Мультифункциональные гибриды НК-конструкций с углеродными нанотрубками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

АПАРЦИН ЕВГЕНИЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГИБРИДЫ НК-КОНСТРУКЦИЙ С УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск 2014

005550643

1 7 ИЮЛ 2014 Л-ИКШ014

005550643

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н. Новопашина Дарья Сергеевна

Официальные оппоненты:

Позмогова Галина Евгеньевна, д.х.н., профессор, Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России, зав. лабораторией

Франк Людмила Алексеевна, д.б.н., Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики СО РАН, в.н.с.

Защита состоится 26 июня 2014 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Автореферат разослан «' » мая 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Углеродные нанотрубки (carbon nanotubes, CNT) и конструкции на их основе в настоящее время находят широкое применение в различных областях нанотехнологии, в том числе, бионанотехнологии и наномедицины. Интерес к этому классу наноматериалов обусловлен их уникальными структурными, механическими и электронными свойствами, совместимостью с биомакромолекулами и клетками, а также наличием широкого спектра приемов ковалентной или нековалентной модификации. Важным свойством углеродных нанотрубок, открывающим возможность их биологического применения, является поглощение нанотрубок животными и растительными клетками. Другая особенность углеродных нанотрубок, а именно, высокая электрическая проводимость, в сочетании с их совместимостью с биомакромолекулами, дает возможность конструирования сенсорных систем для детекции широкого спектра мишеней: от малых молекул до протяженных нуклеиновых кислот (НК), белков и живых клеток.

Несмотря на определенную химическую инертность углеродных нанотрубок, они могут быть модифицированы путем введения на их поверхность функциональных групп, что позволяет изменять свойства нанотрубок, расширяя возможности их использования. Для введения функциональных групп на поверхность одностенных и многостенных углеродных нанотрубок разработан ряд методов ковалентной и нековалентной модификации поверхности и концов нанотрубок, среди которых следует выделить методы нековалентной функционализации нанотрубок полициклическими ароматическими соединениями, выступающими в качестве якорных групп для иммобилизации биологических молекул на поверхности CNT. Комбинация ковалентных и нековалентных методов функционализации CNT позволяет получать наноконструкции, содержащие одновременно несколько различных функциональных групп.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлись разработка подхода к созданию новых мультифункциональных наноконструкций, представляющих собой нековалентные гибриды пирен-содержащих олигонуклеотидов и НК-комплексов -с модифицированными углеродными нанотрубками, и демонстрация потенциальной возможности использования созданных конструкций как транспортеров НК в клетки и компонентов электрохимических биосенсоров. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать методы создания мультифункциональных гибридов одностенных и многостенных СЫТ с пиренильными конъюгатами олигонуклеотидов;

• разработать методы сборки гибридов модифицированных одностенных углеродных нанотрубок с НК-дуплексами и трехкомпонентными НК-комплексами;

• изучить физико-химические свойства полученных мультифункциональных гибридов одностенных углеродных нанотрубок с пиренсодержащими олигонуклеотидами и НК-комплексами, исследовать их биосовместимость и возможность проникновения в клетку;

• изучить возможность использования электродов на основе гибридов вертикально ориентированных многостенных углеродных нанотрубок с пиренильными конъюгатами олигонуклеотидов для детекции РНК-мишеней.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен новый подход к получению мультифункциональных гибридов одностенных и многостенных углеродных нанотрубок с нуклеиновыми кислотами, основанный на сочетании процессов ковалентной модификации концов нанотрубок органическими функциональными группами и нековалентной иммобилизации олигонуклеотидов и их комплексов на поверхности нанотрубок с использованием остатков пирена, введенных в 5'-положение олигонуклеотидов. Разработаны новые методы оценки эффективности формирования гибридов пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками. Показано, что основной вклад в эффективность адсорбции пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов на поверхности одностенных углеродных нанотрубок вносит тип химической модификации нанотрубок, а также длина олигонуклеотида. Предложена стратегия создания гибридов Б1РНК-содержащих конструкций с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками и продемонстрировано высвобождение б1РНК из состава гибрида под действием РНКазы Н. Показана низкая цитотоксичность созданных гибридных конструкций на основе модифицированных одностенных углеродных нанотрубок в широком диапазоне концентраций, продемонстрировано их проникновение через клеточную мембрану путем эндоцитоза. Показана принципиальная возможность детекции РНК-мишени за счет изменения емкостных характеристик гибридного электрода из вертикально ориентированных многостенных углеродных нанотрубок, содержащих олигорибонуклеотид-зонд или его пиренильный конъюгат.

Настоящая работа вносит вклад в изучение взаимодействий олигонуклеотидов и НК-комплексов с одностенными и многостенными

углеродными нанотрубками. Можно ожидать, что предложенный в работе подход позволит создать перспективные мультифункциональные транспортеры терапевтических нуклеиновых кислот в клетки и высокочувствительные электрохимические сенсоры нуклеиновых кислот.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией, глава в монографии и получен патент РФ. Результаты работы представлены на Втором Международном форуме по нанотехнологиям RusNanoTech'09 (Москва, 2009), III Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010), Второй Международной конференции по функциональным, гибридным и наноматериалам (Страсбург, Франция, 2011), Ежегодной конференции по углеродным материалам (Краков, Польша, 2012), Международной конференции «Постгеномные технологии для биомедицины» (Новосибирск, 2012), Международной летней школе «Нанотехнология: от фундаментальных исследований к инновациям» (Буковель, Украина, 2012) и др.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 197 страницах, содержит 75 рисунков, 7 схем и 13 таблиц. Библиография включает 438 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Модифицированные одностенные углеродные нанотрубки — платформа для создания гибридных наноконструкций

Гибриды углеродных нанотрубок с НК находят широкое применение в качестве транспортеров терапевтических нуклеиновых кислот, что обусловлено эффективностью их проникновения в клетки, а также низкой токсичностью после модификации поверхности нанотрубок гидрофильными молекулами. Введение флуоресцентных меток в состав таких гибридов дает возможность наблюдать методами конфокальной микроскопии их проникновение через клеточную мембрану, распределение в клетке после трансфекции, а также выведение из клетки.

В качестве платформы для создания гибридов с олигонуклеотидами и НК-комплексами были использованы окисленные одностенные углеродные нанотрубки (single-walled carbon nanotubes, SWCNT), содержащие

3

карбоксильные группы на концах и в местах дефектов поверхности. В качестве флуоресцентной метки был выбран флуоресцеин. Введение остатков флуоресцеина на поверхность нанотрубок осуществляли посредством алифатического (гексаметилендиамин), дендримерного (полиамидоаминовый дендример поколения 3.0, РАМАМ С3.0) или полиэтиленгликолевого (0,0'-бис-(3-аминопропил)полиэтиленгликоль-1500) линкера (рис. 1).

Рис. 1. Модифицированные одностенные углеродные нанотрубки, полученные в работе и использованные для создания гибридов с НК.

Включение органических фрагментов в структуру 8\¥СЫТ доказывали методами ИК- и КР-спектроскопии, термогравиметрического анализа, элементного анализа, просвечивающей электронной микроскопии. Свойства модифицированных 8\\/СЫТ исследовали методами электронной и флуоресцентной спектроскопии, электрофоретического светорассеяния.

2. Пиренильные конъюгаты олигонуклеотидов — компоненты гибридных наноконструкций

Для обеспечения доступности олигонуклеотида в составе наноконструкции для взаимодействий с комплементарной последовательностью или белковым комплексом необходимо наличие линкера, соединяющего олигонуклеотид с якорной группой. В качестве такого линкера нами был выбран гексаэтиленгликоль, обладающий необходимыми качествами линкера оптимального строения — гидрофильностью, гибкостью и достаточной длиной для обеспечения подвижности остатка пирена как якорной группы. Исходные 5'-фосфат- и 5'-гексаэтиленгликольфосфат-содержащие олигонуклеотиды — модельные последовательности и компоненты НК-комплексов - получали путем конденсации полимерсвязанного олигонуклеотида с Н-фосфонатами сульфонилдиэтанола и гексаэтиленгликоля после окончания твердофазного фосфитамидного синтеза и удаления 5'-0-диметокситритильной защитной группы.

Пиренильные конъюгаты 5'-фосфат- и 5'-гексаэтиленгликольфосфат-содержащих олигорибонуклеотидов и олигодезоксирибонуклеотидов получали путем взаимодействия терминальной 5'-фосфатной группы олигонуклеотида, активированной парой трифенилфосфин-2,2'-дипиридилдисульфид в присутствии 4-(Ы,Ы'-димегиламин()пиридина), с 1-пиренилметиламином (схема).

. ff 5' 3'

O-P-O—Олигонуклеотид

Э-P-of — pp-O-Oj

3'

Олигонуклеотид

PlbP, (PyS); DMAP/DMSO

CH

+~N=< CH

Схема

ff 5' 3-

N-P-O—Олигонуклеотид

CH CH

H-. /=\ 8 ? 5' 3'

■N=< N-P-O | P-O—Олигонуклеотид

Нз \=/' СГ «О-

1. Удаление избытка активирующих реагентов

N-P-O—Олигонуклеотид

М СГ

\~г—0[ --- рР-О—I

5' 3"

Олигонуклеотид

Был синтезирован ряд 5'-пиренильных конъюгатов гомо- и гетеро-последовательностей олигонуклеотидов рибо- и дезоксирибо- ряда для получения гибридов с функционализированными БХУСМТ (табл.). Строение синтезированных конъюгатов доказывали методами УФ- и флуоресцентной спектроскопии, а также МАЬО! ТОР масс-спектрометрии.

Таблица. Пиренильные конъюгаты олигонуклеотидов, полученные в работе

Шифр Последовательность олигонуклеотида Молекулярная масса

Рассчита но Найдено 2

Руг(гА),„ 5'-Pyrpr(AAAAAAAAAA) 3408.3 3409.5

Pyr(rA),s 5'-Pyrpr(AAAAAAAAAAAAAAA) 5169.4 5169.9

Руг(гА)2„ 5 '-Py фг( AAAAAAAAAAAAA AAAAAAA) 6815.4 6819.7

Руг(гА)25 5'-Pyrpr(AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA) 8461.4 8467.1

Pyr(dA)is 5'-Pyфd(AAAAAAAAAAAAAAA) 4929.4 4929.8

Pyr(dA)20 5'-Pyrpd(AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA) 6495.4 6500.3

Pyrd22 5'-Pyrpd(ACCCTGAAGTTCCGGCAAGCTG) 7013.6 7020.0

PyrHEGd22 5'-PyrpHEGpd(ACCCTGAAGTTCCGGCAAGCTG) 7358.0 7364.0

Pyrdl7 5'-Pyrpd(AACCGTGGTCATGCTCC) 5439.6 5448.7

PyrHEGdl7 5'-PyфHEGpd(ACCGTGGTCATGCTCC) 5783.9 5785.1

Pyrmdrl-S 5'-Pyrpr(GGCUUGACAAGUUGUAUAUGG) 7011.3 7011.0

1 Руг - остаток 1-пиренилметиламина; HEG - остаток гексаэтиленгликоля; р - фосфатная группа; г - рибонуклеотиды, d -дезоксирибонуклеотиды.

2 Методом MALDI TOF масс-спектрометрии.

Синтезированные пиренильные конъюгаты олигонуклеотидов использовали далее для получения гибридов с одностенными и многостенными углеродными нанотрубками.

5

L __________________________________________________________

3. Мультифункциональные гибриды пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов с одностенными углеродными нанотрубками

Для получения мультифункциональных гибридов одностенных и многостенных углеродных нанотрубок с нуклеиновыми кислотами мы предложили новый подход, основанный на сочетании процессов ковалентной модификации концов нанотрубок органическими функциональными группами и нековалентной модификации поверхности олигонуклеотидными компонентами. Для нековалентной иммобилизации олигонуклеотидов и НК-конструкций на поверхности углеродных нанотрубок в настоящей работе использованы остатки пирена, введенные в 5'-положение олигонуклеотидов, в качестве якорных групп. Данный подход ранее не применяли для получения мультифункциональных гибридов углеродных нанотрубок с НК-конструкциями.

Нековалентные гибриды получали путем ультразвуковой обработки модифицированных углеродных нанотрубок в растворе пиренильного конъюгата олигонуклеотида с последующим отделением нерастворимых агрегатов нанотрубок центрифугированием. В работе было показано, что такая обработка не вызывает ни деградации фосфодиэфирных связей, ни окисления азотистых оснований в составе олигонуклеотида. Образующиеся гибриды не подвержены самопроизвольному разрушению (растворы гибридов сохраняют стабильность в течение длительного времени), стабильны в условиях ПААГ-электрофореза в нативных условиях, но разрушаются в денатурирующих. Продемонстрирована возможность вытеснения пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов с

поверхности нанотрубок 1-пиренбутановой кислотой и красителем метиленовым синим.

Морфологию полученных

нековалентных гибридов исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), визуализацию органических функциональных групп и олигонуклеотидов на поверхности модифицированных SWCNT осуществляли путем контрастирования образцов ацетатом уранила или фосфорно-вольфрамовой кислотой (рис. 2). На ПЭМ-изображениях наблюдали пучки длиной до 1.5 мкм, составленные из углеродных нанотрубок длиной 300-800 нм; на поверхности нанотрубок наблюдали округлые частицы

Рис. 2. ПЭМ-изображения нековалентных гибридов ЗХУСЫТ-СООН (а) и 8\УСМТ-РЕО-Р1ТС (б) с конъюгатом РугНЕСс117. Белыми стрелками отмечены области введения функциональных групп; черными стрелками отмечены места адсорбции олигонуклеотида на поверхности БШСКТ. Контрастирование ацетатом уранила. Размер шкалы - 100 нм.

диаметром около 5 нм, соответствующие адсорбированному олигонуклеотиду, а также объемные электронно-плотные структуры, соответствующие введенным функциональным группам.

Для сравнения эффективности сорбции пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов на поверхности модифицированных 8\¥С1ЯТ был использован метод построения и анализа изотерм адсорбции. В эксперименте фиксировали концентрацию олигонуклеотида и варьировали содержание нанотрубок и поэтому не вычисляли константы адсорбции, а сравнивали форму и поведение изотерм для разных систем по аналогии с [Позмогова и др., 2008]. В рамках данной работы метод построения изотерм адсорбции олигонуклеотидов на поверхности БХУСЫТ был реализован в двух вариантах: по данным о тушении флуоресценции пиренильных остатков при адсорбции на поверхности 8\¥С>1Т и по результатам электрофоретического разделения растворов гибридов в нативном ПААГ с последующей визуализацией олигонуклеотидов методом радиоавтографии. Было показано, что эти два метода могут использоваться как взаимозаменяемые и взаимодополняющие при исследовании формирования гибридов олигонуклеотидов и НК-комплексов с углеродными нанотрубками различных типов функционализации.

Увеличение длины олигонуклеотида, а также наличие функциональных групп на поверхности модифицированных 8\¥С1ЧТ снижают эффективность адсорбции пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов, наличие гидрофильного гексаэтиленгликолевого линкера в составе пиренильного конъюгата олигонуклеотида облегчает адсорбцию пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов на поверхности Б\\'ГСМТ, а природа олигонуклеотида не влияет на эффективность адсорбции (рис. 3).

Рис. 3. Изотермы адсорбции пиренильных конъюгатов олигорибонуклеотидов Руг(гА)15, Руг(гА)2о, Руг(гА)25 (а), олигодезоксирибонуклеотидов Руг(122, РугНЕСс122, РугНЕС(И7 (б) на SWCNT-COOH и пиренильного конъюгата Ругс122 на 8\\'СЫТ-СООП: 8\УСМТ-НМОА-НТС, 8\¥СОТ-РАМАМ-Е1ТС и SWCNT-PEG-FITC (в), полученные из данных о тушении флуоресценции остатков пирена. Концентрация олигонуклеотидов 1 мкМ. Условия: 10 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 1 мМ №2ЕОТА, 0.1 М ЫаС1; комнатная температура.

&

а.5? «о £ *

40

■ З'Л'СНТ-СООН ♦ Руг(Я2

• SWCNT.HMDA.FITC + Руга22

* 5\Л1СЫТ-РАМАМ-ПТС + Ругй22 » SWCNT.PEG.F1TC + Ругй22

20 40 БО 80 100 120 Содержание ЭУУСМТ (мг/л)

Емкость 8\¥СМТ-СООН составила 20-50 мкмоль/г, в зависимости от типа присоединяемого олигонуклеотида, емкость флуоресцентно модифицированных составила 1-20 мкмоль/г.

Формирование гибрида модифицированных углеродных нанотрубок с олигонуклеотидами сопровождалось изменением суммарного заряда конструкций. На профилях изменения электрокинетического потенциала гибридов от количества нанотрубок наблюдали минимумы при содержании нанотрубок 60-100 мг/л, не характерные для растворов модифицированных 8\¥СМТ и соответствующие оптимальному соотношению олигонуклеотида и нанотрубок (рис. 4).

5

X

I ||

о

Содержание ЗИЛ/СИТ-СООН {мг/л}

100 120 НО Содержание SWCNT.PEG.FrrC (мг/л)

Содержание ЭИ/СМТ-РЕв-НТС (мг/л)

Рис. 4. Профили изменения электрокинетического потенциала в зависимости от содержания 8\¥СОТ в растворе гибридов ЗШСМТ-СООН с пиренильными конъюгатами олигорибонуклеотидов Руг(гА)15, Руг(гА)20, Руг(гА)25 (а), гибридов 8"\¥СШ"-СООН (б) и 8\УСМТ-РЕО-Р1ТС (в) с пиренильными конъюгатами олигодезоксирибонуклеотидов Ругс)22, РугНЕС(122. Концентрация олигонуклеотидов 1 мкМ. Условия: 10 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 1 м1уШа2ЕОТА, 0.1 М №С1; комнатная температура.

Полученные результаты были использованы при конструировании более сложных гибридных наноконструкций, содержащих НК-комплексы.

4. Мультифункциональные гибриды НК-комплексов с одностенными углеродными нанотрубками

Нами была предложена стратегия создания гибридов б 1РН К-содержащих конструкций с модифицированными 8\УСЫТ. В качестве объекта была выбрана $1РНК, направленная на участок 557-577 н. мРНК гена множественной лекарственной устойчивости тс1г1, эффективность которой была продемонстрирована ранее в работе [Ьо§азЬепко е1 а1., 2004]. Для введения на поверхность SWCNT нами предложено два альтернативных способа. Первый предполагает введение пиренильной якорной группы в сенс-цепь анти-тс1г!-$\РНК (Ругтс1г1-8) для иммобилизации конструкции на поверхности модифицированных углеродных нанотрубок (рис. 5а). Второй подход - более сложный и предусматривает использование содержащего пиренильную якорную группу олигодезоксирибонуклеотида-коннектора РугНЕСс117,

последовательность которого комплементарна удлиненной с 3'-конца смысловой

Смысловая цепь »РНК (Ругпк1г1-8)

О 5'

—сс-сиислсААсиисиАиАиос

6 ААСССААСисииСААСАидиА 5'

Антисмысловая цепь »РНК (тйМ-Аз)

Антисмысловая цепь в!РНК (1ти1г1-Ав)

- 9 5' 1 5'

м р от ММ>-ААСС6Т®5ТСАТ<ЗСТСС АОАОАСААсиисисАА 3 - Г-АА но °6 ^саг^А^-АА-А-^ - -'АА-А!- А ■ А-'.- ■

(т<1г1-Ь8) или антисмысловой цепи (тс!г1-ЬАз) анти-/ий?г7-51РНК (рис. 56,в).

Наличие в структуре гибрида химерного РНК/ДНК

дуплекса предполагает

возможность высвобождения б1РНК в клетке под действием РНКазы Н. В качестве платформы для создания гибридов с 51РНК-

содержащими НК-

Олигодеэоксирибонукпеотид- КОМПЛвКСЗМИ бЫЛИ

коннектор (РутНЕ&ИТ)

Смысловая цепьв1Рнк (тс!г1^) использованы два типа й'с ^ЙЙ&^ЕГГ"5 модифицированных SWCNT,

SWCNT-COOH и БХУСМТ-РЕС-Р1ТС с целью сравнительного изучения влияния объемных

функциональных групп на эффективность формирования гибридов. Для формирования гибридов НК-комплексов с модифицированными БХУСШ1 использовали три варианта сборки (рис. 6) - вариант «гшх-апё^о», подразумевающий смешивание всех компонентов с дальнейшей обработкой образцов, алгоритмический вариант сборки - получение предформированного

НК-комплекса с его последующей иммобилизацией на 8\¥С>1Т, иерархический вариант сборки -получение предформированного гибрида 8\¥СМТ с пиренильным конъюгатом олигорибо- или олигодезоксирибонуклеотида с последующим взаимодействием с комплементарным олигорибонуклеотидом или с я1РНК, одна из цепей которой удлинена. Формирование гибридов проводили в условиях отжига или ультразвуковой обработки.

Рис. 5. Варианты конструирования гибридов НК-комплексов, содержащих анти-/иб/г/^Р[ 1К, с углеродными нанотрубками: иммобилизация б1РНК (Ругтс1г 1-5/п1(1г 1-А$) на поверхности одностенных углеродных нанотрубок (а), иммобилизация анти-тй^/^РНК-содержащего трехкомпонентного НК-комплекса РугНЕС(117/тс1г1-Ь8/шс1г1-А5 (б) или РугНЕСс117/1ш1г1-ЬА5/тс1г1-8 (в) на поверхности одностенных углеродных нанотрубок.

"М|Х-апс1-до" Алгоритмическая сборка

Рис. 6. Варианты сборки гибридов НК-дуплексов (а) и трехкомпонентных НК-комплексов (б) с углеродными нанотрубками.

¡ш-мьмпшю- Рис. 7. Эффективность формирования

I Алгоритмическая сборка _

иерархическая сборка гибридов Ру гНЕСа 17/та г 1 -Ь» (слева) и РугНЕСс117/шс)г1-Ь8/тс1г1-А5

(справа) с 8\УСМТ-СООН по данным электрофоретического анализа.

Содержание 8\УСЫТ-СООН 50 мг/л, концентрация олигонуклеотидов 1 мкМ. Условия: 5'-Р2Р1-меченый тс1г1-

Обработка Отжиг Обработка

ультразвуком ультра,,,«,» Ь8; буфер: 50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 200

• гисит-соон мМ КС1, 10 мМ MgCl2.

Было проведено сравнение эффективностей трех вариантов сборки гибридов анти-тс1г 1 -б1РНК Ругт(1г1-8/т(1г1-А5 и дуплексов

«олигодезоксирибонуклеотид-коннектор - удлиненная сенс- или антисенс-цепь анти /ий/г/^РНК» РугНЕСс117/т(1г1-Ь8 или РугНЕСсШ/пиМ-ЬАв с 8\¥СЭТ-СООН и 8\¥СМТ-РЕО-Р1ТС (рис. 7). Предварительное исследование ассоциации компонентов гибрида в конструкцию показало, что сборка гибрида в условиях отжига проходит более эффективно по сравнению со сборкой при обработке ультразвуком, а вариант сборки «ппх-апс1^о» существенно уступает по эффективности алгоритмическому и иерархическому вариантам. В связи с этим, детальное сравнение процессов ассоциации компонентов в гибридные конструкции проводили только для алгоритмического и иерархического вариантов сборки в условиях отжига.

Для оценки эффективности различных вариантов сборки гибридов 8\¥СМТ с НК-комплексами использовали метод анализа изотерм адсорбции. Количественные данные для построения изотерм получали путем обработки радиоавтограмм электрофоретического анализа образцов гибридов в 12%-ном нативном ПААГ. В образцах изменяли содержание 8\УСЫР-СООН или ЗШСЫТ-РЕО-ПТС от 0 мг/л до 128 мг/л при фиксированной концентрации НК-дуплекса (рис. 8). При формировании гибридов дуплексов «олигодезоксирибонуклеотид-коннектор РугНЕСсП 7-удлиненная сенс- (пк1г1-Е8) или антисенс-цепь (тс1г1-ЬАэ) анти-дааН^РНК» с 8\¥СКТ-СООН и вХУСЫТ-РЕО-ЕГТС (рис. 8а и 86) алгоритмический подход оказался более эффективным. В то же время, алгоритмический и иерархический подходы были одинаково эффективны при формировании гибридов пиренсодержащей анти-/яа?г/-з1РНК Ругшс1г1-8/шс1г1-А5 с ЗШСЫТ-СООН и 8\¥СЫТ-РЕО-Р1ТС (рис. 8в и 8г). Для обоих вариантов сборки наличие объемных функциональных групп на поверхности затрудняло формирование гибрида.

Для трехкомпонентного НК-комплекса алгоритмический вариант сборки гибрида как с 8\УСКТ-СООН, так и с 5\¥СШ-РЕС-Р1ТС также продемонстрировал большую эффективность, чем иерархический (рис. 9). Наличие объемных органических групп на поверхности 8\¥СЫТ снижает

эффективность формирования гибрида трехкомпонентных НК-комплексов с одностенными углеродными нанотрубками, также, как в случае гибридов НК-дуплексов с SWCNT-COOH и SWCNT-PEG-FITC.

?

О. 40

5 ^

X

I

а I

I?

Содержание SWNT-COOH (мг/л)

Содержание SWCNT-PEG-FITC (мг/л)

■ РугНЕОсЛ7/т<1г1-1-8, Алгоритмическая сборка

в РугНЕС<117/тс1г1 -1_Аз, Алгоритмическая сборка

ш РутНЕСсШ/тагМ-в, Иерархическая сборка

• РугНЕС<И 7/т<1г1-1-А5, Иерархическая сборка

о.

о — ( ■в- й

£ -в-

Содержание SWCNT-COOH (мг/л)

о ~ 60

£ х

Содержание виС||Т-РЕО-Р1ТС (мг)л)

■ Ругт<1г1-5;т(1г1-А1 Алгоритмическая сборка Рупяаг1 -З.'пк1г',-А» Иерархическая сборка

Рис. 8. Эффективность алгоритмической и иерархической сборки гибридов дуплексов РугНЕС(1!7/ш()г1-Ь8 и РугНЕСсШ/тсМ-ЬАв (а,б) и Ругтс1г1-8/пк1г1-А8 (в,г) с

8\¥С1ЧТ-СООН (а,в) и 8\УСМТ-РЕО-Р1ТС (б,г) по данным электрофоретического анализа. Концентрация олигонуклеотидных компонентов 1 мкМ. Условия: 5'-[ Р]-меченый ш(1г1-Ь8, Ш(1г1-ЬА« (а,б), тсМ-Ав (в,г); буфер: 50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 200 мМ КС1, 10 мМ 1^С12; 12%-ный ПААГ (акриламид:М,М'-метиленбисакриламид (29:1), 50 мМ Трис-борат, рН 8.3, 10 мМ 1У^С12).

■ РугНЕС«П7/тс1г1-1£/пк1г1-Ав. Алгоритмическая сборка

• РугНЕ(5<И7/т<1г1-1А8/тс1г1-3, Алгоритмическая сборка

■ РугНЕ6<117/пж1г1-1-3/т<1г1-Ав, Иерархическая сборка

• РугНЕС<117/пх1П-ШаМ*1г1-5. Иерархическая сборка

100 120 Содержание вУЮТ-СООН (мг/л)

20 40 60 80 100 120 Содержание БУУЫТ-РЕС-РГГС (мг/л)

Рис. 9. Эффективность алгоритмической и иерархической сборки гибридов трехкомпонентных НК-комплексов РугНЕСс117/шс!г1-Ь8/тс!г1-А8 и РугНЕСс117/тс1г1-ЬА8/тс1г1-8 с ЗХУСЫТ-СООН (а) и 8\¥С>1Т-РЕО-Р1ТС (б) по данным электрофоретического анализа. Концентрация олигонуклеотидных компонентов 1 мкМ. Условия: 5'-[32Р]-меченый пк1г1-Ь8 или т<1г1-ЬА8; буфер: 50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 200 мМ КС1, 10 мМ М§С12; 12%-ный ПААГ (акриламид:Ы,>Г-метиленбисакриламид (29:1), 50 мМ Трис-борат, рН 8.3, 10 мМ М^С12).

Аналогично адсорбции дуплексов на поверхности модифицированных 8\УС>)Т, вероятной причиной различий является меньшая доступность олигонуклеотида РугНЕСс117, иммобилизованного на поверхности нанотрубок, для взаимодействия с дуплексами тс1г1-Ь8/т(1г1-А$ или п^г1-ЬА$/тс1г1-8 в условиях иерархической сборки или меньшая доступность остатков пирена в составе трехкомпонентного комплекса РугНЕС(117/тс1г1-Ь8/тс1г1-А8 или РугНЕС(П7/п1{1г1-ЬА5/тс1г1-8 для адсорбции на поверхности нанотрубок.

В структуре НК-конструкций, иммобилизованных на поверхности ЗУ/СМТ. присутствует химерный РНК/ДНК дуплекс, который подразумевает возможность расщепления РНК в его составе под действием РНКазы Н и последующее высвобождение б1РНК из состава гибрида. Было проведено сравнительное исследование расщепления РНК в химерном РНК/ДНК дуплексе в растворе и на поверхности 8\¥СЫТ-СОС)Н под действием РНКазы Н и расщепление РНК в составе трехкомпонентного НК-комплекса и его гибрида с 8\\^СМТ-СООН (рис. 10).

Иммобилизация дуплекса или трехкомпонентного НК-комплекса на поверхности Би'СЫТ-СООН затрудняет расщепление РНК под действием РНКазы Н. Через 5 мин инкубации химерных дуплексов РугНЕС(Н7/шс1г1-Е8 и РугНЕСс117/тс1г1-ЬА8 регистрировали расщепление РНК-фрагмента, находящегося в дуплексе с ДНК, в то время как в составе гибрида степень расщепления РНК через 3 ч составила 70 %. Расщепление РНК в составе трехкомпонентного НК-комплекса РугНЕСс117/т(1г1-Ь8/т(1г1-А8 происходило медленнее, чем в составе химерного дуплекса РугНЕС(И7/тс1г1-Е8 (рис. 10а и 10в), что, вероятно, связано с меньшей доступностью для РНКазы Н химерного РНК/ДНК дуплекса в составе трехкомпонентного комплекса. Как и в случае

Рис. 10. Расщепление РНК в дуплексе PyrHEGdl7/mdrl-LS (а,б) и в трехкомпонентном НК -комплексе PyrHEGdl7/mdrl-LS/mdrl-As (в,г) в растворе (а,в) и в составе гибрида с SWCNT-COOH (б,г). I - Удлиненная сенс-цепь siPHK mdrl-LS, II - продукты расщепления. Kl - mdrl-LS; К2 - НК-дуплекс (а,б) или трехкомпонентной НК-комплекс (в,г). Условия: 5'-[32Р]-меченый mdrl-LS; 2.5 ед.акт РНКазы H Е. coli; 20 мМ Трис-НС1 (рН 7.8), 40 мМ КС1, 8 мМ MgCl2, 1 мМ DTT; 37 °С; 15%-ный ПААГ (акриламид^Х-метиленбисакриламид (29:1), 8 M мочевина, 50 мМ Трис-борат, рН 8.3, 0.1 мМ Na2EDTA).

дуплекса, процесс расщепления РНК РНКазой Н в составе гибрида трехкомпонентного комплекса с БХУСЫТ-СООН проходит значительно медленнее, чем в растворе. Через 6 часов степень расщепления РНК составила 30%, в то время как в «свободном» НК-комплексе расщепление РНК-фрагмента, находящегося в дуплексе с ДНК, регистрировали уже через 15 мин (рис. 10 в,г). Аналогичные результаты получали и в случае гибрида трехкомпонентного комплекса РугНЕСс) 17/тс1г1-ЬА8/т(1г1-8. Полученные результаты могут быть связаны с укладкой олигонуклеотидов на поверхности углеродных нанотрубок, что затрудняет их связывание с РНКазой Н, или со снижением активности РНКазы Н за счет возможной частичной ее адсорбции на поверхности 8\УСЫТ-СООН.

Таким образом, нами продемонстрирована принципиальная возможность высвобождения б1РНК из гибрида трехкомпонентного НК-комплекса с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками под действием РНКазы Н. Это свойство полученных конструкций может быть использовано для высвобождения терапевтических НК из состава гибрида с 8\\^СКТ после проникновения в клетку.

5. Исследование биосовместимости и взаимодействия с клетками модифицированных одностенных углеродных нанотрубок и их гибридов с олигонуклеотидами

Несмотря на интенсивное исследование цитотоксичности и генотоксичности немодифицированных углеродных нанотрубок, биосовместимость ковалентно и нековалентно модифицированных нанотрубок до сих пор остается недостаточно изученной. Для изучения вклада различных функциональных групп (пирен, олигонуклеотид, полиэтиленгликоль), обладающих потенциальной биологической активностью, в биосовместимость созданных гибридных наноконструкций, было проведено сравнительное изучение цитотоксичности модифицированных 8\Л/СМТ и их гибридов с олигонуклеотидами. Данная часть работы выполнена совместно с Лабораторией биохимии нуклеиновых кислот и Группой микроскопических исследований ИХБФМ СО РАН.

Цитотоксичность модифицированных нанотрубок В\¥С1ЧТ-СОС>Н и 8\¥СЫТ-РЕОТТТС и их гибридов с олигонуклеотидами для клеток линий НеЕа, КВ-3-1 и КВ-8-5 определяли с использованием МТТ-теста. Для обоих типов БХУСМТ и их гибридов с олигонуклеотидами наблюдали дозо-зависимый профиль токсичности (рис. 11 а,б). Полученные результаты демонстрируют различную чувствительность клеточных линий по отношению к БШСМТ. Так, клетки НеЕа демонстрируют наименьшую чувствительность, а КВ-3-1 - наибольшую (токсическая концентрация 1С50 для клеток линии КВ-3-1 составила 4.3 мг/л БХУСТМТ-СООН и 19.3 мг/л SWCNT-PEG-FITC).

Влияние иммобилизации олигонуклеотида на поверхности SWCNT на их цитотоксичность оценивали с использованием пиренильного конъюгата олигонуклеотида PyrHEGdl7 и клеток линии КВ-8-5. Данный олигонуклеотид был выбран для исследований биосовместимости гибридов, поскольку он не имеет полностью комплементарной ему последовательности в геноме человека [Zhang et al., 2008] и, таким образом, не проявляет биологической активности. Значения 1С50 для гибридов SWCNT-COOH и SWCNT-PEG-FITC не были достигнуты в диапазоне концентраций до 100 мг/л (рис. 11 в). Отметим, что в большинстве работ по применению CNT для доставки НК in vitro рабочие концентрации нанотрубок лежат в области 1-10 мг/л. Полученные нами данные демонстрируют биосовместимость гибридов олигонуклеотидов с модифицированными SWCNT.

о SWCNT-COOH

О SWCNT-PEG-FITC Л SWCNT-COOH+PyrHEGd17 О SWCNT-PEG-FITC+PvrHEGd17

0,001 0,01 0.1 1 10 11 Содержание SWCNT-COOH (мг/л)

0,001 0,01 0,1 1 10 100 Содержание SWCNT-PEG-FITC (мг/л)

0,001 0,01 0,1 1 10 Содержание SWCNT (мг/л)

Рис. 11. Профили жизнеспособности клеток линий НеЬа, КВ-3-1 и КВ-8-5 при экспозиции с 8\¥СМТ-СООН (а) и 8\¥С1ЧТ-РЕО-Р1ТС (б) и профили жизнеспособности клеток линии КВ-8-5 при экспозиции с 8\УСШ"-СООН, 8\УС>1Т-РЕО-Р1ТС и их гибридом с РугНЕС(117 (в) по данным МТТ-теста.

Для изучения взаимодействия гибридных 8\¥СМТ-наноконструкций, полученных в данной работе, с поверхностью клеток использовали метод ПЭМ-исследования ультратонких срезов. Объектом исследования служили клетки линии КВ-8-5 после экспозиции с SWCNT-COOH, 8\¥С1ЧТ-РЕО-Р1ТС и их гибридами с олигонуклеотидами. Во всех образцах наблюдали адсорбцию модифицированных БХ^УОЧТ на поверхности клеток и выростах цитоплазмы (рис. 12). Следует отметить, что при контакте с БШСМТ не происходит изменения цитоплазмы ни в зоне адсорбции нанотрубок на мембране, ни в других областях клетки.

Адсорбция 8\УС1ЧТ-СООН и их гибридов с олигонуклеотидами на поверхности клеток наблюдалась чаще, чем в случае 8\¥СМТ-РЕС-Р1ТС. В клетках наблюдали эндоцитозные пузырьки и эндосомы, содержащие углеродные наноконструкции. Ультраструктурное исследование показало, что функционализированные Б\УСМТ и их гибриды с олигонуклеотидами после адсорбции на поверхности клеток линии КВ-8-5 не влияют на морфологию клеток и не блокируют митотическое деление не менее, чем в течение 4 ч 14

инкубации, что указывает на отсутствие генотоксических эффектов. Нанотрубки взаимодействуют с плазматической мембраной и проникают внутрь клеток без

видимого повреждения клеточных структур.

Рис. 12. Взаимодействие

модифицированных 8\¥СЫТ с клетками линии КВ-8-5: нанотрубки между двумя клетками (а), адсорбция 8\¥СКТ на поверхности клеток и выростах цитоплазмы (б-г). Тонкими стрелками показаны пучки нанотрубок, толстыми стрелками показана плазматическая мембрана. Кольцами выделены эндоцитозные пузырьки, содержащие 8\¥С14Т. Клетки обрабатывали гибридом ЗШОЧТ-СООН с РугНЕвсШ (а), вХУСЫТ-СООН (б), Б^^СМТ-РЕО^ТС (в), гибридом 8\У»1Т-РЕО-Р1ТС с РугНЕС(117 (г).

Полученные результаты демонстрируют биосовместимость гибридов SWCNT с пиренильными конъюгатами олигонуклеотидов и возможность их проникновения через клеточную мембрану путем эндоцитоза. Несмотря на то, что в данном направлении работы необходимо проведение дополнительных исследований, полученные предварительные результаты демонстрируют возможность применения гибридных CNT-HK-наноконструкций в качестве транспортеров терапевтических НК в клетки.

6. Гибриды пиренильных конъюгатов олигорибонуклеотидов с вертикально ориентированными многостенными углеродными нанотрубками для детекции РНК

Детекция специфических последовательностей нуклеиновых кислот представляет собой актуальную задачу клинической и лабораторной практики. Большой потенциал в этом направлении имеют электрохимические методы с использованием электродов на основе углеродных нанотрубок. В настоящее время разработаны системы детекции последовательностей НК с использованием различных электрохимических методов, в то же время емкостные характеристики CNT-электродов в процессе гибридизации НК-зонда с НК-мишенью до сих пор оставались недостаточно исследованными.

Данный раздел работы посвящен изучению емкостных характеристик электродов из многостенных углеродных нанотрубок (multi-walled carbon nanotubes, MWCNT), несущих олигонуклеотидные зонды. Работа выполнялась совместно с Лабораторией физико-химии наноматериалов ИНХ СО РАН.

Были сконструированы гибридные электроды, представляющие собой каркас, состоящий из массива вертикально ориентированных М\УСЭТ, выращенных на проводящей кремниевой подложке, - преобразователя электродных процессов в электрический сигнал - и иммобилизованного на нем олигорибонуклеотидного

зонда, обеспечивающего

селективность электрода к детектируемой РНК в растворе. Массив MWCNT насыщали олигонуклеотидом-зондом.

Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности М\¥С1ЧТ (

происходила в результате нековалентного взаимодействия гетероциклических оснований олигонуклеотида (зонд р(гА)10) или якорной группы (5'-пиренсодержащий зонд

Гибридные электроды были охарактеризованы методами растровой электронной микроскопии, ХР8- и ^ХЛЕБ-спектроскопии.

Измерение электрохимических свойств полученных гибридных электродов проводили методом циклической вольтамперометрии (ДВА) с линейной разверткой потенциала в диапазоне [0; 1] В в трехэлектродной ячейке с хлорсеребряным электродом сравнения (рис. 13) со скоростью развертки потенциала 20 мВ/с. Из данных ЦВА рассчитывали значения абсолютной емкости электрода и относительного изменения емкости электрода. При добавлении в ячейку олигорибонуклеотида-мишени регистрировали изменение емкости электрода. В качестве мишеней использовали модельные олигорибонуклеотиды р(г11)12 (комплементарный олигонуклеотид-мишень) и р(гС)8 (некомплементарный олигонуклеотид-мишень).

При циклировании гибридного электрода р(гА)ю/М\УСМТ, содержащего ' ^модифицированный олигорибонуклеотид-зонд, в присутствии комплементарного олигорибонуклеотида-мишени р(ги)п регистрировали резкое увеличение емкости (на 70%) с последующим уменьшением до исходного значения. В присутствии некомплементарного олигорибонуклеотида-мишени р(гС)8 регистрировали рост емкости (-20%) с последующим выходом значений емкости на плато. Через 30 циклов (около 3000 с) в обоих случаях происходит стабилизация значений силы тока и емкости электрода (рис. 14а,б). 16

Рис. 13. Схематическое изображение электродного контакта (а) и трехэлектродной ячейки (б). Обозначения: 1 - проводящий клей, 2 -исследуемый образец, 3 - мембрана из полипропиленового волокна, 4 — вспомогательный электрод, 5 — электрод сравнения, 6 - штанга штатива, 7 - рабочий электрод, 8 - изолятор, 9 -фиксатор электродов, 10 — фторопластовый цилиндр, 11 - стеклянный бюкс.

Руг(гА)ю) с поверхностью нанотрубок.

При циклировании гибридного электрода Руг(гА)10/М\¥С1ЧТ, содержащего пирен-модифицированный олигорибонуклеотид-зонд, в присутствии комплементарного олигорибонуклеотида-мишени р(г1Г)12 регистрировали увеличение площади гистерезиса в течение первых трех циклов после добавления мишени с последующей стабилизацией ее значений (рис. 14г,д). При циклировании электродов в присутствии некомплементарного олигорибонуклеотида-мишени р(гС)8 не наблюдали существенных изменений площади гистерезиса. В целом, гибридный электрод, содержащий пирен-модифицированный олигонуклеотидный зонд, обладал большей селективностью и большей стабильностью сигнала в течение анализа.

напряжения (мВ) Номер цикл*

Рис. 14. Циклические вольтамперограммы (а), зависимость относительного изменения емкости гибридного электрода р^А^о/М'М'СМТ в присутствии олигонуклеотидов-мишеней р(ги)и и р(гС)8 (б) и предполагаемая схема взаимодействия иммобилизованного на электроде зонда р(гА)ю с олигонуклеотидом-мишенью р(ги)12 (в). Циклические вольтамперограммы (г), зависимость относительного изменения емкости гибридного электрода Руг(гА)ю/МШСЫТ в присутствии олигонуклеотидов-мишеней р(г11)12 и р(гС)8 (д) и предполагаемая схема взаимодействия иммобилизованного на электроде зонда Руг(гА)10 с олигонуклеотидом-мишенью р(г1!),2 (е). С0 - ёмкость электрода на первом цикле, С — текущая ёмкость. Условия: 10 мМ какодилат натрия, рН 7.4, 0.1 М ЫаС1, 1 мМ №2ЕОТА: скорость развертки 20 мВ/с; комнатная температура. Концентрация олигонуклеотида-мишени 10 мкМ; олигонуклеотид-мишень добавляли на 3-м цикле.

На основании наблюдаемых закономерностей нами были предложены следующие механизмы взаимодействия олигонуклеотидов на поверхности электродов. При добавлении комплементарного олигонуклеотида-мишени в ячейку формируется дуплекс с иммобилизованным на М\УСЫТ олигонуклеотидным зондом, что приводит к увеличению заряда на поверхности

17

электрода, и как следствие, к увеличению его ёмкости. При использовании немодифицированного олигорибонуклеотида-зонда образующийся дуплекс р(гА)ю/р(ги)12 отделяется от поверхности М\УСМТ; этому процессу соответствует уменьшение емкости в связи с уменьшением заряда электрода (рис. 14в).

При использовании пирен-модифицированного олигорибонуклеотида-зонда после добавления в ячейку комплементарного олигорибонуклеотида-мишени р(ги)|2 образующийся дуплекс Руг(гА)ю/р(ги)12 удерживается на поверхности М\УСИТ за счет пиренильной якорной группы в структуре зонда, что приводит к накоплению заряда на поверхности электрода, выражающемуся в росте емкости (рис. 14е). Некомплементарный олигорибонуклеотид-мишень р(гС)8 не способен образовать дуплекс с иммобилизованным зондом р(гА)ю и частично адсорбируется на поверхности МШСИТ за счет стэкинг-взаимодействий гетероциклических оснований с поверхностью, что приводит к увеличению заряда поверхности и, следовательно, к увеличению емкости электрода.

Наблюдаемое в работе явление изменения емкостных характеристик гибридных электродов при взаимодействии с олигонуклеотидами-мишенями может быть использовано для электрохимической детекции РНК, а также ДНК. Следует отметить, что специфичный электрохимический отклик гибридных электродов наблюдается в отсутствие электрохимических меток, что значительно упрощает процесс детекции.

Выводы

1. Получены и охарактеризованы химически модифицированные одностенные углеродные нанотрубки, содержащие остатки флуоресцеина, введенные ковалентно на концы нанотрубок посредством различных аминолинкеров (гексаметилендиамин, полиамидоаминовый дендример, диамино-полиэтиленгликоль).

2. Разработан подход к получению мультифункциональных гибридов углеродных нанотрубок с олигонуклеотидами, основанный на нековалентном взаимодействии 5'-монопиренильных конъюгатов олигорибонуклеотидов и олигодезоксирибонуклеотидов с химически модифицированными углеродными нанотрубками. Методом электрофоретического светорассеяния продемонстрирована стабильность растворов полученных гибридов.

3. Разработаны методы оценки эффективности формирования гибридов пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов с одностенными углеродными нанотрубками по данным флуоресцентной спектроскопии и электрофоретического анализа. Показано, что основной вклад в эффективность адсорбции пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов на поверхности одностенных углеродных нанотрубок вносит тип химической модификации нанотрубок, а также длина олигонуклеотида.

4. Разработаны новые подходы к сборке гибридов з1РНК и НК-комплексов, содержащих 51РНК, с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками. Показано, что оптимальным является алгоритмический вариант сборки гибрида, подразумевающий взаимодействие предформированного НК-комплекса с модифицированными углеродными нанотрубками.

5. Показана способность РНКазы Н расщеплять РНК в составе химерного РНК/ДНК-дуплекса, иммобилизованного на поверхности одностенных углеродных нанотрубок. Продемонстрировано высвобождение б1РНК из гибрида з1РНК-содержащего НК-комплекса с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками.

6. Продемонстрирована биосовместимость модифицированных одностенных углеродных нанотрубок и их гибридов с пиренильными конъюгатами олигонуклеотидов на культурах клеток НеЬа, КВ-3-1, КВ-8-5. Методом ПЭМ показано, что конструкции на основе модифицированных одностенных углеродных нанотрубок способны проникать через клеточную мембрану путем эндоцитоза и накапливаться в эндосомах.

7. На модельной системе показано, что нековалентные гибриды олигорибонуклеотидов и их 5'-монопиренильных конъюгатов с вертикально ориентированными многостенными углеродными нанотрубками могут быть использованы как электроды для специфичного распознавания комплементарного олигорибонуклеотида за счет изменения емкостных характеристик электрода, при этом наличие пиренильного остатка в структуре зонда позволяет улучшить аналитический сигнал.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Апарпин Е.К.. Новопашина Д.С., Окотруб А.В., Веньяминова А.Г. Электрохимические биосенсоры нуклеиновых кислот на основе углеродных нанотрубок (обзор) // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. — 2012. — Т. 10. —№1. — С. 181-190.

2. Апарцин Е.К.. Новопашина Д.С., Настаушев Ю.В., Веньяминова А.Г. Флуоресцентно меченые одностенные углеродные нанотрубки и их гибриды с олигонуклеотидами // Рос. Нанотехнол. - 2012. - Т.7. - №3-4. - С. 99-109.

3. Novopashina D.S., Apartsin Е.К.. Venyaminova A.G. Fluorescently labelled bionanotransporters of nucleic acids based on carbon nanotubes // Ukr. J. Phys. -2012. - V.57. - N7. - P.718-722.

4. Apartsin E.K.. Buyanova M.Yu., Novopashina D.S., Ryabchikova E.I., Venyaminova A.G. Non-covalent immobilization of oligonucleotides on single-walled carbon nanotubes / Fesenko O., Yatsenko L., Brodin M. (eds.) Nanomaterials imaging techniques, surface studies, and applications - New York: Springer Science+Business Media - 2013. - P.291-307.

5. Apartsin E.K.. Buyanova M.Yu., Novopashina D.S., Ryabchikova E.I., Filatov A.V., Zenkova M.A., Venyaminova A.G. Novel multifunctional hybrids of singlewalled carbon nanotubes with nucleic acids: synthesis and interactions with living cells//ACS Appl. Mater. Interfaces-2014.-V.6.-N3.-P.1454-1461.

6. Федоровская E.O., Апарцин E.K.. Новопашина Д.С., Булушева Л.Г., Веньяминова А.Г., Окотруб А.В. Способ детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот (варианты) и устройство для его осуществления // Патент РФ № 2509157, дата приоритета 26.10.2011.

7. Novopashina D.S., Buyanova M.Yu., Apartsin E.K., Permyakova E.S., Ryabchikova E.I., Filatov A.V., Zenkova M.A., Venyaminova A.G. Hybrids of therapeutic nucleic acids with modified SWCNTs // 3rd International Conference "Nanobiophysics: fundamental and applied aspects" (7-10 October 2013). Abstracts. P. 65.

20

Подписано в печать 18.04.2014 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 200 экз. Заказ № 210

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07