Новые подходы к хроматографической идентификации органических соединений природного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

□03060205

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

ЕЩЕНКО АННА ЮРЬСВНА

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ХРОМАТОГ РАФИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность 02 00 02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических на\ к

Санкт-Петербур!

2 4 МАЙ 2007

2007

003060205

Работа выполнена в Межрегиональном центре «Адаптоген» (СПб) и в лаборатории газовой хроматографии кафедры органической химии химического факультета Санкт-Петерб} ргского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Зенкевич Игорь Георгиевич

Официальные оппоненты

доктор технических наук Воронцов Александр Михайлович

кандидат химических наук Журкович Инна Константиновна

Ведущая организация

Институт физической химии и электрохимии им А Н Фрумкина, РАН, г Москва

Защита состоится З^сМа? 2007 г в 15 00 ч

на заседании диссертационного совета Д 212 232 "57 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном 5 ниверситете по адресу 199034 Санкг-Пегербург, Университетская наб д 7, Менделеевский центр, Большая химическая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им А М Горького Санкт-Петербургского государственного университета

А вгорефера г разослан аи^-е/сЯ .2007 г Ученый секретарь </1, У

Диссертационного совета ' ^ О /А Г Папсуева/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность проблемы

В практике современной аналитической ор1 ашпсской химии (разработка новых лекарственных препаратов, судебно-медицинская экспертиза, контроль качества продуктов питания, контроль содержания вредных причсссй в воде и воздухе и г д ) одной из основных задач является правильность идентификации различных органических соединений в многокомпонентных смесях Такие задачи часто приходится решать при отсутствии или ограниченных наборах доступных образцов сравнения

Анализ органических соединении природного происхождения можно проводить методами газовой (ГХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), капиллярного электрофореза, а также с применением наиболее информативных хромато-спсктральных (гибридных) методов

Гакой метод как ВЭЖХ в настоящее время является незаменимым в гначизе природных соединений Идентификация определяемых компонентов основана на применении хроматографических параметров, в том числе индексов удерживания в сочетании с дополнительными аналитическими критериями (V Ф-спектры, относительные оптические плотности при разных длинах волн, коэффициенты распределения в гетерофазных системах и т д ) Однако даже многообразие инструментальных методов и приемок идентификации не всегда оказывается эффективным для определения многих природных соединений, особенно в условиях отс)тствия образцов сравнения Следовательно, необходимость разработки новых алгоритмов идентификации, повышающих правильность интерпретации результатов хрома гографического анализа, остается актуальной

Цель работы разработка алгоритма хроматографической идентификации органических соединений, прежде всего природного происхождения в огс>-гствие образцов сравнения, основанного на корреляции и> параметров удерживания в разных режимах

В с внл1 с поставленной цепью необходимо было решить следующие задачи 1 Разработать алгоритм хроматографической идентификации одновременно нескольких известных соединений в многокомпонентных смесях в отсутствие их образцов сравнения Способ должен обеспечить возможность использования как литературных справочных данных (представленных в любой форме), так и экспериментальных данных, полученных в разных >словиях анализа

2 Ус тановить обтас ги применения такси о способа идентификации в ГХ и обращенно-фазовой

I

(ОФ) ВЭЖХ на модетьных смесях, справочных данных и реальных образцах при анализе природных соединений растительного происхождения

3 Выявить ограничения областей применения разработанного алгоритма идентификации в ОФ ВЭЖХ, связанные как с химической природой аналитов, так и с режим,ши хромаго графического разделения

4 Применить новый подход к идентификации энангиомеров некоторых природных флаван-3-олов и флаванонолоъ (на примере дигидрокверцетина и катехинов) и оптимизировать усчовия их разделения с использованием динамической хиральной модификации подвижной фазы

В работе использованы такие методы как высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография

Научная новизна

Выявтена линейная корреляция как абсолютных, так и относительных времен удерживания различных соединений в разных режимах хроматографического разделения На ее основе разработан алгоритм одновременной идентификации нескольких (трех и более) известных соединений в многокомпонентных смесях в отсутствие образцов сравнения, ориентированный на использование справочной информации, представ ленной как в числовой, так и в графической форме и применимый для обработки данных различных хромагографических методов

Впервые раздечсны энантиочеры таких природных флавоноидов как дигидрокверцетин и катехин в условиях динамической хиральной модификации подвижной фазы в ОФ ВЭЖХ с отнесением конфигураций их мо текут на основе предложенного алгоритма Выявлена зависимость селективности разделения энантаочеров дигидрокверцетина от температуры колонки

Рассматривается применение разработанного алгоритма для идентификации продуктов деструкции различных природных соединений, за счет ич окисления кислородом воздуха Практическая значимость работы

На нескольких примерах показано, что алгоритм одновременной идентификации известных веществ в состава многокомпонентных смесей эффективен при интерпретации результатов крочатографичеекм о анализа природных соединений

У станов тсно, чго возможности предлагаемого алгоритма не ограничиваются анализом толы о природных обьектов Этот способ может рассматриваться как один из общих приечоЕ хрочаТО1 рафической идентификация

Охарактеризованы обтает применения нового способа идентификации на модельных смесях и реальных природных объектах в ГХ и ОФ ВЭЖХ Выявлены ограничения испочьзования нового алгоритма идентификации в ОФ ВЭЖХ

Показано, что при разделении энангиомеров природных фчавоноидов в условиях динамической хиральной модификации подвижной фазы в ОФ ВЭЖХ понижение температуры колонки позволяет уменьшить концентрацию модификатора в элгоенте с одновременным повышением селективности разделения

С использованием разработанных подходов к идентификации выявтена нестабильность природных соединений группы витамина Е и флавонолов (на примере кверцетина) к окислению кислородом воздуха, что необходимо учитывать при производстве соответствующих препаратов, их хранении и анализе

Положения выносимые на защиту

1 Новый алгоритм хроматографической идентификации нескольких известных соединений в отсутствие их образцов сравнения методами ГХ и ВЭЖХ

2 Области применения и ограничения нового способа идентификации

3 Результаты оптимизации условий разделения энантиочеров дигидрокверцетина и катехинов в условиях хиральной модификации подвижной фазы методом ОФ ВЭЖХ с отнесением абсолютных конфигураций молекул

4 Зависимость сетективности разделения энантиочеров дигидрокверцетина от температуры хроматографической ко тонки

Публикации и апробация работы Материалы диссертации опубликованы в 7 статьях и 6 тезисах докладов Результаты исследовании докладывались на 1Г1 научной сессии УНЦХ СПбГУ (2004, Санкт-Петербург), IX Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» Фтофарм (2005, Санкт-Петербург), II Всероссийской конференции «Новые достижения ь химии и химической технологии растительного сырья» (2005, Барнаул), городском Семинаре «Современные проблемы органической химии» СПбГУ (2006, Санкт-Петербург), X Международном съезде «Актуальные проб темы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» Фитофарм (2006 Санкт-Петербург), 54Ul Annual congress on medicinal plant research (2006, Helsinki, Finland) Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 1лав с обсуждением

I

полученных результатов экспериментальной части, приложения, выводов и списка цитируемой литературы (106 наименований) Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 49 рисунков

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели работы Отмечена перспективность применения нового алгоритма хроматографической идентификации одновременно нескотыгах компонентов в образцах при отсутствии препаратов сравнения Обсуждаются аналитические задачи, связанные с разделением и идентификацией энантиомеров природных соединений и нестабильностью некоторых органических соединений природного происхождения в присутствии кислорода воздуха

Обзор литературных данных включает разделы, посвященные обсуждению различных способов идентификации органических соединений, применяемых в газовой хроматографии (ГХ) и ВЭЖХ использование хроматографических параметров удерживания, зависимостей параметров удерживания от физико-химических констант анализируемых соединений для целей их идентификации, дополнительных критериев идентификации органических соединений в ГХ и ВЭЖХ, а также некоторых способов идентификации органических соединений природного происхождения в ВЭЖХ ]

В Экспериментальной части дана общая характеристика объектов и методов исследования В главе Результаты и их обсуждение предметом рассмотрения является разработка и применение нового алгоритма хроматографической идентификации органических соединений различных классов в отсутствие образцов сравнения Разработанный алгоритм основан на сравнении экспериментальных параметров удерживания (абсолютных или относительных) нескольких известных соединений с литературными данными или параметров удерживания аналигов в разных условиях анализа между собой Теоретически обоснована линейная зависимость времен удерживания одних и тех же соединений в разных режимах хроматографического анализа

1. Известно, что влияние температуры колонки (1) на исправленные газохроматографические времена удерживания может быть описано уравнением Ангуана

'8 ^х=а)4 + ь О)

В изотермических режимах анализа температура является постоянной величиной, а тогарифмы абсолютных времен удерживания различных соединении тинейно зависят от значений

lgt'Rx-ax ^ + Ьяаук+к' (2)

Уравнение (2) справедливо и для логарифмов относительных времен удерживания, принимая «St = const

lgC" ~°=ал h/' (3)

Таким образом, функция, описывающая зависимость логарифмов относительных времен удерживания различных соединений в разных изотермических режимах анализа, линейна относи-течьно значений (яч), те аналогична зависимости логарифмов абсолютных времен удерживания Для изократических режимов элюирования в обращенно фазовой ВЭЖХ известна зависимость логарифмов параметров удерживания от концентрации органической фазы в элюенте (С), которая в режимах изократического элюирования является постоянной вечичиной

lg t'»r=a%C + h, (4)

Следовательно, дли корреляции значений tR' нескольких соединений в неодинаковых изотермических (ГХ) и изо1сратичсских (ВЭЖХ) \стозиях можно использовать простейшие линейные регрессионные уравнения

tR'(II) ~ a tR'(I) + Ъ (5)

2 В режимах линеиного программирования температуры в газовой хроматографии и градиентного элюирования в обращенно-фазовой ВЭЖХ можно выявить аналогичную свя!ь абсолютных и относительных времен удерживания различных соединений В ГХ вместо значения Т = const используют переменные значения эквивалентных температур удерживания Ts = То + rtR/2, представляющие собой средние арифметические значения начальных температур (То) и температур удерживания (TR = Т0 + rtR), где г - скорость нагрева хроматографической колонки

lg tiu' ~ ох / (То + i1r/2) + Ь (6)

В ВЭЖХ известно понятие средней концентрации удерживания Суд = Со +■ FtR/2, где F -скорость увеличения концентрации органического KOMiioHCirra в э посте в единицу времени lg W ~ ях х (Со + FtR/2) + Ь (7)

Таким образом, в режимах линейного программирования температуры (ГХ) и градиентного элюированкя (ВЭЖХ) регрессионные уравнения, связывающие значения ^ ити ^ „,„ в разных режимах, теоретически должны иметь не линейную, а линейно-лет арифмическую форму ~ а + 1К'(1) + с (8)

Однако экспериментальная проверка показывает, что за относительно редкими исключениями логарифмические вклады (б^а) в таких условиях настолько меньше линейных (а IV), что ими можно пренебречь и использовать линейные соотношения вида (5)

Выявленная корреляция может быть интерпретирована следующим образом Не пи число анализируемых компонентов в пробе больше или равно трем, то критериями одновременной идентификации всех такт компонентов могут служить высокие значения коэффициентов корреляции (г>0 99) наборов их параметров удерживания Это означает | подтверждение идентичности нескольких компонентов одновременно (не менее трех) в составе образцов сложного состава, практически не рассматривавшееся ранее в качестве самостоятельной аналитической задачи Ее решение представ тяется важным для совершенствования методов идентификации компонентов смссей в условиях недоступное ги препаратов сравнения

Следующий -пап работы представлчт собой проверку нового способа идентификации в газохроматографическом анализе на примере модельных смесей

Газохроматографический анализ восьми соединений проводили в разных изотермических режимах и режимах программирования температуры (табл 1 и 2)

Таблица! Корреляция абсолютных и относительных времен удерживания восьми соединений

Соединение Режим 1 (Т - 100 иС) Режим II (Т = 120 °С)

йь мин ^К ош мин

Бензонитрил 1061 0 37 8 29 0 54

Диэтилмалонат 13 58 0 48 9 39 061

транс -Декалин 14 69 0 52 10 20 0 67

2,4-Диэтилтол> от 19 69 0 69 12 10 0 79

Нафталин 22 65 0 80 13 71 0 90

Метилпеларг омг 28 35 1 00 15 27 ! 1 00

1 -Метилнафталин 40 29 1 42 20 79 1 36

Бифенил 57 08 2 01 27 04 1 77

Параметры линейной зависимости ^(П) - а 1к(1) + Ь для абсолютных времен удерживания

а - 2 46 + 0 04, <¡. = -101 0 7, р 0.999, = 0 74__________________

Параметры линейной зависимости 1р(Н) - а !:к(1) + Ь для относительных времен удерживания а - 0 75 ± 0 01, й = 0 27 + 0 01, р-0 999, 80 = 0.02________!_

Высокие значения коэффициентов корреляции дпя абсолютных и относительных времен удерживания (0 999) подтверждают теоретически установленный факт линейной корреляции времен удерживания одних и тех же соединений е разных режимах I азохроматографического анализа и, следовательно, являются критериями одновременной идентификации всех выбранных соединений

I аблица 2 Корреляция абсолютных и относительных времен удерживания восьми модельных

соединений в различных режимах линеиного программирования температуры

Соединение Режим I (Т0 = 40 "С, г = 4 град/мин, Рп = 1 0 атм) Режим II (То град/мин, Р = 60 "С, г = 2 о = 05 атм)

мин отн мин

Ьензонитрил 15 57 0 60 23 30 0 56

Диэтидчалонат 19 16 0 74 29 12 0 70

транс -Декалин 19 54 0 76 30 10 0 72

2,4-Диэтилтолуоп 22 72 0 88 35 71 0 86

Нафтатин 24 04 0 93 38 72 0 93

Мети чпеларго нат 25 80 1 00 41 50 1 00

1-Метилнафталин 28 81 1 12 47 39 1 14

Бифенил 31 33 1 21 52 21 1 26

Параметры линейной зависимости 1К(И) - а Ы!) + Ь для абсолютных времен удерживания а = 0 541 ± 0 007, & = 33±0 3, р = 0 999 , 80 = 0 2______________

Параметры линейной зависимости ^(И) = а 1К([) + Ь для относительных времен удерживания а = 0 86 ± 0 01, Ь = 0 13 + 0 01, р = 0 999 , 80 = 0 01_______________

Проверка нового алгоритма идентификации на примере сравнения справочных данных по параметрам удерживания примесей в промышленном трифторхлорметане (хладон 11) и в техническом дифтордихлорметане (хладон 12) в разных режимах анализа (режим I колонка (3 м х 3 мм) с 5 % полиэтплсилоксана ПЭС-В-1 (неполярная фаза) на силихагеле КСС-4 (0 25-0 5 мм), температура 115 °С, объемная скорость газа-носителя (гелий) 50 мл/мин, режим II колонка (5 м х 3 мм) с 20 % бг;с-2-цианэтилового эфира (полярная фаза) на силохроче С-120 (0 35-0 5 мм), температура 60 °С, объемная скорость газа-носителя (гелий) 60 мл/мин) приведена в табл 3

Таким образом, пересчет значении г,п| из одного режима в другой характеризуется средней точностью порядка Бо, т е ±018 Но главным выводом является то, что высокий коэффициент корреляции (0 9987) подтверждает правомерность отнесения четырех хроматографических пиков соответствующим фторхлорчетанам в двух сравниваемых режимах анализ.)

На следующем этапе работы бьпа проведена проверка нового алгоритма идентификации на примере реальных природных объектов в методе ОФ ВЭЖХ

I а блина 3 Корреляция относительных времен удерживания шести фторхлорметанов, измеренные в разных режимах (справочные данные)

Параметры линейной зависимости tR(II) - a tR(I) + Ь для относительных времен удерживания а = 0 49 ± 0 01, Ъ = 0 18 + 0 11, г = 0 9987, S„ = 0 18____I__

Для анализа были выбраны сухой экстракт Ьосвеллии Boswellia serrata, содержащий четыре босвеллиевые кислоты, масляный экстракт лимонника Schisandi a chinensis, содержащий не менее 13 соединений схизандринового ряда и природные масла, в которых основными компонентами являются токотриенолы и токоферолы (ípynria витамина Е) (табл 4)

Идентификацию четырех босвехлиевых кислот проводили с использованием данных единственного доступного литературного источника (http /Лиvw lalnnsa com/pi oducts-/btmvell new bidhtr,ñ (табл 5)

Таблица 5. Экспериментальные и литературные времена удерживания компонентов образца Boswellia setrata

Босвеллиевые кислоты ÍR,oth (эксперии ) ÍR,otw (справочн ) 1 ÍR, МИН (эксперим )

ß-Босвеллиевая 1 38±0 02 1 59 20 73±0 09

Ацетил-Р-босвеллиевая 1 90±0 01 2 33 28 45±0 08

11-Кето- ß-босвеллиевая 0 60±0 01 0 68 8 92±0 03

Ацетил-11-ксто-[5-босвеллисвая 1 0 1 0 15 01±0 08

Параметры линейной зависимости 1р ет(П) - а 1коп,(1) + Ь экспериментальных относительных времен удерживания от лигературны к данных |

я - 0 76 ± 0 06, Ь= 016±0.1, г = 0 993, 5р - 0 08._____

Параметры линейной зависимости 1|г.,гг„((1) - а 1|< т„(1) + Ь экспериментальных абсолютных времен удерживания от литературных относите тьных времен удерживания | а = 11.4 ± 1 0, й = 2 31 1 6, г = 0 992, 8р = 1.3________

Высокие значения коэффициентов корреляции (0 993, 0 992) подтверждают, что из всех зари истрированных сигналов четыре ожидаемых компонента правильно идентифицированы по временам удерживания Значительно позже идентификация четырех босвеллиевых кислот была подперждена с использованием образцов сравнения

Таблица 4 Структурные формулы природных соединений, идентифицированных с применением _нового алгоритма____

Соединение Структурная формула Тривиальное название

Босвеллиевые кислоты со,н (X = H, Y = CH2) - ß-босвеллиевая кислота, (X = Ас, Y = СН2) - ацетил-р-босветиевая кислота, (X = Н, Y = СО) - 11-кето-Р-босвеллиевая кислота, (X = Ас, Y = СО) - ацетил-11-кето-Р-босвеллигвая кис чота

Соединения схизандринового ряда Ilfj—^ R4 N-R3 R.O'^T^ OR5 (Ri = OH,R3=H R?,R4 Rs R« R7 Rg R« Rio= Me) -схизандрин, (R, ,R3 = H, R5 R6= CH2,R2 Л R7 R8 P 9 RIO = Me )- у-схизандрин

Токоферолы R R" (R - R' = R" = H) - токоч, (R = R' = R" = CH i) - а-токофероч, (R' = H, R = R" = CH3 ) - ß-токоферол, (R" = H, R = R' = CH3)- у-токофероч, (R = R" = H, R --- CH,) - S-токоферол

Токотриенолы R (R - R' = R" = CHi) - и-то,'отриенол, (R' = H, R = R" = CH3) - ß-токотриеноч, (R" = H, R = R' = CH3) - у-токотрисиоч, (R = R" - H, R = CH3) - д-токотриенол

Другим примером применения нового алгоритма является идентификация соединений

схизандринового ряда в масляном экстракте лимонника (табл б)

Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ анализе позволило получить УФ-спектры каждого компонента, которые являются дополнитетьныч критерием идентификации соединений данного класса (рис 1)

Рис 1 Хроматограмма масляного экстракта лимонника китайского (250 нм) (А) и типичный УФ-спектр соединений схизандринового ряда

Таблица 6 Экспериментальные абсолютные времена удерживания компонентов масляного экстракта лимонника и результаты иденгификации соединений схизандринового ряда по литературным данным

Экспериментальные данные

Литературные данные (Не X -G, and all 1997)

JN® пика tp(, мин № пика tR, мин Идентификация по литературным данным 1

1 7 12*

2 8 90

3 9 61

4 11 32 (l) 1 7 3(1) Схизандрин, изосхизандрин***

2-6** 8 1-10 2

5 15 30 (т) 7 10 8 (т) Схизантерин А

6 15 84 (т) 8 11 1 (т) Схизантерин В

9** 115

7 17 78 10 12 0 I омизин F, ангелоилгомизин Р или

тиглоилгомизин Р***

И** 12 2

В 18 49 (т) 12 12 9 (т) Дезоксисхизавдрин

9 19 92 (т) 13 13 5 (т) Не идентифицирован

10 20 75 (т) 14 13 9 (ш) Гочизин R™N*m

И 21 09(i) 15 14 2(1) 7-Схизандрин

12 22 66 (т) 16 15 0 Схизандрин С

13 28 48 (т) 17 18 9 (т) Не идентифицирован

Параметры линейной зависимости отнСП) = а 1^^,(1) + Ь экспериментальных абсолютных времен удерживания соединений схизандринового ряда от литературных абсолютных времен удерживания а = 1 53 ± 0 05, Ь = - 0 6 ± 0.7, г = 0 995, 80 = 0 5._|_

Примечания *) По /Ф-спектру компонент не относится к группе схизандринов, **) минорные компоненты не имеют аналогов среди компонентов анализируемого образца и не рассматриваются, ***) к данному пику относят несколько веществ, (i) и (т) - обозначения интенсивных и средних пиков, соответс гвенно

Таким образом, в результате применения нового алгоритма удалось использовать литературные данные для идентификации восьми из 13 компонентов анализируемого образца

Идентификацию токотриенолов (для токоферолов были доступны образцы сравнения) в растительных маслах гроводили несколькими способами с использованием логарифмов коэффициентов гидрофобности (log Р), что позволило получить лишь ориентировочные оценки параметров удерживания токотриенолов, и на основании линейной зависимости абсолютных и относительных времен vдepживaния, определенных в разных режимах анализа (табл 7) Анализ проводили на двух приборах Agilent, диодно-чатричное детектирование, колонка Cig (250 х 4,6

мм) (режим I) и Beckman, УФ-детектирование, котенка Cis (150 х4,6 мм) (режим II) в режиме изократического элюирования 100% метанолом

Использование нового алгоритма позволило одновременно идентифицировать шесть соединении группы витамина Е в отсутствие образцов сравнения

Высокие значения коэффициентов корреляции (0 998) зависимостей абсолютных и относительных параметров удерживания, потученных в разных условиях анализа, являются критериями одновременной идентификации токотриенолов и токоферолов

Таблица 7 Абсолютные и относительные времена удерживания токотриенолов и токоферолов, _ определенные в разных режимах анализа___

Соединение (I) (И)

1окотриенолы 1 окоферолы Токотриенолы Токоферолы

tR tRoTH tR tRoni tR tRoni tR ^ROTH

5- 5 53± 0 09 0 52± 0 01 8 01± 0 08 0 75± 0 02 3 80± 0 07 0 46± 0 01 6 10± 0 08 0 73± 0 02

Y- 6 2± 0 1 0 58± 0 02 9 2± 0 1 0 86± 0 03 4 60± 0 09 0 55± 0 02 7 20± 0 07 0 87± 0 01

а- 6 95± 0 09 0 65± 0 02 10 7± 0 1 1 0 5 1± 0 1 0 61± 0 03 8 3± 0 1 1 0

Параметры линеиной зависимости tR (И) = a t'R (1) + h абсолютных времен удерживания токотриенолов и токоферолов в режимах (I) и (II)

я = 087±0.03,¿ = -09±0 2, г = 0998, 5', = 0,11.____

Параметры линейной зависимости (II) - а ^ (I) + Ь относительных времен удерживания токотриенолов и токоферолов в режимах (I) и (II)

а = 1 13 ± 0,03, Ь = -0 1 ± 0,2, г = 0,998, 5„ = 0,01__

При установлении структур продуктов окисления кверцетина кислородом воздуха в умеренно-щелочных (рН~8-10) водно-спиртовьгх растворах методом ГХ-МС были идентифицированы два компонента (флороглюцин и 3,4-дм вдроксибеюойная кислота) Для идентификации третьего основного компонента были рассмотрены линейные зависимое га экспериментальных абсолютных времен удерживания от справочных значений индексов удерживания ТМС-производных В результате этого он был идентифицирован как 2,4,6-тригидроксибензойная кислота Критерием выбора именно этого варианта отнесения явилось высокое значение коэффициента корреляции (г = 0 999) Иные варианты взаимного соотнесения пиков приводят к меньшим значениям коэффициентов корреляции (табл 8)

Таким образом, применение нового способа позволило и в этом случае идентифицировать продукт окислительной деструкции кверцетина

Таблица 8 Идентификация продуктов окисления кверцетина методом ГХ-МС и справочные

значения индексов удерживания идентифицированных компонентов

Абсолютное время удерживания, мин Масс-спектрометрическая идентификация Справочные значения индексов удерживания

25 48 (А) Флоропоцин, трис-ТМС 1656

27 71 Этил-3,4-дигвдроксибеюоат, бис-ТМС

28 25 (Б) 3,4-Дигидроксибензойная кислота, трис-ТМС 1830

30 72 (В) 2,3,4-Тригидроксибензойная кислота, тетракис -ТМС 1932(2,3,4-изомер) 2003(2,4,6-изомер)

32 34 Неидентифицирован [

Параметры регрессионного уравнения tR (II) = a t'R (I) + h для 2,4,6-изомера равны л = 0.0151 ±0 0005, 05 + 09; г = 0999,S0 = 0 12

Параметры регрессионного уравнения tR (II) = a t'R (l) + Ь для 2,3,4-изомера равны д = 2 62 ± 0.20, Ь= 230 + 04, г = 0 997, S0 = 0.29__

Следующий этап работы - установление ограничений применения нового алгоритма идентификации

Первое ограничение рассматриваемого подхода связано с невозможностью сопоставления данных, полученных в изотермических режимах, с данными для различных условий программирования температуры (ГХ), равно как и корреляции параметров удерживания в изократических и градиентных режимах в ОФ ВЭЖХ 1

Второе ограничение связано с изменением порядка выхода компонентов из хроматографической колонки в зависимости от содержания полярной неподвижной жидкой фазы на полярном сорбенте (выявлены минимумы индексов удерживания в диапазоне содержания неподвижной фазы от 5 до 10%) в ГХ и изменением порядка элюирования соединений разных классов при изменении концентрации органического компонента подвижной фазы в ВЭЖХ С учетом указанных фактов рассматриваемый метод идентификации рекомендовано применять к соединениям одной и той же химической природы, что и соблюдается в настоящей работе

Одним из примеров использования нового подхода для идентификации соединений, порядок элюирования которых не изменяется при изменении состава подвижной фазы, является разделение

энантиомеров различных органических соединений В следующем разделе работы рассматривается

I

оптимизация условии разделения энантиомеров дигидрокверцетина и катехина с использованием динамической хиральной модификации подвижной фазы Р-циклодекстриноч и отнесениеи конфигураций их молекул

Изомеры дигидрокверцетина Изомеры катехина

(+)-2Ьи11-транс (-)-28,38-транс (-)-2Я,38-цис (+)-28,ЗЯ-цис лг сх Катехин (-)-28,311-транс (+)-211,38-транс он Т он ^ т>н Эпикатехин (-)-2Я,ЗК-цис (+)-28,38-цис

На рис 2 представлены хрочатограммы энантиомеров дигидрокверцстина [(+)-2К,3[1-транс и (-)-28,38-транс] в условиях изократического (А) и градиентного элюирования (Б) и двух пар энангиочеров катехина в условиях изократического элюирования (В) с содержанием 15 мМ/л р-

циклодекслрина в элюенте

А Б В

Рис 2. (А) Хрочатограчма дигидрокверцстина в режиме изократического элюирования Пики с временами удерживания 15,7 мин (-)-(28,38) и 17,0 мин - (+)-(2К,ЗЯ) энантиомеры дигидрокверцстина

(Б) Хроматограмча дигидрокверцетина в режиме градиентного элюирования Пики, с временам удерживания 14,6 и 15,1 мин - энантиомеры дигидрокверцетина, пики с временами удерживания - 17,2 - (-)-(28,38) энантиочер и 17,6 мин - (+)—(2К,ЗР^) энантиочер дигидрокемпферола

(В) Хроматограмма смеси (+)-катс\ина и (-)-эпикатехина в условиях изократического элюирования Пики с временами 1,7, 2,4 мин - (+)-катехин (211,38) и (-)-кагехин (28,ЗЫ) соответственно Пик с временем удерживания 7,2 мин соответствует (-)-эпикатехину (2Я,311), пик со временем удерживания 9,3 мин - (+)-эпикатехину (28,ЗЭ)

Для оптимизации условий была рассмотрена зависимость селективности разделения

энантиочеров дигидрокверцетина от температуры колонки

При

температурах

хроматографической колонки выше комнатной (30, 40, 45 С) разделения энантиочеров не наблюдалось При понижении температуры колонки до 0 °С селективность разделения выше, чем при комнатной температуре При этом уветичивается вязкость элюенга, в связи с чем наблюдается некоторое снижение эффективности разде тения по сравнению с анализом при комнатной температуре, что иллюстрируют хроматограммы рис 2А и рис ЗБ Однако анализ при 0 °С можно проводить с уменьшением концентрации р-циклодекстрина до 10 мМ/л (рис 3)

-Л__I

Рис. 3 Разделение энантиомеров дигидрокверцетина в условиях изократического элюирования при комнатной температуре (А) и при охлаждении хроматографической колонки до 0 °С (Б) при концентрации Р-циклодекстрина 10 мМУл

Зависимость селективности разделения энантиомеров дигидрокверцетина от температуры колонки приведена в таблице 9

В табтице 10 сопоставлены значения коэффициентов разделения энантиочеров дигидрокверцетина, катехинов и дигидрокемпферола в разных режимах анализа

Таблица 9 Значения коэффициентов селективности разделения энантиомеров дигидрокверцетина (а при разных концентрациях хиральной добавки в элюенте и температуре

хроматографической колонки

Температура, °С Концентрация fJ-ЦД, мМ/л Коэффициент селективности разделения

0 10 1,21

22 10 1 (нет разделения)

22 15 1,09

30, 40,45 15 1 (нет разделения)

Параметры линейной зависимости /па = а (1000 /Т) + Ь а = 1,72 ± 0,18, Ь = -5,69 ±0,63, г = 0,994; 8о = 0,048

Таблица 10 Сетеетивность разделения энантиомеров флавоноидов в разных условиях анализа при _комнатной температуре____

Соединение Режим элюирования а

(±) Эпикатехин Изократический 1,37

(±) Катехин Изократический 1,41

(±) Дигидрокверцетин Изократическии 1,09

(±) Дигидрокверцетин Градиентный 1,04

(±) Дигидрокемпферол Градиентный 1,02

(±) Дигидрокверцетин (0 иС) Изократический 1,21

В последнем разделе диссертации обсу ждается проблема определения некоторых природных соединений, легко окисляемых кислородом воздуха На примере быстрого окисления гокотриенолов и токоферолов (группа витамина Ь) в природных маслач. и фтавоноида кверцетина, которые являются биологически активными соединения и применяются в качестве основы для мчогич лекарственных препаратов, было установлено, что для сохранения активности этих соединений в природном сырье необходимо соблюдение условий технологии производства и хранения препаратов, а также оптимальных условии подготовки проб

ВЫВОДЫ

1 Разработан алгоритм хроматографической идентификации одновременно нескольких известных соединении в многокомпонентных смесях при отсутствии их образцов сравнения, основанный на корреляции как абсолютных, так и относительных времен удерживания аналитов в разных режимах анализа Критерием одновременной идентификации нескольких соединений являются высокие значения коэффициентов корреляции параметров удерживания (г > 0 99)

Показано, что предложенный алгоритм применим как в газовой хроматографии, так и в обращенно-фазовой ВЭЖХ Это доказывает его универсальный характер и позволяет эффективно использовать справочные данные по параметрам удерживания, представленные в любой форме Установлены ограничения нового способа идентификации, связанные с изменением порядка элюирования органических соединений разных классов при разном содержании полярной неподвижной жидкой фазы на полярном сорбенте в ГХ и в неодинаковых режимах изократического и градиентного элюирования в ОФ ВЭЖХ Для разделения энантиомеров дигидрокверцетина, дигидрокечпферола и катехинов подобраны оптимальные условия с использованием динамической хиральной модификации элюента Р-ци клодс кстр и но м в обращенно-фазовой ВЭЖХ Показана зависимость селективности разделения энантиомеров дигидрокверцетина от температуры колонки и установлено, что проведение анализа при О °С позволяет существенно уменьшить концентрацию хирального модификатора в составе элюента при повышении селективности их разделения С использованием предложенного алгоритма идентифицированы ключевые компоненты в составе экстрактивных веществ различных растений при отсутствии их образцов сравнения, в том числе

- четыре босвеллиевые кислоты 11-кето-Р-босвеллиевая, ацетил-11-кето-Р-босведлиевая, р-босвеллиевая и ацетил-Р-босвеллиевая в составе сухих экстрактов Bomelha set rata,

- восемь соединений схизандринового ряда в масляном экстракте лимонника Schisandia chtnermi,

- продукты окислительной деструкции кверцетина кислородом воздуха флороглюцин, 3,4-дигидроксибензойная и 2,4,6-тригидроксибензойная кислоты, и предположительно 4,6-дигидрокси-2-(3,4-дигидроксибензоилокси) бензойная кислота (депсид)

Показано, что повышение надежности идентификации как ключевой стадии анализа позволяет эффективно решить ряд важных задач химии природных соединений, в том числе

- установлено, что несоблюдение условий хранения растительных масел приводит к резкому уменьшению содержания в них соединений группы витамина Е (токотриенолов и токоферолов) за счет их окисления,

- на примере кверцетина, установлено, что природные фтавоноты нестабильны в растворах в условиях контакта с кислородом воздуха в умеренно-щелочных средах при комнатной температуре, что необходимо учитывать при изучении их метаболизма и разработке промышленных методов выделения

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1 Ещенко, А Ю Характеристика межлабораторной воспроизводимости результатов

количественного газохроматографического анализа методом внутренней нормализации

[Текст] /ИГ Зенкевич, А Ю Ещенко, И О Климова // Ж аналит химии - 2005 - Т 60 №2 - С 137-143

2 Ьщенко, А Ю Новый подход к интерпретации «аномальных» свойств полярных сорбентов, модифицированных полярными жидкими фазами [Текст] /ИГ Зенкевич, И В Ьычинская, А Ю Ещенко // Сорбционные и хроматогр процессы - 2005 - Т 5 - Вып 2 -С 225-241

3 Ещенко, А Ю. Определение токоферолов и токотриенолов в растительных маслах и некоторые особенности их состава [ Гекст] / А Ю Ещенко, И Г Зенкевич // Вестник СПб ун-та Сер 4, Физика Химия -2006 - Вып 4 - С 68-75

4 Ьщенко, А Ю Особенности стерсоизомерного состава и некоторые физико-химические свойства природного дигидрокверцетина [Текст] /ИГ Зенкевич, В Г Макаров, А Ю Ещенко // Растит ресурсы - 2006 -Т 42 - Вып 3 - С 81 -92

5 Ещенко, А Ю Продукты окисления кверцетина кис юродом воздуха при комнатной температуре и их идентификация [Текст] /ИГ Зенкевич, А Ю Ещенко, С В Макарова, В А Утсаль //Растит ресурсы -2007 -Т 43 - Вып 2 - С 111-124

6 Ещенко, А Ю Дискриминация относительных площадей пиков в различных температурных режимах газохроматографического анализа и критерий ее выявления [1ексг]/ИГ Зенкевич, А Ю Ещенко, И О Климова //Лабораторный журнал -2002 - Т1 - №1 - С 26-30

7 Eshchenko, A Yu Identification of the products of oxidation of quercetin by air oxygen at ambient temperature [Text] /IG Zenkevich, A Yu Eshchenko, S V Makarova, A G Vitenberg, Yu G Dobryakov, V A Utsal//Molecules -2007 - Vol 12 -p 654-672

8 Ещенко, А Ю Критерий одновременной хрочатографической идентификации нескольких компонентов в смесях на основании ранее не известных закономерностей относительных времен удерживания [Текст] /ИГ Зенкевич, А Ю Ещенко // Труды III научной сессии УНЦХ СПбГУ, Санкт-Петербург - 2004 - С 241-243

9 Ещенко, А.Ю Новый подход к идентификации соединений природного происхождения на примере характеристики сухого экстракта Босвелтии методом ВЭЖХ [Текст] / АЮ Ещенко, И Г Зенкевич // Материалы II Всерос конф «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» В 2 книгах - Книга 2 — 2005 - Барнаул -С 434-439

10 Ьщенко, А Ю Идентификация босвеллиевых кислот в сухом экстракте Босвеллии методом обращенно-фазовой ВЭЖХ [Текст] / А Ю Ещенко, И Г Зенкевич // IX Международный съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» Фитофарч, СПб -2005 -22-25 июня -С 527-531

11 Ьщенко, А Ю Особенности разделения энантиомеров дигидрокверцетина с использованием хирального модификатора подвижной фазы [Текст] / А Ю Ещенко, И Г Зенкевич // X Мюаду народный съезд Фитофарч, СПБ, 27-30 июня -2006 - С 85-93

12 Ещенко, А Ю Сравнительная характеристика свойств и стереоизомерия дигидрокверцетина Состав фтавоноидного комплекса лиственницы [Текст] /ИГ Зенкевич, А Ю Ещенко, В Г Макаров, Ю А Колесник, Д А Шматков, В П Тихонов, В М Ташлицкий//X Международный съезд Фитофарм, СПБ, 27-30 июня - 2006 - С 93-109

13 Eschenko, A Yu Unusual chemical transformations of natural flavonoids [Text] /1 G Zenkevich, A Yu Eschenko, S V Makarova, V G Makarov // Planta medica Abstracts An international journal of natural products and medicinal plant research 54 111 Annual congress on medicinal plant research 29 August - 2 September Helsinki, Finland -2006- Vol 72- №11 - P 1070 - P 300

Подписано к печати 2007 Заказ 3964

Тираж 120 экз Объем 1 п л Отдел оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ с оригинал-макета заказчика 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр 26

1. Введение.

2. Способы идентификации органических соединений хроматографическими методами (обзор литературы).

2.1. Хроматографические параметры удерживания.

2.1.1. Абсолютные параметры удерживания.

2.1.2. Относительные параметры удерживания.

2.1.3. Индексы удерживания.

2.2. Зависимости параметров удерживания от физико-химических констант анализируемых соединений и возможности их использования для идентификации органических соединений.

2.3. Дополнительные критерии идентификации, используемые в газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.4. Некоторые способы идентификации различных природных соединений в обращенно-фазовой ВЭЖХ.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Характеристика аналитического оборудования и условия элюирования.

3.2. Газохроматографический анализ модельных смесей.

3.3. Анализ различных природных соединений методом ОФ ВЭЖХ.

3.3.1. Анализ сухого экстракта Босвелии Boswellia serrata.

3.3.2. Анализ масляного экстракта плодов лимонника Schisandra chinensis.

3.3.3. Анализ продуктов окисления кверцетина.

3.3.4. Анализ токотриенолов и токоферолов в природных маслах.

3.4. Анализ модельных смесей фенола, м-крезола, рутина и кверцетина.

3.4.1. Условия анализа модельных смесей в режимах изократического элюирования.

3.4.2. Условия анализа четырехкомпонентной модельной смеси в режимах градиентного элюирования.

3.5. Анализ экстрактивных веществ листьев березы.

3.6. Анализ модельной смеси флавоноидов.

3.7. Разделение диастереомеров и энантиомеров дигидрокверцетина и катехина.

3.8. Методы обработки данных.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Разработка нового способа хроматографической идентификации органических соединений в многокомпонентных смесях сложного состава.

4.2. Теоретическое обоснование нового способа идентификации.

4.3. Проверка нового способа идентификации в газохроматографическом анализа на примере модельных смесей.

4.4. Проверка нового способа идентификации на примере сравнения справочных значений параметров удерживания.

4.5. Проверка нового способа на примере реальных природных объектов в методе ОФ ВЭЖХ.

4.5.1. Идентификация четырех босвеллиевых кислот в сухом экстракте Boswellia serrata.

4.5.2. Идентификация соединений схизандринового ряда в масляном экстракте Schisandra chinensis.

4.5.3. Идентификация продуктов окисления кверцетина.

4.5.4. Идентификация токоферолов и токотриенолов в природных маслах.

4.6. Ограничения нового способа идентификации.

4.7. Разделение энантиомеров природных соединений на примере дигидрокверцетина и катехинов методом ОФ ВЭЖХ в условиях хиральной модификации подвижной фазы.

4.7.1. Оптимизация условий разделения энантиомеров дигидрокверцетина и катехина в условиях динамической хиральной модификации с использованием (3-циклодекстрина.

4.7.2. Зависимость селективности разделения энантиомеров дигидрокверцетина от температуры колонки.

4.8. Проблема нестабильности природных соединений на примере окисления кверцетина, токотриенолов и токоферолов кислородом воздуха.

4.9. Некоторые приемы количественного определения различных органических соединений в методах ГХ и ВЭЖХ в отсутствие образцов сравнения.

5. Выводы.

Методы органической аналитической химии находят достаточно широкое применение в медицине, фармацевтике, пищевой промышленности и т.д. Актуальными в настоящее время являются экологический контроль (определение вредных примесей в воздухе, питьевой воде, сточных' и природных водах); контроль качества продуктов питания, алкогольных напитков, лекарственных препаратов, судебно-медицинская практика с использованием методов газовой (ГХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), капиллярного электрофореза и различных спектральных методов. В современной практике также используют гибридные методы, такие как ГХ-масс-спектрометрия, ВЭЖХ-масс-спектрометрия, ГХ-ИК-Фурье-спектроскопия, ВЭЖХ-ИК-Фурье-спектроскопия, ВЭЖХ-ПМР и диодно-матричное детектирование. Важно отметить необходимость использования надежных аналитических методов в разработке новых технологий производства продуктов питания, алкогольной промышленности, лекарственных препаратов и биологических добавок к пище.

В зависимости от конкретной проблемы, аналитические задачи можно классифицировать на подтверждающие (определение одного или нескольких соединений в смесях известного состава) и разведочные, ориентированные на исследование новых объектов. К этим задачам, в частности, можно отнести изучение выделенных из растений различных классов природных соединений с целью создания лекарственных препаратов. Действующие вещества в составе препаратов растительного происхождения представлены компонентами, как правило, нескольких классов природных соединений, например, таких как терпеноиды, стероиды, алкалоиды, белки, аминокислоты, полисахариды, витамины (каротиноиды, соединения группы витамина Е, аскорбиновая кислота и т.д.) и так называемый Р-витаминный комплекс (флавоноиды). Для определения соединений этих классов преимущественно используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Помимо выбора оптимальных условий разделения различных соединений, одной из самых важных и трудоемких задач аналитика является идентификация соединений в многокомпонентных смесях. Для иллюстрации ее важности достаточно заметить, что неправильная интерпретация результатов влечет за собой неизбежные ошибки в количественном анализе.

В настоящее время используют большое число приемов идентификации аналитов, из которых наиболее часто применяемым и относительно доступным является способ идентификации с использованием образцов сравнения. Однако, этот метод как в рутинном анализе, так и в групповой идентификации не всегда дает однозначные ответы и требует привлечения дополнительных аналитических параметров. Наиболее сложной и актуальной проблемой является идентификация в отсутствие образцов сравнения (стандартных образцов), особенно «экзотических» природных соединений в связи с их труднодоступностью или высокой стоимостью. Решение этой задачи представляется возможным с использованием хроматографических параметров удерживания, из которых наиболее применяемыми являются относительные времена (объемы) удерживания и индексы удерживания, в совокупности с другими критериями, характеризующими свойства определяемых соединений.

Такой способ интерпретации данных включает в себя сравнение полученных параметров (в частности индексов удерживания, как наиболее воспроизводимых параметров) с табличными данными (с базами данных). В качестве дополнительных критериев можно отметить УФ-спектры (существуют атласы УФ-спектров для большого числа органических соединений), относительные оптические плотности при фиксированных длинах волн, логарифмы коэффициентов гидрофобности (log Р), коэффициенты распределения анализируемых соединений в гетерофазных системах и другие. В главе 2 (обзор литературы) рассматриваются различные способы идентификации органических соединений по литературным данным.

В ряде случаев всех известных приемов бывает недостаточно для однозначной идентификации аналитов. Таким образом, существует необходимость поиска новых способов и критериев идентификации соединений различных классов в многокомпонентных смесях методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Именно этой проблеме посвящена данная работа.

В данной работе впервые рассматривается общий алгоритм идентификации органических соединений различных классов в отсутствие образцов сравнения, который основан на сравнении экспериментальных параметров удерживания, полученных в разных условиях анализа или с литературными данными. Суть приема заключается в том, что, если число анализируемых компонентов в пробе больше или равно трем, то критериями одновременной идентификации всех компонентов могут служить высокие значения коэффициентов корреляции (г > 0,99) сравниваемых наборов данных. Этот способ может быть применен как в обращенно-фазовой ВЭЖХ, так и в газовой хроматографии. В некоторых случаях в процессе работы становились доступными образцы сравнения и, таким образом, удалось подтвердить правильность идентификации.

Обсуждаются ограничения применения нового алгоритма идентификации, связанные с использованием разных режимов анализа и с изменением порядка элюирования соединений различных классов при изменении содержания органического компонента в подвижной фазе.

Известно, что многие органические соединения являются оптически активными. Достаточно часто биологическую активность (как в растениях, так и в организмах человека и животных) проявляет только один энантиомер. Разделение рацематов методами ГХ, ВЭЖХ и капиллярного электрофореза является одной из важных проблем в химии, имеющей непосредственное отношение к медицине. В ВЭЖХ для этих целей преимущественно используют хроматографические колонки с хиральными (оптически активными) сорбентами. Другой вариант с использованием хиральной модификации подвижной фазы (различные добавки в элюент) является более доступным, но и более сложным, чем применение хиральных колонок. С помощью (3-циклодекстрина в качестве добавки в элюент в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ впервые были разделены энантиомеры таких природных соединений как катехин и дигидрокверцетин, которые являются основными компонентами некоторых лекарственных препаратов растительного происхождения и биологически активных добавок к пище. Была установлена температурная зависимость степени (селективности) разделения энантиомеров дигидрокверцетина. Важным этапом этой части работы является отнесение конфигураций энантиомеров дигидрокверцетина и катехина.

Природные масла являются источниками жирорастворимых витаминов (каротиноиды - соединения группы витамина А, токотриенолы и токоферолы - витамин Е). Для определения соединений группы витамина Е в отсутствие образцов сравнения были предложены расчетные способы параметров удерживания по логарифмам коэффициентов гидрофобности (log Р). Применение нового способа идентификации (сравнение параметров удерживания токоферолов и токотриенолов, полученных в разных условиях анализа) позволило провести одновременную идентификацию шести соединений группы витамина Е. В качестве дополнительной информации для идентификации токотриенолов и токоферолов в природных маслах можно рекомендовать относительные оптические плотности при фиксированных длинах волн. Обсуждается проблема определения этих соединений в маслах, связанная с их окислением кислородом воздуха и на свету.

Проблема стабильности многих природных соединений является актуальной и связана со способами хранения природного сырья, а также технологии приготовления лекарственных форм. В данной работе на примере кверцетина было установлено, что флавоноиды, в умеренно-щелочных средах (рН~8-10) в водно-спиртовых растворах в присутствии кислорода воздуха полностью окисляются в течение 3,5 часов. Структуры продуктов окисления кверцетина были установлены с помощью методов ГХ-МС и ВЭЖХ. Идентификацию некоторых из этих соединений проводили с применением нового алгоритма сравнения экспериментальных и литературных данных по параметрам удерживания.

Таким образом, с появлением новых более сложных аналитических задач, таких как исследование компонентного состава различных природных объектов, становится необходимым разрабатывать новые способы идентификации. Несмотря на многообразие коммерческих препаратов (образцов сравнения), они труднодоступны для многих лабораторий в связи с их высокой стоимостью или долгими сроками поставки, что ограничивает быстроту и качество работы аналитика, а также приводит к большим межлабораторным погрешностям и порой к невоспроизводимым результатам.

Разработки новых универсальных способов идентификации в отсутствие образцов сравнения позволят увеличить вероятность правильности интерпретации полученных данных.

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм хроматографической идентификации одновременно нескольких известных соединений в многокомпонентных смесях при отсутствии их образцов сравнения, основанный на корреляции как абсолютных, так и относительных времен удерживания аналитов в разных режимах анализа. Критерием одновременной идентификации нескольких соединений являются высокие значения коэффициентов корреляции параметров удерживания (г > 0.99).

2. Показано, что предложенный алгоритм применим как в газовой хроматографии, так и в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Это доказывает его универсальный характер и позволяет эффективно использовать справочные данные по параметрам удерживания, представленные в любой форме. Установлены ограничения нового способа идентификации, связанные с изменением порядка элюирования органических соединений разных классов при разном содержании полярной неподвижной жидкой фазы на полярном сорбенте в ГХ и в неодинаковых режимах изократического и градиентного элюирования в ОФ ВЭЖХ.

3. Для разделения энантиомеров дигидрокверцетина, дигидрокемпферола и катехинов подобраны оптимальные условия с использованием динамической хиральной модификации элюента р-циклодекстрином в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Показана зависимость селективности разделения энантиомеров дигидрокверцетина от температуры колонки и установлено, что проведение анализа при 0 °С позволяет существенно уменьшить концентрацию хирального модификатора в составе элюента при повышении селективности их разделения.

4. С использованием предложенного алгоритма идентифицированы ключевые компоненты в составе экстрактивных веществ различных растений при отсутствии их образцов сравнения, в том числе:

- четыре босвеллиевые кислоты: 11-кето-Р-босвеллиевая, ацетил-11-кето-р-босвеллиевая, р-босвеллиевая и ацетил-р-босвеллиевая в составе сухих экстрактов Boswellia serrata;

- восемь соединений схизандринового ряда в масляном экстракте лимонника Schisandra chinensis;

- продукты окислительной деструкции кверцетина кислородом воздуха: флороглюцин, 3,4-дигидроксибензойная и 2,4,6-тригидроксибензойная кислоты, и предположительно 4,6-дигидрокси-2-(3,4-дигидроксибензоилокси) бензойная кислота (депсид).

5. Показано, что повышение надежности идентификации как ключевой стадии анализа позволяет эффективно решить ряд важных задач химии природных соединений, в том числе:

- установлено, что несоблюдение условий хранения растительных масел приводит к резкому уменьшению содержания в них соединений группы витамина Е (токотриенолов и токоферолов) за счет их окисления;

- на примере кверцетина, установлено, что природные флавонолы нестабильны в растворах в условиях контакта с кислородом воздуха в умеренно-щелочных средах при комнатной температуре, что необходимо учитывать при изучении их метаболизма и разработке промышленных методов выделения.

1. Столяров, Б.В. Практическая газовая и жидкостная хроматография

2. Текст. / Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Витенберг, Л.А. Карцова, И.Г. Зенкевич, В.И. Калмановский, Ю.А. Каламбет // Учеб. Пособие. Изд-во СПбГУ. 2002. - 616 с.

3. Химическая энциклопедия Текст. Т.2 / М.: Советская энциклопедия. 1990. - 672 с.

4. Шрайнер, Р. Идентификация органических соединений Текст. / Р.Шрайнер, Р.Фьюзон, Д. Кертин, Т. Морил // М.: Мир. 1983.675 с.

5. Стыскин, ЕЛ. Практическая высокоэффективная жидкостнаяхроматография Текст. / Е.Л.Стыскин, Л.Б.Ициксон, Е.В. Брауде. НМл Химия. 1986.-287с.

6. Гольберт, К.А. Курс газовой хроматографии Текст. / К.А. Гольберт, М.С. Вигдергауз // М.: Химия. 1974. 375 с.

7. Шатц, В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии Текст. / В.Д.Шатц, О.В.Сахартова. // Рига.: Зинатне. 1988.-381 с.

8. Green, R. Determination of buspirone and metabolite l-(2-pyrimidinyl)-piperazine in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry Text. / R.Green, R. Houghton, S.Jacobs // Chromatographia. 2004. - T. 59. - № 2. - P. 197-201.

9. Сояк, JI. Разделение и идентификация изомерных углеводородов методами капиллярной газовой хроматографии и сочетаниями ее с масс-спектрометрией и ИК-Фурье спектроскопией Текст. / JI. Сояк // Рос. хим. журн. 2003. - Т. 47. - № 2. - С. 51-69.

10. Хубер, JI. Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ Текст. / Л. Хубер // М.: Мир. 1993.- 95 с.

11. Engelhardt, H. Practice of high performance liquid chromatography. Applications, equipment and quantitative analysis Text. / H. Engelhardt, K. Aitzetmuller // Berlin. Springer-Verlag. 1986. - P. 368.

12. Иванова, С.З. Полимер дигидрокверцетина из древесины лиственницы Текст. / С.З. Иванова, Т.Е. Федорова, Л.А.Остроухова, С.В.Федоров, Н.А. Онучина, В.А. Бабкин // Химия растит, сырья. 2001. № 4. - С. 21-24.

13. Lebron-Aguilar, R. Hold-up time in gas chromatography Text. / R. Lebron-Aguilar, J.A. Garca-Domnguez, J.E. Quintanilla-Lopez // J. Chromatogr. A. 1998. - V. 805. - № 1. - P. 161-168.

14. Le Vent, S. Homologous series methods for determining hold-up parameters in isothermal gas chromatography Text. / S. Le Vent // J. Chromatogr. A. - 1996. - V. 752. - № 1+2. - P. 173-181.

15. Набивач, B.M. Использование корреляционных уравнений для предсказания величин удерживания в газожидкостной хроматографии Текст. / В.М. Набивач, В.П. Дмитриков // Успехи химии. 1993.- Т. 62. № 1. - С. 27-33.

16. Вигдергауз, М.С. Время удерживания несорбирующегося вещества в хроматографии Текст. / М.С. Вигдергауз, И.А. Платонов, А.Л. Лобачев, О.В. Сушко // Журн. физич. хим. 1993. -Т.67. - № 4. - С. 857-860.

17. Van den Dool. A generalization of retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography Text. / Van den Dool, P.D. Kratz // J. Chromatogr. 1963.- V.l 1. - P. 463-471.

18. Zenkevich, I.G. System of retention indices for a linear temperature programming regime Text. / I.G. Zenkevich, B.V. Ioffe // J. Chromatogr. 1988. - V. 439. - № 2. - P. 185-193.

19. Вигдергауз, М.С. Качественный газохроматографический анализ Текст. / М.С. Вигдергауз, J1.B. Семенченко, В.А. Езрец, Ю.Н. Богословский // М.: Наука. 1978. 244с.

20. Зенкевич, И.Г. Обобщенные индексы удерживания для газохроматографического анализа с линейным программированием температуры Текст. / И.Г. Зенкевич // Журн. Аналит. хим. 1984. - Т. 39. - Вып. 7. - С. 1297-1307.

21. Зенкевич, И.Г. Формирование базы данных по индексамудерживания лекарственных веществ в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии Текст. / И.Г. Зенкевич // Журн. Прикл. хим. 1994. - Т.67. - Вып. 11. - С. 18771882.

22. Зенкевич, И.Г. Особенности использования линейно-логарифмических индексов удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии Текст. / И.Г. Зенкевич // Журн. Прикл. хим. 1995. - Т.68. - Вып. 8. - С. 1321 -1327.

23. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений. Распространение, физико-химические свойства, методы исследования Текст. / Л.К. Клышев, В.А. Бандюкова, Л.С. Алюнина // Каз.ССР. Алма-Ата: Наука. 1978.- 196 с.

24. Сакодынский, К.И. Аналитическая хроматография Текст. / К.И. Сакодынский, В.В. Бражников, С.А. Волков, В.Ю. Зельвенский, Э.С. Ганкина, В.Д. Шатц // М.: Химия. 1993. - С. 214-225.

25. Smith, R.M. Retention prediction of analytes in reversed-phase highperformance liquid chromatography based on molecular structure Text. / R.M. Smith, C.M. Burr // J. Chromatogr. 1989. - V. 475. - P. 57-74.

26. Forgacs, E. Quantitative relationship between the retention of peptides on a reversed-phase alumina support and their physicochemical parameters Text. / E. Forgacs, T. Cserhati // J. Chromatogr. A. -2002. V. 948. - P. 69-75.

27. Зенкевич, И.Г. Расчет температур кипения органических соединений по данным для предшествующих гомологов с использованием рекуррентных соотношений Текст. / И.Г. Зенкевич // СПбГУ Труды III научной сессии УНЦХ. 2004. - С. 229-232.

28. Heberger, К. Empirical correlations between gas-chromatographic retention data and physical or topological properties of solute molecules Text. / K. Heberger // Anal. Chim. Acta. 1989. - № 223. -P. 161-174.

29. Алленмарк, С. Хроматографическое разделение энантиомеров Текст. / С. Алленмарк // М.: Мир. 1991. - 257 с.

30. Wiener, H. Structural determination of paraffin boiling points Text. /

31. H. Wiener // J. Am. Chem. Soc. 1947. - V. 69. - P. 17-20.

32. Зенкевич, И.Г. Расчет газохроматографических индексов удерживания по физико-химическим константам органических соединений Текст. / И.Г. Зенкевич // Журн. аналит. хим. 1995. -Т.50. - № 10. - С. 1048-1056.

33. Zenkevich, I.G. Comparison of the topological and dynamics characteristics of molecules for calculating retention indices of organic compounds Text. / I.G. Zenkevich, A.N. Marinichev // J. Struct. Chem. 2001. - V. 42. - № 5. - P. 747-754.

34. Zenkevich, I.G. Using new structurally related additive schemes in the precalculation of gas chromatographi retention indices of polychlorinated hydroxybiphenyls on HP-5 stationary phase Text. /

35. G. Zenkevich, M. Moeder, G. Koeller, S. Schräder // J. Chromatogr. A. 2004. - V.1025. - P. 227-236.

36. Зенкевич, И.Г. О роли информационного обеспечения в обращенно-фазовой ВЭЖХ (на примере идентификации примесей в дигидрокверцетине) Текст. / И.Г. Зенкевич, В.М. Косман // Журн. аналит. хим. 2005. - Т. 60. - № 8. - С. 837-841.

37. Zenkevich, I.G. Interpretation of retention indices in gas chromatography for establishing structures of isomeric products of alkylarenes radical chlorination Text. / I.G. Zenkevich // Rus. J. Org. Chem. 2001. - V. 37. - № 2. - P. 270-280.

38. Valko, K. Selection of gas chromatographic stationary phase pairs for characterization of the 1-octanol-water partition coefficient Text. / K. Valko, O. Papp, F. Darvas // J. Chromatogr. 1984. - T. 301. - № 2. -P. 355-364.

39. Запрометов, M.H. Основы биохимии фенольных соединений Текст. / M.H. Запрометов // M.: Высшая школа. 1974. - 213 с.

40. Березов, Т.Т. Биологическая химия Текст. : учеб. пособие для медицинских вузов / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин // М.: Медицина. 1998. - 704 с.

41. Gallori, S. Identification of Anthocyanins in Amorphophallus titanum (Becc.) Becc. Text. / S. Gallori, C. Giaccherini, A. R. Bilia, N. Mulinacci, F. F. Vincieri // Chromatographia. 2004. - V. 59. - P. 647-651.

42. Stevens, J.F. Quantitative analysis of xanthohumol and related prenylflavonoids in hops and beer by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Text. / J.F. Stevens, A.W. Taylor, M.L. Deinzer // J. Chromatogr. A. 1999. - V. 832. - P. 97-107.

43. Pfanderl, H. HPLC and SFC of carotenoids scope and limitations Text. / H. Pfanderl, R. Riesenz, U. Nigglil // Pure &Appl. Chem. -1994. - V. 66. - №. 5. p. 947-954.

44. Ещенко, А.Ю. Определение токоферолов и токотриенолов в растительных маслах и некоторые особенности их состава Текст. / А.Ю. Ещенко, И.Г. Зенкевич // Вестник СПбГУ. Сер. Физ.-Хим. 2006. - Вып.4. - С.68-75.

45. Bee-Lan Leel. Simultaneous determination of tocotrienols, tocopherols, retinol, and major carotenoids in human plasma Text. / Bee-Lan Leel, Ai-Li New, Choon-Nam Onga // Clinical Chemistry. -2003.-№49.-P. 2056-2066.

46. Зенкевич, И.Г. Новые возможности идентификации органическихсоединений по УФ-спектрам с использованием относительных оптических плотностей Текст. / И.Г. Зенкевич, В.М. Косман // Журн. прикл. хим. 1997. - Т. 70. - Вып. 11. - С. 1861-1869.

47. Zenkevich, I.G. Identification and quantitative determination of 5-(hydroxymethyl)furfural in sugar color Text. / I.G. Zenkevich, A.I. Pimenov, L.I. Sokolova, V.G. Makarov//Rus. J. Appl. Chem. 2001. -V. 74.-№7.- P. 1164-1168.

48. Kreft, S. Rutin in buckwheat herbs grown at different UV-B radiation levels: comparison of two UV-spectrophotometric and an HPLC method Text. / S. Kreft, B. Strukelj, A. Gabercik, I. Kreft // J. Experim. Botany. 2002. - V. 53. - № 375. - P. 1801-1804.

49. Георгиевский, В.П. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений Текст. / В.П. Георгиевский, А.И. Рыбаченко, А.Л. Казаков // Ростов: Ростовский ун-т. 1988. - 131 с.

50. Jin, D. Separation of flavonoids by semi-micro high-performance liquid chromatography with electrochemical detection Text. / D. Jin, H. Hakamata, K. Takahashi, A. Kotani, F. Kusu // Bull. Chem. Soc. Japan. 2004. - V. 77. - № 6. - P.l 147-1152.

51. NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69, June 2005. NIST Mass Spectrometry Data Center. National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD 20899 (http://webbook.nist.gov).

52. Максимов, Б.Н. Промышленные фторорганические продукты. Справочник Текст. / Б.Н. Максимов, В.Г. Барабанов, И.Л. Серушкин // Л.: Химия. 1990. - 464 с.

53. Не, X.-G. Analysis of lignan constituents from Schisandra chinensis by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry Text. / He X.-G., Lian L.-Z., Lin L.-Z. // J. Chromatogr. A. 1997. - V. 757. - P. 81-87.

54. Reference Substances. Phytolab Product Catalogue. 2006-2007. Phytolab GmbH & Co. Vestenbergsgreuth. 154 p.

55. Mabry, T.J. The systematic identification of flavonoids Text. / T.J. Mabry, K. R. Markham, M.B. Thomas // Berlin. Heidelberg. NY. -1970.-345 p.

56. Зенкевич, И.Г. О причинах аномалий УФ-спектра пентаацетилкверцетина Текст. / И.Г. Зенкевич, А.И. Пименов // Растит, ресурсы. 2003. - Т. 39. - Вып. 2. - С. 120-126.

57. Надиров, Н. К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве Текст. / Н.К. Надиров // М.: 1991.- 336 с.

58. Garffield, W. Circular dichroism, optical rotatory dispersion and absolute configuration of flavones, 3-hydroxyflavanones and their glycosides Text. / W. Garffield // Tetrahedron. 1970. - V.26. - № 17.-P. 4093-4108.

59. Han, X. Separation of enantiomers of isochromene derivatives by HPLC using cyclodextrin-based stationary phases Text. / X. Han, Q. Zhong // J. Chromatogr. A. 2005. - V. 61. - P.205 - 211.

60. Lemr, K. Evaluation of experimental parameter influence on HPLC separation of some amines and pyrenthroids using two P-cyclodextrin columns Text. /К. Lemr, J. Selcik // Acta universitatis palaskianae olomucensis. 1999. - P. 41-51.

61. Wang, R. Separation of the enantiomers of thyroxine by HPLC with chiral mobile phases Text. / R. Wang, Z-P Yia // J. Chromatogr. -2004. V .59. - № 11-12. - P. 749 - 752.

62. Nazareth, P.M. P. Chiral ligand exchange chromatography: separation of enantiomeric mixtures of underivatized a-amino acidsunder UV detection Text. / P.M.P. Nazareth, O.A.C. Antunes // J. Braz Chem.Soc. 2002. - V.13. - № 5. - P. 658-663.

63. Guo, Z. Chiral separation of ketoprofen on an achiral Cg column by HPLC using norvancomycin as chiral mobile phase additives Text. / Z. Guo, H. Wang, Y. Zhang // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. - V. 41.-№ 1. - P. 310-314.

64. Hermann, D. // Bioorg. Chem. Text. / D. Hermann, P. Christopher // 1981.-580 c.

65. Bielejewska, A. Cyclodextrins as chiral additives for chromatograchic separation of some mandelic acid esters into enantiomers Text. /.A. Bielejewska, B. Lukasik // Chem. anal. 2002. - V. 47. - P. 419.

66. Lemli, В. The rate of host-guest complex formation of some calixarene derivatives towards neutral aromatic guests Text. / B. Lemli, J. Peles // Supramol. Chem. 2006. - V. 17. - № 2. - P. 1-7.

67. Гороновский, И.Т. Краткий справочник по химии Текст. / И.Т. Гороновский, Ю.П. Назаренко, Е.Ф. Некряч // Киев. 1987. - 828 с.

68. Зенкевич, И.Г. Особенности стереоизомерного состава и некоторые физико-химические свойства природного дигидрокверцетина Текст. / И.Г. Зенкевич, В.Г. Макаров, А.Ю. Ещенко // Журн. Растительные ресурсы. 2006. - Вып. 3. - С. 8192.

69. Vernon, Н.М. The solubility of air in fats, and its relation to caisson disease Text. / H.M. Vernon // Proc. Roy. Soc. London. Ser. B. -1907. V. 79. - № 533. - P. 366-371.

70. Kagan, V.E. Recycling of vitamin E in human low density lipoproteins Text. / V.E. Kagan, E.A. Serbinova // J. Lipid Res. -1992.-V. 33.- P. 385-397.

71. Несмеянов, A.H. Начала органической химии Текст. В 2 т. Т.2. / А.Н. Несмеянов, Н.А. Несмеянов // М.: Химия. 1974. - 713 с.

72. Зенкевич, И.Г. Дискриминация относительных площадей пиков в различных температурных режимах газохроматографического анализа и критерий ее выявления Текст. / И.Г. Зенкевич, А.Ю. Ещенко, И.О. Климова // Лабораторный журнал. 2002. - Т.1. -№1. - С.26-30.

73. Зенкевич, И.Г. Некоторые особенности количественного анализа компонентов эфирных масел в высокоэффективной жидкостной хроматографии Текст. / И.Г. Зенкевич, В.М. Косман, К.Г. Ткаченко // Растит, ресурсы. 1999. - Т. 35. - Вып. 1. - С. 128-137.

74. Зенкевич, И.Г. Методы количественного хроматографического анализа лекарственных веществ Текст. : учеб. пособие дляфармацевтических работников / И.Г. Зенкевич, В.М. Косман // СПб.: СПХФА, 1999.-80с.