Новый эффективный метод направленного олигонуклеотидами сайт-специфического мутагенеза на плазмидных векторах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Трудовйго Красного Знамени н ордена Октябрьском Революции государственный университет им. М. В. Ломоносова

X ИМИ ЧЕСКИ И ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 577.214.42 + 577.213.3 + 577.113.6

КАБЕРДИН ВЛАДИМИР РОДИСЛАВОВИЧ

НОВЫЙ эффективный метод направляемого

ОЛНГОНУ НЛЕОТИДАМИ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕОКОГО МУТАГЕНЕЗА НА ПЛАЗМИДНЫХ ВЕНТОРАХ

02.00.10 — Бноорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва —1891

Работа выполнена на кафедре химии природных соединении химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор 3. А. Шабарова; кандидат химических наук, старшин научный сотрудник В. Л. Друца.

Официальные оппоненты: доктор химических наук О. Г. Чахмахчева; доктор биологических наук 10. Л. Дорохов.

Ведущая организация — ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, корпорация «Фарминдустрии». . _ .

Защита состоится 26 НоЗуШ^ 1991 г. в /часов па заседании Специализированного' совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете .им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-231, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория ЬО/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан М 1991

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

М^С^ЖРНОВА

г.

огллп "зраютисгнсл рдвотн

¿итуакьаосгь теш. ВасоккЛ совремзгашЗ уровень развитая бкоорга-кической xi'j.ani и иаяэкулвпиоП бшдогш по tsiorai обусловлен ycnexmi п исследовании нуклокноыгх »Фслат. T¿ui( d пасто.чдев ррена тззш бистро н О.И'ЗКТПВНО КЛОКЯроПгГСЬ WM Í'VO" l! nr.IfPíO'í. КОПСТру^ЕМЬ споцйадя-зиров&килэ ил^онидциэ и гГлгот'.э nci'ropü, осуществлять дозепи п;!:оз белков и т.д. Psaeimo ¡muc задач j'spaapirano сназша с щхсюшшеи 4л-тодов гоне-шчоскоА гакаггрии. '¡челу теши, »ютодсв относится и направляемый олагонукюотидзии спГ.т-сиэщфиесюй цутпгаюз, • благод91м которому удается üe^chnirpjrnewio и с високой БМектевпсстыэ епос.чть мзк>;пзтя в ггукпэопдоу» последовательность иссяэдуеной ДШ1.

Наиболее зЗДектвшш'л счятатсп иетиди ссЛт-споцп1ичэского иута-генеза на однотяжевах Д!!К шггепщт флгев. До сих пор конструироваштэ путайте«/. генов, ко* ирашно, предполагало слздугоуя последоваталь-иость onep&mííi: ю.ошгрсва!'ли и> lüpyeworo $рап/зн7а г»ша в фаговой ДНЯ, проведение мутагенеза, aavena в екснросскрусдом секторе фрагмента Д!"' "дикого" -иша ^рвгкеитсы, шсуиш долгую нутац'я». Гораздо удобкзо прободать мутагенез потере дс;ввипо из пдазлидах, сосгсвлакцих основу практически всех векторов, прзлдагиачепшх для сксгрэссна. Однако» несмотря на то, что в лиюрвтуро списано несколько методов, позволлвдц в частнцх случая^ конструировать мутации и двут.тазвих векторах, з.Дпн-тпкю.1 и достаточно универсальной cxei.r.i мутагенезе, базирупцеЯсл на относительно простой техники эксперимента, до спх пор не существует. В связи с эти» задача поиска новях подходов к конструированию :лутацш1 представляется в настоящее премл достатошо актуальной.

Цель рэботц. Диссертация посвящена разработке повой достаточно универсальной схем« далравлеипюго мутагенеза па плазмидшх пасторах, которая обеспечивает высокий ьн::од цолевнх мутантов и максимально сокращает время и материала, необходкше для проведения эксперимента.

Научная новдзиа в практическая sn.i4iai2cvh. В работе предложена в проверена на различиих объектах новая схема направляемого олигонуклео-гндами мутагенеза на днутпкевих. векторах. С цомоцьа мутагенного и одного (шш двух) вспомогатольшх крайыеров катод позволяет с высокой эффективностью генерировать мутащш в окрестностях уникального сайта рестрикции нутирусыой ДШС. При атом в ходе конструировании мутантноЯ ЩИ 0Д1Ш из вспомогательных праймеров слуант нсевдозатравкой для ДШ'-толшарази I E.coli, которая осуществляет процесс так называемой шсс--трансляции; используя в качестве матрицы искусственно полученную му-

тантную цепь. Ник-трансляция и данном случае составляет основу специальной системы хи.мческого отбора, благодаря которой достигается высокий (G0-90X) выход мутантов.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что используемый подход может быть с успехом применен не только для мутагенеза, но и для клонирования прог;женних полкнуклеотидов длиной 60-90 звеньев. На примере клонирования терминатора траласршщии фага fd проиллюстрирована принципиальная возмокность точного встраивания эта-.! методом в векторные ДНК полшуклеотидов, получаемых с ходе полимеразной цепной реакции.

С точки зрения практического применения достоинствам данного метода являются использование доступных и недорогих реактивов и оборудования, а такке возможность получения высоких выходов мутантов (при относительно простоя технике генно-шпхенерного эксперимента) в случае практически любых дпутг^евнх; векторов и штаммов клеток-хозяев.

Апробация работ. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направлештя в биотехнологии", Пувдно, 19вЗ; Международном симпозиуме "Синтетические олнгопуклеотидц: проблем и границы практического использования", Москва, 1У91.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Cxpyirrypa работц. Диссертационная работа состоит из введения, трох глав, выводов и списка литература.

В первой главе обобщена и критически рассмотрена имеющиеся в литературе данные ш методам направляемого олигонуклеотидами саГ.т--специфического мутагенеза на двутажовмх вокторах.

Вторая глава цосрщцена обсуждению получегашх автором науч1шх результатов по разработке нового метода сайт-специфического мутагенеза па плазмвдных векторах,

В третьей глава содержатся сведения о реактивах, материалах, оборудовании и методиках, использованных в диссертационной работе.

СОДЕРЖАЩЕ рдпоти

В настоящей работе предлагается новая схема введения мутаций (замен нуклоотцдов, дэлецнй или вставок) в окрестности любого уникального сайта рестрикции произвольной кольцевой двутякевой Д1ПС (рис.1).

Вначавэ походная ДШ расщепляется в уникальном сайге эндонуклеа-зоЯ рестрцкцзда и затем обрабатывается экзонуклеазой III (или Т4-ДНК-полиыеразой в отсутотгаа трифосфатов) так, чтобы с обоих концов линеаризованного вектора рцсвободилисъ достаточно протяженные однотяжевнз

+

РжЛ. Обзая схема направляемого одигснуклеотидгггл мутагенеза на двутяжевих колыдевих Д1ПС.

участки. Далее следует гибридизация с тремя о-пигопуклеотндвия: мутагеном, коиштнентаршм (за исключением участка сведения мутации) одному из однотятавшс. участков линеаризованного вектс|,а, it адаптерами, полностью ко;я1Л8ментаршми его концам. В качеств;} мутигеЛа могут шсту-пать однотяжевие фрагмента пр'.тродных ДНК, синтетические олигонуклеоти-ди, или однотяжевно полинуклеотнда, полученные, например, с помощью техники полиыеразшх цепных реакций. МутагешшЛ праймер и комплементарный той не цепи синтетический оллгсиуклеотид-адаптэр должны иметь фосфатную группу na 5'-конце, второ.1 г.,з синтетический олигонуклеотид-адашер не должен иметь концевого фосфата. Структуру З'-концевих участков обеих адаптеров подбирают так, чтобы после гибридизации концы линеаризованного вектора можно било би снова соединить ДНК-лигазоЯ с восстановлением исходного сайта рестрикции.

На следующем этапе полученный гибрид замыкают в кольцо ДНК-лигазой и затем достраивают его Кленовским фрагментом ДНК-ноликерази I F..coli (или Т4-ДНК-полимеразой) в присутствии всех дезокспиуклеоэид-

трзфэс^атов, гАТР и ДШС-ллгази. Основной продукт предке ствувдтх кашг-пуллциЛ - кольцевой гэтеродуплекс с рззрхтоы в одном из тяг;ей и нару-сегшзы двойной спирали б области мутагенеза. Причем целевая ("мутант-пая") структура встроена в ковалэнтио замкнутяй ip.z: ДНК, а исходная ("дикого тша") структура - в тя» с искусственным разрыве;.!, рзсполо-£Э1Ц"1М в направлении 0'-»5' на относительно нобольпем рассгояш;;:.

Обработка полученной гетеродуплоксноП конструкции (поело удалошш фэрмонтсв, работавших на предыдущей стадии) ДНК-полимеразоЯ I E.coll приводит к ток называемой реакции "ншс-трансляцш". ДНК-полимераза I Б.coli в ходе этой реакции осущзствлг.ет деградаций п одновременнув достройку немутируемой цеш! на матрице цепи со встроенным олигонуклеоти-дом-мутагеном, используя в качестве псевдозатравкн встроешшй в Д13< кефосфорзшфованниП олкгонуклеотид. После проходдзшш ферментом района изкошлекентарности образуется ДНК, обе цепи которой в области гдугаге-ueoa будут шоть запланированную структуру. Тагам образом, паша схема, зо счет своообразной "хшихо-фзрмэитативиоП" селекции in vitro, в принципа допускает возможность генерирования мутаций с выходами до 1003.

В общем случае рассматриваемый «отод мутагенеза предполагает использование одного ила нескольких мутагеюшх и двух вспомогательных ираЯмзров. Однако, если мутируют участок, близкий к базовому сайту рестрикции, функцию одного из вспомогательных прайморов монет выполнять и сам олигонумеотид-мутагеп (двухпраймершй вариант метода).

Зксперименталъную проверку предложенной о 7. ем; мутагенеза в различение ое вариантах и оптимизацию условий гешю-шпкенериого эксперимента tri попытались осуществить при ресении конкретных гешю-инг:онершх задач - дизайне промотор-тестирующей плвзмидц pIiD-OOI-14-II и создании на основе ыультикопийной плазмиды pUCI9 базового вектора для окспрэс-ciiii в E.coll сверхтоксичннх белков тша грибковых рибонуклеаз.

I. Пскструкрованпз цугаisü в шшешдз р'Ш-001-14-11

В пэрвих экспериментах по разработке новой схема конструирования ?,;ута15гй в качества основного объекта мутагенеза нами била выбрана плазгзда рЯБ-001-14-11. Сконструированная на Сазе плазмиды pBR322, она содержит ген устойчивости н 'аьшщашшу и галактозный оперон E.coll, прокоторнпя часть которого закэнопа полклинкером из фага-М10тр8. Если в плазмвду шред gal-опероиэм встроить фрагмент Д1ПС, обладающий прег.га-торной активностью и использовать в качоствэ хозяина шташ E.coll с нарушенной работой gal-оперона (например, PI65'), то клоны с рекомби-пантной плазиидой мохио отбирать на индикаторной среде МакКонки-агара

но ярко-иаииюшЗ окраске их колонка. Вначале ш попитажсь па осиосо предложенной exet« конструирования м.утэщи1 разработать способ быстрого встраивания сигнала кшншащш транскрипции и гокторшэ Я SIC.

Как известно из литературы, в качестве такого сигнала могут отступать , например, короткие IO-14-звонше синтетические Фрагмент» ДНК, содержащие последовательность T/.TAATG (бокс Прибноу). Их. пстранвапш п проглотор-тестирувдий вектор р1Ш-001-1 -t-11 присолит к появлении ярко-Eizpnireiiüoa промоторной активности » области lmcepumi. Эта экспорнши-тн, о так::э после дни о даннно по направлешюпу мутагенезу -35-й области прокарноткческик промоторов поико япьат рассматривать последовательность Прибноу в качестве ключевого слемента дла ([ормироваипя в ДШС сигнала шшциэдга транскрипции. Опираясь па зтп данные, ни попнталзсъ инициировать транещшшню (/al-огкрона плаакиди pHD-OOl -14-11 путем встраивания последовательности TATAATG п область, предшествующую cal-onopoiiy. Подтверждение а нищих экспериментах предполоянття о возможности функ-цно1шроваш1я бокса Прибноу в достаточно сильно варьируемом неканоническом окрукешш ка:с мшпшромотора в сочетает с висскоЯ вМюнтип-постью гешю-ина.енершго эксперимента позволили öu рассматривать этот прием - введение бокса TATAATG - в качестве быстрого метода создании сигнала инициации транскрипции перед практически любим клонировашшм в кольцевом двутякевом вектора геном.

В этих экспериментах били использована 29- и 27-üEemiuo олпгонук-леотидн-мутагепн. В первом случае в результате мутагенеза (двухнрьЛ-мерний вариант метода), направляемого 29-звенш олигонуклеотидом, била , запланирована деления 2 п.о. и встраивание 9 п.о., что долию било привести к удалешга из полшп.ишора плаа.идц pIID-OOI-14-II сайтов рест-рикщш Sali и PatI с одаовремэншм встраиванием уникального сайта рес-трякции Bglll и последовательности TATAATG (см.рис.2). В случае га нс-пользовапкя 27-зв<з!:;юго олигонуклеотида pAAACAATAGATCTATATAATGACATTAA ("р27") в ходе мутагенеза по трехпраймерному варианту метода предполагалось делегировать в плазмиде pHD-OOI-14-II в области "левее" полилинкера фрагмент размером ¡33 п.о. при одновременной вставке 7 п.о. При этом в мутантной плазмиде перед gal-опороиом тагам долкен бил сформироваться бокс Прибноу и уникальный саЯг рестрикции Bglll:

бокс Прибноу gal-оперон

5'~.. .ATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAfiATC'fÄiÄÄÜACATTAAG.. .l'AATGGAGCG..

------ i____i

-ЗЕ-область ПуШ

ва1-оперон

РзИ Н1п(11^1 (базовый сайт)

.. сааттсссоссоатссстссас6тосайсс1асст^аатссасссааттатсасаоттстсс... .. стамсбссссстАсасАбс ...

5'-

Sall

1. Рестриктаза HlndlII

2. Экзонуклеаза III

3. Гибридизация с:

бокс Прибноу

pGGGATCCGTCGAGATd?ATAAT¿CAGCCA И CATAATTCGCTCCATTA

Wl Гр29"} Г)7"}

4. ДНК-лигаза

ТСТАТ AG Aä

pCGGATCCGTCGA tgcagccmgcttaatggagcgaattatgagagttctg^...

. cttaagggcccctággcágct асстсссйссмтсстссстгаатас gg

5. ДНК-полимераза фага Т4 + ДШ-лигаза

6. ДНК-полимераза I E.colI Т. ДНК-лигаза

бокс Прибноу HindiII BstEII

.ggggatccgtcga^tcíat^tócagcc ..

.cccctäggcägctctägätättäcgtcggrä ..

I_I

..BglII

Рис.2. Схема экспресс-метода генерации промоторного сигнала перед клонированным геном на примере модификации полилинкерной области промотор-тестирующей плазмида рНБ-ОСИ-14-11. Показана структура исходной плазмида в области полилинкера (мутируемая область), основного промежуточного гетеродуплекса, конечной целевой мутантной плазмиды и использованных синтетических олигонуклеотидов "р29" и "17". Обозначены сайты рестрикции, бокс Прибноу и начало gal-oпepoнa.

Как в первом, так и во втором случаях о результатах мутагенеза можно судить, проводя скрининг клонов с рекомбинантннми плазмидами по фенотипу и по данным их рестриктного анализа. В качестве нефосфорилировзн-

ного адаптера в обоих случаях использовали 17-звещшЯ одагоиук<"еотид (см.рис.2), а при конструировании 59-звенпой делении применяли еще л IQ-зветщй Б'-фосфорилированный олигонуклеотид-адаптер pCCTGCAGCCA.

По описашюй схеме были получены смеси рекомбштнтпых плазмид (включая целевые мутанты), которые прямо использовали для трансформации шташа E.colt F165*(gal~). Получе1шые трансформантн шсеволп на твердый агар МакКонки с ампициллином и галактозой. При этом на пвдика-торной среде в обоих типах экспериментов формировались п бледно-розовые, и ярко-малиновые колонии. Причем доли колоний малиновой скра-ски состаач.и.и: при мутагенезе с 29-звеншм праймером (двухпраймершй вариант метода) - до 95%; при мутагенезе с 27-звеншм праймерсм (трех-гсрапмершй вариант метода) - до 81Ж. Наличие же таких ярко-окрашиных колоний прямо свидетельствовало об эффективной экспрессии плазмидного Еа1-оперона, что в свою очередь могло быть обусловлено только появлением в плазмидах целевых мутаций, формирующих бокс Прибноу, а с ним и зигнал инициации транскрипции в этом районе ДНК.

Присутствие целевых плазмидных мутаций в "малиновых" клонах было адполнительно подтверждено дашшми рестрштного анализа. Все образцу хлазмид из них (а проанализировано на отсутствие SalI-саЯта, появление BglII-сайта и сохранение базового HindIII-сайта било более согни кло-юв) показали наличие сочетания рестриктазных сайтов, характерного для ъланировавшихся мутаций. Напротив, все неокрашенные или слабоокрашен-ше колошш, содержали плазмиды с "неправильным" сочетанием рестриктазных сайтов: это либо исходные плазмиды, либо побочные неидентифици-ювашше продукты мутагенеза. Секвешфование областей введения целевых «утаций методом Максама-Гилберта в нескольких образцах плазмид из интенсивно окрашенных колоний полностью подтвердило соответствие их ;труктур запланированным при мутагенезе (рис.3).

Таким образом, в представленных экспериментах по окраске колоний жазалось возможным определять выход целевых мутантов статистически юстаточно надежно (на чашках были получены многие тысячи колоний). В ©следующих описываемых ниже опытах по мутагенезу анализировалось го->аздо меньше клонов. Однако в целом, результаты этих экспериментов овпали с оценкам! выхода мутантов при использовании предлагаемой нами хемы, сделанными из рассмотренных выше, многократно повторензшх опы-ов по встраиванию бокса Прибноу в плазмиду pHD-001-14-11. Это около 5% для двухлраймерного варианта метода и около 80% для трехпраймерно-о варианта метода.

сот е мо т

ййхй:.::.-

I:

т

Ат

I1

¿С

аа с°

А°

А

ч

Т'

т

А ■ а А С С

т о с с-

л«

к &

к

1 гал

ЛТ

лс фО

д А Ат

¿Т

<-АТ

У

АС

к

А

А-

С С 0) + + +

Л А С

е с г + * +

С А Л С

"б"

I

Ал °р

ЛГ

.ур

т

Од

«А

с

рТ

к

Ад

ф

А5 а

СГ р-1

Ш;.3. Секвонировшшс методом Ыаксама-Рилберта: а) 32Р-мочегсгагс БсоШ/Вз1;Е11-(1раг?,:анта мутантной плазгада, полученной в ходе встршша-ыая бокса Прнбаоу в полилинкер плазмнда р1П)-001-14-11; б) 32Р-ПЦР-ко ЕШ участка мутантной пдазкида, содержащей вставку бокса Прлбноу и де-лещш Б9 п.о.; в) Э2Р-ПЦР-коши участка мутантной плазмвди с А/Т -> С/( зеыоной в полшамсорв; г) Э2Р-ПЦР-коши участка мутантной плазмвди с< встаской тершштора транскрипции фага 1с1. Вверху обозначены реакци: расцепления оснований: "б" - 0,01 Ы диметипсульфат, 20°С, 1 г/т', "А+С - 50% муравьиная клслэта, 60°С, 1 мин; "А+С" - 1,2 М НаОН, 90°С, 11 и; "С+1И - 60Х водны« гидразин, 37°С, 2 мин; "Т" - 0,3 м.4 перманга нот калия, 20°С, 2 кйщ. Буквы слева - читаемая последовательность нук леотидов. Прямыми скобками показа™ структуры целевых вставок; стрел кой обозначено место точечной замены А/Т ■» С/С.

1\

в

Как било откачено визе, экспроссия пласкпдннх gal-опвромов

бнть удовлетворительно объяснена только формированном сигналов нлпцяа-щш транскр:шщш на базе образующихся в районах целевых мутоцпЯ боксов Прибноу. Для более строгого доказательства формирования upo?,моторного сигнала именно в районе введешюго в ходе мутагенеза бокса Прпбноу ;ли ;.:етодом SI-картнровапия определили расположение точки ипицпашп транскрипции gal-onepona в случае мутантной ДНК, содоргацеЯ бокс Прибноу в районе полшпшкера. Она оказалась располокогаюП но совсем обычно (синтез мРНК накатается со второй позиции бокса Прибноу):

транскрипция

TTTCGTCTTC/LAGMTTCCCGGGOATCCGTCGAGArCTAÍMTGCAGCCAAGCTTAATGGAGCGAAT __ i_i i_

-35-область бокс Прибноу gal-оперон -

Такое расположение не характерно для природных промоторов, однако в случае искусственных наблюдалось пестнократно, что объясняет влиянием на позицию точку инициации транскрипции, погашо бокса Прибноу, участков, флапкирущих эту последовательность, и, в частности, -05-oíl области. Отметим тагсхе, что в рассматриваемой плазмидэ, как впрочем и у другой полученной мутантной плазиидн с боксом Прибноу (см. структур"! вниз), структура ДНИ в области "-G5-.ro пуклоотпда" (отсчет от бокса Прибноу - "-10-й области" формального просторного сигнала) весьма далека от канонической TTGACA.

Таким образом, из получешых дагашх следует, что появло:п:э промо-торного сигнала в районе кнеерции обусловлено образование!! послодова-тельности TATA АТС, тек как в бликайших ое о1фестностях нот каких-либо иных структур, характерных для прокариоттеских промоторов. Подобий аффект - функционирование промотора при отсутствии близкой к канонической структуры в "-35-Í1" области, - в литературе описан. На данной этапе исследований транскрипции в E.coll молю, 'по-видимому, считать бокс Прибноу последовательностью, наличия которой в ДИК вполне достаточно для формирования промоторного сигнала, а фданкирупдпэ ее участки лимь вспомогательным! элементами, влияющими на регуляцию промотора И' расположение точки инициации транскрипции. Если это так, последовательность ТЛТЛЛТО будет всегда, независимо от окружения, обеспечивать формирование в рекомбшантной ДНК более или менее сильного промоторного сигнала, что в сочетании с предлагаемым в настоящеЯ работе эффективным способом ее встраивания в плазмвди монет составить неплохой зк-

спрвсс-метод создания достаточно аффективного искусственного промотор-ного сигала для транскрипции в E.coli клонированных фрагментов ДНК.

Кроме рассмотренного выше исследования бокса Прибноу, мы провели серию экспериментов по дизайну самой плазмидо pHD-OQI-14-II. Так, дву-хпраймершш способом, на базе того ке HlndIII-сайта на расстоянии 4 п.о. от него с помощь» декануклеотида pCCTGCGOCCA ("рЮНБ", выделено "ыутантное" звено) в полилинкер этой плазмида была введена точечная мутация:"замена пары А/Т на С/С,- приведшая к элиминированию одного из двух Pstl-сайтов рестрикции (второй - в середине гена р-лактамазы). Эффективность мутагенеза оценивали по данным рестркктного анализа му-тировавшихся и клонированных плазмид (исчезновение Pstl-сайта и сохранение базового HindIII-сайта). В этом эксперименте выход мутантов составил 92ï. Наличие целевой нуклеотидной замены в одной из отобранных ыутантннх плазмид подтверждено секвенированием (рис.3).

2. Новая технология клонирования одиотяяешх по лшг/клеотидов

в плазоддах

Стандартный путь клонирования генов основан на получении фрагмента ДНК в виде дуплекса, который далее соединяют с векторной ДНК. Значительно сократить объем олигонуклеотидного синтеза, можно, если клонировать не двутяжевой, а однотяжевой фрагмент ДНК. С этой точки зре-шт нам казалось целесообразным попробовать применить разрабатываемый пами способ конструирования мутаций для клонирования искусственных од-нотяжевых фрагментов ДНК. Опробование такого подхода мы провели при клонировании fd-терминатора в плазмиде pHD-OOI-14-II, а такие 63-, 76-и 91-звешшх синтетических полинуклеотидов в плазмиде pUCI9.

Клонирование тершшатора транскрипции фага Id в плазаиде pHD-COI-14-II. Ранее отмечалось, что плазмида pHD-OOI-14-II позволяет тестировать встроенные в район полилинкера фрагменты ДНК на промотор-ную активность. Основной зке ее недостаток - щимчие в области, предшествующей gal-оперону, последовательностей, способ!шх очень слабо, но все же фенотипически детектируемо инициировать его транскрипцию. Это не позволяет использовать ее при изучении слабых промоторов. Для улучшения промотор-тестирущих свойств плазмида нами было выполнено встраивание в нее "слева" от полилшшера терминатора транскрипции фага id, что сводит к минимуму остаточную фоновую экспрессию gal-onepona.

Клонирование íd-терминатора осуществляли с помощью полученного методом асимметричной ПЦР 51-звбнного полинуклеотида-мутагена (рис.4). Известно, что клонирование ПЦР-продуктов обычными методами сопряжено

5'-

8та1 Н1л(1111 (базовый сайт)

.стсттсмсааи6С^^ ..

.САОЛАСТТСтАССССССС^ ...

1. Рестриктаза ШпсЛП

2. ДНК-полимераза фага Т4 (в отсутствие 2 сШТР)

3. Гибридизация с:

Ср51").

рССТССАСССА ("рЮ") ii САТЛАТГСССГССАТТА ("17")

4. ДНК-лигаза

1соттиссасссг 8гаа1

Ь(ХЛАа ттгтг1 рСССССТТТССТС ТТСААСАЛТТССС

■н

рССТССАСССААССТТАЛТСв...

.ТССТСССССАААССАО—ААСТТСТТЛАСССССССТАСССАССТССАССТСССТТСОАЛИАСС...

3'-

5'-

5. ДНК-полимераза фага Т4 + ДНК-лигаза

6. ДНК-полимераза I Е.соИ

7. ДНК-лигаза

Бта!

... ТОСТСССССЛЛЛССЛС'Ш'СССЛааААЛЛССТСаСЛЛААЛЛЛЛАаТТСТТААССаССССТАСКС...

3'- 1-:-'

Гй-терминатор

Рис.4. Схема встраивания Гй-терминатора в плазмиду р1Ш-001-14-П. Показана структура исходной плазмиды в области полилшжера (мутиру-емая область), основного промежуточного гетеродуплекса, конечной целевой мутантной плазмиды (выделена 26-звенная вставка) и использованных олиго- и полинуклеотидов ("р51", "рЮ" и "17"). Отчеркнуты сайты рестрикции и М-терминатор. Дополнительное звено в полйиукле-отиде-мутагене, возможно образовавшееся в ходе | получения его еето-дом асимметричной ПЦР, обозначено "1Г.

о значительными трудностям!, обусловленными свойством Taq-ДHK-I:oлгмэ - , разы присоединять в ПЦР-дуплексе дополнительш1е 3'-концевые звенья. В олучае клонирования продуктов ПЦР по предлагаемой в данной работе технологии проблем« дополнительного некомплементарного матрице 3'-звена в полинуклеогиде-мутагене не существует: они должны полностью выщеплять-ся на стадии достройки гетеродуплекса Т4-ДНК-полймеразой.

Коиструкрозеше мутантной ДНК и клонирование проводили в стандартных условиях по трехпрайшрной схеме. Анализ плазмидных ДНК клонов на присутствие целевой вставки выполняли с использованном метода ЩР: по злоктро<|.оретической нодвииюсти продуктов ПЦР, получешшх на ДНК различных произвольно выбранных клонов, ыокно било судить о наличии в их пласмидах целевой вставки длиной 26 п.о. и оценить выход мутантов. Среди проанализированных таким образом клонов СГ1% содержали вставку необходимой длины. Длл одного из ыутантпых клонов точное соответствие вставки в плазшщэ запланированной структуре было подтверждено секве-нированием (рис.З). Заметим такие, что при встраивании 51-звешюго ПЦР-продукта 01*0 3'-конец перекрывал в гетеродуплексе половину Saal-сайта. В результата рестриктного анализа большого числа клонированных мутантних плазмвд, содержавши ПЩ-вставку, не было обнаружено ни одного нарупания Smal-сайта. Таким образом, было экспериментально подтверждено, что дополнительное нокошлемэнтарное матрице 3*-концевоэ звено однотякевого ПЦР-продукта действительно не оказывает заметного влияния на точность (нот побочного мутагенеза в районе вставки) и эффективность (67%-иый выход) его встраивания в плазмлду.

1Слопировак2е «пггетичзетих полшгуклеотидоа в плазивде pUC19. Создаю» систем вектор-хозяин для эффективной экспрессии белков - одно из важнейших направлений современной генетической инженерии и биотехнологии. В лаборатории химии нуклеиновых кислот к;*2.одри ХПС химфака МГУ ведутся исследовашшя, направленные на создание эффективней и ушшер-сальной векторной системы для экспрессии в E.coli любых чужеродных белков, в том числе таких сверхтоксичных, как грибкоые рибонуклеазы. В рамках этих исследований нами было проведено конструирование нового плазмидаого вектора на основе мультикопийной плазмиды pUC19, содержащего все необходимые регуляторные элементы для эффективной экспрессии клонированных генов белков. Такими элементами „били: терморегулируемый Pj-промотор фага X, терминатор транскрипции фага Т7, а также усиливающая экспрессию бежа часть лидерной последовательности гена 10 фага Т7, содержавшая участок связывания с рибосомой и ATG-ишщиа торный кодов. Формирование всех этих регуляторшх элементов в ппазмиде pUOI 9 осуществляли путем последовательного клонирования трех полинуклеоти-дов: pAACAGCTATGACCAAAAAACCGCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGCTGATTACGGCA ("рбЗ"); pCTAGAGTCGACCTATCTCTGGOGCiTGT'TGACATAAATACCACTGGCCGTGATACTGAGC-ACATAATACGACTCACT -("рТ6") и pCT^GAGTGGACCTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTAG-ШТАА1ЧтаТТШСтААСМ<!САСАТА1ЧтЗС(нр91"),- получешшх 1фямым хши-

'¡оскта сш1тозоп. Само ::e клонирование проводила по предлагаемой в пас-тояг.еП работе схеме мутагенеза, с использованием адаптерах олигопук-леотядов ATGACCATGATTACGCCA ("18R") ц ÎGCAGGCATGCA C12L"):

н шт I

"рбЗ"+"12Ь"

НШП1

—гг-р

HindiII I

=ПЗ=

"p91"+"18R"

HtndIII P-^J_

-он

HtndIII l

"р7б"+"18П" +"p12L"

_ P_f?_

HtndIII

HtndIII

-L-ZJ-

Эф^ективность встраивания синтетических полкнуклеотидов контролировали на каадои этапе рестрикции анализом плазмяд ¡слотов. Наличие в мутанте целевоЯ вставки определяли по уменьшении электрофоретической подвллно-сти в геле включающего всю мутируемуо область фрагмента исходной плаз-мндо (малый РтиИ-Фратаент ). По денннм такого анализа встраивание 63-и 91-звешшх полинуклеотидов по двухпраймерной схеме мутагенеза проходило с весьма bucokimi выхода?® целевых клонов - до 85%. Клонировшше 76-зЕешюго полинуклеотида по трехпрайморяой схеме также проило успешно: выход целевых мутантов составил 642. Для одного из конечных му-тантпых клонов точное соответствие вставок в плазмиде ее зеплапзровап-ноЯ структуре бил^ подтверждено секвепированием (рпс.б).

•■•со,

jjACACQ

.GGCGG ATACT,

ATACG,

;0

¿ТОЛСТ

^AGQGA,

,QA1'CXa A

G

'ATAAÏr

лстатд,

СИ Д G

i í: • ' .л

и fi i

г,' И п »-i

и i

$ ■ 4

ре

V h г. ?

G Д Ï С

AÛQ.

Р;:с,Б. Секвенировакко дидззокси-методом Сзнгера окрестностей Н1п(Ш1-сг.йта [области встраивания шгациаторннх сигналов ("а") и терглшатора ("б")] в конечной мутантной плазмиде, полученной на база рЧС19. Вворку обозначены колонки блогагровки звеньев. Буквы слева - читаемая последовательность нуклеотидов. Прямыми скобками показа-'ш структуры целевых вставок.

fia подробно рассмотрели как сам предлагаемый метод, так и конкретные эксперименты, в которых он- был успешно использован. Описания всех сконструированных в настоящей работе мутаций приведет в таблице:

й J3 п/п Вектор ПраПмеры Тип мутации Расстояние от базового сайта рестрикции Число проанализированных клонов Выход цэ-ЛОШХ 1.5У- тонтов

I. piíD-001 --14-11 "p29" "IT" вставка 9 и делеция 2 П.О. 8 п.о. 100 до 95%

2. piro-001 - —14—II "pIO!ID" „17„ точечная замена А/Т - й/С 4 п.о. 24

3. plffl-001 --14-И "p27" "p1.0" "17" вставка 7 и деления 59 П.О. 82 п.о. 120 OIS

4. pHD-001-—14—11 "p51" "p10" "17" вставка 26 и.о. 3S п.о. 48 675

5. pUC19 "p63" . "12L" вставка 38 п.о. II п.о. 83 89S

в. pUOl 9 "p91" "18R" вставка 67 и.о. II п.о. . 95 895

7. pUG19/ /63Ь91 "p76" "p12L" "16R" вставка 50 и.о. 65 п.о. 48 645

Эти материал! позволяют констатировать: выход мутантов фактичесга! но зависит от типа конструируемой мутации и природы ¿лутагеппого npaihepa, а определяется, главным образом, выбором схемы мутагенеза. При использовании трехпраймерной схемы молено получать целевые мутанта с выходами 60-80', тогда как упрощенный двухпраЛмерный вариант способен поддергивать их на уровне 90-95S.

Отметим также еще одну важную особенность предлагаемого метода: псе итапн нашей схемы целиком базируются на хорошо отработанных, сиро-ко известных и даже рутшпшх приемах генетической инженерии, а, слздо-вательно, надежно воспроизводимы, легко контролируем п пе требую? специальной подготовки пользователя.

Наконец, сада процедура конструировашш мутаций описатшум способом не требует использования каких-либо специальных плазцпд или цтам-иов клеток-хозяев. Это открывает возможность широкого использования ее в направленной мутагенеза практически любых двутяЕОвих кольцевых вак-торних конструкций для трансформации любых клеток про- и эукарнот.

В заключение необходимо сделать несколько общих замечаний относительно предлагаемой методики проводзшя мутагенеза на плазмпдах. Накопленный экспершанталышй материал позволил в основном стандартизировать (оптимизировать) псе зтапи копструирова1ШЯ мутаций. Однако, в отделышх случаях го^юьна ее небольшие изменения (упрощения). Так, последняя ста.ция - обработка ДКК-лигазой после' шиг-трансляшл - из приводит, как правило, и зсмзтнэму росту выхода целевых мутантов и в большинстве простых случаев шахт бить пропущена. Более того, и стадии ник-трансляцки могшо "рошшзоиать" £п vivo после введения гетеродуп-лзкспях ДНК в клетку. Однако й атом случае, высокий выход мутантов будет сохраняться только тогд:;, когда нелигируемый разрыв и мутируемая область в гетеродуплексе находятся достаточно близко.

Десятикратный мольный избыток каждого праймера на стадии гибридизации оказался оптимальшш, к упи.'.нчекле его не приводит к росту выхода целевых мутантов. В то ко время в некоторых экспериментах били получены достаточно высоте (>6QS) ыгхода и при трехкратной избытке олн-гонуклеотида-ыутагена.

Для достижения олпсапгшх влооких выходов мутагенеза необходимо всегда использовать ецсокоочищзшшз препараты исходной кольцевой кова-лентно замкнутой плазмидиой ДНЯ. Тем не менее, предлагаемая схема мутагенеза неплохо работает и на почти совсем неочкцешшх препаратах ДНК, выделенных, напри?,юр, щелочным вкснресс-методом. Выходи целевых мутантов подают при отсм примерно в два раза (с 95% до 45-502).

выводи

1. Разработан новый достаточно ушшерсалышй метод направляемого олигоиуюшотвдами мутагенеза на двутякевых кольцевых векторах. Оптими-знронана методика получения отим путем мутаций в плазмидах с выходам до Í)5X. Экспериментально подтверждена высокая эффективность метода для проведения направленного мутагенеза любого типа (замены пар основажй, короткие и протяженные делеции и вставки) в области базового сайта рестрикции, охватывающей по крайней мере сотни пар оснований.

2. Показано, что разработанные 1фиемл мутагенеза эффективны также

II в качестве своеобразного способа точного встраивания и клонирования протяженных однотяжевых полинуклеотидов, получаемых путем прямого химического синтеза или методом поли.меразиых цепных реакций.

3. Па базе известного приема ник-трансляции разработан способ «химико-ферментативной» селекции in vitro целевых генно-ипженерпых конструкций, который может быть использован в экспериментах по избирательному воздействию на одну из цепей двутяжевой ДНК.

4. Предложен быстрый и экономный способ введения про-моторного сигнала для транскрипции клонированных генов путем встраивании последовательности TATAATG (бокс Прибноу) в окрестности одного из рестриктазиых сайтов клонирования.

5. Проведена реконструкция плазмиды pIID-001-14-11: введен id-терминатор для блокирования синтеза паразитных мРПК в промотор-тсстирующе.м районе. С помощью 63-, 7(5-и 91-знойных синтетических полинуклеотидов в плазмиду pUC19 встроены фрагменты ДНК общей длиной 155. п. о. с набором регуляторпых элементов для экспрессии генов. -

Список публикации по теме диссертации

1. Б. Л. Друца, П. Р. Каберднн. Универсальный метол олигоиуклеотпд-иого мутагемела па илазмпдах/'/Вссс. конф. «Ноиыс направления з биотехнологии»: Тез. докл.—Пущино, 1988, е. 93—96.

2. В. Л. Друца, R. Р. Кабердип. Способ получения направленных мутации к двунптевых кольцевых плазмидннх ДНК.'/А. с. СССР Л'? 1517315.

3. V. L. Driitsa, Y. R. Kaberdin. Simple approach for oligonucleotide-directcd mutagenesis of any double stranded circular DNA//FHBS Lett., 1991. v. 283, Л» 2, p. 227—229.

4. V. L. Drutsa, V. R. Kaberdin. General method for site-directed mutagenesis and cloning of synthetic single-stranded DMA in circular vectors /

Internal. Syrnp. «Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical applications: Abstracts. Moscow, USSR June 23—30, 1991, p. 87. ' ■

5. В. Л. Друца, В. P. Кабердип, О. Н. Королепа. Простой путь введения сигнала инициации транскрипции и векторные ДНК//Биоорган, химия, 1991, т. 17, М> 7, с. 915 -952.

6. В. Л. Друца, В. Р. Кабердип, О. Н. Королева, И. А. Шилов. Эффективный метод направленного взсдсния мутации в плазмиды и клонирования однотяжевых фрагментов ДНК'/Биооргаи. химия, 1991, т. 17, Л» 11, с. 1487—1493.

Заказ 853 Объем 1,0 п. л. Тираж 100

Типография МХТИ имени Д. И- Менделеева