Структурно-функциональное исследование липид-белковых моно- и полислоев на границе раздела фаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

* ч г, 5 91

! российская академия наук ордена трудового^ красного знамени институт биоорраническои химии им. м.м. шемякина

На правах рукописи УДК 577.352.2+577.122

КАЛАБИНА Надежда Анатольевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ MOHO- и ПОЛИСЛОЕВ НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ФАЗ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

".ОСКВА - 1992

Работа выполнена в лаборатории полимеров для биологии Института биоорганической химии им.М.М. Шемякина РАН (зав. лабораторией - д. х. н., проф. В.П. Зубов)

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор В.П. ЗУБОВ Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член-корр. АН России Б.А. Чизмаджев кандидат химических наук И.Н. Курочкин

Ведущая организация:

Московский Ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им.М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится „Ы&ь-Р 1992 г. в часов на' заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им.М.М. Шемякина РАН по адресу: 117871 ГСП-7, Москва-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М. Шемякина РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

В.А. Несмеянов

•>• . ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'""Актуальность проблемы. Ленгмюровские пленки природных 'полимеров привлекают внимание исследователей как в связи с развитием фундаментальных исследований по моделированию биологических мембран, так и в связи с открывающимися в последнее время возможностями их практического использования. Одной из интенсивно развивающихся областей, в которой может быть применена ленгмюровская методика, является область создания биосенсорных устройств, поскольку ленгмюровский метод является одним из перспективных методов иммобилизации белков на сенсорные устройства. Этот метод позволяет создавать ориентированные ультратонкие пленки с заданной толщиной с сохранением нативных свойств белков. В связи с этим становится необходимым исследование поведения белков в монослоях на границе раздела фаз, подбор оптимальных условий для формирования моно- и мультислоев. Среди активно исследуемых белков можно выделить светочувствительные белки. Мембранные системы на основе таких белков могут быть использованы при создании светочувствительных биосенсоров. Перспективным является использование технологии Ленгмюра-Блоджетт для создания ферментных биосенсоров.

Цель работы. Настоящая работа является частью прогреют исследований по созданию стабильных липид-белковых моно- и мультислойшх пленок на границе раздела фаз проводимых в Институте биоорганической химии им.М.М. Шемякина. Работа посвящена получению и исследованию липид-белковых монослоев на поверхности раздела фаз вода/воздух, создание на их основе мультислойных структур на твердых подложках различного типа с использованием различных белков: реакционных центров (РЦ) зеленых нитчатых и пурпурных бактерий, глюкозоксидазы (ГОД), уреазы и бактериолюциферазн (БЛ). Основная часть исследований выполнена с использованием РЦ, для которых важно сохранить их фотоэлектрическую активность и получить преимущественную ориентацию белковых молекул в пленках на поверхности раздела фаз.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Определены условия формирования стабильных моно- и

мультислоев ряда белков на поверхности раздела фаз: мембранного бежа РЦ и водорастворимых. белков (ГОД, уреазы, БЛ). Для белка уреазы впервые получены монослои, обладающие достаточной прочностью. Исследованы условия адсорбции РЦ, ГОД и уреазы на монослои различных поверхностно-активных веществ (ПАВ). Подобраны условия переноса монослоев РЦ и ГОД на твердые подложки, установлено, что эти белки сохраняют активность в пленках. Впервые показана смена ориентации белка РЦ на твердой подложке в зависимости от первоначальной площади, занимаемой молекулой белка в монослое и ПАВ, используемого при формировании смешанных монослоев. Показана защитная функция мультислоев жирной кислоты, которые при нанесении на поверхность белковой пленки, способствуют сохранению функциональной активности белков.

Показана возможность создания биосенсора на основе ГОД, адсорбированной на поверхность монослоев липидов, область определяемой концентрации глюкозы в растворе составила 0,5-5,0 мМ. Обнаружена зависимость амперометрического отклика на глюкозу от числа липид-белковых монослоев и от поверхностного давления, при котором осуществляется указанный перенос. Установлено, что БЛ сохраняет свою активность на поверхности раздела фаз и в связи с этим, является перспективным объектом дальнейших исследований.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на Всесоюзной школе-конференции по ленгмюровским пленкам (Звенигород, апрель 19Э0 г.), ла 11-ой Европейской конференции "Химия поверхностей" (Берлин, Германия, 23-28 апреля 1990 г.), на международном конгрессе по мембранам и мембранным процессам (Чикаго, США, 20-24 августа 1990 г.), на конференции по аналитической химии и прикладной спектроскопии (Чикаго, США, 3-8 марта 1991 г.), на 5-ой конференции по. пленкам Ленгмюра-Блодкетт (Парик, Франция, 26-30 августа 1991 г.).

Структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописного

текста, включая рисунков, ^ таблиц. Работа состоит из введения, литературного обзора по белковым ленгмюровским пленкам, описания в обсуждения результатов исследования.

экспериментальной части, кратких выводов и списка цитируемой литературы, включающего/)^ наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Монослои РЦ

РЦ Chloroilexus aurantlacua (J10 - fl), Rhodobacter Bphaeroides (дикий тип и R-26) и Rhodopseudomonas viridis образуют стабильные монослои на . границе■ раздела фаз вода/воздух (рис.1).

А, Нм2/мол.

Рис.1. Изотермы поверхностное давление (я) - площадь (А) на молекулу белка РЦ, выделенного из С. аигагШасиа (1), №. эрГшегоМез (дикий тип) (2), ИЬ. врИавгоМез (И-2в) (3) и Ирз. т1гШв (4) на поверхности 10 мМ фосфатного Суферг рН 7,0, 20°С.

Монослои формировались на достаточно большой площади поверхности, когда первоначальное поверхностное давление в монослое было шиш I мН м-1 с соответствующей площадью на молекулу при данном давлении для РЦ Rb. sphaeroldes - 470 нм2, для С. aurantlacua - 275 нм2 и для Rps. viridis - 2730 нм2.

Изотермы для РЦ четырех бактерий имеют качественно сходный характер. На изотермах имеются два участка с разным наклоном и характерный перегиб между ними при 31-33 мНм-1, что свидетельствует о наличии двух состояний монослоев РЦ на границе раздела фаз.

Значения площадей, приходящихся на молекулу белка РЦ Rb. . sphaeroldes и С. aurantlacus в монослое, близки, особенно в состоянии I. Площади на молекулу белка РЦ С. aurantlacua и Rb. sphaeroldes схожи, несмотря на присутствие Н-субъединицы в РЦ Rb. sphaeroldes, которая находится на цитоплазматической стороне ML-комплекса и не оказывает воздействия на размеры мембранной части белкового комплекса. Это предполагает наличие сходной упаковки в монослоях. Для белка РЦ Rps. viridis значения площадей, приходящихся на молекулу (Aj=480 нм2/молекулу, ^ =1000 нм2/молекулу) больше, чем для трех первых белков. .Такое увеличение площади можно объяснить присутствием большой цитохромной субъединицы.

Различия между монослоями РЦ указанных бактерий наблюдаются в' точках коллапса. Так, давление коллапса для монослоев РЦ С. aurantlacua составляет 58 мНм"*, а для Rps. viridis и Rb. sphaeroldes (дикий тип и R-26) эти величины сходнъ (52, 49 и 64 мН м"1, соответственно).

, Исследовалась зависимость параметров монослоев РЦ С. aurantlacua и Rb. sphaeroldes (дикий тип) от ионной силы, pH и температуры водной субфазы. Для монослоев РЦ С. aurantlacus площади Aj и Ag, приходящиеся на молекулу белка в состояниях I и II, и давление, при. котором наблюдается переход между двумя состояниями монослоя, практически не зависят от величины ипнной силы водной субфазы. В то же время давление коллапса монослоя РЦ с. aurantlacua (nR) начинает уменьшаться при концентрации фосфатного буфера выше 0,1 М и достигает значений, сравнимых с давлением коллапса монослоев РЦ Rb. sphaeroldes, в области концентраций фосфатного буфера 0,7-1,0

М. Уменьшение давления коллапса можно объяснить частичным разворачиванием полипептидных, цепей при повышении концентрации солей в буфере, благодаря чему молекулы белка становятся •более растворимыми. Следовательно, мембрашг 1 комплекс РЦ С. аигагШасиз лучше всего адсорбируется на поверхности раздела фаз при малых величинах ионной силы водной подложки с образованием стабильного монослоя, в то время, как РЦ Г?Ь. врЬаего1йез в значительной степени солюбилизируется в водной субфазе при низкой ионной силе.

При увеличении рН водной субфазы от 4,0 до 9,0 значения площади на молекулу белка уменьшаются незначительно для РЦ С. аигагШасиз и более резко для РЦ ИЪ. зр1гаего1(1еэ, что можно объяснить, также как и уменьшение давление коллапса для РЦ ИЬ. зрЬаегоМез, лучшей солгабилизацией белков при высоких рН субфазы. При изменении рН изменяется протокированность амино-и карбоксильных групп в гидрофильной Н-субъединице, в результате чего растворимость белка в субфазе увеличивается. РЦ С. аигагШасиз не содеркит гидрофильной субъединицы и имеет небольшое количество гидрофильных остатков в субъединицах М и Ь, его растворимость будет изменяться в меньшей степени при изменении рН. Давления перехода для монослоев РЦ двух бактерий и коллапса для С. аигагШасиз остаются практически неизменными во всей области исследованных рН.

Параметры монослоев РЦ ЛЬ. sphaeroid.es существенно зависят от температуры. Так, давления перехода и коллапса монослоя РЦ Ш). зрЬаегоШеэ при увеличении температуры субфазы от 20 до 4СЯС уменьшаются в 2-3 раза по сравнению с первоначальными значениями. При повышении температуры водной подложки монослои РЦ НЬ. зрЬаегоМеа теряют стабильность и прочность в отличив от практически нечувствительных к температуре монослоев РЦ С. аигагШасиз.

Монослои РЦ С. аигагШасиз и №. зрЬаегоЫеа на поверхности раздела фаз формировались нанесением белков на ограниченную площадь поверхности с первоначальным поверхностным давлением от 15 до 20 мН м . При выдерживании монослоя при постоянной площади в течении 15 минут, давление самопроизвольно уменьшалось до 10-15 мН м-1, что, по-видимому, связано с потерей детергента, который не образует

стабильной пленки. Площадь, приходящаяся на молекулу в плотноупакованном монослое уменьшалась на 41% для РЦ С. аигапиасив и на 48% для РЦ №. 8р1)аего1с1ез по сравнению с соответствующими площадями для монослоев, сформированных при первоначальном давлении менее I мН м"1. Давление коллапса для С. аигапИасиа увеличивается незначительно (на 3 мНм"1), в то время как для ИЪ. арИдегоМеа оно не изменяется, значения точек перегиба, также остается неизменным.

Исходя из я-а изотерм для - двух различных способов формирования монослоев на поверхности, можно сделать следующий вывод, что монослои, сформированные на меньшей исходной площади поверхности имеют более плотную упаковку молекул белка, однако различий в стабильности и жесткости монослоев на поверхности раздела фаз не наблюдается.

2. Спектральные и фотоэлектрические свойства мультислоев РЦ

Для оценки структурно-функциональной целостности монослоев белков РЦ были исследованы их спектральные и фотоэлектрические свойства в мультислойных пленках. Оптимальными условиями -длд переноса монослоев белков РЦ является давление около 30 мН м , когда коэффициент переноса приближается к 100% для метода Ленгмюра-Шефер и 90-95% для метода Ленгмюра-Блоджетт.

При последовательном нанесении монослоев РЦ №. БрМегоЫез при постоянном поверхностном давлении 30 мПм-1 обнар!живается 'линейная зависимость поглощения при длине волны 800 нм от числа нанесенных слоев белка на кварцевую подложку. Это свидетельствует об эффективном переносе белковых монослоев на кварцевые подложки и о хорошем качестве полученных мультислоев. В спектре поглощения мультислойной пленки РЦ сохраняются' все три характерных максимума поглощения при 760 (бактериофеофитин), 800 (бактериохлоро-филл) и 840 нм (димер бактериохлорофилла). Более коротковолновое поглощение димера в мономолекулярной пленке по сравнению с суспензией Ш является, по-видимому, следствием обезвоживания препарата. Действительно, кратковременное погружение пленки в воду приводит к длинноволновому смещению

максимума до 862 нм.

В случае формирования пленки РЦ на твердых подложках из монослоев, сформированных при первоначальном поверхностном давлении выше 10 мНм-1, полученные плгто! имеют более интенсивное поглощение при длине волны 800 нм на монослой белка, чем сформированные на большой площади поверхности. Это может свидетельствовать или о более плотной упаковки молекул в монослое, или о их меньшей денатурации на поверхности раздела фаз. С учетом данных, полученных' из п-А изотерм, наиболее вероятным, является увеличение числа молекул на единицу площади поверхности.

Для РЦ Rps. viridis в пленки из 50 последовательно нанесенных монослоев, сформированных при первоначальном поверхностном давлении . меньше I мН -м"1, получен спектр, характерный для нативного бежа, однако в ИК-диапозоне поглощение порфирщювых кофакторов отчетливо не проявилось.

В случае формирования монослоев РЦ С. aurantlacus при первоначальном поверхностном давлении выше 10 мН м-1 обнаружена линейная зависимость поглощения при 804 нм от числа нанесенных на твердую подложку монослоев. Для белков РЦ 0. aurantlacus и Rb; sphaeroides наблюдается увеличение интенсивности поглощения на монослой в зависимости от давления, используемого для нанесения.

Максимальная величина фотопотенциала пленки РЦ Rb. sphaeroides, сформированной из 50 монослоев, достигала 50 мВ (рис.2а), время нарастания лежит в диапазоне, нескольких десятков секунд, время темновой релаксации - нескольких минут. Были исследованы препараты, содержащие дополнительно по 4 монослоя ФХ, расположенных с двух сторон белковой пленки, которые наносили с целью обеспечения электрической изоляции между РЦ и измерительными электродами. В таких образцах полярность и амплитуда фотопотенциала не изменялись.

Знак фотопотенциала и характер разделения зарядов в РЦ Rb. sphaeroides, позволяет заключить о преимущественной ориентации РЦ на границе раздела фаз Н-субъединицей в сторону воздуха. Соотношение фракций противоположной ориентации 20:80.

Исследована кинетика фотопотенциала в пленке, состоящей

из 16 монослоев РЦ Rb. sphaeroldes, сформированных при первоначальном поверхностном давлении выше 10 мН (рис.20). Величина фотопотенциала составляет около 14 мВ, что не превышает величину фотопотенциала с I монослоя, для пленок образованных при первоначальном поверхностном давлении ниже I МН-м~*. Поверхностная плотность РЦ Rb. Bphaeroldes, оцененная из спектра поглощения пленки в полосе 800 нм, составила 4-5 Ю12-РЦ/см2. с

Рис.2. Фотоэлектрический ответ' ленгмюровской пленки, состоящей из 50 монослоев (п„оп <1мН м-1) (а) и 15 монослоев

т нач.

(лнач >10мНм ) (б) РЦ НЬ. ¡зр)таего1аез„ после возбувдения постоянным светом. Стрелками, направленными вверх и вниз обозначено соответственно включение и выключение света.

Первичный отброс на включение света свидетельствует о том, что при освещении подложка с образцом становится электроположительной. Учитывая, что перенос монослоев был осуществлен по методу Шефер, а фоторазделек :е зарядов ■ в ГЦ приводит к образованию диполя Р+-0д. можно сделать вывод, что данные РЦ ориентированы на границе раздела фаз преимущественно своей Н-субъединицей в сторону водной субфазы.

Пленка из РЦ Rps. viridis из 50 монослоев, сформированных на большой первоначальной <1 мН м-1 ) площади

поверхности дает величину фотопотенциала около 50 мВ. Кинетическая кривая фотопотенциала имеет сходный характер, знак и величину, как и в случае соответствующей кривой для РЦ Rb. sphaeroides. Электропроводящая подложка с нанесенным образцом, при освещении становилась электроотрицательной. В этом случав Н-субъединица располагается в сторону воздуха, а цитохром С' - в сторону водной субфазы. Такая ориентация представляется логичной, исходя из большой гидрофильности цитохрома по сравнению с Н-субъединицей.

С полной уверенностью можно утверждать, что процесс генерации фотопотенциалов связан с фотоокислением димера бактериохлорофилла в РЦ, а не с какими-либо полупроводниковыми фотоэффектами подложки. С помощью граничных светофильтров показано, что наиболее эффективен инфракрасный свет, поглощаемый бактериофеофитином, бактериохлорофиллом и димером бактериохлорофилла, а не свет УФ-диапазона, воздействующий на зоны проводимости Sn02.

Пленка РЦ Rb. sphaeroides на твердой подложке достаточно быстро теряет значительную часть своей активности. В пленке из 15 монослоей через 5 дней поглощение при 800 нм уменьшилось приблизительно в 2 раза, а далее (по-крайней мере до 20 дней) оставалось неизменным. Возможно, это связано с деструктивными "изменениями в нескольких поверхностных слоях РЦ, которые подвергаются окислительному разрушению за счет взаимодействия с кислородом воздуха, но которые в дальнейшем служат защитным покрытием для молекул, расположенных под этим слоем. .

Зафиксировать фотопптенциал пленки из РЦ С. aurantlacus,

состоящей из последовательно нанесенных монослоев, не удалось даже после обработки восстановителем, когда четко проявляются характерные для кофакторов пики в области поглощения 600-900 нм.

Резюмируя, можно сказать, что иследовашше белки РЦ образуют достаточно стабильные монослои на поверхности раздела фаз вода/воздух. Оптимальными условиями формирования монослоев РЦ С. аигапИасиз и №. врйаегоШез (дикий тип) являются 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,0-8,0 при температуре 20°С. Сохранение в этих условиях функциональной активности РЦ является достаточно сложной проблемой, так как белок имеющий относительно большую стабильность в монослоях на поверхности раздела вода/воздух, РЦ С. аигапиасиз, теряет свою функциональную активность, в то время, как РЦ №. 8рйаего1йез сохраняет часть своей активности. Найдено, что интенсивность полосы поглощения бактериохлорофилла зависит как от условий формирования монослоев (в данном случае были использованы разные исходные площади, на которые наносилось одно и токе количество белка), так и от давления, при котором осуществляется перенос монослоев. Обнаружена линейная зависимость поглощения от числа монослоев, нанесенных на подложку. Изменяя условия формирования монослоя, можно добиться смены ориентации белковых молекул, что, по-видимому, связано с разными возможностями для переориентации белковых молекул, которые будут иметь различную упаковку в зависимости от первоначальной площади, занимаемой молекулой белка па поььрхлости.

3. Смешанные РЦ-липид монослои

Исследовались монослои, состоящие из смеси белка РЦ и различных ПАВ (природного и синтетического происхождения) с целью получения липид-белковых пленок, имеющих большую степень сохранения функциональной активности белка и увеличенную степень ориентации белковых молекул по сравнению с белковыми пленками.

Проведенные исследования показали, что РЦ С. аигапиасиз и №. 8р1шего1йез (дикий тип) в их смесях с липидами, так же

как и чистые белки образуют стабильные монослои на границе раздела фаз вода/воздух. Изучалось изменение параметров монослоя в зависимости от доли липида (фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), 1,2-ди-(12-оксо-10-октадеканоил)-глицеро-3-фосфорилхолина (ОДЕК), акрилоилфосфатидилэтанолами-на (АКФЭ) ) в монослое, состоящем из белковых и лшгадных молекул. л-А изотермы для смешанных монослоев имеют качественно сходный характер с таковыми, полученными для РЦ. На изотермах также имеется два участка с разным наклоном и характерный перегиб между ними, что свидетельствует о наличии двух состояний смешашшх монослоев на границе раздела фаз.

При взаимодействии с липидами РЦ образуют стабильные монослои в которых наблюдается распределение белка в липидной фазе, а в некоторых случаях и взаимодействие белка и липида, и их характеристики будут зависеть от использованного липида и его доли в монослов.

Исследовалась зависимость поведения монослоя из смеси белка РЦ Rb. sphaeroides или С. aurantiacus и ФХ или ФЭ при соотношении белок:липид (1:26) (М/М) от рН, ионной силы и температуры в водной подложке. В результате исследований выявлено, что наиболее оптимальными условиями формирования смешанных монослоев являются: 0,001-0,01 M фосфатный буфер, рН 7,0 при температуре субфазы не выше 20°С.

Исследовались смешанные монослои РЦ-липид с использованием ПАВ, имеющих ненасыщенные двойные или тройные связи и способных полимеризоваться в монослоях при УФ-облучении. При этом, полученные данные о скорости полимеризации ПАВ в смешанных монослоях в начальный период времени после инициирования полимеризации сравнивались с аналогичными данными, полученными в нашей лаборатории ранее для монослоев ПАВ. Так, при исследовании монослоев РЦ Rb. зр1шего11ез-тетра-козодииновая кислота наблюдается падение скорости полимеризации в десять раз, для смешанного монослоя из РЦ-ОДЕК падение скорости составляет два порядка, а в случае смешанного монослоя с АКФЭ нам не удалось зафиксировать резкого изменения площади монослоя при УФ-облучении. Эти данные свидетельствуют о том, что белок . встраивается в липидный монослой, и определенным образом распределяется в нем и влияет на скорость полимеризации в монослое. Но несмотря на

замедление скорости полимеризации, можно получить полимерный стабильный матрикс с встроенным в него белком, который может способствовать сохранению активности белка.

4. Спектральные и фотоэлектрические свойства мультислоев

РЦ-липид на твердых подложках

Для оценки структурно-функциональной целостности монослоев РЦ-ПАВ были исследованы спектральные и фотоэлектрические свойства мультислойных пленок РЦ-ПАВ, нанесенных на прозрачные подложки. Оптимальными условиями для переноса монослоев из смеси белка и липида является давление 30 мН м-1, когда коэффициент переноса приближается к 100% при переносе методом горизонтального лифта.

В случае формирования пленок последовательным нанесением монослоев белок-липид, образованных на ограниченной площади поверхности, удалось зафиксировать спектр поглощения с характерными для РЦ пиками. В пленке, состоящей из 15 монослоев РЦ Rb. sphaeroidea:АКФЭ (1:10) (M/M) наблюдается спектр поглощения с характерными максимумами в длинноволновой области.

В смешанных пленках в течении первых 5 дней происходит денатурация почти 40S молекул с последующей стабилизацией в течении, по крайней мере, последующих 20 дней. Использование липида способствует сохранению большей части белковых молекул, в нативном состоянии по сравнению с пленкой из белка, которая через Б дней теряет до 50Ж своей активности.

В случае нанесения дополнительно на монослои РЦ и липида АКФЭ (1:10) (М/М) по 10 монослоев стеариновой кислоты с каадой сторош» пленки, через 14 суток после нанесения пленки не было обнаружено существенных деструктивных изменений в спектрах, за исключением небольшого окисления димера. По-видимому, монослои стеариновой кислоты препятствуют деструктивным изменениям в молекулах белка и служат своеобразным буфером для их защиты.

Были получены пленки из РЦ Rb. sphaeroidea и АКФЭ (1:10) (М/М), состоящие из 10 монослоев, которые подвергались УФ-облучению на водной поверхности. Причем пленка была с двух сторон изолирована 10 монослоями стеариновой кислоты. Спектр поглощения такой пленки в области 700-900 нм соответствовал

спектру поглощения пленки белка РЦ. Пленка сохраняла свои спектральные характеристики в течение последующих 14 дней.

Пленки из РЦ-АКФЭ сохраняли фотоактивность. В ответ на вспышку света наблюдались характерные окислительно-восстановительные превращения в полосе поглощения димера бактерио-хлорофилла при 855 им. Время темнового восстановления Р+ составило 60,5-3 мс,. что близко к значению характеристического времени рекомбинации ион-радикальной пары ^ в суспензии РЦ Rb. sphaerold.ea (около 90 мс), что свидетельствует о потери функциональной связи между первичным и вторичным акцепторами в ленгмюровских монослоях РЦ.

Знак фотопотенциала в этих образцах был положительным на подложке, кинетика его генерации была медленной. Сходный фотопотенциал был получен при исследовании образца, по составу не отличающегося от предыдущего, и его отличие состояло в том, что была проведена полимеризация АКФЭ в смешанной пленке на поверхности раздела фаз. Использованными нами методами исследования, не удалось выявить различий в генерации фотопотенциала в полимерной и мономерной пленках.

В качестве липида, используемого для иммобилизации была применена тетракозодииновая кислота. В такой пленке не было обнаружено изменения величины фотопотенциала по сравнению с белковой пленкой. Пленки, состоящие из 25 монослоев РЦ Rb. sphaeroldea и диацетиленовой кислоты (1:100) (М/М) и по 10 монослоев стеариновой кислоты на кавдой из сторон, имеют отрицательный знак на подложке, и соответвугацую ориентацию Н-субъединицей в сторону воздуха. Таким образом, эта ориентация белка РЦ на поверхности раздела фаз соответствует той, которая получена для монослоев, сформированных на большой площади поверхности.

Таким образом, ориентация белковых молекул может изменяться в зависимости от использованного ПАВ при формировании монослоев. Нами б^ли использованы АКФЭ и тетракозодииновая кислота, имеющие нейтральный (цвиттерион) и отрицательный заряд, соответсветственно, которые в смешанных монослоях будут приводить к разной преимущественной ориентации РЦ.

5. Moho- и мультислои глюкозоксидазы

Проводились исследования с водорастворимым белком ГОД. На поверхности раздела вода/воздух ГОД теряет свою активность. С целью сохранения активности белка на поверхности раздела фаз использовалась адсорбция белка на монослои различных ПАВ.

Была исследована способность ГОД сорбироваться на монослои следующих ПАВ: стеариновой кислоты, природного липида ФХ, цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) и их смесей на границе раздела вода/воздух.

Площади, приходящаяся на молекулу ПАВ в монослов, после одного часа адсорбции белка из водной субфазы увеличиваются почти на 50% в случае стеариновой кислоты и более чем на 200% в случае ее смеси с ЦТАБ (1:1) (М/М). Фермент, в случае адсорбции на монослой стеариновой кислоты, по-видимому, незначительно сорбируется на внешней поверхности, не включаясь непосредственно в монослой стеариновой кислоты.

В случае адсорбции ГОД на смешанных монослоях стеариновая кислота-ЦТАБ вид изотермы существенно изменяется. Система в присутствии фермента имеет только жидко-растянутое состояние. Наблюдаемые изменения свидетельствуют о наличии липид-белковых взаимодействий, что приводит к смешиваемости монослоя и даже частичному встраиванию белка в гидрофильную область липидного слоя.

Адсорбция ГоД на положительно заряженном смешанном монослое ФХ-ЦТАБ значительно больше, чем на монослой цвиттерионного ФХ, при этом в обоих случаях образуются стабильные липид-белковые пленки. Высокую адсорбцию ГОД на смешанные монослои ФХ-ЦТАБ можно объяснить электростатическим взаимодействием отрицательно заряженных участков белковых глобул с положительно заряженными аммониевыми и холиновыми группами ПАВ.

Была оценена активность и распеделение фермента в ленгмюровской ванне. Активность фермента вблизи липидного монослоя (ФХ-ЦГАБ=1:1) примерно в два раза выше, чем в водной субфазе на глубине 5 мм, а также на поверхности и в субфазе за подвижным барьером. Активность адсорбционных слоев белка на границе раздела вода/воздух в отсутствие липидного монослоя почти в 2 раза ниже, чем в водной субфазе или за подвижным

барьером. Таким образом наличие липидного монослоя не только приводит к концентрированию белка на границе раздела фаз, но и способствует сохранению его ферментативной активности.

Полученные липид-белковые монослои стабильны при высоких поверхностных давлениях 20-40 мН-м-*, что позволяет переносить их на различные твердые подлокки, коэффициент переноса на электроды составил 0,95+0,05. Были получены электроды, содержащие от I до 10 липид-белковых монослоев.

Амперометрический сигнал полученного биосенсора на впрыскивание раствора глюкозы в измерительную ячейку достигает максимального значения 0,5-0,8 нА через 10 сек. после добавления раствора глюкозы. В серии из десяти последовательных измерений биосенсором одинаковых концентраций глюкозы величины амперометрических сигналов незначительно уменьшаются, достигая постоянных значений к 4-5 измерению, что свидетельствует о достаточной стабильности полученного датчика.

Наблюдается линейная зависимость амперометрического сигнала биосенсора в области концентраций глюкозы 0,5-5,0 мМ в измерительной ячейке. Была обнаружена резкая зависимость величины сигнала от числа нанесенных на электрод липид-белковых монослоев и линейная зависимость величины сигнала от значения поверхностного давления в области 20-40 мН-м-1, при котором осуществляется перенос липид-белковых монослоев на Рг-электрод.

6. Ленгмюровские пленки уроазы

Одним из объектов исследования являлся водорастворимый белок - уреаза, который может быть использован в качестве чувствительного слоя в ферментных электродах для определения мочевины. Уреаза на поверхности раздела фаз, подобно ГОД, достаточно быстро теряет свою активность.

С увеличением времени адсорбции уреазы на поверхность раздела фаз, форма я-А кривой изменяется. Вероятно, в течение часа устанавливается равновесие, когда дальнейшая адсорбция белка, на монослой прекращается, а увеличение площади,

приходящейся на мг белка, наблюдаемое при дальнейшем выдерживании монослоя, по-видимому, происходит за счет разворачивания полипептидных молекул.

Изучалась адсорбция уреазы на поверхности раздела вода/ воздух на монослои следующих ПАВ: цетиловый спирт, стеариновая кислота, ФХ, Ф9 и смеси ФХ и ФЭ с ЦТАБ, ФС, ОДЕК. Найдено, что наибольшее количество белка сорбируется на монослои цвиттерионных липидов (ФХ и ОДЕК). По-видимому, происходит адсорбция белка на внутренней поверхности монослоя, так как форма я-А кривой для липида остается неизменной. В случае отрицательно заряженных ПАВ (стеариновая кислота, цетиловый спирт) количество адсорбированного белка уменьшается, но, вероятно, происходит незначительное встраивание белка в монослой.

Пленка из адсорбированной к поверхности раздела уреазы обладает достаточной стабильностью. В случае переноса моно-слоэв уреазы на твердые подложки методом Шефер при постоянном поверхностном давлении 30 мН м-1 коэффициет переноса составляет 90%, а при 40 мНм-1 - около 100%, в то время как для метода Ленгмюра-Блоджетт при давлешш 30 мН-м"1, коэффициент перноса составляет 50%. Причем наблюдается зависимость поглощения при 276 им от числа перенесенных на подложку монослоев.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ленгмюровским методом можно сформировать пленки, содержащие уреазу, которые при проведении дальнейших исследований, могут быть использованы для создания ферментных электродов.

> 7. Монослои бактериолюциферазы

БЛ является водорастворимым белком, расположенным в пери-плазматическом пространстве светящихся бактерий. БЛ катализирует окисление длинноцепочечных алифатических альдегидов при участии восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН), одним из продуктов реакции является световой импульс, до интенсивности которого можно судить об активности БЛ.

БЛ образует на поверхности раздела фаз стабильные монослои, коллапс которых наступает при высоком поверхностном

давлении (64-66 мН м-1). Для монословв БЛ фэрма я-А кривой, а также давление коллапса будут зависеть от степени чистоты препарата.

Изучалась зависимость характеристик монослоев от рН субфазы. При изменении рН субфазы от 6,0 до 8,0 происходит изменение площади, приходящейся на молекулу белка в монослое на 40%. Давление коллапса при рН 6,0 и 8,0 меньше, чем при рН 7,0, что можно объяснить большей растворимостью БЛ при изменении рН в кислую или щелочную область вследствии изменения протонировашоста гидрофильных ашшо- и карбокси-. групп.

При исследовании монослоев при различных температурах обнаружено увеличение площади, приходящейся на молекулу белка, что свидетельствует о частичной денатурации белковых молекул. При температуре денатурация белка проходит

быстро и через 1-2 часа активность белка становится такой же, как в случае выдерживания монослоя при 20°С 15 часов.

Изучалось влияние субстратов биолшинисцентной реакции на характеристики монослоев белка. При. добавлении 1-тетрадека-наля (1:10) Ш/М) происходит увеличение площади, приходящейся на молекулу белка, в то время как увеличение количества альдегида до соотношения 1:50 приводит к уменьшению площади на молекулу. 2МН (1:10) (М/Ы) не влияет на параметры монослоя белка.

Измерялась активность БЛ в ванне при отборе проб с разной глубины ванны. Не удалось выявить четкого распределения активности БЛ в зависимости от глубины с которой был произведен отбор пробы.

Несмотря на достаточно быструю денатурацию БЛ в монослое, она является перспективным препаратом для использования в качестве чувствительного слоя биодатчиков, вследствие ее высокой чувствительности к различным веществам.

ВЫВОДЫ

I. Исследована зависимость характеристик монослоев РЦ, выделенных из бактерий С. aurantiacua и Rb. sphaeroldea (да-

кий тип) на поверхности раздела фаз вода/воздух от ионной силы, рН и температуры водной подложки. Оптимальными условиями формирования монослоев РЦ на поверхности раздела фаз вода/воздух являются 10 кЛ1 фосфатный буфер, рН 7,0-8,0, при температуре 20°С.

2. Подобраны условия переноса монослоев РЦ №. зрЬаего1йеа (дикий тип) и С. аигапИасиз на твердые подложки. Оптимальным давлением для переноса монослоев является давление 30 мН м-1 с использованием метода Ленгмюра-Шефер. Обнаружена линейная зависимость оптического поглощения в полосе бактериохлорофилла от числа перенесенных на твердую подложку монослоев, что свидетельствует об эффективном переносе белковых монослоев и о хорошем качестве полученных муль-тислоев.

3. Определены условия формирования стабильных РЦ-липид монослоев с использованием различных ПАВ. Исследована зависимость характеристик смешанных монослоев РЦ №. 8р1шего1с1ез (дикий тип) и С. аигапИасиа и липида от ионной силы, рН и температуры водной подложки. Оптимальными условиями формирования смешанных, монослоев на поверхности вода/воздух являются 0,001-0,01 М фосфатный буфер, рН 7,0 при температуре не выше 20°С.

4. Подобраны условия переноса смешанных монослоев РЦ-липид на твердые подложки. Оптимальным давлением для переноса смешанных монослоев РЦ-липид является давление 30 мН с использованием метода Ленгмюра-Шефер.

5. Впервые установлена смена ориентации белка РЦ №. врЬаего1(1ез (дикий тип) на твердых подложках в зависимости от первоначальной площади, занимаемой молекулой белка в монослое и от использованных ПАВ, имеющих различные заряды, в случае смешанных РЦ-липид монослоев. Обнаружено сохранение активности белка на твердых подложках в течении длительного периода времени, в случае, когда пленка РЦ была покрыта с двух сторон мультислоями липида.

6. Найдено, что ГОД на поверхности раздела фаз лучше всего адсорбируется на положительно заряженный липидный монослой. Был осуществлен перенос монослоев на твердые подложки с сохранением ферментативной .активности белка.

Обнаружена зависимость величины амперометрического сигнала от числа нанесенных на твердую подложку монослоев и от величины поверхностного давления, при котором осуществлялся указанный перенос. Показана возможность создания биосенсоров для определения глюкозы на основе мультислойных структур, сформированных из смешанных лшшд-белковых монослоев.

7. Найдено, что наибольшее количество уреазы на поверхности раздела фаз адсорбируется на цвиттериошше липиды. Был осуществлен перенос монослоев на твердые подложки.

8. Получены монослои бактериолюциферази на границе раздела фаз с сохранением ферментативной активности бежа, показана возможность формирования мультислойных структур бактериолюциферази на твердых подложках.

Основные результаты диссертации опубликованы:

1. Калабина Н.А., Зайцев С.Ю., Кутузов М.А., Золотарев А.С., Лукашев Е.П., Кононенко А.А., Абдулаев Н.Г., Зубов В.П. Сравнительное исследование монослоев белков фотосинтетических реакционных центров из зеленых нитчатых и пурпурных бактерий. - Виол, мембраны, 1990, т.7, JHO, с.1086-1092.

2. Зайцев C.D., Калабина Н.А., Зубов В.П. Биосенсоры на основе ленгмюровских пленок глюкозоксидазы. Журнал аналит. химии, 1990, т.45, вып.1, с.1452-1455.

3. Зайцев C.D., Ханке Т., Волленбергер У., Эберт В., Калабина Н.А., Зубов В.П., Шеллер Ф. Моно- и мультислойные мембраны с адсорбированной глюкозоксидазой. - Биоорг. химия, 1991, Т.17, №6, с.762-772.

4. Zaitsev S.Yu., Kalablna N.A., Zubov V.P., Lukaahev E.P., KononenKo A.A., Uphaus R.P. Monolayers ol Fhotosyntetic Reaction Centera of Green and Purple Bacteria. - Thln Solld Filma, v._J7, 1992, p.1-3.

5. Zaitsev S.YU., Kalabina N.A., Zubov V.P. Lipid-Protein Langnuir Films. - Proceedlngs oi the 1990 International Congresa on Membranes and Membrane Processes, Auguat 20-24, 1990, Chicago, p.127-129.

6. Zaitsev S.Yu., Kalabina N.A., Lukaahev E.P., Kononenko

A.A., Abdulaev N.G., Zubov V.P. Design and Properties of Langmuir-Blodgett Films of Photoslnsetlve proteins -Abstracts Booklet of the Fifth Conference on Langmuir-Blodgett Films, August 26-30, 1991, Paris, France, p.IP3.

7. Zaitsev S.Yu., Kalabina N.A., Zubov V.P., Uphaus R.A., Chumanov G., Gaul D., Cotton T.M. Monolayer characteristics of bacterial photosynthetic reaction centers. - Photochem. Photobiol. (In press).

noAn. 1 Be**. /3. Py. J J 08mm ty^/PD Sn.3/pT

Omwin u poi»np»«T« • tinorpit»» Bpi 1IHH rpyju I03M4, MKIU, jm, EnupcMS, •