Определение энтальпий ферментативного гидролиза некоторых эфиров ортофосфорной кислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

РГ6 Ом На правах рукописи

/. £ СЕН Экз.№_

УДК 541.11+577.150.3

ТИЩЕНКО Светлана Анатольевна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТАЛЬПИЙ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА НЕКОТОРЫХ ЭФИРОВ ОРТОФОСФОРНОЙ кислоты

02.00.04 — физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Экз. №_

УДК 541.11+577.150.3

ТИЩЕНКО Светлана Анатольевна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТАЛЬПИЙ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА НЕКОТОРЫХ ЭФИРОВ ОРТОФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ

02.00.04 — физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в лаборатории термохимии кафедры физической химии Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель

доктор химических наук ведущий научный сотрудник Чухрай Елена Сеиеновна

Официальные оппоненты

доктор химических наук профессор НИЦТИВ ОИВГ РАН Леонидов Владишр Яковлевич

доктор химических наук ведущий научный сотрудник ИХФ им. Н.Н.Семенова РАН Мирошниченко Евгений Александрович

Ведущая организация: НИИ Химии при Нижегородском

Государственном Университете

Защита диссертации состоится " 3" -[ 993 года в часов

на заседании диссертационного совета Д-053.05.44 по химическим наукам при МГУ им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, ауд. 334

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "О" пШ1Т£5рХ 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук О/^С^к?рам ~~ М.С.Бобилева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Диссертация является частью систематических исследований,посвященных изучению термохимии ферментативных реакций, которые проводятся в лаборатории термохимии им. проф.В.Ф.Лугинина Химического факультета МГУ.

Актуальность темы. Термохимическое изучение гидролитических ферментативных реакций представляет не только теоретический но и интерес, практический, поскольку в настоящее время ферменты используются в качестве катализаторов различных'химических процессов, в том числе и реакций гидролиза, что обеспечивает их протекание с высокой селективностью в мягких условиях. Термохимические характеристики для реакций гидролиза ортофосфатов типа модельного субстрата фосфатэз п-нитрофенилфосфата необходимы в медицинской промышленности и в биоаналитической химии, как при разработке новых методов постадий-ного контроля промышленного производства фосфатаз и степени их чистоты, так и в ишуноферментном анализе. Величины энтальпий изученных реакций могут быть использованы также в тонком органическом синтезе при планировании внедрения ферментативных процессов в производство .

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является надежное установление величины энтальпии гидролиза п-нитрофенилфосфата (рИРР), основного модельного субстрата ферментов класса гвдролаз (КФ 3) подкласса фосфатаз (КФ 3.1), а также энтальпий гидролиза

I

других субстратов аденозин - 5 - монофосфата (АМФ-5) и цитидин -5 - монофосфата (ЩЮ-5).

Задачи исследования:1!. Экспериментальное определение величин энтальпий изучаемых реакций и термодинамических параметров ионизации компонентов реакций. 2. Расчеты величин стандартных энтальпий исследуемых реакций и средних значений энтальпий реакций гидролиза ортофосфатов (в расчете на недиссоциированное состояние компонентов). 3- Разработка микрокалориметрических методик определения активности щелочной фосфатазы, и оценки ее субстратной специфичное-

ти. 4. Изучение термостабильности щелочной фосфатазы. 5. Определение концентрации активных центров щелочной фосфатазы с использованием обратимого ингибитора - ортованадата натрия.

Научная новизна работы. Впервые надежно установлена стандартная величина энтальпии гидролиза pNPP двумя независимыми путями на основе определения энтальпии реакции гидролиза щелочной фосфата-зой в щелочной среде и кислой фосфатазой в кислой среде, а также впервые определены энтальпии гидролиза АМФ-5 и ЩМ-5; установлены значения энтальпий ионизации 7 компонентов исследованных реакций (3 из них впервые).

Разработаны микрокалориметрические методики определения активности щелочной фосфатазы и экспресс-оценки субстратной специфичности этого фермента.

Практическая значимость. 'Результаты экспериментальных определений энтальпий реакций гидролиза могут слухигь для термодинамических расчетов оптимальных химико-технологических условий протекания этих реакций, способствовать выявлению новых областей применения этих процессов.

Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены на -IV Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов (Олайне, 1982 г.), XI Всесоюзной конференции по калориметрии и химической термодинамике (Новосибирск, 1986 г.), V и VI Всесоюзной конференции по термодинамике органических соединений (Куйбышев, 1987 г., Минск, 1990 г.).

Публикации. По материалам диссертации имеется 10 публикаций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на /Л> страницах машинописного текста (в том числе 30 таблиц и 24 рисунка) и состоит из введения, 6 глав, включающих литературный обзор, описание установок, экспериментальную часть, обсуждение результатов, основных итогов работы, списка цитируемой литературы из 8g наименований и приложений.

Основное содержание работы.

Во введении обоснованы актуальность, новизна, практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования, определен выбор объектов, кратко изложено содержание диссертации.

В I главе проведен критический анализ имеющихся в литературе данных по термохимии фосфатазных реакций. Показано, что имеющиеся к началу настоящего исследования экспериментальные работы не позволили надежно установить энтальпии рассматриваемых ферментативных реакций.

II глава посвящена описанию михрокалориметрических установок ЛКВ-2107 и ЖБ-2277, относящихся к типу теплопроводящих микрокалориметров с дифференциальным методом измерения; описаны принцип устройства и методики работы.

В III главе представлены результаты определения энтальпии гидролиза рНРР щелочной и кислой фосфатазой, а также энтальпий ионизации компонентов реакции. Приведены расчеты стандартных величин энтальпий реакций гидролиза, а также подтверждена взаимная согласованность полученных экспериментальных данных.

В IV главе приведены результаты определения энтальпий гидролиза 'AMS-5 и ЦМФ-5, включая термодинамические параметры ионизации (pKj, pH-зависимости Д^Н(298,15)) компонентов реакций, а также расчеты стандартных величин энтальпий гидролиза.

У глава посвящена разработке термохимической методики определения активности щелочной фосфатазы как по типичному субстрату pNPP, так и по неорганическому пирофосфату, экспресс-оценке субстратной специфичности щелочной фосфатазы к различным субстратам , для которых при гидролизе зачастую не происходит значительных изменений в спектрах поглощения, в результате чего к их исследовании неприменимы традиционные спектральные методы. Здесь хе приведены результаты исследований процессов термоинактивации и ингибирования ортованадатом щелочной фосфатазы, стабилизированной н-бутанолом, спектрофотометрическим методом.

Обсуждение полученных результатов представлено в главе VI, которая имеет три раздела: в первых двух аргументирована надежность установленных в настоящей работе величин энтальпий гидролиза; в третьем разделе представлены средние величины энтальпий гидролиза основных биологически активных эфиров ортофосфорной кислоты, полученные на основе критического анализа имеющихся литературных данных с использованием определенных наш экспериментальных величин.

Основной текст завершается обобщением результатов работы. I. Характеристики веществ. Аппаратура и иетоды.

В экспериментах использовались препараты ферментов щелочной фосфатазы из кишечника тюленя высокой степени очистки Рижского завода медпрепаратов (АР1), из кишечника цыплят ("Reanal", Венгрия) (АР2), Е coli производства фирмы "P-L Biochemicals" (АРЗ); кислой фосфатазы (Aspegillus Terreus) производства Рижского завода медпрепаратов (АсР). В качество субстратов были использованы pNPP динатриевая соль C6H406NPNa2• 4^0 "Sigma", США; АМФ-5 динатриевая соль CtoH1207N5PNa2'3f^0 "Sigma", США, ЦМ5-5 динатриевая соль CgH12O0N3PNa2'3H2O "Sigma", США, гуанозин-5 -монофосфат (1Ш-5) динатриевая соль C^H^OgN^NagOHjO "P-L Biochemicals", уридин-5 -ыонофосфат (УШ5-5) динатриевая соль CgH110gN2PNa2'3H20 "Р-Ъ Biochemicals" . Кроме того, использовались образцы pNPP,перекристаллизованного многократно из абсолютного этанола, осушенного в вакууме до постоянной массы. Чистота и состав образцов подтверждены данными микроанализа, а также данными жидкостной хроматографии высокого разрешения на колонке "Зорбакс-ГО^" по стандартной методике фирмы "Дюпон".

Термохимические измерения проводили с использованием микрокалориметров ЛКБ-2107 и ЛКБ-2277 "Монитор Биоактивности" (Щвеция) с дифференциальным методом измерений предназначенных для работы при 296,15К. Для экспериментов использовались проточные ячейки, а также титрационная ячейка, сконструированная в лаборатории термохимии для работы совместно с "Монитором Биоактивности" ЛКБ-2277. Правильность

работы микрокалориметрических установок проверяли путем контрольны! определений знтальпий разбавления растворов KCl, энтальпии реакции нейтрализации соляной кислоты гидроксидом натрия, величины которых надежно установлены в литературе; получено хорошее совпадение с литературными данными.

Гидролиз субстратов щелочной фзсфатазой проводили в 0.05М tris-HCl буфере pH 8,50 в микрокалориметре ЛКБ-2277 "Монитор Биоактивности" с титрационной ячейкой. При этом в реакционную ячейку, содержащую 2 мл термостатированного раствора фермента (концентрацией 0,8-0,4 мг/мл) при помощи дозатора вводили с интервалом в 30-40 мин. 0,06-0,12 мл раствора субстрата с концентрацией 15-40 М-10 .Интегральный тепловой эффект фиксировали с помощью записи на потенциометре в условных единицах, которые затем переводили в Дж, используя результаты электрической калибровки калориметра. Концентрации исходного вещества и продукта реакции контролировали спектро-фотометрически при А. 400 нм на приборе "Спекорд М-40". Независимость теплового эффекта от концентрации фермента свидетельствует о полноте протекания реакции. При расчете энтальпий гидролиза учитывали поправку на теплоту разбавления субстрата в 0,05М растворе буфера, определенную экспериментально.

С целью введения корректных поправок на существование различных ионных форм компонентов реакций в растворе нами были экспериментально определены величины энтальпий ионизации компонентов реакций гидролиза. Принцип метода состоял в измерении мощности тепловыделения в результате присоединения протона к протоноакцепгорной группе при значении pH исходного раствора близком к величине рК изучаемой ионогенной группы.Для этой цели использовали микрокалориметры ЛКБ-2107 и ЛКБ-2277 с проточными ячейками. Во всех случаях не наблюдалось зависимости АН^ от концентрации реагента в рассматриваемом интервале и концентрации HCl. Эксперимента показали что, определенные наш значения энтальпий ионизации можно полностью отнести к бесконечно разбавленным растворам. Погрешности для эксперимен-

тальных величин приведены для 95Í доверительного интервала. При расчете погрешностей величин, получаемых с использованием промежуточных величин применялось соотношение

& = /£ ' , где frj - погрешность промежуточной величины.

Определения значений рК° проводили на основе потенциометри-дисс

ческих кривых титрования в термостатируемой ячейке при температурах

20, 25, 30°С для АМФ-5 и 25°С для ЦДО-б (± 0,01°) с использованием

цифрового рН-метра U-120 (Тбилиси). Расчет значений рК выполнял ДИСС

лись по стандартной программе минимизации % . Значения рК полу-

дисс

чили путем экстраполяции зависимости рК от Ур (ц-ионная сила) к нулевому значению Ц.

Для определения активности и субстратной специфичности использовали проточные микрокалориметры ЛКБ-2107-121 и ЛКБ-2277 Эксперименты проводили в 0,05 tris-HCl буфере в присутствии 8'10_AM Mg+2 в качестве активатора щелочной фосфатазы. Концентрация фермента в растворе изменялась в пределах от 1 до 18 мкг/мл.Концентрации субстратов и фермента были выбраны таким образом, чтобы обеспечить строгую пропорциональность мевду интенсивностью тепловыделения в ячейке и концентрацией фермента и субстрата в растворе.

■ Кинетические измерения проводили в кювете двухлучевого регистрирующего спектрофотометра "Chitachi-124" при длине волны 400 нм, что соответствует максимуму поглощения для р№. йнгибирование изучали при температуре 25°С в области рН 8,25 * 10,05 в 0.05М tris-НИ буфере. В качестве активатора использовали раствор MgClg в 0.05М tris'HCl буфере, а в качестве ингибитора Na3V0¿ перекристаллизованный из спирта.

Был изучен процесс инактивации щелочной фосфатазы при 55 и 60°С в оптимуме каталитической активности (рН 9,6) при атом термои-нактивацшо проводили в термостате U-10. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и определяли активность фермента. По этим данным строили кинетические кривые зависимости скорости реакции от времени.

II Определение энтальпии реакция ферментативного гидролиза п-нитрофешлфосфата.

Кинетический механизм ферментативной реакции гидролиза pNPP соответствует схеме

Е + S ^ ES—► Е - Р + HgO —> Е + Р(,

Ч

- где Е - Р - фосфорилированный фермент; Е-фермзнт; S-субстрат (pNPP); Р -первый продукт - pNP, Pj- второй продукт(неорганический фосфат), ES- комплекс Михээлиса Схему реакции гидролиза рКРР можно записать:

02N-^ Ч)-ОРО~2+ Н20 = OgN-^ Ч)-0~+ HP0¡2 + Н+ (1)

O2N-(/_x)-OPO3H" +• н2о о2и-(/_х)-он + Н,Р0~ (2)

*

Искомую величину стандартной ентальпии реакции (1) А Н°

1

определяли по формуле ^

АлН° = ¿Xúf(pH) р«)

где- AjH^tpH)- вклад ионизации каадого компонента, определяемый мольным соотношением ионных форм при данном рН равный: AjH^tpH) = AjH°**10pH-pK Результаты опытов для реакции гидролиза pNPP в 0.05М tris'HCl буфере рН 8,5 приведены в табл 1. Полученная величина AaH°(tris рН 8,5 298,15К) составила -43,2 ± 1,8 кЦж/М;

Для определения энтальпии гидролиза pNPP кислой фосфатазой

* Стандартные величины А^Н0 для всех изученных реакций относятся к строго определенным (полностью ионизированным или недиссоцииро-ванным) формам компонентов реакций в буфере рН 7,0 с энтальпией ионизации равной нулю при 298,15 К.

энтальпия ионизации 1 моля вещества в пересчете к бесконечному разбавлению при 298,15 К.

Таблица 1

Результаты определения енталыши гидролиза pNPP щелочной фосфатазой ¿^ (рН 8,5;298,15)

и п/п тепловыделение концентрация (298,15) кДж/М

^калибр Дх/усл.ед. ^опыт <3 разбавл 9 реакции Дж щелочная фосфатаза мг/мл pNPP (С) ¡л-vf

усл. ед. Дж

1 0,000277 287 0,0796 0,0021 0,0775 0,940* 1,950 -39,7

2 0,000277 160 0,0443 0,0011 0,0432 0,940* 0,975 -44,3

3 0,000277 151 0,0418 0,0011 0,0407 0,940* 0,975 -41,7

4 0,000284 232 0,0660 0,0015 0,0644 0,889* 1,406 -45,8

5 0,000284 421 0,1197 0,0031 0,1166 0,889* 2,811 -41,5

6 0,000284 414 0,1176 0,0031 0,1145 0,889* 2,811 -40,7

7 0,000274 163 0,0446 0,0011 0,0435 4,216** 0,980 -44,4

8 0,000274 299 0,0820 0,0021 0,0799 4,216** 1,960 -40,8

9 0,000274 170 0,0465 0,0011 0,0454 4,216** 0,980 -46,3

10 0,000274 341 0,0933 0,0021 0,0912 4,216** 1,960 -46,5

11- 0,000274 164 0,0450 0,0011 0,0439 2,91** 1,002 -43,8

ч = q - q í

^ре&кц чоп ^разб среднее д^н0'- 3E2g«B!!« , кДж/М -43,2+1,8

* щелочная фосфатаза (Ар1), очищенная, производства Олайне ** щелочная фосфатаза (Ар2), производства Reanal

был такие использован микрокалориметр ЛКБ-2277 "Монитор Биоактивности" с титрационаой ячейкой. Методика определения аналогична вышеизложенной, результаты опытов для реакции гидролиза в 0,05М ацетатном буфере рН 3,0 представлены в табл.2. Полученная величина Дан°(асс рН 3,0; 298.15К) составила -25,9+1,1 кДж/М.

Необходимые для расчета стандартной величины энтальпии гидро-

лиза рНРР (Д^) величины энтальпий ионизации (Д^Н°) аниона Ь^РО рКР и рМРР (реакции 3-5) были определены нами.

Н^ -► Ш~г + Н+ (3)

02,-Он — О^-^-О" + Н+ (4)

( О2Н-(3-ОРО3Н) "-. (О21/-ОРО3 ) ~2+ Н+ (5)

Н Р04 —♦ Е^РО" * Н+ (6)

(Н0СН2)3СГШ3 — (Н0СН2 )3СИН2 + Н+ (7)

Таблица 2

Результаты определения энтальпии гидролиза рМРР кислой фосфатазой АсР'А^, (рН 3,0:298,15)

Л тепловыделение концентрация УС, (298,15) кДж/М

п/п ^калибр Дж/усл.ед. ^опыт Да Ч разбавл Да <\ реакции Дх V мг/мл рМРР (С) м-ю6

1 0,000267 0,0492 0,0020 0,0471 1,729 1,86 -25,4

2 0,000267 0,0407 0,0016 0,0390 1,291 1,49 -26,2

3 0,000279 0,0602 0,0024 0,0573 0,921 2,17 -26,7

4 0,000262 0,0620 0,0025 0,0595 0,936 2,29 -26,0

5 0,000282 0,0690 0,0029 0,0662 0,838 2,65 -25,0

Ч = <1 - Ч < ^реаиц чоп ^разб

среднее А^Н0'* ЯР«»"*" , хДх/Н -25,9 ±1,1

Результаты определения энтальпии ионизации аниона ^РО", приведены в табл.3.

В соответствии с общепринятыми в настоящее время способами

Таблица 3

Результаты определения энтальпии ионизации (А,Н°) иона ^РО' (298,15 К) ^РО" —> НРО^2 + Г

* Мощность Тепловыделения Начальные растворы Скорость протока раствора НС1(К) Д(Н (298,15К) кДх

п/п К калибр у .е/Цвт !? опыт рН концентрация мкМ/г г моль

усл.ед. ЦВт фосфат НС1 час сек-Ю"9 М

1 2,15 26,3 56,5 7,11 100,3 8,23 5,73 13,10 4,31

2 0,634 43,3 27,5 7,11 100,3 4,12 5,73 6,55 4,19

3 0.561 23.4 13.1 6.32 99.6 2.08 5.51 3.18 4.13

4 0,555 46,4 25,8 6,32 99,6 4,16 5,51 6,36 4,05

5 0,630 42,0 26,5 6,38 60,0 4,15 5,75 6,23 4,00

6 0,630 22,0 13,9 7,69 60,0 2,08 5,75 3,32 4,17

7 0,630 42,5 26,8 7,69 60,0 4,15 5,75 6,62 4,04

8 0,560 24,5 13,7 7,10 50,0 2,08 5,80 3,35 4,10

9 0,561 36,0 20,2 7,10 50,0 3,12 5,80 5,02 4,02

10 0,566 23,5 13,3 6,97 30,0 2,08 5,51 3,18 4,18

11 • 0,566 47,0 26,6 6,97 30,0 4,16 5,51 6,36 4,18

V ОПИТ и , кДж/М

среднее 4,14 + 0,12

представления экспериментальных данных и рекомендациями Национального бюро стандартов (США), в вкспериментально полученные величины энтальпии гидролиза р№Р (А^Н^,). используя термодинамические параметры ионизации компонентов (см. реакции (3)- (7), табл.4) были введены поправки на существование различных ионных форм в растворе, в результате чего для реакции (1). получена величина ¿^(298,15), равная 2,1 + 1,9 кДж/М, а для реакции (2) -26,7 ± 1,2 кДж/М

На основании величины энтальпии реакции (1) по закону Гесса

при использованш приведенных вше величин энтальпий ионизации была

Таблица 4

Термодинамические параметры ионизации исходных веществ и продуктов гидролиза рЯРР

ионизация РК( Д(Н°(298,15) источник

Н2Р0^ (3) 6,9 4,14 1 0,12 настоящая работа

pNP (4) 7,1 18,3 ± 0,4 настоящая работа

рКРР (5) 5.4 -7,65 ± 0,20 настоящая работа

V°i (б) 2,1 -7,41 литературные данные

tris-HCl буфер (7) 8,1 -47,48 t 0,03 литературные данные

вычислена энтальпия реакции (2), которая составила -28,0 ± 1,9 кДж/М, что совпадает в пределах погрешности с экспериментально полученной величиной энтальпии гидролиза рЮТ в кислой среде, составляющей -26,7 i 1,2 кДж/М.

Таким образом, впервые в рамках одного исследования определены энтальпии гидролиза р№Р как в щелочной, так и в кислой среде. Взаимная согласованность рассчитанных величин стандартных энтальпий гидролиза свидетельствует о надежности полученных данных.

III Определение энтальпий реакций гидролиза аденозин-5-ыонофосфата и цитидин-5-ионофосфата.

АЮ-5 и ЦМФ-5 являются одними из основных продуктов гидролиза нуклеиновых кислот, который обычно протекает при pH, близких к нейтральным, где вышеуказанные соединения присутствуют в двух ионных формах (с зарядоми -1 и -2). Поэтому надежное установление термодинамических параметров ионизации {Д^Н°и рК|} является не только вспомогательной задачей при определении стандартных величин энтальпий гидролиза, но и само по себе представляет значительный интерес.

В связи с этим, наш были определены Д^Н^рК^и рК°2), рН-зависимости энтальпий ионизации при 298,15К, а также значения

рК° при температурах 20, 25 и 30°С для АМФ-5 и при 25°С для

ДИСС

ЦМФ-5. Ионизация указанных соединений в растворе протекает по следующей схеме:

ЮР03Н" Ь0Р0~2 + Н+ й{Н° (6)

Р^ + ' '

ЬОРОз^ Ь0Р03Н" + Н+ Д(Н° (7)

¿1 ^ где Ь - У4^^' Для АМ&-5 Ь ^ -для Щ№-5

04« ОН М

Определение енталышй ионизации А1№-5 и Ц№-5 проводили на микрокалоримегре ЛКБ-2107-121 с цроточной ячейкой по методике аналогичной описанной выше (см.стр.5 ).

Результаты по определения термодинамических параметров ионизации АЖ-5 и ЦЦФ-5 приведены в табл.5. Экспериментально определенные

Таблица 5

Величины термодинамических параметров ионизации АМФ-5 и ЦМФ-5

соединение температура (град С) ионная среда ентальпю АН?, ионизации 1ж/М Кг

АМФ-5 20 М-=0 3,81 6,37 _ _

II __ И 25 ^=0 3,79 6,54 15,0 ± 0,3 -3,6 ± 0,3

И - » 25 0.05М фос-

фатный бу- 3,81 6,33 - -

фер рН 7,0

»1 _ II 25 0.05М трис 6,39

НС1 буфер 3,8 - -

РН 7,0

II _ И 30 ц=о 3,78 Ь,Ь8 - -

ЦМФ-5 25 Ц=0 4,50 6,46 17,6 ± 1,0 -3,5 £ 0,3

величины внтальпий ионизации составили: для АМФ—5 ДН^(рК^ 3,79)

-1315,0 ± 0,3; А(Н°(рК°t 6,54) -3,6 t 0,11, для Цв-5 Д{Н°(рК^ 4,50) 17,6 ± 1,0; AjH°(pKj 6,46) -3,5 ± 0,3 кДх/М.

Гидролиз АМФ-5 и Utt-5 щелочной фосфатззой проводили в титра-ционной ячейке микрокалориметра ЛКБ-2277 "Монитор Биоактивности" в 0.05М tris-HCl буфере рН 8,5.При указанных условиях энтальпия реакции (8) AgH° (tris рН 8,5; 298,15К) составила:-0,47 ± 0.17 кДж/М для АМФ-5 и -0,86 ± 0,10 кДж/М -для 1ДО-5.

L0P0"2 + HgO —» LO" + Н+ + НР0~г (8) ЪОРОз + н2о —♦ ЪОЯ + HP0¡2 (9)

где L - как в схеме (6)-(7)

Далее были рассчитаны величины стандартных энтальпий гидролиза, которые составили:

а)для полностью ионизированных форм (реакция 8) (А6Н°(29в,15), кДк/М') -1,09 i 0,37 для АМФ-5

-1,48 ± 0,34 для Ц№-5

б)для недиссоциированных форм (реакция 9) (А9Н°(298,15), кДж/М) 2,81 i 0,21 для АМ&-5

3,63 ± 0,16 для Ц№-5 IV. Микрокалориыетрические методики определения активности и субстратной специфичности щелочной фосфатазы.

Принцип метода заключается в измерении величины выделения или поглощения теплоты в реакционном растворе, находящемся в измерительной ячейке. Метод регистрирует только динамические изменения, поэтому наличие любых количеств различных веществ, не реагирующих мекду собой, не влияет на результат определения активности фермента.

В качестве субстратов при определении активности использовались pNPP, а также неорганический шрофосфат, в качестве ферментов АР1 и АРЗ.

Пример калибровочного графика, с помощью которого определяется активность фермента по мощности тепловыделения при использовании растворов фермента с известной активностью, представлен на рис.1.

to 13 20 О IE3 мкг/мл

3 4 3 6 СЕЗ мкг/м/1

Рио.1 Зависимость тепловыделения от концентрации фермента при гидролизе: e)pNPP щелочной фосфатазой: g-1 - рН 8,5 [Б] 5*10_¿M (ЛКБ-2277) АР1; о-2- рН 8,0 [S) Э-Ю"3М (ЛКБ-2277) АРЗ;+-2- рН 8,0 [S] З'10"3м (ЛКБ-2107) API; б)Снеорганического пирофосфата: рН 8,0 [S] 5'10_4Ы (ЛКБ-2277) АР1

Нижний предел применимости метода определяется чувствительностью калориметра. В этой связи подчеркнем, что тепловыделение в случае наименьшей исследованной наш концентрации составляло для pNPP -5,4 (1BT-, а для пирофосфата 5.5 Цвт, тогда как чувствительность микрокалориметра ЛКБ-2107-121 составляет 1 цвт, а микрокалориметра ЛКБ-

II н

2277 Монитор Биоактивности - 0,5 (Хвт.

Минимальные концентрации фермента определенные наш представлены ниже (ff-мощность тепловыделения; С^-минимальная концентрация

субстрата(М) pNPP 5-10_í 5-10"3 неорганнич. пирофосфат 5'10-i

rain

фермента(мкг/мл) АР1 4

W(^bt)

5,4

АРЗ

API

0,6

3,5

5,5

Термохимические методы определения активности щелочной фосфа-тазы с использованием pNPP и неорганического пирофосфата в качестве субстратов практически равноценны по чувствительности. Однако, пирофосфат предпочтительнее использовать вследствие его доступности, дешевизны и чистоты. Кроме того, термохимический метод определения активности щелочной фосфатазы с шрофосфатом в качестве субстрата мог бы быть успешно использован при работе с мутными средами, когда обычный спектрофотометрический метод определения активности с рМРР в качестве субстрата нецриыеним.

Помимо определения активности нами предложена термохимическая методика експресс-оценки субстратной специфичности щелочной фосфатазы, для которой целесообразно использовать субстраты с близкими тепловыми эффектами гидролиза. В качестве исследуемых субстратов были избраны АМФ-5, ЩЮ-5, ГМФ-5 и УМФ-5. Эксперименты проводились на установке ЛКБ-2277 "Монитор Биоактивности" с проточными ячейками. Результаты представлены в табл.6, из которой видно, что разница в тепловыделении на 1 моль субстрата минимальна. Тем не менее можно утверждать, что щелочная фосфатаза из кишечника тюленя (АР1) быстрее гидролизует ГМФ-5 и АМФ-5, нежели Щ№-5 и УЮ-5.

Таблица 6

Оценка субстратной специфичности АР1 термохимическим методом в 0,05М tris'KCl буфере рК 8,0; [Mgf2] 8-10_4W; [Е] 14 мкг/мл

Л п/п субстрат концентрация субстрата [SJ М-103 те! калибр (JJBT хловыдел ш ОПЫТ) усл.ед. зние i цВт скор прот г час эсть зка J М-109 мольное тепловыделение го опытн

усл.ед. сек V кДк/М

1 2 3 4 ГМФ-5 АМФ-5 УМ&-5 ЦМФ-5 2,88 3,07 3,67 2,99 0,313 0,313 0,313 0,313 27,0 27,2 21,2 14,8 8,5 8.5 6.6 4,6 5,55 5,55 5,55 5,55 4,44 4,73 5,66 4,61 1,90 1,80 1,17 1,00

V. Определение концентрации активных центров щелочной фосфатазы.

Нами было изучено конкурентное ингибирование щелочной фосфатазы, стабилизированной бутанолом , ортованадатом натрия с целью получения данных о концентрации активных центров фермента.

Константы ингибирования в области рН 8,25 + 10,05 определяли по методу Диксона. Полученные значения К,(константы равновесия ингибитора с ферментом или константы ингибирования) бутанольной щелочной фосфатазы ортованадатом натрия в области рН 8,25 * 10,05 представлены ниже:

рН 8,25 8,5 9,0 9,25 10,05

К/107, и 1,0 1 0,0 20,0 30,0 2,0 Ингибирование имеет оптимум вблизи рН 9,25.

Концентрация активных центров щелочной фосфатазы была определена с помощью кинетического графического метода, предложенного Полтораком О.М., при использовании уравнения :

1 + и. - и

Йи-ио 0 к1 (^¿[Б],) «„-у

где Шо, (Е1о, [Б!о -начальные концентрации ингибитора, фермента и субстрата соответственно

1>о, V, ит- начальная, текущая и предельная скорости реакции при [I] 00

о

К , Кщ, Кд -соответствующие константы равновесия

Численные значения концентрации активных центров щелочной фосфатазы при различных значениях рН и при начальной концентрации фермента равной 0,14 мг/мл приведены ниже: рК 8,25 8,5 9,0 9,25 10,05

[Е1о.10®М ЗИ6 3,68 3,70 3,85 3,66

VI. Изучение териостабильности щелочной фосфатазы.

Был изучен процесс инактивации щелочной фосфатазы при 55 и 60°С в оптимуме каталитической активности (рН 9,6).Пример кинети-

чвских кривых в координатах и(г), УЦТП7 представлен на рис

2(а, б, в). Видно, что они имеют четко выраженные изломы, положение

m —i—

Рис.2 Кинетические кривые термоинактивации стабилизированной н-бутанолом щелочной фос-фатазы в координатах a) v(t); б) /v{t) ; в) Inu(t) при рН 9,6. Начальная концентрация белка [Е] мкМ/мл: 1- 0,77; 2- 1,0; 3- 1,54

о to "'t^uif пь

которых определяется точкой пересечения асимптот к прямолинейным участкам. Такой характер кинетических кривых свидетельствует о том, что процесс деградации стабилизированной бутанолом щелочной фосфа-тазы в растворе происходит по диссоциативному механизму, который включает обратимую диссоциацию фермента на субъединицы с последующей необратимой денатурацией субъединицы по схеме

ft.

1,

2Е.

2Е

ден

(Ю)

ден

где Е^- активная димерная структура белка, Е)- каталитически неактивные субъединицы, Еден~ денатурированный мономер, к., к , к - соответствующие константы скорости.

I "*» ДбВ

Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации стабилизированной бутанолом димерной формы щелочной фосфатазы, рассчитанные по трактовке, предложенной О.Ы.Полгоракоы, представлены

шасе:

Константы Температура, °С

55 60

^ОО4, с"1 1,95 ±0,11 6,86 + 0,26

йден.ю5, о"1 5,5 ± 0,7 11,00 ±0,6

Кдасс'1°6' М 2,07 1 0,29 3,33 4 0,53

Приведенные данные позволяют сделать вывод, что щелочная фос-

фатаза стабилизирована бутанолом в виде активных димеров, распад

которых соответствует предложенной схеме.

ОСНОВНЫЕ итоги и вывода

1) На прецизионных микрокалориметрах ЛКБ (Щвеция) измерены величины энтальпий реакций гидролиза (кДк/моль) при 298,15К рЯРР: Д.Н° (рН

I * | Л-

8,5) -43,2 ± 1,8 №3,0) -25,9 ± 1,1 ; Ш-5: А^Н0 (рН 8,5) -0,47 ± 0,17 ; ДОФ-5: Д^Н0' (рН 8,5) -0,86 ± 0,10 (впервые) и определены энтальпии ионизации всех семи компонентов реакций А^Н°(из них 3 впервые).

2) Для АЫФ-5 и ЦЮ-5 определены величины рК|, и получена экспериментальная зависимость энтальпий ионизации от рН.

3) На основании экспериментальных величин (рН 8,5), Д^Н0 (рН 3,0) и А^Н° рассчитаны значения стандартных энтальпий гидролиза (АгН° , кДж/М) рЫРР 2,1 ± 1,9 (для полностью ионизированных форм); -26,7 ± 1,2 (для гидролиза в кислой среде, идущего до образования п-нитрофенола и аниона Н^О"); взаимная согласованность полученных данных подтверждена расчетами по закону Гесса; АЫФ-5 -1,09 4 0,37 (для полностью ионизированных форм); 2,81 ± 0,21 (для гидролиза идущего до образования аденозина и аниона НРОд ); ЦМФ-5 -1,48 ♦ 0,34 (для полностью ионизированных форм); 3,63 t 0,16 (для гидролиза идущего до образования цитидана и аниона НР0д ).

4) На основе критического анализа литературных данных с использованием полученных нами экспериментальных величин энтальпий гидролиза рассчитаны средние значения энтальпий гидролиза биологически активных эфиров ортофосфорной кислоты, природных соединений: для эфиров,

содержащих два и более остатков ортофосфорной кислоты (АТФ, ГГФ и

др.) 2~Н° , кДж/М -21 ± 3; для циклических 3.5 и 2,3 нуклеотидов 1 дисс

-52,7 и -36,4 соответственно; для нециклических мононуклеотидов и соединений, где ортофосфорная килота связана с остатком углевода

+2'5 ГЯ^е'1«^1

5) Разработаны микрокалориметрические методики определения активности щелочной фосфатазы с использованием в качестве субстратов pNPP и неорганического пирофосфата.

6) Предложена термохимическая методика експресс-оценки субстратной специфичности щелочной фосфатазы.

7)Изучен процесс териоинактивации щелочной фосфатазы при t° 55 и 60°С в оптимуме каталитической активности (рН 9,6). Показано, что процесс термоинактивации удовлетворяет кинетической схеме диссоциативного механизма.

8)Предложен метод определения концентрации активных центров щелочной фосфатазы на примере АР1 с использованием обратимого ингибитора - ортованадата натрия. Изучена зависимость константы ингибирования от рН.

Основное содержание работы излохено в следующих публикациях:

1. -Арене Э.А., Тшценко С.А. Термоинактивация щелочной фосфатазы различных стадий очистки// В сб.: тез.докл. ГУ Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов. Олай-не. 1982. с. 142

2. Веселова М.Н., Чухрай Е.С., Полторак О.М., Тшценко С.А. Конкурентное ингибирование щелочной фосфатазы, стабилизированной бутано-лом, орто-ванадатом натрия// Вестник Моск.ун-та, сер.2, Химия, 1985.-т.26, М2,- с. 161-164.

3. Веселова М.Н., Чухрай Е.С., Полторак О.М., Тищенко С.А. Термоинактивация стабилизированной н-бутанолом щелочной фосфатазы// Вестник Моск. ун-та, сер.2, Химия, 1985.- т.26, Ji4.,-c. 346-349.

4. Рехарский М.В,, Тищенко С.А., Гальченко Г.Л., Вабищевич П.Н., Денисенко А.В., Егоров A.M., Термо,динамические параметры ионизации

t

аденозин-5-монофосфата// В сб.: тез .докл. Н Всесоюзной конференции

по калориметрии и химической термодинамике,-Новосибирск, 1986., -т.2.- с.15-16.

5. Рехарский М.В., Тшценко С.А., Гальченко Г.Л., Арене Э.А., Арене А.К., Егоров A.M., Энтальпии ионизации аниона HgPO", п-нитрофенилфосфата и п-нитрофенола//Вестник Моск.ун-та.,сер2., Химия, 1986,- т.26., Х4,- с.375-378.

6. Рехарский М.В., Тищенко С.А., Гальченко Г.Л., Егоров A.M., Эн-

I

тальпии ионизации и константы диссоциации аденозин-5-монофосфата//Вестник Моск.ун-та, сер.2., Химия, 1988.- т.29, *1 с.46-49.

7. Тищенко С.А., Рехарский М.В., Гальченко Г.Л., Энтальпии иониза-

ции и константы диссоциации цитидин-5-монофосфата (ЦМФ-5)// в сб. : тез. докл. 7 Всесоюзной' конференции по термодинамике органических соединений,-Куйбышев, 1987-е.104.

8. ТищенкоС.А., Рехарский М.В., Микрокалориметрическое определение энтальпии гидролиза п-нитрофенилфосфата//В сб.: тез.докл. VI Всесоюзной конференции по термодинамике органических соединений.-Минск, 1990.-е.171.

9. Тищенко С.А., Рехарский Ы.В., Егоров A.M., Термохимическое определение активности щелочной фосфатазы//Вестн.Моск.ун-та, сер.2., Химия, 1991.-т.32., т., с.531-533.

10. Рехарский М.В., Тищенко С.А., Энтальпия реакции гидролиза п-нитрофенилфосфата//Вестн.Моск.ун-та.,оер.2., Химия, 1991.-

т.32.,*5.,-с.460-463.