Определение органических ксенобиотиков в волосах человека методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

МАРУЦЕНКО ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Определение органических ксенобиотиков в волосах человека методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Поленова Татьяна Владимировна Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Панин Сергей Николаевич кандидат химических наук, доцент Гурковская Елена Александровна

Ведущая организация:

Институт высокомолекулярных соединений РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится 23 июня 2004 г. в 16 часов 10 минут в ауд. 344 на заседании диссертаиионного Совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последнее десятилетие резко возрос интерес к анализу следовых количеств органических веществ Вместе с тем начал расширяться и круг объектов этого анализа - в частности, медико-биологических, к которым относятся биологические жидкости и ткани С появлением высокочувствительных инструментальных методов биомониторинг инородных органических веществ сразу же приобрел практическое значение в таких сферах жизнедеятельности людей, как медицина, токсикология, судебно-медицинская экспертиза, криминалистика и экология Возник интерес и в социальной сфере, благодаря возможности контролировать употребление наркотических, психотропных и допинговых препаратов сотрудниками опасных областей производства или спортсменами Остался, однако, ряд нерешенных проблем

Классическими объектами арбитражного анализа считаются кровь и моча Извлечение соединений из них, как правило, проводится с помощью различных методов экстракции Однако указанные объекты имеют большой недостаток инородные соединения метаболизируют в крови и быстро выводятся из организма человека с мочой Первая проблема биомониторинга состоит в том, что анализ биожидкостей характеризует только текущий процесс выведения вещества Поэтому в настоящее время многие зарубежные исследователи обратились к использованию нетрадиционных объектов анализа - таких, как волосы человека Волосы являются естественным сорбентом, постепенно накапливающим в своей структуре те соединения, которые либо не попадают, либо малоустойчивы в крови и моче, что дает возможность получения информации об их воздействии на организм в течение длительного времени Тем не менее, вторая проблема современного биомониторинга заключается в том, что сложность химического состава и низкое содержание ксенобиотиков в матрице ограничивают широкое использование волос как объекта анализа

Основными методами определения ксенобиотиков в волосах человека являются иммуноферментный анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием Несмотря

на очевидные достоинства перечисленных мето ов их за днительно применять

з РОС. П \ Ц^Я ОI! Л л I.! 1А Я

для целей мониторинга из-за длительности анализа и высокой стоимости оборудования. Напротив, высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) удовлетворяет требованиям скрининга, но мало популярна для решения сложных аналитических задач из-за низкой чувствительности метода. Сочетание ВЭТСХ с предварительным концентрированием аналитов дает возможность избежать этого недостатка.

Третья проблема заключается в стандартизации процедуры анализа. Говоря о степени извлечения ксенобиотиков из структуры волос, исследователи оперируют такими понятиями, как «больше» или «меньше», и порой опрометчиво судят о полноте десорбции вещества из протеиновой матрицы.

Четвертая проблема связана с ограниченностью круга ксенобиотиков, которые удалось определить в волосах человека. Наиболее изученным является определение в волосах наркотических препаратов - опиатов, каннабиноидов и кокаина. Часть исследований посвящена вопросам, связанным с обнаружением лекарственных препаратов, но при этом нет данных о том, включаются ли в структуру волос неполярные канцерогенные соединения, например, полиароматические углеводороды (ПАУ). Вполне очевидно, что на данный момент возможности определения ПАУ в организме человека остаются практически неиспользованными, несмотря на увеличение числа курящих людей, неблагоприятную экологическую обстановку и прочие негативные факторы.

Цель работы заключалась в оценке возможностей и разработке скрининговой процедуры на основе сочетания высокоэффективной тонкослойной хроматографии с микрожидкостной экстракцией (МЖЭ) для определения психотропных препаратов и полиароматических углеводородов в волосах человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить экстракционное поведение ряда психотропных лекарственных препаратов и некоторых представителей класса ПАУ, используемых в работе в качестве модельных соединений, и оценить возможность реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования определяемых компонентов.

2. Оптимизировать условия, оценить метрологические характеристики и получить количественные характеристики группового и внутригруппового определения модельных соединений методом ВЭТСХ.

3. Изучить закономерности сорбции модельных соединений на волосах человека из газовой фазы и из раствора с целью создания образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков.

4. Изучить эффективность различных способов извлечения органических веществ из модельных образцов волос и выбрать оптимальный «матричный растворитель»1.

5. Разработать методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Научная новизна. Изучено экстракционное концентрирование ряда лекарственных препаратов (фенотиазиновых производных, антидепрессантов и дифенгид-рамина) в наиболее перспективной для МЖЭ системе гексан - вода. Показана принципиальная возможность реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования определяемых компонентов. Изучено хрома-тографическое поведение модельных ксенобиотиков в ВЭТСХ системах с различными подвижными и неподвижными фазами. Изучена сорбция соединений класса ПАУ из сигаретного дыма и модельных лекарственных препаратов из водных растворов на волосы человека. На основе полученных закономерностей разработан подход, позволяющий провести оценку соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений волос человека. Изучена эффективность различных способов извлечения органических веществ из белковой структуры волоса и предложены принципиально новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков из волос человека.

Практическая значимость работы. Доказано, что полиароматические углеводороды аккумулируются в волосах курильщиков. Предложены способы приготовления стандартных образцов волос с известным эндогенным содержанием органических ксенобиотиков на основе двух подходов: сорбции из газовой фазы и из

раствор вещества или смеси веществ, разлагающий волосы

5

водного раствора. Для группового определения соединений класса ПАУ предложена новая хроматографическая система с подвижной фазой состава гексан-дихлометан-нитробензол (5:5:0.1). Разработаны методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Проведено определение некоторых лекарственных препаратов в волосах пациентов психиатрических клиник, а также групповое определение ПАУ в волосах курильщиков.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты изучения экстракционного поведения модельных лекарственных препаратов в системе гексан - вода.

2. Результаты исследования поведения модельных лекарственных препаратов в тринадцати хроматографических системах с различными подвижными и неподвижными фазами.

3. Способ модификации подвижной фазы при групповом ВЭТСХ определении соединений класса ПАУ.

4. Результаты изучения сорбции соединений класса ПАУ из сигаретного дыма и модельных лекарственных препаратов из водных растворов на волосах человека.

5. Разработанный подход для оценки соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений и способы приготовления образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков в волосах человека.

6. Данные по изучению эффективности различных способов извлечения органических веществ из белковой структуры человеческого волоса и предложенные в работе новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков.

7. Методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на международных симпозиумах «Balaton Symposium'99 on high-performance separation methods» (Венгрия, 1999 г.), «Planar Chromatography-2001» (Венгрия, 2001 г.), «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Россия, Туапсе, 2002

б

г.) и VIII Международной научно-практической конференции «Косметические средства и сырье: безопасность и эффективность» (Россия, Москва, 2003 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ 3 статьи и 6 тезисов докладов

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы (3 раздела), экспериментальной части и обсуждения результатов (4 раздела), приложения, выводов и списка литературы (166 наименований). Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 23 таблицы. В обзоре литературы систематизированы сведения об объекте анализа, стадиях пробоподготовки волос, методах анализа волос и классах определяемых соединений. В последующих разделах изложены результаты экспериментальных исследований и их обсуждение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть Органические ксенобиотики, определяемые в волосах человека, можно условно разделить на полярные и малополярные соединения. Кроме того, классификацию можно провести и на основе принципа поступления органических веществ в волосы некоторые соединения могут быть включены в структуру волос преимущественно эндогенным путем (через кровь и прочие биожидкости организма), для других характерен как эндогенный, так и экзогенный (из окружающей среды) способ включения. Для полноты исследования было необходимо изучить взаимодействие с матрицей волос некоторых представителей перечисленных групп

В качестве представителей полярных соединений нами были выбраны лекарственные препараты: дезипрамин (DEZ), амитриптилин (AMI), анафранил (ANF), мапротилин (MAP), левомепромазин (LEV), аминазин (AMZ), хлорпротиксен (CLO), сонапакс (SON) и дифенгидрамин (DIF) В организм человека они попадают в виде инъекций или таблеток, то есть для них характерен эндогенный путь проникновения в матрицу волос. Все перечисленные соединения являются органическими третичными аминами. В качестве малополярных модельных соединений были выбраны следующие представители класса полиароматических углеводородов (ПАУ): антрацен, аценафтен, 3,4-бензпирен, пирен, флуорантен и фенантрен В организм человека ПАУ могут попадать из пищи (особенно копченой и жареной) и

грязной воды, но главным путем их внедрения в организм является вдыхание загрязненного воздуха и курение. Для этих соединений возможны два пути проникновения в матрицу волос: эндогенный и экзогенный.

Хроматографическое разделение проводили в вертикальной камере (Ленхром, Россия) на пластинах Silufol без УФ-индикатора (Kavalier, Чехословакия), пластинах Sorbfil с УФ-индикатором 254 нм (Сорбполимер, Россия) и пластинах Merck с УФ-индикатором 254 нм и зоной концентрирования (Merck, Германия). Для нанесения проб использовали микрошприцы объемом 10, 50 мкл (Hamilton, США) и 250 мкл (Camag, Швейцария). Денситометрические измерения проводили на денситометре Camag TLC Scanner 3 с программным обеспечением "Cats 4" (Camag, Швейцария). Спектры водных растворов лекарственных препаратов снимали на регистрирующем спектрофотометре Specord UV VIS в кварцевых кюветах длиной 1 см. Измерения рН проводили на универсальном иономере ЭВ-74. Ультразвуковую обработку волос проводили с использованием УЗ-ванны Branson 2510 (Bransonic, США). На основе сравнения физических характеристик ряда органических экстрагентов, для проведения МЖЭ был выбран гексан. МЖЭ проводили в стеклянном микроэкстракторе (J&W Scientific, США).

Газохроматографический анализ с масс-спектрометрическим детектированием на содержание ПАУ был проведен в лаборатории методов концентрирования кафедры аналитической химии химического факультета МГУ. Газохроматографический анализ с масс-спектрометрическим детектированием на содержание лекарственных препаратов был проведен на кафедре токсикологической химии ММА им. И. М. Сеченова (Республиканский научно-учебно-методический центр аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ в организме человека). Поляризационно-флуоресцентный имму-ноанализ на содержание амитриптилина был проведен на кафедре энзимологии химического факультета МГУ.

В исследованиях были использованы волосы головы человека. В качестве модельных (чистых) образцов волос были использованы волосы добровольцев, некурящих и не употреблявших психотропные препараты.

Оптимизация условий хроматографического определения ПАУ в тонком слое 8

В настоящей работе было предложено групповое определение ПАУ в тонком слое, что связано, в первую очередь, с низким содержанием этих соединений в выбранном объекте. Нами было исследовано разделение ПАУ в ряде подвижных фаз (ПФ), выбор которых основывался на использовании системы "Призма". Однако, результаты оказались неудовлетворительными. Установлено, что группового определения ПАУ можно достичь, используя акцептор электронов в качестве модификатора ПФ. Среди известных и доступных органических веществ-акцепторов нами был выбран нитробензол (НБ). В качестве подвижной фазы мы выбрали гек-сан - ДХМ (5:5) из-за простоты компонентного состава и модифицировали ее НБ. Наши исследования показали, что НБ обладает негативным свойством, он гасит флуоресценцию. При относительно небольших его количествах в ПФ интенсивность пика флуоресценции ПАУ может снизиться в два раза. Однако, определенное процентное содержание НБ в ПФ позволяет сузить хроматографическую зону ПАУ и получить более узкий пик на денситограмме, что важно для количественных определений. Поэтому было необходимо выявить зависимость между количеством НБ в ПФ и интенсивностью пика флуоресценции. Полученная зависимость представлена на рис. 1.

1 2 3 4 5

% НБ в ПФ

Основываясь на полученных результатах, для дальнейшей работы нами была выбрана ПФ состава гексан - ДХМ - НБ (5:5.0.1). В качестве неподвижной фазы мы выбрали пластины марки Silufol, поскольку на пластинах марки Merck хрома-тографическая зона ПАУ оказалась более растянутой. Кроме того, сорбент на пластинках марки Merck имеет более плотную структуру, что затрудняет удаление НБ после хроматографирования.

Поскольку НБ является высококипящим растворителем, его сложно удалить с пластины. Как показали наши эксперименты, эффекта снижения температуры кипения НБ удается добиться, выдерживая пластину в камере, насыщенной парами ледяной уксусной кислоты. Установлено, что оптимальное время выдержки пластины после элюирования в парах ледяной уксусной кислоты составляет 3 минуты. На основе выбранных условий была построена градуировочная зависимость площади пика флуоресценции от общего количества ПАУ в хроматографической зоне. Предел обнаружения смеси ПАУ составил 0.5 нг/зона.

Изучение сорбции ПАУ из сигаретного дыма на волосы человека

Для определения степени извлечения ПАУ из структуры волоса было необходимо приготовить модельные образцы волос с известным содержанием ПАУ. Для этого мы использовали процесс сорбции ПАУ на волосы из газовой фазы. В качестве газовой фазы был выбран сигаретный дым. Чтобы количественно контролировать сорбированные волосами ПАУ, было необходимо определить общее содержание ПАУ в основном потоке сигаретного дыма. Установлено, что среднее общее количество ПАУ в дыме одной сигареты составляет (0.8 ± 0.1) мкг (Р = 0.95, п = 10). Для проверки правильности анализа, после элюирования хроматографиче-скую зону ТСХ-пластины, содержащую ПАУ, соскребали скальпелем, добавляли 200 мкл дихлорметана и экстрагировали. Полученный экстракт использовали для проведения ГХ/МС анализа. Результаты анализа показали наличие в экстракте девяти соединений этого класса: 1-метилнафталин, 1,8-диметилнафталин, 2,6-диметилнафталин, 1,2-диметилнафталин, 1,3-диметилнафталин, флуорен, антрацен, флуорантен и пирен. Присутствие в хроматографической зоне ПАУ метили-рованых полиароматических углеводородов подтверждает возможность использования данной системы для общегруппового анализа.

В настоящей работе было предложено определение понятий внутреннего и внешнего типов загрязнения, на основе чего были приготовлены образцы волос с известным количеством эндогенно связанных ПАУ. Результаты исследования показали, что в выбранных условиях волосы сорбируют из сигаретного дыма только 5 - 6 % ПАУ. Также была установлена скорость перераспределения ПАУ между поверхностью волоса и его внутренней структурой: уже через 5 суток наблюдается

практически полный переход веществ в протеиновую сетку волос. Приготовлен-

10

ные модельные образцы волос использовали для выбора условий извлечения ПАУ из белковой матрицы.

Выбор условий извлечения ПАУ из матрицы волос В большинстве известных исследований вещества, извлекаемые из волос, представляют собой полярные молекулы, в отличие от гидрофобных полиароматических углеводородов. Мы предположили, что для извлечения ПАУ из волосяной матрицы, необходимо, использовать растворитель с невысокой полярностью. Однако от применения чистого органического растворителя пришлось отказаться -этот подход требует увеличения времени извлечения и последующего упаривания экстракта. Было решено проверить варианты кислотного и щелочного разложения волос. Учитывая плохую растворимость ПАУ в воде и полярных растворителях, было решено добавлять в систему "полярная фаза - волосы" небольшие количества гексана (100 - 150 мкл) перед УЗ-обработкой. В эксперименте использовали приготовленные модельные образцы волос. Навеска волос в каждом случае составляла 100 мг, объем «матричного растворителя» 4 мл. После окончания УЗ-обработки полученную вытяжку переносили в микроэкстрактор и экстрагировали в 200 мкл гексана. При использовании ледяной уксусной кислоты вытяжку перед проведением МЖЭ разбавляли водой (3 мл) для расслоения фаз. Количество ПАУ в концентрате определяли методом ВЭТСХ. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, наиболее эффективным «матричным растворителем» является ледяная уксусная кислота.

Таблица 1

Использование различных «матричныхрастворителей» для извлечения ПАУ

из волос. 1уз = 30 мин (Р = 0.95, п = 3)

Полярная фаза Ледяная СНзСООН 0.5 М НС1 НЫОз конц. 2 М КОН 0.5 М КОН

Степень извлечения, % 81.316.3 43.1 ±7.1 7.4 ±3.3 18.213.2 23.5 ±5.4

Также установлено, что оптимальное время извлечения ПАУ из волос составляет 20 минут при комнатной температуре. Используя модельные образцы волос,

свободные от внешнего загрязнения, нами была определена степень извлечения ПАУ из структуры волос при выбранных условиях Она составляет около 80 % Таким образом, в данном исследовании был разработан способ определения ПАУ в волосах человека, состоящий из следующих этапов (объемы растворителей указаны для массы образца волос 100 мг)

• измельчение пробы и взвешивание,

• обработка навески волос ледяной уксусной кислотой (~ 4 мл) и гексаном (100 мкл) в УЗ-ванне при комнатной температуре,

• перенос вытяжки в микроэкстрактор, разбавление водой и экстракция гексаном,

• перенос всего объема экстракта (~ 200 мкл) в тонкий слой и элюирование в системе гексан - ДХМ - НБ (5 5 0 1),

• выдержка ТСХ-пластины в парах ледяной уксусной кислоты и затем в нагретой до 100 °С муфельной печи для удаления нитробензола,

• сканирование пластины на денситометре «Camag»,

• обработка полученных результатов

На основе подхода к приготовлению образцов волос с известным количеством ПАУ, было проведено исследование защитного воздействия препарата «Хитокси-20» на воюсы человека по заказу НПП «Аквион» Было установлено, что а) обработка волос 10% раствором «Хитокси-20» в 4 раза снижает загрязнение волос ПАУ сигаретного дыма, б) обработка волос 10% раствором «Хитокси-20» практически не оказывает влияние на проникновение сорбированных на поверхности ПАУ во внутреннюю структуру волос

Определение параметров экстракции лекарственных препаратов в системе вода - гексан

Процесс экстракции контролировали спектрофотометрически, измеряя оптические плотности водной фазы Для выбора оптимальной длины волны были сняты спектры поглощения водных растворов гидрохлоридов амитриптилина, анаф-ранила, левомепромазина, аминазина и димедрола в области рН 2 - 3 (рис 2) На основании полученных данных были выбраны рабочие длины волн, для которых рассчитали молярные коэффициенты поглощения (табл 2)

[^-гт

длина волны, нм

Результаты исследования экстракции приведены в табл. 2.

Таблица 2

Молярные коэффициенты поглощения водных растворов веществ и пара-

метры экстракции веществ из воды в гексан

Вещество X, нм е, см"'моль'' ^экстр» ССК К™ ах, %

Амитриптилин 245 (3 4 ± 0 4) 104 60 93+2 13± 1

Анафранил 251 (12 ±0.1) 10" 90 90 ±1 9±-1

Левомепромазин 255 (2.4 ±0 2) 104 90 87 ± 1 7 ± 2

Аминазин 253 (3.2 ±0 1)104 90 97+1 22 ±1

Дифенгидрамин 215 (8 8 ±0 6) 103 60 98 + 1 24 ± 1

При экстракции органических соединений из воды в неполярный растворитель основную и определяющую роль играет гидрофобность соединения, которая, в свою очередь, определяется наличием и характером заместителей в молекуле Согласно этим соображениям, наиболее гидрофобным и наименее полярным среди выбранных для изучения препаратов является дифенгидрамин (не содержит заместителей), а наименьшей гидрофобностью обладают молекулы левомепромазина, которые содержат электронодонорную метокси-группу и разветвленную алифатическую цепь. Это подтверждают и полученные экспериментальные данные. Установлено, что при изменении соотношения объемов контактирующих фаз до 50 1

значения степени экстракции R и коэффициента распределения D практически не

13

изменяются. Этот факт свидетельствует о принципиальной возможности реализации варианта микрожидкостной экстракции при концентрировании лекарственных препаратов в системе вода/гексан.

Оптимизация условий хроматографического определения лекарственных препаратов в тонком слое

В рамках настоящей работы было изучено хроматографическое разделение девяти лекарственных препаратов в тринадцати подвижных фазах. Выбор этих фаз был сделан нами на основе общепринятых критериев и соображений, касающихся химической природы разделяемых компонентов. В процессе выбора ПФ были использованы принципы системы «Призма». Установлено, что оптимальной для внутригруппового разделения является подвижная фаза состава гексан - ацетон -хлороформ - трибутиламин (ТБА) (2:2:2:0.2). При этом в качестве НФ были использованы пластины марки Soгbfil. Помимо внутригруппового разделения, представляло интерес отделить вещества, близкие по свойствам и строению, от других возможных соединений, например, соединений, обладающих кислотными свойствами. Это необходимо для варианта группового определения или в том случае, когда ТСХ используют в качестве метода предварительной очистки.

Рис. 3. Денситограммы пластин после элюирования: а) 1 - фенобарбитал, парацетамол, ацетилсалициловая кислота, 2 - MAP и DEZ, 3 - AMI, ANF, LEV, AMZ, SON, CLO и DIF, 4 - фронт растворителя; б) 1 - MAP и DEZ, 2 - AMI, ANF, AMZ, SON и DIF, 3 - LEV и CLO, 4 -фенобарбитал, парацетамол, ацетилсалициловая кислота во фронте растворителя

Как видно из рис. 3, такие результаты достигаются при использовании ПФ (а) гексан - ацетон - диэтиламин (6:3:1) и (б) спиртовой раствор CfyCOONa - ТБА (4:0.2). В обоих случаях вещества основного характера полностью отделяются от других соединений, обладающих кислотными свойствами - парацетамола, ацетилсалициловой кислоты и фенобарбитала. В выбранных условиях были построены градуировочные зависимости площади пика поглощения вещества от его количества в хроматографической зоне. Показано, что пределы обнаружения соединений и воспроизводимость результатов зависят от типа хроматографических пластин и не зависят от состава подвижной фазы. Были оценены пределы обнаружения для вариантов денситометрического (для пластин Merck и Sorbfil) и визуального детектирования. Для визуального детектирования были использованы реактив Марки, концентрированная азотная кислота и тетрароданокобальтат калия (ТРКК). Установлено, что наиболее чувствительным и селективным является реактив Марки. ТРКК селективен для определения органических аминов в присутствии соединений других классов, однако, при внутригрупповом определении он не подходит -все модельные соединения окрашиваются в ярко-голубой цвет. Концентрированная азотная кислота подходит для обнаружения DEZ и ANF, по отношению к которым является весьма чувствительным, но неселективным реагентом.

Изучение сорбции лекарственных препаратов из водных растворов на волосы человека

Вопрос, касающийся сорбционного поведения определяемых соединений на волосяной матрице, в литературе не освещен. Между тем он имеет принципиальное значение для выбора правильной схемы пробоподготовки, исключающей возможность потерь определяемого вещества на различных ее этапах (промывка и удаление жировых загрязнений, вскрытие пробы и т.д.). Для того чтобы изучить степень извлечения лекарственных препаратов из человеческих волос, путем сорбции из водных растворов были приготовлены стандартные образцы волос, содержащие известное количество исследуемых соединений. Сначала была изучена зависимость степени сорбции AMI, ANF, DIF, LEV и AMZ на волосы от рН растворов (рис. 4). Изменение концентраций растворов контролировали спектрофотомет-рически.

s,

Рис. 4. Зависимость степени сорбции S веществ на волосы от рН раствора 1- AMI, 2 - LEV, 3 - ANF, 4-AMZ,5-DlF

3 5 7 РН 9 11

Как видно из рисунка, максимальная степень сорбции AMI, ANF, LEV и AMZ достигается при значениях рН 3 - 6, а кривые сорбции амитриптилина и левоме-промазина имеют вторичные максимумы при рН ~10 Такие результаты могут быть объяснены влиянием нескольких факторов Во-первых, в слабокислой области вероятность возникновения водородных связей между аминокислотами волоса и модельными препаратами выше, что приводит к увеличению степени сорбции Во-вторых, известно, что амфолиты в области значений рН, близких к изоэлектри-ческой точке (pi), достигают предельных значений своих некоторых свойств (склонности к набуханию, растворимости и пр) Для волос pl ~ 4, то есть волосы обладают максимальной способностью сорбировать вещества из растворов в слабокислой области С другой точки зрения, процесс сорбции модельных соедини ний можно рассматривать как взаимодействие оснований (третичных аминов) с кислотой (волосами) В таком случае, степень сорбции веществ из слабокислых растворов будет зависеть от их рК, Из литературных источников известно, что наиболее сильными основаниями являются представители класса ТЦА, а наиболее слабыми основными свойствами обладает DIF При сорбции соединений из слабокислых растворов это является определяющим фактором При значениях рН растворов > 7 самым сильным основанием является гидроксид-ион, что приводит к уменьшению степени сорбции AMI, ANF, LEV и AMZ В щелочных растворах, скорей всего, основное влияние на степень сорбции оказывает растворимость со-

единений - чем меньше соединение растворимо в воде, тем сильнее его сродство к волосам. Этим объясняется наличие вторых максимумов на зависимостях сорбции от рН для AMI и LEV, а также рост степени сорбции DIF. Зависимость степени сорбции от времени контакта волос с растворами веществ была изучена при установленных оптимальных значениях рН. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Степень сорбции (%) лекарственных препаратов из водных растворов

на волосы

Вещество рН раствора Время сорбции, нас

3 5 20 24 - 48 96

AMI 6.0 21.5 ±0.1 28.1 ±0.1 38.5 ±0.4 44.7 ±0 6 53.6 ±0.4 53.1+0.1

ANF 4.0 19 7 ±0.5 33.7±0 6 40.4 ± 0.3 44.9 ±05 50 8 ± 0.8 52 2 ± 0 1

AMZ 3.0 1.5 ±0.1 6.6 ±0.1 9.3 ±0.2 11.1 ±0.1 17.7 ±0.3 17.9 ±0.3

LEV 5.0 1.1+0.1 7.5 ±0.3 13.5 ±0.4 15.7 ±0.2 23.1 ±0.1 23.3 ±0.1

DIF 10.0 22.7 ±0.5 28.7 ±0.2 49.1 ±0.1 56.3 ±0.1 56.3 ±0.2 56.2 ±0.1

Из таблицы видно, что соединения каждого класса имеют очень близкие характеристики процесса сорбции (степень и кинетика сорбции). Исходя из полученных экспериментальных данных, был сделан вывод о том, что трициклические антидепрессанты (AMI и ANF) являются менее полярными соединениями и более сильными основаниями, чем нейролептики (LEV и AMZ) На основании результатов, полученных ранее при изучении экстракции, нами было сделано предположение, что DIF обладает наименьшей полярностью среди выбранных модельных препаратов. Это подтверждают результаты изучения сорбции: у дифенгидрамина отмечена самая высокая степень сорбции, к тому же максимальная степень сорбции в этом случае достигается не за 48 часов, как у остальных соединений, а за сутки.

Сравнивая степень сорбции ПАУ из сигаретного дыма (5-6 %) и лекарственных препаратов из растворов (20 - 50 %), следует сделать вывод о большей эффективности последнего способа. Степень сорбции ксенобиотиков из растворов превышает таковую из газовой фазы в 4 - 10 раз. Это объясняется тем, что вода спо-

собствует набуханию протеиновой сетки волоса и проникновению веществ в ее структуру.

Было рассчитано количество модельных соединений, эндогенно связанных с матрицей волос. Установлено, что распределение внутреннего и внешнего загрязнений различно для ТЦА и нейролептиков. Несмотря на то, что максимальная степень сорбции из раствора наблюдается именно для DIF, AMI и ANF (табл. 3), рассчитанное эндогенное загрязнение оказалось выше для LEV и AMZ. Это говорит о том, что полярные соединения образуют более прочные связи с белковой матрицей. Такое предположение подтверждают и данные, полученные при исследовании сорбции ПАУ на волосы; в ходе первых суток после обработки волос дымом трехкратное мытье образцов раствором додецилсульфата натрия удаляет 100 % сорбированных углеводородов. Интересен тот факт, что полярность соединений влияет и на эффективность промывки образцов для удаления неполярных ПАУ достаточно 3-кратного промывания, ТЦА и дифенгидрамин удаляются с поверхности волос за четыре раза, а для удаления нейролептиков требуется вымыть образцы пять раз Приготовленные модельные образцы волос использовали для выбора условий извлечения лекарственных препаратов из белковой матрицы.

Выбор условий извлечения лекарственных препаратов из матрицы волос

Важнейший этап при анализе волос на содержание органических соединений - извлечение этих соединений из белковой структуры (матрицы) волоса. Здесь существует две проблемы: 1) неполное извлечение веществ из структуры волоса и 2) полное либо частичное разложение веществ в ходе процесса. Заведомо полностью соединения извлекаются при переводе волосяной матрицы в раствор в достаточно жестких условиях (например, при нагревании навески волос в растворе щелочи). При использовании более «мягких» условий извлечения не существует доказательств полного перехода инородных органических соединений из матрицы в раствор, поскольку матрица волоса разрушается лишь частично. Ранее предложенный нами способ извлечения ПАУ из структуры волос оказался неприменим для решения текущей задачи. В ходе работы нами было сделано следующее предположение: степень разложения веществ при извлечении их из структуры волоса (анализ приготовленных модельных образцов) ниже, чем при проведении контрольного

опыта (раствор с внешней добавкой искомых соединений). Это объясняется тем,

18

что в ходе извлечения эндогенных включений большая их часть экранирована белковыми цепями волоса. В контрольном опыте подобная «защита» веществ сводится к минимуму и, соответственно, возрастает их неустойчивость к воздействию агрессивных сред. Необходимо было решить обе выделенные проблемы, т.е. добиться сочетания максимального разрушения матрицы волос с минимальными потерями веществ из-за их разложения в жестких условиях. В качестве матричных растворителей были использованы 0.5 М NaOH, 3 М и 1 М КОН, концентрированная НгБС^ (96 %) и концентрированный раствор ЫНз (25 %). Масса навесок волос не превышала 300 мг. В ходе контрольных опытов нами было установлено, что вещества, принадлежащие к классу нейролептиков, и дифенгидрамин более устойчивы в агрессивных средах, чем трициклические антидепрессанты Было также выявлено, что устойчивость веществ напрямую связана с временем обработки раствора. Например, при использовании 1 М КОН в ходе первых тридцати минут вещества не образуют метаболитов и извлекаются из раствора на 80 - 90 %. Однако, в таком случае, структура волос остается почти не затронутой, что опять приводит к вопросу о полноте извлечения ксенобиотиков из матрицы. Заметное разрушение волос начинается после 1.5 часов обработки, но, вместе с тем, увеличивается степень разложения самих аналитов. Наиболее «мягким» и относительно быстрым оказался способ, основанный на использовании концентрированного раствора аммиака в качестве «матричного растворителя». Перед окончанием УЗ-обработки в вытяжку необходимо добавлять 5 М КОН (в соотношении 1:8) для максимального разрушения матрицы волос. Следует отметить, что при этом способе разложения наблюдается наибольшая устойчивость всех изучаемых соединений. Перед проведением микроэкстракции следует подкислить раствор несколькими каплями концентрированной H2SO4 до исчезновения мути в вытяжке. Это необходимо для снижения растворимости гексана в водной фазе. Как показали эксперименты, раствор волос в щелочи не пригоден для дальнейшей микроэкстракции, так как гексан образует с вытяжкой стойкую эмульсию, при этом потери экстрагента превышают 75 % К тому же, количество собранного экстракта является невоспроизводимым от опыта к опыту. Таким образом, матричный эффект, в случае щелочного разложения, оказывает существенное влияние на результаты микроэкстракции. После добавления

серной кислоты к полученному матричному раствору, из исходных 200 мкл гекса-

19

на после экстракции удается собрать 170 - 190 мкл, что делает потери органической фазы незначительными. Таким образом, нами было проверено соотношение «устойчивость соединений - степень разложения волос» для различных способов обработки волос. Степень извлечения эндогенных соединений из приготовленных ранее модельных образцов была определена для трех наиболее удачных способов (табл. 4)

Таблица 4

Сравнение различных способов извлечения эндогенно связанных соединений из модельных образцов волос. Объемы «матричныхрастворителей» указаны

на 100мг волос (п = 3, Р = 0.95)

Условия извлечения Вещество АМ1 АОТ ЬЕУ АМ2 ЭШ

4 мл 1 М КОН, 37" С, УЗ 120 мин Степень извлечения, % 81 ±4 86 ±4 61 ±4 71 ±3 81 ±5

НгБОд конц, 5 М КОН (по каплям, дорН 10) 39 ±5 37 ±7 32 ±11 25 ±9 46 ±9

4мл*Ш3 конц., 40и С, УЗ 30 мин, 0.5 мл 5 М КОН 88 ±3 90 ±4 81 ± 5 84 ±6 92 ±5

Как видно из таблицы, наибольшая степень извлечения всех соединений достигается при использовании в качестве «матричного растворителя» концентрированного водного раствора аммиака с последующим добавлением раствора гидро-ксида калия. Следует отметить, что степень извлечения ТЦА и дифенгидрамина во всех трех случаях несколько выше, чем нейролептиков. Это можно объяснить тем, что более полярные соединения - левомепромазин и аминазин - связываются со структурой волос более прочно, чем менее полярные. Таким образом, полярность органических молекул препятствует их включению в волос, однако увеличивает степень удерживания соединений в структуре. Кроме того, полученные данные подтверждают наше предположение о большей устойчивости эндогенных включений по сравнению с экзогенными.

Разработанный нами способ определения ряда лекарственных препаратов в волосах состоит из следующих этапов (объемы растворителей указаны для массы образца волос 100 мг):

• измельчение пробы и взвешивание,

• обработка навески волос концентрированным раствором аммиака (~ 4 мл) в УЗ-ванне при 40 °С,

• добавление в вытяжку 5 М КОН (~ 0.5 мл) при помешивании,

• добавление к раствору по каплям концентрированной НгЗС^ (до исчезновения мути), с тем, чтобы рН раствора был не ниже 9-10,

• перенос вытяжки в микроэкстрактор и экстракция гексаном,

• перенос всего объема экстракта (~ 200 мкл) в тонкий слой и элюирование в системе гексан - ацетон - хлороформ - ТБА (2:2:2:0.2),

• сканирование пластины на денситометре «Camag»,

• обработка полученных результатов.

Определение изученных ксенобиотиков в реальных образцах волос

Используя разработанный в настоящей работе способ извлечения, мы провели определение ПАУ в волосах шестнадцати курящих и некурящих добровольцев методом ВЭТСХ. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Количество ПАУ в волосах курящих и некурящих людей

№ п/п Пол Возраст, лет Навеска волос, мг Количество сигарет в день, шт. Общее количество ПАУ в волосах, нг/г волос

1 М 25 150 20-25 90

2 м 25 220 10-15 5

3 ж 16 500 0 нет

4 ' м 24 160 15-20 300

5 ж 54 110 20-30 20

б м 23 250 0 нет

7 ж 23 150 20-25 100

8 ж 23 400 0 нет

9 ж 29 360 10-20 40

10 М 26 160 20-25 80

11 Ж 23 140 10-20 200

12 М 40 150 20-30 10

13 м 21 130 7- 15 300

14 ж 65 100, J-8 50

15 м 47 120 15-25 200

16 м 33 120 i 10-20 80

нет - отрицательный результат

Нами не была выявлена зависимость содержания в волосах эндогенных полиароматических углеводородов от количества выкуриваемых сигарет, пола и возраста курильщика Установлено, что в волосах некурящих людей, часто подвергающихся внешнему воздействию дыма сигарет, количество ПАУ в волосах находится за пределами чувствительности метода (пробы 3, 6, 8 из табл 5) Обнаружение лекарственных препаратов в волосах людей проводили по представленной в данной работе методике Если исходная масса образца волос была достаточной (> 300 мг), то подобным образом готовили пробы для сравнительного газохромато-графического анализа с МС-детекторованием и поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа Результаты представлены в табл б и 7.

Таблица б

Определение амитриптилина в волосах пациентов методами ВЭТСХ, ГХ/МС и ПФИА

№ п/п Пол Возраст, лет Назначенный препарат, доза/сут Длительность приема на момент отбора пробы Содержание в волосах, мкг/г

Результаты ВЭТСХ Результаты ГХ/МС Результаты ПФИА

1 Ж 39 AMI 100 мг 2 5 мес. 22 ! да да

2 Ж 42 AMI 50 мг 1 мес 58 да ' •

3 м 25 AMI 25 мг 1 мес 13 да •

4 м 33 AMI 125 мг 2 мес 2 да да

5 м 22 AMI 150 мг 5 мес 26 • да

Таблица 7

Определение лекарственных препаратов в волосах пациентов методами ВЭТСХи ГХ/МС

№ п/п Пол Возраст, лет Назначенный препарат, доза/сутки Длительность приема на момент отбора пробы Результат анализа

Результаты ВЭТСХ Результаты ГХ/МС

1 Ж 39 СЬО 50 мг 2.5 мес. да да

2 Ж 48 СЬО 50 мг Неизвестно да да

3 Ж 23 СЬО 50 мг 2 нед. да да

4 Ж 47 СЬО 50 мг 2 мес. да *

5 Ж 40 СЬО 50 мг 1 мес. да *

6 Ж 26 АШ25 мг 1 мес. да *

7 Ж 26 СЬО 25 мг, МАР 100 мг 3 нед. да *

8 Ж 66 МАР 75 мг 1.5 мес. да *

9 ж 20 СЬО 50 мг 2 нед. да да

10 м 27 СЬО 125 мг 8 дн. да да

11 м 24 МАР 150 мг, БОИ 100 мг 11 да. нет. нет

12 м 35 А№ 125 мг 1.5 мес. нет нет

13 м 18 СЬО 300 мг 1 мес. да *

14 м 32 СЬО 100 мг 3 нед. да

15 м 18 SON 30 мг, СЬО 15 мг 2 нед. да *

16 м 41 МАР 75 мг 2 нед да. *

17 м 24 СЬО 100 мг 2.5 мес. да *

18 м 35 SON 75 мг, МАР 150 мг 2.5 мес. да *

да - положительный результат, соединение обнаружено нет - отрицательный результат * - анализ не проводился

Из таблиц видно, что взаимосвязь между дневной дозой препарата и его количеством в волосах пациента отсутствует. Подобный результат был получен и в других исследованиях. Независимые методы (ГХ/МС и ПФИА) подтвердили положительные и отрицательные результаты ВЭТСХ-анализа. Таким образом, была

достигнута основная задача скрининга - отсутствие ложноотрицательных результатов

Результаты работы могут быть использованы в организациях, занимающихся фундаментальными исследованиями в области аналитической химии, биохимии, экологии человека, а также в практических целях криминалистики, медицины и при контроле персонала особо важных предприятий

ВЫВОДЫ

1 Изучено экстракционное концентрирование ряда лекарственных препаратов (амитриптилина, анафранила, левомепромазина, аминазина и дифенгидра-мина) в системе вода - гексан Показано, что однократная экстракция при значении рН ~ 10 позволяет количественна извлекать изученные соединения в органическую фазу. Установлено, что коэффициенты распределения модельных препаратов практически не зависят от соотношения объемов водной и органической фаз вплоть до значения 50 1, что свидетельствует о принципиальной возможности реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования пробы

2. Изучено поведение модельных соединений в хроматографических системах с различными подвижными и неподвижными фазами Проведена оптимизация условий разделения и оценка метрологических характеристик группового и внутригруппового определения модельных соединений методом ВЭТСХ Для группового определения соединений класса ПАУ предложена новая хроматогра-фическая система с подвижной фазой состава гексан-дихлометан-нитробензол (5 5 0 1)

3 Изучена сорбция соединений класса ПАУ из сигаретного дыма на волосы человека Установлено, что из газовой фазы сорбируется до 6% от общего количества ПАУ в сигаретном дыме Для модельных лекарственных препаратов была изучена сорбция из водных растворов и определены оптимальные значения рН, при которых достигается максимальная степень сорбции

4 На основе полученных закономерностей сорбции модельных соединений из газовой фазы и из раствора разработан подход, позволяющий провести оценку соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений на волосах человека На базе такого подхода предложены способы приго-

24

товления образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков в волосах человека.

5. Изучена эффективность различных способов извлечения органических веществ из белковой матрицы волос. Для модельных соединений определены количественные характеристики извлечения. На основе полученных результатов предложены новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков из волос человека.

6. Разработаны методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Методики апробированы при анализе реальных образцов волос курильщиков и пациентов психиатрических клиник. Положительные и отрицательные результаты ВЭТСХ-анализа подтверждены независимыми методами (ГХ/МС и ПФИА).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Marutsenko I.V., Borzenko A.G., Kletskina E.V., Kiselev S.M. Revelsky A.I., Polenova T.V., Revelsky I.A. Large volume sample injection in HPTLC and ultratrace analysis. / International Congress on Analytical Chemistry. Moscow. Russia. 1997. June 15-21.P.E-71.

2. Marutsenko I.V., Revelsky I.A., Borzenko A.G., Kletskina E.V., Polenova T.V., Glazkov I.N. Fast screening of personnel for drugs of abuse and related compounds based on HPTLC analysis of hair. / PITTCON'98. New Orleans. Louisiana. US. 1998. March 1-5. P. 1673.

3. Marutsenko I.V., Polenova T.V., Revelsky I.A., Borzenko A.G., Glazkov I.N. Determination ofpsychotropic drugs in human hair by HPTLC. / Balaton Symposium'99 on High-Performance Separation Methods. Siofok. Hungary. 1999. September 1 - 3. P. 158.

4. Marutsenko I.V., Polenova T.V., Virus E.D., Borzenko A.G., Revelsky I.A. HPTLC determination of polyaromatic hydrocarbons in smokers' hair. / International Simposium on Planar Separation. Lillafured. Hungary. 2001. June 23 - 25. P. 301 - 308.

5. Polenova T.V., Borzenko A.G., Marutsenko I.V., Revelsky I.A. Screening of the psychotropic drugs in hair based on coupling HPTLC and microliquid extraction. // J. of

Chromatographic Sci. 2001. V. 39. P. 293 - 296.

25

6 IV. Marutsenko, T.V. Polenova, E D Virus, A G Borzenko, I A Revelsky HPTLC determination of polyaromatic hydrocarbons in smokers' hair // J Planar Chromatogr 2001 V 14 P. 330-333

7 Поленова Т В , Маруценко И В , Борзенко А Г, Ревельский И А Скрининг психотропных препаратов в волосах человека, основанный на сочетании микрожидкостной экстракции и высокоэффективной хроматографии / Журн Аналит. Хим 2003 Т. 58 С. 633

8 В Н Калиниченко, Т В. Поленова, И В Маруценко Полиэтиленгликолевые эфиры хитозана / VIII Международная научно-практическая конференция «Косметические средства и сырье безопасность и эффективность» Москва Россия. 2003. Ноябрь 10-12.

9 Т.В. Поленова, И В Маруценко, В Н Калиниченко Исследование защитных функций полиэтиленгликолевых эфиров хитозана // Сырье и упаковка для парфюмерии, косметики и бытовой химии 2004 Т 40 С. 34 - 36

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН Тираж 100 экз.

P118 Йб

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Волос как объект анализа

1.1. Отбор пробы

1.2. Очистка и измельчение

1.3. Извлечение органических ксенобиотиков из волос

2. Методы определения ксенобиотиков в волосах человека

3. Классы определяемых соединений

3.1. Наркотические вещества

3.2. Лекарственные препараты

3.3. Полиароматические углеводороды

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Исходные вещества, аппаратура и техника эксперимента

1.1. Выбор модельных соединений

1.2. Реактивы и материалы

1.3. Выбор оптимальных параметров сканирования тонкослойных пластин на денситометре «Сатад»

1.4. Выбор метода предварительного концентрирования

2. Определение ПАУ в волосах человека

2.1. Оптимизация условий хроматографического определения ПАУ в тонком слое

2.2. Изучение сорбции ПАУ из сигаретного дыма на волосы человека

2.3. Выбор условий извлечения ПАУ из матрицы волос

2.4. Практическое приложение: изучение защитного влияния полиэтиленгликолевых эфиров хитозана на волосы человека

3. Определение лекарственных препаратов в волосах человека

3.1. Определение параметров экстракции лекарственных препаратов в системе вода - гексан

3.2. Оптимизация условий хроматографического определения лекарственных препаратов в тонком слое

3.3. Изучение сорбции лекарственных препаратов из водных растворов на волосы человека

3.4. Выбор условий извлечения лекарственных препаратов из матрицы волос

4. Определение изученных ксенобиотиков в реальных образцах волос

Актуальность работы. В последнее десятилетие резко возрос интерес к анализу следовых количеств органических веществ. Вместе с тем начал расширяться и круг объектов этого анализа - в частности, медико-биологических, к которым относятся биологические жидкости и ткани. С появлением высокочувствительных инструментальных методов биомониторинг инородных органических веществ сразу же приобрел практическое значение в таких сферах жизнедеятельности людей, как медицина, токсикология, судебно-медицинская экспертиза, криминалистика и экология. Возник интерес и в социальной сфере, благодаря возможности контролировать употребление наркотических, психотропных и допинговых препаратов сотрудниками опасных областей производства или спортсменами. Остался, однако, ряд нерешенных проблем.

Классическими объектами арбитражного анализа считаются кровь и моча. Извлечение соединений из них, как правило, проводится с помощью различных методов экстракции. Однако указанные объекты имеют большой недостаток: инородные соединения метаболизируют в крови и быстро выводятся из организма человека с мочой. Первая проблема биомониторинга состоит в том, что анализ биожидкостей характеризует только текущий процесс выведения вещества. Поэтому в настоящее время многие зарубежные исследователи обратились к использованию нетрадиционных объектов анализа - таких, как волосы человека. Волосы являются естественным сорбентом, постепенно накапливающим в своей структуре те соединения, которые либо не попадают, либо малоустойчивы в крови и моче, что дает возможность получения информации об их воздействии на организм в течение длительного времени. Тем не менее, вторая проблема современного биомониторинга заключается в том, что сложность химического состава и низкое содержание ксенобиотиков в матрице ограничивают широкое использование волос как объекта анализа.

Основными методами определения ксенобиотиков в волосах человека являются иммуноферментный анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием. Несмотря на очевидные достоинства перечисленных методов, их затруднительно применять для целей мониторинга из-за длительности анализа и высокой стоимости оборудования. Напротив, высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) удовлетворяет требованиям скрининга, но мало популярна для решения сложных аналитических задач из-за низкой чувствительности метода. Сочетание ВЭТСХ с предварительным концентрированием аналитов дает возможность избежать этого недостатка.

Третья проблема заключается в стандартизации процедуры анализа. Говоря о степени извлечения ксенобиотиков из структуры волос, исследователи оперируют такими понятиями, как «больше» или «меньше», и порой опрометчиво судят о полноте десорбции вещества из протеиновой матрицы.

Четвертая проблема связана с ограниченностью круга ксенобиотиков, которые удалось определить в волосах человека. Наиболее изученным является определение в волосах наркотических препаратов - опиатов, каннабиноидов и кокаина. Часть исследований посвящена вопросам, связанным с обнаружением лекарственных препаратов, но при этом нет данных о том, включаются ли в структуру волос неполярные канцерогенные соединения, например, полиароматические углеводороды (ПАУ). Вполне очевидно, что на данный момент возможности определения ПАУ в организме человека остаются практически неиспользованными, несмотря на увеличение числа курящих людей, неблагоприятную экологическую обстановку и прочие негативные факторы.

Цель работы заключалась в оценке возможностей и разработке скрининговой процедуры на основе сочетания высокоэффективной тонкослойной хроматографии с микрожидкостной экстракцией (МЖЭ) для определения психотропных препаратов и полиароматических углеводородов в волосах человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить экстракционное поведение ряда психотропных лекарственных препаратов и некоторых представителей класса ПАУ, используемых в работе в качестве модельных соединений, и оценить возможность реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования определяемых компонентов.

2. Оптимизировать условия, оценить метрологические характеристики и получить количественные характеристики группового и внутригруппового определения модельных соединений методом ВЭТСХ.

3. Изучить закономерности сорбции модельных соединений на волосах человека из газовой фазы и из раствора с целью создания образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков.

4. Изучить эффективность различных способов извлечения органических веществ из модельных образцов волос и выбрать оптимальный «матричный растворитель»1.

5. Разработать методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Научная новизна. Изучено экстракционное концентрирование ряда лекарственных препаратов (фенотиазиновых производных, антидепрессантов и дифенгидрамина) в наиболее перспективной для МЖЭ системе гексан - вода. Показана принципиальная возможность реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования определяемых компонентов. Изучено хроматографическое поведение модельных ксенобиотиков в ВЭТСХ системах с различными подвижными и неподвижными фазами. Изучена сорбция соединений класса ПАУ из сигаретного дыма и модельных лекарственных препаратов из водных

1 раствор вещества или смеси веществ, разлагающий волосы растворов на волосы человека. На основе полученных закономерностей разработан подход, позволяющий провести оценку соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений волос человека. Изучена эффективность различных способов извлечения органических веществ из белковой структуры волоса и предложены принципиально новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков из волос человека.

Практическая значимость работы. Доказано, что полиароматические углеводороды аккумулируются в волосах курильщиков. Предложены способы приготовления стандартных образцов волос с известным эндогенным содержанием органических ксенобиотиков на основе двух подходов: сорбции из газовой фазы и из водного раствора. Для группового определения соединений класса ПАУ предложена новая хроматографическая система с подвижной фазой состава гексан-дихлометан-нитробензол (5:5:0.1). Разработаны методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Проведено определение некоторых лекарственных препаратов в волосах пациентов психиатрических клиник, а также групповое определение ПАУ в волосах курильщиков.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты изучения экстракционного поведения модельных лекарственных препаратов в системе гексан - вода.

2. Результаты исследования поведения модельных лекарственных препаратов в тринадцати хроматографических системах с различными подвижными и неподвижными фазами.

3. Способ модификации подвижной фазы при групповом ВЭТСХ определении соединений класса ПАУ.

4. Результаты изучения сорбции соединений класса ПАУ из сигаретного дыма и модельных лекарственных препаратов из водных растворов на волосах человека.

5. Разработанный подход для оценки соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений и способы приготовления образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков в волосах человека.

6. Данные по изучению эффективности различных способов извлечения органических веществ из белковой структуры человеческого волоса и предложенные в работе новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков.

7. Методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на международных симпозиумах «Balaton Symposium'99 on high-performance separation methods» (Венгрия, 1999 г.), «Planar Chromatography-2001» (Венгрия, 2001 г.), «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Россия, Туапсе, 2002 г.) и VIII Международной научно-практической конференции «Косметические средства и сырье: безопасность и эффективность» (Россия, Москва, 2003 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ: 3 статьи и 6 тезисов докладов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГХ - газовая хроматография

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография

МС - масс-спектрометрия

МС/МС - тандемная масс-спектрометрия

РИА - радиоиммунный анализ

ПФИА - поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ

ИФА — иммуноферментный анализ

JIAMMA - лазерный масс-спектрометрический анализ

ПИД - пламенно-ионизационный детектор

СФЭ - сверхкритическая флюидная экстракция

МЖЭ — микрожидкостная экстракция

УЗ - ультразвуковая обработка

НФ - неподвижная фаза

ПФ - подвижная фаза

ОФ - обращенная фаза

МНК - метод наименьших квадратов

ПАУ - полиароматические углеводороды

ТЦА - трициклические антидепрессанты

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ДХМ - дихлорметан

НБ - нитробензол

ТРКК — тетрароданокобальтат калия ДЭА - диэтиламин

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Изучено экстракционное концентрирование ряда лекарственных препаратов (амитриптилина, анафранила, левомепромазина, аминазина и дифенгидрамина) в системе вода - гексан. Показано, что однократная экстракция при значении рН ~ 10 позволяет количественно извлекать изученные соединения в органическую фазу. Установлено, что коэффициенты распределения модельных препаратов практически не зависят от соотношения объемов водной и органической фаз вплоть до значения 50:1, что свидетельствует о принципиальной возможности реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования пробы.

2. Изучено поведение модельных соединений в хроматографических системах с различными подвижными и неподвижными фазами. Проведена оптимизация условий разделения и оценка метрологических характеристик группового и внутригруппового определения модельных соединений методом ВЭТСХ. Для группового определения соединений класса ПАУ предложена новая хроматографическая система с подвижной фазой состава гексан-дихлометан-нитробензол (5:5:0.1).

3. Изучена сорбция соединений класса ПАУ из сигаретного дыма на волосы человека. Установлено, что из газовой фазы сорбируется до 6% от общего количества ПАУ в сигаретном дыме. Для модельных лекарственных препаратов была изучена сорбция из водных растворов и определены оптимальные значения рН, при которых достигается максимальная степень сорбции.

4. На основе полученных закономерностей сорбции модельных соединений из газовой фазы и из раствора разработан подход, позволяющий провести оценку соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений на волосах человека. На базе такого подхода предложены способы приготовления образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков в волосах человека.

5. Изучена эффективность различных способов извлечения органических веществ из белковой матрицы волос. Для модельных соединений определены количественные характеристики извлечения. На основе полученных результатов предложены новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков из волос человека.

6. Разработаны методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Методики апробированы при анализе реальных образцов волос курильщиков и пациентов психиатрических клиник. Положительные и отрицательные результаты ВЭТСХ-анализа подтверждены независимыми методами (ГХ/МС и ПФИА).

1. M.R. Harkey. Anatomy and physiology of hair. // Forensic Sci. 1.t. 1993. V. 63. P. 9-18.

2. E.A. Симонов, Б.Н. Изотов, A.B. Фесенко. Наркотики. Методы анализа на коже, в ее придатках и выделениях. М.: Анахарсис. 2000. 130 с.

3. D.A. Kidwell. Analysis of phencyclidine and cocaine in human hair by tandem mass spectrometry. // J. Forensic Sci. 1993. V. 38. P. 272 284.

4. D.L. Blank, D.A. Kidwell. Decontamination procedures for drugs of abuse in hair: are they sufficient? // Forensic Sci. Int. 1995. V 70. P. 13 38.

5. S.J. Green, J.F. Wilson. The effect of hair color on the incorporation of methadone into hair in the rat. // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20. P. 121 123.

6. P. Kintz, C. Marescaux, P. Mangin. Testing human hair for carbamazepine in epileptic patients: is hair investigation suitable for drug monitoring? // Human & Experim. Toxicol. 1995. V. 14. P. 812 815.

7. R. Kikura, Y. Nakahara. Hair analysis for drugs of abuse. IX. Comparison of deprenyl use and methamphetamine use by hair analysis. // Biol, and Pharm. Bull. 1995. V. 18. P. 267.

8. Y. Nakahara, K. Takahashi, M. Shimamine, A. Saitoh. Hair analysis for drugs of abuse. IV. Determination of total morphine and confirmation of 6-acetylmorphine in monkey and human hair by GC/MS. // Arch. Toxicol. 1992. V. 66. P. 669-674.

9. A.M. Baumgartner, C.T. Black, P.F. Jones. Detection of phencyclidine in hair. //J. Forensic. Sci. 1981. V. 26. P. 576 581.

10. A.M. Baumgartner, P.F. Jones, W.A. Baumgartner, C.T. Black. Radioimmunoassay of hair for determining opiate-abuse histories. // J. Nucl. Med. 1979. V. 20. P. 748-752.

11. W.A. Baumgartner, C.T. Black, P.F. Jones, W.H. Blahd. Radioimmunoassay of cocaine in hair: concise communication. // J. Nucl. Med. 1982. V. 23. P. 790-792.

12. G.L. Henderson, M.R. Harkey, C. Zhou, R.T. Jones, P. Jacob. Incorporation of isotopically labeled cocaine and metabolites into human hair: 1. Dose-response relationships. // J. Anal. Toxicol. 1996. V. 20. P. 1-12.

13. R. Sato, T. Uematsu, R. Sato, S. Yamaguchi, M. Nakashima. Human scalp hair as evidence of individual dosage history of haloperidol: prospective study. // Ther. Drug Monit. 1989. V. 11. P. 686 691.

14. В. Holmstedt, J. Lindgren, L. River, T. Plowman. Cocaine in blood of coca chewers. // J. Ethnopharmacology. 1979. V. 1. P. 69 78.

15. Y. Galliard, G. Pepin. Testing hair for pharmaceuticals. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 733. P. 231 -246.

16. G. Scopp, L. Potsch, R. Aderjan. Experimental investigations on hair fibers as diffusion bridges and opiates as solutes in solution. // J. Forensic Sci. 1996. V.41.P. 117-120.

17. A. Polettini, M. Montagna, J. Segura, X. de la Torre. Determination of p2-agonists in hair by GC/MS. // J. Mass Spectrometry. 1996. V. 31. P. 47 54.

18. S. McClean, E.J. O'Kane, W.F. Smith. Electrospray ionization mass spectrometer characterization of selected anty-psychotic drugs and their detection and determination in human hair by LC - tandem MS. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 740. P. 141-157.

19. P. Edder, C. Staub, J.L. Veuthey, I. Pierroz, W. Haerdi. Subcritical fluid extraction of opiates in hair of drug addicts. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 658. P. 75 86.

20. M. Rothe, F.Pragst. Solvent optimization for the direct extraction of opiates from hair samples. // J. Anal. Toxicol. 1995. V. 19. P. 236 240.

21. A.B. Камаев, М.Г. Алексеев, E.A. Симонов, A.B. Беляев, А.П. Савилов, Е.П. Семкин. Определение опийных алкалоидов, героина и кокаина в биообъектах. Методические рекомендации. / М.: ЭКЦ МВД России. 1997. 16 с.

22. W.L. Wang, E.J. Cone. Testing human hair for drugs of abuse. IV. Environmental cocaine contamination and washing effects. // Forensic Sci. Int.1995. V. 70. P. 39-51.

23. D. Wilkins, H. Haughey, E.J. Cone, M. Huestis, R. Foltz, D. Rollins. Quantitative analysis of THC, 11-OH-THC, and THCCOOH in human hair by negative ion chemical ionization mass spectrometry. // J. Anal. Toxicol. 1995. V. 19. P. 483-491.

24. B. Janoszka, K. Tyrpien, D. Bodzek. Application of TLC and GC-MC to the identification of amino-PAHs in sewage sludges. // J. Planar Chromatogr.1996. V. 9. P. 450-455.

25. P. Kintz, V. Cirimele, P. Mangin. Testing human hair for cannabis. II. Identification of THC-COOH by GC-MS-NCI as a unique proof. // J. Forensic Sci. 1995. V. 40. P. 619-622.

26. W.A. Baumgartner, V.A. Hill, W.H. Blahd. Hair analysis for drugs of abuse. // J. Forensic Sci. 1989. V. 34. P. 1433 1453

27. D.Valente, M. Cassini, M. Pigliapochi, G. Vansetti. Hair as the sample in assessing morphine and cocaine addiction. // J. Clin. Chem. 1981. V.27. P. 1952 -1953.

28. C.K. Еремин, Б.Н. Изотов, H.B. Веселовская. Анализ наркотических средств. / М.: Мысль. 1993. 271 С.

29. E. Klug. Zur Morphinbestimmung in Kopfhaaren. // Z. Rechtsmed. 1980. V. 84. P. 189-193.

30. M. Marigo, F. Tagliaro, C. Poiesi, S. Lafiska, C. Neri. Determination of morphine in the hair of heroin addicts by HPLC with fluorimetric detection. // J. Anal. Toxicol. 1986. V. 10. P. 158 161.

31. H. Sachs, W. Arnold. Results of comparative determination of morphine in human hair using RIA and GC-MS. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1989. V. 27. P. 873 877.

32. B.A. Goldberger, Y.H. Caplan, T. Maguire, E.J. Cone. Testing human hair for drugs of abuse. III. Identification of heroin and 6-monoacetylmorphine as indicators of heroin use. // J. Anal. Toxicol. 1991. V. 15. P. 226 231.

33. P. Kintz, P. Mangin. Opiate concentrations in human head, axillary and pubic hair. // J. Forensic Sci. 1993. V. 38. P. 657 662.

34. A. Marsh, M.B. Evans. Challenging declarations of abstinence by the determination of morphine in hair by radioimmunoassay. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1993. V. 11. P. 693 698.

35. J.F. Morrison, S.N. Chesler, J.L. Reins. Supercritical fluid extraction-immunoassay for the rapid screening of cocaine in hair. // J. Microcolumn Sep. 1996. V. 8. P. 37-45.

36. S. Balabanova, H. Brunner, R. Novak. Radioimmunological determination of cocaine in human hair. // Z. Rechtsmed. 1987. V. 98. P. 229 -234.

37. R. Forman, J. Schneiderman, J. Klein, K. Graham, M. Greenwald, G. Koren. Accumulation of cocaine in maternal and fetal hair: the dose-response curve.//Life Sci. 1992. V. 50. P. 1333- 1341.

38. Y. Nakahara, T. Ochiai, R. Kukura. Hair analysis for drugs of abuse. V. The facility in incorporation of cocaine into hair over its major metabolites, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester. // Arch. Toxicol. 1992. V. 66. P. 446 -449.

39. P. Kintz, V. Cirimele, C. Sengler, P. Mangin. Testing human hair and urine for anhydroecgonine methyl ester, a pyrolysis product of cocaine. // J. Anal. Toxicol. 1995. V. 19. P. 479 482.

40. O. Suzuki, H. Hattori, M. Asano. Detection of methamphetamine and amphetamine in a single human hair by gas chromatography/chemical ionization mass spectrometry. // J. Forensic. Sci. 1984. V. 29. P. 611 617.

41. T. Nagai, S. Kamiyama. Forensic toxicologic analysis of methamphetamine and amphetamine optical isomers by HPLC. // Z. Rechtsmed. 1988. V. 101. P. 151-159.

42. H. Matsuno, T. Uematsu, M. Kakashima. The measurement of haloperidol and reduced haloperidol in hair as an index of dosage history. // Brit. J. Clin. Pharmacol. 1990. V. 29. P. 187 194.

43. A. Tracqui, P. Kressig, P. Kintz, A. Pouliquen, P. Mangin. Determination of amitriptyline in the hair of psychiatric patients. // Human and Experimental Toxicol. 1992. V. 11. P. 363 367.

44. A. Adam, N. Gervais, A. Panoyan, H. Ong, L. Beliveau, С Ayotte, P. Delahaut. Detection of clenbuterol residues in hair. // Analyst. 1994. V. 119. P. 2663-2666.

45. F.J. Couper, I.M. Mclntyre, O.H. Drummer. Detection of antidepressant and antipsychotic drugs in postmortem human scalp hair. // J. Forensic. Sci. 1995. V. 40. P. 87-90.

46. G.L. Henderson, M.R. Harkey, C. Zhou, R.T. Jones. Cocaine and metabolite concentrations in the hair of South American coca chewers. // J. Anal. Toxicol. 1992. V. 16. P. 199-201.

47. A. Marsh, M.B. Evans. Radioimmunoassay of drugs of abuse in hair. Part 1: Methadone in human hair, method adaptation and the evaluation of decontamination procedures. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1994. V. 12. P. 1123 -ИЗО.

48. V. Cirimele, P. Kintz, R. Majdalani, P. Mangin. Supercritical fluid extraction of drugs in drug addict hair. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 673. P. 173 -181.

49. H.P. Eser, L. Potsch, G. Scopp, M.R. Moeller. Influence of sample preparation on analytical results: drug analysis GC/MS. on hair snippets versus hair powder using various extraction methods. // J. Forensic. Sci. Int. 1997. V. 84. P. 271 -279.

50. N.J. Haley, D. Hoffmann. Analysis for nicotine and cotinine in hair to determine cigarette smoker status. // J. Clin. Chem. 1985. V. 31. P. 1598 1600.

51. F.P. Smith, R.H. Liu. Detection of cocaine metabolite in perspiration stain, menstrual bloodstain, and hair. // J. Forensic. Sci. 1986. V. 31. P. 1269 -1273.

52. W.L. Wang, W.D. Darwin, E.J. Cone. Simultaneous assay of cocaine, heroin and metabolites in hair, plasma, saliva and urine by gas chromatography -mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 660. P. 279 290.

53. S. Balabanova, J. Homoki. Determination of cocaine in human hair by GC/MS. // Z. Rechtsmed. 1987. V. 98. P. 235 240.

54. M.R. Moeller. Drug detection in hair by chromatographic procedures. // J. Chromatogr. B. 1992. V. 580. P. 125 134.

55. P. Kintz, V. Cirimele, P. Mangin, A. Tracqui. Hair analysis for nordiazepam and oxazepam by gas chromatography negative ion chemical ionization mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 677. P. 241 - 244.

56. H. Sachs, M. Uhl. Opiate-Nachweis in Haar-Extracten mit Hilfe von GC/MS/MS und SFE. // Toxichem. and Krimtech. 1992. V. 59. P. 114 120.

57. J.F. Morrison, S.N. Chesler, W.J. Yoo, C.M. Selavka. Matrix and modifier effects in the supercritical fluid extraction of cocaine and benzoylecgonine from human hair. //J. Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 163 172.

58. C. Offidani, A. Carnevale, M Chiarotti. Drugs in hair: a new extraction procedure. //J. Forensic. Sci. Int. 1989. V. 41. P. 35-39.

59. I. Raff, H. Sachs. Enzymatische Aufbereitung von Haaren zum Nachweis eines Betaubungsmittel Konsums. //Z. Rechtsmed. 1990. V. 104 P. 424.

60. M.R. Harkey, G.L. Henderson, C. Zhou. Simultaneous quantitation of cocaine and its major metabolites in human hair by gas chromatography/chemical ionization mass spectrometry. // J. Anal. Toxicol. 1991. V. 15 P. 260 266.

61. C.M.Selavka, A.P. Mason, C.D. Riker, S. Croocham. Determination of fentanyl in hair: the case of crooked criminalist. // J. Forensic. Sci. 1995. V. 40. P. 681 -683.

62. N.N. Valanju, M.M. Baden, S.N. Valanju, D. Mulligan, S.K. Verma. Detection of biotransformed cocaine in urine from drug abusers. // J. Chromatogr. 1973. V. 81. P. 170-173.

63. H. Sachs, I. Raff. Comparison of quantitative results of drugs in human hair by GC/MS. // J. Forensic. Sci. Int. 1993. V. 63. P. 207 216.

64. P. Kintz. Interlaboratory comparison of quantitative determinations of drugs in hair samples. // J. Forensic. Sci. Int. 1995. V. 70. P. 105 109.

65. V. Cirimele, P. Kintz, P. Mangin. Comparison of different extraction procedures for drugs in hair of drugs addicts. // Biomed. Chromatogr. 1996. V. 10. P. 179-182.

66. M.J. Welch, L.T. Sniegoski, C.C. Allgood, M. Habram. Hair analysis for drugs abuse: evaluation of analytical methods, environmental issues, and development of reference materials. // J. Anal. Toxicol. 1993. V. 17. P. 389 398.

67. S. Balabanova, P.J. Arnold, H. Brunner, V. Luckow, H.U. Wolf. Detection of methadone in human hair by gas chromatography/mass spectrometry. // Z. Rechtsmed. 1989. V. 102. P. 495 501.

68. B.H. Chen, E.H. Taylor, A.A. Pappas. Comparison of derivatives for determination of codeine and morphine by GC/MS. // J. Anal. Toxicol. 1990. V. 14. P. 12-17.

69. P. Kintz, P. Mangin. Simultaneous determination of opiates, cocaine and major metabolites of cocaine in human hair by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). // J. Forensic. Sci. Int. 1995. V. 73. P. 93 100.

70. P. Kintz, V. Cirimele, Y. Edel, C. Jamey, P. Mangin. Hair analysis for buprenorphine and its dealkylated metabolite by RIA and confirmation by LC/ECD. // J. Forensic. Sci. 1994. V. 39. P. 1497 1503.

71. A. Tracqui, P. Kintz, P. Mangin. HPLC/MS determination of buprenorphine and norbuprenorphine in biological fluids and hair samples. // J. Forensic. Sci. 1997. V. 42. P. 111 114.

72. F. Tagliaro, G. Carli, F. Cristofori, G. Campagnari, M. Mango. HPLC determination of morphine with amperometric detection at low potential under basic pH conditions. // Chromatographic 1988. V. 26. P. 163 167.

73. A. Mizuno, T. Uematsu, M. Nakashima. Simultaneous determination of ofloxacin, norfloxacin and ciprofloxacin in human hair by high-performance liquid chromatography and fluorescence detection. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 653. P. 187-193.

74. J.J. Sramek, W.A. Baumgartner, J.A. Tallos, T.N. Ahrens, J.F. Heiser, W.H. Blahd. Hair analysis for detection of phencyclidine in newly admitted psychiatric patients. // Am. J. Psychiatry. 1985. V. 142. P. 950 953.

75. S. Balabanova, H.U. Wolf. Determination of methadone in human hair by radioimmunossay. // Z. Rechtsmed. 1989. V. 102. P. 1 4.

76. K.S. Kalasinsky, J. Magluilo, Jr., T. Schaefer. Study of drug distribution in hair by infrared microscopy visualization. // J. Anal. Toxicol. 1994. V. 18. P. 337-341.

77. F. Tagliaro, W.F. Smith, S. Turrina, Z. Deyl, M. Marigo. Capillary electrophoresis: a new tool in forensic toxicology. Applications and prospects in hair analysis for illicit drugs. // J. Forensic. Sci. Int. 1995. V. 70. P. 93 104.

78. C.M. Selavka, F. Rieders. The determination of cocaine in hair: a review. //J. Forensic. Sci. Int. 1995. V. 70. P. 155 164.

79. D.J. Dietzen, J. Koenig, J. Turk. Facilitation of thin-layer chromatographic identification of opiates by derivatization with acetic anhydride or methoxyamine. // J. Anal. Toxicol. 1995. V. 19. P. 299 303.

80. I. Raff, R. Denk, H. Sachs. Monoacetylmorphin in Haaren. // Z. Rechtsmed. 1991. V. 36. P. 479.

81. C. Staub. Supercritical fluid extraction and hair analysis: the situation in 1996. // J. Forensic. Sci. Int. 1997. V. 84. P. 295 304.

82. P. Kintz, В. Ludez, P. Mangin. Detection of drugs in human hair using Abbott ADx with conrirmation by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). //J. Forensic. Sci. 1992. V. 37. P. 328-331.

83. G. Kauert, J. Rohrich. Concentrations of delta 9-tetrahydrocannabinol, cocaine and 6-monoacetylmorphine in hair of drug abusers. // Int. J. Legal Med. 1996. V. 108. P. 294-299.

84. V. Cirimele, H. Sachs, P. Kintz, P. Mangin. Testing human hair for cannabis. III. Rapid screening procedure for the simultaneous identification of Д9-tetrahydrocannabinol, cannabinol, and cannabidiol. // J. Anal. Toxicol. 1996. V. 20. P. 13-16.

85. Polettini A, Stramesi C, Vignali C, Montagna M. Determination of opiates in hair. Effects of extraction methods on recovery and on stability of analytes. // J. Forensic. Sci. Int. 1997. V. 84. P. 259 269.

86. M. Uhl. Determination of drugs in hair using GC/MS/MS. // J. Forensic. Sci. Int. 1997. V. 84. P. 281.

87. M. Scheller, H. Sachs. The detection of codeine abuse by hair analysis. // Deutsche Med. Wochenschrift. 1990. V. 115. P. 1313 -1315.

88. M. Yegles, F. Mersch, R. Wennig. Detection of benzodiazepines and other psychotropic drugs in human hair by GC/MS. // J. Forensic. Sci. Int. 1997. V. 84. P. 211-218.

89. J.J. Sramek, W.A. Baumgartner, T.N. Ahrens, V.A. Hill, N.R. Cutter. Detection of benzodiazepines in human hair by radioimmunoassay. // Ann. Pharmacoter. 1992. V. 26. P. 469-471.

90. O.H. Drummer. Methods for the measurement of benzodiazepines in biological samples. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 733. P. 201 225.

91. V. Cirimele, P. Kintz, B. Ludes. Screening for forensically relevant benzodiazepines in human hair by gas chromatography negative ion chemical ionization-mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1997. V.700. P. 119 - 129.

92. V. Cirimele, P. Kintz, P. Mangin. Detection and quantification of lorazepam in human hair by GC/MS-NCI in case of traffic accident. // Int. J. Legal. Med. 1996. V. 108. P. 265-267.

93. M. Rothe, F. Pragst, S. Thor , J. Hunger. Effect of pigmentation on the drug deposition in hair of grey-haired subjects. // J. Forensic. Sci. Int. 1997. V. 84. P. 53-60.

94. I. Ishiyama, T. Nagai, S. Toshida. Detection of basic drugs (methamphetamine, antidepressants, and nicotine) from human hair. // J. Forensic. Sci. 1983. V. 28. P. 380-385.

95. P. Kintz, A. Tracqui, P. Mangin. Detection of drugs in human hair for clinical and forensic applications. // Int. J. Leg. Med. 1992. V. 105. P. 1 4.

96. Ю.С. Другов. Экологическая аналитическая химия. / М.: 2000. 432с.

97. А.Н. Король, JI.C. Лысюк. Хроматографические методы определения полиядерных ароматических углеводородов в окружающей среде. // Журн. Аналит. Хим. 1979. Т. 34. №3. С. 577 590.

98. Н.А. Клюев, Т.С. Чуранова, Е.И. Соболева, Е.Я. Мир-Кадырова, М.Г. Короткое, С.Г. Дмитриенко. Определение полиароматических углеводородов в объектах окружающей среды. // Аналитика и контроль. 1999. №2. С. 4-18.

99. И.Н. Ким, Г.Н. Ким. О канцерогенном воздействии коптильного дыма. // Гигиена и санитария. 1998. Т. 5. С. 22.

100. A. Bemgard, A. Colmsjo, B.O. Lundmark. Gas chromatographic analysis of hygh-molecular-weight polynuclear aromatic hydrocarbons. I molecular weight 328. // J. Chromatogr. 1992. V. 595. P. 247 258.

101. V.M. Pozhidaev, K.A. Pozhidaeva. Retention indexes of PAHs on quartz capillary columns with chemically immobilized stationary phases. // Zh. Anal. Khim. USSR. 1989. V. 43. P. 1082 1088.

102. V.A. Gerasimenko, V.M. Nabivach. Relationships between gas chromatographic retention indices and molecular structure of aromatic hydrocarbons. // J. Chromatogr. 1990. V. 498. P. 354 357.

103. K. Peltonen, T. Kuljukka. Air sampling and analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 710. P. 93 108.

104. G. Gmeiner, G. Stehlik, H. Tausch. Determination of seventeen polycyclic aromatic hydrocarbons in tobacco smoke condensate. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 767. P. 163-169.

105. K. Pointet, A. Millet. PAHs analysis of fish whole gall bladders and livers from the Natural Reserve of Camargue by GC/MS. // Chemosphere. 2000. V. 40. P. 293-299.

106. P. Baumard, H. Budzinski. Concentrations of PAHs in various marine organisms in relation to those in sediments and to trophic level. // Marine Pollut. Bull. 1998. V. 36. №12. P. 951-960.

107. J. A. Schmit, R.A. Henry, R.C. Williams. Applications of high-speed reversed-phase liquid chromatography. // J. Chromatogr. Sci. 1971. V. 9. P. 645 -651.

108. S.A. Wise, L.C. Sander, W.E. May. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons by liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1993. V. 642. P. 329-349.

109. L.C. Sander, S.A. Wise. Investigations of selectivity in RPLC of polycyclic aromatic hydrocarbons. // Adv. Chromatogr. 1986. V. 25. P. 139-218.

110. L.C. Sander, S.A. Wise. Synthesis and characterization of polymeric CI8 stationary phases for liquid chromatography. // J. Anal. Chem. 1984. V. 56. P. 504-510.

111. S.A. Wise, W.J. Bonnet, F.R. Guenther, W.E. May. A relationship between reversed-phase CI8 liquid chromatographic retention and the shape of polycyclic aromatic hydrocarbons. // J. Chromatogr. Sci. 1981. V. 19. P. 457 -465.

112. К. Нага, T. Hanaoka, Y. Yamano. Urinary 1-hydroxypyrene levels of garbage collectors with low-level exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. // The Sci. of the Total Environ. 1997. V. 199. P. 159 160.

113. P. Simon, Y. Morele, P. Delsaut, T. Nicot. Automated column-switching HPLC method for the determination of 1-hydroxypyrene in human urine. //J. Chromatogr. B. 1999. V. 732. P. 91 101.

114. K. Tyrpien, D. Bodzek, B. Janoszka. Separation of PAHs and heterocompound concentrates from airborne particular matter by thin layer chromatography. //J. Planar Chromatogr. 1991. V. 4. P. 309 312.

115. S.K. Poole, T.A. Dean, C.F. Poole. Preparation of environmental samples for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons by thin-layer chromatography. //J. Chromatogr. 1987. V. 400. P. 323 -341.

116. A. Herold. A review of the users of planar chromatography in the coal and oil industries. //J. Plan. Chromatogr. 1994. V. 7. P. 180 193.

117. C.F. Poole, M.E. Coddens. Comparison of methods for separating polycyclic aromatic hydrocarbons by HPTLC. // J. Liq. Chromatogr. 1985. V. 8. P. 2874-2875.

118. C.F. Poole, H.T. Buttler, M.E. Coddens. Qualitative identification of PAHs by high-perfofmance thin-layer chromatography and fluorescence scanning densitometry. //J. Chromatogr. 1984. V. 302. P. 149- 151.

119. B. Seifert. Stability of benzoa.pyrene on silica gel plates for high-perfofmance thin-layer chromatography. // J. Chromatogr. 1977. V. 131. P. 414 — 417.

120. M. Frank-Neumann, P. Jossang. Emploi des complexes к en chromatographie sur couche mince. Derives polynitres aromatiques et hydrocarbures aromatiques a noyaux condenses. // J. Chromatogr. 1964. V. 14. P. 280-283.

121. A. Berg, J. Lam. Separation of polycyclic aromatic hydrocarbons by thin-layer chromatography on impregnated layers. // J. Chromatogr. 1964. V. 16. P. 157-166.

122. J. Lam, A. Berg. Spectrophotometry determination of polycyclic aromatic hydrocarbons separated by thin-layer chromatography, and evaluation of the light sensitivity of hydrocarbon spots. // J. Chromatogr. 1965. V. 20. P. 168 — 171.

123. H. Kessler, E. Mtiller. Dunnschichtchromatographische Trennung mehkerniger Aromaten mit Pikrinsaure als Komplexbildner. // J. Chromatogr. 1966. V. 24. P. 469-473.

124. B.L. Karger, M. Martin, J. Loheac, G. Guiochon. Separation of polyaromatic hydrocarbons by liquid-solid chromatography using 2,4,7-trinitrofluorenone impregnated Corasil I columns. // J. Anal. Chem. 1973. V. 45. P. 496-500.

125. W. Funk, V. Gluck. PAHs: charge transfer chromatography and fluorimetric determination. // J. Planar Chromatogr. 1989. V. 2. P. 28 32.

126. W. Funk, G. Donnevert, B. Schuch. Quantitative HPTLC determination of six PAHs in water. // J. Plan. Chromatogr. 1989. V. 2. P. 317 320.

127. W. Morden. Separation of nucleotides and bases by HPTLC with identification by tandem MS. // J. Planar Chromatogr. 1995. V. 8. P. 98 102.

128. K. Tyrpien, D. Bodzek. Application of TLC and GC-MS to the identification of azaarenes in sewage sludges. // J. Planar Chromatogr. 1995. V. 8. P. 75-77.

129. K. Ludanyi et al. Application of TLC FAB MS in metabolism research. // J. Planar Chromatogr. 1997. V. 10. P. 90 - 96.

130. R. Kaiser. Thin-layer chromatography in direct coupling with gas chromatography and mass spectrometry. // Chem. Brit. 1969. V. 5. P. 54 61.

131. J. Jacob. TLC, GLC and MS of complex lipid mixtures from uropygial secretions. // J. Chromatogr. Sci. 1975. V. 13. P. 415 422.

132. Справочник по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды. / Под ред. Г.И. Арановича. JL: Судостроение. 1979. 648 с.

133. S. М. Scheifers, S. Verma. Characterization of organic dyes by secondary ion mass spectrometry. // J. Anal. Chem. 1983. V. 55. P. 2260 2266.

134. H. Kutsch, U. Schoen. A simplified HPTLC screening method for the estimation of the PAH content in soil samples. // Fresen. J. Anal. Chem. 2000. V. 367. P. 279-283.

135. A.J. Kubis. Laser mass spectrometric analysis of compounds separated by TLC. // J. Anal. Chem. 1989. V. 61. P. 2516 2523.

136. М.Д. Машковский. Лекарственные средства. В двух частях. / М.: Новая волна. 1996. 736 с.

137. Е.А. Лужников. Клиническая токсикология. / М.: Медицина. 1994.256 с.

138. А.Н. Stead, R. Gill, Т. Wright, J.P. Gibbs, A.C. Moffat. Standardised thin-layer chromatographic systems for the identification of drugs and poisons. // Analyst. 1982. V. 107. P. 1106 1168.

139. А.Ф. Фартушний, Е.Б. Мужановський, A.I. Сэдов. Идентификация деяких токсикологично важливых речовин у биологичних ридинах. // Фармацевтичний журнал. 1988. № 3. С. 45 49.

140. И.М. Коренман. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. / М.: Химия. 1970. 334 с.

141. Sz. Nyiredy, В. Meier, С. A. J. Erdelmeier, О. Sticher. "PRISMA": А geometrical design for solvent optimization in HPLC. // J. High Resol. Chromatogr. & Chromatogr. Commun. 1985. V. 8. № 186.

142. B.A. Рабинович, З.Я. Хавин. Краткий химический справочник. / Л.: Химия. 1978. 392 с.

143. T.V. Polenova, A.G. Borzenko, I.V. Marutsenko, I.A. Revelsky. Screening of psychotropic drugs in human hair based on HPTLC and microliquid extraction. // J. Chromatogr. Sci. 2001. V. 39. P. 293 296.

144. Руководство по современной хроматографии. / Под ред. О.Г. Ларионова. М.: 1994. 311 с.

145. I. Ojanpera. Toxicological drug screening by thin-layer chromatography. // Trends in Analyt. Chem. 1992. V. 11. P. 222 230.

146. А. Гордон, P. Форд. Спутник химика. / M.: Мир. 1976. 541 с.

147. P. Kintz, P. Mangin. Determination of gestational opiate, nicotine, benzodiazepine, cocaine and amphetamine exposure by hair analysis. // J. Forensic. Sci. Soc. 1993. V. 33. P.139- 142.

148. И.В. Власова, В.И. Вершинин, Ю.Н. Смирнов, И.М. Смольская, А.В. Карякин. Экстракционное концентрирование водорастворенных полиаренов. // Журн. аналит. химии. 1988. Т. 43. С. 516 522.

149. J.M. Garcia, A.I. Jimenez, F. Jimenez, J.J. Arias. Simultaneous determination of perphenazine and amitriptyline by derivative spectrophotometry. // Analyt. Letters. 1992. V. 25. P. 1511 1524.

150. I.V. Marutsenko, T.V. Polenova, E.D. Virus, A.G. Borzenko, I.A. Revelsky. HPTLC determination of polyaromatic hydrocarbones in smokers' hair. // J. Planar Chromatogr. 2001. V. 14. P. 330 333.

151. Концентрирование следов органических соединений (Проблемы аналитической химии, т. X). / Под ред. Н.М. Кузьмина. М.: Наука. 1990. 280 с.