Определение структуры и динамических свойств комплексов дигидрофолатредуктазы человека и L.Casel с антибактериальным препаратом триметопримом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577 322 5

КОВАЛЕВСКАЯ Надежда Владимировна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСОВ ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА ИI САБЕ1 С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТОМ ТРИМЕТОПРИМОМ

02 00 15 - катализ 03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003176913

Работа выполнена на кафедре химической энзимологш Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова и в Центре по химии лекарственных средств (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ)

Научный руководитель:

доктор химических наук, Полынаков Владимир Иванович Центр по химии лекарственных средств (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ)

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Преображенская Мария Николаевна Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе

доктор химических наук, Анаников Валентин Павлович Институт органической химии им Н Д Зелинского РАН

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии РАН им М М Шемякина и Ю А Овчинникова

Защита диссертации состоится октября 2007г в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, Кафедра химической энзимоло-гии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан «28« сентября 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

/

иж ifi-y pj к Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы интенсивно развиваются методы поиска новых лекарственных препаратов, основанные на знании свойств и структуры биологической мишени их действия Для рационального дизайна химического соединения, которое могло бы прочно связаться с биомишенью, необходима как информация о трехмерной структуре мишени, так и понимание факторов, которые обеспечивают высокую специфичность связывания с ней низкомолекулярного лиганда Такие знания могут быть получены при исследовании механизма действия лучших лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике Одним из таких лекарственных средств является антибактериальный препарат триметоприм (ТМП) В сочетании с сульфаниламидными препаратами он широко используется для лечения инфекций дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта Мишенью действия ТМП является фермент дигидрофолат-редуктаза (ДГФР, КФ 15 13)

ДГФР - НАДФН-зависимый фермент, который катализирует реакции восстановления фолиевой и дигидрофолиевой кислот до тетрагидрофоиевой кислоты (ТГФ) Продукт восстановления - ТГФ - выступает переносчиком одно-углеродных фрагментов в реакциях биосинтеза азотистых оснований и некоторых аминокислот Нормальная жизнедеятельность клетки невозможна без поддержания его концентрации на достаточно высоком уровне Блокирование работы ДГФР приводит к падению концентрации ТГФ, что вызывает остановку биосинтеза нуклеиновых кислот и белка, блокирует деление клеток и вызывает их последующую гибель

Вследствие описанной важной биохимической роли, фермент представляет собой отличную мишень для действия антифолатных препаратов, которые должны ингибировать ДГФР паразитических организмов или блокировать фермент злокачественных клеток Наиболее известными антифолатами являются противоопухолевые препараты метотрексат и триметрексат, противомалярийный препарат пириметамин и упомянутый выше антибактериальный препарат триметоприм

Антибактериальное действие триметоприма обусловлено высокой селективностью связывания препарата с ДГФР бактерий по сравнению с ферментом человека В основе такой селективности лежит положительный кооперативный эффект связывания между препаратом и кофактором НАДФН при образовании их тройного комплекса с ДГФР бактерий При связывании этих лигандов с ДГФР человека наблюдается лишь весьма незначительный кооперативный эффект

Комплексы ТМП с ферментами различных организмов интенсивно изучались ранее с помощью рентгеновской кристаллографии, но до последнего времени не было предложено ни одной гипотезы, которая могла бы удовлетворительно описать молекулярную природу положительного кооперативного эф-

фекта, возникающего при связывании триметоприма и НАДФН с ДГФР бактерий Поэтому исследование, нацеленное на установление факторов, контролирующих кооперативный эффект связывания указанных лигандов и определяющих высокую селективность действия широко используемого в медицинской практике лекарственного соединения, представляется весьма актуальным

Цель и задачи исследования

Целью работы является установление природы положительного кооперативного эффекта между антибактериальным препаратом триметопримом и кофактором НАДФН при их связывании с ДГФР бактерий, что обуславливает высокую селективность ингибирующего действия препарата и, как следствие, увеличивает терапевтическую широту триметоприма

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи

1) Определение структуры тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН, в котором кооперативный эффект связывания лигандов практически полностью отсутствует,

2) Сравнение полученной структуры с рассчитанной ранее структурой аналогичного тройного комплекса ТМП и НАДФН с бактериальным ферментом (ДГФР Ь сси-ег), в котором реализуется положительный кооперативный эффект связывания лигандов,

3) Определение структуры двух бинарных комплексов ДГФР I савег -ТМП и ДГФР Ь сауег-НАДФН для сравнения их со структурой тройного комплекса ДГФР Ь са.на -ТМП-НАДФН,

4) Определение динамических свойств белковой цепи в апо-форме ДГФР I сахег, бинарных комплексах ДГФР I са$е1 с ТМП и НАДФН и тройных комплексах ДГФР человека и Ь са.$е1 с ТМП и НАДФН,

5) Детальный анализ всех полученных экспериментальных данных с целью выявления факторов, ответственных за возникновение кооперативного эффекта при связывании антибактериального препарата триметоприма и кофактора НАДФН с ДГФР бактерий

В качестве основного метода проведения указанных исследований была использована спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), поскольку этот метод позволяет получить как структурную, так и динамическую информацию о белке и его комплексах в растворе

Научная новизна

В работе впервые исследованы детали молекулярного механизма взаимодействия антибактериального препарата триметоприма с его биологической мишенью - ДГФР человека и бактерий (I сжег) Получены структурные данные о серии комплексов, выбранных системно с целью определения природы кооперативного взаимодействия лигандов - ТМП и НАДФН

Впервые получена информация о структуре ДГФР человека в растворе Впервые получена структурная информация для комплекса ДГФР человека с триметопримом Впервые рассчитаны и депонированы в банк белковых структур (PDB) три новые структуры (1YHO, 2НМ9 и 2HQP)

Получена информация о корреляции динамических свойств белковой цепи в широком диапазоне частот с прочностью связывания лигандов Впервые установлено, в частности, то, что прочность связывания лигандов не обнаруживает заметной корреляции с амплитудами быстрых (в шкале времени от пс до не) движений белковой цепи в соответствующих комплексах В то же время для более медленных конформационных перегруппировок такая корреляция существует, что отмечалось и ранее

Установлено, что природа кооперативного взаимодействия ТМП и НАДФН имеет комплексный характер Оно складывается аддитивно из индуцированных изменений конформации белка, резонансного упрочнения сети водородных связей в белке и прямого лиганд-лигандного взаимодействия

Практическая значимость работы

В ходе работы разработан системный подход к изучению механизма действия лекарственных средств С его помощью показано, что процесс молекулярного узнавания контролируется большим числом структурных и динамических факторов, в конечном итоге определяющих свойства того или иного лекарственного препарата Такой сложный многомерный характер взаимодействия следует учитывать при поиске новых эффективных лекарственных средств, предназначенных для селективного действия на биомишени Представляется недостаточным искать лишь простую структурную комплементарность лиганда к своей биомишени

Полученные данные потенциально могут быть применены для поиска новых лекарственных препаратов - как новых ингибиторов ДГФР, так и препаратов, относящихся к другим классам, но взаимодействующих со своими биомишенями аналогичным образом. Кроме того, установленные факторы кооперативного взаимодействия лигандов могут оказаться полезными для понимания природы взаимодействий белков с эндогенными лигандами различной природы

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих российских и международных конференциях, посвященных спектроскопии ЯМР и структурным исследованиям биомолекул XVII съезд по общей и прикладной химии (Казань, 2003), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004» (Москва, 2004), XXI Международная конференция ICMRBS (International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Хайдерабад, Индия, 2005), IV Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2005), Международная конференция "Biocatalysis-2005" (Саякт-Петербург-Кижи-Валаам, 2005), Международная конференция "Advances in

Sciences for Drug Discovery" (Москва, 2005), Международная конференция «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию» (Химки, 2006), Международный симпозиум CMTPI-2007 (Москва, 2007)

Публикации

Основные результаты диссертации изложены в 9 тезисах докладов и в 2 статьях в реферируемых российских и зарубежных научных журналах

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и заключения Общий объем работы составляет 154 страницы текста, включая 59 рисунков, 26 таблиц и список литературы, содержащий 170 ссылок

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении обоснована актуальность проводимого исследования, обозначены цели и сформулированы основные задачи работы определение структур тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН и двух бинарных комплексов ДГФР L casei-ТМП и ДГФР L сшсг-НАДФН, их сравнение со структурой тройного комплекса ДГФР L салег-ТМП-НАДФН, изучение и сравнение динамических свойств белковой цепи в апо-форме ДГФР L casei, бинарных комплексах ДГФР L casei с ТМП и НАДФН и тройных комплексах ДГФР человека и L casei с ТМП и НАДФН

Литературный обзор

Первый раздел литературного обзора посвящен описанию фермента ди-гидрофолатредуктазы - основных свойств, механизма действия и взаимодействия с ингибиторами Особое внимание уделено описанию структурных и динамических свойств ДГФР, а также их изменению при взаимодействии с ингибиторами Подробно описаны попытки установить природу селективного связывания триметоприма с ДГФР бактерий

Во втором разделе литературного обзора изложена информация о современном состоянии и применении методов спектроскопии ЯМР для исследования структуры и динамики белков

Экспериментальная часть

В разделе «Материалы» перечислены все использованные в ходе работы материалы Для экспрессии ДГФР были использованы штаммы бактерий Е coli NF1 и Rosetta фирмы Novagen (США), несущие плазмиды рМТ702 и рЕТ22Ь, содержащие гены ДГФР L casei и ДГФР человека соответственно Для очистки и экспрессии белков были использованы стандартные реактивы марок очи

x ч Для получения меченных образцов в качестве единственных источников азота и углерода были использованы соответственно 99%-сульфат аммония (15NH4)2S04 и 99%-Б-глюкоза (13С6Н]206), «Cambridge Isotope Laboratories» (США)

Большая часть раздела «Методы исследования» посвящена подробному описанию ключевых стадий процесса определения структуры белка методом спектроскопии ЯМР, как то экспрессия и очистка ДГФР человека и L casei, приготовление образцов для спектроскопии ЯМР, запись спектров ЯМР, обработка и анализ спектров, отнесение сигналов в спектрах, извлечение из спектров информации, необходимой для расчета структуры белка, расчет и уточнение структуры, визуализация и анализ структур

Меченые и немеченые образцы ДГФР человека и L casei были экспресси-рованы и очищены по отработанным методикам Спектры ЯМР были измерены на приборах Varían Unity Plus (400 МГц), Varían Unity (500 и 600 МГц), Vanan Inova (600 и 800 МГц) и Brucker Avance (600 МГц) Обработка спектров проводилась с помощью программы NMRPipe, для отнесения сигналов в спектрах была использована программа Sparky

Для бинарных комплексов ДГФР L casei (162 аминокислотных остатка) с ТМП и НАДФН были использованы следующие спектры 2D COSY, NOESY, NOESY-15N rejected, 'H,'5N-HSQC, 3D 'H,15N-HSQC-NOESY, HNHB и HNHA Для тройного комплекса ДГФР человека (186 аминокислотных остатков) были также измерены следующие гетероядерные эксперименты 2D 'H,13C-HSQC, 3D 'H,13C-NOESY-HSQC, 'H,13C-HSQC-N0ESY, HCCH-TOCSY, HNCA, HN(CO)CA, HNCO, CBCA(CO)NH, CBCANH и HBHA(CO)NH Для отнесения сигналов связанных с белком лигандов были использованы эксперименты с изотопной фильтрацией и изотопным редактированием

Ограничения на межъядерные расстояния были получены из спектров ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО), ограничения на торсионные углы - из анализа величин констант спин-спинового взаимодействия, информация о водородных связях была получена из экспериментов по обмену водорода на дейтерий, для комплексов ДГФР L casei были измерены также остаточные константы диполь-дипольного взаимодействия в разбавленных анизотропных средах При расчете структуры белка на основе перечисленных данных были использованы программы CNS и XPLOR-NIH, для визуализации молекул использовались программы Insightll (Accelrys), PyMOL, YASARA

Для определения динамических свойств белковой цепи в комплексах ДГФР использовали релаксационные эксперименты ЯМР Были изучены апо-форма ДГФР L casei, бинарные комплексы ДГФР L casei с триметопримом и НАДФН, тройные комплексы ДГФР L casei и ДГФР человека с триметопримом и НАДФН Для каждого из комплексов измеряли скорости продольной и поперечной релаксации СП и Т2) и значения гетероядерных эффектов Оверхаузера 15N{'H} Измерения проводили при двух температурах 15°С и 35°С и при двух - трех значениях магнитного поля, соответствующих резонансным частотам ядер 'Н 500, 600 и 800 МГц Анализ релаксационных данных проводили с ис-

пользованием «безмодельного» подхода Липари и Сзабо с использованием программ ТЕ№(Ж2 и ЯекхРи

Результаты н обсуждение

Данная глава состоит из трех разделов В первом разделе представлены результаты определения структур трех обсуждаемых комплексов Во втором разделе проводится детальное сравнение полученных структур В третьем разделе главы обсуждаются результаты исследования динамических свойств комплексов ДГФР человека и Ь савег и их сравнение

Общая характеристика комплексов ДГФР

Тройной комплекс ДГФР человека с ТМП и НАДФН Для расчета структуры были использованы следующие ограничения 3565 ЯЭО, из них 537 ЯЭО дально-дистантных и 81 ЯЭО между белком и лигандом, 326 диэдральных углов, 139 водородных связей, 258 химических сдвигов протонов

В ходе расчета было получено семейство 25 структур ЯМР Координаты атомов и список экспериментальных ограничений депонированы в банк белковых структур РБВ (код доступа 1УНО) В таблице 1 приведена характеристика полученного семейства структур

Таблица 1 Результаты верификации структур тройного комплекса ДГФР человека с триметопримом и НАДФН __

Параметры, с учетом которых проводилась верификация дгфр-тмп-надфн Все структуры семейства ДГФР-ТМП-НАДФН Репрезентативная структура

Остаточные энергии, ккал/моль

Потенциал ЯЭО 0,73 + 0 52 0,83

Потенциал диэдральных углов 1,16 + 0,40 0,81

Потенциал химических сдвигов 2,48 + 0,25 2,66

Среднее отклонение от экспериментальных данных

От расстояний, А 0,0043 ± 0 0025 0,0050

От углов,0 1,073 + 0,181 0,915

Среднее отклонение от идеальной ковалентной геометрии

Длины связей, А 0,0010 ± 0,0001 0,0011

Валентные углы,0 0 290 ± 0,002 0,290

Торсионные углы, ° 0,086 ± 0,003 0,086

Остатков в благоприятной зоне карты Рамачандрана, % 92,4 94,3

Остатков вне благоприятной зоны карты Рамачандрана нет нет

Среднее отклонение координат атомов при наложении на репрезентативную структуру, А

По атомам С, Са, N 061+0,12 -

По всем тяжелым атомам 1,28 + 0,13 -

Из данных таблицы 1 видно, что разброс координат атомов для большинства участков белковой цепи, а также для обоих лигандов относительно невысок, что свидетельствует о хорошей точности определения структуры Среднеквадратичное отклонение координат тяжелых атомов полипептидной цепи (Са,

С и Ы) в семействе рассчитанных структур от соответствующих усредненных значений составляет 0,61±0,12А Значения основных торсионных углов ф и /// белковой цепи для 92,4 % аминокислотных остатков во всех 25 конформерах находятся в наиболее благоприятных областях карты Рамачандрана, в то время как в запрещенные области карты Рамачандрана не попадает ни одного аминокислотного остатка

В таблице 2 представлены результаты наложения по фрагментам всех структур семейства на репрезентативную, а также на кристаллическую структуру ДГФР человека с НАДФН и 2,4-диамино-5-метил-6-[(3,4,5-триметокси-Ы-метиланилино)-метил]-пиридо-[2,3-0]-пиримидином (РОВ ГО - 1РБ8) Сравнение с кристаллической структурой ДГФР человека с лигандом, отличным от ТМП, показывает, что при переходе от одного комплекса к другому не наблюдается существенного изменения конформации белка Среднеквадратичное отклонение по тяжелым атомам всех аминокислотных остатков для двух тройных комплексов составляет всего 1 26 А

Таблица 2 Результаты суперпозиции структур семейства на репрезентативную Суперпозиция проводилась по атомам С, И, Са остатков 1-184 основной цепи Среднеквадратичное отклонение рассчитывалось по атомам С, N. Са для фрагментов основной цепи и по всем тяжелым атомам - для лигапдов В качестве примера кристаллической структуры использовался комплекс ДГФР человека с НАДФН и 2,4-диамино-5-метил-6-[(3,4,5-триметокси-Ы-метиланилино)-метил]-пиридс[2,3-В]пиримидином

(код РРВ -1РР8)

Структурный элемент СКО (наложение на репрезентативную структуру), А СКО (наложение на кристаллическую структуру), А

Остатки 1-186 0 62 1 26

Петля I (остатки 18-27) 0 69 1 18

Каталитическая а-спираль (остатки 28-37) 0 48 1 09

Сайт посадки аденозинового кольца НАДФН (остатки 51-56, 74-78, 89-93,116-124) 0 56 0 89

Сайт посадки никотинамидного кольца НАДФН (остатки 7-И, 16-24, 113-121, 142-147) 0 62 1 11

Сайт посадки триметоприма (остатки 6-11,17-38,56-66, 113-118,133137) 0 64 1 04

триметоприм 1 33 -

Общая топология ДГФР человека сходна с топологией ДГФР других организмов скелет построен из 8 р-листов, с двух сторон от которого расположены 4 основные а-спирали Незначительные отличия составляют несколько дополнительных петель, спиралей и листов, наличие которых связано в первую очередь с тем, что ДГФР человека на -20 аминокислотных остатков длиннее фермента большинства прокариот

Положение триметоприма хорошо определено в семействе 25 структур (см. табл. 2). Торсионные углы Ii и х2 (двугранные углы С4-С5-С7-С11 и С5-С7-С11-С12) имеют значения 206.67°±2.45° и 82.1Г±4.93 соответственно (рис.1).

| Leu 67

•«Дг«'

Arg 91 ,

Ser 76

Рис.1. Аминокислотные остатки, окру- Рис.2. Окружение никотинамидного фраг-жающие триметоприм в тройном ком- мента кофактора в тройном комплексе плексе ДГФР человека с ТМП и ДГФР человека с ТМП и НАДФН.

НАДФН.

Триметоприм занимает сайт связывания субстрата. Протонированный атом N1 находится в близком контакте с атомом Oel остатка Glu 30 (расстояние между атомами - 2.82 Â), что согласуется с ранее установленными фактами для взаимодействия препарата с ферментом из других организмов.

При связывании с ДГФР человека молекула НАДФН находится в вытянутой конформации. Структура связанного кофермента определена с высоким разрешением, величина СКО тяжелых атомов НАДФН составляет 1.26±0.35Â. Карбоксамидная группа никотинамидного фрагмента кофактора находится в транс-положении и образует водородные связи с карбонильными группами остатков Ala 9 и Ile 16, а также амидной группой Val 8 (рис.2). Структура пиро-фосфатной группы определена значительно хуже ввиду отсутствия ЯЭО между ней и остатками белка. Тем не менее в результате анализа структуры удается обнаружить водородные связи между атомами кислорода пирофосфатной группы и остатками Ser 119, Val 120 и Lys 55. Адениновое кольцо располагается в гидрофобной щели, образованной остатками Leu 75, Leu 93, Arg 91 и Val 120.

Лиганды - ТМП и НАДФН - расположены в непосредственной близости друг к другу. Межлигандный интерфейс - участок белковой глобулы, непосредственно примыкающий к обоим лигандам - представлен аминокислотными остатками Тгр 24 и Lys 22. Данные остатки образуют гидрофобный контакт с триметоксифенильным кольцом ТМП и никотинамидным фаргментом НАДФН.

Ближайший контакт между двумя лигандами наблюдается между атомом С4 никотинамидного кольца и атомом С7 ТМП, расстояние составляет 3 24+0 02А

Бинарные комплексы ДГФР Ь сачег с ТМП и НАДФН Для расчета структуры комплекса с ТМП (НАДФН) были использованы следующие ограничения 1180 (2084) ЯЭО, из них 439 (125) ЯЭО дальнодистантных и 36 (102) ЯЭО между белком и лигандом, 321 (0) диэдральный угол, 87 (80) водородных связей, 138 (51) констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия

Для бинарного комплекса ДГФР Ь сазег с ТМП в ходе расчета было получено семейство 33 структур, для аналогичного бинарного комплекса с НАДФН - семейство 32 структур Координаты атомов и список экспериментальных ограничений депонированы в банк белковых структур РОВ (коды доступа 2НМ9 и 2НС>Р соответственно)

Значения основных торсионных углов ф и у/ белковой цепи для 87 9% аминокислотных остатков в 33 структурах бинарного комплекса ДГФР Ь саке: с ТМП и для 82,7% аминокислотных остатков в 32 структурах бинарного комплекса ДГФР £ с£ме2 с НАДФН попадают в наиболее благоприятные области карты Рамачандрана, в то время как в запрещенных зонах не наблюдается ни одного аминокислотного остатка (см таблицу 3)

Таблица 3 Результаты верификации структур ЯМР бинарных комплексов ДГФР Ь сазег

Параметры, с учетом которых проводилась верификация ДГФРЬ с<ке1 -ТМП ДГФР А Ca.se! -НАДФН

Остаточные энергии, ккал/моль

потенциал ЯЭО 0 72 ± 0 26 15 61 ± 1 43

потенциал диэдральныч упов 0 56±0 19 -

потенциал химических сдвигов - 34 88 ±2 04

потенциал диполярных констант 6 23 ±0 17 13 58 ±3 00

Среднее отклонение от экспериментальных данных

от расстояний, А 0 0019 ±0 0003 0 0120 ± 0 0002

от углов, ° 0 154 ±0 028 -

Среднее отклонение от идеализированной ковалентной геометрии

длины связей, А 0 0005 ±0 0001 0 0014 ±0 0001

значения валентных упов ° 0 500 ± 0 003 0 336 ±0 004

значения торсионных }гтов, ° 0 385 ± 0 005 0 202 ± 0 008

Остатков в наиболее благоприятной зоне карты Рамачандрана, % 87 9 82 7

Остатков вне благоприятной зоны карты Рамачандрана пет нет

Среднее отклонение координат атомов при наложении на репрезентативную структуру, А

по атомам С Са, N 0 55 ± 0 06 0 78 ±0 21

по всем тяжелым атомам 121 ±0 07 1 24 ± 0 27

Координаты атомов лигандов в обоих комплексах определены с хорошей точностью: среднекрадратичное отклонение координат тяжелых атомов триме-топрима составляет 0.74 Ä, НАДФН - 1.52 Ä. Более высокое значение СКО в случае НАДФН объясняется отсутствием экспериментальных ограничений (как на межъядерные расстояния, так и на диэдральные углы) для пирофосфатной группы, связывающей адениновый и никотинамидные фрагменты кофермента. Вследствие этого наблюдается довольно высокий разброс координат атомов пирофосфатной группы, что вносит существенный вклад и в СКО всей молекулы НАДФН.

Триметоприм в бинарном комплексе с ДГФР занимает полость связывания субстрата, расположенную между а-спиралью В и ß-листовым остовом белка. Ключевыми факторами, определяющими связывание TMI1 с ферментом, являются кулоновское взаимодействие 2,4-диаминопиримидинового остатка препарата, протонированного по положению N1 с карбоксильной группой остатка Asp 26, а также гидрофобные взаимодействия 3,4,5-триметоксифенильного остатка ТМП с аминокислотными остатками Leu 19, Leu 27, Phe 30 и Phe 49 (рис. 3).

Phe 30

Trp 5

Asp 26

Рис.3. Окружение триметоприма в бинарном комплексе ДГФР L.casei с ТМП.

Phe 49

Phe 30

His 77

Val 79

«■знс

J ^

Gin 101

Thr45

Gly 99

Рис.4. Остатки, расположенные рядом с никотинамидным кольцом кофактора. Координаты взяты из репрезентативной структуры семейства бинарного комплекса ДГФР Ь.Сазе1 с НАДФН. Показаны остатки 4-6, 19, 26,27, 30. 49, 54.

Рис.5. Остатки, расположенные рядом с адениновым кольцом кофактора. Координаты взяты из репрезентативной структуры семейства бинарного комплекса ДГФР ¿.Сауег с НАДФН. Показаны остатки 4345,62, 77, 79, 90, 99, 101, 102.

Молекула кофактора НАДФН расположена в бороздке на поверхности фермента Никотинамидное кольцо находится в непосредственном контакте с ингибитором - практически в том же кармане, что диаминопиримидиновое кольцо триметоприма.

Положения никотинамидного и аденинового фрагментов определены достаточно хорошо, структура рибозно-фосфатного мостика - несколько хуже, ввиду малого числа протонов в этом фрагменте и, как следствие, недостаточного количества дистанционных ограничений на межъядерные расстояния (рис 4 и 5)

Карбоксамидная группа никотинамидного кольца находится в транс-конформации и связана водородными связями с амидным протоном и кислородом карбонильной группы Ala 6, а также с кислородом карбонильной группы Не 13 Никотинамидное кольцо образует гидрофобные контакты с остатками Тгр 5, Phe 30, Gly 98 Рибозный фрагмент никотинамидной части молекулы находится вблизи Gly 17, Arg 44, Ser 48, рибозное кольцо аденинового фрагмента кофактора расположено рядом с Arg 43, Gin 101, Не 102 2'-фосфатная группа этого рибозного кольца связана водородными связями с Arg 43, Thr 63, Gin 65, что согласуется с данными о прямом наблюдении контакта фосфатной группы с гуанидиновым азотом Arg 43 методом ЯМР Следует отметить наличие сигнала гидроксильного протона Thr 63, не обменивающегося с растворителем, что может быть объяснено лишь образованием прочной водородной связи с его участием Рассмотрение окружения этой гидроксильной группы позволяет сделать вывод о том, что единственным ближайшим акцептором водородной связи является фосфатная группа кофактора НАДФН Адениновое кольцо кофактора хорошо определено в структуре ЯМР ввиду значительного количества плотных гидрофобных контактов его с Leu 62, His 64 и Val 79 Пирофосфатная часть молекулы образует водородные связи с Aig 44, Thr 45, Gly 99, Ala 100, Gin 101

Сравнение структур тройного комлекса ДГФР человека и комплексов ДГФР L.casei

Представляется целесообразным проводить сравнение для двух серий комплексов ДГФР 1) всех комплексов ДГФР L casei между собой, 2) двух тройных комплексов ДГФР человека и бактерий Вначале проводится сравнение общей топологии и таких молекулярных параметров, как объем белка, сеть водородных связей в белковой глобуле, относительное расположение субдоменов белка Далее рассматриваются более тонкие различия, которые касаются в первую очередь положения лигандов, их взаимодействия между собой, а также ближайшего лигандного окружения

Сравнение общей топологии ДГФР Сравнение ДГФР человека с ДГФР L casei показывает, что ключевые элементы вторичной структуры остаются аналогичными, но в случае ДГФР человека (которая длиннее на 24 аминокислотных остатков) наблюдается появление двух дополнительных ß-листов, нескольких петель (в частности петли, разрывающей один из ß-листов), а также удлинение ряда a-спиралей (рис 6)

Рис.6. Трехмерное изображение репрезентативных структур: А - тройной комплекс ДГФР Ь. ca.se/-HАДФН-ТМП1, Б - тройной комплекс ДГФР человека-НАДФН-ТМП, В -бинарный комплекс ДГФР Ь.ссиег-ТМП, Г - бинарный комплекс ДГФР ¿.сазе/-НАДФН.

РоЬИакоу VI., ег а!., (2002), JВюто! ЫМЯ 24, 67-70.

14

Сравнение структурных параметров бечковой глобулы в серии комплексов ДГФР При связывании лигандов изменяется молекулярный объем и площадь поверхности молекулы, доступная для растворителя Для комплекса ДГФР че-ловека-ТМП-НАДФН было получено значение объема 27 9 1 03 А3, для тройного комплекса ДГФР I Саяег-ТМП-НАДФН - 21 5 103 А3, для бинарного комплекса ДГФР I Сшег-ТМП - 23 3 1 03 А3, для бинарного комплекса ДГФР Ь Омег-НАДФН - 24 4 1 03 А3 Во всех расчетах не учитывался объем лигандов В данном случае не наблюдается прямой корреляции между связыванием лигандов и объемом молекулы белка Больший объем ДГФР человека связан, прежде всего, с увеличением размера белка по сравнению с бактериальным ферментом В то же время размер ДГФР Ь сахв! в серии комплексов может определяться несколькими факторами изменением конформации белка, сопровождающимся посадкой того или иного лиганда, изменением прочности сети внутримолекулярных водородных связей и, как следствие, плотности белковой упаковки и т п

Ранее было установлено2, что система водородных связей в ДГФР оказывается чрезвычайно чувствительной к связыванию того или иного лиганда Измерение скоростей обмена амидных протонов на дейтерий показало, что прочность сети водородных связей хорошо коррелирует с прочностью связывания лигандов Также наблюдалась корреляция между кооперативным эффектом связывания лигандов и изменением скоростей обмена протонов на дейтерий В этой связи представлялось интересным сравнить плотность сети водородных связей в серии изученных комплексов

Таблица 4 Данные об общем числе водородных связей в четырех сравниваемых комплексах ДГФР (по данным сервиса http //molbio mfo ruh gov/structbio/basic html) В скобках приведены соответствующие коды в Protein Data Bank _

ДГФР-ТМП (2HM9) ДГФР-НАДФН (2HQP) ДГФР-ТМП-НАДФН (1LUD) чДГФР-ТМП-НАДФН (1YHO)

130 118 148 136

Приведенные в таблице 4 данные подтверждают выводы работы об изменении плотности сети водородных связей при образовании тройного комплекса ТМП и НАДФН с бактериальной ДГФР, сделанные на основании независимых экспериментов по измерению скоростей обмена протонов на дейтерий

Следует отметить существенное увеличение числа водородных связей в тройном комплексе ДГФР I сд5е;-ТМП-НАДФН не только по сравнению с бинарными комплексами бактериального фермента, но и по сравнению с аналогичным тройным комплексом ДГФР человека При этом необходимо учитывать, что ДГФР человека длиннее бактериального фермента на 24 аминокислотных остатка Энтальпия образования одной водородной связи в белках составляет в среднем от 3 до 5 ккал/моль Несмотря на значительную компенсацию этого значения энтропийным вкладом в свободную энергию образования

' Polshakov V I, et al, (2006), J Mol Biol 356, 886-903

15

белка, большее значение числа водородных связей, как правило, соответствует более стабитьному белку Таким образом, уменьшение свободной энергии при образовании тройного комплекса ДГФР Ь сшег-ТМП-НАДФН за счет упрочнения сети водородной связи вносит прямой вклад в увеличение прочности связывания лигандов с белком в тройном комплексе, т е в кооперативный эффект связывания ТМП и НАДФН

С помощью программы БУШЮМ было определено относительное положение белковых доменов в серии комплексов ДГФР и идентифицированы мобильные и неподвижные субдомены При анализе пары тройной комплекс ДГФР Ь сазег - бинарный комплекс ДГФР Ь са$е1 с ТМП остатки 9, 11-22, 119129 были отнесены к мобильному субдомену, остатки 3-8, 10, 23-118, 130-160 -к неподвижному Большая часть этих остатков относится к петлям I и Г-О Такое сравнение позволяет прямо идентифицировать результат связывания НАДФН Очевидно, что при связывании никотинамидного кольца кофактора в карман посадки лиганда (который закрывается петлей I), петля I и связанная с ней водородными связями петля Б-О претерпевают значительные конформаци-онные изменения При сравнении бинарного комплекса ДГФР Ь саэе1 -НАДФН с тройным комплексом ДГФР I сдаег -ТМП-НАДФН практически весь каталитический домен (остатки 4-23, 96-160) был отнесен к неподвижной части молекулы, а часть аденозинсвязывающего (остатки 24-33, 37-56, 58, 62, 77-95) - к подвижной Таким образом, в основном изменяется положение а-спирали В, образующей центр связывания ингибитора, и а-спирали С, участвующей в образовании центров посадки кофактора и ингибитора

Сравнение строения центров связывания лигандов в серии комплексов ДГФР Во всех комплексах не было обнаружено существенных различий в наборе аминокислотных остатков, окружающих лиганды Центры связывания лигандов формируются одним и тем же набором остатков с точностью до гомологии Однако наблюдаются различия в количестве и прочности взаимодействий бе-лок-лиганд (водородных связей и гидрофобных контактов).

На рисунке 7 представлено наиболее характерное наблюдаемое отличие Видно, что положение 2,4-диаминопиримидинового фрагмента триметоприма меняется незначительно Чуть более заметно различается положение 3,4,5-триметоксифенильного фрагмента ТМП, а наиболее существенно меняется ориентация петли в бинарном комплексе ДГФР Ь саяе/ с ТМП по сравнению с тройными комплексами (рис 7А) В бинарном комплексе препарат располагается, по меньшей мере, на 2 5А ближе к каталитической петле, чем в обоих тройных комплексах Различия в ориентации каталитической петли I существенно меньше, однако наблюдаются отличия в положении никотинамидного фрагмента НАДФН по отношению к петле (рис 7Б)

Рис.7. Взаимная ориентация каталитической петли I (12-22 в ДГ'ФР Ь.сазег), триме-топрима (А) и никотинамидного фрагмента НАДФН (Б) в бинарном комплексе ДГФР 1.сше/ -ТМП (1), тройном комплексе ДГФР Ь.ссие! -ТМП-НАДФН (2), тройном комплексе ДГФР человека с ТМ11 и НАДФН (3) и бинарном комплексе ДГФР ¿.са^е/ - НАДФН (4). Использованы репрезентативные структуры комплексов, су-перпозированные друг на друга с использованием координат тяжелых атомов тех аминокислотных остатков, которые формируют центр связывания препарата (5-9, 14-20,25-34,45-50,95-100, 113-117 для ДГФР Ь.савех и 8-12, 17-23,29-38,56-61, 1131 18, 133-137 для ДГФР человека).

Таким образом, наиболее существенные лиганд-индуцированные изменения конформации белка при связывании с ТМП и НАДФН наблюдаются для каталитической петли ДГФР. Такое изменение конформации вполне может вносить вклад в кооперативный эффект связывания лигандов.

Динамические свойства ДГФР

Информация о динамических свойствах белка в серии комплексов ДГФР была получена на основании анализа параметров релаксации ядер амидных групп основной белковой цепи.

Для всех изученных комплексов ДГФР человека и и апо-формы

бактериального фермента наилучшее соответствие между экспериментальными и рассчитанными параметрами релаксации были получены в предположении существования двух внутренних молекулярных движений, со временами корреляции порядка 10 пс и 0.8-1.5 не соответственно. Существование лишь этих двух типов внутренних движений является существенным упрощением реального поведения белка, но и эта модель оказывается достаточно сложной для ограниченного количества экспериментально измеренных параметров. Кроме того, удовлетворительные результаты анализа экспериментальных данных удается получить лишь в предположении анизотропного вращательного движения белковых молекул. При этом оптимальные результаты удалось получить с использованием модели аксиальной анизотропии, соответствующей вращению вытянутого эллипсоида. Его геометрические параметры могут быть охарактеризованы отношением двух основных компонентов тензора анизотропии ОцЯ)^.

Рассчитанные параметры для всех исследованных систем приведены ниже, в таблице 5

Таблица 5. Результаты анализа релаксационных данных методом Монте-Карло В расчетах использовалась модель аксиальной анизотропии вращателыют о движения молекул и расширенная модель Липари и Сзабо, предполагающая быстрые (пс) и медленные (не) внутренние движения белковой цепи, происходящие на фоне броуновского движения белковой глобулы____

Изученный комплекс (белок), температура Время корреляции вращательной диффузии та НС Время корреляции медченных движений, тя не Диапазон значений параметра порядка медленных движений, S2, Отношение компонентов тензора анизотропии Dj/Dx

L casei ДГФР-ТМП, 35°С 7 7 ± 0 1 1 1 ±0 1 0 85 - 1 00 1 35 ±0 05

L casei ДГФР-НАДФН, 35°С 7 9 ± 0 1 1 5±02 0 86 - 1 00 1 35 ±0 05

L casei ДГФР-ТМП-НАДФН, 35°С 7 7 ± 0 2 1 4±0 1 0 85 - 1 00 1 30 ± 0 07

L casei ДГФР-ТМП-НАДФН, 15°С 13 1 ±02 0 8 ± 0 1 0 90 - 1 00 1 43 ± 0 06

L casei ario-ДГФР, 15°С 12 5 ±0 2 1 5 ± 0 2 0 85 - 1 00 1 45 ± 0 08

Human ДГФР-ТМП-НАДФН, 15°С 14 4 ± 0 1 1 3±02 0 85 - 1 00 1 50 ±0 05

Относительные амплитуды быстрых движений экспериментальных маркеров (амидных групп белковой цепи) могут быть оценены из величин параметров порядка S2 Более медленные движения (протекающие в мс шкале времени) были идентифицированы по увеличению скорости поперечной релаксации R.2 на величину вклада химического обмена Rex между двумя или более конформе-рами в скорость поперечной релаксации Сравнение результатов анализа релаксационных данных показало, что амплитуды быстрых движений всех изученных комплексов ДГФР и апо-формы ДГФР L casei отличаются друг от друга несущественно Наибольшие различия лежат в области более медленных движений, идентифицируемых по величинам Rex При этом следует отметить удаленное влияние лигандов на динамику белковой цепи в мс шкале времени (см рис 8)

Рис. 8. Относительные амплитуды движения белковой цепи в мс шкале времени для апо-ДГФР Ь.сазе1 и бинарных комплексов ДГФР ¿.савег-ТМП и ДГФР Ь.сазе1-НАДФН (слева направо). Утолщения на белковой цепи соответствуют аминокислотным остаткам, участвующим в конформационных переходах.

Тройной комплекс ДГФР ¿.сауег'-ТМП-НАДФН не претерпевает конформационных переходов. Он является наиболее жесткой системой. При удалении ТМГ1 из тройного комплекса значительно увеличивается конформационная подвижность а-спирали, которая участвует в образовании центра связывания ингибитора (аВ для ДГФР ¿.сдае/). В случае кофермента наблюдается эффект значительно более дальнего действия - при переходе от тройного комплекса к бинарному комплексу ДГФР Ь.саяег - ТМП наблюдается увеличение конформа-ционной подвижности фрагмента 56-57 белковой цепи, который отстоит от центра связывания кофермента более чем на 15А и приближен к месту посадки ингибитора. Указанные динамические эффекты характеризуют взаимодействие центров связывания лигандов, которое может играть определенную роль и в проявлении кооперативного взаимодействия самих лигандов.

Изучение динамики белковой цепи в тройном комплексе ДГФР человека с ТМП и НАДФН показало, что эта форма фермента гораздо более мобильна в сравнении с бактериальной ДГФР. В особенности это характерно для движений, протекающих в медленной (мс) шкале времени, вызывающих конформа-ционные переходы. По степени мобильности тройной комплекс ДГФР человека можно сравнить лишь с апо-ферментом ДГФР бактерий.

Если сравнивать параметры порядка 82, характеризующие относительные амплитуды быстрых (происходящих в шкале времени от пс до не) движений белковой цепи, то следует отметить тот факт, что связывание лигандов не приводит к заметному уменьшению подвижности белка в области быстрых движений. Таким образом, следует отметить интересный факт - связывание лигандов с ДГФР не приводит к изменению подвижности белковой цепи в области быстрых движений (от пико до наносекунд), однако заметно изменяет мобильность белка в области относительно медленных движений (в мс шкале времени), являющихся следствием конформационных перегруппировок. Связывание лигандов, следовательно, изменяет состояние конформационного равновесия, в том числе меняет населенность тех или иных конформеров. При связывании перво-

го лиганда с апо-формой ДГФР бактерий число конформационных состояний белка резко уменьшается При этом структура оставшихся конформеров оказывается благоприятной для связывания второго лиганда, что следует из близости строения двух бинарных и тройного комплексов ДГФР с ТМП и НАДФН Такое вырождение числа конформеров с образованием структур, благоприятных для связывания второго лиганда, может вносить существенный вклад в кооперативный эффект связывания ТМП и НАДФН Подобного эффекта не наблюдается для ДГФР человека Даже образование тройного комплекса не приводит к образованию конформационно жесткой структуры

Выводы

1) Методом спектроскопии ЯМР определены структуры высокого разрешения тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН и двух бинарных комплексов ДГФР Ь саБв! с ТМП и НАДФН Все структуры депонированы в банк белковых структур РБВ (коды доступа - 1УНО, 2НМ9 и 2Н(^Р соответственно)

2) Сравнение структур бинарных комплексов ДГФР Ь сахех -ТМП и ДГФР Ь саь'а -НАДФН с полученной ранее структурой тройного комплекса ДГФР Ь са$е1 -ТМП-НАДФН показало, что общая топология белка в указанных комплексах меняется незначительно, однако наблюдается изменение ориентации тн каталитической петли (I, а о 12-22) и изменение положения лигандов в тройном комплексе по сравнению с бинарными Такое лиганд-индуцированное изменение конформации белка может вносить вклад в кооперативное взаимодействие ТМП и НАДФН при их связывании с ДГФР бактерий

3) Сравнение структуры тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН со структурой аналогичного тройного комплекса ДГФР Ь сахег показало, что в последнем лиганды имеют значительно более плотный гидрофобный контакт Для бактериального комплекса наблюдается также большее количество водородных связей как внутри белка, так и между лигандами и аминокислотными остатками белка

4) На основании экспериментов по измерению параметров релаксации ядер 15Ы амидных групп получена информация о динамике белковой цепи в быстрой (пс-нс) и медленной (мс) шкалах времени для апо-фермента, двух бинарных и тройного комплекса ДГФР Ь са$е1 с ТМП и НАДФН, а также для аналогичного тройного комплекса ДГФР человека Относительные амплитуды быстрых движений практически не изменяются при переходе от апо-формы бактериальной ДГФР к ее бинарным и тройным комплексам, а также в тройных комплексах ДГФР человека и Ь са.че1 В то же время наблюдается существенное уменьшение конформационной подвижности белковой цепи (в мс шкале времени) при образовании бинарных и в особенности тройного комплекса ДГФР Ь саэег с ТМП и НАДФН В аналогичном тройном комплексе ДГФР человека наблюдаются значительно более существенные конформационные переходы Полученные данные позволяют предполагать, что одним из вкладов в кооперативное взаимодействие ТМП и НАДФН при образовании комплекса с ДГФР бактерий,

может быть изменение населенности конформеров, благоприятных для связывания второго лиганда, после связывания первого лиганда с апо-формой белка

5) Проведенное исследование свидетельствует о том, что не существует одного доминирующего фактора, определяющего селективность связывания ТМП с ДГФР бактерий Вместе с тем, эта селективность определяется аддитивным вкладом нескольких факторов изменением конформации белка при связывании лигандов, прямым лиганд-лигандным взаимодействием, увеличением сети водородных связей и изменением населенностей конформеров белка, благоприятных для связывания второго лиганда

Заключение

Автор выражает благодарность коллективу кафедры Химической энзимо-логии Московского Государственного Университета им М В Ломоносова, сотрудникам Аналитического отдела Центра по химии лекарственных средств (Москва) и сотрудникам Лаборатории молекулярных структур Национального института медицинских исследований (Лондон)

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1 В И Польшаков, Н В Ковалевская. Б Бирдсалл, Дж Финей Спектроскопия ЯМР в изучении специфичности связывания белок-лиганд Материалы XVII съезда по общей и прикладной химии, 2003, т 4, с 180, Казань, Россия

2 Н В Ковалевская, В И Польшаков, А Ф Брэдбери, Т А Френкиель, Б Бирдсалл, Дж Финей Структура комплекса дигидрофолатредуктазы человека с коферментом НАДФН и препаратом триметоприм в растворе Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004», 2004, с 97, Москва, Россия

3 N V Kovalevskaya, V I Polshakov, В Birdsall, A F Bradbury, Т A Frenkiel, J Feeney Structure and dynamics m solution of the complex of human dihydrofolate reductase with trimethoprim and NADPH The proceedings of XXI International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, 2005, p 113, Hyderabad, India

4 В И Польшаков, HB Ковалевская, E Д Смурный, Б Бирдсалл, Дж Финей Спектроскопия ЯМР в исследовании структуры белков и белок-лигандных взаимодействий Сборник тезисов IV Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях», 2005, с 24, Казань, Россия

5 Н В Ковалевская, Е Д Смурный, В И Польшаков, Б Бирдсалл, А Ф Брэдбери, Т А Френкиель, Дж Финей Структура и динамика комплекса дигидрофолатредуктазы человека с триметопримом и НАДФН в растворе Сборник тезисов IV Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях», 2005, с 70, Казань, Россия

6 N V Kovalevskaya, Y D Smurnyy, VI Polshakov, В Birdsall, A F Bradbury, T A Frenkiel, J Feeney NMR spectroscopy studies of dynamics of human dihydrofolate reductase complex with NADPH and antibacterial drug

trimethoprim The proceedings of international conference "Biocatalysis-2005 Fundamentals and Applications", 2005, p 86, St Petersburg-Kizhi-Valaam, Russia

7 VI Polshakov, Y Smurnyy, NV Kovalevskava. В Birdsall, J Feeney (2005) NMR spectroscopy m drug research Exploring the origins of cooperative effect of ligand binding to dihydrofolate reductase The proceedings of international conference" Advances in Sciences for Drug Discovery", p Bl, Moscow, Russia

8 NV Kovalevskava. Y D Smurnyy, VI Polshakov, В Birdsall, A F Bradbury, T Frenkiel, J Feeney (2005) Solution structure of human dihydrofolate reductase m its complex with trimethoprim and NADPH, J Biomolecular NMK, v 33, p 69-72

9 В И Полыиаков, E Д Смурный, H В Ковалевская, Б Бирдсал, Дж Фи-ней Спектроскопия ЯМР в исследовании лекарственных препаратов Природа селективности связывания лигандов с дигидрофолатредуктазой Материалы международной конференции «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию», Центр высоких технологий «ХИМРАР», 2006, с 23, г Химки, Россия

10 H В Ковалевская. Е Д Смурный, Б Бирдсал, Дж Финей, В И Польша-ков Структурные факторы, определяющие селективность связывания антибактериального препарата триметоприма с дигидрофолатредуктазой Химико-фармацевтический журнал, 2007, т 41, N°7, с 8-11

11 NV Kovalevskava. Y D Smurnyy, В Birdsall, J Feeney, V I Polshakov Solution structures and dynamics of the dihydrofolate reductase complexes with antibacterial drug trimethoprim The proceedings of international symposium CMTPI-2007, p 112, Moscow, Russia

Подписано в печать 27 09 2007 г Исполнено 28 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 783 Тираж 120 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ИНГИБИТОРАМИ НАДФН-ЗАВИСИМОЙ ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ.

2.1.1. Общие сведения.

2.1.2. Структура фермента.

2.1.3. Механизм действия.

2.1.4. Взаимодействие с ингибиторами.

2.2. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКУРЫ И ДИНАМИКИ БЕЛКОВ.

2.2.1. Общие сведения о структурных и динамических исследованиях белков.

2.2.2. Определение структуры белков методом спектроскопии ЯМР.

2.2.3. Изучение динамики белков в растворе с помощью релаксационных экспериментов ЯМР.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.1. Получение образцов.

3.2.2. Спектроскопия ЯМР.

3.2.3. Обработка спектров ЯМР.

3.2.4. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР.

3.2.5. Отнесение ЯЭО и получение других ограничений.

3.2.6. Расчет и уточнение структуры.

3.2.7. Визуализация и сравнительный анализ белковых структур.

3.2.8. Анализ релаксационных данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСОВ ДГФР.

4.1.1. Тройной комплекс дгфр человека с ТМП и надфн.

4.1.2. Бинарные комплексы ДГФР 1.слж/сТМП и НАДФН.

4.2. СРАВНЕНИЕ СТРУКТУР ТРОЙНОГО КОМПЛЕКСА ДГФР ЧЕЛОВЕКА И КОМПЛЕКСОВ ДГФР Ь.САБЕ1.

4.2.1. Сравнение общей топологии ДГФР.

4.2.2. Сравнение структурных параметров белковой глобулы в серии комплексов дгфр.

4.2.3. Сравнение строения центров связывания лигандов в серии комплексов ДГФР.

4.3. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВОЙ ЦЕПИ В СЕРИИ КОМПЛЕКСОВ ДГФР ЧЕЛОВЕКА И Ь.САБЕ1.

4.3.1. Влияние связывания ТМП и НАДФН на динамику белковой цепи ДГФР Ь.САБЕ1.

4.3.2. Динамические свойства белковой цепи ДГФР человека в тройном комплексе с ТМП и НАДФН.

5. ВЫВОДЫ.

НАДФН-зависимая дигидрофолатредуктаза (ДГФР; КФ 1.5.1.3) катализирует реакции восстановления фолиевой и дигидрофолиевой кислот до тетрагидрофолиевой кислоты. Продукт восстановления - тетрагидрофолат (ТГФ) -выступает переносчиком одноуглеродных фрагментов в реакциях биосинтеза азотистых оснований и некоторых аминокислот. Нормальная жизнедеятельность клетки невозможна без поддержания концентрации ТГФ на достаточно высоком уровне. Блокирование работы ДГФР приводит к падению концентрации ТГФ, что вызывает остановку деления клеток и их последующую гибель.

Вследствие описанной важной биохимической роли ДГФР представляет собой отличную мишень для действия лекарственных средств. Лекарственные препараты в данном случае должны селективно ингибировать ДГФР паразитических или злокачественных клеток. Именно так и работают лучшие антифолатные препараты, применяемые в медицинской практике. Наиболее известными из них являются противоопухолевые препараты метотрексат и триметрексат, противомалярийный препарат пириметамин и антибактериальный препарат триметоприм.

В сочетании с сульфаниламидными препаратами триметоприм широко используется для лечения инфекций дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Антибактериальное действие триметоприма обусловлено высокой селективностью связывания с ДГФР бактерий по сравнению с ферментом человека. Движущей силой этой селективности является положительный кооперативный эффект, возникающий между препаратом и кофактором НАДФН при их связывании с ДГФР бактерий. При связывании этих лигандов с ДГФР человека наблюдается весьма незначительный кооперативный эффект.

Триметоприм (равно как и другие антифолаты) конкурирует за место связывания с субстратом ДГФР, поэтому лишь тонкие различия в структуре и динамике человеческой и бактериальной форм ДГФР определяют селективность связывания препарата с одной из форм фермента.

Комплексы триметоприма с ферментами различных организмов изучались методами рентгеноструктурного анализа и спектроскопии ЯМР, но до сих пор не было предложено единой гипотезы, которая бы удовлетворительно описывала молекулярную природу положительного кооперативного эффекта, возникающего при связывании триметоприма и НАДФН с ДГФР бактерий.

В целях выявления причин селективного действия триметоприма мы решили определить структуру тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН, в котором кооперативный эффект связывания практически отсутствует, и сравнить ее с ранее полученной в нашей лаборатории структурой аналогичного комплекса ДГФР Ь.са$е1, в котором имеет место кооперативное взаимодействие лигандов. Вместе с тем, для идентификации структурных изменений, ответственных за кооперативное взаимодействие лигандов, представлялось необходимым сравнить структуру тройного комплекса ДГФР ¿.саБег со структурами двух бинарных комплексов, образованных ДГФР Ь.саБег с ТМП и НАДФН, поэтому в ходе работы были определены структуры этих бинарных комплексов.

Для обнаружения вклада динамических процессов в кооперативный эффект связывания лигандов было решено провести исследование динамических свойств апо-формы ДГФР Ь.саБег, двух бинарных и тройного комплекса с ТМП и НАДФН, а также получить аналогичную информацию о динамических свойствах тройного комплекса ДГФР человека.

Понимание причин проявления кооперативного эффекта взаимодействия триметоприма и НАДФН при связывании с ДГФР бактерий является важным как в фундаментальном смысле - для понимания факторов, контролирующих процессы молекулярного узнавания, так и в прикладном - для целенаправленного поиска новых, более эффективных антифолатных препаратов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1) Методом спектроскопии ЯМР определены структуры высокого разрешения тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН и двух бинарных комплексов ДГФР 1.соуе/ с ТМП и НАДФН. Все структуры депонированы в банк белковых структур РОВ (коды доступа - 1УНО, 2НМ9 и 2Н(}Р соответственно).

2) Сравнение структур бинарных комплексов ДГФР ¿.соте/ с ТМП и НАДФН с полученной ранее структурой тройного комплекса бактериального фермента с указанными лигандами показало, что общая топология белка в указанных комплексах меняется незначительно, однако наблюдается изменение ориентации т.н. каталитической петли (а.о. 12-22) и изменение положения лигандов в тройном комплексе по сравнению с бинарными. Указанные факторы могут вносить вклад в проявление кооперативного эффекта связывания ТМП и НАДФН с ДГФР бактерий.

3) Сравнение структуры тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН со структурой аналогичного тройного комплекса ДГФР Ь.са$е1 показало, что в последнем лиганды имеют значительно более плотный гидрофобный контакт.

4) На основании экспериментов по измерению параметров релаксации ядер 15Ы амидных групп получена информация о динамике белковой цепи в быстрой (пс-нс) и медленной (мс) шкалах времени для апо-фермента, двух бинарных и тройного комплекса ДГФР 1.соу<?/ с ТМП и НАДФН, а также для аналогичного тройного комплекса ДГФР человека. Относительные амплитуды быстрых движений практически не изменяются при переходе от апо-формы бактериальной ДГФР к ее бинарным и тройным комплексам, а также в тройных комплексах ДГФР человека и Ь-саБеи В то же время, наблюдается существенное уменьшение конформационной мобильности белковой цепи в миллисекундной шкале времени при образовании бинарных и в особенности тройного комплекса ДГФР ¿.сауе/ с ТМП и НАДФН. В аналогичном тройном комплексе ДГФР человека наблюдаются значительно более интенсивные конформационные переходы. Полученные данные позволяют предполагать, что одним из вкладов в кооперативное взаимодействие ТМП и НАДФН при их связывании с ДГФР бактерий может быть изменение населенности конформеров, благоприятных для связывания второго лиганда, после связывания первого лиганда с апо-формой белка.

5) Проведенное исследование свидетельствует о том, что не существует одного доминирующего фактора, определяющего селективность связывания ТМП с ДГФР бактерий. Вместе с тем, эта селективность может определяться аддитивным вкладом нескольких факторов: прямыми лиганд-лигандными взаимодействиями, изменением конформации белка при связывании лигандов, образованием резонансной сети водородных связей и изменением населенностей конформеров белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выражаю огромную благодарность коллективу кафедры Химической энзимологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, сотрудникам Аналитического отдела Центра по химии лекарственных средств (Москва) и сотрудникам Лаборатории молекулярных структур Национального института медицинских исследований (Лондон).

Я благодарна моим родным - за все-все-все, особенно за создание условий для выполнения данной работы; друзьям и любимым - за бесконечную теплоту и своевременную поддержку.

Отдельное спасибо Егору Смурному за помощь в проведении расчетов; В.И. Тишкову за плодотворное обсуждение работы и моральную поддержку; научному руководителю В.И. Польшакову за предоставленную тему и разностороннюю помощь на всех этапах работы.

1. Blakley, R.L. ( 1984) Chemistry and Biochemistry of Folates. Wiley

2. Westbrook, J., Feng, Z.K., Jain, S., Bhat, T.N., Thanki, N. Ravichandran, V., Gilliland, G.L., Bluhm, W., Weissig, H., Greer, D.S., Bourne, P.E., and Berman, H.M. (2002) The Protein Data Bank: Unifying the archive. Nucleic Acids Res. 30,245-248

3. Oefner, C., D'Arcy, A., and Winkler, F.K. (1988) Crystal structure of human dihydrofolate reductase complexed with folate. EurJBiochem 174,377-385

4. Sawaya, M.R., and Kraut, J. (1997) Loop and subdomain movements in the mechanism of Escherichia coli dihydrofolate reductase: crystallographic evidence. Biochemistry 36, 586-603

5. Polshakov, V.I., Smirnov, E.G., Birdsall, В., Kelly, G., and Feeney, J. (2002) NMR-based solution structure of the complex of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase with trimethoprim and NADPH. JBiomol NMR 24,67-70

6. Meiering, E.M., and Wagner, G. (1995) Detection of long-lived bound water molecules in complexes of human dihydrofolate reductase with methotrexate and NADPH. J Mol Biol 247,294-308

7. Gargaro, A.R., Frenkiel, T.A., Nieto, P.M., Birdsall, В., Polshakov, V.I., Morgan, W.D., and Feeney, J. (1996) NMR detection of arginine-ligand interactions in complexes of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase. Eur JBiochem 238,435-439

8. Fierke, C.A., Johnson, K.A., and Benkovic, S.J. (1987) Construction and evaluation of the kinetic scheme associated with dihydrofolate reductase from Escherichia coli. Biochemistry 26,4085-4092

9. Cameron, C.E., and Benkovic, S.J. (1997) Evidence for a functional role of the dynamics of glycine-121 of Escherichia coli dihydrofolate reductase obtained from kinetic analysis of a site-directed mutant. Biochemistry 36, 15792-15800

10. Villafranca, J.E., Howell, E.E., Voet, D.H., Strobel, M.S., Ogden, R.C., Abelson, J.N., and Kraut, J. (1983) Directed mutagenesis of dihydrofolate reductase. Science 222, 782-788

11. Howell, E.E., Villafranca, J.E., Warren, M.S., Oatley, S.J., and Kraut, J. (1986) Functional role of aspartic acid-27 in dihydrofolate reductase revealed by mutagenesis. Science 231, 1123-1128

12. Cannon, W.R., Garrison, B.J., and Benkovic, S.J. (1997) Electrostatic characterization of enzyme complexes: Evaluation of the mechanism of catalysis of dihydrofolate reductase. J. Am. Chem. Soc. 119, 2386-2395

13. Casarotto, M.G., Basran, J., Badii, R., Sze, K.H., and Roberts, G.C. (1999) Direct measurement of the pKa of aspartic acid 26 in Lactobacillus casei dihydrofolate reductase: implications for the catalytic mechanism. Biochemistry 38, 8038-8044

14. Chen, Y.Q., Kraut, J., and Callender, R. (1997) pH-dependent conformational changes in Escherichia coli dihydrofolate reductase revealed by Raman difference spectroscopy. Biophys J 72, 936-941

15. Feeney, J. (2000) NMR studies of ligand binding to dihydrofolate reductase. Angewandte Chemie-International Edition 39, 291-312

16. Agarwal, P.K., S.R.Billeter, and S.Hammes-Schiffer (2002) Nuclear quantum effects and enzyme dynamics in dihydrofolate reductase complexes. JPhys Chem В 106, 3283-3293

17. Agarwal, P.K., Billeter, S.R., Rajagopalan, P.T.R., and Benkovic, S.J. (2002) Network of coupled promoting motions in enzyme catalysis. Proc Natl Acad Sci USA 99, 2794-2799

18. Schnell, J.R., Dyson, H.J., and Wright, P.E. (2004) Effect of cofactor binding and loop conformation on side chain methyl dynamics in dihydrofolate reductase. Biochemistry 43, 374-383

19. Miller, G.P., and Benkovic, S.J. (1998) Strength of an interloop hydrogen bond determines the kinetic pathway in catalysis by Escherichia coli dihydrofolate reductase. Biochemistry 37, 6336-6342

20. Miller, G.P., Wahnon, D.C., and Benkovic, S.J. (2001) Interloop contacts modulate ligand cycling during catalysis by Escherichia coli dihydrofolate reductase. Biochemistry 40, 867-875

21. Польшаков, В.И. (2002) Дигидрофолатредуктаза: структурные аспекты механизма катализа и ингибирования фермента. Известия РАН, Сер Хим, 1652 -1669

22. Bystroff, C., and Kraut, J. (1991) Crystal structure of unliganded Escherichia coli dihydrofolate reductase. Ligand-induced conformational changes and cooperativity in binding. Biochemistry 30,2227-2239

23. Lipari, G., and Szabo, A. (1982) Model-Free Approach to the Interpretation of Nuclear Magnetic- Resonance Relaxation in Macromolecules.l. Theory and Range of Validity. Journal of the American Chemical Society 104,4546-4559

24. Lipari, G., and Szabo, A. (1982) Model-Free Approach to the Interpretation of Nuclear Magnetic- Resonance Relaxation in Macromolecules.2. Analysis of Experimental Results. Journal of the American Chemical Society 104,4559-4570

25. Epstein, D.M., Benkovic, S.J., and Wright, P.E. (1995) Dynamics of the dihydrofolate reductase-folate complex: catalytic sites and regions known to undergo conformational change exhibit diverse dynamical features. Biochemistry 34, 1103711048

26. Osborne, M.J., Schnell, J., Benkovic, S.J., Dyson, H.J., and Wright, P.E. (2001) Backbone dynamics in dihydrofolate reductase complexes: role of loop flexibility in the catalytic mechanism. Biochemistry 40, 9846-9859

27. Schnell, J.R., Dyson, H.J., and Wright, P.E. (2004) Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase. Annu Rev Biophys Biomol Struct 33, 119140

28. Falzone, C.J., Wright, P.E., and Benkovic, S.J. (1994) Dynamics of a flexible loop in dihydrofolate reductase from Escherichia coli and its implication for catalysis. Biochemistry 33,439-442

29. Hitchings, G.H. (1984) Selective Inhibitors of Dihydrofolate-Reductase 40 Years Progress. Abstracts of Papers of the American Chemical Society 187, 36-MEDI

30. Hitchings, G.H., Jr. (1989) Nobel lecture in physiology or medicine 1988. Selective inhibitors of dihydrofolate reductase. In Vitro Cell Dev Biol 25, 303-310

31. Baccanari, D.P., and Kuyper, L.F. (1993) Basis of selectivity of antibacterial diaminopyrimidines. J Chemother 5, 393-399

32. Baccanari, D.P., Daluge, S., and King, R.W. (1982) Inhibition of dihydrofolate reductase: effect of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate on the selectivity and affinity of diaminobenzylpyrimidines. Biochemistry 21, 5068-5075

33. Wermuth, C.G., Ganellin, C.R., Lindberg, P., and Mitscher, L.A. (1997) Glossary of terms used in medicinal chemistry. Pure Appl Chem 70, 1129-1143

34. Matthews, D.A., Bolin, J.T., Burridge, J.M., Filman, D.J., Volz, K.W., and Kraut, J. (1985) Dihydrofolate reductase. The stereochemistry of inhibitor selectivity. J Biol Chem 260, 392-399

35. Groom, C.R., Thillet, J., North, A.C., Pictet, R., and Geddes, A.J. (1991) Trimethoprim binds in a bacterial mode to the wild-type and E30D mutant of mouse dihydrofolate reductase. J Biol Chem 266,19890-19893

36. Roberts, G.C.K., Feeney, J., Burgen, A.S.V., and Daluge, S. (1981) The Charge State of Trimethoprim Bound to Lactobacillus-Casei Dihydrofolate-Reductase. Febs Letters 131,85-88

37. Champness, J.N., Achari, A., Ballantine, S.P., Bryant, P.K., Delves, C.J., and Stammers, D.K. (1994) The structure of Pneumocystis carinii dihydrofolate reductase to 1.9 A resolution. Structure 2, 915-924

38. Cocco, L., Roth, B., Temple, C., Jr., Montgomery, J.A., London, R.E., and Blakley, R.L. (1983) Protonated state of methotrexate, trimethoprim, and pyrimethamine bound to dihydrofolate reductase. Arch Biochem Biophys 226, 567-577

39. Polshakov, V.I., Birdsall, B., and Feeney, J. (1999) Characterization of rates of ring-flipping in trimethoprim in its ternary complexes with Lactobacillus casei dihydrofolate reductase and coenzyme analogues. Biochemistry 38, 15962-15969

40. Perutz, M.F., Rossmann, M.G., Cullis, A.F., Muirhead, H., Will, G., and North, A.C.T. (1960) Structure of hemoglobin 3-dimensional fourier synthesis at 5.5A resolution, obtained by X-ray analysis. Nature 185,416-422

41. Ernst, R.R. (1992) Nobel Lecture. Nuclear magnetic resonance Fourier transform spectroscopy. BiosciRep 12,143-187

42. Wuthrich, K. (2003) NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel Lecture). J Biomol NMR 27,13-39

43. Zerbe, 0., ed (2003) BioNMR in Drug Research. Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.

44. Fu, R.Q., and Cross, T.A. (1999) Solid-state nuclear magnetic resonance investigation of protein and polypeptide structure. Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struc. 28, 235-268

45. McDermott, A.E. (2003) Solid state NMR studies of uniformly isotopically enriched proteins. In Protein NMR for the Millenium (Krishna, N.R., and Berliner, L.J., eds), 103-120, Kluwer

46. McDermott, A.E. (2004) Structural and dynamic studies of proteins by solid-state NMR spectroscopy: rapid movement forward. Curr Opin Struct Biol 14, 554-561

47. Perutz, M.F. (1960) Structure of hemoglobin. Brookhaven Symp Biol 13, 165-183

48. Karplus, M. (2000) Aspects of protein reaction dynamics: Deviations from simple behavior. J.Phys.Chem.B 104, 11-27

49. Gabel, F., Bicout, D„ Lehnert, U., Tehei, M., Weik, M., and ZaccaiG. (2002) Protein dynamics studied by neutron scattering. Quart.Rev.Biophys. 35,327-367

50. Parak, F.G. (2003) Physical aspects of protein dynamics. Rep.Progr.Phys. 66,103129

51. Sinha, N., and Smith-Gill, S.J. (2002) Protein structure to function via dynamics. Protein Peptide Lett. 9

52. Kempf, J.G., and Loria, J.P. (2003) Protein dynamics from solution NMR Theory and applications. Cell Biochem.Biophys. 37, 187-211

53. Wand, A.J. (2001) Dynamic activation of protein function: A view emerging from NMR spectroscopy. Nature Structural Biology 8, 926-931

54. Daniel, R.M., Dunn, R.V., Finney, J.L., Smith, J.C., and (2003) The role of dynamics in enzyme activity. Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struc. 32, 69-92

55. Kay, L.E. (2005) NMR studies of protein structure and dynamics. J Magn Reson 173,193-207

56. Ovchinnikova, T.V., Shenkarev, Z.O., Yakimenko, Z.A., Svishcheva, N.V., Tagaev, A.A., Skladnev, D.A., and Arseniev, A.S. (2003) Biosynthetic uniform 13C,15N-Iabelling of zervamicin IIB. Complete 13C and 15N NMR assignment. J Pept Sci 9, 817826

57. Gardner, K.H., and Kay, L.E. (1998) The use of 2H, 13C, 15N multidimensional NMR to study the structure and dynamics of proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct 27, 357-406

58. Wishart, D.S., Sykes, B.D., and Richards, F.M. (1992) The chemical shift index: a fast and simple method for the assignment of protein secondary structure through NMR spectroscopy. Biochemistry 31,1647-1651

59. Wishart, D.S., and Sykes, B.D. (1994) The 13C chemical-shift index: a simple method for the identification of protein secondary structure using 13C chemical-shift data. J Biomol NMR 4,171-180

60. Kuszewski, J., Gronenborn, A.M., and Clore, G.M. (1996) Improving the quality of NMR and crystallographic protein structures by means of a conformational database potential derived from structure databases. Protein Sci 5, 1067-1080

61. Evans, J.N.S. (1995) Biomolecular NMR spectroscopy. Oxford University Press

62. Bystrov, V.F. (1976) Spin-spin coupling and conformational states of peptide systems. Progr NMR Spectr 10,41-81

63. Эрнст, P., Боденхаузен, Д., and Вокаун, A. (1990) ЯМР в одном и двух измерениях. Мир, Москва

64. Hommel, U., Harvey, T.S., Driscoll, Р.С., and Campbell, I.D. (1992) Human epidermal growth factor. High resolution solution structure and comparison with human transforming growth factor alpha. J Mol Biol 227, 271-282

65. LeMaster, D.M., Kay, L.E., Brunger, A.T., and Prestegard, J.H. (1988) Protein dynamics and distance determination by NOE measurements. FEBS Lett 236,71-76

66. Nilges, M., Macias, M.J., O'Donoghue, S.I., and Oschkinat, H. (1997) Automated NOESY interpretation with ambiguous distance restraints: the refined NMR solution structure of the pleckstrin homology domain from beta-spectrin. J Mol Biol 269, 408-422

67. Xu, Y., Wu, J., Gorenstein, D., and Braun, W. (1999) Automated 2D NOESY assignment and structure calculation of Crambin(S22/I25) with the self-correcting distance geometry based NOAH/DIAMOD programs. J Magn Reson 136, 76-85

68. Herrmann, T., Guntert, P., and Wuthrich, K. (2002) Protein NMR structure determination with automated NOE-identification in the NOESY spectra using the new software ATNOS. J Biomol NMR 24, 171-189

69. Herrmann, T., Guntert, P., and Wuthrich, K. (2002) Protein NMR structure determination with automated NOE assignment using the new software CANDID and the torsion angle dynamics algorithm DYANA. J Mol Biol 319,209-227

70. Jee, J., and Guntert, P. (2003) Influence of the completeness of chemical shift assignments on NMR structures obtained with automated NOE assignment. J Struct Funct Genomics 4, 179-189

71. Brunger, A.T. (1992)X-PLOR version 3.1. Yale University Press

72. Schwieters, C.D., Kuszewski, J.J., Tjandra, N., and Clore, G.M. (2003) The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package. J Magn Reson 160, 65-73

73. Guntert, P., Mumenthaler, C., and Wuthrich, K. (1997) Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA. J Mol Biol 273,283-298

74. Bax, A. (2003) Weak alignment offers new NMR opportunities to study protein structure and dynamics. Protein Sci 12, 1-16

75. Tjandra, N., Omichinski, J.G., Gronenborn, A.M., Clore, G.M., and Bax, A. (1997) Use of dipolar 1H-15N and 1H-13C couplings in the structure determination of magnetically oriented macromolecules in solution. Nat Struct Biol 4, 732-738

76. Andrec, M., Peicheng, D., and Levy, R.M. (2001) Protein backbone structure determination using only residual dipolar couplings from one ordering medium. J Biomol NMR 21, 335-347

77. Pearlman, D.A., Case, D.A., Caldwell, J.C., Seibel, G.L., U., C.S., Weiner, P., and Kollman, P.A. (1991) Amber 4.0

78. Brooks, B.R., Broccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan, S., and Karplus, M. (1983) Charmm: a program for macromolecular energy minimization and dynamics calculations. J Comp Chem 4, 187-217

79. Lindahl, E., Hess, B., and van der Spoel, D. (2001) GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. Journal of Molecular Modeling 7, 306-317

80. Leach, A.R. (1996) Molecular Modelling. Principles and applications. Pearson Education Ltd

81. Morris, A.L., MacArthur, M.W., Hutchinson, E.G., and Thornton, J.M. (1992) Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins 12,345-364

82. Doreleijers, J.F., Rullmann, J.A., and Kaptein, R. (1998) Quality assessment of NMR structures: a statistical survey. J Mol Biol 281, 149-164

83. Protein structure. Wikipedia, the free encyclopedia (http://www.wikipedia.org)

84. Pauling, L. (1956) Modern Structural Chemistry. Science 123,255-258

85. Open GL. Wikipedia, the free encyclopedia (http://www.wikipedia.org)

86. Richards, F.M. (1977) Areas, volumes, packing and protein structure. Annu Rev Biophys Bioeng 6, 151 -176

87. Lee, В., and Richards, F. (1971) The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. J Mol Biol 55,379-400

88. Connolly, M.L. (1983) Analytical molecular surface calculation. J Appl Cryst 16, 548-558

89. Connolly, M.L. (1992) The molecular surface package. J Mol Graphics 11, 139141

90. Barbato, G., Ikura, M., Kay, L.E., Pastor, R.W., and Bax, A. (1992) Backbone dynamics of calmodulin studied by 15N relaxation using inverse detected two-dimensional NMR spectroscopy: the central helix is flexible. Biochemistry 31, 5269-5278

91. Kordel, J., Skelton, N.J., Akke, M., Palmer, A.G.d., and Chazin, W.J. (1992) Backbone dynamics of calcium-loaded calbindin D9k studied by two- dimensional proton-detected 15N NMR spectroscopy. Biochemistry 31,4856-4866

92. Daragan, V.A., and Mayo, K.H. (1997) Motional model analyses of protein and peptide dynamics using C-13 and N-15 NMR relaxation. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 31, 63-105

93. Korzhnev, D.M., Billeter, M., Arseniev, A.S., and Orekhov, V.Y. (2001) NMR studies of Brownian tumbling and internal motions in proteins. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 38, 197-266

94. Hilser, V.J., and Freire, E. (1996) Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J Mol Biol 262, 756-772

95. Polshakov, V.I., Birdsall, В., and Feeney, J. (2006) Effects of co-operative ligand binding on protein amide NH hydrogen exchange. J Mol Biol 356, 886-903

96. Skrynnikov, N.R., Millet, О., and Kay, L.E. (2002) Deuterium spin probes of side-chain dynamics in proteins. 2. Spectral density mapping and identification of nanosecond time-scale side-chain motions. J Am Chem Soc 124, 6449-6460

97. Tugarinov, V., and Kay, L.E. (2004) 1H,13C-1H,1H dipolar cross-correlated spin relaxation in methyl groups. JBiomolNMR 29,369-376

98. Yang, D., Mittermaier, A., Мок, Y.K., and Kay, L.E. (1998) A study of protein side-chain dynamics from new 2H auto-correlation and 13C cross-correlation NMR experiments: application to the N-terminal SH3 domain from drk. J Mol Biol 276, 939954

99. Сликтер, 4. (1981) Основы теории магнитного резонанса. Мир, Москва

100. Fischer, M.W.F., Majumdar, A., and Zuiderweg, E.R.P. (1998) Protein NMR relaxation: theory, applications and outlook. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 33, 207-272

101. Абрагам, A. (1963) Ядерный магнетизм. Изд-во иностр. лит-ры, Москва

102. Idiyatullin, D., Daragan, V.A., and Mayo, K.H. (2003) 15NH Backbone Dynamics of Protein GB1: Comparison of Order Parameters and Correlation Times Derived Using Various "Model-Free" Approaches. J. Phys. Chem. 107,2602-2609

103. Peng, J.W., and Wagner, G. (1995) Frequency spectrum of NH bonds in eglin с from spectral density mapping at multiple fields. Biochemistry 34,16733-16752

104. Tjandra, N., Wingfield, P., Stahl, S., and Bax, A. (1996) Anisotropic rotational diffusion of perdeuterated HIV protease from 15N NMR relaxation measurements at two magnetic fields. JBiomol NMR 8,273-284

105. Palmer, A.G., 3rd (2001) Nmr probes of molecular dynamics: overview and comparison with other techniques. Annu Rev Biophys Biomol Struct 30,129-155

106. Prendergast, N.J., Delcamp, T.J., Smith, P.L., and Freisheim, J.H. (1988) Expression and site-directed mutagenesis of human dihydrofolate reductase. Biochemistry 27, 3664-3671

107. Ranee, M., Sorensen, O.W., Bodenhausen, G., Wagner, G., Ernst, R.R., and Wuthrich, K. (1983) Improved Spectral Resolution in COSY 1H NMR Spectra of Proteins via Double Quantum Filtering. Biochem. Biophys. Res. Commun. 117,479-481

108. Davis, D.G., and Bax, A. (1985) Assignment of complex 'H NMR spectra via two-dimensional homonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy. J Am Chem Soc 107,2820-2821

109. Jeener, J., Meier, B.H., Bachmann, P., and Ernst, R.R. (1979) Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR spectroscopy. J.Chem.Phys. 71, 45464553

110. Bax, A., and Davis, D.G. (1985) 2D ROESY with CW spinlock for mixing phase sensitive using States-TPPI method. J. Magn. Reson 63,207-213

111. Bodenhausen, G., and Ruben, D. (1980) Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chem Phys Lett. 69,185-189

112. Ikura, M., Kay, L.E., and Bax, A. (1991) Improved three-dimensional 1H-I3C-1H correlation spectroscopy of a 13C- labeled protein using constant-time evolution. J Biomol NMR 1,299-304

113. Vuister, G.W., and Bax, A. (1993) Quantitative J Correlation a New Approach For Measuring Homonuclear 3-Bond J(H(N)H(Alpha) Coupling-Constants in N-15-Enriched Proteins. Journal of the American Chemical Society 115, 7772-7777

114. Archer, S.J., Ikura, M., Torchia, D.A., and Bax, A. (1991) An Alternative 3d-Nmr Technique For Correlating Backbone N-15 With Side-Chain H-Beta-Resonances in Larger Proteins. Journal of Magnetic Resonance 95, 636-641

115. Piotto, M., Saudek, V., and Sklenar, V. (1992) Gradient-tailored Excitation for Single-quantum NMR Spectroscopy of Aqueous Solutions. J. Biomol. NMR 2, 661

116. Konrat, R., Muhandiram, D.R., Farrow, N.A., and Kay, L.E. (1997) Pulse schemes for the measurement of 3JC'C gamma and 3JNC gamma scalar couplings in 15N,13C uniformly labeled proteins. J Biomol NMR 9,409-422

117. Ottiger, M., Delaglio, F., and Bax, A. (1998) Measurement of J and dipolar couplings from simplified two-dimensional NMR spectra. JMagn Reson 131, 373-378

118. Polshakov, V.I., Smirnov, E.G., Birdsall, B., Kelly, G., and Feeney, J. (2002) NMR-based solution structure of the complex of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase with trimethoprim and NADPH. J. Biomol. NMR, 24, 67-70

119. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G.W., Zhu, G., Pfeifer, J., and Bax, A. (1995) NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR 6,277-293

120. Bartels, С., Xia, T.-H., Billeter, M., Guntert, P., and Wiithrich, K. (1995) The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules. J. Biomol. NMR 5, 1-10

121. Goddard, T.D., and Kneller, D.G. SPARKY 3. University of California

122. Kuboniwa, H., Grzesiek, S., Delaglio, F., and Bax, A. (1994) Measurement of HN-H alpha J couplings in calcium-free calmodulin using new 2D and 3D water-flip-back methods. J Biomol NMR 4, 871-878

123. Cornilescu, G., Delaglio, F., and Bax, A. (1999) Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR 13, 289-302

124. Schwieters, C.D., and Clore, G.M. (2001) The VMD-XPLOR visualization package for NMR structure refinement. J Magn Reson 149, 239-244

125. Laskowski, R.A., Rullmannn, J.A., MacArthur, M.W., Kaptein, R., and Thornton, J.M. (1996) AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J Biomol NMR 8,477-486

126. Финкелыитейн, A.B., and Птицын, О.Б. (2002) Физика белка. Университет Книжный Дом, Москва

127. Вороной, Г.Ф. (1952) Исследования о примитивных параллелоэдрах. Собрание сочинений. Изд-во АН УССР, Киев

128. Jeffrey, G.A. (1997) An Introduction to Hydrogen Bonding. Oxford University

129. Kleywegt, G.J., and Jones, T.A. (1994) Detection, delineation, measurement and display of cavities in macromolecular structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 178-185

130. Dosset, P., Hus, J.C., Blackledge, M., and Marion, D. (2000) Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data. J Biomol NMR 16,23-28.

131. Kay, L.E., Torchia, D.A., and Bax, A. (1989) Backbone dynamics of proteins as studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease. Biochemistry 28, 8972-8979

132. Palmer, A.G.d. (1993) Dynamic properties of proteins from NMR spectroscopy. Curr Opin Biotechnol 4,385-391

133. Orekhov, V.Y., Nolde, D.E., Golovanov, A.P., Korzhnev, D.M., and Arseniev, A.S. (1995) Processing of heteronuclear NMR relaxation data with the new software DASHA. Appl. Magn. Reson. 9, 581-588

134. Bevan, A.W., Roberts, G.C.K., Feeney, J., and Kuyper, L. (1985) H-l and N-15 Nmr-Studies of Protonation and Hydrogen-Bonding in the Binding of Trimethoprim to Dihydrofolate-Reductase. European Biophysics Journal With Biophysics Letters 11,211218

135. Gerstein, M.A. (1992) Resolution-sensitive procedure for comparing protein surfaces and its application to the comparison of antigen-combining sites. Acta Cryst A 48,271-276

136. Teague, S.J. (2003) Implications of protein flexibility for drug discovery. Nat Rev Drug Discov 2, 527-541