Определение некоторых биологически-активных веществ, основанное на эффекте сенсибилизированной флуоресценции в организованных средах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Неврюева Наталия Владимировна

Определение некоторых биологически-активных веществ, основанное на эффекте сенсибилизированной флуоресценции в организованных средах

02 00 02- аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□ОЗ 17 1=>э (

Саратов - 2008

003171957

Работа выполнена в Саратовском государственно университете им. НГ Чернышевского

Научный руководитель

Доктор химических наук, профессор Штыков С Н д х н., профессор Проскурнин М А к.х н , профессор Ястребова Н.И

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Уральский государственный Университет им. А М Горького

Защита состоится «2» июля 2008г в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 212 243 07 при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу.

410012, г Саратов, ул Астраханская, 83, СГУ, корп 1, химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им Н Г. Чернышевского

Автореферат разослан <Г*>> 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета

Сорокин В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Соединения, обладающие биологической активностью, например, различного рода антибиотики, аминокислоты, антикоагулянты и пестициды широко применяют в клинической практике и животноводстве в качестве лекарственных препаратов и добавок к кормам, а также в сельском хозяйстве для уничтожения вредителей В связи с этим их содержание необходимо контролировать в биологических жидкостях, пищевых продуктах и объектах окружающей среды

Одним из распространенных методов определения веществ данных классов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Ее основные недостатки - относительно высокая стоимость аппаратуры, сложность ее обслуживания и, вследствие этого, пока еще недостаточная распространенность метода в практике работы рядовых аналитических лабораторий

Флуориметрическая аппаратура более проста в обращении, а флуоресцентный метод существенно более чувствителен Однако количество интенсивно флуоресцирующих органических соединений невелико, в связи с чем необходимо развитие подходов, позволяющих увеличивать квантовый выход флуоресценции. Одним из таких подходов является метод сенсибилизированной флуоресценции с использованием некоторых лантаноидов Он основан на переносе энергии электронного возбуждения с триплетного уровня органического лигавда (донор) на резонансный излучательный уровень иона лантаноида (акцептор), испускающего характерную для него флуоресценцию Такой прием позволяет увеличить интенсивность аналитического сигнала и снизить предел обнаружения органических соединений

Наличие в составе хелата с лантаноидом нескольких лигандов приводит к реализации эффекта «антенны», состоящего в одновременной передаче одному иону металла энергии электронного возбуждения нескольких доноров, а в ряде случаев и энергии других лигандов, входящих в состав смешаннолигандного комплекса Дополнительным фактором, усиливающим эффект антенны, может быть солюбилизация хелата в наноразмерном объеме организованной системы, что способствует концентрированию компонентов реакции, повышению устойчивости хелатов и увеличению эффективности переноса энергии электронного возбуждения. Еще одним достоинством сенсибилизированной флуоресценции является возможность улучшения избирательности определений, поскольку перенос триплетной энергии может происходить только с триплетных уровней тех лигандов, энергия которых больше энергии излучательного уровня лантаноида

Автор выражает благодарность к х н, доценту кафедры аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета Т Д Смирновой за участие в обсуждении результатов и синтез реактивов.

Данная работа является частью плановых госбюджетных исследований кафедры аналитической химии и химической экологии, а также выполнялась в соответствии с проектами РФФИ № 04-03-32946а, 08-03-00725а и Госконтракгом 02 513 11.3028 Агентства по науке и инновациям

Целью работы явилось применение эффектов переноса энергии и сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в организованных средах для разработки методов определения некоторых биологически-активных веществ в пищевых, биологических и природных объектах

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

- выявить системы лантаноид - лиганд, для которых реализуются эффекты переноса энергии и сенсибилизированной флуоресценции,

- оценить влияние второго лиганда на сенсибилизированную флуоресценцию изучаемых систем,

изучить влияние организованных сред на собственную и сенсибилизированную флуоресценцию некоторых антибиотиков, антикоагулянтов и аминокислот и выбрать подход, обеспечивающий максимальный аналитический эффект,

- изучить влияние природы и концентрации ПАВ, а также цикподекстринов на хроматографическое определение фторхинолонов,

- разработать методики флуоресцентного определения антибиотиков, антикоагулянтов и аминокислот, основанные на сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в лекарственных формах, биологических, пищевых объектах и в почве

Научная новизна

• получены данные о флуоресценции европия, тербия и гадолиния, сенсибилизированной представителями хинолонов, фторхинолонов, тетрациклинов, кумариновых антикоагулянтов, аминокислот, и влиянии на сенсибилизацию мицелл различных поверхностно-активных веществ (ПАВ),

• изучено влияние вторых лигандов на сенсибилизированную флуоресценцию указанных лантаноидов и установлено, что наибольший рост интенсивности флуоресценции наблюдается для второго лиганда, способного участвовать в переносе энергии к иону лантаноида,

• выяснено влияние природы и концентрации мицелл ПАВ и микроэмульсий на интенсивность сенсибилизированной флуоресценции европия, тербия и гадолиния в присутствии вторых лигавдов, выбраны оптимальные условия ее реализации и показана возможность применения эффектов для флуориметрического определения некоторых хинолонов, фторхинолонов, тетрациклинов, антикоагулянтов и аминокислот в виде смешаннолигандных хелатов с указанными лантаноидами,

• изучено влияние мицелл ПАВ на собственную флуоресценцию некоторых антибиотиков и антикоагулянтов, не способных сенсибилизировать лантаноиды, и найдены оптимальные условия их фл>ориметрического определения;

• проведено сравнение влияния организованных сред на основе мицелл ПАВ и циклодекстринов на определение флюмеквина методом жидкостной хроматографии и выявлены условия получения максимального аналитического сигнала

Практическая значимость работы.

• Разработан подход, основанный на переносе энергии электронного возбуждения и эффекте антенны в системе хромофорный лиганд - ион лантаноида, вызывающий явление сенсибилизированной флуоресценции и позволяющий значительно уменьшить предел обнаружения веществ,

• разработаны методики флуориметрического определения оксолиниевой кислоты и доксициклина в плазме крови, флюмеквина - в плазме крови и мышечных тканях кур,

• проанализировано содержание норфлоксацина в лекарственных препаратах, доксициклина в лекарственной форме, разработанной в ЗАО «НИТА-ФАРМ»,

• разработана методика определения варфарина в почвах

На защиту автор выносит:

• Результаты изучения сенсибилизированной флуоресценции европия, тербия и гадолиния с различными классами биологически-активных веществ,

• влияние второго лиганда на сенсибилизированную флуоресценцию в системе лантаноид- БАВ,

• влияние организованных сред на собственную флуоресценцию БАВ и сенсибилизированную флуоресценцию лантаноидов,

• методики определения антибиотиков хинолонового, фторхинолонового, тетрациклинового рядов и антикоагулянтов в биологических, фармацевтических, пищевых объектах и почве.

Апробация работы. Основные результаты работы должны на IV, V Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003, 2005), международной конференции молодых ученых и студентов в области оптики, лазерной физики и биофизики «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2005, 2006), VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2006», (Самара, 2006), международной конференции по аналитической химии «ICAS-2006» (Москва, 2006), Всероссийских конференциях с международным участием «Аналитика России», (Краснодар, 2004, 2007); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Российско-Украинско-Германском симпозиуме по аналитической химии «ARGUS'2007- Nanoanalytics», (Саратов, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 4 статьи в журналах, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 6 статей в сборниках, 11 тезисов докладов

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 193 стр машинописного текста, содержит 44 таблицы, 53 рисунка Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка использованной литературы и приложения Библиография включает 191 источник

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложены новизна, практическая значимость полученных результатов и основные положения, выносимые на защиту

В главе 1 дано обобщение и систематизация литературных данных по современным методам определения антибиотиков, аминокислот и антикоагулянтов в лекарственных препаратах, биологических жидкостях, тканях и объектах окружающей среда, проанализированы их достоинства и недостатки

В главе 2 описаны использованные в работе реактивы и оборудование Объектами исследования явились биологически-активные вещества (БАВ) следующих классов хинолоны, фторхинолоны, тетрациклины, кумарины, аминокислоты, а также соли редкоземельных элементов, нитраты европия, тербия, гадолиния

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Хинолоны

О он

од

Оксолиниевая кислота (ОК)

О ОН

Налидиксовая кислота (НК)

Фторхинолоны

Норфлоксацин (НОР)

Флюмеквин (ФЛ)

он

Ломефлоксацин (ЛФ)

Офлоксацин (ОФ)

Тетрапиклиаы

Сщ Н он К1(СН3)2

Доксициклин (ДЦ)

Аминокислоты

НН2

ноос-сн-сн2

соон

-ы

ын

Гистндин (Н^)

Пролин (Рго)

Антикоагуляпты

Варфарин (ВФ)

он

О' х0

Оксикумарин (ОКМ)

О

я

ш

9 ?нз

•ССЙ^СНСН он

Куматетралил (КУМ)

Содержание основного вещества БАВ составляло более 99 %

В роли второго лиганда использовали 1,10-фенантролин (Фен), теноилтрифторацетон (ТТА), триоктилфосфиноксид (ТОФО), 2,9-диметил-дифенил-1,10-фенантролин (ДМДФФен), этилендиаминтетраксусной кислоты

динатриевую соль (ЭДТА) Исследовали влияние анионных (додецилсульфат натрия (ДЦС), додецилбензолсульфонат натрия (ДЦБС)), катионных (бромид цетилтриметиламмония (ЦТАБ), хлорид цетилпиридиния (ЦПХ)) и 3 типов неионных (Тритон Х-100, Тритон Х-305, Твин-80, Бридж-35) ПАВ В работе использовали молекулы-рецепторы а-, р- и у- циклодекстрины

Спектры флуоресценции регистрировали на флуориметре ФЛ-УХЛ-4 с источником возбуждения - галогенной лампой КГМ-12-100-2, при полностью открытой диафрагме в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см, а также на флуориметре «ФЛЮОРАТ-02-ПАНОРАМА», («ЛЮМЭКС», г. С -Петербург) с импульсной лампой и на спектрометре СДЛ-1, («ЛОМО», г С-Петербург), с ксеноновой лампой Сигнал регистрировали под углом 90° к возбуждающему свету Оптическую плотность растворов и спектры поглощения получали на спектрофотометре СФ-46, («ЛОМО» г. С -Петербург) Использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см ("Регкт-Е1тег")

Хроматографические исследования проводили на жидкостном хроматографе «Стайер» («Аквилон», Москва) с УФ- и флуориметрическим детекторами Использовали колонки с обращенной фазой С18 Подвижные фазы содержали ацетатно-аммиачный буферный раствор и ацетонитрил.

В главах 3-7 приведены экспериментальные результаты

Флуоресценция лантанондов, сенсибилизированная БАВ

Показано (табл 1), что все антибиотики и кумарины флуоресцируют Из 20-ти аминокислот незначительной собственной флуоресценцией обладают только гистидин, пролин, тирозин, триптофан и фенилаланин. Все указанные лантаноиды образуют комплексы с БАВ, что подтверждается батохромным смещением на 10-15 нм максимумов их спектров поглощения

Перенос энергии в комплексах европия и тербия с хинолонами, фторхинолонами, тетрациклинами, кумаринами и указанными аминокислотами наблюдается практически во всех случаях Он сопровождается несколькими явлениями перекрыванием спектра излучения донора со спектром поглощения акцептора (рис 1), снижением интенсивности флуоресценции донора (лиганда) в присутствии акцептора (лантаноида), возникновением одновременно с тушением донора сенсибилизированной флуоресценции акцептора, что видно на примере системы альбумин (донор) - варфарин (акцептор) (рис 2), соответствием величины убыли интенсивности флуоресценции донора и ее роста для акцептора, а также условием Ед> ЕА.

Сенсибилизированная флуоресценция, обусловленная переносом энергии, наблюдается не всегда и возможна, как правило, когда Ед > ЕА и величина энергетической щели не очень велика (табл 1) В соответствии с этим, сенсибилизация флуоресценции тербия обнаружена для всех видов антибиотиков Для европия она характерна только для антикоагулянтов, норфлоксацина и доксициклина, причем для последнего эффект увеличения интенсивности флуоресценции существенно сильнее, поскольку триплетный

уровень ДЦ (18100 см') расположен ближе к излучательному уровню европия (17260 см"1,5D0 - 7F2 переход)

Для аминокислот сенсибилизированная флуоресценция свойственна только комплексам пролина и гистидина с Eu3+, ТЬ3+ и Gd3+ Интенсивность флуоресценции комплекса лантаноида с Pro возрастает по сравнению с собственной флуоресценцией аминокислоты в присутствии ТЬ3+ - в 9 0 раз, Еи3+ - в 1.8 раза.

Таблица 1 Кратность увеличения флуоресценции некоторых антибиотиков в присутствии ионов европия и тербия (в скобках значение энергии в см"1)

Лантаноид Антибиотики Антикоагулянты

ФЛ НОР ОК НК ДЦ ВФ ОКМ КУМ

ТЬ3+ 20500 см"1 2 (21275) 2 (21275) 4 (20620) 3 5 (22420) 3 (18100) 4 4* 3* 4*

Еи3+ 17260 см"1 2* 1 3 6* 5* 5 25 1 5 1 7

* кратность уменьшения флуоресценции лигандов

Рис 1 Нормированные спектры поглощения (1,3) и флуоресценции (2) Tb34" (1), доксициклина (2), Еи3+ (3) (Сд„=1 0-10"5М, CEu3+=8 0 103 М, Стьз+ =2 0 10"3 М, рН 6 2)

300 320 340 360 380 400 420 440 Длина волны, нм

Рис 2. Спектр флуоресценции АБ в присутствии ВФ Сае=5.0 10"5М 1 СВФ=1 0-10'7М, 2. СВф=5 0-10'7М, 3 СВФ=1 О-Ю^М

Сенсибилизированная флуоресценция не обнаружена для антибиотиков ломефлоксацина и офлоксацина и, в случае тербия, для кумаринов Таким образом, эффективность сенсибилизированной флуоресценции зависит от природы антибиотика, иона лантаноида, числа координированных лигандов и соотношения энергий триплетного уровня органического лиганда и излучательного уровня иона лантаноида

Влияние второго лиганда на сенсибилизированную флуоресценцию

лантаноидов

Введение второю лиганда в бинарные системы лантаноид - БАВ во многих случаях увеличивает интенсивность флуоресценции комплексов, те сопровождается синергетическим эффектом Этот эффект может быть результатом двух процессов 1) замещения остаточных молекул воды (тушителей флуоресценции) в первой координационной сфере иона металла, 2) дополнительного переноса энергии возбуждения со второго лиганда на лантаноид (эффект «антенны»)

Антибиотики. Установлено, что наиболее эффективными вторыми лигандами для исследованных антибиотиков являются Фен и ТТА, которые дополнительно сенсибилизируют флуоресценцию лантаноидов (табл 2) В присутствии ДМДФен, и ТОФО во всех системах выпадают осадки

Из табл 2 видно, что флуоресценция хелата Еи3+- ДЦ в присутствии ТТА выше, чем в присутствии Фен Однако, диапазон определяемых концентраций ДЦ в системе Еи3+-ТТА меньше, что можно объяснить возможной конкуренцией ТТА по отношению к ДЦ при образовании хелата с ионом лантаноида. Отсутствие сенсибилизации теноилтрифторацетоном флуоресценции тербия объясняется близостью энергетических уровней лиганда (20660 см"1) и иона металла (20500 см'1), способствующей обратному переносу энергии возбуждения с акцептора на донор

Таблица 2 Кратность увеличения интенсивности сенсибилизированной флуоресценции хелатов при добавлении второго лиганда_

Второй лиганд Ио

Еи3+- ДЦ ТЬ3+- хинолон ТЬ3+-фторхинолон

ОК НК НОР ФЛ

Фен 4 2 2 1 5 1 6

ТТА 5 1 1 1 1

ЭДТА 3 1 3 1 2 1 1

Альбумин 5 - - - -

Известно, что роль синергетического агента в хелатах Ей"14" может выполнять биополимер - альбумин, содержащий в молекуле фрагмент триптофана, способного к комплексообразованию и передаче энергии возбуждения иону металла Установлено, что флуоресценция хелата Еи3+-ДЦ в присутствии альбумина возрастает в 5 раз Вклад в её увеличение может вносить также уменьшение доли безызлучательных потерь энергии при солюбилизации хелата Еи3+- ДЦ и изменение полярности его микроокружения в глобуле белка

Аптнкоагулянты. Установлено, что для комплексов ВФ, ОКМ и КУМ с Еи3+ максимальное увеличение интенсивности флуоресценции в 20,24 и 19 раз происходит в присутствии ТТА, а с ТЬ3+ - в 10, 4 и 2 раза, соответственно, в присутствии Фен (табл 3) Влияние ЭДТА, роль которой сводится только к вытеснению остаточных молекул воды их координационной сферы металла, не столь значительно

Таблица 3 Кратность увеличения интенсивности сенсибилизированной флуоресценции комплексов кумаринов при добавлении второго _лиганда_____ _

Комплекс Второй лиганд

Фен ТТА ЭДТА А1Ь

Еи3+-ВФ 2 20 1 5 1.5

ТЬ^-ВФ 10 1 5 2 1

Еи3+-ОКМ 2 24 2 1

ТЬ3+-ОКМ 4 1 1 1

Еи3+- КУМ 1 19 1 1

ТЬ3+-КУМ 2 1 2 1

Наиболее яркие эффекты сенсибилизированной флуоресценции получены на примере ВФ В таблице 4 представлены метрологические характеристики флуориметрических методик определения ВФ по собственной флуоресценции, в присутствии АБ или ТТА, а также с помощью систем ТЪ3+-Фен и Еи3+-ТТА, из которой видно, что использование сенсибилизированной флуоресценции позволяют понизить предел обнаружения в 4, 28, 83 и 3800 раз, соответственно В последнем случае предел обнаружения ВФ снижается до величины 5 2-10"'°М Такое поведение согласуется с ростом квантового выхода (<р) флуоресценции системы.

Таблица 4. Пределы обнаружения и диапазоны линейности определения ВФ

Система Ш0 Диапазон определяемых концентраций, М Предел обнаружения, М R2 а б Ф

ВФ 1 5 0 10'6-5 010'4 2 0 10"6 0 943 0.25 2 37 0 32

ВФ-ТТА 2 1 0 lO '-l о-ю-4 7 2'10"8 0 976 0 28 3 09 -

ВФ-АБ 7 1 0 10"6-1 0 10"4 5 1-Ю"7 0 983 0 33 4 26 0 56

ТЬ3+-ВФ-Фен 15 5 0 10~8-5 0 10"6 2 4 10"8 0.995 0 45 6 30 0 66

Еи3+-ВФ-ТТА 25 1 0 10'9-1 0 10'7 5.2 10'ш 0 998 0.73 8 32 0 75

Аминокислоты. Для бинарного комплекса Еи3+ с Pro максимальная флуоресценция наблюдается в присутствии ТТА, который превышает собственную флуоресценцию аминокислоты в 18 раз и флуоресценцию бинарного хелата Eu3+-Pro в 5 5 раза Интенсивность флуоресценции системы ТЪ3+ - Pro изменяется в присутствии добавок ТТА и Фен в 1 5 и 2 раза, соответственно Сигнал сенсибилизированной флуоресценции в комплексе Gd3+-His-TTA превышает флуоресценцию систем Eu3+-His-TTA и ТЬ3+- His-Фен в 15 2 и 14.6 раз соответственно.

Можно предположить, что синергетический рост флуоресценции при добавлении таких вторых лигандов как ТТА и Фен связан с эффектом «антенны», вызывающим дополнительную сенсибилизацию флуоресценции лантаноида.

Влияние организованных сред на собственную флуоресценцию БАВ и сенсибилизированную флуоресценцию лантаноидов

Мицеллы ПАВ — смешвннолнгандные комплексы. Основным типом исследованных организованных систем были мицеллы катионных, анионных и неионных ПАВ. Как видно из табл 5, при их действии на сенсибилизированную флуоресценцию смешаннолигандных комплексов антибиотиков наблюдается дифференцирующий эффект Так мицеллы

анионных ПАВ тушат флуоресценцию хелатов Еи3+-ДЦ-Фен и ТЬ^-ОК-Фен, а мицеллы катионных - наоборот, увеличивают ее Мицеллы неионных ПАВ сильно увеличивают флуоресценцию первого комплекса и не изменяют -второго Влияние мицелл АПАВ может быть связано с разрушением хелатов в результате связывания иона металла отрицательно заряженной поверхностью анионной мицеллы, которая к тому же не связывает лиганды, имеющие тоже отрицательный заряд В то же время ориентация солюбилизированных хелатов в мицеллах катионных ПАВ видимо такова, что положительно заряженная поверхность не разрушает хелаты Хелат тербия с оксолиниевой кислотой и Фен, по-видимому, не солюбилизируется мицеллами неионных ПАВ

Таблица 5 Влияние мицелл ПАВ на интенсивность флуоресценции смешаннолигандных хелатов европия и тербия с антибиотиками

Ио

ПАВ Еи3+- ДЦ- ТЬ3+- НОР- ТЬ3+-ФЛ ТЬ3+-ОК- ТЬ3+-НК-

Фен Фен Фен Фен Фен

ддс тушение 2 5 3.0 тушение 20

ДДБС тушение 4 2 1 тушение 1 2

ЦГ1Х тушение тушение 2 4 1 4 тушение

ЦТАБ 2 5 тушение 1.2 4 2 тушение

Тритон Х-100 7 тушение тушение 1 0 1 0

Бридж-35 6 тушение тушение 1.0 1.2

Твин -80 6 тушение тушение 1 0 1 0

Интересно, что дифференцирование наблюдается даже для хелатов тербия с Фен и лигандами одного класса фторхинолонов -норфлоксацином и флюмеквином (табл 5) Если мицеллы анионных ПАВ увеличивают флуоресценцию обоих хелатов, а мицеллы неионных тушат ее, то катионные ПАВ действуют по-разному Поскольку строение НОР и ФЛ отличается, можно предположить, что именно селективная солюбилизация лигандов является причиной разного влияния мицелл КПАВ Особенностями солюбилизации можно объяснить и влияние мицелл на хелат тербия с налидиксовой кислотой и Фен, флуоресценция которого тушится мицеллами только катионных ПАВ, в отличие от хелата другого хинолона - оксолиниевой кислоты

Метрологические характеристики определения хинолонов и фторхинолонов методом сенсибилизированной флуоресценции при проведении реакции в мицеллярных средах приведены в таблице 6. Видно, что интервал определяемых концентраций составляет от трех до пяти порядков, а пределы обнаружения находятся на уровне 10"8 -10'9 моля

Изучено влияние мицелл ПАВ на флуоресценцию комплексов аминокислот в системах вс13,-ТТА-Н|з и Еи3+-Рго-ТГА Установлено, что в мицеллярных

растворах катионных ПАВ (ЦПХ, ЦТАБ) интенсивность флуоресценции смешаннолигандных комплексов вс!3+-ТТА-1 Пб и Еи3+-Рго-ТТА уменьшается соответственно в 1 8 и 2 3 раза Анионный ПАВ - ДДС не оказывает влияния на флуоресценцию Неионные ПАВ Тритон Х-100 и Бридж-35 увеличивают ее интенсивность для 0<13+-Н13-ТТА и Еи3~Рго-ТТА в 2 2 и 25 раз и в 8 7 и 3.5 раз, соответственно В связи с этим лучшим ПАВ для системы СсР-Юб-ТТА оказался Бридж-35 (рН 6 8-7 5), для Еи3~Тго-ТТА - Тритон Х-100 (рН 6 3-6 5)

Мицеллы ПАВ — собственная флуоресценция БАВ. Как упоминалось выше, для двух фторхинолонов - ломефлоксацина и офлоксацина, сенсибилизированная флуоресценция с лантаноидами не наблюдалась. В связи с этим нами исследовано влияние мицелл ПАВ на собственную флуоресценцию этих соединений Установлено, что максимальное увеличение флуоресценции ЛФ наблюдается в присутствии ДДС, а ОФ - ЦПХ в 25 и 4 раза, соответственно, что может быть использовано для улучшения их флуориметрического определения Таким образом, и для самих антибиотиков обнаружен дифференцирующий эффект

Таблица 6 Метрологические характеристики определения хинолонов и фторхинолонов (р1=а-рС+Ъ)

Антибиотик Аналитическая система Линейность градуировочного графика, М а Ь ПрО, М

ФЛ ТЬ3+-Фен-ДДС 1.0 10"8 —1 0 10"3 0 39 7 07 6 2 10"9

НОР ТЬ3+-Фен -ДЦБС 1 0 10"8-! 0 10'3 0 35 3 54 3 1 10"9

ОК ТЬ3+-Фен- ЦТАБ 1 0 10'7-1 0 10"4 120 9 42 7 0 10'8

НК ТЬ3+-Фен- ДДС 5 0 10"8 -80 10'5 08 44 2 8 10'8

ДЦ Еи3+-Фен-Тритон-Х-100 5 0 10'8-5 0 10"5 0 47 54 2 2 Ю-8

ЛФ ЛФ-ЦПХ 1 0 10"8-1 0 Ю-4 0 72 6 95 8 8 10'9

ОФ ОФ-ДЦС 1 0 10"7-5 0 10"4 0 87 7.91 5 2 Ю"8

Установлено, что интенсивность собственной флуоресценции кумаринов возрастает в присутствии мицелл неионных, катионных и анионных ПАВ Ее максимальное увеличение (в 4-5 раз) наблюдается в мицеллярных растворах Тритона Х-100, однако диапазон определяемых содержаний уменьшается до одного порядка 5 О 10"5-5 О 10"4М Установлено, что при добавлении АБ к водному раствору ВФ интенсивность флуоресценции возрастает в 7 раз

Микроэмульсии. Влияние других представителей организованных систем - микроэмульсий - изучали на примере системы ТЬ3+-ФЛ-ДМДФФен в микроэмульсиях состава ДДС/н-пентанол/н-октан/вода при переходе от

структуры «масло в воде» к структуре «вода в масле» Установлено два эффекта- рост флуоресценции в обратной микроэмульсии масло/вода 80/20; - высокая солюбилизирующая способность микроэмульсий, позволившая использовать в качестве второго лиганда такое гидрофобное соединение как ДМДФФен, добавки которого даже в мицеллярных растворах приводили к образованию осадков Такое поведение микроэмульсий может быть связано с особенностью ее микрогетерогенной структуры и большой солюбилизирующей емкостью, что соответствует общим представлениям о свойствах микроэмульсий Для хелата ТЬ3+-ФЛ-ДМДФФен подобраны оптимальные условия комплексообразования Как видно из рисунка, в присутствии ДМДФФен интенсивность флуоресценции системы ФЛ- ТЬ3+ возросла в 1 7 раз по отношению к мицеллярному раствору, содержашему тот же анионный ПАВ - додецилсульфат натрия

Цнклодекстрнны. Попытки использовать циклодекстрины для увеличения интенсивности собственной и сенсибилизированной флуоресценции рассмотренных ранее биологически-активных веществ не привели к успеху Однако оказалось, что использование у-ЦД при хроматографировании самих антибиотиков приводит к увеличению площади хроматографического пика в 2 3 раза и селективности хроматографирования, что положено в основу разработки более высокочувствительного метода определения флюмеквина Применение других мицелл ПАВ оказалось менее эффективно, только для Тритона Х-100 площадь пика увеличилась практически в 2 раза Использование у-ЦД позволило снизить предел обнаружения ФЛ в 4 2 раза и значительно расширить интервал определяемых концентраций (табл 7)

Таблица 7 Метрологические характеристики хроматографического определения ФЛ в отсутствии и присутствии в подвижной фазе у-ЦЦ

Организованная среда Диапазон определяемых концентраций, м кг/мл ПрО, мкг/мл Уравнение регрессии Я2

- 2 5 - 650 135 у=3 90х+61 4 0 997

у-ЦД 0 65 - 2500 0 32 у=3 54х+201 0 999

Аналогичные зависимости установлены для кумаринов ОКМ и КУМ. Лучшей системой для их определения оказалась система Еи3+-ТТА, однако диапазон определяемых концентраций составляет лишь два порядка

Определение биологически-активных веществ методом сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в мнцеллярных

растворах ПАВ

На основе проведенных исследований разработаны методики флуоресцентного определения антибиотиков, антикоагулянтов и аминокислот, основанные на сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в лекарственных формах, биологических, пищевых объектах и в почве

Одной из таких методик явилось определение флюмеквина в плазме крови и мышечных тканях кур Флюмеквин входит в лекарственные формы, разрабатываемые в ЗАО «НИТА-ФАРМ» (г Саратов) для применения в птицеводстве Флуориметрическое определение ФЛ по градуировочному графику в мясе курицы проводилось в присутствии мицеллярных и микроэмульсионных сред Результаты определения ФЛ в мышечных тканях куриц после их трехдневного кормления представлены в таблице 8 Правильность определения в плазме крови контролировали методом «введено-найдено», а в тканях - методом ВЭЖХ с УФ- детектором по известной методике

Таблица 8 Результаты определения флюмеквина в курином мясе (п = 3, Р=0 95, Ъабл = 4 30, Егабя = 19 0)

Образец Найдено, мкг/мл 8Г Р ^экс п

Флуориметрич метод ВЭЖХ Флуориметрич метод ВЭЖХ

1 5 37±0 12 5 57±0 18 0 048 0 072 1 5 1 0

2 8 63±0 18 8 74±0 15 0 072 0 060 1 2 05

3 6 53±0 09 6 65Ю.07 0 036 0 028 1 3 08

В лекарственных препаратах «Ренор», «Норбактин» и «Нолицин», с использованием сенсибилизированной флуоресценции тербия в присутствии второго лиганда Фен и мицелл ДЦБС определено содержание норфлоксацина Правильность контролировали методом добавок

Разработаны методики флуориметрического определения ОКМ и ДЦ в плазме крови человека Правильность контролировали методом «введено-найдено».

С целью изучения фармакокинетики доксициклина в ЗАО «НИТА-ФАРМ» проводили опытное вскармливание кур данным антибиотиком Через определенное время, указанное в таблице 9, у подопытных отбирали пробы крови, в плазме которой определяли флуориметрическим методом содержание антибиотика по предложенной нами методике

Таблица 9 Результаты определения доксициклина в плазме крови кур

Однократно введенная концентрация ДЦ, мг/мл

40мг/мл 20мг/мл 5мг/мл

Время, мин Найденная концентрация ДЦ, х ± Дх, мкг/мл

30 0 07±0 01 0 06±0 01 0 16±0 01

60 3 77±0 47 0 23±0 03 0 60±0 02

180 1 13±0 06 1.34±0 08 0 41±0 05

240 0 47±0 02 0 39±0 02 0 34±0 02

360 0 24±0 01 0 32±0 01 0 20±0 05

480 0.19±0 01 0 24±0 01 012±0 01

Для подтверждения правильности результатов использовали известную методику опредетсния методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Сопоставление результатов определения по Р- и I- критериям (табл 10) позволило установить отсутствие систематической погрешности в предлагаемой флуориметрической методике

Таблица 10 Результаты определения доксициклина в плазме курицы

(Ртабл=19,2 при р=0 95,1та5л=4 30, п=3)

Метод х±дх, мкг/мл Б, р А эксп ^эксп

ВЭЖХ 2 50±0 01 0 007 25 0 77

Флуоримет-рический 2 50±0 02 0 01

Актуальна также проблема определения ВФ в водах и почвах, поскольку это соединение может легко аккумулироваться в сельскохозяйственных культурах Легко адсорбируемый почвой, богатой глиной и органическими остатками, ВФ может накапливаться в ней Пробоподготовку почвы осуществляли по известной методике Разработанная нами методика флуориметрического определения основана на использовании смешаннолигандного хелата Еи3+-ВФ-ТТА Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций 0 3-30 мкг/л Стандартное отклонение определения Б, не превышало 0 025

Выводы

1 На примере биологически-активных веществ четырех классов органических соединений изучены условия реализации переноса энергии электронного возбуждения в системе лиганд-лантаноид, варфарин-альбумин и сенсибилизации флуоресценции европия, тербия и гадолиния, а также варфарина Показано, что в указанных системах присутствуют основные признаки переноса энергии, такие как уменьшение флуоресценции донора и соответствующий ему рост флуоресценции акцептора, перекрывание спектра флуоресценции донора и спектра поглощения акцептора, большая величина энергии триплетного уровня донора по отношению к излучающему уровню акцептора Выявлены соединения, не сенсибилизирующие флуоресценцию лантаноидов

2 Установлено, что в присутствии второго лиганда интенсивность флуоресценции бинарных хелатов лантаноидов с антибиотиками, антикоагулянтами, аминокислотами возрастает в 1.5 - 24 раз Максимальный эффект увеличения флуоресценции наблюдается в присутствии лиганда, который способствует не только удалению из первой координационной сферы иона комплексообразователя остаточных молекул воды, но и участвует в процессе сенсибилизации иона металла Указанный факт является следствием эффекта «антенны», состоящего в одновременной передаче энергии электронного возбуждения со всех лигандов на один излучающий ион лантаноида

3 Обнаружено дифференцирующее действие природы мицелл ПАВ на сенсибилизированную смешанными лигандами флуоресценцию лантаноидов, имеющее место даже внугри одного класса биологически-активных лигандов Такое действие может быть связано с селективной солюбилизацией компонентов комплекса в мицелле, способствующей либо увеличению устойчивости комплекса, либо его разрушению Мицеллы ПАВ существенно увеличивают интенсивность собственной флуоресценции ломефлоксацина и офлоксацина, которые не сенсибилизировали флуоресценцию лантаноидов Показано, что большая солюбилизирующая способность микроэмульсий позволяет переводить в раствор и использовать в анализе высокогидрофобные системы, образующие осадки даже в мицеллярных растворах ПАВ

4 Выявлены условия проведения реакций и получены метрологические характеристики определения всех исследованных классов биологически-активных веществ, из которых следует, что метод сенсибилизированной флуоресценции позволил снизить пределы обнаружения веществ в десятки раз до уровня 10"8-Ю"10 М Обнаружен уникальный эффект 3800-кратного снижения предела обнаружения варфарина по его сенсибилизированной флуоресценции в системе европий-варфарин-ТТА

5 Изучено влияние мицелл ПАВ и циклодекстринов на определение антибиотиков группы фторхинолонов и тетрациклинов методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором Показано, что в ряде случаев при

применении у-циклодекстрина возможно двукратное увеличение площади хроматографического пика, позволяющее уменьшить предел обнаружения веществ в 3-4 раза и на несколько порядков увеличить интервал линейности градуировочного графика 6 Разработаны методики флуориметрического определения флюмеквина - в плазме крови и тканях кур, докснциклина в плазме крови кур и лекарственной форме, разработанной в ЗАО «НИТА-ФАРМ», оксолиниевой кислоты в плазме крови человека, найдено содержание норфлоксацина в трех лекарственных препаратах, предложена методика определения варфарина в почвах

Основные публикации по теме диссертации

1. Штыков СН, Смирнова ТД, Былинкин ЮГ, Калашникова (Неврюева) Н В , Жемеричкин Д А Определение ципрофлоксацина и энрофлоксацина методом сенсибилизированной флуоресценции европия в присутствии второго лиганда и мицелл анионных ПАВ // Журн аналит химии 2007 Т62 №2 С 153-157

2 Штыков С Н, Калашникова (Неврюева) Н В , Смирнова Т Д, Жемеричкин ДА Флуориметрический метод определения норфлоксацина, основанный на явлении переноса энергии // Изв вузов Химия и хим технол 2006 Т 49 №7 С 27-30

3 Штыков С Н, Калашникова (Неврюева) Н В , Смирнова Т Д, Конюхова Ю Г Комплексы с переносом энергии в возбужденном состоянии в организованных средах для флуориметрического определения биологически активных веществ //Биомед. технол и радиоэлектроника 2006 №12. С.4-9

4 Shtykov S N , Smirnova Т D , Kalashnikova (Nevrjueva) N V , Byhnkm Y G, Zhemerichkin D A Fluorescence m the system Eu(III) - Oxytetracycline - co-ligand - sodium dodecylbenzene sulphonate micelles and its analytical application // Proc SPIE. 2006 V.6165 P 61650Q1-6165Q6

5 Неврюева H В, Штыков С H, Смирнова Т Д, Криволапова J1Ю, Ханина О М Флуориметрическое определение некоторых хинолонов с помощью хелагов тербия в организованных средах // Межвуз сб науч. трудов «Современные проблемы теорет иэксперим химии» Саратов, 2007. С 213-217.

6 Неврюева Н В, Штыков С Н., Смирнова Т Д, Астахова Н А Сенсибилизированная флуоресценция хелатов лантанидов с пролином в мицеллярных растворах ПАВ // Межвуз сб науч трудов «Современные проблемы теорет. и эксперим химии». Саратов, 2007. С 217-219

7 Неврюева Н В , Штыков С Н, Смирнова Т Д, Фаррахова JI В. Определение ломефлоксацина и офлоксацина флуориметрическим методом в присутствии мицелл поверхностно-активных веществ // Межвуз сб науч. трудов «Современные проблемы теорет. и эксперим химии» Саратов, 2007 С.219-222

8 Smirnova Т D, Nevrjueva N.V., Shtykov S N Effect of micelles and second ligands on Eu3+ and Tb3+ sensitized fluorescence determination of tetracycline and

fluoroquinolone antibiotics based on energy transfer and antenna phenomenon // Proc. «Argus'2007-Nanoanalytics». Saratov, 2007. P 122-124.

9 Неврюева H В, Смирнова T Д, Штыков С Н. Флуориметрическое определение биологически-активных веществ с помощью хелатов с переносом энергии в организованных средах // Тез докл «Аналитические методы и приборы для химического анализа». Санкт-Петербург, 2007. С 37-42.

10 Калашникова (Неврюева) Н В , Богомолова И В, Штыков С Н, Смирнова Т Д Флуоресцентное определение флюмеквина в курином мясе // Межвуз сб. науч трудов «Современные проблемы теорет и эксперим. химии» Саратов, 2005 С 161-164

11 Былинкин Ю.Г, Калашникова (Неврюева) НВ Флуоресцентный метод определения норфлоксацина с использованием хелата ТЬ3+ в мицеллярных растворах ПАВ // Сб науч статей молодых ученых, посвященный 75-летию химического факультета «Современные проблемы теоретической и эксперим химии» Саратов, 2004. С.115-119

12 Хрячкова Е С, Неврюева Н В, Смирнова Т Д, Штыков С Н Определение норфлоксацина методом сенсибилизированной флуоресценции РЗЭ в лекарственном препарате // Матер XV Международ конф студентов, аспирантов и молодых ученых по фундам наукам «Ломоносов-2008» Химия Москва, 2008 С 78.

13 Shtykov SN., Smirnova TD, Kalashnikova (Nevrjueva) NV Fluorimetric determination of some 4-fluoroqumolone and tetracycline antibactenals based on the energy-transfer in micelles of surfactants // Intern conf «Modern Physical Chemistry for Advanced Materials» Kharkiv, Ukraine, 2007 P 224-225

14 Штыков С H, Неврюева Н.В , Смирнова Т Д, Ханина О М Определение доксициклина флуоресцентным методом и ВЭЖХ с флуориметрическим детектором в организованных средах // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Москва, 2007 Т 1 С 623.

15 Штыков С Н, Смирнова Т Д, Неврюева Н В Влияние организованных сред на эффективность переноса энергии в хелатах биологически активных веществ // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Москва, 2007. Т 2. С 624.

16 Штыков СН, Неврюева НВ , Смирнова ТД Флуориметрический метод определения некоторых аминокислот с помощью хелатов лантанидов в организованных средах // Материалы II Всерос конф с междунар участием «Аналитика России» Краснодар, 2007. С 484

17 Штыков СН, Смирнова ТД, Неврюева НВ Комплексы с переносом энергии для определения биологически-активных веществ флуориметрическим методом // Материалы II Всерос. конф. с междунар участием «Аналитика России». Краснодар, 2007 С 177

18 Shtykov S.N, Kalashnikova (Nevjueva) NV, Smirnova TD, Shishimna E Fluronmertic determination of tetracycline based on the energy- transfer in micelles of surfactants // Intern Congress Anal. Sci "1С AS 2006", Moscow, 2006 P 514

19 Shtykov S N, Smirnova T D, Kalashnikova (Nevrjueva) N V , E Shishinma E Lanthamde-sensitized spectrofluorimetric determination of some 4-fluoroquinolone antibactenals using organized media // Intern Congress Anal Sci "ICAS 2006", Moscow, 2006 P 514-515

20 Штыков С H, Смирнова Т Д, Калашникова (Неврюева) Н В Определение оксолиниевой кислоты с помощью сенсибилизированной флуоресценции в организованных средах в биологических жидкостях // VI Всерос конф по анализу объектов окруж среды «Экоаналитика-2006» Самара, 2006 С.304.

21 Былинкин ЮГ, Штыков СН, Смирнова ТД, Жемеричкин ДА, Калашникова (Неврюеза) НВ. Определение производных фторхинолонов методом сенсибилизированной флуоресценции // Всерос конф по аналит химии «Аналитика России» Москва, 2004 С 137-138

Автореферат

Неврюева Наталия Владимировна

Определение некоторых биологически-аггивных веществ, основанное на эффекте сенсибилизированной флуоресценции в организованных средах

02 00 02- аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано к печати 22 05 2008 г Объем - 1 печатный лист Тираж 100 Заказ № 97 Отпечатано в типографии ООО «Техно-Текор», 410012, г Саратов улица Московская 160

Список условных обозначений и сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Методы определения антибиотиков 15 1.1.1 Хроматографические методы определения антибиотиков

1.1.2. Фотометрические методы определения антибиотиков

1.1.3. Фармакопейные методы определения антибиотиков

1.1.4. Флуориметрическое определение антцбиотикрв

1.2. Методы определения аминокислот за 5 лет

1.3. Методы определения антикоагулянтов

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Реактивы

2.2. Приготовление микроэмульсий

2.3. Определение квантового выхода флуоресценции

2.4. Аппаратура и техника измерений

Глава 3. Сенсибилизированная флуоресценция лантаноидов в присутствии антибиотиков в организованных средах

3.1. Флуоресценция антибиотиков в водных и организованных средах

3.2. Изучение состава и устойчивости бинарного и смешанолигандного хелатов европия с антибиотиками в водных и 64 мицеллярных средах ПАВ.

3.3. Сенсибилизированная флуоресценция европия и тербия с антибиотиками

3.4. Влияние второго лиганда на интенсивность флуоресценции хелатов лантаноидов с антибиотиками

3.5. Влияние организованных сред на флуоресценцию хелатов РЗЭантибиотик - второй лиганд

3.6. Влияние микроэмульсий на интенсивность флуоресценции 87 смешаннолигнадного комплекса тербия с флюмеквином и фенантролином

3.6.1. Влияние рН на сенсибилизированную флуоресценцию 88 тербия

3.6.2. Выбор оптимальных условий флуоресценции системы

3.6.3. Градуировочный график для определения флюмеквина в микроэмульсии н-октан/вода/н-пентанол/ДДС

3.7. Градуировочные графики для определения антибиотиков.

Глава 4 Сенсибилизированная флуоресценция лантаноидов с ^ производными кумарина

4.1. Флуоресцентные свойства антикоагулянтов.

4.2. Влияние организованных сред на флуоресцентные свойства кумаринов

4.3. Сенсибилизированная флуоресценция производных кумаринов в присутствии органических соединений

4.4. Флуоресцентные свойства комплексов кумаринов с лантаноидами.

4.5.Влияние второго лиганда на сенсибилизированную флуоресценцию бинарных хелатов кумаринов

4.6. Флуоресцентные свойства лантаноидных комплексов кумаринов в мицеллярных растворах ПАВ

4.7.Выбор оптимальных условий сенсибилизированной флуоресценции кумаринов

4.8.Выбор оптимальных концентраций компонентов систем Ей -КУМ

- ТТА, ТЬ - КУМ - Фен.

Глава 5. Сенсибилизированная флуоресценция лантаноидов с аминокислотами

5.1 Сенсибилизированная флуоресценция лантаноидов с аминокислотами

5.2 Влияние второго лиганда на интенсивность сенсибилизированной флуоресценции комплексов лантаноидов с аминокислотами 5. 3. Влияние мицеллярных растворов ПАВ на сенсибилизированную флуоресценцию хелатов Gd3+-Pro-TTA и Eu3+-Pro-TTA 5.4. Выбор оптимальных условий сенсибилизированной флуоресценции исследуемых систем

ГЛАВА 6. Определение флюмеквина методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием

6.1. Выбор неподвижной и подвижной фазы

6.2. Влияние природы и концентрации ПАВ

6.3. Влияние циклодекстринов

6.4. Влияние кислотности среды на селективность хроматографирования

6.5. Градуировочный график для определения ФЛ в присутствии у-ЦД

ГЛАВА 7. Использование сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в мицеллярных растворах ПАВ для определения 144 биологически-активных веществ.

7.1. Определение флюмеквина в мышечных тканях и плазме крови курицы.

7.2. Определение норфлоксацина в лекарственных препаратах

7.3. Определение оксолиниевой кислоты в плазме крови флуориметрическим методом.

7.4. Определение доксициклина в плазме крови

7.5. Определение доксициклина в лекарственной форме

7.6. Определение варфарина в почве 156 Выводы

Актуальность работы. Соединения, обладающие биологической активностью, например, различного рода антибиотики, аминокислоты, антикоагулянты и пестициды широко применяют в клинической практике и животноводстве в качестве лекарственных препаратов и добавок к кормам, а также в сельском хозяйстве для уничтожения вредителей. В связи с этим их содержание необходимо контролировать в ■ биологических жидкостях, пищевых продуктах и объектах окружающей среды.

Одним из распространенных методов определения веществ данных классов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Её основные недостатки - относительно высокая стоимость аппаратуры, сложность её обслуживания и, вследствие этого, пока еще недостаточная распространенность метода в практике работы рядовых аналитических лабораторий.

Флуориметрическая аппаратура более проста в обращении, а флуоресцентный метод существенно более чувствителен. Однако количество интенсивно флуоресцирующих органических соединений невелико, в связи с чем необходимо развитие подходов, позволяющих увеличивать квантовый выход флуоресценции. Одним из таких подходов является метод сенсибилизированной флуоресценции с использованием некоторых лантаноидов. Он основан на переносе энергии электронного возбуждения с триплетного уровня органического лиганда (донор) на резонансный излучательный уровень иона лантаноида (акцептор), испускающего характерную для него флуоресценцию. Такой прием позволяет увеличить интенсивность аналитического сигнала и снизить . предел обнаружения органических соединений.

Наличие в составе хелата с лантаноидом нескольких лигандов приводит к реализации эффекта «антенны», состоящего в одновременной передаче одному иону металла энергии электронного возбуждения нескольких доноров, а в ряде случаев и энергии других лигандов, входящих в состав смешаннолигандного комплекса. Дополнительным фактором, усиливающим эффект антенны, может быть солюбилизация хелата в наноразмерном объеме организованной системы, что способствует концентрированию компонентов реакции, повышении) устойчивости хелатов и увеличению эффективности переноса энергии электронного возбуждения. Еще одним достоинством сенсибилизированной флуоресценции является возможность улучшения избирательности определений, поскольку перенос триплетной энергии может происходить только с триплетных уровней тех лигандов, энергия которых больше энергии излучательного уровня лантаноида.

Данная работа является частью плановых госбюджетных исследований кафедры аналитической химии и химической экологии, а также выполнялась в соответствии с, проектами РФФИ № 04-03-32946а, 08-03-00725а, Госконтрактом 02.513.11.3028 Агентства по науке и инновациям.

Целью работы явилось применение эффектов переноса энергии и сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в организованных средах для разработки методов определения некоторых биологически-активных веществ в пищевых, биологических и природных объектах.

Для достижения поставленной задачи в работе необходимо было решить следующие задачи: * »

- выявить системы лантаноид — лиганд, для которых реализуются эффекты переноса энергии и сенсибилизированной флуоресценции;

- оценить влияние второго лиганда на сенсибилизированную флуоресценцию изучаемых систем;

- изучить влияние организованных сред на собственную и сенсибилизированную флуоресценцию некоторых антибиотиков, и антикоагулянтов и аминокислот и выбрать подход, обеспечивающий максимальный аналитический эффект; , изучить влияние природы и концентрации ПАВ, а также циклодекстринов на хроматографическое определение фторхинолонов;

- разработать методики флуоресцентного определения антибиотиков, антикоагулянтов и аминокислот, основанные на сенсибилизированной флуоресценции лантаноидов в лекарственных формах, биологических, пищевых объектах и в почве.

Научная новизна

• получены данные о флуоресценции европия, тербия и гадолиния, сенсибилизированной представителями хинолонов, фторхинолонов, тетрациклинов, кумариновых антикоагулянтов, аминокислот, и влиянии на сенсибилизацию мицелл различных поверхностно-активных веществ (ПАВ);

• изучено влияние вторых лигандов на сенсибилизированную флуоресценцию указанных лантаноидов и установлено, что наибольший рост интенсивности флуоресценции наблюдается для второго лиганда, способного участвовать в переносе энергии к иону лантаноида;

• выяснено влияние природы и концентрации мицелл ПАВ и микроэмульсий :на интенсивность сенсибилизированной флуоресценции европия, тербия и гадолиния в присутствии вторых лигандов, выбраны оптимальные условия её реализации и показана возможность применения эффектов для флуориметрического определения некоторых хинолонов, фторхинолонов, тетрациклинов, антикоагулянтов и аминокислот в виде смешаннолигандных хелатов с указанными лантаноидами;

• изучено влияние мицелл ПАВ на собственную флуоресценцию некоторых антибиотиков и антикоагулянтов, не способных сенсибилизировать лантаноиды, и найдены оптимальные условия их флуориметрического определения; *

• проведено сравнение влияния организованных сред на основе мицелл ПАВ и циклодекстринов на определение флюмеквина методом жидкостной хроматографии и выявлены условия получения максимального аналитического сигнала.

Практическая значимость работы

• Разработан подход, основанный на переносе энергии электронного возбуждения и эффекте антенны в системе хромофорный лиганд - ион лантаноида, вызывающий явление сенсибилизированной флуоресценции и позволяющий значительно уменьшить предел обнаружения таких лигандов, обладающих биологически-активными свойствами;

• разработаны методики флуориметрического определения оксолиниевой кислоты и доксициклина в плазме крови, флюмеквина — в плазме крови и мышечных тканях кур;

• проанализировано содержание норфлоксацина в лекарственных препаратах, доксициклина в лекарственной форме, разработанной в ЗАО «ИИТА- Ф АРМ»;

• разработана методика определения варфарина в почвах.

На защиту автор выносит:

• Результаты изучения сенсибилизированной флуоресценции европия, тербия и гадолиния с различными классами биологически-активных веществ;

• влияние второго лиганда на сенсибилизированную флуоресценцию в системе лантаноид- БАВ;

• влияние организованных сред на собственную флуоресценцию БАВ и сенсибилизированную флуоресценцию лантаноидов;

• методики определения антибиотиков хинолонового, фторхинолонового, тетрациклинового рядов и антикоагулянтов в биологических, фармацевтических, пищевых объектах и почве.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на IV, V Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003, 2005); международной конференции молодых ученых и студентов в области оптики, лазерной физики и биофизики «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2005, 2006); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2006», (Самара, 2006); международной конференции по аналитической химии «ICAS-2006» (Москва, 2006), Всероссийских конференциях с международным участием «Аналитика России», (Краснодар, 2004, 2007); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007); Российско-Украинско-Германском симпозиуме по аналитической химии «ARGUS'2007- Nanoanalytics», (Саратов, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 4 статьи в журналах, 6 статей в сборниках, 11 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 193 стр. машинописного текста, содержит 44 таблицы, 53 рисунка. Диссертация состоит из. введения, 7 глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Библиография включает 191 источник.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложены новизна, практическая значимость полученных результатов и основные положения, выносимые на защиту.

В главе 1 дано обобщение и систематизация литературных данных по современным методам определения антибиотиков, аминокислот и антикоагулянтов в лекарственных препаратах, биологических жидкостях, тканях и объектах окружающей среды, проанализированы их достоинства и недостатки.

В главе 2 описаны использованные в работе реактивы и оборудование. Объектами исследования явились биологически-активные вещества (БАВ) следующих классов: хинолоны, фторхинолоны, тетрациклины, кумарины, аминокислоты, а также соли редкоземельных элементов: нитраты европия, тербия, гадолиния.

Третья глава посвящена изучению влияния второго лиганда, мицелл ПАВ на сенсибилизированную флуоресценцию хелатов тербия и европия с антибиотиками НОР, ФЛ, OK, НК, ЛФ и ОФ.

В четвертой главе описано определение кумаринов ВФ, КУМ и ОКМ, основанное на использовании комплексов с переносом энергии в присутствии вторых сенсибилизирющих агентов.

В пятой главе оценена возможность флуоресцентного определения аминокислот, в частности His и Pro, используя комплексообразование в организованных средах.

В шестой главе приведены результаты хроматографического определения фторхинолонов ЦФ и ФЛ в организованных средах.

В седьмой главе представлены методики флуориметрического определения фторхинолонов, тетрациклина в биологических, фармацевтических и пищевых объектах, а также варфарина в почве.

В приложении приведены грдуировочные зависимости определения исследуемых веществ, выбор оптимальных концентраций комплексообразования, а так же кривые насыщения хелата ДЦ-Eu .

Выводы

1. На примере биологически-активных веществ четырех классов органических соединений изучены условия реализации переноса энергии электронного возбуждения в системе лиганд-лантаноид, варфарин-альбумин и сенсибилизации флуоресценции европия, тербия и гадолиния, а также варфарина. Показано, что в указанных системах присутствуют основные признаки переноса энергии, такие как уменьшение флуоресценции донора и соответствующий ему рост флуоресценции акцептора, перекрывание спектра флуоресценции донора и спектра поглощения акцептора, большая величина энергии триплетного уровня донора по отношению к излучающему уровню акцептора. Выявлены соединения, не сенсибилизирующие флуоресценцию лантаноидов.

2. Установлено, ■ что в присутствии второго лиганда интенсивность флуоресценции бинарных хелатов лантаноидов с антибиотиками, антикоагулянтами, аминокислотами возрастает в 1.5 - 24 раз. Максимальный эффект увеличения флуоресценции наблюдается в присутствии лиганда, который способствует не только удалению из первой координационной сферы иона комплексообразователя остаточных молекул воды, но и участвует в процессе сенсибилизации иона металла. Указанный факт является следствием эффекта «антенны», состоящего в одновременной передаче энергии электронного возбуждения со" всех лигандов на один излучающий ион лантаноида.

3. Обнаружено дифференцирующее действие природы мицелл ПАВ на сенсибилизированную смешанными лигандами флуоресценцию лантаноидов, имеющее место даже внутри одного класса биологически-активных лигандов. Такое действие может быть связано с селективной солюбилизацией компонентов комплекса в мицелле, способствующей либо увеличению устойчивости комплекса, либо его разрушению.

Мицеллы ПАВ существенно увеличивают интенсивность собственной флуоресценции ломефлоксацина и офлоксацина, которые не сенсибилизировали флуоресценцию лантаноидов. Показано, что большая солюбилизирующая способность микроэмульсий позволяет переводить в раствор и использовать в анализе высокогидрофобные системы, образующие осадки даже в мицеллярных растворах ПАВ.

4. Выявлены условия проведения реакций и получены метрологические характеристики определения всех исследованных классов биологически-активных веществ, из которых следует, что метод сенсибилизированной флуоресценции позволил снизить пределы обнаружения веществ в

Q 1л десятки раз до уровня 10" -10" М. Обнаружен уникальный эффект 3800-кратного снижения предела обнаружения ' варфарина по его сенсибилизированной флуоресценции в системе европий-варфарин-ТТА.

5. Изучено влияние мицелл ПАВ и циклодекстринов на определение антибиотиков группы фторхинолонов и тетрациклинов методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Показано, что в ряде случаев при применении у-циклодекстрина возможно двукратное увеличение площади хроматографического пика, позволяющее уменьшить предел обнаружения веществ в 3-4 раза и на несколько порядков увеличить интервал линейности градуировочного графика.

6. Разработаны методики флуориметрического определения флюмеквина — в плазме крови и тканях кур; доксициклина в плазме крови кур и лекарственной форме, разработанной в ЗАО «НИТА-ФАРМ»; оксолиниевой кислоты в плазме крови человека, найдено содержание норфлоксацина в трех лекарственных препаратах, предложена методика определения варфарина в почвах.

1. Полануер Б.М. Применение хроматографических методов анализа в биотехнологии: проблемы, перспективы //Биотехнология. 1996. №4. С.47-57. ,

2. Xie S., Chin S., Zhang F. Determination of enrofloxacin and its metabolite in animal plasma by reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography // Se Pu. 1998. V.16. № 3. P.258-264.

3. Marines S.E., Sonzaa В., Celso F. Liquid chromatography determination of enrofloxacin // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. V.28. № 6. P. 1195-1199.

4. Samonidae V.F., Christodoulou E.A., Papadoyannis I.N. Direct determination of five fluorquinolones in chicken whole blood and veterinary drugs by HPLC // J. Separ. Sci. 2005. V.28. № 4. P.27-31.

5. Фирсов A.A., Алексеева M.E., Кулешов C.E. Ципрофлоксацин: ВЭЖХ имикробиологический метод при оценке биоэквивалентности лекарственной формы//Хим. фарм. журн. 1995. № 3. С. 17-19.

6. Delmas J.M., Chapel A.M., Sanders P. Determination of flumequine and 7-hydroxyflumequine in plasma of sheep by high-performance liquidchromatography //■: J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1998. V. 712, № 1-2. P.263-268.

7. Decolin D., Nicolas A., Siest G. Determination of flumequine and 7-hydroxy metabolite by reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. В: Biomed. Sci. Appl. 1987.V.414. P.499-503.

8. Guyonnet J., Pacaud M., Richard M. Routine determination of flumequine in kidney tissue of pig using automated liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1996. V.679, № 1-2. P.177-184.

9. Vybiralova Z., Nobilis M., Zoulova J., Kvetina J., Petr P. High-performance liquid chromatographic determination of ciprofloxacin in plasma samples // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 37, № 5. P.851-858.

10. Sunderland J., Lovering A.M., Tobin C.M., MacGowan A.P., Roe J.M., Delsol A.A. A reverse-phase HPLC assay for the simultaneous determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in pig faeces // Intern. J. Antimicrob. Agents. 2004. V.23. № 4. P.390-393.

11. Idowu O. R., Peggins J.O. Simple, rapid determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in . bovine milk and plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. V.35. № 1. P.143-153.

12. Imre S., Dogaru M.T., Vari C.E., Muntean Т., Kelemen L. Validation of an HPLC method for the determination of ciprofloxacin in human plasma // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. V.33. № l.P.125-130.

13. Ramos M., Aranda A., Garcia E., Reuvers Т., Hooghuis H. Simple and sensitive determination of five quinolones in food by liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. B. 2003. V.789. № 2. P.373-381.

14. Zotou A., Miltiadou N. Sensitive LC determination of ciprofloxacin in pharmaceutical preparations and biological fluids with fluorescence detection //J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. V.28. № 3-4. P.559-568.

15. Schneide M. J., Braden S. E., Reyes-Herrera I., Donoghue D.J. Simultaneous determination of fluoroquinolones and tetracyclines in chicken muscle using HPLC with fluorescence detection // J. Chromatogr. B. 2007. V.846. № 1-2. P.8-13.

16. Rieutord A., Prognot P., Brion F., Mahuzier G. Liquid Chromatographic Determination Using Lanthanides as Time-Resolved Luminescence Probes for Drugs and Xenobiotics: Advantages and Limitations. // Analyst. 1997. V.122, P.59-69.

17. Garcia M.A., Solans C., Calvo A. Determination of enrofloxacin and primary metabolite ciproflixacin in pig tissues. Application to residue studies // Biomed. Chromatogr. 2005. V.19. № 1. P.27-31.

18. Holtzapple C.K., Buckley S.A., Stancer L.H. Determination of four fluorquinolones in milk by on-line immunoaffinity capture coupled withreversed-phase liquid chromatography // J. AOAC Intern. 1999. V.82. № 3. P.607-613.

19. Garsia M.A., Solous C., Aramayona J.J. Simultaneous determination of enrofloxacin and; primary metabolitic ciprofloxacin in plasma by HPLC with fluorescence detection // Biomed. Chromatogr. 1999. V.13. № 5. P.35-30.

20. Hernandez-Arteseros J. A., Beltran J. L., Compano R., Prat M. D. Fast-scanning fluorescence spectroscopy as a detection system in liquid chromatography for confirmatory analysis of flumequine and oxolinic acid // J. Chromatogr. A. V.942. P.275-281.

21. Roybal S.E., Pfenning A.P., Turnipsed S.B. Determination of four fluorquinolones in milk by liquid chromatography // J. AOAC Intern. 1997. V.80. № 5. P.982-975. 2.

22. Gigososa P.G., :Revosadoa' P.R., Gadahiaa O., et. al. Determination of quinolones in animal tissues and eggs by high-performance liquid chromatography with photodiode-array detection // J. Chromatogr. A. 2000. V. 871. № 1-2. P.31-36.

23. Hudrea. F., Grosset. C., Alary. J., Bojita. M. Stability study of ciprofloxacin hydrochloride using reversed phase HPLC // Pharmaz. 1997. V.52. №7. P.516-519.

24. Tyczkowskaa K.L., Voyksnerb R.D. Simultaneous determination of enrofloxacin and its primary metabolite ciprofloxacin in booing milk and plasma by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. sci. appl. 1994. V.658. №2. P.341-348.

25. Pecorelli I., Galarini R., Bibi R., Floridi Al., Casciarri E., Floridi A. Simultaneous determination of 13 quinolones from feeds using accelerated solvent extraction and liquid chromatography //Anal. chim. acta. 2002. V. 464. №.1. P.37-45.

26. Schneider M. J., Donoghue D. J. Multiresidue determination of fluoroquinolone antibiotics in eggs using liquid chromatography-fluorescence-mass spectrometry // Analyt. Chim. Acta. 2003. V.483. №1-2. P.81-89.

27. Kurie M, Hiroyuki K. Determination of fluoroquinolones in environmental waters by in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Anal. chim. acta. 2006. V. 562. № 1. p. 16-22.

28. Lolo M., Pedreira S., Fente C., Vazquez В. I., Franco С. M., Cepeda A. Use of the diphasic dialysis as a new extraction procedure in the determination ofenrofloxacin and ciprofloxacin in egg // Anal. chim. acta. 2003. V. 480. № 1. P. 123-130.

29. Vyncht G., Janosi A., Bordin G., Toussaint В., Pauw E., Rodriguez A-R. Multiresidue determination of (fluoro) quinolones antibiotics in swine kidney using liquid chromatography tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. 2002. Y.952. № 1-2. P.121-129.

30. Harnandoa M.D., Mezcuaa M., Suarez-Barcenab J.M. Liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry for simultaneous determination of chemotherapeutant residues in salmon // Anal. chim. acta. 2006. V.562. № 2. P.176-184.

31. Rasmussen К. E., Tonnesen F., Thanh H.H. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of flumequine and oxolinic acid in salmon plasma // J. Chromatogr. 1989. V.496. P.355-364.

32. Barbosa J., Berges R., Sanz-Nebot V Solvatochromic parameter values and pHin aqueous-organic mixtures used in liquid chromatography. Prediction of retention of a series of quinolones // J. Chromatogr. 1996. V.719. P.27-36.

33. Wang P.L., Feng Y.L. Simultaneous TLC determination of norfloxacin,pefoxacin and ciprofloxacin in urine and serum // Microchem. J. 1997. V.56. P.229-232.

34. Juhel-Gaugain M., Abjean J.P. Application of HPTLC for the screening of quinolone residues in pig muscles // Chromatogr. 1998. V.47. P.101-108.

35. Линберг Л.Ф., Цирлина Л.А., Машилов В.П., Лисукова Т.Е., Кашин А. М.,

36. Аликеева Г.А., Кузнецов В.Ф., Милова О.Г. Фармакокинетика доксициклина // Хим.-фарм. журн. 1989. Т.23. №1. С.23-26.

37. Lu Н.-Т., Jiang Y., Li Н.-В. Simultaneous Determination of Oxytetracycline,

38. Doxycycline, Tetracycline and Chlortetracycline in Tetracycline Antibiotics by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection // J. Chromatogr. 2004. V.60. № 5/6. P.259-264.

39. Yekkala R., Diana J., Adams E. Development of an Improved Liquid Chromatographic Method for the Analysis of Doxycycline // J. Chromatogr. 2003. V.58. № 5/6. P.313-316.

40. Viennean D.S., Kindberg C.G. Development and validation of a sensitive method for tetracycline in gingival crevicular fluid by HPLC using fluorescence detection // J. Pharmac. Biomed. Anal. 1997. № 16. P. 111-117.

41. Santos M.D.F., Vermeersch H., Remon J.P. Validation of a high-performanceliquid chromatographic method for the determination of doxycycline in turkey plasma // J. Chromatogr. B. 1996. V.682. P.301-308.

42. Nieder M., Jaegear H. Selective Quantification of Doxycycline in Human plasma and Urine with Optimized Chromatography // J. Chromatogr. 1998. V.58. №6. P.526-530

43. Ingolfsson E., Kristmundsdottir Т., Skulason S. Development of a simple HPLC method for separation of doxycycline and its degradation producnts // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. V.33. № 1-2. P.81-89.

44. Zhao F., Zhang X., Gan Y. Determination of tetracyclines in ovine milk byhigh-performance liquid chromatography with coulometric electrode array system//J. Chromatogr. A. 2004. V. 1055, №1-2. P.109-114.

45. Кабрера К., Хайзенредер С., Дике И. Новая неподвижная фаза для разделения активных компонентов лекарственных препаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Росс. хим. журн. 1997. Т. XLI. № 1.С.

46. Skulason S., Ingolfsson E., Kristmundsdottir T. Development of a simple HPLC method for separation of doxycycline'» and its degradation products // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. V. 33. № 4. P.667-672.

47. Cordoba-Borredo M., Cordoba-Dias M., Bemabel. First derivative UV -spectroscopic for determination of norfloxacin with presence of different antacids// J. Pharm. Biomed. Anal. 1996. V.14. P.977-1000.

48. Chan C.Y., Yew W.W., Chung A.F. Introacular concentration and pharmacokinetics of triamcinolone acetonide after a single intravitreal injection//Chemoterapy. 1998. V.44. P.7-13.

49. Abdelgawad F.M., Abouttia F.M. Spectrophotometric determination of Flumequine using Iron (III) Chloride as a Color Developer // Microchem. J. 1994. V.50. P.106-110.

50. Bhowal S.K., Das Т.К. Solution and solid state properties of a set of procaineand procainamide derivatives // Anal. Lett. 1991. V.24. P.25-30.

51. Satry C.S.P., Praad D.S. An intravenous formulation design tree for discovery compounds formulation development // Talanta. 1995. V.52. P.311-320.

52. Das Т., Saha U. Spectrofluorimetric determination of tetracyclines in pharmaceutical preparations with uranyl acetate // Talanta. 1990. V.37. №12. P.l 193-1196.

53. Eboka C.J., Aigbavboa S.O., Akerele J.O. Colorimetric determination of the fluoroquinolones // J. Antimicrob. Chemotherapy. 1997. V.39. P.639-645.

54. Prasad D., Raol K., Sastryl C. Extracitive spectrophotometric Method for the Determination of Certain 4-Quinolones in Drug Formulation // Sci. Pharm. 2000. V.68. P.173-188.

55. Международная фармакопея. 3е издание. Т.1. Общие методы анализа. Всемирная организация здравоохранения. Женева., 1981. С. 165-166.

56. Международная фармакопея. 3е издание. Т.2. Спецификация для контроля качества фармацевтических препаратов. Всемирная организация здравоохранения. Женева. 1983. С.292-297.

57. Oomori Y. Disk-diffusion method for determination of norfloxacin using E. coli NINJ JC-2 and modified Muller-Hinton medium // Chemotherapy. 1981. V.29. P.91-94.

58. Bland J. Determination of norfloxacin in serum, tissues and serum using Klebsiellapxeumonia ATCC 10031 //Eur. J. Clin. Microbiol. 1983. V.2. P.249.

59. Leigh D.A., Harris C.A., Tail S., Walsh В., Hancock P. Microbiological determination of lomefloxacin in serum using the disc susceptibility test // J. Antimicrob. Chemotherapy. 1991. V.27. P.655-659.

60. Зельцер И. 3., Ануфриева P. Г., Бару Р. В. и др. Токсичность доксициклина гидрохлорида // Фармакол. и токсикол. 1986. № 2. С. 121123.

61. Jin J. Spectrofluorimetric method for determination of norfloxacin after dissolving in hydrogenchloric acid / Anal. Abatr. 1991. V.53. P.5-39.

62. El-Yazbi F.A. . Ciprofloxacin as broad-spectrum empiric therapy- are fluoroquinolones still viable monotherapeutic agents compared with lactams: Data from the MYSTIC Program (US) // Spectroscopy Lett. 1992. V.25. P.279-286.

63. Drakopouos A.I., Loannou P.C. The interactions of metal ions withquinolone antibacterial agents // Anal. chim. acta. 1997. V.354. P.197-203.

64. Rizk M., Belal F, Ibrahim F. Spectrofluorimetric analysis of 4-quinolone in pharmaceuticals and biological fluids // Pharmaceut. Acta Helv. 2000. V. 74. P. 371-377.

65. Michael E. El-Kommos, Gamal A. S., Samia M. E-G. Spectrofluorimetric determination of certain quinolone antibacterials using metal chelation // Talanta. 2003. V.60. P. 1033-1050.

66. Zhihong L., Zuyun H., Ruxiu C. Study of the fluorescence characteristics of norfloxacin in reversed micelles and application in analysis // Analyst. 2000. V.125. P.1477-1481.

67. Duran-Meras I., Munoz de-La-Pena, Salinas I., Rodrigues C. Simultaneous fluorometric determination of nalidixic acid and 7-hydroxymethylnalidixic acid by partial least squares calibration // Appl. Spectrosc. 1997. V.51. P.684-692.

68. Xu L., Huang Z.Y., Chen Z.H. Spectofluorimetric determination of norfloxacinin presence of cyclodextrin // Anal. Abstr. G28.

69. Wang Yu., Feng L., Jiang C. Fluorimetric study of the interaction between human serum albumin and quinolones terbium complex and its application // Spectrochim. Acta Part A: Molecular and Biomolec. Spectrosc. 2005.V.61, № 13-14. P.2909-2914.

70. Roger D. J. Study of Micellar Solutions to Enhance the Europium sensitized Luminescence of Tetracycline // Analyst. 1995. V.120. P.2867-2872.

71. Georges J., Arnaud N. Sensitive detection of tetracycline using europium-sensitized fluorescence with EDTA as co-ligand and cetyltrimethylammonium chloride as surfactant // Analyst. 2001. V. 126. P.694-697.

72. Hernandez-Arteseros J.A., Compano R., Prat M.D. Application of principal component regression to luminescence data for the screening of ciprofloxacin and enrofloxacin in animal tissues//Analyst. 2000. V.125. P.l 155-1163.

73. Veiopoulou C.J., Ioannou P.C., Liaidou E.S. Application of terbium sensitized fluorescence for the determination of fluoroquinolone antibiotics pefloxacin, ciprofloxacin and norfloxacin in serum // J. Pharm. Biomed. Anal. 1997. V.15. P.1839-1843.

74. Panadero S., Gomez-Hens A., Perez-Bendito D. Stopped flow kinetic determination of nalidixic acid and norfloxacin based on lanthanide-sensitized fluorescence // Anal. Chim. Acta. 1995. V.303. P.39-45.

75. Jiang C.Q., Zhang N. Enzyme-amplified lanthanide luminescence based on complexation reaction a new technique for the determination of doxycycline // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. V.35. P.1301-1306.

76. El-Walily A.F.M., Belal S.F., Bakru R.S. Spectrophotometric and spectrofluorimetric estimation of ciprofloxacin and norfloxacin by ternary complex formation with eosin and palladium(II) // J. Pharm. Biomed. Anal. 1996. V.14. P.561-569.

77. Rizk M.3 Belal F., Aly F.A., El-Enany N.M. Differential pulse polarographic determination of ofloxacin in pharmaceuticals and biological fluids // Talanta. 1998. V.6. №1. P.83-89.

78. Xu Y., Shen H. X., Huang H.G., Studies on the energy transfer system of terbium-norfloxacin chelate and its interaction with serum albumins // Anal. Abstr. 1997. V.59. 11 G 48.

79. Jiang C., Luo L. Spectrofluorimetric determination of human serum albumin using a doxycycline-europium probe // Anal. Chim. Acta. 2004. V.506. № 2. P.171-175.

80. Jing L., Jinkai L., Xiaojing Z. Spectrofluorimetric determination of heparin using doxycycline-europium probe // J. Luminescence. 2005. V.113. №3-4. P.305-313.

81. Бельтюкова C.B., Егорова A.B., Теслюк О.И. Хелаты европия (III) и тербия (III) с производными хинолонкарбоновой кислоты как метки для иммунофлуоресцентного анализа. // Журн. аналит. химии. 2000. Т.55. №7. Р.760-768.

82. Elbanowski М., Makowska В. The lanthanides as luminescent probes in investigations of biochemical systems. // J. Photochem. Photobiol. A. Chem. 1996. V.99. P.85-92.

83. Lis S. Analytical applications of lanthanide luminescence in solution. // Chem. Anal. 1993. V. 38. P.443-454.

84. Полуэктов H.C., Кононенко Л.И., Ефрюшина Н.П., Бельтюкова С.В. Спектрографические и люминесцентные методы определения лантанидов. Киев: Наукова Думка. 1989. 253 с.

85. Lis S., Elbanowski М., Makowska В., Hnatejko Z. Energy transfer in solution of lanthanide complexes. // J. Photochem. Photobiol. A. Chem. 2002. V.150. P. 233-247.

86. Georges J. Lanthanide-sensitized luminescence and application to the determination of organic analytes A review. // Analyst. 1993. V.118. P.1481-1486.

87. Лен Ж-М. Супрамолекулярная химия: концепции и перспективы. -Новосибирск: Наука, 1998. сЛ 15.

88. Namera A., Yashiki M., Nishida M., Kojima T. Direct extract derivatization for determination of amino acids in human urine by gas chromatography and mass spectrometry // J. Chromatogr. 2002. V.776. № 1. P.49-55.

89. Tcherkas Y.V., Kartsova L.A., Krasnova N. Analysis of amino acids in human serum by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chromatogr. 2001. V. 913. № 1-2. P. 303-308.

90. Costin J.W., Francis P.S., Lewis S.W. Selective determination of amino acids using flow injection analysis coupled with chemiluminescence detection // Anal.Chim. Acta. 2003. V.480. № 1. P.67-77.

91. Чернобровкин М.Г., Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Шпигун О.А. Определение энантиомеров аминокислот в фармацевтических препаратах методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии. 2004. Т.59. № 1. С.64-72.

92. Gioia M.G., Gatti R., Minarini A. LC determination of leuprolide component amino acids in injectable solution by phanquinone pre-column derivatizationabeling procedure // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V.37. № 5. P.l 135-1141.

93. Hirokawa Т., Okamoto H., Gosyo Y., Tsuda Т., Timerbaev A.R. Simultaneous monitoring of inorganic cations, amines and amino acids in human sweat by capillary electrophoresis //Anal. Chim. Acta. 2007. V.581. № 1. P.83-88.

94. Latorre R.M., Saurina J., Hernandez-Cassou S. Determination of amino acids in overlapped capillary electrophoresis peaks by means of partial least-squares regression // J. Chromatogr. 2000. V.570. № 1. P.331-340.

95. Zhang L.-Y., Sun M-X. Determination of histamine and histidine by capillary zone electrophoresis with pre-column naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde derivatization and fluorescence detection // J. Chromatogr. 2004. V.1040. № 1. P.133-140.

96. Ali A. Ensafi, R. Hajian. Determination of tryptophan and histidine by adsorptive cathodic stripping voltammetry using H-point standard addition method //Anal. Chim. Acta. 2006. V.580. № 2. P.236-243.

97. Perez A. S., Conde F. L., Mendez J. H. Polarographic determination of phenylalanine, tyrosine, methionine, glutamic acid and histidine with a dropping copper amalgam electrode //J. Electroanal. Chem. 1976. V.74. № 3. P.339-346.

98. E1-Brashy A. M., Al-Ghannam S.M. Titrimetric Determinations of Some Amino Acids //Mikrochem. J. 1996. V.53. № 4. P.420-427.

99. Chen Z., Liu J., Han Y. A novel histidine assay using tetraphenylporphyrin manganese (III) chloride as a molecular recognition probe by resonance light scattering technique // Anal. Chim. Acta. 2006. V.75. № 3. P. 109-115.

100. Wu J.G., Shi C., Zhang X. Estimating the amino acid composition in milled rice by near-infrared reflectance spectroscopy // Field Crops Research. 2002. V.75. № 1. P.1-7.

101. Wagner В., Manus J.E. Enhancement of the fluorescence and stability of o-phthalaldehyde-derived isoindoles of amino acid using hy droxypropy 1-P-cyclodextrin // J. Chromatogr. 1998. V. 712. № 2. P.235-241.

102. Li X., Ma H., Dong S., Duan X., Liang S. Selective labeling of histidine by a designed fluorescein-based probe // Talanta. 2004. V.62. P.367-371.

103. Imai K., Watanabe Y. Fluorimetric determination of secondary amino acid by 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazole // Anal. Chim. Acta. 1981. V.130. № 2. P.377-383.

104. Mundy D.E., Quick M.P., Machin A.F. Determination of warfarin in animal relicta and feedingstuffs by high-pressure liquid chromatography with confirmation of identity by mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 1976. V. 121. № 2. P.335-342.

105. Hunter K.A. Determination of coumarin anticoagulant rodenticide residues in animal tissue by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 1983. V.270. P.267-276.

106. Determination of coumarin anticoagulant rodenticide residues in animal tissue by high-performance liquid chromatography I. Fluorescence detection using post-column techniques // J. Chromatogr. A. 1983. V.270. P.277-283.

107. Boppana V.K., Schaefer W.H., Cyronak M.J. High-performance liquid-chromatographic determination of warfarin enantiomers in plasma automated on-line sample enrichment // J. Biochem. Biophys. Methods. 2002. V.54. № 1-3. P.315-326.

108. Sanchez F.G., Diaz A.N., Pareja A.G. Ion-pair reversed-phase liquid chromatography with fluorimetric detection of pesticides // J. Chromatogr. A. 1994. V.676. № 2. P.347-354.

109. Hunter K. High-performance liquid chromatographic strategies for the determinarion and confirmation of anticoagulant rodenticide in animal tissues //J. Chromatogr. A. 1985. V.321. P.255-272.

110. Lang D., Bocker R. Highly sensitive and specific high-performance liquid chromatographic analysis of 7-hydroxywarfarin, a marker for human cytochrome P-4502C9 activity // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1995. V. 672. № 2. P. 305-309.

111. Medvedovici A., David F., Sandra P. Determination of the rodenticides warfarin, diphenadione and chlorophacinone in soil samples by HPLC-DAD // Talanta. 1997. V.44. № 9. P. 1633-1640.

112. Sanchez F.G., Blanco C.C. Synchronous derivative room-temperature phosphorescence determination of warfarin in blood serum // Anal. Chim. Acta. 1989. V.222. № 1. P.177-188.

113. Ring P. R., Bostick J.M. Validation of a method for the determination of (R)-warfarin and (S)-warfarin in human plasma using LC with UV detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. V.22. № 3. P.573-581.

114. Wong Y.W.J., Davis P.J. Analysis of warfarin and its metabolites by reversed-phase ion-pair liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. A. 1989. V.469. P.281-291.

115. McCormick T.J., Gibson A.B., Diana A.B. Development and validation of a dissolution method for warfarin sodium and aspirin combination tablets // J. Pharm. Biomed. Anal. 1997. V.15. № 12. P.1881-1891.

116. Locatelli I., Kmetec V., Mrhar A., Grabnar I. Determination of warfarin enantiomers and hydroxylated metabolites in human blood plasma by liquid chromatography with achiral and chiral separation // J. Chromatogr. B. 2005. V.818.№2. P.191-198.

117. Pouliquen H., Fauconnet V., Morvan M.-L., Pinault L. Determination of warfarin in the yolk and the white of hens' eggs by reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1997. V.702. № 1-2. P.143-148.

118. Dalbacke J., Dahlquist I., Persson C. Determination of warfarin in drinking water by high-performance liquid chromatography after solid-phase extraction //J. Chromatogr. A. 1990. V.507. P.381-387.

119. Hou J., Zheng J., Shamsi S.A. Separation and determination of warfarin enantiomers in human plasma using a novel polymeric surfactant for micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2007. V.1159. №1 1-2. P.208-216.

120. Mundy D.E., Machin. A.F. The multi-residue determination of coumarin-based anti-coagulant rodenticides in animal materials by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. V. 234. № 2. P.427-435.

121. Sun S., Wang M., Su L., Li L., Li H., Gu D. Study on warfarin plasma concentration and its correlation with international normalized ratio // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V.42. № 2. P.218-222.

122. Muccio A.D, Camoni I., Vergori L., Dommarco R., Barbini D.A. Screening for coumatetralyl in soft drinks by solid-matrix extraction and high-performance liquid chromatography with diode-array detection // J. Chromatogr. A. 1991. V.553. P.305-309.

123. Osman A., Arbring K., Lindahl T.L. A new high-performance liquid chromatographic method for determination of warfarin enantiomers // J. Chromatogr. B. 2005. V.826. № 1-2. P.75-80

124. Ghoneim M. M., Tawfik A. Assay of anti-coagulant drug warfarin sodium in pharmaceutical formulation and human biological fluids by square-wave adsorptive cathodic stripping voltammetry // Anal. Chim. Acta. 2004. 511. № 1. P.63-69.

125. Zhang J., На P.T.T., Lou Y., Hoogmartens J., Van Schepdael A. Kinetic study of cytochrome P450 3A4 activity on warfarin by capillary electrophoresis with fluorescence detection // J. Chromatogr. 2005. V.1082. № 2. P.235-239.

126. Hassan S.S.M., Mahmoud W.H., Elmosallamy M.A.F., Almarzooqi M.H. Iron(II)-phthalocyanine as a novel recognition sensor for selective potentiometric determination of diclofenac and warfarin drugs // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V.39. № 1-2. P.315-321.

127. Ложкин A.B., Саканян Е.И. Природные кумарины: методы выделения и анализа (обзор) // Хим. фарм. журнал. 2006. Т.40. №6. С.47-55.

128. Hollifield Н.С., Winefordner J.D. Fluorescence and phosphorescence characteristics of anticoagulants // Talanta. 1967. V.14. №1. P.103-107.

129. Panadero S., Gomes-Hens A., Perez-Bendito D. Simulataneous determination of warfarin and bromdiolone by derivative synchronous fluorescence spectrometry // Talanta. 1993. V.40. № 2. P.225-230.

130. Tran C.D., Oliveira D. Fluorescence determination of enantiomeric composition of pharmaceuticals via use of ionic liquid that serves as both solvent and chiral selector // Anal. Biochem. 2006. V.356. № 1. P.51-58.

131. Garcia Sanchez F., Ramos Rubio A.L., Cerda V. Oms M.T. Variable-angle scanning fluorescence spectrometry for the determination of closely overlapped pesticide mixtures // Anal. Chim. Acta. 1990. V.228. P.293-299.

132. Shidemasa I., Mamotu K. Cyclodextrin inclusion effect and fluorimetric properties of the pesticide warfarin // Chemosphere. 1997. V.34. № 4. P.783-789.

133. Badia R., Diaz-Garcia M. Cyclodextrin-Based Optosensor for the Determination of Warfarin in Waters // J. Agric. Food Chem. 1999. V.47. P.4256-4260.

134. Tang L. X., Rowell F.J. Rapid determination of warfarin by sequential injection analysis with cyclodextrin-enhanced fluorescence detection // Anal. Lett. 1998. V.5.P.891-901.

135. Welling P.G., Lee K.P., Khanna V., Wagner J.C. // J. Pharm. Sci. engineering. 1979. V.59. P.1621-1625.

136. Sanchez F. G., Cedazo M., Lovillo J., Diaz A. N. Variable-angle synchronous.,. fluorescence spectrometry and rank annihilation methods for mixture resolution // Talanta. 1996. V.43. P. 1327-1333.

137. Vilchez Quero J.L., Rohand J., Monton A.N., Avidad Castaneda R., Capitan -Vallvey L.F. Determination of warfarin at trace-levels in water by solid-phase spectrofluorimetry // Fresenius J. Anal. Chem. 1996. V.354. P.470.

138. Zhu G-Y., Si Z-K., Zhu W-J. Study on Sensitized Luminescence of Rare Earths by Fluorescence Enhancement of the Europium-Gadolinium-Difacinone-Ammonia Complex System and its Application // Analyst. 1990. V.l 15. P.l 139-1141.

139. Sendra В., Panadero S., Gomes-Hens A. Kinetic determination of bromadiolone based on lanthanide-sensitized luminescence // Anal. Chim. Acta. 1997. V.335. P.145-150.

140. Deppa S., Mishra A. K. Fluorescence spectroscopic study of serum albumin-bromadiolone interaction: fluorimetric determination bromadiolone // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V.38. P.556-563.

141. Tang J., Qi Sh., Chen X. Spectroscopic studies of the interaction of anticoagulant rodenticide diphacinone with human serum albumin // J. Molec. Struct. 2005. V.779. P.87-95.

142. Ruedas Rama M. J., Ruiz Medina A., Molina Diaz A. Use of a solid sensing zone implemented with unsegmented flow analysis for simultaneous determination of thiabendazole and warfarin // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 459. № 2. P.235-243.

143. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. Ленинград: Химия. 1986. С.431.

144. Штыков С.Н., Смирнова Т.Д., Калашникова Н.В., Жемеричкин Д.А. Флуориметрический метод определения норфлоксацина, основанный на явлении переноса энергии // Изв. вузов. Химия и хим. технол. 2006. Т.49. №7. С.27-30.

145. Штыков С.Н. Химический анализ в нанореакторах: основные понятия и применение //Журн. аналит. химии. 2002. Т.57. № 10. С. 1018-1028.

146. Саввин С.Б., Чернова Р.К., Штыков С.Н. Поверхностно-активные вещества (Аналитические реагенты). М.: Наука. 1991. 251с.

147. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии. Книга 1. Общие вопросы. Методы разделения. Москва: «Высшая школа». 1999. С. 54.

148. Ni Y., Su Sh., Kokot S. Spectrofluorimetric studies on the binding of salicylic acid to bovine serum albumin using and ibuprofen as site markers with the aid of parallel factor analysis // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 580. P.206.

149. Левшин Л.В., Салецкий A.M. Оптические методы исследования молекулярных систем. 4.1 Молекулярная спектроскопия. М.: Изд-воМГУ. 1994. С.320.

150. Parson W.W. Modern Optical Spectroscopy. Springer-Verlag: Berlin Heidelberg, 2007. 512 p.

151. Otto M. Современные методы аналитической химии. 2-е исправл. издание. / Пер. с немецкого под ред. А.В. Гармаша. Техносфера. Москва. 2006. С.363-371.

152. Штыков С.Н. Организованные среды стратегия, основанная на принципах биоподобия в аналитической химии // Вестник Харьк. нац. ун-та. Химия. 2000. №495. Вып.6. С.9-14.

153. Дорофеев B.JL, Сюбаева С.Е., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ для анализа чистоты лекарственных средств группы фторхинолонов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. №2. С. 199-204.

154. Стид Д. В., Этвуд Д.Л. Супрамолекулярная химия Т.1. М.:«Академкнига». 2007. С.372-379.

155. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Veterinary Medicines Evalution Unit. 1996. P. 104-111.

156. Moffat A.C., Jackson J.V., Moss M.S. Clarkes isolation and identification of Drugs, 2nd end. The Pharmaceutical Press. London. 1986. P. 1068-1065.

157. Heitzman R.J. Veterminary Drug Residues: Residues in Food-Products Preference Materials and Methods, Blackwell Scientific Publ. Oxford. 1994.

158. Падейская E.H., Яковлев В.П. Фторхинолоны. М.: Биоинформ. 1995. С.54.

159. Rodaut B. Yorke J.-C. High—performance liquid chromatographic method with fluorescence detection for the screening and quantification of oxolinic acid, flumequine and sarfloxacin in fish // J. Chromatogr. B. 2002. V.780. № 2. P.481-485.

160. Touraki M., Ladoukakis M., Prokopiou C. High-performance liquid chromatographic determination oxolinic acid and flumequine in the live fish feed Artemia // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 2001. V.751. № 2. P.247-256.

161. Thanh H.H., Andersen A.T., Agasoster T. Automated column-switching high-performance liquid chromatographic determination of flumequine and oxolinic acid in extracts from fish // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1990. Y.532. P.363-373.

162. Аркадьева Г. В. Автореферат дис. д-ра мед. наук «Антикоагулянтная терапия в профилактике и лечении тромботических и тромбоэболических осложнений при сердечно-сосудистой патологии». Москва. 2006. С.З.

163. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-воМГУ. 1961. С.494.