Сверхкритическая флюидная экстракция среднелетучих органических соединений из человеческих волос с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом всего экстракта тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Богданов Александр Владимирович

Сверхкритическая флюидная экстракция среднелетучих органических соединений из человеческих волос с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом всего экстракта

02 00 02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□□3158623

Москва - 2007

003158623

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Ревельский Игорь Александрович Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Белякова Любовь Дмитриевна, Институт физической химии РАН

доктор химических наук, профессор Рыбальченко Игорь Владимирович, ФГУ "27 научный центр МО РФ" Ведущая организация

Институт общей и неорганической химии им Н С Курнакова

Защита состоится 24 октября 2007 года на заседании диссертационного Совета Д 501 001 88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 3, МГУ им M В Ломоносова, химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан 18 сентября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук Торочешникова И И

Общая характеристика работы

Актуальность темы В настоящее время волосы являются третьим по важности биологическим объектом для медицинских и токсикологических исследований после крови и мочи, выгодно отличаясь от них простотой отбора, долговременностью хранения аналитов в матрице (можно зафиксировать однократное принятие наркотического вещества спустя 2-6 месяцев), а также возможностью отбора пробы в любое время суток

Обычно работы ограничиваются определением одной группы заданных соединений (например, анаболические стероиды) и продуктами их метаболизма Гораздо реже встречаются работы, в которых определяют 2-3 группы соединений (чаще всего опиаты и кокаин с продуктами их метаболизма), и для определения в волосах соединений различных групп необходимо проведение множества дорогостоящих анализов, нацеленных на определение конкретных групп соединений

Существует два подхода к экстракции органических соединений из волос -экстракция без разложения волос и экстракция с частичным либо полным разложением Наиболее широко используются деструктивные способы извлечения, которые можно разделить на три типа разложение волос при помощи щелочей, кислот и ферментативное разложение Каждый из этих способов имеет свои ограничения При щелочном разложении соединения, неустойчивые к действию щелочей, такие как героин, разрушаются с образованием более простых производных Кислотное разложение минимизирует разложение сложных эфиров, но при извлечении соединений, неустойчивых к действию кислот, например, бензодиазепинов, приводит к их деструкции Также при щелочном либо кислотном разложении происходит загрязнение пробы примесями из реагентов, используемых как для разложения волос, так и для нейтрализации полученного раствора Ферментативное разложение позволяет извлекать вещества, неустойчивые к действию как кислот, так и оснований, но при этом требует дополнительной очистки раствора после экстракции, а также характеризуется большой стоимостью реагентов После разложения определяемые соединения извлекают из раствора при помощи жидкость-жидкостной экстракции, твердофазной экстракции либо твердофазной микроэкстракции Основным недостатком ЖЖЭ является необходимость использования больших объемов токсичных, а часто и горючих органических растворителей Кроме того, их чистота редко превышает 99 7 %, и при упаривании происходит концентрирование примесей из растворителя, что приводит к искажению состава пробы При этом для дальнейшего анализа используется 0 001-0 01 часть

экстракта Недостатком ТФЭ является использование органических растворителей, хотя и в количествах, меньших, чем в ЖЖЭ При этом для анализа также используется малая часть экстракта Преимущество ТФМЭ перед ЖЖЭ и ТФЭ - в отсутствии использования органических растворителей, недостаток - в малых степенях извлечения

Также для извлечения органических соединений из волос используют жидкостную экстракцию буферными растворами (чаще всего - фосфатными) либо органическими растворителями При экстракции буферными растворами далее проводят экстракцию из полученного раствора теми же методами, что и при разложении волос При экстракции органическими растворителями часто применяется экстракция в аппарате Сокслета и экстракция в ультразвуковом поле Недостатки способа - в использовании органических растворителей и в низких степенях извлечения При этом для анализа также используется малая часть экстракта

В последние годы возник интерес к сверхкритической флюидной экстракции (СФЭ) как к альтернативе классическим методам экстракции веществ из биологических матриц В качестве преимуществ этого метода можно отметить

желаемая селективность экстракции может быть получена варьированием таких параметров, как давление, температура, модификатор, •/ хорошие диффузионные качества сверхкритических флюидов способствуют быстрому проникновению и извлечению из образца,

использование низких температур позволяет извлекать без разложения термически лабильные соединения Сверкритическую флюидную экстракцию органических соединений из волос обычно проводят, ограничиваясь 1-2 классами заданных соединений, при анализе лишь малой (0 001-0 01) части экстракта

После экстракции производят определение соединений с помощью иммуноферментных методов, ВЭЖХ, капиллярного электрофореза, ГХ-МС, ВЭЖХ-МС Основная сложность при этом заключается в низком содержании определяемых соединений - на уровне нг/мг, иногда - пг/мг ВЭЖХ и капиллярный электрофорез для определения органических соединений в волосах используются крайне редко ввиду низкой чувствительности и недостатком достоверности определения, иммуноферментные методы обычно используются как скриннинговые для обнаружения заданных соединений, и даже хромато-масс-спектрометрические методы зачастую ограничены применением "режима сбора отдельных ионов" в целях достижения более низких пределов обнаружения Использование всего экстракта для

анализа является одним из возможных путей дополнительного снижения пределов обнаружения Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют работы по изучению состава неизвестных среднелетучих примесей, присутствующих в волосах Кроме того, нет единого мнения о степени извлечения соединений, принадлежащих к различным классам, при использовании известных методов извлечения Поэтому актуально исследование возможности обнаружения различных классов органических соединений, присутствующих в волосах, и их идентификации

Целью настоящей работы являлось разработка способа определения состава среднелетучих органических соединений, присутствующих в волосах человека, основанного на СФЭ без использования растворителя и ГХ/МС анализе всего экстракта, и его сопоставление с существующими способами выделения примесей из волос и их определения

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Исследовать зависимости сверхкритической флюидной экстракции из волос от давления и температуры, а также от времени экстракции,

2 Разработать способ определения среднелетучих органических соединений различных классов в человеческих волосах, основанный на СФЭ из волос и последующем ГХ-МС анализе всего экстракта,

3 В оптимальных условиях провести анализ волос различных людей с использованием разработанного способа,

4 Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при использовании экстракции из волос органическими растворителями с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта,

5 Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при разложении волос с последующей экстракцией из реакционной смеси органическими растворителями с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта,

6 Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при разложении волос с последующей СФЭ из реакционной смеси и анализом всего экстракта методом ГХ/МС

Научная новизна работы

1 Исследована зависимость степени извлечения среднелетучих органических соединений из волос методом СФЭ без использования растворителя от времени экстракции, температуры и давления сверхкритического флюида,

2 В результате проведенных исследований разработан способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на сочетании СФЭ из волос с хромато-масс-спектрометрическим анализом всего экстракта без использования органических растворителей,

3 Исследован состав среднелетучих органических соединений в волосах различных людей при использовании разработанного способа определения Диапазон содержаний определяемых соединений составил 0 002 - 99 6 нг/мг волос Показано, что состав экстрагированных соединений и их количества схожи для различных образцов волос В основном, различия между образцами волос проявляются на уровне менее 1 нг/мг волос,

4 Исследован состав среднелетучих соединений, выделенных из одного из образцов волос жидкостной экстракцией без разложения и проведено сопоставление с данными, полученными разработанным способом При использовании разработанного способа обнаружено 214 соединений, при использовании экстракции метанолом - 43, при этом 28 соединений обнаружено обоими способами Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании разработанного способа составило 223 нг/мг волос, при использовании экстракции метанолом -123 нг/мг волос,

5 Исследован состав среднелетучих соединений, выделенных жидкостной экстракцией дихлорметаном из реакционной смеси после разложения волос и проведено сопоставление с данными, полученными разработанным способом При использовании ЖЖЭ зарегистрировано 36 соединений, из них 11 входят в число соединений, выделенных СФЭ из волос Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании экстракции дихлорметаном из реакционной смеси составило 37 нг/мг волос,

6 С использованием ГХ/МС и анализа всего экстракта исследован состав органических соединений, выделенных сверхкритической флюидной экстракцией без использования органического растворителя из реакционной смеси, полученной щелочным разложением волос, и проведено сопоставление с составом примесей, полученных при использовании разработанного способа, основанного на СФЭ из волос и ГХ/МС анализе всего концентрата Обнаружено

151 соединение, из них 47 входят в число соединений, выделенных СФЭ из волос Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании СФЭ из реакционной смеси составило 188 нг/мг волос,

7 Показано, что в состав исследованных экстрактов входили соединения, принадлежащие к таким классам соединений, как алифатические углеводороды, альдегиды, кетоны, спирты, карбоновые кислоты и их эфиры Наряду с ними в состав всех исследованных образцов волос входили различные фталаты, которые относятся к стойким органическим загрязнителям (СОЗ), подлежащим обязательному контролю Практическая значимость работы Разработан способ определения неизвестных среднелетучих органических соединений в человеческих волосах на уровне 0 001 -100 нг/мг волос, основанный на СФЭ из волос, улавливании соединений из потока СФ в сорбционный картридж, термодесорбции в газовый хроматограф и ГХ-МС анализе всего экстракта Результаты работы использованы на Химическом факультете МГУ им М В Ломоносова С использованием разработанного способа проведено определение состава среднелетучих органических соединений в волосах различных людей Показано, что наиболее полная информация о составе неизвестных среднелетучих примесей в волосах может быть получена при сочетании различных способов выделения, рассмотренных в работе Результаты работы могут быть использованы для оценки загрязненности внутренней среды организма человека стойкими органическими загрязнителями, а также для в медицине для ранней диагностики различных заболеваний путем определения в волосах соединений-маркеров заболеваний

На защиту выносятся следующие положения

1 Результаты исследования зависимости степени извлечения органических соединений методом СФЭ из волос без использования органических растворителей от параметров эксперимента

2 Способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на СФЭ из волос и хромато-масс-спектрометрическом анализе всего экстракта без использования органических растворителей

3 Результаты определения среднелетучих органических соединений в волосах различных людей, полученные с использованием разработанного способа

4 Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и общепринятого способа, основанного на экстракции органическим

растворителем из волос с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта

5 Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и общепринятого способа, основанного на разложении волос раствором ЫаОН, жидкостной экстракции из реакционной смеси органическим растворителем и ГХ/МС анализе малой части экстракта

6 Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и предложенного нами способа, основанного на разложении волос раствором №014, прямой СФЭ из реакционной смеси без использования органического растворителя и ГХ/МС анализе всего экстракта

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Тринадцатой европейской конференции по аналитической химии Еигоапа1ув18 XIII (Саламанка, Испания, 2004 г), на Втором международном симпозиуме по разделению и концентрированию в аналитической химии и радиохимии (Краснодар, Россия, 2005 г), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, Россия, 2005 г), на Двадцать восьмом международном симпозиуме по газовой хроматографии и капиллярному электрофорезу (Лас Вегас, США, 2005 г)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ в виде статей и тезисов докладов

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель работы, задачи, научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту Первая глава представляет собой литературный обзор методов анализа волос на содержание следовых количеств заранее заданных органических соединений Основное внимание уделено рассмотрению общепринятых методов пробоподготовки, используемых при анализе волос, их возможностям и ограничениям с точки зрения определения следовых количеств органических соединений различных классов Рассмотрены ключевые источники существующих ограничений общепринятых методов пробоподготовки В этой же главе рассматривается состояние одного из перспективных вариантов пробоподготовки, развивающихся сегодня -

сверхкритической флюидной экстракции Особое внимание уделяется основному источнику ограничений метода - способам улавливания соединений из потока сверхкритического флюида, рассматриваются их достоинства и недостатки Здесь же дается критическая оценка состоянию дел в области использования СФЭ при определении следовых содержаний органических соединений в волосах

Во второй главе описывается оборудование и методика эксперимента В третьей главе представлены результаты разработки способа определения среднелетучих органических соединений в волосах, основанного на сочетании СФЭ из волос с газохроматографическим анализом всего экстракта Приведены результаты исследования условий сверхкритической флюидной экстракции из волос соединений, присутствующих в экстракте в наибольших концентрациях В четвертой главе представлены результаты использования разработанного способа для анализа ряда образцов волос В пятой главе представлены результаты использования различных способов анализа волос, а также проведено сопоставление с результатом, полученным при использовании разработанного способа

В заключении проводится обобщение полученных результатов и рассматриваются возможности дальнейшего развития предлагаемого метода

Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 31 рисунок, 22 таблицы и список литературы из 123 наименований

Основное содержание работы

Оборудование, исходные вещества, методика эксперимента

Для выполнения данной работы использовали следующее оборудование

- насос для сверхкритической флюидной экстракции модели «SFE 300» (Carlo Erba Instruments, Италия), оснащенный системой охлаждения до-15°С,

- установку для сверхкритической флюидной экстракции модели «SFE 30», оборудованную металлическим обогреваемым рестриктором с возможностью регулировки потока (Carlo Erba Instruments, Италия),

- ячейки для проведения СФЭ объемом 0,4 мл и 12 мл из нержавеющей стали

- газовый хроматограф модели «4160» (Carlo Erba Instruments, Италия), оснащенный инжектором для ввода пробы с делением/без деления потока, инжектором для ввода пробы непосредственно в колонку, пламенно-ионизационным детектором с блоком управления EL-480 (Carlo Erba Instruments, Италия),

- газовый хроматограф модели «Vanan 3400» в сочетании с масс-спектрометром модели «INCOS 50» (Finnigan),

- капиллярные колонки CPSil 24СВ 30 м х 0 32 мм х 0 5 мкм

CPSil 8CB Lowbleed/MS 30 м x 0 32 мм x 1 мкм,

- систему для сбора и обработки хроматографических данных модели «Chrom Card», включающую персональный компьютер IBM PC AT 485, блок оцифровки данных и соответствующее программное обеспечение,

- шприцы для приготовления растворов и ввода пробы в газовый хроматограф объемом 10 мкл и 1 мл (Hamilton, США),

- генератор водорода модели «ГВЧ-12» (Россия),

- сорбционный картридж, заполненный активированным углем, Тенаксом и стеклянными шариками с 5% SE-30,

- ультразвуковую ванну модели «BRANSONIC 220» (Германия),

- электронагревательную воздуходувку (Bosch, Германия)

В качестве сверхкритического флюида использовали СОг (особой чистоты 99 995%, баллон), дополнительно очищенный с помощью активированного угля и молекулярных сит 5А

Для проведения газохроматографического анализа использовали следующие газы газ-носитель - водород (генератор, дополнительная очистка молекулярными ситами 5Ä), гелий (марки А, баллон), вспомогательный газ - воздух (компрессор, дополнительная очистка молекулярными ситами 5Ä)

В качестве внутренних стандартов использовали 1,4-дихлорбензолчМ, нафталинов, аценафтен-dlO, фенантрен-dlO, кризен-012 и nepwieH-d12 (Absolute Standards Inc , Хамден, США)

В качестве органического растворителя для жидкостной экстракции из волос использовали метанол (хч)

Для разложения волос использовали 1М раствор NaOH в бидистиллированной воде Для нейтрализации полученного раствора использовали 0 5 М раствор H2SO4 в бидистиллированной воде

В качестве органического растворителя для жидкость-жидкостной экстракции из раствора, полученного после разложения волос, использовали дихлорметан (х ч ) Исследование зависимости степени извлечения среднелетучих органических соединений из волос методом СФЭ от параметров

эксперимента

Одним из ключевых моментов в СФЭ является сбор и перенос экстракта в хроматографическую систему В настоящее время в СФЭ для сбора и переноса экстракта в хроматографическую систему преимущественно используют либо «online» сочетание, либо улавливание в органический растворитель Эффективность и

чувствительность метода значительно возрастет, если осуществить полный (т.е. количественный) перенос всего экстракта в хроматографическую систему. Вдобавок, отказ от использования органических растворителей сведет к минимуму искажение состава пробы за счет привнесения примесей из растворителя, что особенно важно при анализе смесей неизвестных соединений.

Для решения поставленной задачи было предложено использовать решение, которое ранее было предложено для улавливания аналитов различной летучести, выделенных СФЭ из водных растворов и полимеров в нашей лаборатории

Сбор экстракта осуществляли при помощи сорбционного устройства-картриджа, улавливающего определяемые соединения из газового потока. Перенос экстракта с картриджа проводили напрямую в инжектор газового хроматографа при помощи термодесорбции.

5 мг измельченных волос помещали в экстракционную ячейку объемом 0.4 мл (рис 1). Ячейку помещали в установку для СФЭ и термостатировали в течение 5 минут. Экстракцию проводили сверхкритическим СО; при контролируемых давлении и температуре. Поток сверхкритического флюида через ячейку контролировали, изменяя выходное отверстие рестриктора. Сбор экстрагируемых соединений осуществляли на сорбционном устройстве-картридже (рис.2).

1 Линия подачи сверхкритической фазы.

2 Измельченные валосы;

3. С верх критическая фаза;

4. Металлический фильтр;

Линия выхода сверх критической фазы

Рис.1. Ячейка для проведения сверхкритической флюидной экстракций из волос.

Рис 2 Система для проведения сверхкритической флюидной экстракции с улавливанием экстрагированных соединений в сорбционный картридж.

Для ГХ анализа экстракта к картриджу с сорбированными соединениями с одной стороны присоединяли иглу, а с другой стороны подключали газовую линию. Перекрывали потоком газа-носителя через колонку Иглу вводили в инжектор газового хроматографа и включали поток водорода через присоединенную газовую линию. Поток водорода устанавливали равным потоку газа-носителя через газохроматографическую колонку при нормальном анализе (рис.3.).

Рис.3. Схема перевода органических соединений в ГХ систему.

Далее проводили термодесорбцию определяемых соединений, обогревая картридж в течение 15 минут потоком горячего воздуха (270°С). После термодесорбции поток водорода через дополнительную линию перекрывали, вынимали из инжектора картридж с иглой, включали поток газа-носителя и проводили хроматографическое определение исследуемых соединений.

Так как изначально количество соединений, содержащихся в волосах, неизвестно, тс точное определение степени извлечения из волос затруднено. Поэтому для оценки эффективности извлечения соединений из волос в различных условиях нами был предложен следующий метод:

а) при заданных температуре и давлении сверхкритического флюида проводили экстракцию в течение 10 минут. Далее картридж с экстрагированными соединениями присоединяли к инжектору хроматографа и проводили термодесорбцию в течение 15 минут при температуре 270°С. Проводили газохроматографическое разделение по следующей температурной программе: 50°С (15 мин) 23°С/мин 280СС (20 мин). Полученная хроматограмма представлена на рис. 4.

Сорбционный картридж

ш

-_

тгжМ I

! -Т~Г

Рис 4 Хроматограмма экстракта из волос при времени экстракции 10 минут, зарегистрированная с помощью ПИД Цифрами 1-4 обозначены пики, которые использовались для расчета эффективности экстракции

б) С той же пробы волос проводили экстракцию 3 раза по 10 минут, затем - 20, 30 и 60 минут Таким образом, суммарное время экстракции одной пробы волос составило 150 минут

в) Проводили оценку эффективности экстракции по четырем максимальным пикам на хроматограммах по следующей формуле

Для первых 10 минут экстракции R(%) = Si/(£S,)*100% ,где Si - площадь пика на хроматограмме, соответствующей первым 10 минутам экстракции, a £S, - сумма площадей данного пика на всех 7 хроматограммах, отвечающих различным временам экстракции

Для первых 20 минут экстракции R(%) = (Si+S2)/(ESi)*100% ,где Si - площадь пика на хроматограмме, соответствующей первым 10 минутам экстракции, S2 -площадь пика на хроматограмме, соответствующей следующим 10 минутам экстракции, a ES, - сумма площадей данного пика на всех 7 хроматограммах, отвечающих различным временам экстракции

Для расчета степеней извлечения при 30, 40, 60, 90, 150 минутах экстракции использовались аналогичные формулы

При изучении рассматриваемой зависимости температуру варьировали в диапазоне 45 - 80°С при давлении сверхкритического флюида 25 МПа В качестве сверхкритического флюида использовали С02 Рис 5-8 иллюстрируют влияние температуры в экстракционной системе на скорость извлечения соединений из волос сверхкритическим флюидом

Рис.5. Зависимость степени извлечения соединения, соответствующего первому гику на хроматограмме, от температуры флюида.

Рис. 6. Зависимость степени извлечения соединения, соответствующего второму пику на хром это грамме, от температуры флюида.

Рис.7. Зависимость степени извлечения Рис. В. Зависимость степени извлечения

соединения, соответствующего третьему пику соединения, соответствующего четвертому пику на хроматограмме, от температуры флюида. нз хроматограмме, от температурь: флюида.

Давление варьировали в диапазоне 15 - 25 МПа при температуре сверхкритического флюида 80°С. В качестве сверхкритического флюида использовали С02. Рис. 9-12 иллюстрируют влияние давления в экстракционной системе на скорость извлечения соединений из волос сверхкритическим флюидом.

Рис.Э. Зависимость степени извлечения соединения, соответствующего первому пику на хроматограмме, от давления фпюида.

Рис. 10. Зависимость степени извлечения соединения, соответствующего второму пику на хроматограмме, от давления флюида.

МПа

—Г 1 1

Рис.11. Зависимость степени извлечения Рис. 12. Зависимость степени извлечения

соединения, соответствующего третьему пику соединения, соответствующего четвертому пику на хроматсграмме, от давления флюида. на хромэтограмме от давления флюида.

Как видно из полученных данных, повышение температуры и давления в экстракционной системе приводит к увеличению скорости экстракции. В связи с этим для всех изученных соединений оптимальная температура и давление составляли 80"С и 25 И Па, соответственно. Мы приняли, что эти условия, выбранные в результате исследования для четырех экстрагированных неизвестных соединений, справедливы и для остальных экстрагированных соединений.

Таким образом, в результате проведенного исследования изучены зависимости степеней извлечения неизвестных среднелетучих соединений от условий сверхкритической флюидной экстракции из человеческих волос На основании изучения условий предложен новый экспрессный способ извлечения и концентрирования среднелетучих органических соединений из волос, основанный на СФЭ из волос, исключающий использование органических растворителей.

Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов человеческих

волос

Полученные результаты исследования условий СФЭ из волос позволили изучить возможность разработки способа определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанного на СФЭ из волос, сорбционном улавливании экстрагированных соединений на выходе из флюидного экстрактора, переводе всего концентрата термодесорбцией в инжектор хроматографа и ГХ/МС анализе этого концентрата

В качестве образцов волос были испопьзованы волосы четырех сотрудников Химического факультета МГУ, Образец №1 - мужчина, 23 года; образец №2 -женщина, 20 лет; образец №3 - мужчина, 24 года; образец №4 - женщина, 25 лет.

Извлечение органических соединений из волос проводили сверхкритическим С02 (1 мл/мин) при температуре 80°С и давлении 25 МПа в течение 15 мин при температуре рестриктора 250°С Температура термодесорбции составляла 270°С В качестве внутреннего стандарта использовали смесь дейтерированных ПАУ (4 нг/мкп/компонент, 1 мкл)

Проводили газохроматографическое разделение по следующей температурной программе 40°С (15 мин) 10°С/мин 270°С (40 мин)

Масс-спектрометрический анализ проводили при ионизации электронным ударом с энергией электронов, равной 70 эВ, с диапазоном сканирования 50-500 а е м при скорости сканирования 2 скана/сек Температура источника ионов составляла 170°С, температура интерфейса - 250°С

Хроматограммы по полному ионному току четырех исследованных образцов волос представлены на рис 13-16

1 00 ~атЕ

^-lL_

Retention Time (min)

Рис 13 Хроматограмма по полному ионному току экстракта первого образца волос

1 00 0 75 0 50 0 25

IA^L

25 30 35 40

Retention Time (min)

Рис 14 Хроматограмма по полному ионному току экстракта второго образца волос

Рис 15 Хроматограмма по полному ионному току экстракта третьего образца волос

Рис 16 Хроматограмма по полному ионному току экстракта четвертого образца волос

Исследование хромато-масс-спектрометрических данных проводили следующим образом на хроматограмме, отвечающей полному ионному току, находили пики, даже незначительно (отношение сигнал/шум около 3) отличающиеся от фона Далее производили усреднение нескольких сканов вблизи максимума пика и вычитание усредненного спектра фона вблизи пика По полученным значениям m/z строили масс-хроматограммы и исследовали их на наличие пика с соотношением сигнал/шум более 3 В случае обнаружения подобных пиков производили повторное усреднение сканов на максимуме пика масс-хроматограммы и вычитание сканов фона вблизи пика Далее исследовали данные холостого опыта на предмет наличия на данном участке хроматограммы пика с подобным спектром Пики, не имеющие аналога в холостом опыте, считались соответствующими соединениям, экстрагированным из волос Полученный масс-спектр относили к неизвестному соединению, а далее проводили дополнительную очистку масс-спектра Пики высотой менее 1% удалялись из масс-спектра После этого строилась масс-хроматограмма по каждому оставшемуся пику на масс-спектре В случае отсутствия пика на данной масс-хроматограмме при данном времени удерживания, пик удалялся из масс-спектра

В процессе очистки масс-спектров параллельно проводили поиск пиков, незаметных на хроматограмме, зарегистрированной по полному ионному току Для этого после построения масс-хроматограмм по пикам в исследуемом масс-спектре исследовали несколько последующих пиков на данной масс-хроматограмме на предмет наличия пика при данном времени удерживания на хроматограмме по полному ионному току В случае наличия пика на масс-хроматограмме и отсутствия пика на хроматограмме по полному ионному току после окончания очистки текущего пика переходили к найденному пику, проводили усреднение сканов на максимуме пика масс-хроматограммы и вычитание сканов фона вблизи пика Далее полученный масс-спектр обрабатывали вышеуказанным способом

Полученные таким образом масс-спектры далее использовали для поиска в библиотеке масс-спектров NIST При обнаружении спектров соединений в библиотеке,

индекс сходимости которых с данным неизвестным масс-спектром составлял более 800, считали соединение идентифицированным

Также, вследствие огромного количества соединений, часто наблюдалось наложение пиков разных соединений Так, на рис 17 представлен участок хроматограммы по полному ионному току, на котором находится пик с временем удерживания 9 065 мин

90 9 1

Retention Time (min)

Рис 17 Участок хроматограммы по полному ионному току

При усреднении нескольких сканов вблизи максимума пика и вычитании усредненного спектра фона был получен масс-спектр, представленный на рис 18

too

"яп—

au

Я

С

S ~S5~

s

к "40

£

"20

1

,■I I, 1.11

104

тй

Рис 18 Масс-спектр электронной ионизации, полученный при усреднении сканов вблизи максимума пика с временем удерживания 9 065 мин

При поиске в библиотеке масс-спектров NIST соединения, отвечающего данному спектру, найдено не было При последовательном выводе масс-хроматограмм по m/z данного спектра было найдено, что данный пик образован перекрыванием двух соединений с разницей во времени удерживания 1 сек (9 049 и 9 065 мин, рис 19)

120000 100000 30000

о

н 60000 40000 20000

86 87 88 89 90 9 1 82 93 94

Retention Time (min)

Рис 19 Участок масс-хроматограмм по m/z 142 и 150

При повторном усреднении сканов вблизи максимумов пиков на масс-хроматограммах были получены два масс-спектра, в которых присутствовали пики обоих соединений Последовательный вывод всех масс в полученных масс-спектрах в виде масс-хроматограмм позволил определить, какие пики в масс-спектрах принадлежат первому соединению, какие - второму Пики, не принадлежащие данному соединению, удалялись из масс-спектра Таким образом, были получены два очищенных масс-спектра, представленные на рис 20 и 21

150-,

100

S®

1 "во

<2

тз "55

&

~20

.............nlli "1 88i...............Ii...............................L

56 64 72 S0 80 06 104 112 120 128 13S 144 152

шЛ

Рис 20 Очищенный масс-спектр, соответствующий соединению с временем удерживания 9 049 мин

m/z 150 ^

/Д m/z 142 it

III

I II,

Рис 21 Очищенный масс-спектр, соответствующий соединению с временем удерживания 9 065 мин

При поиске в библиотеке масс-спектров NIST эти соединения были идентифицированы соединение с временем удерживания 9 049 мин - как 1,4-

дихлорбензол-с)4 (Я=850, внутренний стандарт), соединение с временем удерживания 9 065 мин - как 2-метилгепта-1,5-диен-3,4-диол (К=905)

Данные о числе зарегистрированных в четырех образцах волос соединений и их идентификации представлены в табл 1

Таблица 1

Число обнаруженных и идентифицированных органических соединений в четырех образцах волос

Проба ВОЛОС, N9 Зарегистрировано соединений Идентифицировано соединений

На уровне 1-100 пг/мг На уровне 0 1-1 нг/мг На уровне 1-100 нг/мг Всего

1 83 123 44 250 72

2 61 109 44 214 78

3 75 101 34 210 70

4 61 88 42 191 66

Профили примесей в изученных образцах волос сравнивали по времени

удерживания и масс-спектрам В четырех образцах волос обнаружено 276

соединений, из них 89 идентифицировано В результате исследования найдено, что

во всех исследованных образцах по времени удерживания и масс-спектрам

совпадало 145 соединений, содержание которых составляло от 0 002 до 99 6 нг/мг

волос, из них 61 было идентифицировано В основном, эти соединения относились к

таким классам, как алифатические углеводороды, альдегиды, кетоны, спирты,

карбоновые кислоты и их эфиры Различие между образцами наблюдалось по числу

зарегистрированных примесей, их масс-спектрам и содержанию 131 соединение (из

276), распределялось между образцами неравномерно Уровень содержаний таких

соединений составил от 0 002 до 3 03 нг/мг волос, 28 из них было идентифицировано

В основном, различия между образцами волос проявляются на уровне содержаний

менее 1 нг/мг волос Различие наблюдалось как между мужчинами, так и женщинами

Сравнение различных способов извлечения среднелетучих органических соединений из человеческих волос и их определения

В литературе нет единого способа извлечения из волос даже заданных

примесей Наиболее общепринятыми являются экстракция из волос метанолом и разложение волос с последующей жидкость-жидкостной экстракцией Было решено провести сопоставление разработанного способа извлечения примесей из волос со следующими способами, первые два из которых широко известны, а последний предложен нами

- ультразвуковая экстракция метанолом,

- разложение волос при помощи 1М NaOH с последующей жидкость-жидкостной экстракцией из полученного раствора,

- разложение волос при помощи 1М NaOH с последующей сверхкритической флюидной экстракцией из полученного раствора

Сравнение различных способов извлечения органических соединений проводили, используя образец волос №2 (женщина, 20 лет)

Хроматографические и масс-спектральные условия были такими же, как в разработанном способе

Экстракция среднелетучих органических соединений из волос метанолом под

действием ультразвука

Органические соединения извлекали из 50 мг волос метанолом (0 5 мл) под действием ультразвука (100 Вт) в течение 2 ч при комнатной температуре

Для хромато-масс-спектрометрического анализа использовали 1 мкл полученного экстракта (1/500 часть) В качестве внутреннего стандарта использовали смесь дейтерированных ПАУ (4 нг/мкл/компонент, 1 мкл)

Хромато-масс-спектрометрические данные обрабатывались таким же образом, как и данные, полученные при помощи СФЭ из волос В анализируемой пробе экстракта было обнаружено 43 соединения на уровне содержаний 0 034 - 81 5 нг/мг волос, из них 25 идентифицировано

Сопоставление обнаруженных соединений по их масс-спектрам и времени удерживания при использовании разработанного способа извлечения примесей и способа, основанного на ЖЭ метанолом, показало, что в обоих экстрактах обнаружено одинаковых 19 идентифицированных и 9 неидентифицированных соединений Остальные обнаруженные соединения были индивидуальны для каждого способа, при этом для жидкостной экстракции метанолом таких соединений было 15, а для СФЭ - 186 Различие в числе и природе зарегистрированных примесей объясняется как различной степенью их извлечения, так и различием в величине анализируемой пробы экстракта

Разложение волос при помощи 1М NaOH с последующей жидкость-жидкостной экстракцией из полученного раствора

500 мг измельченных волос поместили в колбу объемом 20 мл, прилили 10 мл

1М NaOH, выдерживали при комнатной температуре в течение 40 ч Полученный раствор трижды экстрагировали 2 мл дихлорметана Органическую фазу декантировали, к водной фазе приливали 0 5 M раствор H2S04 до рН ~ 1 Полученный

раствор трижды экстрагировали 2 мл дихлорметана, органические фазы объединили и упарили до 1 мл 1 мкл полученного экстракта вводили в ГХ-МС систему В качестве внутреннего стандарта использовали смесь дейтерированных ПАУ (4 нг/мкл/компонент, 1 мкл)

Хромато-масс-спектрометрические данные обрабатывались таким же образом, как и данные, полученные при помощи СФЭ из волос Было обнаружено 36 соединений на уровне содержаний 0 063 - 4 92 нг/мг волос, из них идентифицировано 13

Состав экстрагированных дихлорметаном из реакционной смеси соединений отличается от состава экстракта, полученного при помощи СФЭ из волос Это происходит вследствие различных степеней извлечения одних и тех же соединений сверхкритическим флюидом из волос и дихлорметаном из водного раствора, из-за возможной частичной деструкции ряда соединений, содержащихся в волосах, в условиях щелочного разложения, и различия в величине анализируемой пробы

Сопоставление обнаруженных соединений по их масс-спектрам и времени удерживания показало, что в обоих экстрактах обнаружено одинаковых 7 идентифицированных и 4 неидентифицированных соединений Остальные обнаруженные соединения были индивидуальны для каждого способа, при этом для ЖЭ дихлорметаном таких соединений было 25, а для СФЭ - 203

Также найдено, что при разложении волос с последующей ЖЖЭ наблюдается большое количество пиков в холостом опыте, которые зачастую очень близки по времени удерживания к пикам соединений, извлеченных из волос Это затрудняет поиск и идентификацию соединений, содержащихся в волосах

Разложение волос при помощи 1М ЫаОН с последующей сверхкритической флюидной экстракцией из полученного раствора

Наряду с общепринятыми способами нами было решено изучить возможность сочетания разложения волос при помощи 1М №ОН, СФЭ из полученного после разложения раствора и последующего анализа всего концентрата методом ГХ/МС

После разложения 5 мг волос (1 мл 1М ЫаОН, комн температура, 16 ч) был получен раствор, к которому прибавили 1М Н2804 до рН ~ 7, разбавили до 7 мл бидистиллированной водой и поместили в экстракционную ячейку объемом 12 мл Извлечение органических соединений из волос проводили сверхкритическим С02 (1 мл/мин) при температуре 80°С и давлении 25 МПа в течение 15 мин при температуре рестриктора 250°С Температура термодесорбции составляла 270°С В качестве

внутреннего стандарта использовали смесь дейтерированных ПАУ (4 нг/мкл/компонент, 1 мкл)

Хромато-масс-спектрометрические данные обрабатывались таким же образом, как и данные, полученные при помощи СФЭ из волос Было обнаружено 151 соединение на уровне содержаний 0 006 - 19 98 нг/мг волос, из них 48 идентифицировано

Состав экстрагированных соединений отличается от состава экстракта, полученного при помощи СФЭ из волос Это происходит вследствие различных степеней извлечения сверхкритическим флюидом одних и тех же соединений из волос и из водного раствора и из-за возможной частичной деструкции ряда соединений, содержащихся в волосах, в условиях щелочного разложения

Сопоставление обнаруженных соединений по их масс-спектрам и времени удерживания показало, что в обоих экстрактах обнаружено одинаковых 23 идентифицированных и 24 неидентифицированных соединения Остальные обнаруженные соединения были индивидуальны для каждого способа (для СФЭ из реакционной смеси - 104, а для СФЭ из волос - 167)

Данные, полученные при ГХ-МС анализе волос с использованием различных методов извлечения, представлены в табл 2

Таблица 2

Сравнение различных методов извлечения органических соединений из волос по числу определенных соединений на различном уровне содержаний, числу идентифицированных соединений, минимальному уровню содержаний

зарегистрированных примесей и их суммарному содержанию

Метод Зарегистрировано соединений Идентифи- Минималь- Суммарное

На уровне 1-100 пг/мг На уровне 0 1-1 нг/мг На уровне 1-100 нг/мг Всего цировано соединений ный уровень содержаний зарегистрированных примесей, пг/мг содержание зарегистрированных примесей, нг/мг

СФЭ из волос 61 109 44 214 78 2 223

Экстракция из 4 30 9 43 25 34 123

волос метанолом

ЖЖЭ 3 21 12 36 13 63 37

дихлорметаном из

раствора после

разложения волос с помощью ЫаОН

СФЭ из раствора 45 64 42 151 48 6 188

после разложения

волос с помощью №ОН

Заключение

В результате проведенного исследования изучено состояние современных методов определения среднелетучих органических соединений различных классов в волосах Критически рассмотрены достоинства и недостатки существующих методов, показаны их ограничения при анализе волос при решении экологических, токсикологических и медицинских задач Предложен новый подход к решению данной проблемы, основанный на СФЭ таких соединений из волос с последующим хроматографическим или хромато-масс-спектрометрическим анализом всего экстракта Проведено сравнение состава среднелетучих примесей в волосах различных людей с использованием СФЭ-ГХ-МС В четырех образцах волос обнаружено 276 соединений, из них 89 идентифицировано

Проведено сравнение результатов разработанного способа при анализе одного образца волос с результатами, полученными при использовании трех других способов определения органических соединений в человеческих волосах, два из которых (ЖЭ-ГХ-МС, разложение-ЖЖЭ-ГХ-МС) широко известны, третий (разложение-СФЭ-ГХ-МС) предложен нами Всего при совместном использовании данных, полученных для всех четырех способов, в одном образце волос было обнаружено 336 соединений, из них 108 идентифицировано Из них разработанным способом (СФЭ-ГХ-МС) было обнаружено 214 соединений, способом ЖЭ-ГХ-МС - 43, способом разложение-ЖЖЭ-ГХ-МС - 36, способом разложение-СФЭ-ГХ-МС - 151 При сравнении волос различных людей наиболее целесообразно использовать способ СФЭ-ГХ-МС, как способ, обеспечивающий обнаружение максимального количества примесей в волосах Предложенный способ обеспечивает увеличение количеств извлеченных из волос соединений, снижение пределов обнаружения и уменьшение загрязнения окружающей среды

Предложенный способ сверхкритической флюидной экстракции из волос и способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на сочетании СФЭ из волос с последующим хроматографическим либо ГХ-МС анализом всего экстракта, открывает широкие перспективы для определения широкого спектра органических соединений в человеческих волосах на следовом и ультраследовом уровнях содержаний В общем случае, при исследовании человеческих волос необходимо совместное использование рассмотренных способов

Выводы

1 Исследованы зависимости сверхкритической флюидной экстракции из волос среднелетучих органических соединений неизвестного состава от температуры и

24

давления сверхкритического флюида, от времени экстракции, выбраны оптимальные условия СФЭ неизвестных соединений из волос

2 На основании проведенных исследований разработан способ определения среднелетучих органических соединений в волосах, основанный на сверхкритической флюидной экстракции из волос без использования органического растворителя, сорбционном концентрировании экстрагированных соединений на выходе из экстрактора и переводе термодесорбцией в инжектор хроматографа всего экстракта и его анализе с помощью ГХ/МС

3 С использованием разработанного способа исследован состав среднелетучих органических соединений в ряде образцов волос, полученных от разных людей Диапазон определяемых содержаний составил 0 002 - 99 6 нг/мг волос Показано, что состав экстрагированных соединений и их количества схожи для различных образцов волос В основном, различия между образцами волос проявляются на уровне менее 1 нг/мг волос

4 Исследован состав среднелетучих органических соединений, выделенных из одного из образцов волос общепринятым способом жидкостной экстракции метанолом с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта, и проведено сопоставление с результатом, полученным при помощи разработанного способа, основанного на СФЭ из волос При использовании разработанного способа обнаружено 214 соединений, при использовании экстракции метанолом - 43, при этом 28 соединений обнаружено обоими способами Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании разработанного способа составило 223 нг/мг волос, при использовании экстракции метанолом - 123 нг/мг волос

5 Исследован состав среднелетучих органических соединений, выделенных общепринятым способом жидкостной экстракции из реакционной смеси, полученной после разложения волос раствором №ОН, с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта, и проведено сопоставление с результатом, полученным при помощи разработанного способа В этом случае зарегистрировано 36 соединений, из них 11 входят также в 214, выделенных СФЭ из волос Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании экстракции дихлорметаном из реакционной смеси составило 37 нг/мг волос

6 Исследован состав среднелетучих органических соединений, выделенных сверхкритической флюидной экстракцией из реакционной смеси, полученной после разложения волос раствором №ОН, с последующим ГХ/МС анализом всего экстракта Обнаружено 151 соединение, при этом 47 соединений входят в число

зарегистрированных с использованием СФЭ из волос Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании СФЭ из реакционной смеси составило 188 нг/мг волос

7 Показано, что в состав исследованных экстрактов входили соединения, принадлежащие к таким классам соединений, как алифатические углеводороды, альдегиды, кетоны, спирты, карбоновые кислоты и их эфиры Наряду с ними в состав всех исследованных образцов волос входили различные фталаты, которые относятся к стойким органическим загрязнителям (СОЗ), подлежащим обязательному контролю

8 Показано, что наиболее полная информация о составе неизвестных среднелетучих примесей в волосах может быть получена при сочетании различных способов выделения, рассмотренных в работе

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах-

1 Богданов А В, Глазков И H, Ревельский И А Определение органических соединений в волосах человека//Журн аналит химии 2006 Т61 №10 С 10141031

2 Богданов А В, Глазков И H , Ревельский И А Сочетание сверхкритической флюидной экстракции и хромато-масс-спектрометрии Анализ волос Обработка хромато-масс-спектрометрических данных с использованием математического алгоритма CODA // Журн аналит химии 2007 Т62 №1 С 71-75

3 Bogdanov А V, Glazkov I N, Revelsky I A Solvent-less SFE from human hair / European conference on analytical chemistry «Euroanalysis XIII», Salamanka, Spane, 5-10 September 2004 PS2-102

4 Богданов А В, Глазков И H, Ревельский И А Идентификация фталатов в человеческих волосах методом СФЭ-ГХ-МС / Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Москва, Россия, 12-15 апреля 2005 г С 9

5 Bogdanov А V, Glazkoiv I N, Revelsky I A Human Hair Analysis Using Solvent-less SFE/GC/MS Coupling / 28th International Symposium on Capillary Chromatography and Electrophoresis, May 21-26, 2005, Las Vegas, Nevada, USA PS1-178

6 Богданов А В , Глазков И H , Ревельский И А Возможности математической обработки хромато-масс-спектрометрических данных в анализе человеческих волос методом СФЭ-ГХ/МС / Второй международный симпозиум по разделению и концентрированию в аналитической химии и радиохимии, Краснодар, Россия, 2530 сентября 2005 г С 454-455

Отпечатано на ризографе вОНТИ ГЕОХИРАН Подписано в печать 13 09 2007 г Тираж 100 экз

Введение.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Способы очистки волос.

1.2. Способы разложения волос.

1.2.1. Щелочное разложение.

1.2.2. Кислотное разложение.

1.2.3. Ферментативное разложение волос.

1.3. Способы экстракции из волос.

1.3.1. Способы экстракции из раствора после разложения волос.

1.3.1.1. Жидкость-жидкостная экстракция.

1.3.1.2. Твердофазная экстракция.

1.3.1.3. Твердофазная микроэкстракция.

1.3.2. Способы экстракции органических соединений без разложения волос.

1.3.2.1. Жидкостная экстракция.

1.3.2.2. Сверхкритическая флюидная экстракция.

1.4. Способы улавливания органических соединений из потока сверхкритического флюида.

1.5. Химическая модификация.

1.6. Сравнение различных методов извлечения органических соединений из волос

ГЛАВА 2. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, АППАРАТУРА, МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.1. Оборудование.

2.2. Исходные вещества и реагенты.

2.3. Методика эксперимента.

2.3.1. Измельчение волос.

2.3.2. Разложение волос.

2.3.3. Жидкость-жидкостная экстракция.

2.3.4. Экстракция органических соединений из волос метанолом.

2.3.5. Сверхкритическая флюидная экстракция из волос.

2.3.6. Сверхкритическая флюидная экстракция из раствора.

2.3.7. Сбор экстракта.

2.3.8. Газохроматографический анализ экстрактов.

2.3.9. Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ СТЕПЕНИ ИЗВЛЕЧЕНИЯ СРЕДНЕЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ ВОЛОС МЕТОДОМ СФЭ ОТ ПАРАМЕТРОВ ЭКСПЕРИМЕНТА.

3.1. Исследование зависимости степени извлечения от температуры флюида.

3.2. Исследование зависимости степени извлечения от давления флюида.

ГЛАВА 4. ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСТРАКТОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ВОЛОС.

ГЛАВА 5. СРАВНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ИЗВЛЕЧЕНИЯ СРЕДНЕ ЛЕТУ ЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ВОЛОС.

5.1. Экстракция органических соединений метанолом под действием ультразвука.

5.2. Разложение волос при помощи IMNaOHc последующей жидкость-жидкостной экстракцией из полученного раствора.

5.3. Разложение волос при помощи 1МNaOH с последующей сверхкритической флюидной экстракцией из полученного раствора.

В настоящее время волосы являются третьим по важности биологическим объектом для медицинских и токсикологических исследований после крови и мочи, выгодно отличаясь от них простотой отбора, долговременностью хранения аналитов в матрице (можно зафиксировать однократное принятие наркотического вещества спустя 2-6 месяцев), а также возможностью отбора пробы в любое время суток.

Обычно работы ограничиваются определением одной группы заданных соединений (например, анаболические стероиды) и продуктами их метаболизма. Гораздо реже встречаются работы, в которых определяют 2-3 группы соединений (чаще всего опиаты и кокаин с продуктами их метаболизма), и для определения в волосах соединений различных групп необходимо проведение множества дорогостоящих анализов, нацеленных на определение конкретных групп соединений.

Существует два подхода к экстракции органических соединений из волос - экстракция без разложения волос и экстракция с частичным либо полным разложением. Наиболее широко используются деструктивные способы извлечения, которые можно разделить на три типа: разложение при помощи щелочей (0.1 - 5М NaOH), кислот (0.05 - ЗМ HCI, H2S04) HCI/MeOH, ТФК/МеОН) и ферментативное разложение. После разложения проводят нейтрализацию и экстракцию определяемых соединений с помощью органических растворителей либо картриджей для твердофазной экстракции. Каждый из этих способов имеет свои ограничения. Так, щелочное разложение позволяет извлекать такие вещества, как морфин, амфетамины и каннабиноиды, но кокаин, героин, ацетилморфин и другие соединения, неустойчивые к действию щелочей, претерпевают деструкцию с образованием более простых производных. Кислотное разложение, особенно с использованием смесей ТФК/МеОН и HCI/MeOH минимизирует разложение сложных эфиров и способствует эффективной экстракции кокаина и опиатов, но при извлечении, неустойчивых к действию кислот, например, бензодиазепинов, приводит к деструкции и образованию множества побочных продуктов. Также при щелочном либо кислотном разложении происходит загрязнение пробы примесями из реагентов, используемых как для разложения волос, так и для нейтрализации полученного раствора. Ферментативное разложение позволяет извлекать вещества, неустойчивые к действию как кислот, так и оснований, но при этом требует дополнительной очистки раствора после экстракции, а также характеризуется большой стоимостью реагентов. После разложения определяемые соединения извлекают из раствора при помощи жидкостьжидкостной экстракции, твердофазной экстракции либо твердофазной микроэкстракции. Основным недостатком ЖЖЭ является необходимость использования больших объемов токсичных, а часто и горючих органических растворителей. Кроме того, их чистота редко превышает 99.7 %, и при упаривании происходит концентрирование примесей из растворителя, что приводит к искажению состава пробы. При этом для дальнейшего анализа используется 0.001-0.01 часть экстракта. Недостатком ТФЭ является использование органических растворителей, хотя и в количествах, меньших, чем в ЖЖЭ. При этом для анализа также используется малая часть экстракта. Преимущество ТФМЭ перед ЖЖЭ и ТФЭ - в отсутствии использования органических растворителей, недостаток

- в малых степенях извлечения.

Существуют также способы извлечения органических соединений из волос без их разложения, например, экстракции метанолом под действием ультразвука (обычно при определении бензодиазепинов, но возможно использование для извлечения каннабиноидов), инкубация в фосфатном буфере (КНгРО^МагНРСУ NaOH, рН 7.6) с последующей экстракцией смесью диэтилового эфира и хлороформа (при определении бензодиазепинов), экстракция в аппарате Сокслета (толуол, при определении внешнего загрязнения экотоксикантами). Недостатки способа

- в использовании органических растворителей и в низких степенях извлечения. При этом для анализа также используется малая часть экстракта.

В последние годы возник интерес к сверхкритической флюидной экстракции (СФЭ) как к альтернативе классическим методам экстракции веществ из биологических матриц. В качестве преимуществ этого метода можно отметить: s желаемая селективность экстракции может быть получена варьированием таких параметров, как давление, температура, модификатор; s хорошие диффузионные качества сверхкритических флюидов способствуют быстрому проникновению и извлечению из образца; использование низких температур позволяет извлекать без разложения термически лабильные соединения.

Также преимуществом СФЭ из волос перед другими экстракционными методами является возможность одновременной экстракции соединений, извлечение которых другими методами невозможно из-за различных условий экстракции. Так, например, при экстракции кокаина и опиатов волосы обычно подвергают щелочному либо кислотному гидролизу, а бензодиазепины в этих условиях разлагаются с образованием различных соединений (например, бензофенонов). На настоящий момент в литературе описаны методики извлечения органических соединений (опиатов, кокаина, метадона, каннабиноидов, бензодиазепинов и барбитуратов), не включающие разложение волос.

Сверкритическую флюидную экстракцию органических соединений из волос обычно проводят, ограничиваясь 1-2 классами заданных соединений, при анализе лишь малой (0.001-0.01) части экстракта. Также встречаются редкие работы по определению некоторых экотоксикантов в волосах, но вопрос определения всех неизвестных органических соединений, включая экотоксиканты, в волосах с использованием СФЭ из волос и анализа всего экстракта в литературе не рассматривался.

После экстракции производят определение соединений с помощью иммуноферментативных методов, ВЭЖХ, капиллярного электрофореза, ГХ-МС ВЭЖХ-МС. Основная сложность при этом заключается в низком содержании определяемых соединений - на уровне нг/мг, иногда - пг/мг.

ВЭЖХ и капиллярный электрофорез для определения органических соединений в волосах используются крайне редко ввиду низкой чувствительности и недостатком достоверности определения, иммуноферментативные методы обычно используются как скриннинговые из-за малой точности на данном уровне концентраций, и даже хромато-масс-спектрометрические методы зачастую ограничены применением "режима сбора отдельных ионов" в целях достижения большей чувствительности. Использование всего экстракта для анализа является одним из возможных путей решения данной проблемы.

Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют работы по изучению состава неизвестных среднелетучих примесей, присутствующих в волосах. Кроме того, нет единого мнения о степени извлечения соединений, принадлежащих к различным классам, при использовании известных методов извлечения. Поэтому актуально исследование возможности обнаружения различных классов органических соединений, присутствующих в волосах, и их идентификации.

Целью настоящей работы являлось разработка способа определения состава среднелетучих органических соединений, присутствующих в волосах человека, основанного на СФЭ без использования растворителя и ГХ/МС анализе всего экстракта, и его сопоставление с существующими способами выделения примесей из волос и их определения.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать зависимости сверхкритической флюидной экстракции из волос от давления и температуры, а также от времени экстракции;

2. Разработать способ определения среднелетучих органических соединений различных классов в человеческих волосах, основанный на СФЭ из волос и последующем ГХ-МС анализе всего экстракта;

3. В оптимальных условиях провести анализ волос различных людей с использованием перевода всего экстракта в ГХ-МС путем термодесорбции;

4. Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при использовании экстракции из волос органическими растворителями с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта;

5. Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при разложении волос с последующей экстракцией из реакционной смеси органическими растворителями с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта;

6. Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при разложении волос с последующей СФЭ из реакционной смеси и анализом всего экстракта методом ГХ/МС.

Научная новизна работы:

1. Исследована зависимость степени извлечения среднелетучих органических соединений из волос методом СФЭ без использования растворителя от времени экстракции, температуры и давления сверхкритического флюида;

2. В результате проведенных исследований разработан способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на сочетании СФЭ из волос с хромато-масс-спекгрометрическим анализом всего экстракта без использования органических растворителей;

3. Исследован состав среднелетучих органических соединений в волосах различных людей при использовании разработанного способа определения. Диапазон содержаний определяемых соединений составил 0.002 - 99.6 нг/мг волос. Показано, что состав экстрагированных соединений и их количества схожи для различных образцов волос. В основном, различия между образцами волос проявляются на уровне менее 1 нг/мг волос;

4. Исследован состав среднелетучих соединений, выделенных из одного из образцов волос жидкостной экстракцией без разложения и проведено сопоставление с данными, полученными разработанным способом. При использовании разработанного способа обнаружено 214 соединений, при использовании экстракции метанолом - 43, при этом 28 соединений обнаружено обоими способами. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании разработанного способа составило 223 нг/мг волос, при использовании экстракции метанолом - 123 нг/мг волос;

5. Исследован состав среднелетучих соединений, выделенных жидкостной экстракцией дихлорметаном из реакционной смеси после разложения волос и проведено сопоставление с данными, полученными разработанным способом. При использовании ЖЖЭ зарегистрировано 36 соединений, из них 11 входят в число соединений, выделенных СФЭ из волос. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании экстракции дихлорметаном из реакционной смеси составило 37 нг/мг волос;

6. С использованием ГХ/МС и анализа всего экстракта исследован состав органических соединений, выделенных сверхкритической флюидной экстракцией без использования органического растворителя из реакционной смеси, полученной щелочным разложением волос, и проведено сопоставление с составом примесей, полученных при использовании разработанного способа, основанного на СФЭ из волос и ГХ/МС анализе всего концентрата. Обнаружено 151 соединение, из них 47 входят в число соединений, выделенных СФЭ из волос. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании СФЭ из реакционной смеси составило 188 нг/мг волос;

7. Показано, что в состав исследованных экстрактов входили соединения, принадлежащие к таким классам соединений, как алифатические углеводороды, альдегиды, кетоны, спирты, карбоновые кислоты и их эфиры. Наряду с ними в состав всех исследованных образцов волос входили различные фталаты, которые относятся к стойким органическим загрязнителям (СОЗ), подлежащим обязательному контролю.

Практическая значимость работы: Разработан способ определения неизвестных среднелетучих органических соединений в человеческих волосах на уровне 0.001 - 100 нг/мг волос, основанный на СФЭ из волос, улавливании соединений из потока СФ в сорбционный картридж, термодесорбции в газовый хроматограф и ГХ-МС анализе всего экстракта. Результаты работы использованы на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. С использованием разработанного способа проведено определение состава среднелетучих органических соединений в волосах различных людей. Показано, что наиболее полная информация о составе неизвестных среднелетучих примесей в волосах может быть получена при сочетании различных способов выделения, рассмотренных в работе. Результаты работы могут быть использованы для оценки загрязненности внутренней среды организма человека стойкими органическими загрязнителями, а также для в медицине для ранней диагностики различных заболеваний путем определения в волосах соединений-маркеров заболеваний.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты исследования зависимости степени извлечения органических соединений методом СФЭ из волос без использования органических растворителей от параметров эксперимента.

2. Способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на СФЭ из волос и хромато-масс-спектрометрическом анализе всего экстракта без использования органических растворителей.

3. Результаты определения среднелетучих органических соединений в волосах различных людей, полученные с использованием разработанного способа.

4. Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и общепринятого способа, основанного на экстракции органическим растворителем из волос с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта.

5. Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и общепринятого способа, основанного на разложении волос раствором NaOH, жидкостной экстракции из реакционной смеси органическим растворителем и ГХ/МС анализе малой части экстракта.

6. Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и предложенного нами способа, основанного на разложении волос раствором NaOH, прямой СФЭ из реакционной смеси без использования органического растворителя и ГХ/МС анализе всего экстракта.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на Тринадцатой европейской конференции по аналитической химии Euroanalysis XIII (Саламанка, Испания, 2004 г), на Втором международном симпозиуме по разделению и концентрированию в аналитической химии и радиохимии (Краснодар, Россия, 2005 г), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, Россия, 2005 г.), на Двадцать восьмом международном симпозиуме по газовой хроматографии и капиллярному электрофорезу (Лас Вегас, США, 2005 г.).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 6 работ в виде статей и тезисов докладов.

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель работы, задачи, научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту. Первая глава представляет собой литературный обзор методов анализа волос на

Выводы

1. Исследованы зависимости сверхкритической флюидной экстракции из волос среднелетучих органических соединений неизвестного состава от температуры и давления сверхкритического флюида, от времени экстракции; выбраны оптимальные условия СФЭ неизвестных соединений из волос.

2. На основании проведенных исследований разработан способ определения среднелетучих органических соединений в волосах, основанный на сверхкритической флюидной экстракции из волос без использования органического растворителя, сорбционном концентрировании экстрагированных соединений на выходе из экстрактора и переводе термодесорбцией в инжектор хроматографа всего экстракта и его анализе с помощью ГХ/МС.

3. С использованием разработанного способа исследован состав среднелетучих органических соединений в ряде образцов волос, полученных от разных людей. Диапазон определяемых содержаний составил 0.002 - 99.6 нг/мг волос. Показано, что состав экстрагированных соединений и их количества схожи для различных образцов волос. В основном, различия между образцами волос проявляются на уровне менее 1 нг/мг волос.

4. Исследован состав среднелетучих органических соединений, выделенных из одного из образцов волос общепринятым способом жидкостной экстракции метанолом с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта, и проведено сопоставление с результатом, полученным при помощи разработанного способа, основанного на СФЭ из волос. При использовании разработанного способа обнаружено 214 соединений, при использовании экстракции метанолом - 43, при этом 28 соединений обнаружено обоими способами. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании разработанного способа составило 223 нг/мг волос, при использовании экстракции метанолом -123 нг/мг волос.

5. Исследован состав среднелетучих органических соединений, выделенных общепринятым способом жидкостной экстракции из реакционной смеси, полученной после разложения волос раствором NaOH, с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта, и проведено сопоставление с результатом, полученным при помощи разработанного способа. В этом случае зарегистрировано 36 соединений, из них 11 входят также в 214, выделенных СФЭ из волос. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании экстракции дихлорметаном из реакционной смеси составило 37 нг/мг волос.

6. Исследован состав среднелетучих органических соединений, выделенных сверхкритической флюидной экстракцией из реакционной смеси, полученной после разложения волос раствором NaOH, с последующим ГХ/МС анализом всего экстракта. Обнаружено 151 соединение, при этом 47 соединений входят в число зарегистрированных с использованием СФЭ из волос. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании СФЭ из реакционной смеси составило 188 нг/мг волос.

7. Показано, что в состав исследованных экстрактов входили соединения, принадлежащие к таким классам соединений, как алифатические углеводороды, альдегиды, кетоны, спирты, карбоновые кислоты и их эфиры. Наряду с ними в состав всех исследованных образцов волос входили различные фталаты, которые относятся к стойким органическим загрязнителям (СОЗ), подлежащим обязательному контролю.

8. Показано, что наиболее полная информация о составе неизвестных среднелетучих примесей в волосах может быть получена при сочетании различных способов выделения, рассмотренных в работе.

Заключение

В результате проведенного исследования изучено состояние современных методов определения среднелетучих органических соединений различных классов в волосах. Критически рассмотрены достоинства и недостатки существующих методов, показаны их ограничения при анализе волос при решении экологических, токсикологических и медицинских задач. Предложен новый подход к решению данной проблемы, основанный на СФЭ таких соединений из волос с последующим хроматографическим или хромато-масс-спекгрометрическим анализом всего экстракта. Проведено сравнение состава среднелетучих примесей в волосах различных людей с использованием СФЭ-ГХ-МС. В четырех образцах волос обнаружено 276 соединений, из них 89 идентифицировано.

Проведено сравнение результатов разработанного способа при анализе одного образца волос с результатами, полученными при использовании трех других способов определения органических соединений в человеческих волосах, два из которых (ЖЭ-ГХ-МС, разложение-ЖЖЭ-ГХ-МС) широко известны, третий (разложение-СФЭ-ГХ-МС) предложен нами. Всего при совместном использовании данных, полученных для всех четырех способов, в одном образце волос было обнаружено 336 соединений, из них 108 идентифицировано. Из них разработанным способом (СФЭ-ГХ-МС) было обнаружено 214 соединений, способом ЖЭ-ГХ-МС - 43, способом разложение-ЖЖЭ-ГХ-МС - 36, способом разложение-СФЭ-ГХ-МС - 151. При сравнении волос различных людей наиболее целесообразно использовать способ СФЭ-ГХ-МС, как способ, обеспечивающий обнаружение максимального количества примесей в волосах. Предложенный способ обеспечивает увеличение количеств извлеченных из волос соединений, снижение пределов обнаружения и уменьшение загрязнения окружающей среды.

Предложенный способ сверхкритической флюидной экстракции из волос и способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на сочетании СФЭ из волос с последующим хроматографическим либо ГХ-МС анализом всего экстракта, открывает широкие перспективы для определения широкого спектра органических соединений в человеческих волосах на следовом и ультраследовом уровнях содержаний. В общем случае, при исследовании человеческих волос необходимо совместное использование рассмотренных способов.

1. Nakahara Y. Hair analysis for abused and therapeutic drugs // J. of Chromatogr. B. 1999. V.733. P.161-180

2. Nakahara Y., Takahashi K., Kikura R. // Biol. Chem. Bull. 1995. V.18. P.1223-1227

3. Sachs H., Kintz P. Testing for drugs in hair. Critical review of chromatographic procedures since 1992 //J. of Chromatogr. B. 1998. V.713. P.147-161

4. Thieme D., Sachs H. Improved screening capabilities in forensic toxicology by application of liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. 2003. V.492. P. 171-186

5. Thieme D., Anielski P., Grosse J., Sachs H., Mueller R. K. Identification of anabolic steroids in serum, urine, sweat and hair. Comparison of metabolic patterns //Anal. Chim. Acta. 2003. V.483. P. 299-306

6. Welch M. J., Sinegoski L. Т., Allgood С. C., Habram M. Hair analysis for drugs of abuse: evaluation of analytical methods, environmental issues, and development of reference materials II J. Anal. Toxicol. 1993. V.17(7). P. 389398

7. Nishida M., Namera A., Yashiki M., Kojima T. Routine analysis of amphetamine and methamphetamine in biological materials by gas chromatography-mass spectrometry and on-column derivatization // J. of Chromatogr. B. 2003. V.789. P.65-71

8. Jouvel C., Maciejewski P., Garcia P., Bonnaire Y., Horning S., Popot M.-A. Detection of diazepam in horse hair samples by mass spectrometric methods //Analyst. 2000. V.125. P.1765-1769

9. Toyo'oka Т., Yano M., Kato M., Nakahara Y. Simultaneous determination of morphine and its glucironides in rat hair and rat plasma by reversed-phaseliquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry // Analyst. 2001. V.126. P.1339-1345

10. Al-Dirbashi 0., Kuroda N., Inuduka S., Menchini F., Nakashima K. HPLC with fluorescence detection of methamphetamine and amphetamine in segmentally analyzed human hair // Analyst. 1999. V.124. P.493-497

11. Nakahara Y., Kikura R. Hair analysis for drugs of abuse. XVIII. 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA) disposition in hair roots and use in identification of acute MDMA poisoning // Biol. Pharm. Bull. 1995. V.18. P. 1223-1227

12. Nakahara Y., Kikura R. Hair analysis for drugs of abuse. XIX. Determination of ephedrine and its gomologues in rat hair and human hair drugs // J. of Chromatogr. B. 1997. V.700(1-2). P.83-91

13. Kikura R., Nakahara Y. Hair analysis for drugs of abuse. XVI. Disposition of fenethylline and its metabolite into hair and discrimination between fenethylline use and amphetamine use by hair analysis // J. Anal. Toxicol. 1997. V.21(4). P.291-296

14. Nakahara Y., Kikura R., Takanashi K. Foltz P. L., Mieczkowski T. Detection of lysergic acid diethylamide (LSD) and its metabolites in rat and human hair// J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(5). P.323-329

15. Polettini A., Montagna M., Segura J., de-la-Torre X. Determination of beta-agonists in hair by gas chromatography/mass spectrometry analysis // J. Mass. Spectrom. 1996. V.31(1). P.47-54

16. Sakamoto Т., Tanaka A., Nakahara Y. Hair analysis for drugs of abuse. XII. Determination of PCP and its major metabolites, PCHP and PPC, in rat hair after administration of PCP // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(2). P. 124-130

17. Scherer C., Wachter U., Wudy S. A. Determination of testosterone in human hair by gas chromatography-selected ion monitoring mass spectrometry // Analyst. 1998. V.123. P.2661-2663

18. Choi M. H., Kim K. R., Chung В. C. Determination of estrone and 17/?-estradiol in human hair by gas chromatography-mass spectrometry // Analyst. 2000. V.125. P.711-714

19. Choi M. H., Kim K. R., Chung В. C. Determination of hair polyamines as N-ethoxycarbonyl-N-pentafluoropropionyl derivatives by gas chromatography-mass spectrometry//J. Chromatogr. A. 2000. V.897 P.295-305

20. Choi M. H., Chung В. C. GC-MS determination of steroids related to androgen biosynthesis in human hair with pentafluorophenyldimethylsilyl-trimethylsilyl derivatisation //Analyst. 1999. V.124. P. 1297-1300

21. Wainhaus S. В., Tzanani N., Dagan S., Miller M. L., Amirav A. Fast analysis of drugs in a single hair // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 1998. V.9(12). P.1311-1320

22. Dauberschmidt C., Wennig R. Organochlorine pollutants in human hair. Letter. II J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(7). P.610-611

23. Negrusz A., Moore С. M., Perry J. L. Detection of doxepin and its major metabolite desmethyldoxepin in hair following drug therapy // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(6). P.531-536

24. Iwersen S., Schmoldt A., Schulz F., Pueschel K. Evidence of destational heroin exposure by comparative analysis of foetal and maternal body fluids, tissues, and hair in a heroin-related death hair // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(4). P.296-298

25. Kronstrand R., Grundin R., Jonsson J. Incidence of opiates, amphetamines, and cocaine in hair and blood in fatal cases of heroin overdose // Forensic. Sci. Int. 1998. V.92(1). P.29-38

26. Rossi S. S., Offdani CM Charlotti M. Application of hair analysis to document coercive heroin administration to a child. // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(1). P.75-77

27. Polettini A., Stramesi C., Vignali C., Montagna M. Determination of opiates in hair. Effects of extraction methods on recovery and on stability of analytes // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P.259-269

28. Yegles M., Mersch F., Wennig R. Detection of benzodiazepines and other psychotropic drugs in human hair by GC-MS // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P.211-218

29. Cassani M., Da-Re N., Giuliani L., Sesana F. Experience with hair testing in the clinical biochemistry laboratory of Ca'Granda Niguarda // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P. 17-24

30. Tanada N., Kageura M., Нага K., Hieda Y., Takamoto M., Kashimura S. Demonstration of oxidation dyes on human hair // Forensic. Sci. Int. 1994. V.64(1). P. 1-8

31. Schramm K. W. Hair: A Matrix for Non-Invasive Biomonitoring of Organic Chemicals in Mammals // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1997. V.59. P.396-402

32. Villan M., Cirimele V., Tracqui A., Ricaut F. X., Ludes В., Kintz P. Testing for kavain in human hair using gas chromatography-tandem mass spectrometry // J. of Chromatogr. B. 2003. V.798. P.351-354

33. Cirimele V., Kintz P., Ludes B. Screening for forensically relevant benzodiazepines in human hair by gas chromatography-negative ion chemical ionization-mass spectrometry//J. of Chromatogr. B. 1997. V.700. P.119-129

34. Mahoney G. N. Al-Delaimy W. Measurement of nicotine in hair by reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection //J. Chromatogr. B. 2001. V.753. P. 179-187

35. Kintz P., Cirimele V., Ludes B. Physiological concentrations of dehydroepiandrosterone (DHEA) in human hair // J. Anal. Toxicol. 1999. V.23(6). P.424-428

36. Kintz P., Cirimele V., Jeanneau Т., Ludes B. Identification of testosterone and testosterone esters in human hair // J. Anal. Toxicol. 1999. V.23(5). P.352-356

37. Cirimele V., Kintz P., Jamey C., Ludes B. Are cannabinoids detected in hair after washing with Cannabio shampoo? // J. Anal. Toxicol. 1999. V.23(5). P.349-351

38. Pichini S., Pacifici R., Altieri I., Pellegrini M., Zuccaro P. Determination of opiates and cocaine in hair as trimethylsilyl derivatives using gas chromatography-tandem mass spectrometry// J. Anal. Toxicol. 1999. V.23(5). P.343-348

39. Kintz P., Jamey C., Cirimele V., Brenneisen R., Ludes B. Evaluation of acetylcodeine as a specific marker of illicit heroin in human hair // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(6). P.425-429

40. Kintz P,. Bundeli P., Brenneisen R., Ludes B. Dose-concentration relationships in hair from subjects in a controlled heroin-maintenance programme // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(3). P.231-236

41. Kintz P., Cirimele V. Inter-laboratory comparison of quantitative determination of amphetamine and related compounds in hair samples hair // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P.151-156

42. Cirimele V., Kintz P., Staub C., Mangin P. Testing human hair for flunitrazepam and 7-aminoflunitrazepam by GC negative-ion CIMS // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P.189-200

43. Jurado C., Menendez M., Repetto M., Kintz P., Cirimele V., Mangin P. Hair testing for cannabis in Spain and France: is there a difference in consumption?//J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(2). P.111-115

44. Cirimele V., Sachs H., Kintz P., Mangin P. Testing human hair for cannabis. III. Rapid screening procedure for the simultaneous identification of Delta9-tetrahydrocannabinol, cannabinol, and cannabidiol // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(1). P.13-16

45. Kintz P., Cirimele V., Mangin P. Testing human hair for cannabis II. Identification of THC-COOH by GC-MS-NCI as a unique proof // J. Forensic. Sci. 1995. V.40(4). P.619-622

46. Kintz P., Mangin P. Simultaneous determination of opiates, cocaine and major metabolites of cocaine in human hair by gas chromatography-mass spectrometry//Forensic. Sci. Int. 1995. V.73(2). P.93-100

47. Cirimele V., Kintz P., Mangin P. Testing human hair for cannabis // Forensic. Sci. Int. 1995. V.70(1-3). P. 175-182

48. Jurado C., Gimenez M. P., Menendez M., Repetto M. Simultaneous quantification of opiates, cocaine and cannabinoids in hair II Forensic. Sci. Int. 1995. V.70(1-3). P. 165-174

49. Goulle J. P., Noyon J., Layet A., Rapoport N. F., Vaschalde Y., Pignier Y., Bouige D., Jouen F. Phenobarbital in hair and drug monitoring // Forensic. Sci. Int. 1995. V.70(1-3). P.191-202

50. Mangin P., Kintz P. Variability of opiates concentrations in human hair according to their anatomical origin: head, axillary and pubic regions // Forensic. Sci. Int. 1993. V.63(1-3). P.77-83

51. Staub С. Hair analysis: its importance for the diagnosis of poisoning associated with opiate addiction // Forensic. Sci. Int. 1993. V.63(1-3). P.69-75

52. Sabzevari O., Abdi K., Amini M., Shafie A. Application of a simple and sensitive GC-MS method for determination of morphine in the hair of opium abusers//Anal. Bioanal. Chem. 2004. V.379. P.120-124

53. Shen M., Xiang P., Shen В. H. Detection of meperidine and its metabolites in the hair of meperidine addicts // Forensic. Sci. Int. 1999. V. 103(3). P. 159171

54. Roehrich J., Kauert G. Determination of amphetamine and methylenedioxyamphetamine derivatives in hair // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P. 179-188

55. Uhl M. Determination of drugs in hair using GC-MS-MS // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P.281-294

56. Gaillard Y., Pepin G. Simultaneous solid-phase extraction on C18 cartridges of opiates and cocainics for an improved quantitation in human hair by GC-MS: one year of forensic applications // Forensic. Sci. Int. 1997. N/.86(1-2). P.49-59

57. Fente C. A., N/azquez В. I., Franco C., Cepeda A., Gigosos P. G. Determination of clenbuterol residues in bovine hair by using diphasic dialysisand gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. B. 1999. V.726. P. 133-139

58. Haasnoot W., Stouten P., Schilt R., Hooijernk D. A fast immunoassay for screening of ^-agonists in hair//Analyst. 1998. V.123. P.2707-2710

59. Machnik M., Geyer H., Horning S., Breidbach A., Delahaut P., Shanzer W. Long-term detection of clenbuterol in human scalp hair by gas chromatography-high-resolution mass spectrometry//J. Chromatogr. B. 1999. V.723. P.147-155

60. Kintz P., Cirimele V., Sachs H., Jeanneau Т., Ludes B. Testing for anabolic steroids in hair from two bodybuilders // Forensic. Sci. Int. 1999. V. 101(3). P.209-216

61. Strano-Rossi S., Chiarotti M. Solid-phase microextraction for cannabinoid analysis in hair and its possible application to other drugs // J. Anal. Toxicol. 1999. V.23(1). P.7-10

62. Tanada N., Kashimura S., Kageura M., Нага K. Practical GC-MS analysis of oxidation dye components in hair fibre as a forensic investigative procedure // J. Forensic. Sci. 1999. V.44(2). P.292-296

63. Scherer C., Wachter U., Wudy S. A. Determination of testosterone in human hair by gas chromatography selected-ion monitoring mass spectrometry // Analyst. 1998. V.123(12). P.2661-2663

64. Rothe M., Pragst F., Spiegel K., Harrach Т., Fischer K., Kunkel J. Hair concentrations and self-reported abuse history of 20 amphetamine and ecstasy users//Forensic. Sci. Int. 1997. V.89(1-2). P.111-128

65. Hoeld К. M., Crouch D. J., Wilkins D. G., Rollins D. E., Maes R. A. Detection of alprazolam in hair by negative-ion chemical-ionization mass spectrometry // Forensic. Sci. Int. 1997. V.84(1-3). P.201-209

66. Hoeld К. M., Wilkins D. G., Crouch D. J., Rollins D. E., Maes R. A. Detection of stanozolol in hair by negative-ion chemical-ionization mass spectrometry // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(6). P.345-349

67. Wilkins D. G., Nagasawa P. R., Gygi S. P., Foltz R. L., Rollins D. E. Quantitative analysis of methadone and two major metabolites in hair bychemical-ionization ion-trap mass spectrometry // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(6). P.355-361

68. Wilkins D., Haughey H., Cone E. J., Huestis M. A., Foltz R., Rollins D. E. Quantitative analysis of THC, 11-OH-THC, and THCCOOH in human hair by negative ion chemical ionization mass spectrometry // J. Anal. Toxicol. 1995. V.19(6). P.483-491

69. Nielen M. W. F., Hooijernik H.p Essers M. L., Lasaroms J. J. P., van Bennekom E. 0., Brouwer L. Value of alternative sample matrices in residue analysis for stanozol // Anal. Chim. Acta. 2003. V.483. P. 11 -17

70. Covaci A., Tutudaki M., Tsatsakis A. M., Scepens P. Hair analysis: another approach for the assessment of human exposure to selected persistent organochlorine pollutants // Chemosphere. 2002. V.46. P.413-418

71. Balabanova S., Brunner H., Nowak R. Radioimmunological determination of cocaine in human hair//Z.Rechtsmed. 1987. V.98. P.229-234

72. Kintz P. Inter-laboratory comparison of quantitative determinations of drugs in hair samples//Forensic. Sci. Int. 1995. V.70(1-3). P. 105-109

73. Wang W. L., Cone E. J. Testing human hair for drugs of abuse. IV. Environmental cocaine contamination and washing effects // Forensic. Sci. Int. 1995. V.70(1-3). P.39-51

74. Kikura R., Nakahara Y. Hair analysis for drugs of abuse. IX. Comparison of deprenyl use and methylamphetamine use by hair analysis // Biol. Pharm. Bull. 1995. V.18(2). P.267-272

75. Hold К. M., Hubbard D. L., Wilkins D. G., Rollins D. E. Quantitation of cocaine in human hair: the effect of centrifugation of hair digests // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(6). P.414-417

76. Chiarotti M., Strano-Rossi S., Offidani C., Fiori A. Evaluation of cocaine use during pregnancy through toxicological analysis of hair // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(7). P.555-558

77. Moeller M. R., Mueller C. The detection of 6-monoacetylmorphine in urine, serum and hair by GC-MS and RIA // Forensic. Sci. Int. 1995. V.70(1-3). P. 125-133

78. Moeller M. R., Fey P., Wennig R. Simultaneous determination of drugs of abuse (opiates, cocaine and amphetamine) in human hair by GC-MS and its application to a methadone treatment programme // Forensic. Sci. Int. 1993. V.63(1-3). P. 185-206

79. Liu J., Нага K., Kashimura S., Kashiwagi M., Kageura M. New method of derivatization and headspace solid-phase microextraction for gas chromatographic-mass spectrometric analysis of amphetamines in hair // J. Chromatogr. B. 2001. V.758. P.1-7

80. Goldberger B. A., Darraj A. G., Caplan Y. H., Cone E. J. Detection of methadone, methadone metabolites, and other illicit drugs of abuse in hair of methadone-treated subjects // J. Anal. Toxicol. 1998. V.22(6). P.526-530

81. Crimele V., Kintz P., Mangin P. Determination of chronic flunitrazepam abuse by hair analysis using GC-MS-NCI // J. Anal. Toxicol. 1996. V.20(7). P.596-598

82. Kintz P., Cirimele V., Vayssette F., Mangin P. Hair analysis for nordiazepam and oxazepam by gas chromatography-negative-ion chemical ionization mass spectrometry//J. Chromatogr. B. 1996. V.677(2). P.241-244

83. Cone E. J., Darwin W. D., Wang W. L. The occurrence of cocaine, heroin and metabolites in hair of drug abusers // Forensic. Sci. Int. 1993. V.63(1-3). P.55-68

84. Phelis C. L., Smart N. G., Wai С. M. Past, present, and possible future applications of supercritical fluid extraction technology // J. of Chem. Education 1996. V.73. №12. P. 1163-1167

85. Satyajit Sengupta, Sumnesh Gupta, Kerry M. Dooley, F. Carl Knopf // J. of Supercritical Fluids 1994. V.7. P.201-209

86. Radcliffe CM Maguire K., Lockwood B. Applications of supercritical fluid extraction and chromatography in forensic science // J. of Biochem. and Biophys. Methods. 2000. V.43. P.261-272

87. Edder P., Staub C., Veuthey J. L., Pierroz I., Haerdi W. Subcritical-fluid extraction of opiates in hair of drug addicts // J. Chromatogr. B. 1994. V.658(1). P.75-86

88. Crimele V., Kintz P., Majdalani R., Mangin P. Supercritical fluid extraction of drugs in drug addict hair//J. of Chromatogr. B. 1995. V.673. P. 173-181

89. Hawthorne S.B., Miller D. J., Nivens D. E., White D. C. Supercritical-fluid extraction of polar analytes using in situ chemical derivatization // Anal. Chem. 1992. N/.64. P.405-412

90. Marguerite Y. Croft, E. John Murby, Robert J. Wells // Anal. Chem. 1994. V.66. P.4459-4465

91. Mulkahey L. J., Taylor L.T. Supercritical-fluid extraction of active components in a drug formulation //Anal. Chem. 1992. V.64. P.981-984

92. Barnabas I.J., Dean J.R. Supercritical fluid extraction of analytes from environmental samples: review // Analyst. 1994. N/.119. P.2381-2394

93. Bowadt S., Hawthorne B. Supercritical fluid extraction in environmental analysis II J. of Chromatogr. A. 1995. N/.703. P.549-571

94. Eckard P.R., Taylor T. // J. of High Resol. Chromatogr. 1996. V.16. P.117-120

95. HO.Vejrosta J., Ansorgova A., Mikesova M., Bartle K.D. Sensitivity enhancement in dynamic "off-line" supercritical-fluid extraction // J. of Chromatogr. A. 1994. V.659. P.209-212

96. Vejrosta J., Ansorgova A., Planeta J., BreenD.G., Bartle K.D., Clifford A.A. Solute trapping in off-line supercritical fluid extraction using controlled modifier condensation //J. of Chromatogr. A. 1994. V.683. P.407-410

97. Palma M., Taylor L.T. Statistical design for optimization of extraction of polyphenols from an inert matrix using carbon dioxide-based fluids // Anal. Chim. Acta. 1999. V.391. P. 321-329

98. Chaudot X., Tambute A., Caude M. Simultaneous extraction and derivatization of 2-chlorovinilarsonous acid from soils using supercritical and pressurized fluids // J. of Chromatogr. A. 2000. V.888. P.327-333

99. Ramsey E. D., Minty В., Lewis R. Hydrocarbons in water analysis using online aqueous supercritical-fluid extraction-fourier transform-infrared spectroscopy//Anal. Commun. 1996. V.33. P.203-204

100. Glazkov I.N., Revelsky I.A., Efimov I.P., Zolotov Y.A. Direct solventless supercritical fluid extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons from aqueous solutions // Chromatographia. 2000. V.52. P.495-498

101. Glazkov I.N., Revelsky I.A., Efimov I.P., Zolotov Y.A. Supercritical fluid extraction of water samples containing ultratrace amounts of organic micropollutants // J. Microcol. Sep. 1999. V.11. P.729-736

102. Глазков И.Н., Ревельский И.А., Кузнецов М.П., Мартынов А.А., Ефимов И.П. Оптимизация условий прямой сверхкритической флюидной экстракции эфиров фталевой кислоты из водных растворов // Заводская Лаборатория. 2003. Т.69. №6 С. 13-16

103. Field J. A. Coupling chemical derivatization reactions with supercritical fluid extraction //J. of Chromatogr. A. 1997. V.785. P.239-249