Новый эффективный метод направляемого олигонуклеотидами сайт-специфического мутагенеза на плазмидных векторах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Трудового Красного Знамени и ордена Октябрьской Революции государственный университет им. Д\. В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИ« ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 377.214.42 + 577.213.3 + 577.113.0

КАБЕРДИН ВЛАДИМИР РОДИСЛАВОВИЧ

НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД НАПРАВЛЯЕМОГО 0ЛНГ9НШЕ0ЩАМИ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА НА ПШЩНЫХ ВЕКТОРАХ

02.00.10 — Биоорганическап химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сонсканне ученой степени кандидата химических наук

Москва —1091

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова..

Научные руководители: доктор химических на-• ук, профессор 3. А. Шабарова; кандидат химических наук, старшим научный сотрудник В. Л. Друца.

Официальные оппоненты: доктор химических наук О. Г. Чахмахчева; доктор биологических наук Ю. Л. Дорохов.

Ведущая организация — ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, корпорация «Фарминдустрия».

Зашита состоится ¡МЬ Л 1991 г.

в /С часов на заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «Л», аудитория Щ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

стая ирдкаггп.стшгд РАБОШ

¿иууалъносгь тт. Висслшй соврег-лзшша уровень развития б;;осрга-нической хюлш и шлеиудкрпоА Сиодопш во i.sofch обусловлен успехами п исследовании нуклеппошх кислот. Так, п настоядвв рре«а ют бистро п аффективно клоьяровать ivm »430- it ъглхр:.or, копструкрошть спзццаяп-аироватшо плазмздкиэ н tnrotiiía not'ropj, асувисгашигь дйзайи rníica балков и т.д. Рекашп uttu. задач перазриша связыю с применением тодов генетической шarate ргл. К числу tckiu. методов относится м на-правляеьшП олигонук.чооттими сгЛт-спощфиес^а иутагепез, ■ благодпрч г.оторому удается цеяеиянравленна и с шеокой &|[ектавцсстью ttiociríb iiEMfiiiemia в «уклеотидпуп последовательность исслэдуешй ДШС.

Наиболее ^ектгагаш считаглсл мзтодн сайт-спещф1Ч8сцого мутагенеза на однотяжс-вих ДЖ шиегвдинх фагов. До си пор конструировшпгэ мутантшх генов, как правило, предполагало слодувдув посладоватолъ-кость операций: клонирован «а '¡утируемого фрагмента гена в фаговой ,ЩИ, проведений мутагенеза, закеиа в виспрвссирувдем векторе фрагмента ДНЯ "дикого" типа фрагментом, но сущим целевую мутащт. Гораздо удобнее [проводить мутагенез непосредственно на илазшдах, составляющие основу практически всех векторов, предназначенных для онспрвссиз. Однако, несмотря на то, что в литоретуро описало несколько методов, позволяйся в чпетннх случая1' конструировать мутации в дбугяезвцх векторах, Еффэгс-пгвноЯ и достаточно универсальной схем« мутагенеза, СазнругцеПся пэ относительно простой тэхшпее эксперимента, до cinc пор не существует. D связи с этим задача поиска новнх подходов к конструирование нутаций представляется в настоящее ьрэня достатошо актуальной.

Цель работы. Диссертация посвящена разработке новой достаточно универсальной схема ньлрапленного мутагоноза на плазмидних векторах, которая обеспечивает высокий ьнход цолешх мутантов к максимально сокращает время i! материалы, необходимо для нровэдонля эксперимента.

Паутаав новизна а ппэкт<л2сг.кгт. аиачгаюсть. В рзбото продлокеца и проверена на различких объектах новая схака направляемого олигопуклэа-тидами мутагенеза на дпугяжевих векторах. С иомоцш мутагенного и одного (или двух) вспомогательных праймеров катод позволяет с высокой эффективностью генерировать мутации в окрестностях уникального сайта рестрикции иутаруешй ДЖ. При этом в ходе конструирования мутантной ЩЖ один из вспомогательных праймеров сдуют псевдозатравкой длл Д1П'-юлимеразя I lE.coli, которая осуществляет процесс так називпемоЯ innt--трэиеллцпи, используя в качестве матриц»! искусственно подученную му-

тангпую цепь. Пнк-трансллция и данном случао составляет основу спо;;т; -ельной система химического отбора, благодаря ¡соторой достигается шсо-icitii (60-50%) шход мутантов.

Нолучошше экспериментальные дзчщю свидетельствуют о том, что используешй подход может быть с успехом применен не только для метагенеза, но и длл клонирования прогжешшх полгахуклеотидов длиной 60-90 звеньев. На примере клонирования терминатора транскрипции фага id проиллюстрирована принципиальная возможность точного встраивать этюд методом в векторное Л К полинуклеотидов, получаемых в ходе полшзразной цвгаюА реакции.

С точки зрения практического применения достоинствами дшшого ыотода являются использование достушшх и недорогих реактивов и оборудования, а такие возмоямость получения высоких выходов мутантов (при относительно простой технике генно-гак;енерного эксперимента) в случао практически любих двутк'гавих векторов и пга:<ж>в клеток-хозяев.

Апробация рабс-iu. Материал: диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пущнно, 1983; Ызвдународном симпозиуме "Синтетические одлгонуклеотвдц: нроблеш и границы практического использования", Москва, 1уЭ1.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ. Структура ра5о-*и. Диссертационная работа состоит из введения, трах глав, выводов н списка литературу,

D первой главе обобщены п критически рассмотрена шзщиэся в литературе дашшо iij методам направляемого олнгонуклеотидами сайт--споцуфлчсского мутагенеза на двутяявщц вокторах.

Вторая глава посвящена обсуздондо полученных автором научных результатов по разработке нового метода сайт-специфического мутагенеза на плазмщцш. векторах,

В третьей главе содержатся сведения о реактивах, материалах, оборудовании и методиках, использованных в диссертационной работе.

СОДЕРЖА! ES ГАЛОШ В настоящей работе предлагается новая схема введения мутаций (замен нуклеотидов, дэдэщй hjui вставок) в окрестности любого уникального сайта рестриащи цродеЕодыюП кольцевой двутякевой ДНК (рис.1).

Вначадэ цоходтая ДЗП; расщепляется в уникальном сайте эвдоиуилеа-зой рестрвквда и эатен обрабатывается экзонуклеазой III (или Т4-ЛЗЖ-полшеразой С ртсутеткяа трмфосфатов) тал, чтобы с обоих концов линеаризованного вакторг» освободились доста'гочяо протяженные однотяжевио

двутяташх кольцевдх ДШС.

участки. Далэе слздует гибридизация с тремя о.игону1иаотидг.мя: мутагеном, ксмплемзнтарннм (за исключением участка ссэдашш мутощт) одному из однатяпзшх участков линеаризованного вектора, и адаптера!,а, полностью комплементарными ого концам. В качества пугигена могут внету-пать однотяжвце фрагмбнтн природных ДНК, синтетикеcíalo олагонуклеоти-да, или однотяхевио иолинуклеотидц, получению, например, с пемещьи техники полимеразшх цепных реакций. Мутагешшй праймер и комплементарный той цега синтетический одигонуклеотиД-адаптер. должки иметь фосфатную группу на 5'-конце, второй да синтетический олигонуклеотид-адаптер не должен иметь концевого фосфата. Структуру З'-кокцевих участков обоих адаптеров подбирают так, чтобы поело гибридизации концц линеаризованного вектора можно было Си снова соединить ДНК-лигазой с восстановлением исходного сайта рестрикции.

На следующем этапе полученный гибрид замыкают в кольцо ДНК-лигазой и затем достраивают его Кленовским фрагментом ДНК-полимерази I E.colt (или Т4-ДИК-полимеразой) в присутствии всех дезоксинуклеозид-

тркфосфатсш, гАТР п ЛЗК-ллгазу. ОсиошоП продукт прсд^оствунщпз: маш-пудяцгй - кольцевой гэтеродуплзкс с разрывом в одного из тякэЛ и игру-Ез1шзм двойной спирали в области мутагоноза. Гплчсм целевая ("[.¡утапг-пая") структура встроена в ковалэптно зомкнутнй тя;; ДНК, а неходкая ("дикого типа") структура -,в тяг; с искусственным разрывом, распохо-г.:эш"ш в направлении 3'+5* па относительно шбольяом расстоянии.

Обработай полученной гетеродуплоксной конструкции (поело удаления ферментов, работавших на предыдущей стадии) ДНК-полшоразой. I В.colt приводит к так называемой реакции "шгк-трансляцш". ДНК-полимераза I IL col i а ходе этой реакции осуществляет деградация и одновремеииу» достройку кемутаруемой цегп: на матрица цепи со встроенном олигонунлеоти-дом-мутагеном, используя в качестве псевдозатравки встроенный v ЯШ Еафосфораифоващшй олнгонуклеотид. После прохождения форлентом района шкомшкыеитарности образуется ЛИК, обе цепи icoTopoít в области мутагоноза будут иметь запланированную структуру. Таим образом, папа схема, за счзт своеобразной "хшико-фзрмзитатившй" селекции In vitro, в принципе допускает возможность генерирования мутаций с выхода!,® до IOQS.

Б общем случае рассматриваемый метод мутагенеза предполагает кс-пэльзоианЕз одного ¡vsi нескольких мутагв1пых н двух вспомогательная крайкзров. Однако, если мутируют участок, близкий к базовому сайту рэстрикцж;, функции одного из вспомогателышх праймзров кокет выполнять Ii сам оллгонуклеотид-ыутагеп (двухлраЯмерный вариант метода).

Экспериментальную проверку предлокешой схог.и мутагенеза в разли-45ÜIX ее вариантах и оптидизащш условий гешю-гатазнерного эксперимента |.ы попнталлсь осуществить при pccereai конкретных генио -ишганерних задач - дазайне промотор-тостируюдай шазмцда pIID-OOI-14-II и создании на oci'.om мультнкопкйной плазмндн pUGI9 базового вектора дня экспрессии в Е.соИ сворхтоксячншс белков типа грибковых рибонуклэаз.

I. Ковотруирсвакка цутвцяЗ d плазшда pHD-COI-14-II

В перша экспериментах но разработка повой схемп конструирования глутоций в качестве основного объекта мутагепэза наш била шбрана штзквда píID—001 -14-11. Сконструированная на базе плазмиди pBR322, она содержит гол устойчивости к еьвещшувшу к гопактозный опарон E.coli, црошторная часть которого заменена шлавпнкером из фага MIOrnpS. Если в шшзкнду перед gal-опэрошм встроить фрагмонт ДИК, обладавший промо-торной активностью и использовать в качество хозяина нтамм E.coli с нарукзшюО работой gal-oiiepona (например, PI65'), то клопы с рекомби-пантной плазтэдой шзшо отбирать на индикаторной среде МакКонки-агора

по ярко-малиновой окраске их колоний. Вначале tax поткадась па ociioeq прздлокешюй схемы конструирования мутаций разработать cnccoö Ca строго встраивания сигнала тгацнащш транскрипции и векторшо ДШС.

Как известно из литературу, d качества такого сигнала могут выступать, например, короткие ia-14-звошшо сшггогаческш фрагмента ЛШ, содерхагдаз последовательность TATAATG (Сохе Прибцоу). ¡'s. пстрмтанш и щккютор-тестфукщий вектор pltD-OOl-M-11 приводят н появления ярко-шражшной проштсриой активности в области mtcopuuu. Эти зкепормзп-П1, а танкэ последние дапшо по irenpaпленисну мутагенезу -254! области прокерпотичоекпх прокоторсв позве 'Шит рассматривать последовательность Прабпоу в качества ключевого э.-ешита два форшровпшм в ДЛИ сигнала инициации транскрипции. Опираясь на атн данше, ш попытались ишдцш-ровать транскршшда gai -оторона плаь>я«Х1 pHÛ-001 -14-11 путем встраивания последовательности l'ATAATG в область, придшествукцу» gal-onspouy. Подтверждение в наших йкспоркшптах предположения о возмозяшети функционирования бокса Прпбноу в достаточно сильно варьируемом неканоническом окружении как мшшпромотора с сочетании с писакой аф&зКтаз-ность» генло-гаш-нерього эксперимента позволили би расс-мятр'шэть этот прием - введение бокса TATAAÏ'C - в качества с'истрого катода соидстм сигнала гагациапш транскрипция перед практически любим клоахроввшшм в кольцевом двутяжевоч векторе гзпем.

В этих эксперч'лэптаг. бит кеиолъэоваш 29- и 27-пигипнэ олигопук-лоотидц-мутагвш. В первом случае в результате мутагенез« (двуглр?л1-марннИ вариант метода), направляемого 29-звешм оллгонуклоотвдом, била запланирована делецня 2 п.о. и встраивание 9 и.о., что до .паю сило привести к удалению из полилгапсера плакшадц pHD-ÛOI-14-II сайтов рестрикции Sali и Fstl с одзговремотпм встраиванием уникального сайта рестрикции BglII и последовательности TATAATG (см.рис.2). В случае ш использования 27-звэгогого олигонуклеотида pAMCAATAGATCTATATAATGAOATTM ("р27") в ходе мутагенеза по трехлрай,тарному варианту метода предполагалось делетировать в ппазмвде рШ)-001~14-П в области "левее" поли-лшкеера фрагмент размером 59 п.о. при однорременной вставке 7 п.о. При а то» в мутанткой плаьшщв перед gal-отроксм такае должен бил сформироваться бокс Прибноу и лшкалъннй ca!îv рестрикции liglll:

бокс Прибноу gai-опарой

5 . .ATCTAmAGAAAAA'FAAACAAATAn.'iTekTÄACAmAC.. .ÎAAÎG6AGCG... .

-Зб-облпсть

5' 3'

gal-оперон

Pstl Hlndlil (базовый сайт)

... GMMCCCGGGG ATCCGTCGAC ...

.. ctöiÄGGGCCCCMGGCÄGCT^ ...

_ i_i

Sali

t. Рестриктаза Hlndlil

2. Экзонуклеаза III

3. Гибридизация с:

бокс ПриОноу

pGGGATCCGTCGAGArcÍATMT¿CAGCCA и CATAATTCGCTCCATTA ^[ (-Р29-) ("17")

4. ЛНК-лигаза

ТСГАТ

Áq дА

pGGCATCCGTCGA TCCAGCCMGCTrAATGG AGCGAATTATGAGAGrTCTGG...

.CTTAAGGGCÓCÓTÁGGCAGCT ACGTCGGCTCGÄÄräÄCCTCGcräÄÄTÄC

GG

5. ДНК-полимераза фага Т4 + ДНК-лигаза

6. ДНК-полимераза I E.coli

7. ДНК-лигаза

бокс Прибноу HindiII BstEII

.GGGGATCCGTCGAaTCifAm^ ..

. CCCCTAGGCAGCicMM^^ ..

i_i

JBglII

Ряс.2. Схема экспресс-мотода генерации промоторного сигнала перед клонированным геном на примере модификации полилинкерной области промотор-тестирукщей плазмида рШМХИ-14-11. Показана структура исходной плаз?,ища в области полилинкера (мугируемая область), основного промекуточиого гетеродуилекса, конечной целевой мутантной плазмида и использованных синтетических, олигонуклеотидов "р29" и "17". Обозначена сайты рестрикции, бокс Прибноу и начало ®а1-оперона.

Как в первом, так и во втором случаях о результатах мутагенеза можно судить, провода скрининг клонов с рекомОинантнимя плазмидами но фенотипу и по данным их рестриктиого анализа. В качестве нефосфорилирован-

ного адаптера в обоих случаях использовали 17-звешшй олигонуклеотид (см.рис.2), а при конструировании 59-звенной делении применяли еще и Ю-зввншй Б' -фосфорилированшй олигонуклёотид-адаптер pCCTGCAGCCA.

По описанной схеме были получены смеси рекомбинанткых плазмид (включая целевые мутанты), которые прямо использовали для трансформации штамма E.coll F165'(gal-). Полученные трансформан ты высевали на твердый агар МакКонки с ампициллином и галактозой. При этом на индикаторной среде в обоих типах экспериментов формировались и бледно-розовые, и ярко-малиновые колонии. Причем доли колоний малиновой окраски составляли: при мутагенезе с 29-звенным праймером (двухлраймерннй вариант метода) - до 95Ж; при мутагенезе с 27-звенным праймером (трех-праймерннй вариант метода) - до 81$. Наличие ха таких ярко-окрашенных колоний прямо свидетельствовало об эф$ектавной экспрессии плазмидного gal-оперона, что в свою очередь могло быть обусловлено только появлением в плазмидах целевых мутаций, формирующих бокс Прибноу, а с ним и сигнал инициации транскрипции в этом районе ДНК.

Присутствие целевых плазмидных мутаций в "малиновых" клонах, было дополнительно подтверждено данными рестриктного анализа. Все образца цлазмвд из них (а проанализировано на отсутствие Sail-сайта, появление BglII-сайта и сохранение базового HindIII-сайта было более сотни клопов) показали наличие сочетания рестриктазных сайтов, характерного для планировавшихся мутаций. Напротив, все неокрашенные или слабоокрашен-яые колонии, содержали плазмидо с "неправильным" сочетанием рестряк-газных сайтов: это либо исходные плазмвды, либо побочные неидентифици-рованные продукты мутагенеза. Секвенирование областей введения целевых «утаций методом Максама-Гялберта в нескольких образцах плазмид из интенсивно окрашенных колоний полностью подтвердило соответствие их структур запланированным при мутагенезе (рис.3).

Таким образом, в представленных экспериментах по окраске колоний оказалось возможным определять выход целевых мутантов статистически достаточно надежно (на чашках были получены многие тысячи колоний). В тоследущих описываемых ниже опытах по мутагенезу анализировалось го-заздо меньше клонов. Однако в целом, результаты этих экспериментов совпали с оценками выхода мутантов при использовании предлагаемой нами ;хемы, сделанными из рассмотренных выше, многократно повторенных опытов по встраиванию бокса Прибноу в плазмиду pHD-001-14-11. Это около )5% для двухпраймерного варианта метода и около 80% для трехпраймерно->о варианта метода.

ост

С А А С I

ОСТ •Н+ С ДАО Т

К

¿с ,,

т4 •

т ,

л !'

V

а > о г ? и • а ¡4. ■

С

?ч'.

Л

ь

ас

Ар ^

к

<

I

а£ а!

А А

А—

"б"

*0 Сф

СС

«о

А1 С«

АЛ АА

аа

4

$

\ ?с

Рас.З. Секввнарованне методом Каксама-Гилберта: а) 32Р-м8Чзшюгс ЕсоШ/Вз1Е11-фрагшнта мутантной плазмида, полученной в ходе встршша-шя бокса Прибиоу в иолшшнкер плазмидц рШ)-001-Н-11; б) э2Р-ПЦР-ко-хеш участка мутантной плазмидц, содержащей вставку бокса Прибноу и де-лоция 59 и.о.; в) 32Р-ВДР-котш участка мутантной плазмиди с А/Т -» С/< заменой в шшлаккере; г) -32Р-ПЦР-когош участка мутантной илазмида с< вставкой терданагора транскрипции фага М. Вверху обозначены реакцш расцепления оснований: "В" - 0,01 I! дидатилсульфат, 20°С, 1 шн; "А+С - 50» муравьиная кислота, 60°С, 1 мин; "А+С" - 1,2 Ы ИаОН, 90°с, И кия; "С+1" - 60Я бодщЗ гидразин, 37°С, 2 мин; "Т" - 0,3 мМ перманга нат калия, 20°С, 2 май. Буквы слева - читаемая последовательность нук Леонидов. Прямыми скобками показаны структуры целевых вставок; стрел кой обозначено место точечной замены А/Т -» О/С.

к

\Е-

>4 ".и , Л

У|

Как било отмечено вше, экспрессия плазкидных gal-оперонов мокет быть удовлетворительно объяснена только форг.трозанием сигналов инициации транскршицгл на базе образующихся в районах целевнх мутаций боксов Пркбноу. Для более строгого доказательства формирования промоторпого сигнала именно в районе введенного в ходе мутагенеза бокса Прибноу га из то дом SI-картировэшя определили расположение точки инициации тралс-кр1шцш1 gal-onepona в случае мутантной ДНК, содержащей бокс Прибноу в районе полилшкера. Она оказалась располокогаюй не совсем обкчно (синтез мР1Ж начинается со второй позиции бокса Прибноу):

транскрипция

TTTCGTCTrOAAGAAmCCGGGGATCCGTCGAGATCriiMTGCAGCCAAGCTTAATGGAGCGAAT

__I_I I_

-35-область бокс Пркбноу gal-оперсн.

Такое расположение не характерно для природных промоторов, однако в случае искусственных наблюдалось неоднократно, что объясняют влиянием на позицию точки инициации транскрипция, помимо бокса Прибпоу, участков, фланкируодих эту последовательность, и, в частности, -35-ой области. Отметим также, что в рассматриваемой плазмвде, как спрочом и у другой полученной мутантной плазмидн с боксом Прибноу (см. структур-:! вшэ), структура ДНК в области "-35-го щпслеотида" (отсчет от бокса Прибноу - "-10-й области" формального промоторпого сигнала) весьма далека от канонической TTGACA.

Таким образогл, из полученных дашшх следует, что появление промоторпого сигнала в районе инсэрции обусловлено образованием последовательности TATAATG, так как в Слипавших ео окрестностях нот каких-либо иных структур, характерной для прокариотических промоторов. Подобный зффект - функционирование промотора при отсутствии близкой к канонической структура в "-35-й" области, - в литературе описан. На данном этапе исследований транскрипции в E.coll можно,'по-видимому, считать бокс Прибноу последовательностью, наличия которой в ДНК вполне достаточно для формирования промоторпого сигнала, а флашшрущиэ ее участки лишь вспомогательными элементами, влияющими на регуляцию промотора И' расположение точки инициации транскрипции. Если это так, последовательность TATAATG будет всегда, независимо от окружения, обеспечивать формирование в рекомбинантной ДНК более или Менее сильного просторного сигнала, что в сочетании с предлагаемым в настоящей работе эффективным способом ее встраивания в плазмидн мотет составить неплохой ак-

спресс-ыетод создания достаточно эффективного искусственного промотор-ного сигала для транскрипции в E.coli клонированных фрагментов ДНК.

Кроме рассмотренного вше исследования бокса Прибноу, мы провели серию экспериментов по дизайну самой плазмида pHD-OOI-14-II. Так, дву-хпраймерным способом, на базе того хе HtndlII-сайта на расстоянии 4 п.о. от него с помощью декануклеотвда pCCTGCCGCCA ("pIQHD", выделено "мутантное" звено) в полилинкер этой плазмида была введена точечная мутация:" замена пары А/Т на G/С,- приведшая к элиминированию одного из двух Pstl-сайтов рестрикции (второй - в середине гена ß-лактамазы). Эффективность мутагенеза оценивали по данным рестриктного анализа му-тировавшихся и клонированных плазмид (исчезновение Pstl-сайта и сохранение базового HlnlIII-сайта). В атом эксперименте выход мутантов составил 92%. Наличие целевой нуклеотидаой замены в одаой из отобранных мутантных плазмид подтверждено секвенированием (рис.3).

2. Новая технология клонирования однотяжевых полинуклеотндов

в плазшдах

Стандартный путь клонирования. генов основан на получении фрагмента ДНК в виде дуплекса, который далее соединяют с векторной ДНК. Значительно сократить объем олигонуклеотидного синтеза, можно, если клонировать не дву тяже вой, а однотяжевой фрагмент ДНК. С этой точки зрения нам казалось целесообразным попробовать применить разрабатываемый наш способ конструирования мутаций для клонирования искусственных од-нотялевых фрагментов ДНК. Опробование такого подхода мы провели при клонировании id-терминатора в плазмида pHD-OOI-14-II, а также 63-, 76-и 91-звенных синтетических полинуклеотидов в плазмиде pUCI9.

Клонирование терминатора транскрипции фага id в плазкиде pHD-QOI-14-II. Ранее отмечалось, что плазмида pHD-OOI-14-II позволяет тестировать встроенные в район полилинкера фрагменты ДНК на промотор-ную активность. Основной же ее недостаток - наличие в области, предшествующей gal-оперону, последовательностей, способных очень слабо, но все же фенотипически детектируемо инициировать его транскрипцию. Это не позволяет использовать ее при изучении слабых промоторов. Для улучшения промотор-тестируодих свойств плазмиды нами было выполнено встраивание в нее "слева" от полилинкера терминатора транскрипции фага fd, что сводит к минимуму остаточную фоновую экспрессию gal-оперонэ.

Клонирование fd-терминатора осуществляли с помощью полученного методом асимметричной ПЦР 51-звбнного полинуклеотида-мутагена (рис.4). Известно, что клонирование ПЦР-продуктов обычными методами сопряжено

5»_ Smal Hlndlll (базовый сайт)

.. .GTCTTCMGAmicCCGiaATCCGTCGM ..

... GÄGMGCTGiTAÄGGGCGCGTAGGGÄGGTGG^ ...

3'-

1. Рестриктаза Hüidlll

2. ДНК-полимераза фага Т4 (в отсутствие 2 dNTP)

3. Гибридизация с: preccCTTrcGTcmerarrccrmmwAHCTiTm™ ("psi • ).

pCCTGCAGCCA ("pi0") и CATAATTCGCTCCATTA ("17")

4. ДНК-лигаза

jCCTTTTCGACCGj, SmaI

СССААД ГТТИТ

pCGCCCTETCGTC TTCAAGAATTCCCH pCCTGCAGCCAAGCTTAATGG...

...TGCTCCGGGAAAGCAG—AAGTTCTTAAGGGCCCCTAGGCAGCrGGACGTCGGTTCGAATTACO...

3' -

5. ДНК-полимераза фага Г4 + ДНК-лигаза

6. ДНК-полимераза I E.coli

7. ДНК-лигаза Smal

... ACijAGGCCCTTTCGTCAMGGCTCCT^ ...

... TGCTCCGGGÄMGC ACTraCCGAGGAAM^ ...

.-:-:-'

fd-термииатор

Рис.4. Схема встраивания fd-терминатора в плазмиду pHD-00I-I4-II. Показана структура исходной плазмида в области полилинкера (мутиру-емая область), основного промежуточного гетеродуплекса, конечной целевой мутаптной плгчмвды (выделена 26-звенная вставка) н использованных олиго- и полшуклеотидов ("p5I", "pIQ" и "17"). Отчеркнута сайта рестрикции и fd-терминатор. Дополнительное звено в полинзгкдаэ-отиде-мутагене, возможно образовавшееся в ходе i получения его методом асимметричной ПЦР, обозначено "iV\

со значительними трудностями, обусловленными свойством Taq-ДШ-полкмэ-. рази присоединять в ПНР-дуплексе дополнительные З'-концеше звенья. В случае клонирования продуктов ПЦР по предлагаемой в панной работа технологии проблема дополнительного некомплементарного матрице З'-звопа в нолинуклоотиде-мутагене не существует: ошт долим полностью гицеплять-оя на стадии достройки гетеродуплекса Т4-ДНН-полнмеразоЯ.

Конструирований путантной ДНК и клонирование проводили в стандартных условиях по трехпрайшрной схема. Анализ илазмидных ДНК клонов ка присутствие целевой вставки выполняли с использованием метода ГЩР: по электрофоретической подвижности продуктов ПЦР, получешшх. на ДНК различных произвольно выбранных, клоков, мошо било судить о наличии в их плазгащах целевой вставки длшюй 26 и.о. и оценить выход мутантов. Среди проанализированных таким образом клонов 67% содержали вставку необходимой длины. Дня одного из мутанпшх клонов точное соответствие вставки в ллазшде запланированной структуре было подтверждено секве-шфовашем (рис.3). Замотим там», что при встраивании 51-зветюго ЩР-продукта его 3'-конец терекривал в гетородушшксе половину Биа1-сайта. В результате рестриктиого анализа большого числа клонированиях мутантаых шшзмвд, соде ржавит ВДР-вставку. не было обнаружено 1Ш одного норувения Бпа1-сайта. Таким образом, било экспериментально подтверждено, что дополнительное некомплементарное матрица 3'-концевое звено однотжэвого ПЦР-продукга действительно но оказывает заметного влияния на точность (нет побочного мутагенеза в районе вставки) и эффективность (67?ь-ный касод) его встраивания в илазмиду.

Юкяшрование синтетических псыкшгклзотгАОв с шшзцвде р1Ю19. Создание систем вектор-хозяин для эффективной экспрессии белков - одно из вазшейшх направлений современной генетической инзкенэрии и биотехнологии. В лаборатории химия нуклеиновых кислот кафедры ХПС химфака МГУ ведутся исследовашшя, направленные на создание эффективной и универсальной векторной системы для экспрессии, в Е.соИ любых чужеродных белков, в том числе таких сверхтоксичшх, как грибковые рибонуклеази. В рамках этих исследований нами было проведено конструирование нового плазмидного вектора на основе мультихопийной плазмида рШМЭ, содержащего все необходимые регуляторнне элементы для эффективной экспрессии клонированных генов белков. Такими элементами »были: терморегулируемый Р^-промотор фага к, терминатор транскрипции фага ТТ, а также усиливающая экспрессию белка честь лвдерной последовательности гена 10 фага 77, содержавшая участок связывания с рибосомой л АТС-инициаторный ко-дон. 4оршровачие всех этих рэгуляторшх элементов в шазмпде рЯ019 осуществляли путем последовательного клонирования трех шшшуклоотл-дов: рАЛОАССТАТСАССАААААЛССССТСАЛаАССССТтаСЛаСССССААССССПСАТ-ГАСаОСх^ (>:,3" ); рСа'ЛаАОТСГ.АООТАТСТСТССССаТС'ХТаАСЛТААЛТАССАО'ТСаОСОТСАТАСТСАаС-АСАТДАТАСОАСТСШ ("р'Гб" ) и рХггХ&аа'ОаАССТШЛСОАСТСАСЖАТАа&ЗАСАТСЖАС-ШУМПШт-итЧШииСЛ№АШСС(*р91получешшх 1флшм хиш~

чо стог.! сшпозом. Само яо клонирование проводила по предлагаемой в пас-толпой работе схеме мутагенеза, с попользованном адвптерних олигонун-леотидоп АТСЛССЛШТГАСаоСА (Я18Н") П ТССАСССЛТССЛ ("12Ь"):

ншт I

"рбЗ'Ч"12У

ишт

-25—Р

мыт I

"р91"+"18Н"

ншт

-он

ншт I

"ртб'ч-'^а" - Р_'

-ОН

ншт

ЗКякпгоность встраивания синтетических полппукдеотидов контролировала на каэдом этапе рестрихтшм анализом плаггс!Д плодов. Наличие в мутанте целевой вставки определяли по уменьяешп элзктрофоретической подвизпо-сти в геле включающего всю мутяруекув область фрагмента исходной плаз-мадц (малый РтоП-фрэгмент). По данным такого анализа встраивание 63-н 91-звешшх полинуклеотидов по двухпраймеряой схеме мутагене па проходило с весьма высокими выходами целевых ¡слонов - до 892. Клонирование 76-звенного полинуклеотида по трехпраЯмэрной схеме таккэ проало успеа-ио: выход целевых мутантов составил 6455. Для одного из конечных му-тантшх клонов точное соответствие вставок в плазздцв ее ЗЕПЛйНкровшг-ной структуре билг подтверэдеш секвешрованием (рис.5).

ЬрАСД-Сй

■ •■ }ОТСтОи

'оотсг^

дАЯАСЛ0 ^АССАд

ейосаоа

3А5АСТП

А1ГАСО

.50АСТ

.^Аааад, ^ТААТ,

^тхтсаг

Л

0лаалла

с:

.00

0 1' А Г»

1 .{Ц СЪ^О

-и • * *• н 1

- И

: « п " 1 ..{г 1

. ""Г,

«М] Т^ Ь-

С Л 2 О

2 .. С 2

Рка,5, Секвенировашо дадезокси -методом Статора окрестностей Н1МШ-сайта {области встраивания ишцпаторних сигналов ("а") и терьашотора ("б")] в конечной ыутантйой плазмаде, полученной на база рис19. Вверху о'бозпачзнн колошей блокировки звеньев. Буквы слева - читаемая последовательность нуклеотидов. Прямыми скобками показа' нн структуры целевых вставок.

Ыы подробно рассмотрели как сам предлагаемый метод, так и конкретные эксперименты, в которых он был успешно использован. Описахшя всех сконструированных в настоящей работа мутаций приведены в таблице:

Н

й 8 п/п Взкгор ПраКмери Т!Ш муттрш Расстояние от базового сайта рэст-раищш Число про-анализиро-вашшх клонов Еиход цэ- ловпх глу— таптоп

1 _ рШ)-001 --14-11 "р29" -"17" вставка 9 и деления 2 п. о. 8 п.о. 180 до 953

2. р!Ш-001 --14-11 "рШШ" "17" точечная замена А/Т - С/С 4 п.о. 24 92%

3. р!Ш-001 --14-11 "р27" "р1.0" "17" вставка 7 и дэлецил 59 п.о. 82 п.о. 120 812

4. Р1Ш-001--14-П "р51" "р10" "17" вставка 26 п.о. 36 п.о. 48 67й

5. рис 19 "рбЗ" "121." встаЕка 38 п.о. II п.о. 35 893

6. рИ019 "р91 " ")8 П" вставка 67 п.о. II п.о. . 9в 85$

7. рис19/ /63 4-91 "р76" "р12Ь" вставка 50 п.о. 65 п.о. 48 64?

Эти материалы позволяют констапгровать: выход мутантов фактически пе зависит от типа конструируемой мутации и природа ^мутагенного праА'.сра, а определяется, главным образом, вибором схемы мутагенеза. При использовании трехпраймерной схемы можно получать целевые мутанты с выхода:® 60-80', тогда как упрощенный двухпраймэрнцй вариант способен поддоргся-вать их на уровне 90-953.

отметим такие еце одну вакную осоСешюсть предлагаемого метода: рое итятш нашей схемы целиком базируются на хорошо отработанных, скро-к.о известных и даке рутгаяшх приемах генетической инженерии, а, следовательно, наделаю воспроизводимы, легко контролируемы п не требуют специальной подготовки пользователя.

Наконец, сама процедура конструирования мутащй описшгазм способе!,! не требует использования каких-либо специальных плазшд или в теинов клеток-хозяев. .Это откриаает возможность широкого использования ее в, направленном мутагенеза практически лиОых двутякевих кольцевых векторных конструкция для тршЗДормацци любых клеток про- п зукаркот.

В заключение шобхо^мо сделать несколько общих замечаний относительно предлагаемой мэтедшш проведения мутагенеза на плазнидах. Накопленный зкспер;шецгадышп материал позволил в основном стандартизировать (оптимизировать) все отапы конструирования мутаций. Ода а:-: о, в отдельных случаях tosmokíü ее небольшие изменения (упразднил). Так, последняя стадия - обработка ДЩС-лыгазой после ник-трансляции - ие приводит, как правило, к заметному росту выхода целевых мутантов и в большшетве простых случаев монет быть пропущена. Более того, н стадию пик-трансляции мошо "реализовать" irt vivo после введения гетеродуп-лексных ДНК в клетку. Однако в отоы случае, высокий выход иутантов будет сохраняться только тогда, когда нелигируемый разрыв и мутируемая область в гетеродуплексе находятся достаточно б.пизко.

Десятикратный мольный избыток каадого праймвра на стадии гибридизации оказался оптимальным, И увеличение его не приводит к росту выхода целевых мутантов. В то i:o время в некоторых экспериментах били получены достаточно высокие (>60%) выхода и при трехкратной избытке оли-гонуклеотида-мутагена.

Для достижения описанных pucoraiz выходов мутагенеза кообходиш всегда использовать внсокоочшцешше препараты исходной кольцевой кова-лентно замкнутой плазшщной ДНК. Тем не менее, предлагаемая схема мутагенеза неплохо работает и на почти повеем неочищетшх препаратах ДНК, выделенных, например; щелочным эвдпресс-методом. Выхода целевых

мутантов подают при этом примерно в дьу раза (с 95% до 45-502).

*

ВЫВОДУ

1. Разработан новый достаточно универсальный метод направляемого олигонуклеотвдами мутагенеза на двутякевых кольцевых векторах. Оптимн-знроиана методика получения этим путем мутаций в плазмидах с выходами до 9S2. Экспо риле нтально подтверждена высокая эффективность метода для проведения направленного мутагенэза любого типа (замены пар оснований, короткие и протяженные делещш и вставки) в области базового сайта рестрикции, охватывающей по крайней мере сотни пар основшшй.

2. Показано, что разработанные приемы мутагенеза эффективны такле

и в качестве своеобразного способа точного встраивания и клонирования протяжённых однотяжевых полинуклеотидов, получаемых путем прямого химического синтеза или методом полнмеразных ценных реакций.

3. На базе известного приема ник-трлнеляции разработан способ «химико-ферментативном» селекции in vitro целевых гснно-ннженерных конструкции, который может быть использовал в экспериментах по избирательному воздействию на одну из пепси двутяжевои ДНК.

4. Предложен быстрый и экономный способ введения про-моторного сигнала для транскрипции клонированных генов путем встраивания последовательности TATAATG (бокс Прибноу) в окрестности одного из рсстрнктазных сайтов клонирования.

5. Проведена реконструкция плазмиды pHD-001-14-11: введем id-терминатор для блокирования синтеза паразитных мРПК в промотор-тестиругошем районе. С помощью 63-, 7(i-н 91-звенных синтетических полинуклеотидов в нлазмиду pUC19 встроены фрагменты ДНК общей длиной ]55. и. о. с набором регуляторных элементов для экспрессии генов.

Список публикации по теме диссертации

1. В. Л. Друца, В. Р. Кабердин. Универсальный метод олнгопуклеотид-ного мутагенеза на нла.чмидах'/Вссс. конф. «Новые направления г. биотехнологии»: Тез. докл.—Пуишно, 1988, с. 95—96.

2. В. Л. Друца, Pj. Р. Кабердин. Способ получения направленных мутации п диуннтеннх кольцевых п.тазмндных ДНК//А. с. СССР JS's 154/315.

3. У. L. Drulsa, У. R, Kaberdin. Simple approach for oli<,'oiuicleolidc-direcfed mutagenesis of any double stranded circular D\'A//FEBS Lett., 1991, v. 283, .\o 2, p. 227—229.

4. V. L. Drutsa, У. R. Kaberdin. General method For site-directed mutagenesis and cloning of synthetic single-stranded DNA in circular vectors'/ .

internal. Symp. «Synthetic oligonucleotides', problems and frontiers o[ practical application»: Abstracts. Moscow, USSR, June 23—30, 1991, p. 87.

5. В. Л. Друца, В. P. Кабердлп, О. H. Королева. Простой путь, введения сигнала инициации транскрипции в векторные ДНК//Биоорган. химия, 1991, т. 17, Ла 7, с. 915 -952.

6. В. Л. Друца, В. Р. Кабердин, О. Н. Королева, И. А. Ши.тон. Эффективный метод направленного мведепия мутаций в плазмиды и клонирования одногяжеиых фрагментов ДНК/'/Биоорган. химия, 1991, т. 17, № 11, с. 1487—1493.

Заказ 853 Объем 1,0 п. л. Тираж 100

Типография МХТИ имени Д. И. Менделеева

ктм: