концентрации.

затем не меняется, что согласуется с тем, что мочевина мало влияет на поверхностное натяжение воды и интенсивного концентрирования на границе раздела не происходит. В таком случае, согласно данным можно было ожидать, что на поверхности происходят обратимые локальные изменения конформации полипептидных цепей в молекуле коллагена (без полного расплетения на отдельные полипептидные цепи), то-есть коллаген сохраняется в виде трехспиральных (однако дефектных на уровне 2-3 триплетов) молекул. Гидратационный объём и соотношение осей молекул коллагена несколько уменьшаются. Параметр у также уменьшается в той же области концентраций мочевины, свидетельствуя о резком уменьшении взаимодействия между молекулами коллагена на участке изотерм сжатия до плато и между фибриллами на участке после плато. Симбатно этому изменяются и значения модуля эластичности. Таким образом, слегка дефектный коллаген не теряет способности к фибриллообразованию, но образующиеся фибриллы сохраняют дефекты молекул коллагена. Снижение давления коллапса поверхностных плёнок коллагена снязано со снижением давления плато, при котором происходит фибриллообразование, и при концентрациях мочевины > 2 М, от давления плато до точки коллапса двумерное давление повышается примерно на одну и ту же величину = 10 мН/м. Итак, изменение поверхностных свойств коллагена на растворах мочевины связаны с небольшими изменениями конформации полипептидных цепей в молекулах коллагена и все изменения на поверхности ограничены начальной (обратимой) стадией денатурации коллагена. Ввиду того, что механизму денатурации белков под действием мочевины уделяется очень большое внимание, что также связано с задачей понимания деталей фолдинга белков, полученные данные проанализированы в работе для коллагена. В результате 40-летней дискуссии сложилось мнение (Напс1е1 Б., 1998), что два основных механизма - непрямого, через изменение структуры воды и прямого, через образование связей с полипептидным

скелетом, а также с неполярными и полярными боковыми аминокислотными остатками, не выполняются в случае белков. Энергетические оценки взаимодействия вода-вода, мочевина-мочевина и вода-мочевина, полученные в ряде работ с помощью компьютерного моделирования, показали, что взаимодействия изменяются лишь в гидратационных сферах, но не в объеме воды, причём все они усиливаются. Таким образом, можно думать, что внедрение мочевины в гидратную оболочку молекул коллагена, усиливающееся с ростом концентрации, приводит к изменению ее конфигурации и, как следствие, топологии молекулы, что в свою очередь приводит к изменению поверхностных свойств.

Денатурирующее действие тиомочевины на коллаген в монослое.

Совершенно по-иному ведут себя монослои коллагена, если субфаза представлена растворами тиомочевины (рис. 13). При концентрациях тиомочевины 2 0,1 М практически сразу при поджатии монослоя наблюдается фазовый переход (широкое плато при низких я). Молекулы тиомочевины несколько более гидрофобны и дифильны по сравнению с молекулами мочевины, что, по-видимому, приводит к повышению её концентрации не только в приповерхностном, но и в поверхностном слое. Даже, если принять тот же механизм денатурации, лимитирующийся перестройкой гидратной оболочки вокруг молекул белка, можно утверждать, что денатурация коллагена в этом случае происходит глубоко, включая последнюю стадию распада коллагена на отдельные полипептидные цепи (по сути, образование клубков желатины, обычно сопровождаемое необратимыми изменениями). Необратимые изменения являются следствием возникновения случайных связей, включая химические, внутри полипептидной цепи или между разными полипептидными цепями.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Площадь на молекулу А, нм"

Рис. 13. Изотермы сжатия л-А монослоёв коллагена на поверхности водных растворов тиомочевины.

Это подтверждается сильным возрастанием параметра у в интервале концентраций тиомочевины от 0,1 до 1,0 М при постоянной и низкой величине модуля эластичности. Образование фибрилл в этом случае исключается, а фазовый переход монослоя связан с конформационным переходом молекул коллагена. Участки сжатия после плато отражают поверхностные свойства клубкообразных полипептидных цепей.

Сделанные выводы были подтверждены при исследовании циклического гистереза сжатия-растяжения.

Выводы.

1. Впервые выделен и охарактеризован коллаген типа I из склеры глаза свиньи, определены условия образования стабильных монослоёв. Установлено, что непременным фактором ассоциации молекул коллагена является состояние, близкое к нативному.

2. На основании изотерм л-А, модуля эластичности (го), параметра у и циклического гистерезиса сжатия-растяжения для устойчивых монослоёв коллагена найдено, что отдельные участки л-А можно отнести к следующим стадиям ассоциации коллагена: 1) возникновение ориентации больших осей палочкообразных жёстких молекул коллагена, 2) образование фибрилл при площадях на молекулу ~ 600 нм2, что соответствует расстоянию между молекулами ~ 1,6 нм, заканчивается образование при площади ~ 350-300 нм2, 3) ориентационные явления фибрилл, 4) необратимая стадия объединения фибрилл в волокна (коллапс). Стадия фибриллообразования облегчена в 20-пространстве специфической ориентацией молекул тропоколлагена.

3. Установлено, что электростатические взаимодействия в значительной мере влияют на ассоциацию коллагена. Уникальное распределение по поверхности молекулы тропоколлагена положительно и отрицательно заряженных групп в изоэлектрическом состоянии оптимально отвечает возможности самоорганизации. Увеличение сил отталкивания одноимённо заряженных функциональных групп при отклонении рН от р/ ингибирует образование фибрилл вследствие электростатического барьера отталкивания. Введение электролита на стадии двумерной ориентации полностью подавляет эффект ингибирования.

4. Обнаружено, что в поверхностном слое коллагена на водных растворах н-гексанола существуют стерические препятствия притяжению молекул тропоколлагена на стадии фибриллообразования при низких концентрациях спирта, связанные с гидрофобными взаимодействиями н-гексанола с молекулами тропоколлагена в поверхностном слое. При высоких концентрациях н-гексанола в подложке вследствии образования конденсированного слоя н-гексанола наблюдается коллапс монослоёв коллагена на начальных стадиях сжатия. В совокупности с данными для монослоёв на водных растворах трет-бутанола сделан вывод,. что

стабильность поверхностных плёнок, воспроизводящих отдельные стадии самоорганизации зависит от поверхностного натяжения (ст) подложки.

5. Подтверждена определяющая роль изменений гидратных оболочек молекул коллагена в процессе образования фибрилл при исследовании монослоёв коллагена на растворах /ирг/«-бутанола и мочевины. Установлено, что устойчивость монослоев коллагена и фибриллообразование при сжатии на концентрированных растворах трет-бутанола лимитируется возможностью перераспределения воды в гидратных оболочках коллагена и трет-бутанола.

6. В исследованных условиях действие мочевины на границах вода-воздух определяется локальным нарушением конформации полипептидных цепей и не приводит к необратимой денатурации коллагена с разрушением молекул на отдельные полипептидные цепи. Показано, что тиомочевина обладает гораздо более выраженной денатурирующей способностью по отношению к коллагену по сравнению с мочевиной. На границе раздела вода-воздух глубина денатурации коллагена на 8,0 М мочевине намного меньше (начальная стадия) глубины структурных изменений коллагена на 0,1 М тиомочевины (конечная необратимая стадия денатурации). Предложен возможный механизм денатурирующего действия тиомочевины.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Фадеев А. С., Левачёв С. М., Ямпольская Г. П., Рудой В. М., Измайлова В. Н. Свойства монослоёв коллагена, сформированных на границе фаз вода-воздух. Влияние рН и ионной силы субфазы. "Коллоидный журнал", 1999, т. 61, № 4, стр. 558-566.

2. Фадеев А. С., Левачёв С. М., Измайлова В. Н. Мономолекулярные слои коллагена. "Вестник МГУ. Серия 2-Химия", 1999, т. 40, № 4, стр. 270-275.

3. Измайлова В. Н., Ямпольская Г. П., Туловская 3. Д., Левачёв С. М., Фадеев А. С. Мономолекулярные слои поверхностно-активных веществ на границе жидкость-воздух. Методические разработки к спецпрактикуму по коллоидной химии. Москва, Химический факультет МГУ, кафедра коллоидной химии, 1999, 29 с.

4. Фадеев А. С. Влияние рН на свойства монослоёв коллагена. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-97", 12-14 апреля 1997 года. Секция Химия. Выпуск 1. Россия, Москва, 1997, стр. 227.

5. Фадеев А. С., Левачёв С. М. Оптимизация метода выделения коллагена. Тезисы восьмой научно-технической конференции МГТУ, Мурманск, 1997.

6. Фадеев А. С. Монослои коллагена на водных растворах третичного бутилового спирта. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-98", 7-10 апреля 1998 года. Секция Химия. Россия, Москва, 1998, стр. 190.

7. Фадеев А. С., Левачёв С. М. Монослои коллагена на водных растворах трет-бутанола. Тезисы девятой научно-технической конференции МГТУ, Мурманск, 1998.

8. Izmailova V. N., Yampolskaya G. P., Levachev S. M., Tulovskaya Z. D., Pelekh V. V., Nuss P. V., Tarasevich B. N., Fadeyev A. S. Rheological properties of interfaciai layers of serum albumins in the presence of additives of different nature. XIX Symposium on Rheology, June 22-27, 1998. Collection of Abstracts, Lithuania, Klaipeda, 1998, p. 28.

9. Fadeyev A. S., Izmailova V. N., Levachev S. M. Surface elasticity of the collagen monolayers. International Conference on Colloid Chemistry and Physical-Chemical Mechanics, 4-8 October 1998. Oral and Poster Presentations Abstracts, Russia, Moscow, 1998, Section В, PB10, p. 157.

10. Фадеев А. С. Денатурация коллагена в монослое мочевиной и тиомочевиной. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99", 20-23 апреля 1999 года. Секция Химия. Россия, Москва, 1999, стр. 248.

11. Фадеев А. С. .Монослои коллагена на водных растворах мочевины. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99", 20-23 апреля 1999 года. Секция Химия. Россия, Москва, 1999, стр. 249.

12. Фадеев А. С., Левачёв С. М., Ямпольская Г. П., Измайлова В. Н. Монослои коллагена на водных растворах тиомочевины. Тезисы десятой научно-технической конференции М1ТУ, 20-30 апреля 1999 г. Мурманск, МГТУ, 1999, стр. 350-353.

i. введение. ii. литературный обзор.

1. Монослои белков и пептидов.

1.1. Получение мопослоёв белков и пептидов.

1.2. Стабильность монослоёв белков и полипептидов.

1.3. Монослои водорастворимых глобулярных белков.

1.3.1. Общая характеристика изотерм л-А.

1.3.2. Влияние рН и ионной силы подложки.

1.3.3. Конформационное состояние и образование специфических структур.

1.3.4. Реологические свойства.

1.3.5. Примеры монослоёв глобулярных белков.

1.3.6. Монослои р-казеина и желатины.

1.4. Монослои природных и синтетических полипептидов.

1.4.1. Природные полипептиды.

1.4.2. Синтетические полипептиды.

1.5. Монослои мембранных белков.

1.6. Монослои фибриллярных белков.

2. Коллаген.

2.1. Структура и свойства коллагена.

2.1.1. Первичная структура коллагена.

2.1.2. Типы коллагена.

2.1.3. Пространственное строение коллагена.

2.1.4. Коллаген в организме.

2.2. Физико-химические свойства растворов коллагена.

2.2.1. Перевод коллагена в растворимое состояние.

2.2.2. Переходы клубок-спираль и их обратимость.

2.2.3. Фибриллогенез коллагена in vitro.

2.2.4. Оптические свойства растворимого коллагена.

2.2.5. Влияние рН и ионной силы на свойства растворов коллагена.

2.2.6. Действие облучения на коллаген в растворе.

2.2.7. Реология водных растворов коллагена.

2.2.8. Адсорбция коллагена из растворов. iii. экспериментальная часть.

1 .Объекты исследования.

2. Методы исследования. iv. результаты и обсуждения.

1. Свойства монослоёв коллагена при разных pH подложки.

2. Влияние ионной силы подложки на монослои коллагена.

3. Действие различных спиртов на поверхностные свойства коллагена.

3.1. Взаимодействие коллагена с tert-BuOH, введённым в субфазу.

3.2. Влияние н-гексанола, введённого в субфазу, на свойства коллагена.

4. Взаимодействие денатурирующих агентов с коллагеном в монослоях.

4.1. Влияние мочевины в субфазе на монослои коллагена.

4.2. Денатурация коллагена тиомочевиной.

Вопрос о фолдинге (процесс сворачивания белковой глобулы за счёт нековалентных взаимодействий, приводящий к компактизации полипептидных цепей) белков на различных уровнях молекулярной организации является одним из важнейших в современном естествознании, причём одной из основных проблем является изучение нековалентных взаимодействий, определяющих специфичность формирующихся супрамолекулярных структур. Два подхода, развитые в современной химии высокомолекулярных соединений и коллоидной химии -оперирование с мономолекулярными плёнками с использованием техники Ленгмюра и прямое измерение сил взаимодействия с помощью силовой микроскопии -являются перспективными для исследований ассоциации и других специфических взаимодействий, характерных для белков.

Коллагены относятся к самому распространённому классу белков животного происхождения с ярко выраженной способностью к образованию надмолекулярных структур, заложеной в него природой. Этот процесс включает по крайней мере следующую иерархию структур: три полипептидные a-цепи (первичная структура), свёрнутые в левую спираль (вторичная структура), ассоциируются с образованием тройной правозакрученной спирали (супервторичная структура), образуя молекулу коллагена (называемую тропоколлагеном). Далее тропоколлаген (длина 300 нм, диаметр 1,4-1,5 нм) ассоциируется в фибриллы. В свою очередь фибриллы образуют супрамолекулярные ансамбли, играющие in vivo роль внеклеточного матрикса, выполняющего не только функции несущих конструкций, но и определённую роль в передаче информации клеткам, регулируя их адгезию, миграцию и др., а также специфические взаимодействия с белками, нуклеиновыми кислотами и неорганическими ионами. Нарушение специфической ассоциации приводит к тяжёлым патологиям, зачастую мало исследованным (так называемые "коллагеновые болезни"). In vivo нарушения самоассоциации связаны с мутациями, возникающими в первичной структуре (a-цепях), в основном вследствие замены в них одного-двух остатков глицина (Gly) на любую другую аминокислоту. In vitro аналогичные нарушения могут быть вызваны рядом физико-химических факторов.

Изучение мономолекулярных слоев позволяет экспериментально моделировать отдельные этапы ассоциации белков в двумерном (2D) пространстве. Актуальность исследований механизма ассоциации коллагена в 2D системах определяется также практическими задачами воспроизведения in vitro биосовместимых материалов, по механическим и функциональным свойствам аналогичных коллагеновым структурам in vivo.

Цель работы. Моделирование отдельных этапов образования надмолекулярных структур коллагена с использованием метода мономолекулярных слоев при широком варьировании состава водной субфазы.

Научная новизна.

• Впервые изучены свойства стабильных мономолекулярных слоев коллагена. Использованный подход позволил контролировать нековалентные взаимодействия при образовании надмолекулярных структур коллагена.

• Изотермы поверхностное давление - площадь, приходящаяся на молекулу (п-А) монослоёв коллагена характеризуются двумя близкими к линейным участками, разделёнными плато, условно названными жидко-растянутым и жидко-конденсированным. Жидко-растянутый участок отвечает мономолекулярному слою коллагена, в области плато образуются фибриллы. Жидко-конденсированный участок соответствует поверхностным плёнкам фибрилл коллагена. Плато разделяет ориентированные поверхностные слои: из ориентированных палочкообразных молекул тропоколлагена и ориентированных жёстких фибрилл коллагена. Точка коллапса связана с образованием неупорядоченных волокон.

• Показан вклад электростатических взаимодействий при образовании фибрилл и волокон коллагена. Отклонение рН субфазы от изоэлектрической точки в кислую и щелочную область препятствует образованию надмолекулярных структур коллагена.

• По изменению изотерм 7Г-А монослоёв коллагена при варьировании природы и состава субфазы показано, что потеря устойчивости монослоёв коллагена может быть вызвана фазовыми переходами в смешанных монослоях (с н-гексанолом), изменением активности воды {трет-бутанол) или денатурацией коллагена (мочевина и тиомочевина).

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют определить оптимальные условия для получения устойчивых многослойных ЛБ-плёнок коллагена определённой структуры и контролируемыми свойствами.

Автор защищает: о Предложенную схему ориентационных и фазовых переходов в монослоях коллагена на границе раздела вода-воздух и уточнённую модель фибриллы коллагена. о Наличие вклада электростатических взаимодействий в монослое с процессами фибриллообразования и видом изотерм тг-А. о Предложенные модели взаимодействия спиртов (н-гексанола и трет-бутанола) и денатурирующих агентов (мочевины и тиомочевины) с монослоями коллагена, ведущие к потере устойчивости монослоёв вследствие образования смешанного монослоя (с м-гексанолом), нарушения слоя структурированной воды вокруг молекулы коллагена (трет-бутаиол) и частичной или полной денатурации (мочевина и тиомочевина).

И. Литературный обзор.

V. Выводы.

1. Впервые выделен и охарактеризован коллаген типа I из склеры глаза свиньи, определены условия образования стабильных монослоёв.

2. На основании изотерм тс-А, модуля эластичности (£о), параметра у и циклического гистерезиса сжатия-растяжения для устойчивых монослоёв коллагена отдельные участки л-А отнесены к следующим стадиям ассоциации коллагена: 1) возникновение ориентации больших осей палочкообразных жёстких молекул коллагена, 2) образование фибрилл при площадях на молекулу ~ 600 нм , что соответствует расстоянию между молекулами ~ 1,6 нм, заканчивается образование при площади ~ 350-300 нм , 3) ориентационныс явления фибрилл, 4) необратимая стадия объединения фибрилл в волокна (коллапс). Стадия фибриллообразования облегчена в 20-пространстве специфической ориентацией молекул тропоколлагена.

3. Установлено, что электростатические взаимодействия в значительной мере влияют на ассоциацию коллагена. Уникальное распределение по поверхности молекулы тропоколлагена положительно и отрицательно заряженных групп в изоэлектрическом состоянии оптимально отвечает возможности самоорганизации. Увеличение сил отталкивания одноимённо заряженных функциональных групп при отклонении рН от р/ ингибирует образование фибрилл вследствие электростатического барьера отталкивания. Введение электролита на стадии двумерной ориентации полностью подавляет эффект ингибирования.

4. Обнаружено, что в поверхностном слое коллагена на водных растворах н-гексанола существуют стерические препятствия притяжению молекул тропоколлагена на стадии фибриллообразования при низких концентрациях спирта, связанные с гидрофобными взаимодействиями н-гексанола с молекулами тропоколлагена в поверхностном слое. При высоких концентрациях н-гексанола в подложке вследствии образования конденсированного слоя н-гексанола наблюдается коллапс монослоёв коллагена на начальных стадиях сжатия. В совокупности с данными для монослоёв на водных растворах /нрет-бутанола сделан вывод, что стабильность поверхностных плёнок, воспроизводящих отдельные стадии самоорганизации зависит от поверхностного натяжения (а) подложки.

5. Подтверждена определяющая роль изменений гидратных оболочек молекул коллагена в процессе образования фибрилл при исследовании монослоёв коллагена на растворах трет-бутанола и мочевины.

6. Установлено, что устойчивость монослоев коллагена и фибриллообразование при сжатии на концентрированных растворах трет-Ъутянож лимитируется возможностью перераспределения воды в гидратных оболочках коллагена и трет-бутанола.

7. В исследованных условиях действие мочевины на границах вода-воздух определяется локальным нарушением конформации полипептидных цепей и не приводит к необратимой денатурации коллагена с разрушением молекул на отдельные полипептидные цепи.

8. Показано, что тиомочевина обладает гораздо более выраженной денатурирующей способностью по отношению к коллагену по сравнению с мочевиной. На границе раздела вода-воздух глубина денатурации коллагена на 8,0 М мочевине намного меньше (начальная стадия) глубины структурных изменений коллагена на 0,1 М тиомочевины (конечная необратимая стадия денатурации). Предложен возможный механизм денатурирующего действия тиомочевины.

9. Установлено, что непременным фактором ассоциации молекул коллагена является состояние, близкое к нативному.

5. Заключение.

Изучение монослоёв фибриллярного белка коллагена наглядно показало, какие необычные поверхностные структуры, не встречающиеся среди монослоёв глобулярных белков, возможны для сильно анизотропных палочкообразных макромолекул. Способность к фибриллообразованию, сохраняющаяся в монослое, приводит к формированию таких же анизотропных стержнеобразных фибрилл, для которых сохраняются те же закономерности. Образование таких структур отличает монослои коллагена от монослоёв всех ранее изученных белков. В монослое коллаген проходит через те же стадии структурной организации, что и в объёме, причём двумерное состояние стабилизирует промежуточную фазу протофибрилл коллагена, что впервые позволило установить их структуру.

Основной особенностью монослоёв коллагена является то, что сжатие разреженного мономолекулярного слоя приводит его в итоге не к полному коллапсу с выходом из двумерной фазы и интенсивной десорбцией в объём, а образованию надмолекулярных структур (фибрилл), которые в свою очередь также образуют монослой со своей точкой коллапса. Из-за этого изотермы к-А монослоёв коллагена образуют два близких к линейным участка, разделённых плато, которые мы условно назвали жидко-растянутым и жидко-конденсированным. Всего на изотерме к-А можно выделить 5 характерных участков (рис. 9), поверхностная структура для каждого приведена на рис. 18. Предположительно, в фибриллярном монослое присутствует один тип фибрилл, структура которых была рассчитана (рис. 17). Зависимость от рН лс (рис. 11) зеркально противоположна по сравнению с другими полиэлектролитами из-за своеобразной зависимости кинетики образования надмолекулярных структур (как фибрилл, так и волокон) от рН. Отметим также, что получающиеся при сжатии монослоя коллагена надмолекулярные структуры (фибриллы) при растяжении достаточно легко диссоциируют обратно на отдельные молекулы, что в объёмной фазе сильно затруднено. Это тем более необычно, так как для глобулярных белков, например, для БСА ситуация прямо противоположная -двумерное состояние стабилизирует агрегаты (димеры, тримеры), которые в растворе легко распадаются при разбавлении. Наконец, обращает на себя внимание большая устойчивость двумерного состояния коллагена: на любых подложках сохраняется характер изотерм л-А и, соответственно, все структурные переходы в монослое; выраженная склонность к самоорганизации и образованию упорядоченных, но не кристаллических, структур независимо от состава подложки; десорбция начинается только в экстремальных условиях.

Рост ионной силы водной субфазы при добавлении KCl нивелирует влияние pH и приводит к увеличению л плато и лс монослоёв коллагена (рис. 16). Ассоциация молекул и фибрилл в монослое затруднена и для неё требуется большее л, чем на чистой воде, во и у монослоёв коллагена с ростом ионной силы увеличиваются в молекулярном и уменьшаются в фибриллярном монослое (рис. 21). Опыты по циклическому сжатию-растяжению как на воде, так и на растворах KCl, показывают наличие релаксационного гистерезиса, который уменьшается с увеличением времени выдержки монослоя в промежутках между циклами (рис. 13 и 20).

Представленная работа оказалась первой по изучению монослоёв фибриллярных белков на водно-спиртовых подложках. Эксперименты на растворах трет-бутанола наглядно показали, какую огромную роль играет структура воды в субфазе на свойства монослоя. Изменение структуры воды в субфазе с трет-бутанолом и его предполагаемая адсорбция на коллагене нивелируют поверхностную активность коллагена, уменьшая so монослоёв почти до нуля (рис. 26), причём особенно сильное воздействие наблюдается в фибриллярном монослое. Гистерезис в циклах сжатия-растяжения на поверхности 0,054 М трет-бутшола показывает необратимость изменений в монослое (рис. 25). Предложен механизм действия трет-бутапош, заключающийся в адсорбции молекул трет-бутанола на поверхности коллагена, изменяющей гидрофобно-липофильный баланс белка и увеличивающей ею растворимость в субфазе (рис. 24). Присутствие н-гексанола в субфазе приводит к образованию смешанного монослоя, значительно понижает и и го на всех участках изотерм л-А. однако значения А остаются прежними и десорбции не наблюдается (рис. 28 и 29).

Присутствие денатурирующих агентов в субфазе вызывает быстрое и необратимое изменение свойств коллагена в монослоях, возрастающее с увеличением концентрации денатураита и времени выдержки монослоя на подложке. Значения л плато и лс в 2-3 раза меньше, чем на воде, что говорит о нарушении процессов формирования фибрилл и волокон (рис. 31 и 36). Значения А для переходов в монослое коллагена практически не изменяются в присутствии мочевины и возрастают с тиомочевиной. Гистерезис в циклах сжатия-растяжения носит необратимый характер для обоих денатурантов (рис. 33, 34 и 38). Тиомочевина оказывает на монослои коллагена значительно более сильное денатурирующее действие, причём образующаяся желатина вначале остаётся в монослое, значительно расширяя его, а затем постепенно десорбируется в объёмную фазу, го в прису тствии мочевины сначала резко уменьшается, но после 1,0 М 1\И2ССЖН2 стабилизируется и практически не меняется с ростом концентрации мочевины (рис. 32). Величина у для фибриллярного монослоя также быстро уменьшается до 1,0 М МНгСОМЬ. после чего стабилизируется, а для молекулярного монослоя продолжает заметно уменьшаться. В случае тиомочевины во ведёт себя аналогично, но стабилизация значений го происходит после 0,1 М ОТ^СЗМИг (рис. 37). Величина у в присутствии тиомочевины изменяется аналогично для конденсированного монослоя, но для жидко-растянутого монослоя после 0,1 М ЫЬЬС^ЫН^ падение сменяется значительным подъёмом, что может говорить об увеличении сил когезии в монослое.

На основании полученных и имеющихся литературных данных предложен механизм денатурирующего действия тиомочевины на белки, заключающийся в гидрофобном взаимодействии группы С=8 тиомочевины с неполярными участками на поверхности белка с последующей переориентацией карбонильных групп белка на образование водородных связей с ХЬЬ-группами тиомочевины и разрывом собственных водородных связей. В случае коллагенового монослоя получившаяся таким образом молекула желатины легко десорбируется в объёмную фазу, где молекулы тиомочевины могут отщепиться и затем участвовать в денатурации новых молекул коллагена.

1. Ямпольская Г. П., Нусс 1.. В., Разникова Г. Ц., Измайлова В. Н. Мономолекулярные слои белков. В сб. Успехи коллоидной химии. Ленинград, "Химия", 1991, 292-305.

2. Eremenko Arkadi, Kurochkin Ilya, Chernov Sergei, Barmin Anatoli, Yaroslavov Alexander, Moskvitina Tatyana. Monomolecular enzyme films stabilized by amphiphilic polyelectrolytes for biosensor devices. "Thin Solid Films", 1995, 260(2), 212-216.

3. Sasabe Hiroyuki, Furuno Taiji, Otomo Jun, Sato Ayana, Nagamune Teruyuki, Ulmer Kevin M. Control of two-dimensional array of protein molecules for bioelectronics. "New Journal Chem. 1991,15(2-3), 149-152.

4. Sun S., Ho-Si P.-H., Harrison D. J. Preparation of active Langmuir-Blodgett films of glucose oxidase. "Langmuir", 1991, 7(4), 727-737.

5. Ерохин В. В., Каюшина Р. Л., Горкин II. Н., Курочкин И. Н., Попов Б. Н., Чернов С. Ф. Исследование гравиметрических биосенсоров. "Журнал аналитической химии", 1990, 45(7), 1446-1451.

6. Boncheva Mila, Duschl Claus, Beck Werner, Jung Guenter, Vogel Horst. Formation and characterization of lipopeptide layers at interfaces for the molecular recognition of antibodies. "Langmuir", 1996, 12(23), 5636-5642.

7. Mota F. M., Busquets M. A., Reig F., Alsina M. А., Наго I. Physicochemical study of several peptide constructs based on the sequence (96-107) of VP2-HAV protein. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1997, 188(1), 81-93.

8. Izmailova V. N., Yampolskaya G. P. Properties of Protein Layers at Liquid interfaces. In monograph "Proteins at Liquid Interfaces", ed. by D. Mobius and R. Miller, Amsterdam, "Elsevier Science Publisher", vol. 7, 1998, 103-148.

9. Скоупс P. Методы очистки белков. Пер. с англ. Москва, "Мир", 1985, 358 с.

10. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. Москва, "Мир", 1989, т. 1, 692 е., т. 2, 590 с.

11. Попов Е. М., Демин В. В., Шибанова Е. Д. Проблема белка. Том 2: Пространственное строение белка. Москва, "Наука", 1996, 480 с.

12. Kadler Karl. Extracellular matrix 1: Fibril-forming collagens. "Protein Profile ", 1995, 2(5), 491-619.

13. Fukada E. and Date M. Viscoelastic properties of collagen solutions in dilute hydrochloric acid. "Biorheolog)>", 1963, 1(2), 101-109.

14. Chirita G., Trandafir V. Rheologische Untersuchungen von Kollagenlosungen. "Leder", 1973, 24(7), 139-143.

15. Pawlak J., Blenkiewicz K. J. Le spectrendu collagene dans des solutions d'acide acetique. "Revue Technique des Industries du Cuir", 1984, 76(5), 130-131, 134-136, 138.

16. Кульман P. А. Адсорбционные слои коллагена. Влияние упорядоченных структур биополимеров в растворе на формирование адсорбционных слоев. "Доклады Академии наук СССР", 1971, 196(2), 386-389.

17. Dufrene Y. F., Marchai T. G., Rouxhet P. G. Influence of substatum surface properties on the organization of adsorbed collagen films: in situ characterization by atomic force microscopy. "Langmuir", 1999, 15(8), 2871-2878.

18. Nakamura Makoto, Kawato Kazuko, Matuura Ryohei. The monolayers of collagen and gelatin. "Memoirs of the Faculty of Science. Kyushu University. Series С -Chemistry", 1978, 10(3), 183-188.

19. Friess Wolfgang. Collagen. Biomaterial for drug delivery. "Eur. Journal Pharm. Biopharm. ", 1998, 45(2), 113-136.

20. Cotte J., Duman H. Le collagene et ses possibilités technologiques. "Journal de pharmacie de Belgique", 1991, 46(3), 201-210.

21. Измайлова В. Н., Ямпольская Г. П., Сумм Б. Д. Поверхностные явления в белковых системах. Москва, "Химия", 1988, 240 с.

22. Boncheva Mila, Vogel Horst. Formation of stable polypeptide monolayers at interfaces: controlling molecular conformation and orientation. "Biophysical Journal", 1997, 73(2), 1056-1072.

23. Malcolm Benjamin R. The flow and deformation of synthetic polypeptide monolayers during compression. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1985, 104(2), 520-529.

24. Ямпольская Г. П., Измайлова В. Н., Разникова Г. Ц., Нусс П. В. Ориентациоппый порядок в мономолекулярных слоях белков. "Известия Академии паук. Серия физическая", 1995, 59(3), 109-116.

25. Nitsch Walter, Maksymiw R. Catalase monolayers at the air/water interface. I. Reversibilities and irreversibilities. "Colloid and Polymer Science", 1990, 268(5), 452459.

26. Blank Martin, Lucassen Jacob, Van den Tempel Max. Elasticities of spread monolayers of bovine serum albumin and of ovalbumin. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1970, 33(1), 94-100.

27. Murray Brent S. Equilibrium and dynamic surface pressure-area measurements on protein films at air-water and oil-water interfaces. "Colloids and Surfaces, A", 1997, 125(1), 73-83.

28. MacRitchie F., Ter-Minassian-Saraga Lisbeth. Stability of highly compressed spread monolayers of iodine-125-labeled and cold BSA. "Progress in Colloid and Polymer Science", 1983, 68 (Front. Colloid Sci.), 14-19.

29. Игошин В. А., Бенинг Г. П., Выпряжкина Е. Г., Ямпольская Г. П. Равновесная и динамические изотермы двумерного давления монослоёв сывороточного альбумина. "Коллоидный журнал", 1986, 48(2), 251-256.

30. Flower Darren R. SERF: a program for accessible surface area calculations. "Journal of Molecular Graphics and Modelling", 1998, 15(4), 238-244.

31. Laskowski Roman A. SURFNET: a program for visualizing molecular surfaces, cavities, and intermolecular interactions. "Journal of Molecular Graphics", 1995, 13(5), 323-330.

32. Vorobjev Yury N., Hermans Jan. SIMS: computation of a smooth invariant molecular surface. "Biophysical Journal", 1997, 73(2), 722-732.

33. Fraczkiewicz Robert, Braun Werner. Exact and efficient analytical calculation of the accessible surface areas and their gradients for macromolecules. "Journal Comput. Chem.", 1998, 19(3), 319-333.

34. Cheng Yuen-Kit, Rossky Peter J. Surface topography dependence of biomolecular hydrophobic hydration. "Nature " (London), 1998, 392(6677), 696-699.

35. Sanner Michel F., Olson Arthur J., Spehner Jean-Claude. Reduced surface: an efficient way to compute molecular surfaces. "Biopolymers", 1996, 38(3), 305-320.

36. Eisenhaber Frank, Argos Patrick. Hydrophobic regions on protein surfaces: definition based on hydration shell structure and a quick method for their computation. "Protein Engineering", 1996, 9(12), 1121-1133.

37. Pattabiraman N., Ward К. В., Fleming P. J. Occluded molecular surface: analysis of protein packing. "Journal Mol. Recognit. ", 1995, 8(6), 334-344.

38. Jones Susan, Thornton Janet M. Analysis of protein-protein interaction sites using surface patches. "Journal of Molecular Biology", 1997,272(1), 121-132.

39. Adamson Arthur W., Gast Alice. Physical Chemistry of Surfaces. New York, "John Wiley & Sons", 1997, 808 p.

40. Ishii Toshio, Muramatsu Mitsuo. Spreadability of ovalbumin monolayers at the air-water interface. "Bulletin of the Chemical Society of Japan ", 1970, 43(8), 2364-2366.

41. Ishii Toshio, Muramatsu Mitsuo. Spreadability of ovalbumin monolayers at air-water interface. Effects of additives to spreading solutions. "Bulletin of the Chemical Society of Japan ", 1971, 44(3), 679-681.

42. Gabrielli Gabriella, Baglioni Piero, Ferroni Enzo. On the mechanism of collapse of monolayers of macromolecular substances: poly(Z, D and D/,)alaninc. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1981,81(1), 139-149.

43. Lavigne Pierre, Tancrede Pierre, Lamarche Francois, Grandbois Michel, Salesse Christian. The organization of poly(y-benzyl-L-glutamate) in the a-helical conformation at the air-water interface. "Thin Solid Films ", 1994, 242(1-2), 229-233.

44. Malcolm Benjamin R. The flow and deformation of synthetic polypeptide monolayers during compression. "Journal of the Colloid and Interface Science ", 1985, 104(2), 520-529.

45. Ries Herman E. Effect of the spreading solvent on monolayers of valinomycin. "Langmuir", 1990, 6(4), 883-885.

46. Львов Ю. M., Ерохин В. В., Зайцев С. Ю. Белковые плёнки Ленгмюра-Блоджетт. "Биологические мембраны", 1990,7(9), 917-937.

47. MacRitchie Finlay, Ter-Minassian-Saraga Lisbeth. Concentrated protein monolayers: desorption studies with radiolabeled bovine serum albumin. "Colloids and Surfaces ", 1984,10, 53-64.

48. MacRitchie F. Desorption of protein monolayers. "Journal of the Colloid and Interface Science ", 1977, 61(2), 223-226.

49. Herrington Т. M., Sahi S. S. Desorption of bovine serum albumin from the air-water interface. "Spec. Publ. R. Soc. Chem." 1987, 58, (Food Emulsions Foams), 188-206.

50. Herrington Т. M., Sahi S. S. Desorption of spread monolayers of 14C.methylated and cold BSA from the air-aqueous interface. "Colloids and Surfaces", 1988, 32(3-4), 289295.

51. Murray B. S. Dynamics of proteins at air-water and oil-water interfaces using novel Langmuir trough methods. "Progress in Colloid and Polymer Science", 1997, 103(Amphiphiles at Interfaces), 41-50.

52. Cho Daechul, Franses Elias I., Narsimhan Ganesan. Effect of diffusional losses on the formation of monolayers of soluble proteins at air/water interfaces with Tmrnit's method. "Colloids and Surfaces, A", 1996,117(1/2), 45-54.

53. MacRitchie F. Desorption of proteins from the air/water interface. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1985,105(1), 119-123.

54. MacRitchie F. Spread monolayers of proteins. "Advances in Colloid and Interface Science" (Amsterdam), 1986, 25(4), 341-385.

55. Чудинова Г. К., Покровская О. Н., Савицкий А. П. Влияние концентрации солей на процесс формирования монослоёв белков. "Известия Академии наук. Серия химическая", 1995, (10), 2038-2042.

56. Kozo Hamaguchi. The effect of salt on the monolayers of electrolytic copolypeptide. "Memoirs of the Institute of Scientific and Industrial Research, Osaka University ", 1954, 11, 175-177.

57. Bull Henry B. Monolayers of egg albumin on concentrated salt solutions. "Journal of American Chemical Society", 1945, 67(1), 4-8.

58. Bull Henry B. Monolayers of P-lactoglobulin on concentrated salt solutions. "Journal of American Chemical Society", 1945, 67(1), 8-10.

59. Minones Trillo J., Iribarnegaray Jado E., Garcia Fernandez S., Sanz Pedrero P. Monolayers of human serum albumin. II. Effect of pH and ionic strength substrate. "Kolloid-Zeitschrift undZeitschriftfur Polymere", 1972, 250(4), 325-329.

60. Thomas C., Ter-Minassian-Saraga L. Characterization of monolayers of a structural protein from myelin spread at the air/water interface. Effect of pH and ionic strength. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1976, 56(3), 412-425.

61. Ellis S. C. and Pankhurst K. G. A. Interaction of tanning materials with collagen monolayers. "Discussions of the Faraday Society", 1954,(16), 170-177.

62. Nitoo Kakiyama. Studies on tanning effect by means of the method of protein monolayer. I. Monolayers of gelatin. "Nippon Kagaku Zasshi", 1957, 78, 256-259.

63. Nitoo Kakiyama. Monolayers of proteins and tanning mechanism. II. Properties of gelatin monolayer and effect of chromium salt. III. Effects of vegetable tannin. IV. Effects of metal salts. "Nippon Kagaku Zasshi", 1961, 82, 535-538, 538-542, 542-545.

64. Арсланов В. В. Полимерные монослои и плёнки Ленгмюра-Блоджетт. Полиреакции в организованных молекулярных ансамблях: структурные превращения и свойства. "Успехи химии", 1991,60(6), 1155-1189.

65. Широкова Т. Ю., Волкова Н. Г., Трапезников А. А. Двумерное давление и реологические свойства монослоёв трипсина при разных площадях распространения. "Коллоидный журнал ", 1980,42(5), 921-928.

66. Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества: Справочник. Под ред. А. А. Абрамзонаи Е. Д. Щукина, Ленинград, "Химия", 1984, 392 с.

67. Трапезников А. А., Волкова Н. Г., Широкова Т. Ю. Двумерное давление и упругие свойства монослоёв лизоцима на границах раздела воздух-солевая подкладка и углеводород-солевая подкладка. "Доклады Академии наук СССР", 1984,276(4), 903-907.

68. Сухомлинов Б. Ф., Малеева И. И. Исследование поверхностного давления монослоёв гемоглобина. В сб. Молекулярная генетика и биофизика. Киев, 1980, (5), 120-124.

69. Min Dong J., Winterton Lynn and Andrade Joseph D. Behavior of model proteins, pretreated in urea and/or dithiothreitol at air/solution interfaces. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1998, 197(1), 43-47.

70. Nitsch Walter, Maksymiw Roman and Erdmann Helmut. Lipase monolayers at the air-water interface: interfacial behavior and enzymatic activity. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1991, 141(2), 322-328.

71. Cheesman D. F. and Schuller H. Surface inactivation of pepsin. "Journal of Colloid Science", 1954, 9(2), 113-121.

72. Белки и пептиды. Под ред. В. Т. Иванова и В. М. Липкина. Москва, "Наука", 1995, том 1,448 с.

73. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия. Москва, "Просвещение", 1987, 815 с.

74. Галактионов В. Г. Иммунология. Москва, изд-во МГУ, 1998, 480 с.

75. Tronin A., Dubrovsky Т., Nitti С. De, Gussoni A., Erokhin V., Nicolini С. Langmuir-Blodgett films of immunoglobulins IgG. Ellipsometric study of the deposition process and of immunological activity. "Thin Solid Films", 1994,238(1), 127-132.

76. Alsina A., Vails O., Castillo M. Physicochemical study of surface monolayers of human immunoglobulin G and its fragments. "Anales de la Real Academia de Farmaeia", 1978, 44(3), 393-401.

77. Лаврентьев В. В., Часовникова Л. В., Тарханова И. О., Фишевская Е. В., Кульберг А. Я. Исследование иммуноглобулина G и его протеолитических фрагментов методом мономолекулярных слоев. "Биофизика", 1980, 25(3), 432-438.

78. Часовникова Л. И., Матвеева Н. А., Лаврентьев В. В. Исследование конформационной устойчивости иммуноглобулинов G в монослоях на границе фаз водные растворы NaCl октан. "Биофизика", 1982, 27(3), 435-440.

79. Матвеева П. А., Часовникова Л. В., Лаврентьев В. В. Сравнительное изучение нормального и миеломного иммуноглобулина G в мономолекулярных слоях на границах воздух-вода и масло-вода. "Биофизика", 1983, 28(3), 407-411.

80. Лаврентьев В. В. Часовникова Л. В., Курек А. К., Алешкин В. А. Изменение ориентации мышиного миеломного иммуноглобулина G мыши в монослоях в результате обработки дезоксихолатом натрия. "Биофизика", 1987, 32(1), 37-41.

81. Часовникова Л. В., Курек А. К., Алешкин В. А., Лаврентьев В. В. Неионогеапое ПАВ как регулятор ориентации миеломного IgG мыши в мономолекулярных слоях. "Коллоидный журнал ", 1987, 49(2), 402-405.

82. Tronin A., Dubrovsky Т., Nitti С. De, Gussoni A., Erokhin V., Nicolini С. Langmuir-Blodgett films of immunoglobulins IgG. Ellipsometric study of the deposition process and of immunological activity. "Thin Solid Films", 1994, 238(1), 127-132.

83. Tronin A., Dubrovsky Т., Nicolini C. Comparative study of Langmuir monolayers of Immunoglobulin G formed at the air-water interface and covalently immobilized on solid supports. "Langmuir", 1995,11(2), 385-389.

84. Dubrovsky Т., Tronin A., Dubrovskaya S., Vakula S., Nicolini C. Immunological activity of IgG Langmuir films oriented by protein A sublayer. "Sensors and Actuators. B, Chemical", 1995, B23(l), 1-7.

85. Ahluwalia Arti, Stussi Elisa, Domenici Claudio. Mechanical Properties of Immunoglobulin G and Albumin Monolayers. "Langmuir", 1996, 12(2), 416-422.

86. Пчелин В. А. Поверхностные потенциалы растворов аминокислот и протеинов. "Журнал физической химии", 1940,14(8), 1085-1102.

87. Minones Trillo J., Iribarnegaray Jado E., Garcia Fernandez S., Sanz Pedrero P. Monolayers of human serum albumin. I. Effect of the solution and method for the spreading. "Kolloid-Zeitschrift und Zeitschrift fur Polymcre ", 1972, 250(4), 318-324.

88. Birdi K. S. The determination of work of compression of protein monolayers at the air-water interface. "Kolloid-Zeitschrift und Zeitschrift fur Polymere", 1972, 250(3), 222226.

89. Birdi K. S., Gabrielli G., Puggelli M. Monolayers of proteins. Application of an equation of a two-dimensional state. "Kolloid-Zeitschrift und Zeitschrift fur Polymere", 1972, 250(6), 591-593.

90. Rosano Henri L., Chen Shu Hsien, Whittam James H. Surface drag viscosity of bovine serum albumin monolayers. "The Journal of Physical Chemistry", 1974, 78(22), 22662270.

91. Ямпольская Г. П., Измайлова В. Н., Туловская 3. Д. Регулирующая роль поверхностной энегрии в липолитических реакциях. В "Итоги науки и техники", Москва, ВИНИТИ, серия Биотехнология, т. 4, 1987, 199-269.

92. Wilson Michael, Mulvihill Daniel M., Donnelly William J., Gill Brian P. Surface active properties at the air-water interface of P-casein and its fragments derived by plasmin proteolysis. "Journal of Dairy Research", 1988 (Pub. 1989), 56(3), 487-494.

93. Mitchell J., Irons L., Palmer G. J. Spread and adsorbed films of the casein components of bovine milk. Chun. Phys. Appl. Prat. Ag. Surface, C. R. Congr. Int. Detcrg., 5th 0913 Sep. 1968 (Pub. 1969), 2 (Pt.l), 495-504.

94. Douillard Roger, Daoud Mohamed, Lefebvre Jacques, Minier Christophe, Lecannu Gerald, Coutret Jocelyne. State equation of P-casein at the air/water interface. "Journal of the Colloid and Interface Science ", 1994,163(2), 277-288.

95. Mellema, M.: Clark, D. С.; Husband, F. A.; Mackie, A. R. Properties of (3-Casein at the Air/Water interface As Supported by Surface Rheological Measurements. "Langmuir", 1998,14(7), 1753-1758.

96. Footnote Rosario Rodgruez Nio, Cecilio Carrera Snchez, Juan M. Rodgruez Patino. Interfacial characteristics of P-casein spread films at the air-water interface. "Colloids and Surfaces В: Biointerfaces", 1999,12(3-6), 161-173.

97. Clark S. G. and Holt P. F. Interaction of silicic acid with collagen and gelatin monolayers. "Transaction of the Faraday Society", 1957, 53(11), 1509-1515.

98. Wuestneck R., Hermel H., Kretzschmar G. Effect of the type of gelatin on the surface properties of the gelatin + surfactant system. "Colloid and Polymer Science", 1984, 262(10), 827-832.

99. Трапезников А. А., Вине В. E. Способность желатины к распространению по поверхности воды n к адсорбции из водных растворов по данным двухмерного давления и реологических свойств. "Коллоидный журнал ", 1981, 43(3), 519-527.

100. Kemp George, Wenner Charles E. Interaction of valinomycin with cations at the air-water interface. "Biochimica et Biophysica acta", 1972,282(1), 1-7.

101. Ries Herman E., Swift Hewson S. Monolayers of valinomycin and its equimolar mixtures cholesterol and with stearic acid. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1978, 64(1), 111-119.

102. Birdi K. S., Gevod V. S. Monolayers of globular proteins and membrane proteins (A: melittin; B: valinomycin) a membrane model system. Part B: Monomolecular films of valinomycin (at air-water interface). "Biophys. Membr. Transp. ", 1984, (1), 37-46.

103. Abraham Bernard M., Ketterson J. B. Determination of the viscosity of valinomycin monolayers as a function of surface density and a comment on conformation. "Langmuir", 1985, 1(4), 461-464.

104. Ries Herman E., Swift Hewson. Monolayers of two transmembrane channel formers and an ionophore. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1987, 117(2), 584588.

105. Зайцев С. Ю., Зубов В. П. Ионная избирательность валиномицина в монослоях. "Биологические мембраны", 1988,6(8), 883-891.

106. Zaitsev S. Yu., Zubov V. P., Moebius D. Monolayer characteristics of valinomycin in the presence of various cations in aqueous subphase. "Biochimica et Biophysica Acta", 1993, 1148(), 191-196.

107. Mita Tomoyoshi. Effect of cation binding on the conformation of gramicidin A and valinomycin in monolayers. "Bulletin of the Chemical Society of Japan", 1993, 66(5), 1490-1495.

108. Ксенжек О. С., Гевод В. С. Мелиттин: поверхностная активность и возможный механизм литического действия. "Биологические мембраны", 1985, 2(4), 395-404.

109. Ксенжек О. С., Гевод В. С. Мелиттин и фрагмент 8-26. Различия во взаимодействии с анионами на границе раздела фаз вода-воздух. "Биологические мембраны", 1985, 2(5), 510-515.

110. Ксенжек О. С., Гевод В. С. Взаимодействие дискретных зарядов на границе раздела фаз причина аномально высокой поверхностной активности мелиттина. "Доклады Академии наук Украинской ССР. Серия Б: Геология, химия и биологические науки", 1985, (3), 69-72.

111. Birdi К. S., Gevod V. S. Monolayers of globular proteins and membrane proteins (A: melittin; B: valinomycin) a membrane model system. Part A: A-I. Melittin monolayers at the air-water interface. "Biophys. Membr. Transp. ", 1984, (1), 10-36.

112. Birdi K. S., Gevod V. S. Melittin and ionic surfactant interactions in monomolecular films. "Colloid and Polymer Science", 1987, 265(3), 257-261.

113. Wackerbauer Gerhard, Wis Ingrid, Schwarz Gerhard. Preferential partitioning of melittin into the air/water interface: structural and thermodynamic implications. "Biophysical Journal", 1996,71(3), 1422-1427.

114. Toshizo Isemura and Kozo Hamaguchi. Surface chemistry of synthetic protein analogs. I. Surface pressure-area relation of synthetic polypeptides as the model of proteins. "Bulletin of the Chemical Society of Japan ", 1952, 25(1), 40-45.

115. Toshizo Isemura and Kozo Hamaguchi. Surface chemistry of synthetic protein analogs. III. The surface viscosity of monolayers of nonelectrolytic synthetic polypeptides. "Bulletin of the Chemical Society of Japan", 1954, 27, 125-130.

116. Toshizo Isemura, Shoichi Ikeda and Takuya Yamashita. Surface chemistry of synthetic polypeptides poly-Z-proline and poly(Z-prolyl-Z-leucylglycine). "Memoirs of the Institute of Scientific and Industrial Research, Osaka University", 1958, 15, 167172.

117. Riou S. A., Hsu S. L., Stidham H. D. Characterization of Helical Sense Transition for Poly(:i-benzyl /.-Aspartate) Constrained to the Air-Water Interface. "Langmuir", 1998, 14(11), 3062-3066.

118. Shoichi Ikeda and Toshizo Isemura. Differences in monolayer properties of poly(y-benzyl L-glutamate) and poly((3-benzyl Z-aspartate). "Bulletin of the Chemical Society of Japan", 1961, 34, 416-422.

119. Gabrielli G., Ferroni E., Pugelli M., Huggins M. L. Study of the bidimensional state conformation of poly-P-benzyl-Z-aspartate. II. Comparison with Huggin's theory. "Colloid and Polymer Science", 1978, 256(5), 417-421.

120. Gabrielli G., Puggelli M., Dei L., Domini C. Mixed monolayers of polypeptides. "Colloid and Polymer Science ", 1988, 266(5), 429-436.

121. Baier Robert E., Zisman William A. Influence of polymer conformation on the surface properties of poly(y-methyl-L-glutamate) and poly(y-benzyl-L-glutamate). "Macromolecules ", 1970, 3(1), 70-79.

122. Albert A., Cordoba J. Pure and mixed monolayers of poly-Z-methionine and poly(y-m ethyl-/.-glutamate) with 1,2-dioleyl-L-a-phosphatidylcholine at an air-water interface. "Colloid and Polymer Science ", 1984, 262( 10), 811 -816.

123. Арсланов В. В. Полимерные монослои и плёнки Ленгмюра-Блоджетт. Влияние химической структуры полимера и внешних условий на формирование и свойства организованных планарных ансамблей. "Успехи химии", 1994, 63(1), 342.

124. Lavigne Pierre, Tancrede Pierre, Lamarche Francois, Grandbois Michel, Salesse Christian. The organization of poly(y-benzyl-L-glutamate) in the a-helical conformation at the air-water interface. "Thin Solid Films", 1994, 242(1-2), 229-233.

125. Shoichi Ikeda. Condensation and expansion of polypeptide monolayers. I. Monolayers of poly-/)/.-alanine. "Annual Report of Scientific Works, Faculty of Science, Osaka University", 1962,10, 13-22.

126. YamashitaTakuya, Yamashita Shinsuke. Monolayers of polyalanine. "Маки", 1976, 1(3), 225-230.

127. Gabrielli Gabriella, Baglioni Piero, Ferroni Enzo. On the mechanism of collapse of monolayers of macromolecular substances: poly(£, D and £>L)alanine. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1981,81(1), 139-149.

128. Lavigne Pierre, Tancrede Pierre, Lamarche Francois. The monolayer technique as a tool to study the energetics of protein-protein interactions. "Biochimica et Biophysica Acta", 1998,1382(1), 249-256.

129. Геннис P. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. Пер. с англ. Москва, "Мир", 1997, 624 с.

130. Atsuchi Hyono, Shigeko Kuriyama, Kenzo Tsuji and Yuji Hosoya. Monolayer film rhodopsin at the air/water interface. "Nature", 1962, 193(4816), 679-680.

131. Hwang San-Bao, Korenbrot Juan I., Stoeckenius Walter. Structural and spectroscopic characteristics ofbacteriorhodopsin in air-water interface films. "Journal of Membrane Biology", 1977,36(2-3), 115-135.

132. Karan Hiroko Ito, Hirsch Rhodaq Elison, Brody Seymour Steven. Stability and regeneration of rhodopsin absorption spectra at air-water interface. "Zeitschrift fur Naturforschung. TellC, Biosciences", 1978, 33C(5-6), 317-320.

133. Vivino A., Berns D. S., Brody S. S. Light and pH induced changes in the surface pressure-area isotherms ofbacteriorhodopsin. "Photochemistry and Photobiology", 1980,31(4), 363-366.

134. Лукашев E. П., Зайцев С. Ю., Кононенко А. А., Зубов В. П. Фотоэлектрические свойства мономолекулярных плёнок бактериородопсина. "Доклады Академии наук СССР", 1989, 308(1), 225-230.

135. Sukhorukov G. В., Lobyshev V. L., Erokhin V. V. Preparation and X-ray study of bacteriorhodopsin Langmuir films. "Molecular Ciystals and Liqitid Crystals Sci. Technol., Sect. C", 1992,1(1), 91-95.

136. Liu S. H., Du Weichong. Optical nonlinearity of pure bacteriorhodopsin Langmuir-Blodgett films derived from multi-wave mixing. "AIP Conf. Proc. ", 1994, 290 (Laser Spectroscopy), 162-164.

137. Нелинейные оптические свойства Ленгмюр-Блоджетт монослоёв бактериородопсина. Алексеев А. С., Валянский С. Л., Савранский В. В. " Груды Института Общей Физики, РАН", 1992, 38, 131-150.

138. Lemmetyinen Helge, Ikonen Marjo. Photo-induced optical and electrical signals on highly oriented bacteriorhodopsin Langmuir-Blodgett films. "Trends Photochem. Photobiol. ", 1994, 3(2), 413-426.

139. Зайцев С. Ю., Маак Ю., Мёбиус Д., Зубов В. П. Фотоиндуцированные изменения в монослоях бактериородопсина, исследованные методом брустеровского рассеяния. "Биологические мембраны", 1994,11(4), 461-464.

140. Рере Isidore Mario, Nicolini Claudio. Langmuir-Blodgett films of photosensitive proteins. "Journal ofPhotochemistry and Photobiology, B", 1996, 33(3), 191-200.

141. Рере I. M., Ram M. K., Padden S., Nicolini C. Langmuir-Blodgett films of rhodopsin: an infrared spectroscopic study. "Thin Solid Films", 1998, 327-329, 118122.

142. Степанов В. M. Молекулярная биология. Структура и функции белков. Москва, "Высшая школа", 1996, 335 с.

143. Наггар В. S. The molecular weight at the air-water interface of some keratin derivatives extracted from wool. "Australian Journal of Biological Sciences", 1955, 8, 122-128.

144. Bull Henry B. Determination of molecular weights of proteins in spread monolayers. "Journal of Biological Chemistry", 1950,185(1), 27-38.

145. Watanabe Akira, Ono Yoshiki. On monomolecular layers of silk proteins. "Bulletin Fac. Text. Sci. Kyoto Univ. Ind. Arts and Text. Fibers", 1970, 6(1), 61-73.

146. Shimizu Yoshiaki, Kimura Mitsuo. Surface activity of silk fibroin and water-soluble proteins. "Sen 'i Gakkaishi", 1978, 35(5), T214-T216 (Japan).

147. Muller Wayne S., Samuelson Lynne A., Fossey Stephen A., Kaplan David L. Formation and characterization of Langmuir silk films. "Langmuir", 1993,9(7), 18571861.

148. Muller Wayne S., Samuelson Lynne A., Fossey Stephen A., Kaplan David. Formation and properties of silk thin films. "ACS Symp. Ser.", 1994, 544 (Silk Polymers), 342-352.

149. Munch-Petersen Agnete. Effect of adenosine triphosphate on monolayers of myosin. "Nature", 1948,162(4118), 537.

150. Трапезников А. А. Упругие свойства монослоёв белков (миозина и миогена) и их зависимость от температуры в связи с тепловой денатурацией. "Доклады Академии наук СССР", 1948, 63(1), 57-60.

151. Трапезников А. А. Сопоставление динамического и статического методов исследования упруго-вязких свойств монослоёв белков. "Доклады Академии наук СССР", 1950, 74(3), 525-528.

152. Lajtha Abel and Rideal Eric К. The spreading of monolayers of myosin. "Archives of Biochemistry and Biophysics", 1951, 33, 252-258.

153. Tern Hayashi. Contractile properties of compressed monolayers of actomyosin. "Journal of General Physiology", 1952, 36, 139-152.

154. Cheesman D. F. The effect of adenosine triphosphate (ATP) on unimolecular films of myosin and actomyosin. "The Journal of Physiology" (London), 1952, 116, 34P-35P.

155. Kashiwagi K. and Rabinovich B. A surface study of myosin monolayers and certain biologically important substrates. I. Adenosinetriphosphate. "The Journal of Physical Chemistry", 1955, 59, 498-502.

156. Трапезников А. А. Влияние температуры на структурно-реологические свойства монослоёв миозина. "Коллоидный журнал ", 1985, 47(2), 348-354.

157. Vassilev Р. М., Taneva S., Panaiotov I. and Georgiev G. Dilatational viscoelastic properties of tubulin and mixed tubulin-lipid monolayers. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1981, 84(1), 169-174.

158. Nimni Marcel E. Collagen: Biochemistry, Biomechanics, Biotechnology. City, "Franklin Book Company", 1999, Vol. 1, 384 p.; Vol. 2, 336 p.; Vol. 3, 368 p.

159. Burjanadze Thengiz V., Veis Arthur. A thermodynamic analysis of the contribution of hydroxyproline to the structural stability of the collagen triple helix. "Connective Tissue Research", 1997, 36(4), 347-365.

160. Brodsky Barbara, Ramshaw John A. M. The collagen triple-helix structure. "Matrix Biol.", 1997, 15(8-9), 545-554.

161. Reichenberger Ernst, Olsen Bjorn R. Collagens as organizers of extracellular matrix during morphogenesis. "Seminars in Cell and Developmental Biology", 1996, 7(5), 631-638.

162. Ramachandran G. N. Treatise on collagen. London, "Academic Press": Vol. 1. Chemistry of collagen, 1967, XIII, 556 p.

163. Treatise on collagen. Ed. Gould Bermard S. London-New York, "Academic Press", Vol. 2. Biology of Collagen. Part A. 1968, XVIII, 434 p.; Part В, XVI, 488 p.

164. Miller Edwardn J. Biochemical characteristics and biological significance of the genetically-distinct collagens. "Molecular and cellular biochemistry", 1976, 13(3), 165-192.

165. Beck Konrad and Brodsky Barbara. Supercoiled protein motifs: the collagen triple-helix and the a-helical coiled coil. "Journal of Structural Biology", 1998, 122(1/2), 17-29.

166. Шулыд Ееорг E., Ширмер Хайнер P. Принципы структурной организации белков. Пер. с англ., Москва, "Мир", 1982, 354 с.

167. Cannon Donald J., Cintron Charles. Collagen cross-linking in corneal scar formation. "Biochimica et Biophysica Acta", 1975,412(1), 18-25.

168. Yamauchi Mitsuo, Chandler Gloria S., Tanzawa Hideki and Katz Elton P. Cross-linking and the molecular packing of corneal collagen. "Biochemical and Biophysical Research Communications ", 1996, 219, 311-319.

169. Wilkinson S. J., Hukins D. W. L. Determination of collagen fibril structure and orientation in connective tissues by X-ray diffraction. "Radiation Physics and Chemistry", 1999, 56, 197-204.

170. Wess T. J., Hammersley A. P., Wess L., Miller A. A Consensus Model for Molecular Packing of Type I Collagen. "Journal of Structural Biology", 1998, 122(1/2), 92-100.

171. Wess T. J., Hammersley A. P., Wess L., Miller A. Molecular Packing of type I Collagen in Tendon. "Journal of Molecular Biology", 1998, 275(2), 255-267.

172. Knupp Carlo, Chew Michael, Morris Ed, Squire John. Three-dimensional reconstruction of a collagen IV analogue in the Dogfish egg case wall. "Journal of Structural Biology", 1996, 117(3), 209-221.

173. Brodsky Barbara, Belbruno Kathleen Cassidy, Hardt Thomas A., Eikenberry Eric F. Collagen fibril structure in Lamprey. "Journal of Molecular Biology", 1994, 243(1), 38-47.

174. Baselt David R., Revel Jean Paul, Baldeschwieler John D. Subfibrillar structure of type I collagen observed by atomic force microscopy. "Biophysical Journal", 1993, 65(6), 2644-2655.

175. Raspanti Mario, Alessandrini Andrea, Ottani Vittoria, Ruggeri Alessandro. Direct Visualization of Collagen-Bound Proteoglycans by Tapping-Mode Atomic Force Microscopy. "Journal of Structural Biology", 1997,119(2), 118-122.

176. Chen James M., Kung Chun E., Feairheller Stephen H., Brown Eleanor M. An energetic evaluation a "Smith" collagen microfibrill model. "Journal of Protein Chemistry", 1991, 10(5), 535-552.

177. King Gregory, Brown Eleanor M., Chen James M. Computer model of a bovine type I collagen microfibril. "Protein Engineering", 1996, 9(1), 43-49.

178. Brown Eleanor M., King Gregory. Use of computer-generated models in studies of modified collagen. "Journal of the American Leather Chemists' Association", 1996, 91(6), 161-170.

179. Brown Eleanor M., King Gregory, Chen James M. Model of the helical portion of a type I collagen microfibril. "Journal of the American Leather Chemists' Association ", 1997, 92(1), 1-7.

180. Bella Jordi, Berman Helen M. Crystallographic Evidence for C-H •0=C Hydrogen Bonds in a Collagen Triple Helix. "Journal of Molecular Biology", 1996, 264(4), 734742.

181. Mayo Kevin H. NMR and x-ray studies of collagen model peptides. "Biopolymers", 1996, 40(4), 359-370.

182. Prockop Darwin J., Fertala Andrzej. The Collagen Fibril: The Almost Crystalline Structure. "Journal of Structural Biology", 1998,122(1/2), 111-118.

183. Мазуров В. И. Биосинтез коллагеновых белков. В сб. Успехи биологической химии, том 15. Москва, "Наука", 1974, 85-120.

184. Structure and function of collagen types. Ed. Mayne Richard, Burgeson Robert E. Orlando, "Academic Press", 1987, 317 p.

185. Kadler Karl E., Holmes David F., Trotter John A., Chapman John A. Collagen fibril formation. "Biochemical Journal", 1996,316(1), 1-11.

186. Miyahara M., Hayashi K., Berger J., Tanzawa K., Njieha F. K., Trelstad R. L. and Prockop D. J. Formation of collagen fibrils by enzymic cleavage of precursors of type I collagen in vitro. "Journal of Biological Chemistry", 1984, 259(15), 9891-9898.

187. Drouven B. J. and Evans С. H. Collagen fibrillogenesis in the presence of lanthanides. "Journal of Biological Chemistry", 1986,261(25), 11792-11797.

188. Na G. C., Butz L. J. and Carroll R. J. Mechanism of in vitro collagen fibril assembly. Kinetic and morphological studies. "Journal of Biological Chemistry", 1986, 261(26), 12290-12299.

189. Silver F. H. Type I collagen fibrillogenesis in vitro. Additional evidence for the assembly mechanism. "Journal of Biological Chemistry", 1981, 256(10), 4973-4977.

190. Gelman R. A. and Piez K. A. Collagen fibril formation in vitro. A quasielastic light-scattering study of early stages. "Journal of Biological Chemistry", 1980, 255(17), 8098-8102.

191. Fratzl Peter, Misof Klaus, Zizak Ivo, Rapp Gert, Amenitsch Heinz, Bernstorff Sigrid. Fibrillar Structure and Mechanical Properties of Collagen. "Journal of Structural Biology", 1998, 122(1/2), 119-122.

192. Jarial M. S., Ganion L. R., Verhoestra B. A. Ultrastructure of the collagen fibrils in the coelacanth. "Journal of Fish Biology", 1999,55(5), 1119-1122.

193. Muthukumaran G., Blumberg B. and Kurkinen M. The complete primary structure for the a 1-chain of mouse collagen IV. Differential evolution of collagen IV domains. "Journal of Biological Chemistry", 1989, 264(11), 6310-6317.

194. Pihlajaniemi T., Pohjolainen E. R. and Myers J. C. Complete primary structure of the triple-helical region and the carboxyl-tenninal domain of a new type IV collagen chain, a5(IV). "Journal ofBiological Chemistty", 1990,265(23), 13758-13766.

195. Exposito J. Y., D'Alessio M., Liberto M. Di and Ramirez F. Complete primary structure of a sea urchin type IV collagen a-chain and analysis of the 5' end of its gene. "Journal of Biological Chemistry", 1993, 268(7), 5249-5254.

196. Greenspan D. S., Cheng W. and Hoffman G. G. The pro-al(V) collagen chain. Complete primary structure, distribution of expression, and comparison with the pro-al(XI) collagen chain. "Journal of Biological Chemistry", 1991, 266(36), 2472724733.

197. Silver F. H. and Trelstad R. L. Type I collagen in solution. Structure and properties of fibril fragments. "Journal of Biological Chemistry", 1980, 255(19), 9427-9433.

198. Haruhiko Noda. Physico-chemical studies on the soluble collagen of rat tail tendon. "Biochimica et Biophysica Acta", 1955,17, 92-98.

199. Кутьин В. А., Кочетова С. П., Голованова П. М. Об исследовании процесса гелеобразования из надмолекулярных структур коллагена. "Кожевенно-обувиая промышленность", 1972, (11), 32-34.

200. Trandafir Viorica, Chirita Gheorghe. Rheological behavior of collagen solutions. "Industria Usoara", 1972, 19(3), 141-150.

201. Михайлов A. H. Химия и физика коллагена кожного покрова. Москва, "Лёгкая индустрия", 1980, 232 с.

202. Cioca Gheorghe. Aspecte privind cercetarea in domeniul colagenului, legate de metodele de preparare ale solutiilor de colagen. "Industria Usoará", 1972, 19(12), 719-726.

203. Bianchi E., Conio G. The role of pH, temperature, salt type and salt concentration on the stability of the crystalline, helical and randomly coiled forms of collagen. "Journal of Biological Chemistry", 1967,242(7), 1361-1369.

204. Wiley Eugene R., McClain Philip E. Isolation and characterization of type III collagen from bovine cardiac muscle. "International Journal of Biochemistry", 1978, 9(2), 139-143.

205. Davison Peter F., Hong Bor-Shyue, Cannon Donald J. Quantitative analysis of the collagens in the bovine cornea. "Experimental eye research", 1979, 29(2), 97-107.

206. Васильев И. П., Пухова 3. И., Чуфаровская Т. И., Иванова Н. М. Изучение свойств растворов коллагена в различных кислотах. В сб. "Вопросы химии и экологии в текстильном производстве", Ленинград, 1979, 31-34.

207. Каспарьянц С. А., Баблоян О. О., Яровой А. И. Сравнительная оценка различных методов растворения коллагена. "Сборник научных трудов Московской ветеринарной академии", 1973, 68, 65-67.

208. Miller Edward J., Rhodes R. Kent. Preparation and characterization of the different types of collagen. "Methods in enzymology". Vol. 82, New York e. a., 1982, 33-64.

209. Crosby N. Т., Stainsby G. Thermo-reversible denaturation of eucollagen in solution. "Nature", 1961,190(4770), 80-81.

210. Komsa-Penkova Regina, Koynova Rumiana, Kostov Georgi, Tenchov Boris G. Thermal stability of calf skin collagen type I in salt solutions. "Biochimica et Biophysica Acta", 1996, 1297(2), 171-181.

211. Rigby В. J. Amino-acid composition and thermal stability of the skin collagen of the Antarctic ice-fish. "Nature", 1968,219(5150), 166-167.

212. Rigby B. J., Mason P. Thermal transitions in gastropod collagen and their correlation with environmental temperature. "Australian Journal of Biological Sciences", 1967, 20(1), 265-271.

213. Freedman Robert. Proline and folding proteins. "Nature", 1979, 279(5716), 756-757.

214. Bernengo J. С., Ronziere М. С., Bezot P., Bezot С., Herbage D. and Veis А. А hydrodynamic study of collagen fibrillogenesis by electric birefringence and quasielastic light scattering. "Journal of Biological Chemistry", 1983, 258(2), 10011006.

215. Bachinger H. P. The influence of peptidyl-prolyl cis-trans isomerase on the in vitro folding of type III collagen. "Journal of Biological Chemistry", 1987, 262(35), 1714417148.

216. Fertala Andrzej, Holmes David F., Kadler Karl E., Sieron Aleksander L. and Prockop Darwin J. Assembly in vitro of thin and thick fibrils of collagen II from recombinant procollagen II. "Journal of Biological Chemistry", 1996,271(25), 1486414869.

217. Birk David E., Silver Frederic H. Kinetic analysis of collagen fibrillogenesis: II. Corneal and scleral type I collagen. "Collagen and Related Research", 1984, 4(4), 265-277.

218. Bria Aurel, Zainescu Gabriel. Spectrul IR al colagenului solubil si al hidrolizatului de colagen din pielea de miel. "Industria Usoara", 1988, 35(8), 283-285.

219. Hue A., Sanejouand J. Etude du spectre infra-rouge du collagene acido-soluble. "Biochimica etBiophysica acta", 1968, 154(2), 408-410.

220. Лексовская H. П., Горн Л. Э. Исследование тепловой денатурации дисперсий коллагена методом ИК-спектроскопии. "Прикладная биохимия и микробиология ", 1976, 12(6), 904-908.

221. Ramachandran G. N. Infrared spectrum and structure of collagen. "Journal of Chemical Physics", 1955, 23(3), 600-601.

222. Doyle R. J., Bello Jake. Ultraviolet absorbance changes accompanying the denaturation of soluble collagen and atelocollagen. "Biochemical and Biophysical Research Communicaions", 1968, 31(6), 869-876.

223. Wood G. C. Spectral changes accompanying the thermal denaturation of collagen. "Biochemical and Biophysical Research Communications", 1963, 13(2), 95-99.

224. Cohen Carolyn. Optical rotation and helical polypeptide chain configuration in collagen and gelatin. "Journal of Biophysical Biochemical Cytology", 1955, 1, 203214.

225. Venkataraman S. Collagen. IV. Influence of lyotropic salt solutions on the opticalactivity of collagen. "Proceeding of the Indian Academy of Sciences, Section A ", 1960, A52, 80-86.

226. Gratzer W. В. Rhodes W. and Fasman G. D. Optical properties of the poly-Z,-proline and collagen helixes. "Biopolymers", 1963,1(4), 319-330.

227. Gardi A., Rieder K., Hitschmann Hs. Comparative optical study on modified gelatins and on calf skin collagen. Influence of the modification on the conformative behavior. "Chimia", 1973,27(2), 116-121.

228. Tiffany M. Lois. Optical activity related to ordered aggregation in some biological molecules. 1. Poly(L-proline) and collagen. "International Journal of Polymeric Materials", 1976, 4(3-4), 293-302.

229. Mandel Richard, Holzwarth George. Ultraviolet circular dichroism of polyproline and oriented collagen. "Biopolymers", 1973,12(3), 655-674.

230. Истранов Л. П., Сербинова Т. А., Васильев П. С., Белова Л. А. Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм ферменто- и щелочнорастворённого коллагена. "Биофизика", 1976, 21(4), 624-628.

231. Hutschenreiter J., Scheuner G. Double refraction of collagen. "Acta Histochemica ", 1970,35(2), 337-342.

232. Yoshioka Koshiro, O'Konski Chester T. Electric properties of macromolecules. IX. Dipole moment, polarizability, and optical anisotropy factor of collagen in solution from electric birefringence. "Biopolymers", 1966, 4(5), 499-507.

233. Kahn Leo D., Wilnauer Lee P. Electric birefringence of collagen. "Journal of the American Leather Chemists' Association", 1969, 64(1), 12-18.

234. Kahn Leo D., Witnauer Lee P. Electric birefringence build up curve as applied to the determination of the dipole moment of soluble collagen. "Biochimica et Biophysica Acta", 1971,243(2), 388-397.

235. Bernengo J. C., Roux B. Herbage D. Electrical birefringence study of monodisperse collagen solutions. "Biopolymers", 1974, 13(3), 641-647.

236. Murthy N. S. Liquid crystallinity in collagen solutions and magnetic orientation of collagen fibrils. "Biopolymers ", 1984,23(7), 1261-1267.

237. Fletcher Guy C. Dinamic light scattering from collagen solutions. I. Translational diffusion coefficient and aggregation effects. "Biopolymers", 1976, 15(11), 22012217.

238. Claire Karen, Pecora R. Translational and rotational dynamics of collagen in dilute solution. "Journal of Physical Chemistry, B", 1997, 101(5), 746-753.

239. Hayashi Toshihiko, Nagai Yutaka. Effect of pH on the stability of collagen molecule in solution. "The Journal of Biochemistry" (Tokyo), 1973, 73(5), 999-1006.

240. Russell Allan E. Effect of pH on thermal stability of collagen in the dispersed and aggregated states. "Biochemical Journal", 1974,139(1), 277-280.

241. Heikkinen E., Kulonen E. Precipitation of the collagen components by salts. "Acta chem. Scand. ", 1966, 20(3), 914-915.

242. Candlish John K. The dispersion of the collagen system of proteins by concentrated salt solutions. "Biochimica et Biophysica Acta", 1963, 74(2), 275-282.

243. Russell A. E. Salt-pH effects on collagen thermal stability in pickling and curing. "Journal of the Society of Leather Technologists and Chemists ", 1975, 59(1), 6-13.

244. Buzagh A. The solubility of collagen in various buffer solutions. "KolloidZeitschrift", 1960,169, 72-76.

245. Cooper D. R. and Davidson R. J. The effect of ultraviolet irradiation on soluble collagen. "Biochemical Journal", 1965,97(1), 139-147.

246. Zvanut C. W., Rodriguez F. Modulus jump and degradation of collagen gels: dependence on concentration and pH. "Polymer", 1977,18(5), 467-474.

247. Van Caneghem P. and Lapiere С. M. Effect of x-rays on the reversibility of a collagen gel. "Comptes Rendus des Séances de la Société de Biologie et de ses Filiales", 1965,159(5), 1250-1252.

248. Dancewicz A. M., Majewska Maria R. Radiation-induced changes in subunit composition of acid-soluble rat skin collagen in vitro. "Acta Biochimica Polonia ", 1971,18(3), 283-287.

249. Majewska Maria R., Dancewicz A. M. Differences in secondary structure between tropocollagen and its molecules aggregated upon exposure to X-rays. "Studia Biophysica", 1977, 63(3), 189-197.

250. Ramanathan N., Mohanaradhakrishnan V. and Nayudamma Y. The effect of y-radiation on soluble and insoluble collagens. "Biochimica et Biophysica Acta ", 1965, 102(2), 533-541.

251. Страхов И. П., Головтеева А. А., Цветкова Н. А., Балашов Ю. П. Действие у-лучей на коллаген. Сообщение 1. "Известия высших учебных заведений. Технол. лёгкой промышленности 1969, (1), 55-61.

252. Davidson R. J., Cooper D. R. The effect of y-irradiation on soluble collagen. "Biochemical Journal", 1968, 107(1), 29-34.

253. Cooper D. R., Rusell A. E. The decomposition of soluble collagen by y-irradiation. "Biochemical Journal", 1969, 113(2), 263-269.

254. Страхов И. П., Барамбойм H. К., Тихвинская H. П. Влияние ионизирующих излучений на некоторые физико-химические свойства коллагена. "Кожевенио-обувная промышленность", 1975, (1), 57-59.

255. Kahn Leo D. and Witnauer Lee P. The viscometric behaviour of solubilized calf skin collagen at low rates of shear. "Journal of Biological Chemistry", 1966, 241(8), 17841789.

256. Kahn Leo D. and Witnauer Lee P. Viscometer study of solubilized calfskin collagen by using the Zimm-Crothers viscometer. "Biochimica et Biophysica Acta", 1967, 133(1), 184-185.

257. Rume Sakai, Shoichi Ikeda, Toshizo Isemura. Soluble collagen of chicken leg tendon; its denaturation temperature and hydrodinamic properties. "Bulletin of the Chemical Society of Japan ", 1967, 40(12), 2890-2894.

258. Истранов Jl. П., Барамбойм Н. К., Чернов Н. В. Исследование гидродинамических свойств продуктов растворения коллагена. "Научные труды. Московский технологический институт лёгкой промышленности", 1969, выпуск 35, 3-8.

259. Whitmore R., Jones Н., Windus W., Naghski J. Preparation and viscoelastic properties of fibrous collagen dispersions from limed cattlehide splits. "Journal of Food Science", 1972, 37(2), 302-305.

260. Fasio S., Granato Corigliano G., Iarussi D. Viscometry of dilute collagen solutions. "Rendiconti ed Atti della Accademia di Scienze Mediche e Chirurgiche", 1972, 126, 169-172.

261. Silvestre C., Viggiano Giulio, Santamaría Roberto. Quantitative rheology of collagen solutions. "Rendiconti ed Atti della Accademia di Scienze Mediche e Chirurgiche", 1973,127, 91-97.

262. Истранов Л. П., Кутьин В. А., Голованова П. М., Васильев М. П., Вольф Л. А. Структурно-механические свойства растворов коллагена. В сб. "Научно-исследовательские труды ЦНИИ кожно-обувной промышленности", 1974,1,3-8.

263. Chirit Gh., Bulacovschi V., Lenke V. Rheological behavior of the collagen solutions. "BulletinulInstitutului Politehnic din lasi", 1979, Sectia 7, 25(1-4), 7-12.

264. Хануков Л. А., Васильев M. П., Вольф Л. А. Структурно-механические свойства концентрированных дисперсий коллагена. "Химические волокна", 1979, (4), 36-37.

265. Pollice U., Viggiano G., Accarino В., Santamaría R. Correction of coneplate viscometer flow curver to reveal real non-Newtonian effects. "Rheologica acta ", 1982, 21(2), 201-206.

266. Bagnall R. D. Adsorption of collagen on model hydrophobic surfaces. "Journal of Bioenergetics", 1978, 2(1-2), 69-78.

267. Bettelheim Frederick A., Priel Zvi. Adsorption of biopolymers on solid surfaces. "Journal of Colloid and Interface Science", 1979, 70(2), 395-398.

268. Penners G., Priel Z., Silberg A. Irreversible adsorption of triple-helical soluble collagen monomers from solution to glass and other surfaces. "Journal of Colloid and Interface Science", 1981, 80(2), 437-444.

269. Meltzer H., Silberberg A. Adsorption of collagen, serum albumin and fibronectin to glass and to each other. "Journal of Colloid and Interface Science", 1988, 126(1), 293303.

270. Chirita Gheorghe, Chirita Mihai, Pop Otilia, Flocea Aurica. Surface-active properties of collagen hydrolyzates. "Industria Usoarâ", 1989, 36(1), 13-16.

271. Ghannam M. M., Mady Mohsen M., Khalil W. A. Interaction of type-I collagen with phospholipid monolayer. "Biophysical Chemistry", 1999, 80(1), 31-40.

272. Fonseca M. J., Busquets M. A., Alsina M. A., Reig F. Synthesis and physicochemical study of collagen hydrophobic derivatives. "Langmuir", 1993, 9(11), 3149-3153.

273. Fonseca M. J., Juvé A., Lôrincz Z., Reig F., Alsina M. A. Physicochemical Study of Hydrophobic Derivatives of Collagen Fragments. "Journal of Colloid and Interface Science", 1998,205(1), 141-148.

274. Ellis S. C. and Pankhurst K. G. A. Monolayers of collagen. "Nature", 1949, 163, 600-601.

275. Ellis S. C. and Pankhurst K. G. A. Monolayers of collagen. "Transaction of the Faraday Society", 1954, 50(1), 82-89.

276. Elstow W. E., Hathway D. E., Pankhurst K. G. A. Formation of tannins by the enzymatic oxidation of certain phenolic compounds. "Research", 1955, 8(12), S64-S65.

277. Keeley F. W., Morin J. D., Vesely S. Characterization of collagen from normal human sclera. "Experimental eye research", 1984, 39(5), 533-542.

278. Polatnick Jerome, La Tessa A. J. and Katzin H. M. Comparison of collagen preparations from beef cornea and sclera. "Biochimica et Biophysica Acta", 1957, 26(2), 365-369.

279. Quantock Andrew J., Meek Keith M. Axial electron density of human scleral collagen. Location of proteoglycans by X-ray diffraction. "Biophysical Journal", 1988,54(1), 159-164.

280. Демин Ю. А., Шарлей Т. M. Влияние низкотемпературного консервирования на структурную организацию склеры. "Криобиология ", 1988, (4), 43-44.

281. Демин Ю. А., Юрченко Т. Н., Шарлай Т. М. Изучение коллагена склеры после низкотемпературного консервирования. В сб. "Влияние охлаждения на биологические объекты". Харьков, АН УССР, Институт проблем криобиологии и криомедицины, 1990, 38-41.

282. Lowry О. Н., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. "Journal of Biological Chemistry", 1951, 193(1), 265-275.

283. Слуцкий Jl. И., Шелекетина И. И. Количественное определение коллагена в легочной ткани. "Вопросы медицинской химии", 1959, 5(6), 466-468.

284. Измайлова В. Н., Родин В. В., Нусс П. В. Поверхностные и объёмные свойства растворов третичного бутилового спирта в воде. "Коллоидный журнал", 1996, 58(5), 616-622.

285. Dynarowicz Patrycja. Studies on the surface structure of tert-butyl alcohol-water mixtures. "Colloids and Surfaces: A", 1993, 78(1-3), 51-56.

286. Glinski Jacek, Chavepeyer Guy, Platten Jean-Karl. Surface properties of diluted aqueous solutions of tert-butyl alcohol. "Journal of Chemical Physics", 1995, 102(5), 2113-2117.

287. Posner A. M., Anderson J. R. and Alexander A. E. The surface tension and surface potential of aqueous solutions of normal aliphatic alcohols. "Journal of Colloid Science", 1952, 7, 623-644.

288. Kozo Hamaguchi. Protein denaturation by surface chemical method. III. The interaction of urea with lysozyme monolayer. "The Journal of Biochemistry" (Tokyo), 1956, 43, 83-92.

289. Lubomir Jager, Jaroslav Nyvlt, Helena Kocova, Stanislav Horacek and Frantisek Micek. Some physicochemical properties of urea solutions. "Chemicky Prumysl", 1965, 15(6), 366-368.

290. Sears Dewey F. Surface activity of urea. "Journal of the Colloid and Interface Science", 1969, 29(2), 288-295.

291. Dreyer Guenther, Kahrig Erwin, Kirstein Dieter, Erpenbeck John, Lange Fritz. Structure anomalies of water. "Naturwissenschaften ", 1969, 56(11), 558-559.

292. Rao N. Prabhakara, Reddy К. C. Ultrasonic studies in aqueous solutions of urea and thiourea. "Zeitschrift fur Physikalische Chemie" (Frankfurt am Main), 1976, 100(3-4), 133-138.

293. Bugeau de Hemsy M. E., Acuna de Molina M. A., Minano A. Sancho, Lobo P. W. Dielectric behavior of aqueous urea and thiourea solutions. "Anales de la Asociacion Quimica Argentina", 1975, 63(5-6), 243-250.

294. Taniewska-Osinska Stefania, Palecz Bartlomiej. Enthalpies of solution of thiourea in water from 293,15 to 333,15 K. "Journal of Chemical Thermodynamics", 1980, 12(8), 775-778.

295. Лященко А. К., Харькин В. С., Ястремский П. С., Лилеев А. С. Действие полярных молекул на воду. IV. Мочевина и тиомочевина как нарушители структуры воды. "Журнал физической химии", 1982, 56(11), 2777-2782.

296. Nandel Fateh S., Verma Rajnish, Singh Balvinder, Jain Dharam V. S. Mechanism of hydration of urea and guanidium ion: a model study of denaturation of proteins. "Pure and Applied Chemistry", 1998, 70(3), 659-664.

297. Taniewska-Osinska Stefania, Palecz Bartlomiej. Thermodynamic study of thiourea in water solutions. "Acta Universitatis Lodziensis. Folia Chimica", 1982, 1, 77-83.

298. Mattace-Raso F., Sarto G., Loffredo A. and Santamaria R. Denaturing action of urea and thiourea. "Bollettino della Societa Italiana di Biologia Sperimentale", 1959, 35, 279-280.

299. Santamaria R., Loffredo A. and Mattace-Raso F. Denaturation by urea and thiourea. "Rendiconti ed Atti della Accademia di Scienze Mediche e Chirurgiche", 1959, 113, 138-145.

300. Gordon Julius A., Warren John R. Denaturation of globular proteins. I. The interaction of urea and thiourea with bovine plasma albumin. "Journal of Biological Chemistry", 1968, 243(21), 5663-5669.

301. Colaccio D., Santamaria R. Thermodynamic analysis of protein denaturation with urea and thiourea. "Rendiconti ed Atti della Accademia di Scienze Mediche e Chirurgiche", 1981, 135, 54-57.

302. Areas Elizabeth P. G., Ribeiro Mauro C. C., Santos Paulo S. Raman band-shape analysis of urea-lysozyme interaction in aqueous solution. "Journal of Molecular Structure", 1996, 378(2), 111-119.

303. Rabilloud Thierry. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. "Electrophoresis", 1998,19(5), 758-760.

304. Bairati A. and Paterno M. The solubility of fibrous tissue and of collagen in concentrated solutions of urea. "Bollettino della Societa Italiana di Biologia Sperimentale", 1954, 30, 1079-1080.

305. Steven F. S. and Tristram G. R. Denaturation of acid-soluble calf-skin collagen -changes in optical rotation, viscosity and susceptibility towards enzymes during serial denaturation in solutions of urea. "Biochemical Journal", 1962, 85, 207-210.

306. Petruccioli M. G. Periodic structure of collagen fibrils; preparatory techniques. III. Effect of concentrated urea. "Bollettino della Societa Italiana di Biologia Sperimentale", 1968,44(15), 1262-1264.

307. Menashi Suzanne, Finch Arthur, Gardner Peter J., Ledward David A. The enthalpy of interaction between collagen fibers and denaturing solvents. "Biochemical Society Transactions", 1976, 4(4), 740-741.

308. Komsa-Penkova R., Goshev I., Alexandrova Tz. Influence of urea and guanidine chloride on thermal denaturation of various collagens. "Scientific Works of the Medical University of Pleven", 1995, 15(1), 5-8.

309. Komsa-Penkova R., Goshev I., Alexandrova Tz. Influence of urea and guanidine hydrochloride on the thermal behavior of cartilage collagens type II and XI. "Scientific Works of the Medical University of Pleven ", 1996, 16(1), 6-11.

310. Rose Chellan, Mandai Asit. B. The interaction of sodium dodecyl sulphate and urea with cat-fish collagen solutions in acetate buffer: hydrodynamic and thermodynamic studies. "International Journal of Biological Macromolecules", 1996, 18(1-2), 41-53.

311. Kuharski Robert A. and Rossky Peter J. Molecular dynamic study of solvation in urea-water solution. "Journal of American Chemical Society", 1984, 106(20), 57865793.

312. Kuharski Robert A. and Rossky Peter J. Solvation of hydrophobic species in aqueous urea solution: a molecular dynamics study. "Journal of American Chemical Society", 1984,106(20), 5794-5800.

313. Wallqvist A. and Covell D. G. Hydrophobic interactions in aqueous urea solutions with implications for the mechanism of protein denaturation. "Journal of American Chemical Society", 1998,120(2), 427-428.