Нелинейно-оптические эффекты и многофотонное поглощение фемтосекундных импульсов в микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

005050270

на правах рукописи

Залесский Александр Дмитриевич

НЕЛИНЕЙНО-ОПТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И МНОГОФОТОННОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ ФЕМТОСЕКУНДНЫХ ИМПУЛЬСОВ В МИКРОХИРУРГИИ РАННИХ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных

состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

н НАР 2013

Москва-2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической физики им. H.H. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН)

Научный руководитель: Надточенко Виктор Андреевич,

доктор химических наук, профессор, ИХФ РАН, зав. лаб.

Официальные оппоненты: Гурия Георгий Теодорович,

доктор физико-математических наук, профессор, ГНЦ МЗ РФ, зав. лаб.

Смирнов Вячеслав Александрович, доктор физико-математических наук, ИПХФ РАН, в.н.с.

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт проблем лазерных и информационных технологий Российской академии наук (ИПЛИТ РАН)

Защита диссертации состоится «20» марта 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.012.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической физики им. H.H. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН) по адресу: И 9991, Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте химической физики им. H.H. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН).

Автореферат разослан «20» февраля 2013 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 002.012.02,

кандидат физико-математических наук М.Г. Голубков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Диссертационная работа посвящена экспериментальному и теоретическому изучению взаимодействия лазерного излучения с искусственными и биологическими мезоскопическими объектами. Основной задачей работы является исследование взаимодействия остросфокусированных лазерных пучков с эмбриональными клетками и разработка экспериментальных методик.

Актуальность работы определяется фундаментальным интересом к механизмам взаимодействия сверхкоротких лазерных (фемтосекундных) импульсов с биологическими объектами, что определяется развитием новых клеточных биотехнологий. Остросфокусированное лазерный луч можно использовать в качестве «пинцета» за счет различных опто-механических эффектов, и осуществлять манипулирование мезоскопическими биообъектами. При использовании фемтосекундных импульсов в фокальной плоскости объектива можно получить высокую плотность мощности излучения в результате чего оптически прозрачный биологический материал становится поглощающим за счет нелинейно-оптических эффектов. Фемтосекундные импульсы обеспечивают высокую плотность мощности излучения при невысокой энергии импульса, и в результате удается сфокусированный лазерный луч использовать в качестве лазерного «скальпеля» без значительного теплового повреждения биообъекта. На основе оптического «пинцета» и «скальпеля» представляется возможным создать методики манипулирования биообъектами в которых операции можно осуществлять с биоклетками без нарушения целостности оболочки. Этот подход открывает новые возможности в биотехнологии клеток. Фундаментальными основами такого подхода служит исследование фотохимических и фотофизических процессов в биообъектах индуцированных многофотонным поглощением фемтосекундных импульсов. В данной работе решаются задачи разработки экспериментальных методов лазерной нанохирургии с использованием множества оптических «скальпелей» и «пинцетов», сформированных методами динамической голографии, с использованием фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения с различными спектральными характеристиками.

і / I

Задачи и цели работы

Цель работы состоит в разработке и реализации методик оптического манипулирования с использованием лазерных импульсов фемтосекундной длительности. Данная работа решает следующие задачи:

1. Исследовать возможность использования фемтосекундных лазерных импульсов для реализации оптического манипулирования мезоскопическими объектами и осуществления активного физико-химического воздействия на объект изучения.

2. Разработать и реализовать новую методику голографического оптического манипулирования мезоскопическими объектами с использованием фемтосекундных импульсов, исследовать возможности и ограничения новой методики.

3. Разработать фундаментальные основы технологии получения генетически модифицированных животных при помощи лазерного манипулятора с использованием принципов многофотонной фотохимии.

4. Разработать фундаментальные основы технологии терапевтического клонирования с использованием методов лазерного манипулирования мезоскопическими объектами.

Научная новизна

Разработана и реализована не имеющая аналогов экспериментальная установка лазерного манипулирования микрообъектами, с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров. Таким образом, реализован новый метод оптического манипулирования, совмещающий возможности фемтосекундного лазерного скальпеля и «голографического оптического пинцета».

Экспериментально установлены параметры лазерного излучения (длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, длина волны 800 нм, энергия импульса 1 нДж, длительность экспозиции 30 мс) необходимые для проведения неинвазивного лазерного слияния двух бластомеров эмбриона мыши. Также установлены параметры воздействия фемтосекундным скальпелем (длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, длина волны 800 нм, энергия импульса 1 нДж, длительность экспозиции 10 мс) для слияния яйцеклетки мыши с соматической клеткой. Выявлены различия при слиянии двух клеток равного размера и клеток, размеры которых различаются на порядок величины. Успешное слияние бластомеров эмбриона мыши происходило при образовании кавитационного пузыря при воздействии фемтосекундным лазерным скальпелем. При этом не наблюдалось заметного изменения

морфологии клеток сразу после воздействия, полное слияние происходило через 20 - 30 минут. При слиянии ооцита (яйцеклетки) мыши и фибробласта (размер фибробласта на порядок величины меньше размера ооцита) процедура протекала успешно при отсутствии кавитационного пузыря. При этом сразу после воздействия фемтосекундного скальпеля наблюдалось образование «перемычки» между клетками.

Практическая значимость работы

Методики, разработанные на основе полученных в ходе работы данных, имеют непосредственное прикладное значение в биологии, медицине и фармацевтике. Предложенная новая технология получения генетически модифицированных животных («чистые линии») находится на стадии патентования.

Получение индивидуальных эмбриональных стволовых клеток человека и на сегодняшний день является актуальнейшей задачей современной биомедицины. Одним из важнейших результатов работы является демонстрация возможности использовать разработанную методику лазерного манипулирования для проведения терапевтического клонирования, т.е. получения индивидуальных эмбриональных стволовых клеток.

Личный вклад автора

Экспериментальные установки для проведения экспериментов были собраны лично автором. Все приведённые в диссертации экспериментальные результаты получены автором лично либо при его участии. Постановка задачи, а также обсуждение результатов всех представленных экспериментальных данных происходило при непосредственном участии автора.

Апробация работы

Основные результаты, вошедшие в диссертацию, были представлены в докладах на следующих научных конференциях:

1. 51-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», г. Москва —Долгопрудный,

2008 г.

2. Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», г. Москва, 2008 г.

3. 52-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», г. Москва - Долгопрудный,

2009 г.

4. «Конференция-конкурс молодых физиков», г. Москва, 2010 г.

5. «14-я Пущинская международная школа-конференция молодых учёных», г. Пущино, 2010 г.

6. ICONO/LAT, Kazan, 2010

7. «15-я Пущинская международная школа-конференция молодых учёных», г. Пущино, 2011 г.

8. «Химическая физика вчера, сегодня, завтра», г. Москва, 2011 г.

9. XXIV Семёновские чтения, г. Москва, 2012 г.

Ю.Н-я Международная конференция «Модели инновационного развития

фармацевтической и медицинской промышленности на базе

университетов, как интеграторов науки и индустрии», г.

Долгопрудный, 2012 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, входящих в перечень ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении приведено обоснование актуальности выбранной темы, перечислены основные цели и задачи работы, говорится о её научной новизне и практической значимости, коротко излагается содержание диссертации.

Первая глава диссертации является обзором научной литературы по тематике работы. В этой главе кратко изложены основные принципы оптического манипулирования, рассмотрена история развития этой методики, представлены модели взаимодействия фемтосекундного лазерного излучения с биообъектами, которое приводит к практически важному результату - локальной деструкции биоматериала или микрохирургии.

Во второй главе описываются разработанные экспериментальные установки и предварительные экспериментальные результаты. Установки созданы в лаборатории био- и нанофотоники Института химической физики им. H.H. Семёнова РАН.

Во третьей главе теоретически рассматривается возможность реализации оптического захвата и манипулирования при помощи фемтосекундных лазерных импульсов, обсуждается вопрос возможности реализации голографического оптического манипулирования фемтосекундными импульсами.

В четвёртой главе приведены результаты различных подготовительных экспериментов, демонстрирующих широкие возможности предлагаемой методики манипулирования биообъектами при помощи лазерного излучения. Описываются экспериментальные результаты по микрохирургическому воздействию на ранние эмбрионы мышей при использовании двух источников лазерного излучения - непрерывного и фемтосекундного. Приведены данные по развитию эмбрионов после воздействия, выполнено сравнение с контрольными группами. Сделаны

выводы о влиянии лазерного воздействия на последующее развитие эмбрионов. Рассмотрены особенности лазерного слияния бластомеров эмбриона, приведены экспериментальные результаты по слиянию этих клеток, рассмотрены возможные механизмы слияния.

В пятой главе, исходя из предыдущих результатов, предлагаются две новые, практически важные, неинвазивные методики для клеточной инженерии - методика получения «чистых линий» животных и методика лазерного терапевтического клонирования. Кратко обосновывается важность предлагаемых разработок и актуальность этих тематик. Приводятся экспериментальные данные по получению реконструированного эмбриона, как в процессе получения «чистой линии», так и в случае терапевтического клонирования. Приведены результаты развития подобных реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты - стадии, на которой возможна имплантация реципиенту и дальнейшее получение потомства.

В Заключении даётся перечень результатов, выносимых на защиту, обсуждается их практическая и научная значимость.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Принцип действия оптического манипулятора

Оптический манипулятор основан на оптическом захвате объекта. Описание физики захвата зависит от отношения размера частицы и длины волны излучения, с помощью которого производится захват. Существует два предельных случая: 1) размер частицы много меньше длины волны и 2) размер частицы много больше длины волны.

В первом случае полагают, что частица в фокусе объектива под действием лазерного излучения становится однородно поляризованной, и далее её рассматривают как точечный диполь. На частицу подобного типа, в общем случае, действуют силы, обусловленные поглощением, рассеянием света (Рпогл. и /^расс ), а также градиентом интенсивности излучения ^фад).

Сила /^рад пропорциональна поляризуемости:

р.,., = (е 2>> (1>

и всегда направлена вдоль градиента интенсивности к дифракционно ограниченному фокальному пятну. Эта сила может превосходить другие упомянутые силы (^погл. и /^расс.), что приводит к эффекту «ловушки»: частица попадает в потенциальную яму, которую в данном приближении можно

описывать гармоническим потенциалом: и = , где к является

характеристической константой захвата и х0- центр ловушки.

Поведение прозрачных частиц, размеры которых много больше длины волны падающего излучения, описывается классическими теориями преломления и отражения.

Движения частицы в потенциальной яме под действием света

С целью установления необходимых параметров установки при использовании фемтосекундного лазера для оптического захвата, было проведено теоретическое описание перемещения броуновской частицы

Для непрерывного лазера рассмотрим поведение захваченной частицы в потенциальной яме U(r) = U(r) глубины Ub и ширины /„(рис.1). Последняя величина определяется из равенства U(lJ = -kBT. Потенциал U(r) обусловлен взаимодействием частицы с электрическим полем [см. формулу (1)]:

Щг)—aE2(r)~-alV(r), (2).

которое пропорционально квадрату

электрического поля лазерного излучения Е(г) , т.е. мощности лазера W(г) ~ Е2(г) и поляризуемости частицы а. Ширина Iw и глубина Ut ямы определяются длиной волны лазера X , мощностью излучения W, фокусирующим объективом (есть зависимость от параметров установки).

Кинетика движения частицы описывается функцией распределения (ФР) p(r,t) этой частицы, которая удовлетворяет уравнению Смолуховского p = Dr-ldldr[r\dpldr+pduldr)}, где u(r) = U(r)/(kBT).

Модуляция напряжённости электрического поля лазера E(r,t) приводит к зависимости потенциала от времени. Пусть зависимость E(t) имеет импульсный вид, Ер - амплитуда импульсов, тр- их длительность, а xd -время между импульсами, причём xd » тр.

В пределе быстрой модуляции E(r,t), когда за время «модуляции» rp + rd частица практически не смещается внутри потенциальной «ямы»: Dt eil, где т = т +Tj, поставленная задача существенно упрощается. В этом пределе кинетика частицы может быть описана с помощью ФР, усреднённой по некоторому периоду Те .который удовлетворяет неравенствам г <к <к Л / D:

ФР p(r,t) подчиняется усреднённому уравнению Смолуховского p = DV(Vp+pVU), где й(г) = П(г)/(кТ), в котором средний потенциал О (г) не зависит от времени и определяется потенциалом Up(r) - aE2p(r) ~ Wp(r):

й(г)==Tp(TJ+Tpy'up(r). (3)

Таким образом, в пределе быстрой модуляции кинетика броуновской частицы также описывается уравнением Смолуховского [аналогичным уравнению, относящемуся к случаю непрерывного лазера, т.е. остаётся

импульсным лазером.

Рис. 1. Потенциальная яма оптической «ловушки».

захваченной], но с потенциалом и(г), заменённым на средний и (г), который может быть легко определён. Можно сделать следующий вывод: для успешного оптического захвата броуновской частицы необходимо использовать импульсный лазер с высокой частотой повторения импульсов, чтобы за время между импульсами частица не успевала значительно сместиться из точки захвата. Воспользоваться формулой Стокса для определения коэффициента диффузии £> = (кТ) /(б7П]а), в которой Т] вязкость растворителя и а радиус частицы (предполагается, что частица имеет сферическую форму). Для невязкого растворителя, такого как вода при комнатной температуре, для а ~ Ю-4 с« эта формула даёт О ~ 10"9см2/с , для а«10"7си получаем Б ~ 10"бсм2/с. Условие быстрой модуляции £>г<к/* выполняется как в первом, так и во втором случае для лазера с частотой повторения импульсов порядка 1 МГц. Таким образом, оптический захват фемтосекундными импульсами возможен для широкого диапазона размеров объектов.

Отметим, что в рассмотренном пределе та»т усреднённая потенциальная яма намного мельче ямы и (г) \ и (г) ~ (тр / тл )ир (г)« ир (г). Также видно, что в рассмотренном пределе при равенстве мощности излучения непрерывного лазера и средней мощности импульсного лазера поведение броуновской частицы идентично.

Эффект движения потенциальной ямы

Кинетика движения броуновской частицы в потенциальной яме, которая перемещается в пространстве, также может быть описана с помощью уравнения, Смолуховского но с заменой потенциала и (г) на ¿7,(г,<) = £7(г-г,(0): Р = + где й,(г,1) = й(г-гр{1))1(кТ). В этом

случае процесс удобно анализировать в системе отсчёта, связанной с потенциальной ямой, т.е. в координате х = г-гр(0, в которых уравнение имеет вид: р = где

и

йх(х,0 = их(х,1)/(кТ) = ¿Г(х)+Г,(/)х

Сила ¥р0) = (кТ/О)чр(0 = ур(0//1, в которой ц = й/(кТ) -подвижность частицы, описывает эффект «трения».

действующего со стороны среды на Броуновскую

частицу. Потенциал йх(х,1) схематически изображён на рис. 2 как функция координаты х вдоль вектора \р.

Энергия иа может быть оценена как 11а

Г,(0 = Р,(/)/(*Г) = у,(/)/Д.(4)

Рис. 2. Вид потенциала при движении оптической «ловушки».

(кту1„ , т.о. потенциальная яма «разрушается» (частица «уходит» из ямы с большой скоростью), когда

иа"(кТ)/р1^иь, т.о. чр~фПЖ1кТ) = Киь10. (5) Формула (5) даёт зависимость максимальной скорости перемещения броуновской частицы с помощью фемтосекундного оптического захвата от характеристик частицы (подвижность, поляризуемость) и установки(значение глубины потенциальной ямы зависит от мощности лазерного излучения).

Проведём небольшую оценку: для невязкого растворителя, такого как вода и а => 10"* см, £) ~ 10"9см2/с (получено ранее).Тогда для [/¡/(кТ) =10 и /„, = Л ~ 8-10"5см мы получаем значение предельной скорости перемещения \р ~2 мкм/с. Таким образом, используя фемтосекундный оптический захват, можно манипулировать захваченным объектом. Следует отметить, что предельная скорость перемещения напрямую зависит от формы потенциальной ямы, которая, в свою очередь, зависит от параметров установки. Следовательно, полученная из формулы (5) скорость ур может использоваться как критерий эффективности фемтосекундного оптического захвата.

Голографический захват с использованием фемтосекундного излучения

Схема установки представлена на рис. 3. Основными элементами установки являются: фемтосекундный лазер Mai -Tai фирмы Newport\Spectra Physics (длительность 100 фс, частота повторения 80 МГц, спектральный диапазон 690-1000 нм), непрерывны Nd : YV04 лазера с удвоением гармоники Milenia фирмы NewportVSpectra Physics (длина волны 532 нм, средняя мощность 3.5 Вт), титан-сапфировый резонатор для генерации непрерывного излучения в ближнем ИК- диапазоне (750-850 нм) фирмы Avesta, инвертированный микроскоп OLYMPUS 1X71, пространственные оптические модуляторы (ПОМ) SLM Holoeye НЕО 1080Р (размером 15.36 х 8.64 мм2 и разрешением 1920 х 1080 пикселей) и SLM Brillian (размером 16.39 X 10.56 мм2 и разрешением 1920 х 1200 пикселей), платформа атомно-силовой зондовой микроскопии NTEGRA фирмы NT-MDT.

При помощи пары линз достигалась коллимация и растягивание диаметра фемтосекундного пучка до размеров первого ПОМ. Для непрерывного лазера также использовалась пара линз с целью коллимации и увеличения диаметра пучка до размеров второго ПОМ. Фемтосекундное и непрерывное лазерное излучение, отражённое каждое от своего ПОМ, совмещалось при помощи дихроичсекого зеркала. Далее, использовалась ещё одна пара линз и дихроическое зеркало для заведения фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения в объектив (Olympus ЮОх UPLSAPO с числовой апертурой 1.4 или Olympus 60х LUCPLFLN с числовой апертурой 0.7) инвертированного микроскопа. Кроме того, в установке используется призменный компрессор для чирпирования фемтосекундных импульсов, что

позволяет менять длительность действия оптической ловушки в предметной плоскости.

Флуоресценция образца собиралось этим же объективом, направлялось на ССО-камеру Апёога. Также в установке используется электромеханический затвор (ТИогкЬв 8Н05), позволяющий получать цуги фемтосекудных импульсов минимальной длительностью 10 мс. Измерение длительности оптических ловушек на предметном столике микроскопа осуществлялось при помощи автокоррелятора (Ауез1а). В работе использовалось разработанное нами программное обеспечение, позволяющее создавать и перемещать множество оптических ловушек в трехмерном пространстве, одновременно как для фемтосекундного, так и для непрерывного излучения. Установка оснащена дополнительным источником лазерного излучения — непрерывный диодный лазер с возможностью

контроля времени экспозиции, длина волны 1,48 мкм, мощность 500 мВт. Данный лазер используется нами для осуществления микрохирургического воздействия, в тех случаях, когда не требуется высокая степень локализации, а напротив, необходимо выполнить микрохирургию на участке в несколько микрометров.

Демонстрация возможности использования фемтосекундных импульсов света для одновременной манипуляции несколькими объектами показана на рис. 4 - 5. В наших экспериментах использовалась фемтосекундная голографическая установка. В первом эксперименте несколько оптических ловушек создавалось на пластинке, покрытой флуоресцентной краской (максимум поглощения близок к 400 нм). Двухфотонная флуоресценция возбуждалась фемтосекундными импульсами на длине волны 800 нм (длительность 100 фс, средняя мощность излучения 40 мВт). С помощью компьютера задавались траектории движения нескольких ловушек. Они перемещались одновременно и независимо друг от друга. Направления перемещений указаны стрелками. На рисунке представлены два кадра из видеозаписи эксперимента: первый и последний. В оптической схеме использовалось делительное зеркало, пропускающее видимое излучение, и не пропускающее в видеокамеру ИК-излучение

Рис. 4. Последовательность кадров из видеозаписи (пунктиром обозначены изначально заданные траектории).

Во втором эксперименте (рис. 5) использовались полимерные шарики диаметром 4,4 мкм. Была реализована манипуляция пятью шариками одновременно, причём каждый шарик перемещался независимо от остальных. Использовались фемтосекундные импульсы на длине волны 720 нм (длительность 100 фс, средняя мощность 80 мВт). Управление положением шариков осуществлялось в автоматическом режиме при помощи компьютера. На представленном рисунке приведена последовательность кадров из видеозаписи эксперимента. На первом кадре стрелками обозначены направления движения шариков.

Рис. 5. Управление полимерными шариками (пунктиром обозначены траектории частиц изначально заданные траектории движения частиц).

Лазерная энуклеация ооцита (яйцеклетки) мыши

Процедуру энуклеации (инактивации метафазной пластинки ооцита, содержащей генетический материал клетки) можно условно разбить на несколько этапов. Первый этап: нужно локализовать генный материал, который содержится в ооците. Было выполнено флуоресцентное окрашивание (Хёхст 33342, флуоресценция 460-490 нм) генного материала, после чего с использованием методики сканирующей двухфотонной микроскопии (длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, время экспозиции 30 мс, энергия импульса 0,13 нДж, размер области сканирования 40*40 мкм) была локализована область в ооците содержащая генный материал (рис. 6).

Рис. 6. Флуоресцентное изображение метафазной пластинки в яйцеклетке (ооците) мыши.

После локализации мы переходили ко второму этапу: энергия лазерного излучения увеличивалась, производилось облучение области,

содержащей генный материал, и одновременно регистрировался сигнал дфухфотонной флуоресценции. В нашей работе мы обнаружили два режима воздействия, зависящих от энергии фемтосекундных импульсов: первый режим реализовывался при высоких значениях энергии импульса и сопровождался видимым образованием микропузырьков кипения (или кавитационных пузырьков). Второй режим реализовывался при меньших значениях энергии импульса. В этом режиме не наблюдалось такого локального «вскипания» как в первом режиме, при этом мы наблюдали, что флуоресцирующая область уменьшалась от сканирования к сканированию. Зависимость значения площади флуоресцирующей области от номера сканирования, соответствующего времени облучения, приведена на рис. 7. В этом режиме энергия импульса составляла 0,33 нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция в точке 30 мс, область сканирования составляла 40*40 мкм.

номер сканирования

Рис. 7. Зависимость площади флуоресцирующей метафазной пластинки от номера последующего сканирования.

Такие различия между первым и вторым режимом воздействия мы интерпретируем следующим образом: в первом режиме происходит пороговое разрушение биоматериала с выделением тепла, во втором режиме происходит разрушение биоматериала, связанное с разрывом химических связей при многофотонном поглощении света практические без выделения тепла. Мы полагаем, что второй режим хоть и происходит медленнее, чем первый, однако он является перспективным для осуществления энуклеации, так как он связан с более «мягким» процессом разрушения генного материала. Эти данные в настоящее время являются предварительными, и мы планируем дополнительную работу для их проверки.

Микрохирургия при помощи диодного лазера

При помощи диодного источника лазерного излучения выполнены эксперименты по микрохирургическому воздействию на блестящую оболочку эмбриональных клеток, находящихся на различных стадиях развития. Найдены параметры воздействия необходимые для локального разрушения блестящей оболочки эмбриональных клеток. Дальнейшее инкубирование и контроль развития облучённых клеток показал, что такое воздействие не сказывается на жизнеспособности эмбрионов.

Выполнено микрохирургическое воздействие на блестящую оболочку двухклеточного эмбриона и его дальнейшее развитие. Длина волны лазера -1,48 мкм, мощность в предметной плоскости - 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс. Осуществлялось воздействие несколькими импульсами по 15 мс для получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера. При последующем инкубировании наблюдалось развитие эмбриона до стадии бластоцисты.

Рис. 8. Микрохирургия блестящей оболочки эмбриона мыши на стадии двух клеток, и выход эмбриона из под блестящей оболочки на стадии бластоцисты.

Аналогичные результаты получены для эмбрионов, находящихся на стадии восьми бластомеров.

Рис. 9. Микрохирургия блестящей оболочки эмбриона мыши на стадии восьми клеток, и выход эмбриона из под блестящей оболочки на стадии бластоцисты.

Технология получения химерных животных и «чистых линий» животных

В данной работе предлагается методами лазерной микрохирургии вносить модифицированный ген не в бластоцисту, а в любые стадии развития доимплантационного эмбриона на стадии 2 , 4 и 8 бластомеров. Отработанная методика неинвазивного слияния бластомеров внутри эмбриона позволяет создавать тетраплоидные, гексаплоидные и т.д. эмбрионы, в которые будут вводиться стволовые клетки. В полученных таким образом эмбрионах, полиплоидные бластомеры будут образовывать только вне эмбриональные ткани, а введенные диплоидные стволовые клетки — собственно сам эмбрион. Таким образом, могут быть получены в одной технологической операции чистые линии модельных животных.

Получение «чистой линии» из двухклеточного (двухбластомерного) эмбриона

Была выполнена серия экспериментов, демонстрирующих возможность получения «чистой линии» из двухклеточного эмбриона мыши и модифицированных стволовых клеток. Стволовые клетки содержали ген, кодирующий зелёный флуоресцирующий белок (ОБР). После проведения экспериментов по получению реконструированных эмбрионов и стадии культивирования, используя метод флуоресцентной микроскопии, проводился анализ распределения введённых клеток в бластоцисте.

Сам эксперимент по получению реконструированного эмбриона, который в дальнейшем может быть развит до генетически модифицированного животного, можно разделить на следующие этапы. Первый этап: при помощи фемтосекундного лазера (100 фс, 80 МГц частота повторения, длина волны 800 нм, энергия 1,5 нДж в импульсе, экспозиция 30 мс) выполняется слияние двух бластомеров эмбриона путём облучения участка естественного контакта (параметры лазерного излучения указаны выше). Второй этап: диодным лазером (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс) выполняется микрохирургия блестящей оболочки эмбриона в области максимально удалённой от бластомеров. Воздействие осуществляется несколькими импульсами по 15 мс до получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера (порядка 10-12 мкм). Третий этап: при помощи непрерывного лазера (длина волны 790 нм, мощность в предметной плоскости 10-15 мВт) выполняется оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их поочерёдное перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Все этапы этого эксперимента были отработаны отдельно, несколькими сериями экспериментов.

Рис. 10. Иллюстрация методики получения «чистой линии» животного: лазерное фемтосекундное слияние бластомеров эмбриона; микрохирургия непрерывным диодным лазером блестящей оболочки; оптический захват и перемещение модифицированных стволовых клеток под блестящую оболочку эмбриона.

Полученный реконструированный эмбрион содержит одну клетку с исходным генетическим материалом в двойном наборе, и модифицированные эмбриональные стволовые клетки, генетический материал которых и будет далее развит до стадии внутренней клеточной массы бластоцисты, а в после трансплантации, до организма. На рисунке ниже приведены фотографии каждого этапа эксперимента - фемтосекундное слияние бластомеров, микрохирургия блестящей оболочки эмбриона, оптический захват и перемещение модифицированных стволовых клеток.

На следующем рисунке представлен результат флуоресцентной микроскопии бластоцисты, которая была получена культивированием полученного ранее реконструированного эмбриона. Видно, что основной сигнал флуоресценции наблюдается от внутренней клеточной массы. Это свидетельствует о том, что внутренняя клеточная масса полученной бластоцисты образована введёнными модифицированными стволовыми клетками. Таким образом, если далее осуществить трансплантацию этой бластоцисты, то геном родившейся мыши будет соответствовать геному модифицированных стволовых клеток.

Рис. 11. Реконструированный эмбрион на стадии бластоцисты: флуоресцентное изображение; оптическое изображение в проходящем свете; совмещение первых двух изображений.

Практическая значимость предложенной технологии заключается в следующем. Во-первых, одновременное использование трех лазеров позволяет быстро и технологично вводить стволовые клетки с модифицированным геномом в эмбрион мыши на различных стадиях развития и с разной плоидностью бластомеров в один этап. Это даёт возможность сразу получать чистые линии с более высокой эффективностью, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер, с целью выведения чистых линий. Во-вторых, в практической медицине предлагаемая технология получения чистых линий генетически модифицированных мышей позволит получить оригинальные модели заболеваний, в том числе и модели социально значимых заболеваний. Создание моделей болезни позволит понять механизм возникновения и развития патологии, выявить роль различных генов в этом процессе. Такой подход принципиально важен для поиска и тестирования новых лекарственных препаратов.

Получение «химеры» из доимплантного эмбриона

Предложенная технология получения «чистых линий» также может быть использована для получения «химерных» организмов. Для этого выполняются аналогичные операции, с той разницей, что исходный эмбрион может быть взят на стадии более двух бластомеров(4-х клеточный,8-ми клеточный эмбрион и т.д.) Используя отработанные лазерные методики манипулирования, и подбирая нужную стадию развития эмбриона, можно варьировать отношение исходного и привнесённого генетического материала в конечной химере. Ниже приведён результат одного из экспериментов по получению химерной бластоцисты из эмбриона, находящегося на стадии морулы.

«р ЭДг.../.л:? с -

. , • ,, ■ . . - ....

Рис. 12. Иллюстрация методики получения «химерного» животного: микрохирургия непрерывным диодным лазером блестящей оболочки эмбриона на стадии морулы; оптический захват и перемещение модифицированных стволовых клеток под блестящую оболочку эмбриона.

Также можно выделить основные этапы эксперимента. Первый этап: диодным лазером (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс) выполняется микрохирургия блестящей оболочки эмбриона в области максимально удалённой от бластомеров. Воздействие осуществляется несколькими импульсами по 15 мс до получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера (порядка 1012 мкм). Второй этап: при помощи непрерывного лазера (длина волны 790 нм, мощность в предметной плоскости 10-15 мВт) выполняется оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Полученный эмбрион содержит клетки, содержащие как исходный генетический материал, так и клетки, содержащие модифицированный генетический материал. Дальнейшее инкубирование и трансплантация такого реконструированного эмбриона даст «химерный» организм. На следующем рисунке представлен результат флуоресцентной микроскопии бластоцисты, которая была получена культивированием полученного ранее реконструированного эмбриона. Видно, что сигнал флуоресценции равномерно распределён по всей бластоцисте. Это свидетельствует о том, что внесённые модифицированные стволовые клетки делились и встраивались как во внутреннюю клеточную массу, так и в

Рис. 13. Реконструированный эмбрион на стадии бластоцисты: флуоресцентное изображение; оптическое изображение в проходящем свете; совмещение первых двух изображений.

Неинвазивная лазерная методика терапевтического клонирования

Выполнены эксперименты по созданию реконструированного эмбриона с использованием только лазерного манипулирования (оптический захват, лазерная микрохирургия, лазерное слияние). Весь эксперимент условно можно разделить на стадии.

А) Лазерная инактивация генетического материала. На рис. 13 представлено начальное состояние ооцита и момент фемтосекундной лазерной инактивации (энергия импульса составляла 1 нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция 30 мс).

Рис. 14. Фемтосекундная инактивация генетического материала (метофазной пластинкии) ооцита мыши.

Б) Далее была проведена микрохирургия блестящей оболочки с помощью диодного лазера (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс).

Рис. 15. Микрохирургия блестящей оболочки ооцита непрерывным диодным лазером.

На рисунках представлено состояние блестящей оболочки после первой экспозиции 15 мс диодным лазером и конечное состояние после завершение операции.

В) Затем, выполнялся оптический захват соматической клетки (фибробласта) и приведение его в плотный контакт с мембраной ооцита. Оптический захват и дальнейшее перемещение соматической клетки выполнялось непрерывным лазером (длина волны 790 нм, средняя мощность в предметной плоскости составляла 20 мВт).

Рис. 16. Оптический захват и перемещение фибробласта до получения контакта с ооцитом при помощи непрерывного лазера.

Г) Далее было выполнено лазерное слияние мембран ооцита и соматической клетки при помощи фемтосекундного лазера (энергия импульса составляла 1

нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция 30 мс). На рис.17 представлены момент облучения фемтосекундым излучением и конечное состояние через минуту после облучения. Во время проведения процедуры слияния непрерывный лазер продолжал удерживать фибробласт, обеспечивая плотный контакт с ооцитом.

Рис. 17. Фемтосекундное лазерное слияние фибробласта и ооцита.

Д) Так выглядит конечное состояние после проведения всех этапов лазерного

Рис. 18. Реконструированный эмбрион.

Е) Через два часа после слияния соматической клетки и ооцита.

Рис. 19. Реконструированный эмбрион после двух часов культивирования в СОг инкубаторе.

Ж) Стадия

бластоцисти.

Рис. 20. Реконструированный эмбрион после 48 и 72 часов культивирования в СОг инкубаторе.

Внутренняя клеточная масса полученной бластоцисты - это эмбриональные стволовые клетки, обладающие геномом соматической клетки, ядро которой было помещено в ооцит методом слияния ооцита и соматической клетки. Таким образом, проведённый эксперимент показывает, что развитая методика оптического манипулирования, совмещённая с фемтосекундной микрохирургией, может успешно решить задачу неинвазивного терапевтического клонирования.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Разработана и изготовлена оригинальная экспериментальная установка голографического оптического манипулятора-скальпеля с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров формирующих множество оптических ловушек. Разработаны методы независимого управления каждой отдельной из множества оптических ловушек по заданной программе, что позволяет выполнять сложные операции с мезоскопическими биологическими объектами с использованием только лазерного излучения, без использования механических или иных микроманипуляторв.

2. Теоретически и экспериментально доказана возможность манипулирования мезообъектами при помощи фемтосекундного лазера с использованием методов голографической оптики.

3. На основе проведенных физико-химических исследований взаимодействия остро сфокусированного лазерного излучения с биоклетками разработаны оригинальные экспериментальные методики оптического манипулирования биологическими клетками (клетки крови, нейроны, скопление эпителиальных клеток и пр.), диссекции стенок и мембран эукориотических клеток (эмбриональные клетки, нейроны, нервные волокна, фибробласты) и прокариотических клеток (сине-зелёные бактерии АпаЬепа), неинвазивной инактивации ядра ДНК в эмбрионах без повреждения зоны пелюцида эмбриона.

4. На основе полученных результатов по оптическому манипулированию и фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработаны фундаментальные основы технологии получения генетически модифицированных животных (т.н. «чистые линии» животных) без использования механических манипуляторов, электрослияния и других инвазивных методы манипулирования клетками.

5. Впервые экспериментально продемонстрирована возможность выполнить процесс терапевтического клонирования (получение истинных эмбриональных клеток с заданным геномом), используя только неинвазивные лазерные методы манипулирования.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Занесений А.Д., Бучанов В.В., Державин В.А., Решетов И.В., Шушин А.И., Саркисов О.М., «Оптический лазерный манипулятор фемтосекундными импульсами», Труды МФТИ Том 1, №1, 53-58, 2009 г.

2) Buchanov V. V., Derzhavin V.A., Zalesskii A.D., Reshetov I. V., Sarkisov O.M., Shushin A.I., "Optical manipulators of microparticles using femtosecond laser radiation", Quantum Electronics 40(5), 446-450, 2010

3) Залесский А.Д., Данилъченко H.A., Максименко Ю.Б., Барбашов Ю.В., Западинский Б.И., Саркисов О.М., «Голографический фемтосекундный лазерный манипулятор», Приложение к журналу Физическое образование в вузах, Том 16, №1,2010 г.

4) Барбашов Ю.В., Залесский А.Д., Айбушев A.B., Саркисов О.М., Радциг М.А., Хмель И.А., Кокшарова O.A.,. Надточенко В.А., «Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 в присутствии наночастиц золота», Российские нанотехнологии, Том 6, № 9-10, 136-141,2011 г.

5) Барбашов Ю.В., Залесский А.Д., Березуцкая М.А., Максимов Г.В., Рубин А.Б., Саркисов О.М., Надточенко В.А., «Нелинейно-оптическое воздействие фемтосекундного лазерного излучения ближнего ИК диапазона на морфологию и структуру нервной клетки в поле оптической ловушки», Химическая физика, Том 31, № 6, 9-15, 2012 г.

6) Залесский АД., Саркисов О.М., «Оптический захват: реализация и применения оптического манипулирования микрообъектами», Труды 50-й научной конференции МФТИ, сборник тезисов, г. Москва -Долгопрудный, 2007 г.

7) Залесский А.Д., Бучанов В.В., Державин В.А., Решетов И.В., Шушин А.И., Саркисов О.М., «Фемтосекундный оптический лазерный «пинцет», Труды 51-й научной конференции МФТИ, сборник тезисов, г. Москва -Долгопрудный, 2008 г.

8) Залесский АД., Бучанов В.В., Державин В.А., Решетов И.В., Шушин А.И., Саркисов О.М., «Фемтосекундный оптический голографический «пинцет» в онкологии», Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», сборник тезисов, г. Москва, 2008 г.

9) Залесский АД., Данилъченко H.A., Максименко Ю.Б., Барбашов Ю.В., Шушин А.И., Державин В.И., Решетов В.И., Саркисов О.М., «Фемтосекундный лазерный манипулятор», 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых учёных, сборник тезисов, Том 1,г. Пущино, 2010 г.

10) Zalesskiy A.D., Danilchenko N.A., Maksimenko J.В., Barbashov Yu.V., Zapadinskiy B.I., Maksimov G.V., Sarkisov O.M., "Holographic femtosecond optical tweezers and scalpel", thesis ICONO/LAT V.l, Kazan, 2010

Подписано в печать 11.02.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1638. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

1. Введение.

2. Глава 1. Литературный обзор.

3. 1.1 Лазерный оптический «пинцет»

4. 1.1.1 Принцип действия оптического манипулятора.

5. 1.1.2 Обзор применений методики оптического «пинцета».

6. 1.1.3 Новые возможности оптического манипулирования -голографический оптический «пинцет».

7. 1.2 Фемтосекундный лазерный скальпель для биологических объектов

8. 1.2.1 Классификация механизмов воздействия лазерного излучения на биологические объекты

9. 1.2.2. Примеры экспериментального использования фемтосекундного лазерного скальпеля

10. 1.3 Возможность использования лазерных технологий в клеточной инженерии

11. Глава 2. Реализация экспериментальных методик: фемтосекундный «манипулятор-скальпель» и глографический «манипулятор-скальпель» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров.

12. 2.1 Экспериментальная установка фемтосекундного«манипулятора -скальпеля»

13. 2.2 Экспериментальная установка голографического «манипулятора-скальпеля» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров.

14. Глава 3. Теоретическое рассмотрение фемтосекундного оптического пинцета и голографического манипулятора.

15. 3.1 Оптический захват и манипулирование мезоскопической частицей фемтосекундным лазером

16. 3.1.1 Движения частицы в потенциальной яме под действием света.

17. 3.1.2 Эффект движения потенциальной ямы.

18. 3.2 Отражение фемтосекундного лазерного импульса от пространственного оптического модулятора.

19. 3.2.1 Метод вычислений

20. 3.2.2 Результаты вычислений

21. Глава 4. Экспериментальные результаты по оптическому манипулированию и лазерной микрохирургии.

22. 4.1 Микрохирургическое воздействие фемтосекундным «скальпелем»

23. 4.1.1 Воздействие на скопление раковых эпителиальных клеток.

24. 4.1.2 Эксперименты с единичным нейроном и нервным волокном.

25. 4.1.3 Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерии АпаЬаепа эр. РСС 7120 в присутствии наночастиц золота. усовершенствование традиционно используемого на сегодняшний день метода введения стволовых клеток с модифицированным геномом в эмбрионы мышей, при создании моделей социально значимых заболеваний. Для достижения поставленной цели необходимо решение нескольких задач, в том числе по созданию лазерного микроманипулятора с функциями лазерного скальпеля и пинцета; подбора оптимальных, необходимых параметров манипулятора; отработка технологии трансплантации эмбриональных стволовых клеток, в том числе в тетраплоидные и гексаплоидные эмбрионы. Применение лазерной микрохирургии, в том числе возможность получения тетраплоидных эмбрионов, позволит эффективно проводить операции по получению как модифицированных химерных мышей, так и с большой вероятностью, получение сразу чистых линии, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер.

В процессе выполнения диссертационной работы разработана и реализована не имеющая аналогов экспериментальная установка лазерного манипулирования микрообъектами, с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров. Таким образом, реализован новый метод оптического манипулирования, совмещающий возможности фемтосекундного лазерного скальпеля и «голографического оптического пинцета».

В данной работе выполнена разработка экспериментальных методов лазерной нанохирургии с использованием множества лазерных «скальпелей» и «пинцетов», сформированных методами динамической голографии, с использованием фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения с различными спектральными характеристиками. Методики, разработанные на основе полученных в ходе работы данных, имеют непосредственное прикладное значение в биологии, медицине и фармацевтике. Предложенная новая технология получения генетически модифицированных животных («чистые линии») находится на стадии патентования.

Получение индивидуальных эмбриональных стволовых клеток человека и на сегодняшний день является актуальнейшей задачей современной биомедицины. Одним из важнейших результатов работы является демонстрация возможности использовать разработанную методику лазерного манипулирования для проведения терапевтического клонирования, т.е. получения индивидуальных эмбриональных стволовых клеток.

Данная работа решает следующие задачи:

1. Исследовать возможность использования фемтосекундных лазерных импульсов для реализации оптического манипулирования мезоскопическими объектами и осуществления активного физико-химического воздействия на объект изучения.

2. Разработать и реализовать новую методику голографического оптического манипулирования мезоскопическими объектами с использованием фемтосекундных импульсов, исследовать возможности и ограничения новой методики.

3. Разработать фундаментальные основы технологии получения генетически модифицированных животных при помощи лазерного манипулятора с использованием принципов многофотонной фотохимии.

4. Разработать фундаментальные основы технологии терапевтического клонирования с использованием методов лазерного манипулирования мезоскопическими объектами.

Глава 1.

Литературный обзор.

1.1 Лазерный оптический «пинцет».

1.1.1. Принцип действия оптического манипулятора.

Оптический манипулятор основан на оптическом захвате объекта. Описание физики захвата зависит от отношения размера частицы и длины волны излучения, с помощью которого производится захват. Существует два предельных случая: 1) частица много меньше длины волны и 2) частица много больше длины волны.

В первом случае полагают, что частица в фокусе объектива под действием лазерного излучения становится однородно поляризованной, и далее её рассматривают как точечный диполь. На частицу подобного типа, в общем случае, действуют силы, обусловленные поглощением, рассеянием света (Рпогл. и Т^расс.), а также градиентом интенсивности излучения (-Рград.). Сила /Чрад пропорциональна поляризуемости: и всегда направлена вдоль градиента интенсивности к ограниченному дифракцией фокальному пятну. Эта сила может превосходить другие упомянутые силы С^погл- и Fpacc), что приводит к эффекту «ловушки»: частица попадает в потенциальную яму, которую в данном приближении можно описывать гармоническим потенциалом: и = ^к(^х-х0) ^, где к является характеристической константой захвата и центр ловушки.

Поведение прозрачных частиц, размеры которых много больше длины волны падающего излучения, может быть описано классическими теориями преломления и отражения. В качестве иллюстрации, рассмотрим прозрачный шарик, центр которого смещен относительно положения фокуса объектива (рис. 1.1). Два луча а и Ь испытывают преломление в шарике и отклоняются от начального направления распространения. Таким образом, шарик изменяет импульс фотонов, ассоциированных с лучами а и Ь. Как видно из рисунка, шарик «толкает» луч а вправо и вверх. Следовательно, отклоненные фотоны придают импульс шарику направленный в противоположном направлении, т.е. влево и вниз. Рассуждая аналогично, приходим к тому, что луч Ь «толкает» шарик влево и вверх. Это приводит к появлению действующих на шарик сил и которые дают результирующую силу направленную к оптической оси. Аналогично, возникают возвращающие силы при смещении шарика вверх и вниз. Таким образом, поле излучения создает силу, направленную к фокусу излучения. При достаточно сильном поле излучения, частице трудно изменить положение вблизи фокуса, и она оказывается в «ловушке». Следует отметить, что положение ловушки будет смещено относительно точки фокусировки силами, вызванными отражением света от поверхности шарика.

Рис. 1.1. Иллюстрация возникновения сил, толкающих шарик к точке фокуса. Пунктир - для конечного положения шарика, сплошные линии - для смещённого положения шарика.

В промежуточном режиме, когда длина волны сравнима с размерами частицы, необходимо прибегнуть к полной теории электромагнетизма и при этом учитывать, что амплитуда поля переменна вдоль частицы.

1.1.2. Обзор применений методики оптического «пинцета».

С момента появления метод «оптического захвата» прошёл путь развития от простых и недорогих в реализации установок до сложных и дорогостоящих систем[22]. В настоящее время существует большое разнообразие реализаций оптического манипулирования, которые отличаются числом оптических ловушек, модами лазерного излучения, образующего ловушку, различаются способы реализации управления ловушками и их позиционирования. Основные виды «оптических пицетов»:

• Оптические ловушки основанные на лазерах с излучением ТЕМоо

• Оптические ловушки основанные на альтернативных модах лазерного излучения(использование эрмит-гауссовых пучков (ТЕМпш), лагерр-гауссовых пучков (Ьв, ТЕМр1) и бесселевых пучков (7п))

• Многолучевые оптические ловушки (двойные, голографические пинцеты»)

• Оптические ловушки основанные на оптических волокнах

В силу свойств неинвазивности метод оптической ловушки нашёл широкое применение в биологических и биофизических исследованиях. Возможность прикладывать к мезоскопическим объектам силы порядка нескольких пиконьютонов и, при этом, отслеживать перемещения объекта исследования с точностью до субнанометров позволяет исследователям проводить изучения биологических важных процессов, таких как митоз, транскрипция, механические перемещение «биомоторов», таких как кинезин.

В качестве примера применения метода «оптического захвата» в биофизических исследованиях можно отметить следующие работы.

А).Исследование особенностей перемещения кинезина по микротубулиновой трубочке (исследование одиночных биомолекул)

Эта работа посвящена изучению особенностей работы «белка-мотора» кинезина[23]. Кинезин играет важную роль во внутри клеточных процессах транспортирования веществ, поэтому понимание механизма перемещения этого белка достаточно важно. Данная работа проводилась на одномолекулярном уровне, т.е. экспериментаторы исследовали единичные молекулы белка кинезина.

Кинезин имеет две головки при помощи которых передвигается по микротубулиновым трубочкам «шагами» по 8 нм. Было разработано два больших класса теорий, которые объясняли бы механизм его перемещения: «Ьапё-оуег-Ьапё» и «тс1шюгт». В моделях «Ьапс1-оуег-Ьап<1» головки меняются лидирующей и замыкающей ролью с каждым шагом, в то время как в моделях «тсЬлуогт» такого обмена нет - одна головка всегда лидирует. Измеряя «шагающее» движение этого энзима, авторы работы обнаружили, что некоторые молекулы кинезина (исследовалось несколько различных по происхождению молекул) проявляют выраженное различие во временах ожидания между следующими друг за другом шагами. Это приводит к «хромающей походке» моторов вдоль микротрубочки. «Прихрамывание» подразумевает, что эти молекулы кинезина четко чередуют своё состояние между двумя различными конформациями во время своего движения, указывая тем самым на ассиметричный «Ьапё-оуег-Ьапё» механизм перемещения.

Для проведения эксперимента молекула кинезина прикреплялась к полимерному шарику (диаметр 500 нм). Шарик служил маркером перемещения кинезина. Затем полимерный шарик захватывался оптической ловушкой и перемещался к поверхности покровного стекла. На покровное стекло были помещены (иммобилизированы) микротубулиновые трубочки.

Молекула кинезина своими головками связывалась с микротрубчкой, после чего экспериментаторы наблюдали перемещение шарика в оптической ловушке с пространственным разрешением порядка 1-2 нм (отдельные шаги кинезина чётко наблюдались).На рис. 1.2 приведены схематическое описание экспериментов и характерный вид зависимостиперемещения кинезинаот времени. optical trap bead » —>

-70„m^fkineSin 2 ■ii microtubule

1.0 1.5 Time (s)

Рис. 1.2 Исследование механизма перемещения кинезина методикой оптического «пинцета».

Б). Исследование молекулы ДНК.

Так же из ряда работ, посвященных исследованию свойств одиночных биомолекул хочу выделить работу по исследованию свойств молекулы ДНК.

В этой работе применены сразу несколько методов: оптический захват и одномолекулярная флуоресценция[24]. Целью работы было определить силу разрыва фрагмента нити ДНК, состоящего из 15 пар оснований. Разрыв происходил по оси молекулы ДНК, т.е. разрывались все 15 пар оснований. Схема эксперимента аналогична описанной в предыдущей работе: для отслеживания положения и прикладывания силы к молекуле ДНК (длинный фрагмент) химическим способом прикреплялся полимерный шарик (bead), после чего к предметному стеклу прикрепляли коротки фрагмент ДНК (рис. 1.3).

Optical trap

Long strand

Evanescent wave 5' excitation

3' 15-mer

Glass coverslip

4 6 8 10 12 Time (s)

Рис. 1.3. Исследование механических свойств молекулы ДНК при помощи методики оптического «пинцета».

Для установления момента разрыва короткого фрагмента с его 5' и 3' концами связывали флуоресцентные молекулы (метки), которые не флуоресцируют находясь на расстоянии в несколько нм (из-за образования димера). При разрыве метки расходились, разрушая тем самым димер, после чего наблюдалась одномолекулярная флуоресценция. На рис. 3 часть (а) схематически изображён ход эксперимента, на части (Ь) представлены полученные данные. Красная линия отображает прикладываемую к молекуле ДНК силу, синяя линия показывает уровень сигнала флуоресценции. Из приведённых данных видно, что после прохождения чуть более двух секунд эксперимента, когда сила достигает значения порядка 9 пН, происходит резкий обрыв значения силы до нуля и в то же самое время появляется ненулевой сигнал флуоресценции. Таким образом, разрыв 15 пар оснований молекулы ДНК был зафиксирован при прикладывании силы в 9 пН.

Похожие эксперименты проводились и в других исследованиях, где своё применение нашёл метод «оптической ловушки». При помощи данного метода наблюдалось обратное движение РНК-полимеразы в процессе транскрипции с пространственным разрешением порядка одной пары оснований[25].

Метод «оптического захвата» также успешно применяется для исследования процесса деления клетки - митоза[26].

В). Механические манипуляции «оптической ловушкой»

В приведённых выше работах «оптическая ловушка» использовалась как измерительный инструмент, однако, метод «оптического захвата» также находит применения в тех случаях, когда в эксперименте требуется неинвазивно переместить биообъект, клетку, органеллу и т.д[27]. В качестве примера такого плана можно отметить работу, в которой производилась сортировка сперматозоидов[28]. Сортировка проводилась по критерию подвижности.

Для решения этой задачи экспериментаторами была использована «кольцевая» оптическая ловушка. Лазерное излучение преобразовывалось при помощи «аксиона» с целью получения бесселева пучка, который фокусируется в трёхмерную кольцевую ловушку. Такой подход был выбран по ряду причин: 1)лазерное излучение сосредоточено не в фокальном пятне, а распределено по «кольцу» и таким образом не повреждает исследуемые клетки; 2) «кольцевая ловушка» позволяет работать сразу с несколькими клетками. На рис. 1.4 сперматозоиды расположенные по кольцу (область фокусировки лазерного излучения), вне кольца и внутри кольца. введении, голографический захват реализуется путём управляемого изменения фронта лазерного излучения. «Голографический оптический захват» позволяет:

1. создавать большое количество оптических «ловушек»;

2. независимо управлять каждой из «ловушек» в трёхмерном пространстве;

3. создавать любые трёхмерные распределения интенсивности излучения.

В качестве примера использования метода «голографического оптического захвата» можно отметить следующие работы.

А). Сортировка микрообъектов

Сортировку при помощи метода «оптического захвата» можно разделить на два вида: активную и пассивную сортировки. Пассивная сортировка заключается в создании какого либо постоянного разделяющего фактора. Это может быть кольцевая ловушка, набор ловушек, образующих сортировочную решётку и т.д., аналог «фильтра», который разделяет поток частиц по какому либо критерию. Активная сортировка - автоматический или полуавтоматический процесс, когда из потока микрообъектов выбираются нужные, после чего они механически удаляются из общего потока. Выше уже приводился пример сортировки клеток при помощи «оптической ловушки». Эта сортировка относится к пассивному виду. Следует отметить, что сортировка является весьма востребованной задачей, коммерческие установки по сортировке в настоящее время весьма дорогостоящи и сложны.

В настоящее время уже существуют работы по реализации как пассивной [29], так и активной сортировки при помощи «голографического оптического захвата»[30]. Создание пассивно сортирующего «фильтра» при помощи оптических ловушек сравнительно просто: на рис. 1.5 представлена полимерных шариков[31]. На рис. 1.6 представлены этапы эксперимента и его результаты. На первом этапе (а) при помощи методики голографического оптического захвата было захвачено достаточное число полимерных шариков для образования квазикристалла. Конфигурация шариков представляла собой проекцию трёхмерной структуры кристалла на плоскость.

Г'- - О со "

О * . .о

О'О^:' I . . • я«"'''- • • • • • • . ■ •( " ■ • "1 • .мй • . ' . ' . . ' . V .*. *.

• • • • • • # ~ С* ■ * - * ~ ^ - о о

С о О - О с ие о - о

О О в о О о ло СО » о о >,0 О • О о О О

О О ^ о О «О ;

О о О • о

Рис. 1.6. Создание квазикристалла при помощи голографического оптического «пинцета».

Второй этап состоял в перестройке плоской конфигурации в трёхмерную структуру кристалла(Ъ). На последней, третей стадии(с) постоянная решётки кристалла была уменьшена с целью создания более компактной структуры, после чего производилось облучение ультрафиолетом для запуска процесса полимеризации раствора, в котором находился полученный квазикристалл. характерны низкая плотность мощности и длительное время экспозиции, от нескольких секунд до нескольких минут.

-1-1-1-1— н о о к л н о о и н о

Фоторазрушение Фотоабляция

Плазмоиндуцирем ая абляция

Термическое воздействие

Фотохимическое воздействие

-12 10

Время экспозиции (сек.)

Рис. 1.9. Диаграмма взаимодействия лазерного излучения с биообъектами. Круги дают приблизительную оценку связи типа механизма взаимодействия и параметров

Фотоабляция — это один из методов разрушения вещества лазерным излучением. Под воздействием света высокой плотности мощности происходит выброс материала с поверхности. Для данного механизма взаимодействия требуется высокая плотность энергии, которая обычно достигается с помощью импульсного лазера. Локализация воздействия оказывается очень высокой, при этом наблюдаются лишь слабые тепловые эффекты, вызывая соответственно небольшой побочный ущерб. Самым распространенным приложением фотоабляции является рефракционная хирургия роговицы.

Два верхних механизма взаимодействия, изображенные на рис. 1.9, плазмо-индуцируемая абляция и фоторазрушение. Они оба приводят к оптическому пробою, что возможно только при очень высоком значении плотности мощности излучения, превышающей 10 Вт/см . Такие значения могут быть достигнуты с помощью импульсных лазеров сверхкороткой длительности. Различие между этими двумя типами взаимодействий заключается в том, что в первом случае, оптический пробой приводит к генерации плазмы и разрушению материала, а во втором случае плотность мощности выше и присутствуют дополнительные эффекты, такие как ударные волны, образование кавитационных пузырьков и формирования струи.

Процесс образования плазмы через лазерно-индуцированный пробой в прозрачных биологических средах схематически изображен на рис. 1.10.

Обратное тормозное поглощение

Кинет, энергия, необходимая для ударной

Энергия ионизации

Валентная зона

Фотоионизация

Ударная ионизация

Рис. 1.10. Схема образования плазмы при лазерно-индуцированном пробое в прозрачных средах.

По существу, процесс заключается в образовании квази-свободных электронов посредством фотоионизации и лавинной ионизации. Экспериментально показано, что порог оптического пробоя в воде и в биообъектах является величиной одного порядка [33].

В конеденсированных веществах электроны либо связанны с определенной молекулой, либо они «квази-свободны». В последнем случае они обладают достаточной кинетической энергией, для того чтобы преодолеть локальные взаимодействия с молекулами. Переходы между связанным и квази-свободным состоянием аналогичны ионизации молекул в газах. Для описания процесса пробоя в воде, Сакчи [34] предложил рассматривать воду как аморфный полупроводник, а энергию возбуждения А рассчитывать как энергию, необходимую для перехода с молекулярной 1В1 орбитали в зону проводимости (ширина запрещенной зоны 6,5 эВ) [35]. Для простоты, далее будут использоваться термины «свободные электроны» и «ионизация», как сокращения для «квази-свободные электроны» и «переход в зону проводимости». Нелинейное поглощение воды включает в себя не только ионизацию, но и диссоциацию молекул воды [35], но, зачастую, диссоциацией пренебрегают для упрощения численных расчетов.

Для длин волн 1064 нм, 800 нм, 532 нм и 355 нм энергии фотонов составляют 1.17 эВ, 1.56 эВ, 2.34 эВ и 3.51 эВ соответственно. Это означает, что энергия шести, пяти, трех и двух фотонов, соответственно, необходима для преодоления запрещенной зоны шириной 6,5 эВ. Энергия, необходимая для перехода в зону проводимости, может быть получена путем фотоионизации (многофотонной ионизации или туннелирования [36, 37]), либо путем ударной ионизации [38]. Для очень коротких лазерных импульсов характерны высокие значения напряжённости электрического поля, поэтому энергия запрещенной зоны должна быть заменена на эффективный потенциал ионизации. Это необходимо для учета энергии осцилляций электрона в электрическом поле лазера. Потенциал ионизации отдельных атомов в таком случае определяется формулой

А Л ±

А = АЧ--г

4т со (1) где со и Б - круговая частота и амплитуда электрического поля лазера, е-заряд электрона, 1 / т = 1/тс + 1/ту - приведенная масса экситона, которая определяется эффективными массами шс - квазисвободных электронов в зоне проводимости и шу - дыр в валентной зоне [36]. Вторым слагаемым в формуле (1) можно пренебречь при рассмотрении наносекундного оптического пробоя, в отличии от фемтосекундного оптического пробоя, где Б на несколько порядков больше. Многофотонная ионизация (МФИ) и туннелирование являются основными механизмами фотоионизации при облучении биообъектов сверхкороткими лазерными импульсами. В своей классической работе [36], Л. В. Келдыш ввел параметр у = со/юг, позволяющий различать 2 режима: туннелирование и МФИ. Здесь 1/ характеризует время туннелирования через атомный потенциальный барьер, которое обратно пропорционально напряжённости электрического поля. Для значений у « 1, получаемых при низких частотах и большой напряженности поля, за ионизацию отвечает туннелирование, а для значений у » 1, характерных для оптических частот и умеренной напряженности поля, вероятность МФИ гораздо выше, чем у туннелирования. Сфокусированные фемтосекундные импульсы света обладают очень высокими значениями напряженности поля, для которых характерно очень малое время туннелирования через потенциальный барьер атома, что приводит к значениям параметра Келдыша у < 1 даже для оптических частот. Для X = 800 нм, переход от многофотонной к туннельной ионизации происходит при напряженности поля порядка 100 - 200 МВ / см, что соответствует значениям плотности мощности в диапазоне 1.3 - 2.6 х 10 Вт/см [39]. Значения интенсивности для пробоя в случае 100 фс импульса в дистиллированной

1 л п

1,1 х ю" Вт/см для X = 580 нм [40]) близки к этому переходу. Таким образом, рассмотрение только многофотонной ионизации, не подходят для моделирования фемтосекундного пробоя, особенно при длительности импульса <100 фс.

Как только свободный электрон образуется в среде, он может поглощать фотоны в не резонансном процессе «обратного тормозного поглощения» в ходе столкновения с тяжелыми заряженными частицами ионами или атомными ядрами) [41]. Наличие третей частицы (иона или атома) является необходимым условием для выполнения законов сохранения энергии и импульса в процессе поглощения, так как они не могут одновременно выполняться, если взаимодействие происходит только между электроном и фотоном. Таким образом, при поглощении фотона происходит увеличение кинетической энергии электрона. После последовательности нескольких таких событий, кинетическая энергии достаточно велика, для того чтобы произвести еще один свободный электрон посредством ударной ионизации [38, 39]. Таким образом, образуется два свободных электронов с низкой кинетической энергией, которые могут получить энергию путем обратного поглощения тормозного излучения (рис. 18). Повторяющаяся последовательность актов обратного тормозного поглощения и ударной ионизации приводит к лавинообразному росту числа свободных электронов, если интенсивность излучения достаточно велика, чтобы преодолеть потери свободных электронов за счет диффузии из фокального объема и рекомбинации. Весь этот процесс носит название «лавинной ионизации» или «каскадной ионизации».

Несмотря на то, что ионизации в присутствии сильного внешнего поля происходит почти мгновенно, существуют временные ограничения на лавинную ионизацию, так как несколько последовательных событий обратного поглощения тормозного излучения необходимы для накопления свободным электроном критической энергии, необходимой для ударной ионизации. Для ширины запрещенной зоны 6,5 эВ в воде и параметре

Келдыша у = 2, эффективный потенциал ионизации А ~ 7.3 эВ, а средний прирост кинетической энергии, необходимый для ударной ионизации (3/2) А 10.95 эВ. При облучении на длине волны 800 нм (энергия фотона 1,55 эВ) электрону необходимо, по крайней мере, восемь событий обратного тормозного поглощения, прежде чем ударная ионизация сможет произойти.

Как упоминалось выше, обратное поглощение тормозного излучения можно происходят только при столкновениях электронов с тяжелыми частицами. В конденсированной среде, время между столкновениями составляет порядка 1,7 фс для расплавленного кварца [42]. Исходя из этого значения, минимальное время необходимое для удвоения числа свободных электронов в процессе лавинной ионизации составляет 13,6 фс, даже если каждое столкновение предполагает поглощение фотона. Детальный анализ временных ограничений при каскадной ионизации был представлен Кейзером [39] и Ретфелдом [43]. Они пришли к выводу, что лавинная ионизация играет лишь незначительную роль в фемтосекундном пробое по сравнению с многофотонными эффектами.

Для того, чтобы получить более глубокое понимание механизмов клеточной хирургии с применением фемтосекундных импульсов, необходимо рассматривать плазму ниже и чуть выше порога оптического пробоя. Очевидно, что точное разграничение в соответствующем диапазоне интенсивностей требует четкого определения порога пробоя. При применении нано-и пикосекундных импульсов, оптический пробой сопровождается образованием светящейся плазмы, за которым следует появление ударной волны и кавитации [44, 45]. При таких длительностях импульса, свечение плазмы обычно служит экспериментальным критерием пробоя [44]. При малых длительностях импульсов, свечение плазмы отсутствует в видимой области спектра, и в водной среде, как правило, пробой обнаруживают путем наблюдения образования кавитационных пузырьков [46, 47]. Напротив, в теоретических исследованиях порог пробоя определяется плотностью мощности излучения (или энергией), необходимой для образования некоторой критической концентрации свободных электронов в области фокусировки (фокальном «пятне»). Плотность электронов

2тсЧ РкР = ™ —Ге ,(3) используется как критерий пробоя [39, 48, 49]. Критическая плотность электронов ркр составляет 0.984 х 10 см" для X = 1064 нм, до 3.94 х Ю см" для X = 532 нм, а также 8.86 х 10 см" для 355 нм, соответственно. Значение плотности свободных электронов ркр =10 см' можно использовать как критерий пробоя при численном моделировании образования плазмы.

1.2.2. Примеры экспериментального использования фемтосекундного лазерного скальпеля.

Фемтосекундные лазеры широко применяются в биологических исследованиях, а в последнее время они начинают применяться и в медицине. Стоит отметить несколько работ, в которых особенности фемтосекундных лазерных импульсов особенно ярко проявились.

Большое число работ посвящено изучению воздействия фемтосекундного излучения на биологические объекты (ткани, клетки и др.)[50]. Я приведу примеры исследований, в которых такое воздействие уже непосредственно используется.

А).Разрушение единичной митохондрии в клетках НеЬа[51]

В этой работе использовался Титан - сапфировый осциллятор, частота повторения импульсов 76 МГц, длительность импульса 145 фс, длина волны излучения 800 нм. Целью работы заключалась в исследовании влияния удаления митохондрии при помощи лазера на жизнеспособность клетки. Были проведены серии экспериментов с различными значениями энергий импульса и длительностью облучения. Наблюдались два процесса: а) разрушение митохондрии (меньшие энергии и времена экспозиции); б) фрагментация митохондрии (большие энергии и времена экспозиции). Основой эксперимент: энергия импульса 0,39 нДж, время экспозиции 32 мс (2,4*106 импульсов). Результат одного из экспериментов представлен на рис. 1.11.

После облучения митохондрии, за клетками наблюдали в течение нескольких часов. На рис. 1.12 представлены фотографии через промежутки времени после облучения.

Наличие процесса деления клетки после удаления митохондрии, свидетельствует о том, что лазерная хирургия фемтосекундными импульсами не вызывает нарушения жизненно важных процессов в клетке.

Б).Изучение регенерации аксона после воздействия фемтосекундными лазерными импульсами[52].

Цель данной работы заключалась в исследовании процессво регенерации аксонов червя C.elegans после разрезания его участка.

В этой работе использовался лазер Ti-Sapphire (Spectra Physics, "Tsunami") вместе с усилителем Ti-Sapphire amplifier (Spectra Physics, "Spitfire"). Длина волны излучения 780 нм, частота повторения импульсов 1 кГц, длительность импульса после всей оптики в предметной плоскости по оценкам авторов 430 фс (компенсация не производилась, изначально, длительность импульсов была 220 фс). Пятно фокусировки лазера по оценкам авторов составляло 620 нм. В эксперименте аксон облучался 100 импульсами по 1,9 Дж/см (учитывая площадь фокусировки, 6 нДж в импульсе). На рис. 20 представлен результат одного из экспериментов.

Авторами предполагается, что в данном случае при облучении аксона возникала плазма низкой плотности, и аксон испытывал термический «стресс», что приводило к образованию временных нано-размерных «пузырьков». Это связано с тем, что термолизация плазмы происходила быстрее, чем акустическая релаксация[50]. клонированного) эмбриона. Все остальные так называемые «взрослые стволовые клетки», которые выделяют из органов взрослых особей или эмбрионов более поздних стадий, ограничены в своих возможностях дифференцировки и не обладают тотипотентностью свойственной ЭСК.

Первый реальный успех в клонировании эмбрионов млекопитающих был достигнут при применении метода электрослияния донорской клетки и энуклеированного ооцита [53]. Эта методика была использована для получения различных видов клонированных животных [54-56] Одновременно с этим были выявлены принципиальные недостатки этого метода - при электрослиянии применяют специальные диэлектрические среды с экстремально низкими концентрациями жизненно важных ионов, что может неблагоприятно влиять на последующее развитие эмбрионов [57] Если для клонирования применять метод электрослияния в обычных средах [58], то все равно происходят значительные изменения внутриклеточного ионного гомеостаза у реконструированных зародышей [59] вследствие электропробоя и вероятного формирования временных пор по всей поверхностной мембране, а не только в области контакта клеток [60, 61]. Как показывает накопленный опыт электрослияние приводит к значительному снижению жизнеспособности реконструированных эмбрионов.

Следующим шагом в плане совершенствования метода клонирования эмбрионов млекопитающих было использование пьезо-манипулятора для микроинъекции донорских клеточных ядер в энуклеированный ооцит [62, 63]. Предварительные сравнения методов электрослияния и микроинъекции ядра показали, что оба метода имеют примерно одну и ту же эффективность. [64-66]. Недавно было продемонстрировано, что пьезо-микроманипуляции могут вызывать в реконструированных эмбрионах повреждения ДНК, апоптоз. В результате происходит уменьшение количества клеток в бластоцисте и понижение ее жизнеспособности [67]. Одним из ключевых этапов клонирования является энуклеация - удаление или инактивация генома ооцитов или зигот с целью получения реципиентных цитопластов для последующего введения донорских ядер. Процесс энуклеации обычно осуществляется традиционным методом механического микрохирургического удаления хромосомной пластинки из ооцита. Несмотря на высокую степень лабильности эмбриональных клеток, такие приемы являются в серьезной степени травмирующими. Варианты механической энуклеации были использованы во многих работах. [62, 68, 69]. Относительно недавно стали также использовать химическую энуклеацию [70-72]. Кроме того, стандартные механические методы энуклеации предполагают обязательное использование цитохалазина. В для повышения пластичности клетки, который вызывает значительные изменения цитоскелета особенно воздействуя на актиновые филаменты [73, 74]. На сегодняшний день эффективность клонирования остается весьма низкой, в том числе из-за этапа энуклеации, поскольку механическое извлечение ядра неизбежно связано с уменьшением объема цитопласта и, вероятно, вследствие этого со снижением его репрограммирующей способности, а при химической энуклеации ооциты или зиготы подвергаются воздействию токсических веществ, что также может приводить к снижению их жизнеспособности.

Интенсивное развитие лазерных технологий и биофотонной инженерии способствовало широкому использованию этих методов в биологических исследованиях, в том числе в клеточной биологии. Возможность использования лазерных технологий в клеточной биологии и биологии развития принципиально была показана еще несколько десятилетий назад [9]. Интересно отметить, что одно из первых исследований по лазерной микрохирургии на отдельной клетке было проведено на ранних эмбрионах млекопитающих, предимплантационных эмбрионах кролика [9], но эта микрохирургия заключалась только в разрушении отдельных бластомеров. В настоящее время лазерные методы достаточно интенсивно используется в медицинских центрах по искусственному оплодотворению и трансплантации эмбрионов человека. Лазером перфорируют прозрачную оболочку ооцита: для уменьшения травматических последствий при введении микроиглой сперматозоида [12, 13] для облегчения вылупления эмбриона из прозрачной оболочки [14, 15], для минимизации травматизма при биопсии доимплантационных эмбрионов [16, 17]. Эта же операция, по лазерной перфорации блестящей оболочки ооцита, использовалась при трансплантации ядер [18] и получении химерных животных [19]. Недавно лазер был использован для выделения внутренней клеточной массы (ВМК) из бластоцист млекопитающих [20,21].

Глава 2. Реализация экспериментальных методик: фемтосекундный «манипулятор-скальпель» и глографический «манипулятор-скальпель» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров.

2.1. Экспериментальная установка фемтосекундного «манипулятора-скальпеля».

В рамках данной работы, для осуществления оптического захвата и выполнения микрохирургического воздействия, была создана экспериментальная установка, схема которой представлена на рис .2.1. Основу установки составляет инвертированный оптический микроскоп(01утриз 1X71), в который заводится фемтосекундное лазерное излучение.

Рис. 2.1. Схема установки: 1 - лазер;2 - линзы, расширяющие пучок; 3,4 -поляризатор, анализатор; 5 - дихроическое зеркало; 6 - объектив; 7 - предметный столик; 8 - освещение; 9 - спектрометр/счётчик фотонов; 10 - камера. пороговых значений мощности лазерного излучения при осуществлении микрохирургического воздействия (диссекция тканей и волокон, оптоперфорация клеток, лазерное слияние клеток).

2.2. Экспериментальная установка голографического «манипулятора-скальпеля» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров.

Схема установки представлена на рис. 1. Основными элементами установки являются: фемтосекундный лазер Mai -Tai фирмы Newport\Spectra Physics (длительность 100 фс, частота повторения 80 МГц, спектральный диапазон 690-1000 нм), непрерывны Nd : YVO4 лазера с удвоением гармоники Milenia фирмы Newport\Spectra Physics (длина волны 532 нм, средняя мощность 3.5 Вт), титан-сапфировый резонатор для генерации непрерывного излучения в ближнем ИК- диапазоне (750-850 нм) фирмы Avesta, инвертированный микроскоп OLYMPUS 1X71, пространственные оптические модуляторы (ПОМ) SLM Holoeye НЕО 1080Р (размером 15.36 х 8.64 мм2 и разрешением 1920 х 1080 пикселей) и SLM Brillian (размером

16.39 х 10.56 мм и разрешением 1920 х 1200 пикселей), платформа атомно-силовой зондовой микроскопии NTEGRA фирмы NT-MDT.

При помощи пары линз достигалась коллимация и растягивание диаметра фемтосекундного пучка до размеров первого ПОМ. Для непрерывного лазера также использовалась пара линз с целью коллимации и увеличения диаметра пучка до размеров второго ПОМ. Фемтосекундное и непрерывное лазерное излучение, отражённое каждое от своего ПОМ, совмещалось при помощи дихроичсекого зеркала. Далее, использовалась ещё одна пара линз и дихроическое зеркало для заведения фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения в объектив (Olympus ЮОх UPLSAPO с числовой апертурой 1.4 или Olympus 60х LUCPLFLN с числовой апертурой

0.7) инвертированного микроскопа. Кроме того, в установке используется призменный компрессор для чирпирования фемтосекундных импульсов, что

В этом случае, при перемещении одной ловушки и неподвижных остальных ловушках, перерасчёт нужно будет выполнять не для всей матрицы ПОМ, а только для участков, которые кодируют движущуюся ловушку. В качестве примера, рассмотрим случай когда нужно создать и управлять двумя ловушками. Матрица ПОМ разбивается на одинаковые участки и случайным образом каждый участок приписывается либо ловушке №1, либо ловушке №2, как показано на рис. 2.5.

Для повышения производительности, реализовано параллельное вычисление значений фазовых задержек для каждого элемента матрицы модулятора. Это достигается путём использования многопроцессорной видеокарты NVIDIA 9800GT с помощью технологии NVIDIA CUDA. Использование параллельных вычислений фазовых задержек позволяет осуществлять динамическое управление положением большого числа ловушек в трёхмерном пространстве в реальном времени и ограничивается только скоростью обновления матрицы модулятора (60 Гц). Разработанное программное обеспечение позволяет создавать произвольные трёхмерные независимые траектории движения ловушек. Реализовано синхронизированное управление двумя оптическими пространственными модуляторами с целью пространственного совмещения оптических ловушек, образованных непрерывным и фемтосекундным лазерным излучением.

Используемый в установке титан-сапфировый резонатор позволяет осуществлять голографическое оптическое манипулирование при помощи непрерывного лазерного излучения на длине волны 790 нм. Это обусловлено тем, что биологические объекты имеют «окно прозрачности» (минимальное поглощение) в области спектра 750-1000 нм. Таким образом, выбирая длину волны 790 нм можно существенно уменьшить (или совсем убрать) негативное воздействие сфокусированного непрерывного лазерного излучения на клетки, которые подвергаются манипулированию.

Установка оснащена дополнительным источником лазерного излучения — непрерывный диодный лазер с возможностью контроля

Потенциал и(г) обусловлен взаимодействием частицы с электрическим полем [см. формулу (1)]: и (г) —аЕ2{г)—аЩг), (2). который пропорционален квадрату электрического поля лазерного излучения Е(г) , т.е. мощности лазера 1¥(г)~Е2(г) и поляризуемости частицы а . Ширина и глубина Щ ямы определяются длиной волны лазера А, , мощностью излучения \¥, числовой апертуры фокусирующего объектива. Кинетика движения частицы описывается функцией распределения (ФР) р(г, 0 этой частицы, которая удовлетворяет уравнению Смолуховского р = Ог~2д/дг[г2(др/дг + рди/дг)], где и(г) = и(г)/(квТ).

Модуляция напряжённости электрического поля лазера Е(г,і) приводит к зависимости потенциала от времени. Пусть зависимость Е{і) имеет импульсный вид, Ер - амплитуда импульсов, г - их длительность, а та время между импульсами, причём га^>тр.

В пределе быстрой модуляции Е(г,і), когда за время «модуляции» тр + т( частица практически не смещается внутри ямы: где т = тр+т(1, поставленная задача существенно упрощается. В этом пределе кинетика частицы может быть описана с помощью ФР, усреднённой по некоторому периоду Те,который удовлетворяет неравенствам т Те II /I):

ФР р{ г, 0 подчиняется усреднённому уравнению Смолуховского р = + где її(г) = 0(г)/(кТ), в котором средний потенциал О (г) не зависит от времени и определяется потенциалом ир{г) ~ аЕ2р(г) ~ Жр(г):

Щг) = Т^№е>22ЛхЩг^) = тр(та + тру1ир(г). (3)

Таким образом, в пределе быстрой модуляции кинетика броуновской частицы также описывается уравнением Смолуховского (аналогичным уравнению, относящемуся к случаю непрерывного лазера, т.е. остаётся захваченной), но с потенциалом U(r), заменённым на средний Ü(г), который может быть легко определён. Можно сделать следующий вывод: для успешного оптического захвата броуновской частицы необходимо использовать импульсный лазер с высокой частотой повторения импульсов, чтобы за время между импульсами частица не успевала значительно сместиться из точки захвата. Воспользоваться формулой Стокса для определения коэффициента диффузии D = (kT)l(6nria), в которой г/ вязкость растворителя и а радиус частицы (предполагается, что частица имеет сферическую форму). Для невязкого растворителя, такого как вода и а « КГ'см эта формула даёт D ~ 10"9см2/с, для а »10см получаем D ~ 10"6см2/с при комнатной температуре. Условие быстрой модуляции Dt<z.12w выполняется как в первом, так и во втором случае для лазера с частотой повторения импульсов порядка 1 МГц. Таким образом, оптический захват фемтосекундными импульсами возможен для широкого диапазона размеров объектов.

Отметим, что в рассмотренном пределе td»тр усреднённая потенциальная яма намного мельче ямы Up(r): Ü(г)«(тр /rd)Up(г)Up(г).

Также видно, что в рассмотренном пределе при равенстве мощности излучения непрерывного лазера и средней мощности импульсного лазера поведение броуновской частицы идентично.

3.1.2. Эффект движения потенциальной ямы.

Кинетика движения броуновской частицы в потенциальной яме, которая перемещается в пространстве, также может быть описана с помощью уравнения, Смолуховского но с заменой потенциала D{r) на Ü,(r,t) = Ü(r-rp(t)): p = D4(Vp + pVüt), где ül(r,t) = Ü(r-rp(t))/(kT). В этом

8-10"5см мы получаем значение предельной скорости перемещения \р ~2 мкм/с. Таким образом, используя фемтосекундный оптический захват, можно манипулировать захваченным объектом. Следует отметить, что предельная скорость перемещения напрямую зависит от формы потенциальной ямы, которая, в свою очередь, зависит от параметров установки. Следовательно, полученная из формулы (5) скорость ур может использоваться как критерий эффективности фемтосекундного оптического захвата. Проведя эксперимент по определению максимально возможной скорости перемещения захваченной частицы, по формуле (5) можно будет определить глубину потенциальной «ямы», обусловленной взаимодействием лазера и частицы.

3.2. Отражение фемтосекундного лазерного импульса от пространственного оптического модулятора.

При реализации методики голографического управления фемтосекундным лазерным излучением необходимо было рассмотреть особенности отражения фемтосекундного импульса от пространственного оптического модулятора (ПОМ). Установлено, что существенной является проблема пространственного разделения спектральных компонент импульса за счёт дифракции. Длительность импульса в фокусе «оптического манипулятора» оказывается увеличенной, что снижает эффективность управления химическими реакциями в образце, ухудшает эффективность инициирования процессов, протекающих при многофотонном поглощении лазерного излучения. Были рассмотрены изменения формы огибающей и длительности импульса при его отражении от фазового ПОМ Но1оеуе НЕО

1080 Р. Предполагалось, что ПОМ работает в режиме линейной модуляции фазового фронта. Поскольку глубина фазовой модуляции ПОМ ограничена, неизбежно возникает дифракция импульса за счёт периодического скачкообразного изменения фазы волнового фронта вдоль поверхности

ПОМ. Проведена оценка критического угла отклонения импульса от оптической оси, при котором становится существенным изменение его длительности в фокусе.

3.2.1. Метод вычислений.

Пусть на ПОМ падает плоская линейно поляризованная волна под углом во по отношению к нормали поверхности ПОМ. Введём систему координат х ,у) на поверхности (рис. 3.3) и определим временной аргумент амплитуды светового колебания с учётом запаздывания по формуле

1Г = I — х з'тв0/ (1)

Обозначим через ер вектор поляризации и для электрического поля запишем выражение

Е (С, х) = ер Е(С, х). (2)

Воспользуемся методом медленно меняющихся амплитуд (ММА) и выделим огибающуюетового импул А^): Е(и х) = ^ +с.

Здесь со0 - центральная частота падающей волны. С помощью преобразования Фурье можем формально записать, считая огибающую А0(ґ) вещественной функцией,

Е (со, х) = йі Е{1, (4)

Л{(о) = ^ [Л0(о> - ш0) + А0(а> + о)0)].

При отражении от ПОМ фаза волны получает приращение в зависимости от напряжения, приложенного к данному элементу матрицы модулятора. Будем рассматривать далее только состояния ПОМ с линейным изменением приращения фазы вдоль координаты х. Поскольку доступная глубина фазовой модуляции ограничена, зависимость приращения фазы волны от координаты имеет пилообразную форму. По аналогии с фазовой дифракционной решёткой (эшелетом) будем называть штрихом полосу элементов матрицы ПОМ, на ширине которой пробегается весь доступный диапазон фазовой модуляции. Рассмотрим монохроматическую компаненту падающей волны, комплексная амплитуда которой даётся в точке х выражением (5). Комплексная амплитуда отражённой волны получается умножением на коэффициент максимальная оптическая длина хода волны в модуляторе, А - ширина штриха, й = к/й — угол наклона штрихов эквивалентной фазовой решётки (эшелета), соответствующий угол блеска равен д5 — — 2П, [дг/й] обозначает целую часть от х/й

Распределение поля дифрагированной волны зависит от соотношения между размером ПОМ Ь и расстоянием до точки наблюдения г . В случае пучка с ограниченным сечением требуется заменить размер ПОМ диаметром сечения лазерного импульса. Дальняя зона дифракции соответствует условию

В частности, это приближение описывает характеристики импульса в фокусе лазерного луча установки фемтосекундного «скальпеля». Запишем дифракционный интеграл Фраунгофера для угла отражения в:

Здесь К0 - несущественный нормировочный коэффициент, 2/і г »12/&0.

Рис. 4.12а показывает уровень градации оптической плотности изображения вдоль белой вертикальной линии на рис. 4.11 при последовательных экспозициях клетки. Глубина провала в кривой градации красного в области ПО растет практически линейно с увеличением экспозиции, как это видно из рис. 4.126. Распределение градации красного в области ПО хорошо аппроксимируется гауссовым профилем. Полуширина профиля оптической плотности ПО на рис. 76 составляет для первого шага 0.72 ±0.15 мкм, для второго шага 0.57 ± 0.05 мкм и для третьего - 0.65 ± 0.05 мкм. Эти величины близки к значению ~ 0.75 мкм гауссового пучка фемтосекундного лазера в предметной плоскости микроскопа. Увеличение времени экспозиции в режиме образования ПО приводит к увеличению глубины воздействия, практически не влияя на полуширину образующегося отверстия.

Рис. 4.12. На рисунке показаны: а) уровень градации оптической плотности изображения при последовательных экспозициях клетки, б) зависимость глубины повреждения от общего времени экспозиции

Параметры излучения Размер пузырька кипения (ПК)/перфорационного отверстия(ПО), мкм

Мощность, мВт Экспозиция, мс Нативный образец Образец с Аи

60 100 12(ПК) >11(ПК)

50 8(ПК)

25 6(ПК)

10 3(ПК)

30 100 1.5(ПО) 11 (ПК)

50 НПО) 7(ПК)

25 0.8(ПО) 5 (ПК)

10 без видимого повреждения 4(ПК)

15 100 без видимого повреждения 3(ПК)

50 НПО)

25 0.75(ПО)

10 0.7(ПО)

8 100 без видимого повреждения 0.7(ПО)

50 О.б(ПО)

25 без ВИДИМОГО повреждения

Таблица 4.1. В таблице приведены данные экспериментов

Таблица 4.1 суммирует результаты наблюдений образования ПК и ПО в клетках с золотыми наночастицами и без золотых наночастиц. Данные в таблице 1 приводятся на основании усреднения серии из 10 измерений. Наблюдения показали, что в случае клеток, содержащих золотые наночастицы, ПК и ПО наблюдаются при более низких энергиях импульса и при менее длительных экспозициях. Размеры ПО и ПК рассчитываются исходя из пространственной калибровки изображений, полученных с помощью оптического микроскопа. В силу дифракционных ограничений оптическая микроскопия не позволяет разрешить истинный размер повреждений (ПО). Размеры ПО, приведенные в таблице, получены из профилей градации красной компоненты изображений вдоль линии повреждений и являются аппроксимацией.

Основной экспериментальный результат состоит в том, что золотые наночастицы способствуют оптической перфорации стенки бактерии фемтосекундными импульсами и при этом достигаются субмикронные отверстия в стенке. Дополнительные представления о природе активации оптической перфорации золотыми наночастицами можно получить из анализа двух возможных механизмов - усиления оптического поля и локального теплового разогрева.

Отличие экспериментальных спектров и расчетных по теории Ми спектров на рис. 4.8, по-видимому, обусловлено двумя причинами: 1) отклонением реальных частиц от сферической формы; 2) образованием близко расположенных частиц (ансамблей) и смещением плазмонного резонанса. Взаимодействие близко расположенных диполей плазмонных наночастиц определяет появление новых мод плазменных колебаний и рост усиления поля в зазоре между наночастицами, как это показано на рис. 4.13, где представлены результат решения уравнений Максвелла методом конечных разностей во временной области (БТОТ). Для полуколичественного описания системы золотых наночастиц на стенке бактериальной клетки мы ограничимся теорией Ми.

Рис. 4.13. Отношение амплитуды локального поля к амплитуде падающего поля в зависимости от расстояния между наночастицами. Расчет представлен для двух длин волн падающего светового поля.

Рассеяние и поглощение кванта света золотыми наночастицами обусловлено плазмонным резонансом. Поглощения кванта приводит к релаксационным процессам в наночастице, которые в упрощенном виде сводят к двухтемпературной модели. Когерентные плазменные колебания 6б электронов зоны проводимости Аи с характерным временем жизни порядка десятков фемтосекунд термализуются с образованием высокой неравновесной температуры электронного газа. За счет электрон-фононного взаимодействия достигается термодинамическое равновесие электронов и решетки с характерным временем около 4 пс. Передача тепла от разогретой решетки в окружающую среду определяет наиболее длительные процессы релаксации Аи наночастицы и составляет от сотен пикосекунд до

123456789 расстояние (1, нм наносекунды. Приняв эту картину во внимание можно представить, что плазмон будет существовать приблизительно столько, сколько длится импульс возбуждения 120 фс. При жизни плазмона локальное поле ЕЬос возле поверхности наночастицы будет существенно отличаться от падающего поля Е1п по амплитуде и по ориентации вектора поля, а также будет существенно зависеть от частоты поля и от поляризации. Поле Еьос существенно зависит от расстояния до центра частицы и от полярной координаты на сфере вокруг частицы. В данной работе представляет интерес усредненное по сферической координате поле (<соз20>=1/3, <соб49>=1/5). На рис. 4.14 представлена зависимость параметра усиления поля <РЬос>=<|ЕЬос(со)| /|Е1П| > от поляризации, расстояния к центру сферы и от длины волны. Как видно из этого рисунка максимальное значение <РЬос> не сильно зависит от размера наночастицы. Однако, от размера наночастиц существенно зависит пространственная локализация поля, поле более сильно локализовано возле мелких наночастиц (рис. 4.14). Как видно из этого рисунка, фактор <РЬос> близок к 4 для лазерного излучения около 800 нм. Можно ожидать увеличения эффективности п-фотонного процесса взаимодействия света с веществом стенки клетки в <РЬос>п ~ 4П раз в ближнем поле наночастиц. Так как в реальной системе присутствуют ансамбли наночастиц, то следует принять во внимание, что фактор <РЬос> может достигать более высоких максимальных значений, чем предсказывает теория Ми. Это связано с тем, что плазмонный резонанс ансамбля золотых наночастиц сдвигается в сторону

800 нм, происходит дополнительное усиление поля в зазорах между близкими наночастицами (рис. 4.13).

Качественно рис. 4.146 демонстрирует, что можно ожидать существенного усиления нелинейно-оптического воздействия на материал клетки в близкой окрестности наночастиц золота: ~ 0.5 нм для с1=5 нм, ~2 нм для с1=15 нм и ~5 нм для <1=45 нм.

Рис. 4.14. Фактор усиления для длины волны 800 нм падающего поля Ei„. Окружающая среда - вода, а) Зависимость фактора усиления поля от удаления от наночастиц диаметром 15 нм. 1 <FLoc>. 2 <FLoc>||. 3 <FLoc>i .6) Зависимость <FLoc> от расстояния от центра сферической наночастицы диаметром 1-5 нм, 2-15 нм и 3-45 нм. в) Зависимость <FLoc> от длины волны для сферической наночастицы диаметром 1-5 нм, 2-15 нм и 3-45 нм.

Несмотря на небольшую энергию импульса 0.1 нДж (далее приводятся оценки температуры для этого значения энергии) из-за сильной фокусировки лазерного пучка w0=0.75 мкм, плотность энергии не является малой величиной и составляет 43 мДж/см , что соответствует плотности мощности

1.9 10 Вт/см . Для частиц диаметром 5 нм, 15 нм и 45 нм, приняв значения сечения поглощения Qabs= üabs/7ur , из расчета по теории Ми 0.0019, 0.0058 и 0.0194 соответственно, получим значения поглощенной одной наночастицей энергией q 1.610"17, 4.410"16 и 1.3 10"14 Дж. Чтобы оценить распределение температур в окрестности золотой наночастицы, можно упрощенно считать, что тепло выделяется равномерно со скоростью А = q/4 пс, где 4 пс -время электрон-решеточной релаксации. Воспользовавшись уравнениями теплопроводности, можно получить значения температуры внутри (1) и в окрестности (2) наночастицы.

К* \ ЗК sin у—у cos у) sin^

---dy у2 (с sin у — у соs у}2 +Ь2у2sin2у

R2ÄI Kj rK7 \ 3 К7 п

00 expv о J (sin у-у СО s у) (by sin у cos Н'у- (с sin у—у cos у) sin wy) с sin у-у cos у)2 +b2y2sin2y jj2 Ifc jf /JJ \ Ijj где а = —, b = -1, с = 1 -~f, w = {--1) M, КЬК2 - коэффициенты i Sj \j «i Kj vr / v «i температуропроводности, ki , k2 - теплопроводности золота и воды соответственно.

Распространение тепла после 4пс (выключение источника) определяется известными выражениями для Т(гД) функция теплового влияния

Температура золотых наночастиц 5нм, 15 нм и 45 нм к окончанию тепловыделения 4пс ниже, чем адиабатическая температура и составляет 30, 45 и 60 °С. Температура адиабатического разогрева будет 58, 59 и 66 °С соотв. На рис. 4.15 показано распределение температуры вокруг золотой наночастицы 15 нм для 4 моментов времени. Характерной чертой этого распределения является сильная локализация повышенной температуры в окрестности наночастицы. Так в момент времени 1 не, зона разогрева близкая к 10 °С локализуется в слое около 5 нм у поверхности наночастицы. При энергии накачки 0.75 нДж у поверхности золотых наночастиц в момент времени 1 не температура для 5 нм, 15нм и 45нм наночастиц достигает величин 15, 41 и 102 °С. При этом характер распределения повышенной температуры аналогичен приведённому на рис. 4.15. Это означает, что золотые наночастицы выступают не только концентраторами электромагнитной энергии в своей окрестности, но и концентраторами теплового поля. На этот эффект указывали ранее в работах по инактивации отдельных клеток. В данной работе мы обращаем внимание на то, что этот эффект может быть полезен в опытах с фемтосекундной оптоперфорацией. Разогрев до температур кипения воды и выше основных структурных

0(х,у,2,1£,л,С)[20]. элементов стенки клетки - слоев липидов, пептидогликанов, гликолипидов и т.п. может приводить к образованию отверстий. Тот факт, что диаметр ПО практически совпал с wo говорит о том, что золотые наночастицы приводят к локальному действию на стенку, как и предсказывают расчеты. Экспериментально разделить обсуждаемые два механизма пока не удается. При длительном воздействии цуга фемтосекундных импульсов возникает ПК с грубым разрывом стенки. Вероятно этот эффект связан преимущественно с тепловым механизмом. Такое воздействие с ПК также может найти практическое применение, например в задачах селективной инактивации бактериальных клеток. расстояние (см) хЮ"

Рис. 4.15. Температурный профиль вокруг наночастицы золота. Центр нанчастицы помещен в 0. Диаметр 15 нм, окружающая среда-вода. Одиночный фемтосекундный импульс возбуждения 0.19 нДж, 800 нм, С)аЬз=0.0058 (а =10"14 см2), плотность падающей энергии 43 мДж/см2, энергия поглощенная наночастицей 4.4 10"16 Дж. 0 - Температура при адиабатиеском разогреве наночастицы. 1 - Температурный профиль вокруг наночастицы к моменту времени 4 пс (характерное время электрон-решеточной релаксации). Температурный профиль вокруг наночастицы на момент времени:2 - 1 не; 3 -10 не; 4- 100 не. видимым образованием пузырьков кипения. Второй режим реализовывался при меньших значениях энергии импульса. В этом режиме не наблюдалось такого локального «вскипания» как в первом режиме, при этом мы наблюдали, что флуоресцирующая область уменьшалась от сканирования к сканированию. Зависимость значения площади флуоресцирующей области от номера сканирования, соответствующего времени облучения, приведена н рис. 4.17. В этом режиме энергия импульса составляла 0,33 нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция в точке 30 мс, область сканирования составляла 40*40 мкм.

Рис. 4.17. Зависимость площади флуоресцирующей метафазной пластинки от номера последующего сканирования.

Такие различия между первым и вторым режимом воздействия мы интерпретируем следующим образом: в первом режиме происходит пороговое разрушение биоматериала с выделением тепла, во втором режиме происходит разрушение биоматериала, связанное с разрывом химических связей при многофотонном поглощении света практические без выделения тепла. Мы полагаем, что второй режим хоть и происходит медленнее, чем первый, однако он является перспективным для осуществления энуклеации, так как он связан с более «мягким» процессом разрушения генного материала. Эти данные в настоящее время являются предварительными, и мы планируем дополнительную работу для их проверки.

4.1.5. Слияние бластомеров в двухклеточном эмбрионе фемтосекундным «скальпелем».

Выполнена серия экспериментов по слиянию клеток в двухклеточном эмбрионе мыши. Слияние выполнялось при помощи фемтосекундного «скальпеля», путём воздействия в область плотного контакта клеток. После воздействия, эмбрионы помещались в СО2 инкубатор для дальнейшего культивирования. Через 40-60 мин. Проводилась проверка результата слияния путём непосредственного наблюдения. При успешном проведении процедуры наблюдалось полное слияние клеток эмбриона и образование одной большой клетки. Проводились контрольные наблюдения за развитием эмбрионов после воздействия через 24, 48, 72 часа. Эмбрионы после слияния оказывались жизнеспособными, о чём свидетельствовало деление клеток. Эмбрионы проходили стадию двух, четырёх клеток и т.д. вплоть до стадии бластоцисты. В результате проведённых экспериментов были установлены параметры фемтосекундного излучения, необходимые для успешного выполнения процедуры слияния клеток эмбриона - длительность импулься 100 фс, частота повторения 80 МГц, длина волны излучения 800 нм, энергия импульса 1 нДж, длительность экспозиции 30 мс. В ходе экспериментов установлено, что успешное слияние клеток происходило в тех случаях, когда при воздействии образовывался кавитационный пузырь диаметром не менее 5 мкм, и при этом время спада размера пузыря составляло не менее секунды. На рис. 4.18 приведена последовательность кадров, полученных в ходе эксперимента по слиянию клеток двухклеточного эмбриона. На нём продемонстрирована характерная картина образования кавитационного пузыря при воздействии фемтосекундным «скальпелем», после чего происходило слияние клеток. развития патологии, выявить роль различных генов в этом процессе. Такой подход принципиально важен для поиска и тестирования новых лекарственных препаратов.

5.1.2. Получение «химеры» из доимплантного эмбриона.

Предложенная технология получения «чистых линий» также открывает обширные возможности для биологических исследований в области генетики. Теперь стало возможным получение химерных организмов, в которых экспериментатор может сам определять соотношение исходного и привнесённого генетического материала.

Выполняются аналогичные операции, с той разницей, что исходный эмбрион может быть взят на стадии более двух бластомеров(4-х клеточный,8-ми клеточный эмбрион и т.д.) Используя отработанные лазерные методики манипулирования, и подбирая нужную стадию развития эмбриона, можно варьировать отношение исходного и привнесённого генетического материала в конечной химере. Ниже приведён результат одного из экспериментов по получению химерной бластоцисты из эмбриона, находящегося на стадии морулы (рис. 5.5). Также можно выделить основные этапы эксперимента. Первый этап: диодным лазером (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс) выполняется микрохирургия блестящей оболочки эмбриона в области максимально удалённой от бластомеров. Воздействие осуществляется несколькими импульсами по 15 мс до получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера (порядка 10-12 мкм). Второй этап: при помощи непрерывного лазера (длина волны 790 нм, мощность в предметной плоскости 10-15 мВт) выполняется оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Полученный эмбрион использования механических манипуляторов, электрослияния и других инвазивных методы манипулирования клетками.

5. Впервые экспериментально продемонстрирована возможность выполнить процесс терапевтического клонирования (получение истинных эмбриональных клеток с заданным геномом), используя только неинвазивные лазерные методы манипулирования.