Оптическое преобразование редокс-состояний полимерных посредников и кофакторов при электро- и биохимических превращениях. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах

РАЙТМАН Олег Аркадьевич

ОПТИЧЕСКОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ РЕДОКС-СОСТОЯНИЙ ПОЛИМЕРНЫХ ПОСРЕДНИКОВ И КОФАКТОРОВ ПРИ ЭЛЕКТРО-И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИЯХ. СПЕКТРОСКОПИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА

02.00.04 - физическая химия; 02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Иерусалимском университете, Израиль и в Институте физической химии Российской академии наук

Научные руководители

доктор химических наук Арсланов Владимир Валентинович

Официальные оппоненты

Ведущая организация

кандидат химических наук Харитонов Андрей Борисович

доктор химических наук

профессор Ванников Анатолий Вениаминович

доктор физико-математических наук профессор Ролдугин Вячеслав Иванович

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Защита диссертации состоится «5» февраля 2004 г. в 15 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.246.02 в конференц-зале Института физической химии РАН по адресу: 119991, Москва, Ленинский пр., 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химической литературы ИОНХ РАН по адресу: 119991, Москва, Ленинский пр., 31.

Автореферат разослан « » декабря 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат химических наук /СТ „ Платонова Н.П.

-H

2-t

' Актуальность проблемы. Создание компактных организованных молекулярно-механических, информационных и сенсорных систем в настоящее время является одной из главных задач супрамолекулярной химии. Интерес к таким системам обусловлен потребностью в разработке' молекулярных компьютеров и механизмов (приводы, моторы), химических сенсоров для анализа состава различных сред, а также моделей биологических объектов, в которых осуществляются процессы распознавания и мембранного транспорта. В таких устройствах электронная запись, хранение, передача и стирание информации должны быть реализованы на уровне одной молекулы или супрамолекулярного ансамбля. Однако платой за стремление к миниатюризации устройств являются затраты на преодоление фундаментальных и практических проблем, обусловленных необходимостью ввода и вывода сигналов на уровне молекулярных объектов. Иными словами, механические и логические функции создаваемых структур должны быть не только контролируемы, но также обладать способностью к передаче выходного результата к другому компоненту. Важной составляющей этой проблемы является необходимость управления и, что не менее важно, мониторинга сборки сложных молекулярных агрегатов, способных выполнять заданные физические функции. Разработка методик, позволяющих осуществлять такое управление и интеграцию, может обеспечить реализацию ожиданий мирового сообщества в получении дешевых, мощных и ультра-миниатюрных приборов для вычислительной техники, оптоэлектроники, медицины и др.

Супрамолекулярные взаимодействия между различными молекулами в растворах и на поверхности могут быть использованы для образования сложных многокомпонентных систем. При современном уровне органической химии, способном предложить пути для сложных синтезов, и современной технологии, обеспечивающей средства для структурирования на субмикронном уровне, становится возможным проводить исследования в этом направлении. Однако для исследования и использования таких систем требуется создание новых методов анализа, отличающихся низким пределом обнаружения, высокой селективностью и экспрессностью, возможностью использования их "вне лаборатории" (on-site и on-line системы) Одним из таких новых методов для изучения поведения супрамолекулярных систем является спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (ППР), обладающая несомненными преимуществами перед громоздкими и сложными спектрометрами, проведение одного эксперимента на которых занимает довольно продолжительное время. Возможность спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса га situ оценивать оптические константы, геометрию тонких пленок и некоторые другие физические характеристики иммобилизованных на поверхности веществ предполагает использование этого метода в качестве средства контроля за механическими и информационными функциями молекулярных машин. Также пристальное внимание привлекает поверхностный плазмонный резонанс в комбинации с электрохимическими измерениями. При такой комбинации открываются широкие возможности для изучения биоэлектрокаталитических свойств энзиматических электродов и создания новых -Оптических,биосенсоров на их основе. Кроме того, одним из перспективных, но еще не достаточно освоенных направлений, является^гепользованйе~спекгроскощш ППР для создания оптических сенсоров на основе молекулярно импринтированных полимеров.

В последние годы много исследований посвящено разработке электронных устройств на основе ультратонких пленок, обладающих новыми электрическими и оптическими свойствами. В этом отношении большое внимание уделяется проводящим полимерам, а также их сополимерам и композитным системам на их основе. Среди проводящих полимеров полианилин занимает важное место благодаря высокой химической стабильности как на воздухе, так и в воде, легкости перехода между редокс-состояниями, возможности использования при создании химических и биологических сенсоров, элекгрохромных экранов, фотоэлементов, батарей и др. При допировании полианилина протонными кислотами появляется возможность создания композитных матриц на основе этого полимера, в которые можно встраивать такие жизненно важные энзимы, как глюкозооксидазу или лактат-дегидрогеназу. Непроводящие, но меняющие свои физико-химические свойства полимеры,

БИБЛИОТЕКА С.Петербург«

о»

также представляют большой интерес, так как

мониторинговые системы, химические и биохимические оптические сенсоры, транспортные мембраны.

Целью работы является создание интегрированных супрамолекулярных систем на основе полимеров, кофакторов и энзимов, восприимчивых к электрохимическому, биохимическому и биоэлектрохимическому переключению редокс-состояний и осуществление оптического преобразования этих состояний с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса.

Научная новизна заключается в создании сложных интегрированных органических электродов и пленок с электро- и биохимически переключаемыми редокс-функциями и реализации оптического контроля этих функций с помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса.

1. Впервые для ультратонких пленок полианилина исследованы обратимые эффекты сорбции-десорбции воды при электрохимическом циклировании этого редокс-активного полимера.

2. Впервые редокс-активная пленка берлинской лазури, нанесенная на модифицированный меркаптопропионовой кислотой золотой электрод, использована для получения переключаемой оптоэлектронной системы, в которой электрохимическая информация, характерная для трех редокс состояний, преобразована в оптическую с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

3. Создана композитная ультратонкая пленка на основе полианилина и полиакриловой кислоты, позволяющая получать супрамолекулярные переключаемые структуры, пригодные для работы в нейтральных средах.

4. Впервые исследовано оптическое преобразование электрокаталитического окисления никотинамидадениндинуклеотида полимерными пленками берлинской лазури и полианилина.

5. Разработаны композитные энзиматические электроды, в которых полианилин выступает в качестве посредника переноса электронов между такими энзимами, как глкжозооксидаза, лактат-дегидрогеназа и глюкозо-дегидрогеназа и подложками электродов.

6. Впервые показана принципиальная возможность создания электрического контакта между пирролохинолинхинон(Р(2(3)-зависимой глюкозо-дегидрогеназой (GDH) и золотым электродом путем реконструирования ano-GDH на полианилиновой пленке, функционализированной PQQ-кофактором.

7. Показано, что в комбинации с электрохимическими методами спектроскопия ППР может быть использована как основа для датчиков на глюкозу, дигидро-никотинамидадениндинуклеотид (NADH) или лактат.

8. Разработан метод создания импринтированной полимерной матрицы, оптимизированной для исследования с помощью спектроскопии ППР, и впервые проведено неэлектрохимическое селективное определение редокс-кофакторов NAD+, NADP , NADH и NADPH, основанное на принципе молекулярного импринтинга.

Практическая значимость работы. Разработаны чувствительные элементы оптических сенсоров на основе ультратонких полимерных пленок. Продемонстрирована возможность количественного анализа in situ таких важных органических соединений, как глюкоза, лактат, кофакторы NAD+, NADP+, NADH и NADPH, участвующих в процессах жизнедеятельности. Высокая чувствительность метода поверхностного плазмонного резонанса и функциональная стабильность исследованных систем открывают перспективы для создания с помощью спектроскопии ППР молекулярных информационных и сенсорных устройств.

На защиту выносятся

• результаты исследования оптического преобразования электрохимически индуцированных процессов набухания и усадки тонких пленок полианилина и композитных пленок полианилин/полиакриловая кислота;

• экспериментальные данные по изучению редокс-состояний берлинской лазури методом поверхностного плазмонного резонанса;

• способы модифицирования поверхности золотых электродов для создания чувствительных элементов сенсоров на такие вещества, как глюкоза, лактат, кофакторы NAD+, NADP+, NADH и NADPH, и результаты исследований электрокаталитической, биокаталитической и биоэлектрокаталитической активности полученных тонкопленочных супрамолекулярных систем методом поверхностного плазмонного резонанса;

• данные о селективности определения химически и структурно близких соединений методом ППР с импринтированными мембранами;

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures" (Казань, Россия, 2002), I Международной молодежной конференции-школе по синтезу и строению супрамолекулярных соединений (Казань, Россия, 2002), Международной конференции "II International Workshop on Molecularly Imprinted Polymers" (La Grande Motte, Франция, 2002), XVI Европейской конференции "Chemistry at Interfaces" (Владимир, Россия, 2003), Всероссийском семинаре "Структура и динамика молекулярных систем" (Йошкар-Ола, 2003). По результатам работы опубликованы 9 статей и тезисы 3 докладов на научных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по молекулярным устройствам, обеспечению электрического контакта между редокс-энзимами и электродами, основным принципам молекулярного импринтинга и основам спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Вторая глава работы посвящена описанию объектов и методов исследования. В третьей главе

диссертации представлены и обсуждены результаты исследований. Работа изложена на_

страницах, включая_рисунков,_схем и_литературные ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В первой части литературного обзора рассмотрены публикации, касающиеся разработки устройств молекулярной памяти и супрамолекулярных механизмов в растворах и на поверхности. Во второй части обсуждаются различные способы реализации электрического, контакта, между энзимами и элеетродами. Третья часть посвящена методу молекулярною импринтинга. В ней рассматриваются основные принципы" молекулярного импринтинга, обсуждаются различные виды аналитов, импринтированных матриц, применение молекулярно импринтированных полимеров в аналитической химии. В четвертой части литературного обзора рассмотрен новый аналитический метод, применяемый для исследования супрамолекулярных структур - спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса. Приведены теоретические основы ППР, рассмотрены вопросы применения ППР для решения фундаментальных и практических задач.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили ультратонкие пленки полианшшна и берлинской лазури (BJI), молекулярно импршггированные полимерные матрицы на основе акриламида и акриламидофенилборной кислоты, а также композитные матрицы, состоящие из полианилина и полиакриловой кислоты. Модификация электродов полианилином проводилась электрохимически при 0,8 В в течение 5 с из водного 0.1 M раствора анилина, содержащего 0,1 M H2SO4 и 0,5 M Na2S04, (pH 1,8). Электроосаждение берлинской лазури на золотую

поверхность из раствора, содержащего 0,1М К3[Те(СМ)б] и ОДМ БеСЬ, рН 7,0, проводили циклическим сканированием потенциалов (10 циклов) между -0,2 В и 1,3 В (скорость сканирования 100 мВхсек'1). Для получения стабильной, редокс-активной в нейтральной среде пленки БЛ, имеющей два обратимых пика на циклической вольтамперограмме, НИР-электрод предварительно модифицировали меркаптопропионовой кислотой. Композитный полимер полианилин/полиакриловая кислота получали из водного раствора электролита, содержащего 0,2 М анилина, 1,5 мгхмл"1 полиакриловой кислоты (450000 гхмоль"'), 0,1 М НгЯС^ и 0,5 М N82804 (рН 1,8) путем циклического сканирования потенциалов между -0,1 и 1,1 В со скоростью 100 мВхс'1. Для удаления остатков мономеров все полученные полимеры тщательно промывали растворами соответствующих фоновых электролитов. Для приготовления импринтированных полимерных мембран и их связывания с ППР-электродами, золотую поверхность предварительно функционализировали цистамином, к которому ковалентно пришивали акриловую кислоту. Затем модифицированные электроды помещали в смесь, состоящую из функциональных мономеров (0,5 М акриламида и 0,01 М акриламидофенилборной кислоты), сшивающего агента (0,2 М МТС-метиленбисакриламида), и соответствующего шаблонного субстрата (ИАО+, МЛОР+, КАОН или ИАОРН) на 1 час. После этого на поверхность электрода наносили каплю, содержащую смесь инициаторов полимеризации: 0,02 М персульфата аммония и 10 об. % Ы,Н,Н'.№-тетраметилендламина. Модифицированные таким образом поверхности оставляли на ночь до полного высыхания на воздухе. Для удаления импринтированных молекул аиалига модифицированные поверхности тщательно промывали 1 % раствором N1-1}, а затем фосфатным буфером, рН = 7,3, до получения стабильного ППР сигнала. Полученные поверхности использовали для проведения соответствующих анализов.

Для исследования ультратонких полимерных композитных пленок использовали методы спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса, пьезокварцевою микровзвешивания, а также электрохимические методы. ППР измерения проводили на спектрофотометре "Вюзир1аг-2" (Апа1>11са1-ц5уз1ет, Германия) с лазерным диодом с длиной волны X = 670 нм и выходной мощностью 0,2 мВт. ППР-данные обрабатывали с помощью программного обеспечения "Вю8ир1аг-2" (версия 2.2.30) на РС компьютере. Экспериментальные спектры ППР полимерных пленок обрабатывали путем математического моделирования на основе пятифазных вычислений Френеля с использованием алгоритма минимизации Нелдера-Мида. Циклическую вольтамперометрию и хроноамперометрические измерения проводили с использованием электрохимического анализатора (ЕО&О, Уег5а81а1, Германия), подсоединенного к компьютеру (программное обеспечение ЕО&О №270/250). Для электрохимических и ППР-измерений использовали стеклянные подложки (ПМ, 20x20 мм), покрытые подслоем Сг (5 нм) и слоем поликристашшческого золота (50 нм), поставляемые компанией Апа1у11са1-ц8уз1ет (Германия). Покрытая золотом стеклянная пластина служила рабочим электродом (площадь соприкосновения с раствором - 1,5 см2), вспомогательный платиновый электрод и серебряный квази-электрод сравнения были выполнены в виде полуколец из проволоки диаметром 0,5 мм и встроены в электрохимическую ячейку открытого типа, обеспечивающую свободный доступ в зону измерений. Серебряный квази-электрод сравнения калибровали путем сравнения с эталонным потенциалом диметилвиологена (Е° = -0,687 В относительно насыщенного каломельного электрода), измеренным методом циклической вольтамперометрии. В экспериментах, не связанных с электрохимическими измерениями, использовали закрытую ячейку проточного типа. Для измерений методом пьезокварцевого микровзвешивания образцы готовились на кварцевых резонаторах в точном соответствии с методиками приготовления образцов на ППР-электродах.

Результаты и их обсуждение Полимерные пленочные сенсорные системы на основе поверхностного плазмонного резонанса. Ключевым звеном в проблеме создания молекулярных машин или информационных устройств является выбор (синтез) молекул, обладающих определенной

рабочей (физической или химической) функцией. Переключение этой функции или запись и считывание информации должно осуществляться, по-возможности, простыми воздействиями на систему. Среди переключаемых систем одно из ведущих мест в фундаментальных исследованиях принадлежит редокс-активным полимерам. Возможность спектроскопии поверхностного плазменного резонанса in situ оценивать оптические константы, геометрию и некоторые другие физические характеристики иммобилизованных на поверхности адсорбционных слоев и тонких пленок предполагает использование этого метода в качестве средства контроля за механическими и информационными функциями молекулярных машин.

Среди проводящих полимеров полианилин занимает важное место благодаря высокой химической стабильности и легкости перехода между редокс-состояниями. Процессы окисления-восстановления приводят к изменению оптических и физико-химических

характеристик полимера.

Полианилин обратимо окисляется и восстанавливается в соответствии с уравнением (1), где полимер находится в окисленном состоянии, (An21) п, при 0,4 В, и в восстановленном состоянии, (Ап)„, - при 0,0 В. Эффективность использования метода ППР при исследовании электрохимических преобразований редокс-активных пленок полианилина в кислых средах демонстрирует рис.1. В секции А приведены спектры ППР окисленного полианилина, (Ап2+)„ для разных времен выдержки системы в электролите при 0,4 В (кривые а-е). Первый спектр (кривая а) был записан сразу после подачи на электрод потенциала 0,4 В. Рассчитанная с его помощью толщина пленки полимера^ составила 150 нм. Каждый последующий спектр ППР записывался через 30 секунд после предыдущего. Анализ процессов, способных вызывать наблюдаемые изменения в спектрах ППР, показал, что понижение минимума интенсивности отраженного света при увеличении времени выдержки обусловлено набуханием полимера. Спектр, записанный через 10 минут после приложения окислительного потенциала 0,4 В (рис. 1А, кривая е), дал толщину полимера ~ 180 нм. Отсюда следует, что процесс набухания полимерной пленки, происходящий при 0,4 В, приводит к увеличению ее толщины ~ на 30 нм. Переход полимера из окисленного состояния (Ап2+)„ в восстановленное (Ап)„ демонстрирует рис. 1 А, кривая f, записанная при резком изменении потенциала от 0,4 В до 0,0

Рис.1. Спектры ППР полианилина, нанесенного на золотую подложку, при электрохимически индуцированных процессах усадки и набухания.

В. Быстрое изменение спектра является следствием изменения коэффициента преломления полимера в результате его восстановления. Далее спектры записывались для восстановленной формы полимера при потенциале 0,0 В, кривые Рис. 1А, кривая g, например, показывает значительное изменение интенсивности отраженного света относительно спектра £ после которого наблюдаются лишь небольшие изменения спектров, рис. 1А, кривые Ь и ¡. Эти изменения спектров можно отнести к процессу усадки восстановленного полимера, который прекращается через ~ 4 минуты. Основное уменьшение толщины полимера в процессе его усадки, происходит в течение первой минуты после изменения потенциала до 0,0 В. Этот процесс - быстрее времени, требующегося для записи полного спектра ППР. Следовательно, для определения кинетики процесса усадки при изменении потенциала с 0,4 В до 0,0 В измерения должны проводиться при фиксированном угле падения (0 = 65°), рис 1, вставка I. На основании математической обработки экспериментальных данных установлена биэкспоненциальная кинетика процесса усадки полимера с константами скорости к|=9х10' с' и к2=5х10"4 с'1. Быстрая константа усадки, кь характеризует процесс уплотнения гидрофобных полимерных цепочек, происходящий вследствие высвобождения противоионов и приводящий, при восстановлении, к метастабильной конфигурации полимера. Медленная константа, к2, характеризует процесс релаксации этой пленки с образованием плотноупакованной, по-видимому, организованной структуры, которая выталкивает остаточную воду.

Далее, на примере процессов набухания-усадки полимера была изучена обратимость электрохимически индуцированных преобразований, происходящих в полианилиновой пленке. Модифицированный полимером электрод был выдержан при 0,4 В для достижения состояния равновесия при этом потенциале. Первый спектр ППР был записан после того, как потенциал снизили до 0,0 В, рис. 1В, кривая а. Медленная стадия процесса усадки при 0,0 В четко просматривается на спектрах ППР, показанных на рис. 1В, кривые а-с. Во время следующего измерения, рис. 1В, кривая (1, потенциал был изменен с 0,0 В до 0,4 В. Резкое изменение спектра происходит в основном вследствие изменения коэффициента преломления полимера в процессе его окисления. Последующие измерения ППР при потенциале Е = 0,4 В показывают уменьшение интенсивности отражения полимерного слоя, соответствующее медленному процессу набухания, происходящего за счет поглощения противоионов и гидратации пленки, рис. 1В, кривые сы. Кинетические измерения набухания полимера при фиксированном угле падения (0 = 65°), рис. 1, вставка II, показали, что кинетика набухания является

нтой скорости к=3 х 10"4 сек"1.

Идентичные изменения в значениях толщины полимерного слоя при восстановлении и окислении получены независимо от последовательности изменений окислительно-восстановительных состояний, которые приводят к набуханию или усадке полимерной пленки. Из этого следует, что возможно обратимое преобразование полимерного слоя из сжатого в набухшее состояние с различной толщиной. Однако, если полный цикл усадка-набухание занимает на временной шкале минуты, то коэффициент преломления полимера подвергается очень быстрым изменениям в процессах окисления-восстановления. Это позволяет использовать полианилиновую пленку как объект для обратимого ППР преобразования электронного сигнала, вырабатываемого полимером. На рис. 2 показан оптический отклик системы на переходы полианилинового слоя между окисленным (0,4 В) и восстановленным (0,0 В) состояниями. Потенциал переключали с 0,0 В на 0,4 В для перевода

моноэкспоненциальным процессом с конст;

300

200

В!

100

0.0 в

О

10 1/с

Изменения

20

30

Рис.2. Изменения интенсивности отраженного света во времени, измеренные при фиксированном угле падения, 0 = 65°. Стрелками показано время приложения окислительного (0,4 В) и восстановительного (0,0 В) потенциалов._

(Ап)„ в (Лп2+)„, после чего полимеру не позволяли набухнуть, а прикладывали противоположный, восстановительный потенциал, чтобы получить метастабильный (Ап)„, который снова окислялся до начала процесса усадки. Путем циклического прикладывания окислительного и восстановительного потенциалов достигался ППР-контроль обратимого преобразования состояний полимера.

Примером более сложной, мультистабильной системы является берлинская лазурь (БЛ). Окислительно-восстановительные свойства берлинской лазури описываются уравнением

2, где К* - катион и А" -

К^е^ССадз

состояние I

Уравнение (2).

* Ке,4"[Ь'е11(СМ)6]3 44е* +4К состояние II

Ре^'

ч 1(СМ)6]3А

состояние III

анион.

Обычно для

- электрополимеризации

БЛ используют графитовые электроды. Непосредственное электроосаждение берлинской лазури на чистый золотой электрод, которое проводится в кислой среде (рН ~ 1,5), приводит к получению редокс-активной пленки, имеющей низкую адгезию к подложке. С целью устранения этого недостатка мы предложили проводить

предварительную функционализацию золотого электрода

меркаптопропионовой кислотой

(ГО(СН2)2С02Н). Вольтамперограмма такого модифицированного золотого электрода с пленкой БЛ в нейтральной среде (0,1М К>ТОз, рН 7,0) имеет два редокс пика, Е/° = 0,0 В и Я/ = 0,72 В относительно серебряного квазиэлектрода сравнения (рис. ЗА), которые соответствуют электрохимическим реакциям, описываемым уравнением (2). Следовательно, при потенциале Е = 0,3 В пленка существует в нейтральном состоянии II, при Е = -0,2 В пленка находится в восстановленном состоянии I, в то время как при Е - 0,9 В - в полностью окисленном состоянии

III.------------

Рассмотрим возможность

использования фотонного

преобразования трех электрохимически переключаемых редокс-функций этого неорганического полимера. На рис. ЗВ представлены спектры ППР трех редокс состояний пленки БЛ. Кривая а соответствует состоянию I, кривая Ь -состоянию II, и кривая с - состоянию 1П. Спектры характеризуются величинами минимального

резонансного угла 9 = 69,8°, 69,3° и 68,3° для кривых а, Ь и с, соответственно. Для этих трех состояний наблюдаются существенно

15» А А /

100 /\ А

50

0 ( г^С /

/ / мкА ч / \/

-50

-100 V

-150 -0 4 -Л.2 0 0.2 0.4 ПА 0.8 1

Е / В -

100 В ^^

80 \

60 ■

40

* \ \

20 с1 *

6 0 62 64 66 68 70 72 74

в / 0 - Рис.3. (А) Циклическая вольтамперограмма пленки берлинской лазури на золотом электроде, записанная в растворе 0,1 М КЖ)з, рН 7,0, скорость сканирования потенциала 100 мВхс'1. (В) Спектры ППР этой системы, записанные в 0,1 М ККОз, рН 7,0 при потенциалах, соответствующих трем состояниям: а) -0,2 В, состояние I, Ь) 0,3 В, состояние II, с) 0,9 В, состояние Ш.

различающиеся спектры ППР, и, так как редокс-состояиие не влияет на толщину пленки (см. ниже), то эти различия можно связать с изменением коэффициента преломления полимера при переходе из одного редокс-состояния в другое.

На рис. 4А (1) показана последовательность многоступенчатых хроноамперометричсских переходов, происходящих in situ в пленке БЛ при изменении потенциала на электроде, между нейтральным состоянием И, Е = 0,3 В, и восстановленным состоянием I, Е = -0,2В. Такое изменение потенциала приводит к изменению интенсивности отраженного света в спектрах ППР, полученных при фиксированной величине угла падения 0 = 69,5°, рис. 4А (2). При изменении потенциала, прилагаемого к электроду, наблюдали обратимые изменения интенсивности отраженного света. На рис. 4В (1) показана последовательность in situ хроноамперометрических переходов пленки берлинской лазури при ступенчатом изменении потенциала на электроде между Е = 0,3 В (нейтральное состояние II) и Е = 0,9 В (окисленное состояние III). Интенсивность отраженного света уменьшается с ростом количества циклов, что свидетельствует о частичной деградации системы, рис. 4В (2), связанной с окислительной деструкцией органического подслоя и десорбцией части редокс-активной пленки полимера с поверхности электрода. Действительно, уменьшение времени

20 40 60 S0 100 t/c --

Рисунок 4. Многоступенчатые хроноамперометрические импульсы, соответствующие переходам пленки БЛ между: А(1) - состояниями П и I, В(1) - состояниями III и П, С(1) - состояниями Ш и I. Стрелками показаны моменты времени, когда прикладывались окислительный (а) и восстановительный (Ь) потенциалы. В нижней части показаны изменения интенсивности отраженного света во времени, соответствующие хроноамперометрическим переходам, измеренные при фиксированном угле падения: А(2) 6^69,5°, В(2) ff=68°, С(2) #=69,5°. Все измерения проводились в растворе 0,1 M KNQ3, р№°7,0.

приложения потенциала с 10 с до 1,5 с приводит к 10 идентичным изменениям интенсивности отраженного света. Хотя в этом случае интенсивности отраженного света показывают меньшую амплитуду вследствие неполного окисления или восстановления полимера в течение полуторасекундных импульсов, электрохимическая система проявляет большую стабильность и воспроизводимость благодаря небольшим временам воздействия на органическое покрытие электрода. Система также откликается на электрохимические изменения двух крайних редокс-состояний(рис. 4С (1 и 2)): восстановленного состояния I при Е = -0,2 В и окисленного состояния III при Е = 0,9 В.

Таким образом, в представленных выше исследованиях редокс-активные пленки полианилина и БЛ использованы для получения переключаемых оптоэлектронных систем, в которых электрохимическая информация, характерная для редокс-состояний, преобразована в оптическую с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В отличие от электрохимического выходного сигнала, характерного для данных редокс-состояний БЛ и полианилина, который стирает информацию, ППР сигнал не влияет на редокс-состояние полимеров. В целом, рассмотренные примеры показывают принципиальную возможность того, что сложные, многоступенчатые редокс-преобразования могут быть использованы для создания стабильных и воспроизводимых мультипереключаемых оптоэлектронных систем.

Электрохимическое окисление NADH, индуцируемое берлинской лазурью. ППР-контроль электрохимически изменяемых редокс-состояний полимерных пленок позволяет

использовать электроды,

модифицированные такими

полимерами, в качестве сенсоров для in situ определения 1,4-дигидро-никотинамидадениндинуклеотида (NADH). Берлинская лазурь в состоянии П при Е = 0,3 В может выступать в роли электрокатализатора окисления NADH. В присутствии NADH электрод,

функционализованный БЛ в состоянии II, частично восстанавливается до состояния I. Прикладывание постоянного потенциала Е = 0,3 В к электроду позволяет пленке снова окислиться до состояния II. Принимая во внимание, что

электрокаталитическое окисление NADH происходит быстрее, чем окисление полимера из состояния I в состояние II, в пленке при этом потенциале будет существовать равновесие между состояниями I и II, контролируемое концентрацией

NADH. Такое равновесие будет существовать до тех пор, пока весь NADH в растворе не перейдет в NAD+.

Таким__образом,__при_высоких

концентрациях NADH пленка будет находиться преимущественно в состоянии I, в то время как при низких

концентрациях NADH - в состоянии II.

На рис. 5А показаны спектры ППР модифицированного берлинской лазурью электрода, к которому приложен потенциал 0,3 В, полученные в присутствии различных концентраций NADH. Очевидно, что с ростом концентрации NADH спектр ППР пленки приближается к спектру пленки, полученному для состояния I. На рис. 5В кривая а представляет собой калибровочную кривую, т.е. концентрационную (по NADH) зависимость разницы, AR, между интенсивностями отраженного света при различных концентрациях NADH, измеренными при потенциале 0,3 В и -0,2 В и постоянном значении 9 = 68,5°. Для сравнения на этом же графике приведена кривая Ь, соответствующая in situ амперометрическому отклику системы, /кэт, на электрокаталитическое окисление NADH полимером. Очевидно, что NADH можно

1>лш!| / мМ -"

Рис.5. (А) Спектры ППР пленки БЛ, измеренные: (а) при потенциале -ОД В в отсутствии ЫЛВН, (Ь-Ь) при потенциале 0,3 В в присутствии КАРН в концентрациях: (Ь) 0 М, (с) 0,5 мМ, ((1) 1,0 мМ, (е) 2,5 мМ, (0 5,0 мМ, (8) 7,5 мМ, (Ь) 10,0-мМ. (В) калибровочные кривые, соответствующие ППР - (а) и амперометрическому - (Ь). анализу ЫАРН._

анализировать амперометрически в диапазоне концентраций от 5x1 О^М до 5хЮ"3М. При концентрации ИАОН вьппе, чем 1х10'2М электрокаталитический ток в системе достигает постоянного значения, ~ 0,9 мА. ППР сенсор способен определять ЫАОН в более широком диапазоне концентраций 5x1 О^М - 1х10"2М. При более высоком содержании NADH в анализируемом растворе спектры ППР перестают зависеть от концентрации кофактора. В этих условиях пленка работает с максимальной производительностью по отношению к каталитическому окислению ЫАОН.

Разработка композиции на основе полианилина и полиакриловой кислоты для электрокаталитического окисления биологических объектов в нейтральных средах. Полианилин также окисляет ИАОН до КТАБ+ и, в принципе, мог бы быть использован для создания ППР-сенсора на КАБН, аналогично берлинской лазури. Однако известно, что полианилин проявляет свои редокс-активные свойства только в кислых средах (рН < 3), что делает невозможным его прямое использование для работы с редокс-энзимами или их кофакторами, которые обычно имеют максимальную активность в нейтральных растворах. С целью реализации такой возможности, открывающей перспективы использования полианилина в качестве электрокатализатора окисления КАБН, была создана композитная пленка путем проведения электрополимеризации анилина на золотой подложке в присутствии полиакриловой

На рис. 6 представлена циклическая вольтамперограмма полученного

полимерного слоя, записанная при рН = 7,0. Очевидно, что процесс, происходящий на модифицированном редокс-полимером золотом электроде, квази-обратим и расстояние между катодным и анодным пиками составляет 85 мВ. Далее методом ППР изучены физико-химические и оптические свойства полученной композитной пленки. Установлено, что процессы набухания и усадки и изменение оптических характеристик композита аналогичны происходящим в обычном полианилине, работающем в кислых средах. Тот факт, что при допировании полиакриловой кислотой полианилин проявляет редокс-активность в нейтральных средах, и спектры ППР такой композитной пленки существенно различаются для разных редокс-состояний, предполагает использование этого полимера в сенсорике для количественного определения кофактора ЫАОЫ оптическим методом при его электрокаталитическом преобразовании.

На рис. 7 показаны циклические вольтамперограммы электрода, покрытого композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота, записанные в присутствии различных концентраций КА13Н. Электрокаталитический анодный ток возникает при окислительном потенциале Е = 0,5 В. Ток растет с увеличением концентрации ИАЛН, что подтверждает способность композитною полимера, состоящего из полианилина и полиакриловой кислоты, окислять ИАОН.

кислоты.

Е / В --

Рис.б Циклическая вольтамперограмма золотого электрода, функционализированного композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота. 0,1 М фосфатный буфер, рН = 7,0, скорость сканирования 100 мВхс'1.__

Рис.7. Циклические вольтамперограммы золотого электрода, модифицированного композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота, в присутствии КАОН в концентрациях: (а) О М, (Ь) 10 мМ, (с) 20 мМ, (с!) 50 мМ и (е) 100 мМ. Скорость сканирования потенциала 5 мВхс"'.

И

0/° --

Рис.8. Спектры ППР золотого электрода, модифицированного композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота, в присутствии ИАОН. Спектры а-с! и а'-с1' записаны при потенциалах -0,3 В и 0,6 В, соответственно, для концентраций КАОН: (а, а') 0 М, (Ь, Ь') 5 мМ, (с, с') ю мм и (а, а1) 20 мм. _

В следующем эксперименте к электроду прикладывали

окислительный потенциал 0,6 В в присутствии различных концентраций ИАОН, который восстанавливает полианилин до (Ап)„. Очевидно, что соотношение (Ап)п/(Ап2+)„

контролируется концентрацией КАОН. В то время как в отсутствие ИАОН при этом потенциале 100 % редокс-полимера находится в окисленном состоянии (Ая2+)п, введение NADH в систему будет увеличивать содержание восстановленной формы полимера (Ап)„, причем с ростом содержания

кофактора_доля восстановленного

полианилина в смеси (Ап)„/(Ап2+)п будет возрастать.

На рис. 8 представлены спектры ППР электрода, модифицированного

композитной пленкой

полианилин/полиакриловая кислота, в отсутствии и в присутствии ЫАОН при потенциалах Е = -0,3 В и Е = 0,6 В, при которых редокс-полимер находится в восстановленном и окисленном состояниях, соответственно. При потенциале -0,3 В полимер присутствует в форме (Ап)„, и спектр, записанный в отсутствии ИАОН, представлен на рис. 8 кривой а. Добавление КАИН приводит к сдвигу резонансного угла в сторону более высоких значений. Это изменение обусловлено в основном изменением коэффициента преломления на границе раздела полимер-раствор. Математическое моделирование спектров показывает, что

РШ)Н] / мМ

Рис.9, (а) Калибровочная кривая амперометрического отклика системы, на различные концентрации ЫАОН, измеренного при потенциале 0,6 В. (Ь) Соответствующие изменения интенсивности отраженного света, ДЛ, при различных концентрациях ЫАРН._

коэффициент преломления изменяется с п = 1,338+0,008/ до п = 1,370+0,030/ при добавлении 10 мМ NADH. Изменение коэффициента преломления происходит, видимо, из-за ассоциации NADH с пленкой полимера через водородные связи. Дальнейшее добавление NADH практически не влияет на спектр ППР, наблюдается лишь незначительное повышение интенсивности отраженного света (рис. 8 кривые b-d). Приложение потенциала 0,6 В приводит к окислению полимера до (Ап2+)П. Спектр ППР в отсутствии NADH представлен на рис. 8 кривой а'. Различие между спектрами, снятыми для (Ап)„ при Е = -0,3 В, кривая а, и (Ап2+)„ при Е = 0,6 В, кривая а', возникают вследствие изменения коэффициента преломления редокс-полимера, как обсуждалось выше. Добавление NADH при Е = 0,6 В приводит к уменьшению интенсивности отраженного света, а спектр ППР занимает положение между спектрами окисленного и восстановленного полианилина. Чем выше концентрация NADH, тем сильнее спектр сдвигается в сторону спектра восстановленного полианилина, т.е. содержание последнего в равновесном отношении (Ап)„/(Ап2+)„ повышается.

На рис. 9 представлены калибровочные кривые для определения NADH in situ электрохимическими-ППР измерениями. Измерения проводили методом амперометрии (кривая а) и поверхностного плазмонного резонанса (кривая Ь). За меру отклика сенсора на различные концентрации кофактора принимали изменение интенсивности отраженного света, AR, которое определяли как разницу минимумов отраженного света, измеренных при 0,6 В и -0,3 В для каждой концентрации NADH.

Таким образом, применение ППР для контроля электрокаталитического окисления NADH пленкой берлинской лазури или композитом полианилин/полиакриловая кислота позволяет существенно расширить как фундаментальные исследования электрокаталитических реакций, так и разработку оптоэлектронных сенсорных систем.

Биосенсорные системы на основе ППР

Исследование биоэлектрокаталитического окисления глюкозы

глюкозооксидазой, иммобилизованной в композитной полимерной мембране на основе полианилина. Продемонстрированная выше на примере NADH возможность использования композитной пленки полианилин/полиакриловая кислота для электрокаталитического окисления кофактора при биологических рН была реализована при создании на основе этой полимерной пленки более сложных биоэлектрокаталитических систем с иммобилизованными

энзимами. Полимерный слой, состоящий из полианилина и полиакриловой кислоты, был активирован через ковалентную пришивку амино-флавин-аденин-динуклеотида (амино-FAD) к карбоксильным группам полиакриловой кислоты. Последующее реконструирование апоглюкозооксидазы (ano-GOx) на FAD группах (вставка нативного кофактора в структуру энзима) приводит к биоэлектрокаталитической редокс-акгивной композитной пленке на основе полианилина (схема 1). Следующие in situ эксперименты посвящены исследованию биоэлектрокаталитического окисления глюкозы композитным слоем полианилин/полиакриловая кислота/GOx. На рис. 10 представлены циклические вольтамперограммы золотого электрода, функционализированного этим композитом, в присутствии глюкозы в растворе. Очевидно, что повышение концентрации глюкозы приводит к росту электрокаталитического анодного тока. Пик электрокаталитического анодного тока проявляется при окислительном потенциале, характерном для полианилина, означая тем самым,

■ ХДн

w

Ano-GOx 1 Глюконовая Иу^ K&Sl)* кислота

Схема 1. Реконструирование глюкозооксидазы на композитной пленке полианилин/полиакриловая кислота, функционализированной кофактором FAD.

что редокс-полимер вызывает биоэлектрокаталитическое окисление глюкозы посредством окисления флавинового центра (FAD) в энзиме. Методом пьезокварцевого микровзвешивания

было определено содержание энзима в композитном слое, ЗхЮ'12 мольхсм"2. Для наивысшей плотности тока, i = 0,3 мАхсм"2, определена скорость обмена между редокс-центром энзима и электродом, которая составила ~ 1000 электронов в секунду. При температуре эксперимента Т = 30°С скорость обмена для природной глюкозооксидазы при переносе электронов от глюкозы к кислороду (природному акцептору электронов) составляет ~ 900+150 с*'. Таким образом, реконструированная на поверхности композитного полимерного слоя

полианилин/полиакриловая кислота

глюкозооксидаза показывает практически такую же скорость обмена, как и нативный энзим, означая тем самым, что рассмотренный композитный полимер, состоящий из полианилина и полиакриловой кислоты, обеспечивает высокоэффективный электрический контакт между редокс центром энзима и электродом.

В контрольном эксперименте, в котором нативная GOx была ковалентно пришита к полимерному слою полианилин/полиакриловая кислота через лизиновые группы биокатализатора (энзима) и карбоксильные группы композита, получен незначительный биоэлектрокаталитический ток окисления глюкозы, на два порядка величины меньший, чем амперометрический отклик рассмотренной выше системы с реконструированной глюкозооксидазой. Этот эксперимент показывает, что хаотичная модификация электрода энзимом не приводит к столь же эффективному электрическому контакту электрода и энзима GOx. Таким образом, мы выяснили, что только организованный дизайн композитного слоя приводит к эффективному электрическому контакту между электродом и энзимом.

На рис. 11 представлены результаты in situ электрохимических-ППР измерений. При потенциале Е = -0,3 В электрод, модифицированный композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота/FAD/GOx, имеет спектр ППР, представленный кривой а. При данном потенциале пленка композитного полимера находится в восстановленном состоянии. Добавление глюкозы к раствору электролита приводит к изменению спектра ППР пленки, связанному с восстановлением FAD-центров в глюкозооксидазе до FADH2. При этом спектр ППР практически не зависит от

Е/В --

Рис.10. Циклические вольтамперограммы энзиматического электрода, состоящего из полианилина, полиакриловой кислоты и реконструированной глюкозооксидазы, в присутствии: (а) 0 М, (Ь) 5 мМ, (с) 10 мМ, (б) 20 мМ, (е) 35 мМ и (0 50 мМ глюкозы. Скорость сканирования потенциала 5 мВхс*1._

е/°

Рис.11. Спектры ППР композитной пленки полианилин/полиакриловая кислота/РАО/ глюкозооксидаза. Спектры а^ и а'^ записаны при потенциалах -0,3 В и 0,6 В в присутствии: (а, а1) 0 М, (Ь, Ь') 5 мМ, (с, с') 10 мМ, (<1, а') 20 мМ, (е, е') 35 мМ и (£ Г) 50 мМ глюкозы._

концентрации глюкозы, что видно из рис. 11, кривые b-f. Изменение потенциала композитного электрода до Е = 0,6 В в отсутствии глюкозы приводит к спектру ППР, представленному на рис. 11 кривой а который характеризует окисленное состояние полианилина. Рост содержания глюкозы в системе при данном потенциале, Е = 0,6 В, приводит к изменению спектров ППР, рис И, кривые b '-f '. Резонансный угол сдвигается в сторону более низких значений, а интенсивность отраженного света понижается с ростом концентрации глюкозы. Очевидно, что спектры окисленного полианилина сдвигаются в сторону спектров восстановленного полианилина при увеличении концентрации глюкозы. В результате переноса электронов от восстановленного кофактора к слою окисленного полимера и далее к проводящей золотой подложке (для потенциала 0,6 В) достигается равновесное соотношение (Ап)„/(Ап2+)п. Доля восстановленного полимера расчет, так как при увеличении концентрации глюкозы повышается количество переносимых электронов от восстановленного FADH2 к Ani+.

Поскольку каждой

концентрации глюкозы соответствует воспроизводимый спектр ППР и амперометрический отклик системы, данный подход может быть использован для создания сенсора на глюкозу на основе поверхностного плазмонного резонанса. На рис. 12 показаны калибровочные кривые, полученные с помощью

электрохимических и ППР-измерений: кривая а -амперометрический отклик системы на изменение концентрации глюкозы, b - изменение интенсивности отраженного света, 4R, от концентрации глюкозы. Значения AR рассчитывали как разницу между интенсивностями отраженного света, измеренными при 0,6 В и -0,3 В для каждой концентрации глюкозы. Очевидно, что

биоэлектрокаталитический анодный ток, вызванный окислением глюкозы, линейно растет с увеличением концентрации глюкозы в диапазоне 0-100 мМ, в то время как,

значения AR уменьшаются при повышении концентрации гшокозы.__

Таким образом, in situ электрохимический-ППР метод позволяет использовать биоэлектрокаталитические функции композитного слоя, содержащего полианилин и полиакриловую кислоту с реконструированной глюкозооксидазой, для количественного амперометрического или оптического анализа глюкозы в растворе.

Исследование биоэлектрокаталитического окисления лактата. Очевидно, что аналогичный подход может быть использован и для других энзиматических систем. Среди редокс-энзимов наиболее распространены НА13(Р)+-зависимые энзимы. Использование таких энзимов в качестве биологически активных слоев в сенсорных устройствах требует интеграции биокатализатора, ЫЛО(Р)+-кофактора и кофактора, способного восстановить электрокатализатор на поверхности электрода. Кроме того, такая система должна обеспечивать надежный электрический контакт с электродом. Для реализации этих условий в работе проведена сборка МАВ+-зависимого энзиматического электрода. Последовательность сборки такой супрамолекулярной системы показана на схеме 2.

40 60

[глюкоза] / мМ-«Рис.12, (а) Калибровочная кривая амперометрического отклика системы, 1„т, измеренного при потенциале 0,6 В, на различные концентрации глюкозы. (Ь) Соответствующие изменения интенсивности отраженного света, ЛЯ. Все измерения проводились в 0,1 М фосфатном буфере, рН = 7,0._

Сначала на золотой подложке по описанной выше методике

формировали композитную пленку из полианилина и полиакриловой кислоты. Эта пленка выполняет функции редокс-активного посредника, обеспечивающего электрический контакт с золотым электродом, и матрицы, на которую прививается кофактор NAD+. Затем на функционализированной NAD+ поверхности

композитной пленки закрепляли NAD'-зависимый энзим, лактат-дегидрогеназу (LDH), используя известный факт образования между ними аффинного комплекса. Наконец, поперечной сшивкой молекул ассоциированного на поверхности энзима обеспечивали получение жесткого биокаталитического слоя.

Биокаталитическое окисление лактата в пируват в присутствии LDH вызывает восстановление КАО+-кофактора до NADH, который, в свою очередь, связан с полимерной матрицей. Окисление NADH полимером регенерирует кофактор, который в дальнейшем опять восстанавливается лактатом. Таким образом, появляется возможность

электрохимического-ППР контроля

биоэлектрокаталитического окисления лактата. Катализируемое полимером окисление NADH приводит к возникновению

электрокаталитического тока, а так как концентрация лактата контролирует скорость восстановления NADH, то амперометрический отклик системы будет являться функцией концентрации лактата. А также и равновесное соотношение (Ап)„/(Ап2+)п при потенциале окисления полианилина 0,6 В будет определяться концентрацией лактата. Поскольку, как показано выше, выходной сигнал ППР в значительной степени изменяется при переходе полианилина из окисленной формы в восстановленную и обратно, то данный метод может быть использован как основа для датчика на лактат.

Результаты in situ электрохимических-ППР измерений представлены на рис. 13. При потенциале -0,3 В композитная матрица находится в восстановленном состоянии. Добавление лактата при данном потенциале приводит к снижению интенсивности отраженного света, рис. 13. Спектр а переходит в спектр Ь. На изменения спектров практически не влияет концентрация добавленного лактата, и спектры ППР пленки при добавлении 1х 10"3 М и 2x10"2 М лактата практически идентичны. Прикладывание окислительного потенциала, Е = 0,6 В, к электроду,

Схема 2. Формирование и принцип действия энзиматического электрода, собранного путем объединения лактат-дегидрогеназы с композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота, функционализированной кофактором НАР'._

240

220

200 \\

180 d'c' I?' Я'

1» YvV. М J

R v^oVo' ' '

140

120

a—

100 ■ > ....... ........

62 64 66 68 70 72

0/° --

Рис.13. Спектры ППР энзиматического электрода

состоящего из полианилина, полиакриловой

кислоты, NAD* и лактат-дегидрогеназы. Спектры

а -е и a'-e' записаны при потенциалах -0,3 В и 0,6

В, соответственно, для концентраций лактата: (а,

а ') 0 М, (Ь, Ь') 1 мМ, (с, с') 5 мМ, (d, d') 10 мМ и

<е,е')20мМ.

модифицированному полученной композитной пленкой, в отсутствии лактата приводит к спектру ППР, представленному на рис. 13 кривой а'. Кривые Ь'-е1 показывают, что добавление лактата к системе при данном потенциале приводит к падению интенсивности отраженного света и сдвигу резонансного угла в сторону более низких значений. С повышением концентрации лактата ППР спектры все больше становятся похожими на спектры восстановленной пленки, означая тем самым, что даже несмотря на приложенный окислительный потенциал, Е = 0,6 В, композит содержит все больше восстановленного полианилина. Это подтверждает биокаталитический механизм окисления лактата, при котором слой полианилина выступает как посредник при переносе электронов от иммобилизованного NADH к проводящей подложке электрода. Таким образом, увеличение концентрации лактата повышает скорость образования NADH. В результате, при повышении концентрации лактата содержание восстановленного полианилина в равновесном соотношении (Лп)„/(Ап2+)п также

спектров ППР. Так же как для системы с реконструированной глюкозооксидазой, в данном случае каждой концентрации лактата соответствует воспроизводимый спектр ППР и амперометрический отклик системы. Поэтому данный подход был использован для создания сенсора на лактат на основе поверхностного плазменного

резонанса. На рис. 14 приведены калибровочные кривые, полученные из электрохимических-ППР

измерений. Очевидно, что биоэлектрокаталитический анодный ток, вызванный окислением глюкозы, линейно растет с увеличением концентрации лактата в диапазоне 0 -100 мМ, в то время как значения AR уменьшаются с ростом концентрации лактата.

Таким образом, in situ электрохимический-ППР метод позволяет использовать

биоэлектрокагалитические функции композитной матрицы, состоящей из полианилина, полиакриловой кислоты, NAD+ и лактат-дегидрогеназы,- для -оптического контроля биоэлектрокаталитического окисления лактата, а также для количественного анализа лактата в растворе.

Исследование биоэлектрокаталитического окисления глюкозы глюкозо-дегидрогеназой, иммобилизованной в композитной полимерной мембране на основе полианилина. Пирролохинолин хинон (РС?<2)-зависимые энзимы представляют также обширный класс редокс-энзимов, однако, до сих пор они не получили широкого распространения для использования в биосенсорах. До настоящего времени все попытки создать электрически контактирующий энзиматический электрод поверхностным реконструированием глюкозо-дегидрогеназы (GDH) на монослое PQQ кофактора не принесли успеха, несмотря на то, что пленка энзима существовала в биологически активной форме.В настоящей работе преде гавлены результаты создания электрического контакта между PQQ-зависимой глюкозо-дегидрогеназой (GDH) и золотым электродом путем реконструирования

повышается, что приводит к наблюдаемым изменениям

0 20 40 60

[лактат] / мм->-

Рис.14, (а) Калибровочная кривая амперомегрического отклика системы, 1мг, измеренного при потенциале 0,6 В, на различные концентрации лактата. (Ь) Соответствующие изменения интенсивности отраженного света, ЛИ, при различных концентрациях лактата._

ano-GDH на полианилиновой пленке, функционализированной PQQ-кофактором и ассоциированной на золотом электроде.

Композитная пленка, состоящая из полианилина и полиакриловой кислоты, была приготовлена по описанной выше методике, после чего ее модифицировали 1,4-диаминобутаном и далее пирролохинолин хиноном. Затем апо-глюкозо-дегидрогеназа (ano-GDH) была реконструирована на группах пирролохинолин хинона, связанного с полимерной матрицей. Аналогично проведенным выше исследованиям полученная система была охарактеризована in situ электрохимическими-ППР измерениями. Циклические вольтамперограммы золотого электрода, модифицированного этой матрицей, обнаруживают амперометрический отклик системы на различные концентрации глюкозы. Электрокаталитический анодный ток наблюдается при потенциале окисления полианилина, означая тем самым, что редокс полимер вызывает электрокаталитическое окисление PQQ и, соответственно, биоэлектрокаталитическое окисление глюкозы. Исследования методом ППР показали, что, как и в описанных выше экспериментах, увеличение концентрации глюкозы в системе, в то время как к электроду приложен окислительный потенциал, приводит к сдвигу спектров ППР окисленного полианилина в сторону спектров восстановленного полимера. Это согласуется с тем фактом, что в присутствии глюкозы биокаталитическая реакция, вызываемая глюкозо-дегидрогеназой, приводит к частичному восстановлению полианилиновой пленки и, соответственно, к образованию равновесия между окисленным и восстановленным состояниями полианилина. При увеличении концентрации глюкозы равновесное содержание восстановленного полианилина в пленке повышается.

По результатам in situ электрохимических-ППР экспериментов построены калибровочные графики зависимости электрокаталитического тока и оптического отклика системы от концентрации глюкозы. Таким образом, впервые показана принципиальная возможность создания композитного энзиматического электрода, в котором PQQ-зависимая глюкозо-дегидрогеназа непосредственно контактирует с электродом. In situ электрохимический-ППР метод позволяет использовать биоэлектрокаталитические функции полученной системы для оптического контроля окисления глюкозы, а также для количественного анализа глюкозы в растворе.

Молекулярный импрннтинг как новый способ формирования селективных отпечатков для определения субстратов методом поверхностного плазменного резонанса.

Исследования ферментативных реакций с участием NADH (1,4-дигидро-р-никотинамид-аденин-динуклеотид) и NADPH (1,4-дигидро-Р-никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат), а также их окисленных форм, NAD+ и NADP+, соответственно, (рис.15) занимают одно из

Чаще всего количественный анализ одной из форм этих кофакторов проводят

электрохимическими методами. Однако, например, при амперометрическом анализе ЫАО(Р)+ происходит

необратимое электрохимическое восстановление этих

соединений, сопровождаемое высокими перенапряжениями, в результате чего образуется биологически неактивный димер. Кроме того до сих пор не разработаны методы для селективного определения ИАО+ в присутствии КАОР+ или

ведущих мест в биохимии и биоэлектрохимии.

н н он но О-

У*

_о о оф

он он

nh2 н н

OHHOI

■оч

NAD

,0 йь

-fo-P-o-iHnH

NADH

nh2

н н он но .1-0-

NHa

о О СО

NADP+

JH о

■o-i=o он

" 0 CO

NADPH

НГ [H

1H 0 -O-i.O 6H

Рис.15. Структура кофакторов NAD*, NADP*, NADH и NADPH

селективного анализа NADH в присутствии NADPH и наоборот. Предлагаемый в настоящей работе новый альтернативный неэлектрохимический способ определения NAD(P)+ и NAD(P)H основан па принципе молекулярного импринтинга, который лишь в последние годы начал использоваться для идентификации и количественного определения веществ.

Метод основан на формировании смеси из мономеров и импринтируемого соединения (в последующем - оно же: аналит, субстрат), способного образовывать со специально подобранными функциональными группами мономера комплексы. После сополимеризации функциональных мономеров импринтируемое соединение удаляется из матрицы, в которой остаются полости (отпечатки), способные селективно связывать только это соединение. Однако основная сложность при использовании импринтированных полимеров в качестве активных компонентов сенсорных устройств заключается в связывании сенсорной мембраны с электронным преобразователем. Обычно органические импринтированные полимеры имеют относительно большую толщину, в результате чего активные центры испытывают недостаток прямого электрического сообщения с преобразователем. Поэтому для регистрации аналитов в большинстве сенсорных устройств, основанных на импринтированных полимерах, используются либо оптические эффекты, либо микрогравиметрический анализ.

Для формирования импринтированных кофакторами NAD(P)H и NAD(P)+ матриц мы использовали сополимеры акриламидофенилборной кислоты. На данный момент имеются лишь единичные работы, посвященные использованию ППР для анализа ассоциации субстрата с импринтированными полимерами. В этих работах исследовалось изменение спектров ППР за счет изменений массы при связывании субстрата с полимером. Эти изменения очень малы, особенно для низкомолекулярных субстратов, что приводит к слабому отклику, и, соответственно, возможность аналитического применения таких сенсоров сильно ограничена. Поэтому нами были выбраны такие полимеры, которые подвержены набуханию при связывании субстрата, что приводит к значительным изменениям коэффициента преломления у поверхносги сенсора. Это позволяет повысить эффективность применения спектроскопии ППР для изучения ассоциации субстрата с импринтированными полимерами и создания сенсоров на их основе.

В качестве полимерной матрицы был использован сополимер на основе акриламида и акриламидофенилборной кислоты с умеренным содержанием сшивающего агента, hTN-метиленбисакриламида, что делает полимерную матрицу достаточно жесткой и в то же время не исключает ее набухание и усадку. Каждый из окисленных (NAD или NADP+) и восстановленных (NADH или NADPH) кофакторов был импринтирован в сополимер, нанесенный на покрытую золотом стеклянную подложку. Так как кофакторы NAD(P)+ и NAD(P)H содержат рибозные группы, то они способны образовывать комплекс с акриламидофенилборной кислотой. Лиганды борной кислоты сильно и обратимо связывают 1,2-диолы, Это комплексообразование, усиленное водородными связями между функциональными группами кофактора и мономера, приводит к образованию

импринтированной—кофактором—полимерной матрицы__Для _ улучшения адгезии пленки

импринтированного полимера с покрытой золотом стеклянной подложкой поверхность металла сначала бьша модифицирована монослоем цистамина, а затем к поверхности монослоя была ковалентно пришита акриловая кислота. Далее акриловые группы вводились в реакцию радикальной полимеризации с растворенными мономерами, что приводило к образованию сшитой пленки сополимера. После удаления кофактора 1 % раствором NH3 в сополимере оставались импринтированные полости, комплементарные этому кофактору. Очевидно, что как геометрия полости, так и аранжировка функциональных групп на периферии ее импринтированного молекулярного контура (радикалы борной кислоты, амидные группы и т.д.) будут хранить память о характеристиках соответствующего окисленного или восстановленного кофактора и в последующем осуществлять его селективное связывание.

На рисунке 16

NAD* 103 М

NAD' 0.0 М

представлены спектры ППР полимера, импринтированного NAD+, в отсутствии NAD+, кривая (а), и после обработки lxlO"3 М раствором NAD1", кривая (Ь). Видно, что при связывании кофактора угол минимального отражения сдвигается в сторону более низких значений. В контрольном эксперименте

пленка сополимера акриламид-акриламидофенилборная кислота

матрицы из сополимера акриламид-акриламидофенилборная кислота, записанные: (а) после удаления молекул субстрата из матрицы и (Ь) после обработки матрицы раствором, содержащим lxlO"3 М NAD'._

64

66

68

была залолимеризована в отсутствии кофактора NAD+. В процессе обработки такой неимпринтированной пленки lxlO"3 М раствором NAD+ не произошло заметного изменения спектра ППР пленки. Данный

контрольный эксперимент наглядно демонстрирует отсутствие неспецифического связывания NAD+ с полимером. Таким образом, изменение спектра ППР при взаимодействии с NAD+ происходит вследствие специфической ассоциации окисленного кофактора с импринтированными полостями. Математическое моделирование спектра ППР пленки сополимера с NAD+ (кривая Ь) на основе формализма Френеля для пятифазных систем с использованием алгоритма минимизации Нелдера-Мида показало, что коэффициент преломления полимера уменьшается по мере ассоциации NAD+ с 1,45 до 1,40, а толщина пленки (22 нм) увеличивается на 5 нм в результате набухания полимера. Изменения спектров ППР импринтированного полимера контролируются объемной концентрацией NAD+ в растворе.

Полимерная пленка, импринтированная NAD+, проявляет высокую селективность при анализе импринтированного кофактора. Рисунок 17 демонстрирует возможности метода ППР для анализа различных концентраций четырех окисленных и восстановленных кофакторов пленкой, импринтированной NAD+. Сенсограмма (рис. 17) представляет собой зависимость угла минимального отражения в спектре ППР от времени контакта датчика с раствором аналита. В этом эксперименте пленка, импринтированная NAD+, сначала была обработана растворами с различной концентрацией этого кофактора. Очевидно, что с повышением объемной концентрации NAD+ угол минимального отражения уменьшается, и нижний предел обнаружения NAD этой системой составляет lxlO"6 М. При связывании субстрата с импринтированной матрицей на изменение спектра ППР будут влиять два процесса: увеличение массы вследствие ассоциации NAD+ на чувствительной поверхности и уменьшение коэффициента преломления чувствительной среды вследствие набухания полимера водой, так как коэффициент преломления воды, п =1,33, существенно ниже коэффициента преломления полимера, ni = 1,45. Увеличение массы полимера должно приводить к увеличению угла минимального отражения спектра ППР, в то время как понижение коэффициента преломления пленки будет уменьшать угол минимального отражения. В эксперименте по связыванию NAD+ с импринтированными полостями наблюдается сдвиг угла минимального отражения в сторону более низких значений. Это означает, что на спектры ППР в основном влияют изменения коэффициента преломления полимера, обусловленные его набуханием. После завершения цикла анализа NAD+ пленку промывали водой. Очевидно, что связанный NAD+ полностью вымывается, так как значения угла минимального отражения пленки после отмывки возвращаются к значениям резонансного угла до обработки NAD+.

концентрации ЫАЭН (1х10"6 М - 1 х 10"3 М). Наблюдались лишь небольшие изменения угла минимального отражения. Аналогично, после отмывания ИАО1 -импринтированной пленки от ОДРН ее обработка растворами с различным содержанием кофакторов ИАОР+ и ИАОРН не привела к сколько-нибудь значительным изменениям угла минимального отражения спектров ППР полимера. Для определения полноты регенерации и сохранения у МАЬ+-импринтированной пленки высокой чувствительности и селективности к НАБ+ данная система, использованная для анализа ЫАОН, ЫАОР+ и ИАОРН, затем снова применялась для анализа различных концентраций ИАО+ (рис. 17, е). Очевидно, что изменения резонансного угла спектров ППР пленки при обработке растворами с различным содержанием ИЛЕ)* воспроизводимы и аналогичны изменениям при первом цикле анализа КАП'. Результаты показывают, что МАО'-имцринтированный полимер проявляет селективность к импринтируемому веществу в присутствии окисленного кофактора ЫАЭР+ и восстановленных ----кофакторов ЫА1)Н и 1ЯАОРН_______

На рисунке 18 показаны калибровочные кривые сенсоров, соответствующие изменениям углов минимального отражения КАО+-импринтированной пленки при определениях различных кофакторов. Очевидно, что в диапазоне концентраций кофактора 1x10"5 - 1x10"3 М определение ЫАО+ предложенным способом может быть осуществлено селективно.

Аналогичные результаты были получены при импринтировании полимерной матрицы, состоящей из акриламида и акриламидофенилборной кислоты, окисленным кофактором ИАОР+ и восстановленными кофакторами КАБН и КАОРН. Каждый кофактор может быть селективно определен соответствующей импринтированной матрицей из смеси структурно очень близких соединений, что свидетельствует о принципиальной возможности создания высокоселективных оптических сенсоров на основе имнринтированных полимеров на кофакторы ИАО1, ЫАОН ИАОР+ и ИАБРН.

NADH-импринтированная пленка была также использована для анализа биокаталитического процесса окисления лактата в пируват кофактором NAD+ в присутствии лактат-дегидрогеназы. NADH,

образующийся в процессе биокаталитической реакции,

связывается с пленкой,

импринтированной NADH, что приводит к ее набуханию вследствие захвата молекул воды.

Эффективность определения

импринтированной мембраной

кофактора NADH в отсутствие каких-либо добавок демонстрирует рисунок 19, участок а. При обработке NADH-импринтированной пленки 1x10"3 М раствором NADH угол минимального отражения изменяется на 8,2 угловые минуты. Отмывка полимера водой приводит к его полной регенерации (точка X). В точке Y на участке b датчик был помещен в раствор, содержащий 0,1 мкг/мл LDH и lxlO'3 М NAD+. Видно, что в этом случае наблюдается лишь незначительное изменение резонансного угла. После стабилизации сигнала (точка Z) в раствор был добавлен лактат (1x10"2 М). Резкое изменение сигнала указывает на связывание NADH, образующегося в ходе биокаталитического процесса, с NADH-импринтированным полимером. Проведенные контрольные эксперименты показали, что добавление только лишь лактата к системе не приводит к изменению угла минимального отражения полимера. Следовательно, наблюдаемые изменения угла минимального отражения происходят исключительно вследствие биокаталитического образования NADH. Как отмечалось выше, уменьшение величины резонансного угла обусловлено поглощением воды, и, соответственно, уменьшением коэффициента преломления полимера. При этом величина изменения резонансного угла, Д0тт = 7,9', аналогична величине изменения этого сигнала, полученной при определении чистого NADH (участок а, рис.19). Это согласуется с тем фактом, что концентрация NAD+ в системе составляет lxlO"3 М, в то время как концентрация лактата в 10 раз больше, 1x10'2 М, и, следовательно, окисленный кофактор полностью переходит в восстановленную форму, NADH, что и определяется функциональной мембраной. Анализ кинетической кривой, показанной на вставке к рисунку 19, позволил определить реакцию окисления лактата кофактором NAD+ в присутствии LDH как реакцию первого порядка с константой скорости к = З,2х10"3 с"1.

Таким образом, проведено специфическое импринтирование полостей для молекулярного распознавания кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH в пленку сополимера акриламид-акриламидофенилборная кислота и продемонстрирована эффективность использования спектроскопии ППР как инструментария для контроля распознавания этих кофакторов пленками импринтированных полимеров. Показано, что метод ППР с импринтированными мембранами позволяет определять импринтируемое вещество с высокой селективностью на фоне структурно очень близких соединений. Также NADH-импринтированная пленка использована для изучения методом ППР кинетики биокаталитического окисления лактата МАО+-зависимой лактат-дегидрогеназой. Применение ППР для регистрации выходного оптического сигнала, индуцируемого ассоциацией субстрата с импринтированными полостями, открывает перспективы создания супрамолекулярных аналитических устройств с улучшенными характеристиками.

а ° __О С)

-»-х* -Мс)

1* 2

ч & ■* ■■ —• (b)

L -

в \(а)

7 в S 4 3

- Lg (С , М)

Рис.18. Отклик ППР-сенсора на основе мембраны, импринтированной NAD+, на концентрации растворов кофакторов: (a) NAD4 (с) NADP* и (d) NADPH. полимерной изменение , (b) NADH,

4183,3

4175,0

4166,7

4158,3

4150,0

J 4141,7

4133,3 -

10000

¡5 4158 J

? 4156.7

4153,0

4153,3

е

4151,7

J 4150 Д)

41484

LDH g.l pr/мл NAD^IO"3 M шт 10 1M

29500 ЭОООО 30S00 31000 31500 32000 Э2500 время, с

20000

30000

40000

время, с

Рис.19. Сенсограмма ППР дня датчика на основе NADH-импринтированного полимера, соответствующая: (а) анализу NADH, (Ь) анализу биокаталитического окисления лакгата в присутствии NAD* и LDH. На вставке показана увеличенная временная зависимость ППР-сигнапа датчика в присутствии лактата (1 х 10"2 М), LDH (1 х 107 гхмл"1) и NAD* (1 х 10"3 М)._

ВЫВОДЫ

1. Методом ППР изучено влияние процессов окисления-восстановления на изменение оптических и физико-химических характеристик ультратонких пленок полианилина. Определена кинетика набухания и усадки полимера при электрохимическом переключении и проведена оценка кинетических констант этих процессов. Показано, что метод ППР обеспечивает надежную регистрацию выходного сигнала редокс-состояний электрохимически активируемого полимера (полианилина).

2. Предложен способ формирования мультистабильной пленки берлинской лазури на поверхности золота путем функционализадии электрода меркаптопропионовой кислотой. Методом ППР изучено оптическое преобразование электрохимической информации, характерной для трех редокс-состояний берлинской лазури и показано, что эти системы могут бьгть использованы для создания мультистабильных элементов молекулярной памяти^

3. Методом ППР изучены процессы электрокаталитического окисления ^ОН такими редокс-полимерами, как берлинская лазурь и полианилин. Показано, что вследствие существенного различия спектров ППР полимеров, находящихся в разных редокс-состояниях, эти пленки имеют перспективы использования в сенсорике для определения концентрации кофактора при его электрокаталитическом преобразовании.

4. С целью получения редокс-активных элементов сенсоров на основе полианилина, пригодных для функционирования в нейтральных средах, разработан электрохимический метод синтеза композитной пленки, состоящей из полианилина и полиакриловой кислоты. Методом ППР изучены физико-химические, оптические и редокс-свойства полученной композитной пленки на золотой подложке. Определены кинетические константы процессов набухания и усадки. Показано, что данную систему можно использовать для разработки электрохимически переключаемых молекулярных машин.

5. Получена биоэлектрокаталитическая редокс-активная композитная пленка на основе полианилина. Оптимизирован ее электрический контакт с электродом путем реконструирования апоглюкозооксидазы на FAD-кофакторе, ковалентно пришитом к полимеру. Проведена оценка плотности заполнения поверхности композитного полимерного электрода кофактором FAD и реконструированной глюкозооксидазой. Установлено, что реконструированная глюкозооксидаза обладает такой же высокой скоростью электронного обмена, как и нативный энзим, т.е. организованный дизайн композитного слоя обеспечивает высокоэффективный электрический контакт между энзимом и электродом. Показано, что комбинация электрохимического метода и спектроскопии ППР позволяет использовать биоэлектрокаталитические функции композитного слоя для количественного анализа глюкозы в растворе.

6. Предложен способ формирования энзиматического электрода, в котором полианилин выступает в качестве посредника переноса электронов между NAD-зависимой лактат-дегидрогеназой и подложкой электрода. Методом ППР изучено биоэлектрокаталитическое окисление лактата синтезированной матрицей. Поскольку выходной сигнал ППР в значительной степени изменяется при переходе полианилина из окисленной формы в восстановленную и обратно, то в комбинации с электрохимическими методами спектроскопия ППР может бьггь использована как основа для датчика на лактат.

7. Впервые показана принципиальная возможность создания электрического контакта между PQQ-зависимой глюкозо-дегидрогеназой и золотым электродом путем реконструирования апо-GDH на полианилиновой пленке, функционализированной PQQ-кофактором. Изучены электрохимические и оптические свойства этой биоэлектрокаталитической системы in situ. Дана оценка поверхностного заполнения композитного электрода PQQ-кофактором и реконструированной глюкозо-дегидрогеназой. Показана возможность использования биоэлектрокаталитических функций полученной системы для количественного анализа глюкозы в растворе методом ППР.

8. Предложен новый неэлекгрохимический способ селективного определения редокс-кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH, основанный на принципе молекулярного импринтинга. Разработан метод создания импринтированной полимерной матрицы, оптимизированной для исследования с помощью спектроскопии ППР.

9. Проведено специфическое импринтирование полостей в пленку сополимера акриламида и акриламидофенилборной кислоты для молекулярного распознавания кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH. Продемонстрирована эффективность использования спектроскопии ППР в качестве метода контроля связывания этих кофакторов с пленками импринтированных полимеров. Показано, что метод ППР в сочетании с импринтированными мембранами обладает высокой селективностью при определении импринтируемого вещества из его смеси с химически и структурно близкими соединениями.

10. С помощью ППР проведено исследование биокаталитического процесса окисления лактата в пируват кофактором NAD+ в присутствии лактат-дегидрогеназы. Показано, что использование NADH-импринтированной пленки и спектроскопии ППР для контроля кинетики этого процесса открывает новые возможности для изучения биокаталитических реакций с участием NAD(P)+ и NAD(P)H оптическими методами.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. V. Chegel, О. Raitman, Е. Katz, R. Gabai and I. Willner "Photonic transduction of electrochemically-triggered redox-functions of polyaniline films using surface plasmon resonance spectroscopy"// Chem. Commun., 2001, P.883-884

2. O. A. Raitman, E. Katz, I. Willner, V. I. Chegel, and G. V. Popova "Photonic Transduction of a Three-State Electronic Memory and of Electrochemical Sensing of NADH by Using Surface Plasmon Resonance Spectroscopy"// Angew. Chem. Int. Ed. 2001,40, No. 19, P.3649-3652

3. O. A. Raitman, E. Katz, A. F. Buckmann, and I. Willner "Integration of Polyaniline/Poly(acrylic acid) Films and Redox Enzymes on Electrode Supports: An in situ Electrochemical/Surface

Plasmon Resonance Study of the Bioelectrocatalyzed Oxidation of Glucose or Lactate in the Integrated Bioelectrocatalytic Systems"//J. Am. Chem. Soc. 2002,124, P.6487-6496

4. O. Raitman, F. Patolsky, E. Katz and I. Willner "Electrical Contacting of Glucose Dehydrogenase by the Reconstitution of a Pyrroloquinoline Quinone-Functionalized Polyaniline Film Associated with an Au-Electrode: An in situ SPR-Electrochemical Study"// Chem. Commun, 2002, P.1936-1937

5. V. Chegel, O. A. Raitman, O. Lioubashevski, Y. Shirshov, E. Katz and I. Willner "Redox-Switching of Electrorefractive, Electrochromic and Conductivity Functions of Cu2+/Polyacrylic Acid Films Associated with Electrodes"// Adv. Mater., 2002, 14, No.21, P. 1549-1553

6. M. Zayats, O. A. Raitman, V. I. Chegel, A. B. Kharitonov, and I. Willner "Probing Antigen-Antibody Binding Processes by Impedance Measurements on Ion-Sensitive Field-Effect Transistor Devices and Complementary Surface Plasmon Resonance Analyses: Developing of Cholera Toxin Sensors"// Analytical Chemistiy, 2002, Vol.74, No.l 8, P.4763-4773

7. О. А. Райтман, В. В. Арсланов, С. П. Погорелова, А. Б. Харитонов "Полимеры с молекулярными отпечатками для определения кофактора NADH: метод поверхностного плазмонного резонанса"// ДАН, 2003, Т.392, N.4, С.256-258

8. О. А. Райтман, В. В. Арсланов, А. Б. Харитонов "Использование молекулярно имприн тированных полимеров для определения NADH методом поверхностного плазмонного резонанса"// Сб. ст. "Структура и динамика молекулярных систем", Вьт.Х, Т.1, КГУ, Казань-Йошкар-Ола-Москва, 2003, С.180-184

9. О. А. Райтман, В. В. Арсланов "Оптическое преобразование электрохимических свойств берлинской лазури для разработки систем электронной памяти с использованием спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса"// Сб. ст. "Структура и динамика молекулярных систем", Вып.Х, Т.1, КГУ, Казань-Йошкар-Ола-Москва, 2003, С.363-367

10. О. A. Raitman, Е. Katz, A. F. Buckmann, and I. Willner "Integration of Polyaniline/Poly(acrylic acid) Films and Redox Enzymes on Electrode Supports: An in situ Electrochemical/Surface Plasmon Resonance Study of the Bioelectrocatalyzed Oxidation of Glucose or Lactate in the Integrated Bioelectrocatalytic Systems"// Second International Symposium "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures", 2002, Kazan, P.48.

11. A.B. Kharitonov^ S.P. Pogorelova, T Bourenko, O.A. Raitman, M. Zayats. I. Willner "Use of moleculary imprinted acrylamide-acrylamydophenylboronic acid co-polymer in development of sensors for diols"// Second International Workshop on Molecularly Imprinted Polymers, 2002, La Grande Motte, France, P.42.

12. O. A. Raitman, E. Katz, A. F. Buckmann, and I. Willner "An In Situ Electrochemical/Surface Plasmon Resonance Study of the Bioelectrocatalyzed Oxidation of Glucose or Lactate in the Integrated Bioelectrocatalytic Systems"// XVI European Chemistry at Interfaces Conference, 2003, Vladimir, P.54.

Заказ _Объем п. л._Тираж 100 экя.

Издательский центр РХТУ им. Д. И. Менделеева

12147 а

ЬоЯ

i 4

) 1

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Устройства молекулярной памяти и контроля в растворах и на поверхностях

1.1.1. Введение

1.1.1.1. Требования к молекулярным информационным устройствам

1.1.1.2. Проблемы создания молекулярных информационных устройств

1.1.2. Молекулярные устройства в растворах и на поверхности 12 1.1.2.1 Реализация информационных функций при связывании

1.1.2.2. Молекулярные структуры с функциями механического переключения

1.1.2.3. Иммобилизованные молекулярные оптоэлектронные структуры 17 1.1.2.4 Механические переключения в молекулярных системах, закрепленных на поверхности

1.1.3. Выводы и перспективы '

1.2. Опосредованный перенос электронов между редокс-энзимами и подложками электродов

1.2.1. Введение

1.2.2. Перенос электронов диффузионными посредниками

1.2.2.1. Активация энзимов диффузионными посредниками в растворах

1.2.2.2. Монослойные и многослойные энзиматические электроды, активируемые диффузионными посредниками

1.2.2.3. Иммобилизованные в полимерные или неорганические матрицы энзимы, активируемые диффузионными посредниками

1.2.3. Реализация электрического контакта между растворенными энзимами и электродами, функционализированными посредниками

1.2.4. Электрическое контактирование с электродами растворенных энзимов, модифицированных посредниками

1.2.4.1. Функционализация редокс-энзимов посредниками переноса электронов в растворах

1.2.4.2. Монослойные и многослойные архитектуры на электродах, содержащие энзимы, функционализированные посредниками переноса электронов

1.2.5. Композитные полимерные и неорганические матрицы на электродах, содержащие энзимы и посредники

1.2.5.1. Функционализированные посредниками полимерно-энзиматические матрицы

1.2.5.2. Функционализированные посредниками золь-гелевые матрицы с иммобилизованными энзимами

1.2.5.3. Функционализированные посредниками композитные графитовые пасты, содержащие иммобилизованные энзимы

1.2.6. Оптимизация электрического контакта энзимов с электродом с помощью функционализированного посредником кофактора

1.2.6.1. Реконструирование апо-флавоэнзимов FAD-кофакторами с ко валентно пришитыми переносчиками электронов

1.2.6.2. Поверхностное реконструирование апо-флавоэнзимов на электродах, последовательно модифицированных переносчиком и FAD

1.2.7. Реализация электрического контакта NAD(P)+-3aBHCHMbix энзимов

1.2.7.1. Электрохимическая регенерация кофакторов NAD(P)+

1.2.7.2. Электрохимическая регенерация кофакторов NAD(P)H

1.2.7.3. Ассоциация NAD(P)+-3aBHCHMbix энзимов с NAD(P)+-koфакторами 42,

1.2.8. Применение энзимов, электрический контакт которых с электродом реализуется с помощью посредников переноса электронов

1.2.9. Выводы и перспективы

1.3. Молекулярный импринтинг в аналитической химии

1.3.1. Введение

1.3.2. Основные принципы молекулярного импринтинга

1.3.3. Аналиты

1.3.4. Импринтированные матрицы

1.3.5. Физические формы МИП и новые методы их приготовления

1.3.6. Применение молекулярно импринтированных полимеров в аналитической химии

1.3.6.1. Разделение и анализ

1.3.6.2. Сенсоры

1.3.7. Выводы и перспективы

1.4 Исследование супрамолекулярных систем методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса

1.4.1. Введение

1.4.2. Теоретическое обоснование ППР

1.4.3. Применение ППР для решения фундаментальных и практических задач

1.4.4. Выводы и перспективы

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Ультратонкие пленки полианилина

2.1.3. Модификация золотой поверхности мультистабильными пленками берлинской лазури.

2.1.4. Композитные пленки на основе полианилина и полиакриловой кислоты

2.1.5. Реконструирование глюкозооксидазы на композитной пленке полианилин/полиакриловая кислота, функционализированной кофактором FAD

2.1.6. Формирование энзиматического электрода, содержащего NAD-зависимый энзим лактат-дегидрогеназу

2.1.7. Реконструирование глюкозо-дегидрогеназы на композитной пленке полианилин/полиакриловая кислота, функционализированной кофактором PQQ 60 Синтез импринтированных кофакторами полимерных мембран на основе фенилборной кислоты и акриламидных мономеров

2.2. Методы исследования

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Полимерные пленочные сенсорные системы на основе поверхностного плазмонного резонанса

3.1.1. Оптический контроль электрохимических преобразований редокс-активных пленок полианилина

3.1.2. Исследование оптического отклика на электрохимическое переключение в мультистабильных пленках берлинской лазури для разработки систем электронной памяти

3.1.3. Мультистабильные пленочные ППР-сенсоры для определения кофактора NADH

3.1.3.1. Электрохимическое окисление NADH, индуцируемое берлинской лазурью

3.1.3.2. Разработка композиции на основе полианилина и полиакриловой кислоты для электрокаталитического окисления биологических объектов в нейтральных средах

3.2. Биосенсорные системы на основе ППР

3.2.1. Исследование биоэлектрокаталитического окисления глюкозы глюкозооксидазой, иммобилизованной в композитной полимерной мембране на основе полианилина

3.2.2. Исследование биоэлектрокаталитического окисления лактата

3.2.3. Исследование биоэлектрокаталитического окисления глюкозы глюкозо-дегидрогеназой, ассоциированной с полианилиновой пленкой через пирролохинолин хинон

3.3. Молекулярный импринтинг как новый способ формирования селективных матриц для определения субстратов методом поверхностного плазмонного резонанса

3.3.1. Получение импринтированных кофакторами полимерных мембран на основе фенилборной кислоты и акриламидных мономеров

3.3.2. Определение кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH сенсорными системами на основе молекулярно импринтированных полимеров и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса

3.3.3. Мониторинг биокаталитического окисления лактата кофактором NAD+ с использованием NADH-импринтированного полимера и спектроскопии

ВЫВОДЫ

Актуальность проблемы. Создание компактных организованных молекулярно-механических, информационных и сенсорных систем в настоящее время является одной из главных задач супрамолекулярной химии. Интерес к таким системам обусловлен потребностью в разработке молекулярных компьютеров и механизмов (приводы, моторы), химических сенсоров для анализа состава различных сред, а также моделей биологических объектов, в которых осуществляются процессы распознавания и мембранного транспорта. В таких устройствах электронная запись, хранение, передача и стирание информации должны быть реализованы на уровне одной молекулы или супрамолекулярного ансамбля. Однако платой за стремление к миниатюризации устройств являются затраты на преодоление фундаментальных и практических проблем, обусловленных необходимостью ввода и вывода сигналов на уровне молекулярных объектов. Иными словами, механические и логические функции создаваемых структур должны бьггь не только контролируемы, но также обладать способностью к передаче выходного результата к другому компоненту. Важной составляющей этой проблемы является необходимость управления и, что не менее важно, мониторинга сборки сложных молекулярных агрегатов, способных выполнять заданные физические функции. Разработка методик, позволяющих осуществлять такое управление и интеграцию, может обеспечить реализацию ожиданий мирового сообщества в получении дешевых, мощных и ультра-миниатюрных приборов для вычислительной техники, оптоэлектроники, медицины и др.

Супрамолекулярные взаимодействия между различными молекулами в растворах и на поверхности могут быть использованы для образования сложных многокомпонентных систем. При современном уровне органической химии, способном предложить пути для сложных синтезов, и современной технологии, обеспечивающей средства для структурирования на субмикронном уровне, становится возможным проводить исследования в этом направлении. Однако для исследования и использования таких систем требуется создание новых методов анализа, отличающихся низким пределом обнаружения, высокой селективностью и экспрессностью, возможностью использования их "вне лаборатории" (on-site и on-line системы).

Одним из таких новых методов для изучения поведения супрамолекулярных систем является спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (ППР), обладающая несомненными преимуществами перед громоздкими и сложными спектрометрами, проведение одного эксперимента на которых занимает довольно продолжительное время. Возможность спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса in situ оценивать оптические константы, геометрию тонких пленок и некоторые другие физические характеристики иммобилизованных на поверхности веществ предполагает использование этого метода в качестве средства контроля за механическими и информационными функциями молекулярных машин. Также пристальное внимание привлекает поверхностный плазмонный резонанс в комбинации с электрохимическими измерениями. При такой комбинации открываются широкие возможности для изучения биоэлектрокаталитических свойств энзиматических электродов и создания новых оптических биосенсоров на их основе. Кроме того, одним из перспективных, но еще не достаточно освоенных направлений, является использование спектроскопии ППР для создания оптических сенсоров на основе молекулярно импринтированных полимеров.

В последние годы много исследований посвящено разработке электронных устройств на основе ультратонких пленок, обладающих новыми электрическими и оптическими свойствами. В этом отношении большое внимание уделяется проводящим полимерам, а также их сополимерам и композитным системам на их основе. Среди проводящих полимеров полианилин занимает важное место благодаря высокой химической стабильности как на воздухе, так и в воде, легкости перехода между редокс-состояниями, возможности использования при создании химических и биологических сенсоров, электрохромных экранов, фотоэлементов, батарей и др. При допировании полианилина протонными кислотами появляется возможность создания композитных матриц на основе этого полимера, в которые можно встраивать такие жизненно важные энзимы, как глюкозооксидазу или лактат-дегидрогеназу. Непроводящие, но меняющие свои физико-химические свойства полимеры, также представляют большой интерес, так как позволяют создавать управляемые мониторинговые системы, химические и биохимические оптические сенсоры, транспортные мембраны.

Целью работы является создание интегрированных супрамолекулярных систем на основе полимеров, кофакторов и энзимов, восприимчивых к электрохимическому, биохимическому и биоэлектрохимическому переключению редокс-состояний и осуществление оптического преобразования этих состояний с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса.

Научная новизна заключается в создании сложных интегрированных органических электродов и пленок с электро- и биохимически переключаемыми редокс-функциями и реализации оптического контроля этих функций с помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса.

1. Впервые для ультратонких пленок полианилина исследованы обратимые эффекты сорбции-десорбции воды при электрохимическом циклировании этого редокс-активного полимера.

2. Впервые редокс-активная пленка берлинской лазури, нанесенная на модифицированный меркаптопропионовой кислотой золотой электрод, использована для получения переключаемой оптоэлектронной системы, в которой электрохимическая информация, характерная для трех редокс состояний, преобразована в оптическую с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

3. Создана композитная ультратонкая пленка на основе полианилина и полиакриловой ~ кислоты, позволяющая получать супрамолекулярные переключаемые структуры, пригодные для работы в нейтральных средах.

4. Впервые исследовано оптическое преобразование электрокаталитического окисления никотинамидадениндинуклеотида полимерными пленками берлинской лазури и полианилина.

5. Разработаны композитные энзиматические электроды, в которых полианилин выступает в качестве посредника переноса электронов между такими энзимами как глюкозооксидаза, лактат-дегидрогеназа и глюкозо-дегидрогеназа и подложками электродов.

6. Впервые показана принципиальная возможность создания электрического контакта между пирролохинолинхинон(Р(3(3)-зависимой глюкозо-дегидрогеназой (GDH) и золотым электродом путем реконструирования ano-GDH на полианилиновой пленке, функционализированной PQQ-кофактором.

7. Показано, что в комбинации с электрохимическими методами спектроскопия ППР может быть использована как основа для датчиков на глюкозу, дигидро-никотинамид-аденин-динуклеотид (NADH) или лактат.

Разработан метод создания импринтированной полимерной матрицы, оптимизированной для исследования с помощью спектроскопии ППР, и впервые проведено неэлектрохимическое селективное определение редокс-кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH, основанное на принципе молекулярного импринтинга.

Практическая значимость работы. Разработаны чувствительные элементы оптических сенсоров на основе ультратонких полимерных пленок. Продемонстрирована возможность количественного анализа in situ таких важных органических соединений, как глюкоза, лактат, кофакторы NAD+, NADP+, NADH и NADPH, участвующих в процессах жизнедеятельности. Высокая чувствительность метода поверхностного плазмонного резонанса и функциональная стабильность исследованных систем открывают перспективы для создания с помощью спектроскопии ППР молекулярных информационных и сенсорных устройств.

На защиту выносятся

• результаты исследования оптического преобразования электрохимически индуцированных процессов набухания и усадки тонких пленок полианилина и композитных пленок полианилин/полиакриловая кислота;

• экспериментальные данные по изучению редокс-состояний берлинской лазури методом поверхностного плазмонного резонанса;

• способы модифицирования поверхности золотых электродов для создания чувствительных элементов сенсоров на такие вещества как глюкоза, лактат, кофакторы NAD+, NADP+, NADH и NADPH, и результаты исследований электрокаталитической, биокаталитической и биоэлектрокаталитической активности полученных тонкопленочных супрамолекулярных систем методом поверхностного плазмонного резонанса;

• данные о селективности определения химически и структурно близких соединений методом ППР с импринтированными мембранами;

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures" (Казань, Россия, 2002), I Международной молодежной конференции-школе по синтезу и строению супрамолекулярных соединений (Казань, Россия, 2002), Международной конференции "II International Workshop on Molecularly Imprinted Polymers" (La Grande Motte, Франция, 2002), XVI Европейской конференции "Chemistry at Interfaces" (Владимир, Россия, 2003), Всероссийском семинаре "Структура и динамика молекулярных систем" (Йошкар-Ола, 2003). По результатам работы опубликованы 9 статей и тезисы 3 докладов на научных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по молекулярным устройствам, обеспечению электрического контакта между редокс-энзимами и электродами, основным принципам молекулярного импринтинга и основам спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Вторая глава работы посвящена описанию объектов и методов исследования. В третьей главе диссертации представлены и обсуждены результаты исследований. Работа изложена на 142 страницах, включая 52 рисунка, 8 схем и 258 литературных ссылок.

выводы

1. Методом ППР изучено влияние процессов окисления-восстановления на изменение оптических и физико-химических характеристик ультратонких пленок полианилина. Определена кинетика набухания и усадки полимера при электрохимическом переключении и проведена оценка кинетических констант этих процессов. Показано, что метод ППР обеспечивает надежную регистрацию выходного сигнала редокс-состояний электрохимически активируемого полимера (полианилина).

2. Предложен способ формирования мультистабильной пленки берлинской лазури на поверхности золота путем функционализации электрода меркаптопропионовой кислотой. Методом ППР изучено оптическое преобразование электрохимической информации, характерной для трех редокс-состояний берлинской лазури и показано, что эти системы могут быть использованы для создания мультистабильных элементов молекулярной памяти.

3. Методом ППР изучены процессы электрокаталитического окисления NADH такими редокс-полимерами, как берлинская лазурь и полианилин. Показано, что вследствие существенного различия спектров ППР полимеров, находящихся в разных редокс-состояниях, эти пленки имеют перспективы использования в сенсорике для определения концентрации кофактора при его электрокаталитическом преобразовании.

4. С целью получения редокс-активных элементов сенсоров на основе полианилина, пригодных для функционирования в нейтральных средах, разработан электрохимический метод синтеза композитной пленки, состоящей из полианилина и полиакриловой кислоты. Методом ППР изучены физико-химические, оптические и редокс-свойства полученной композитной пленки на золотой подложке. Определены кинетические константы процессов набухания и усадки. Показано, что данную систему можно использовать для разработки электрохимически переключаемых молекулярных машин.

5. Проведена сборка сложной биоэлектрокаталитической редокс-активной композитной пленки на основе полианилина. Оптимизирован ее электрический контакт с электродом путем реконструирования апоглюкозооксидазы на FAD-кофакторе, ковалентно пришитом к полимеру. Проведена оценка плотности заполнения поверхности композитного полимерного электрода кофактором FAD и реконструированной глюкозооксидазой. Установлено, что реконструированная глюкозооксидаза обладает такой же высокой скоростью электронного обмена, как и нативный энзим, т.е. организованный дизайн композитного слоя обеспечивает высокоэффективный электрический контакт между энзимом и электродом. Показано, что комбинация электрохимического метода и спектроскопии ППР позволяет использовать биоэлектрокаталитические функции композитного слоя для количественного анализа глюкозы в растворе.

6. Предложен способ формирования энзиматического электрода, в котором полианилин выступает в качестве посредника переноса электронов между NAD-зависимой лактат-дегидрогеназой и подложкой электрода. Методом ППР изучено биоэлектрокаталитическое окисление лактата синтезированной матрицей. Поскольку выходной сигнал ППР в значительной степени изменяется при переходе полианилина из окисленной формы в восстановленную и обратно, то в комбинации с электрохимическими методами спектроскопия ППР может быть использована как основа для датчика на лактат.

7. Впервые показана принципиальная возможность создания электрического контакта между PQQ-зависимой глюкозо-дегидрогеназой и золотым электродом путем реконструирования ano-GDH на полианилиновой пленке, функционализированной PQQ-кофактором. Изучены электрохимические и оптические свойства этой биоэлектрокаталитической системы in situ. Дана оценка поверхностного заполнения композитного электрода PQQ-кофактором и реконструированной глюкозо-дегидрогеназой. Показано, что биоэлектрокаталитические функции полученной системы могут быть использованы для количественного анализа глюкозы в растворе методом ППР.

8. Предложен новый неэлектрохимический способ селективного определения редокс-кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH, основанный на принципе молекулярного импринтинга. Разработан метод создания импринтированной полимерной матрицы, оптимизированной для исследования с помощью спектроскопии ППР.

9. Проведено специфическое импринтирование полостей в пленку сополимера акриламида и акриламидофенилборной кислоты для молекулярного распознавания кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH. Продемонстрирована эффективность использования спектроскопии ППР в качестве метода контроля связывания этих кофакторов с пленками импринтированных полимеров. Показано, что метод ППР в сочетании с импринтированными мембранами обладает высокой селективностью при определении импринтируемого вещества из его смеси с химически и структурно близкими соединениями.

10. С помощью ППР проведено исследование биокаталитического процесса окисления лактата в пируват кофактором NAD+ в присутствии лактат-дегидрогеназы. Показано, что использование NADH-импринтированной пленки и спектроскопии ППР для контроля кинетики этого процесса открывает новые возможности для изучения биокаталитических реакций с участием NAD(P)+ и NAD(P)H оптическими методами.

1. М. Gomez-Lopez, J.F. Stoddart в кн.: Handbook of Nanostructured Materials Vol 5: "Organics, Polymers and Biological Materials" (Ed. by H.S. Nalwa) 2000, Academic Press, San Diego, USA

2. A. Guenzi, C.A. Johnson, F. Cozzi, K. Mizlow J. Am. Chem. Soc. 1983,105, 1438-1448

3. D. Philp, J.F. Stoddart Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996,35, 1154-1196

4. S. Menzer, A.J. White, D.J. Williams, M. Belohradsky, C. Hamers, F.M. Raymo, A.N. Shipway, J.F. Stoddart Macromolecules 1998,31, 295-307

5. В кн.: Nanosystems, Molecular Machinery, Manufacturing and Computation (Ed. by K.E. Drexler) 1992, Wiley, New York

6. I. Willner, E. KatzAngew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000,39, 1181-1218

7. A.B. Kharitonov, A.N. Shipway, I. Willner Anal. Chem. 1999, 71, 5441-5443

8. В кн.: Organic Photochromic and Thermochromic Compounds (Ed. by J.C. Crano, Guglielmetti) 1998, Plenum Press

9. D. Leigh, K. Moody, J.P. Smart, KJ. Watson, A.M. Slawin Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 55,306-310

10. A. Livoreil, C.O. Dietrich-Buchecker, J-P. Sauvage J. Am. Chem. Soc. 1994,116, 9399-9400

11. Y. Yokoyama Chem. Rev. 2000,100, 1717-1740

12. C. Brachle, N. Hampp в кн.: "Photochromism, Molecules and Systems" (Ed. by H. Dilrr, H.L. Bouas,) 1990, Elsevier, Amsterdam, Studies in Organic Chemistry 40, Ch.3, p. 64

13. R.W. Murray Acc. Chem. Res. 1980,13, 135-141

14. H.D. Finklea в кн.: "Electroanalytical Chemistry" (Ed. by A.J. Bard, I. Rubinstein), Marcel Dekker, New York 1996, 19, 109

15. A. Ulman в кн.: "An Introduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blodgett to Self-Assembly" 1991, Academic Press

16. S. Shinkai, T. Nakaji, Y. Nishida, T. Ogawa, O. Manabe J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 58605865

17. K. Kimura, R. Mizutani, M. Yokoyama, R. Arakawa, G. Matsubayashi, M. Okamoto, H. Doe J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 2062-2063

18. T. Nabeshima, A. Sakiyama, A. Yagyu, N. Furukawa Tetrahedron Lett. 1989,30, 5287-5288

19. D. Bethell, G. Dougherty, D.C. Cupertino J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1995,675-676

20. M. Irie, M. Kato J. Am. Chem. Soc. 1985 107, 1024-1028

21. A.C. Benniston Chem. Soc. Rev. 1996,427-436

22. C. Canevet, J. Libman, A. Shanzer Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2657-2660

23. J-P. Sauvage Acc. Chem. Res. 1998, 31, 611-619

24. J-P. Collin, P. GavinS, J-P. Sauvage Chem. Commun. 1996,2005-2006

25. P.R. Ashton, R. Ballardini, V. Balzani, S.E. Boyd, A. Credi, M.T. Gandolfi, M. Gomez-Lopez, S. Iqbal, D. Philp, J.A. Preece, L. Prodi, H.G. Ricketts, J.F. Stoddart, M.S. Tolley, M. Venturi, A.J. White, D.J. Williams Chem. Eur. J. 1997,3, 152-170

26. Z. Sekkat, J. Wood, Y. Geerts, W. Knoll Langmuir 1995,11, 2856-2859

27. R. Wang, T. Iyoda, D.A. Tryk, K. Hashimoto, A. Fujishima Langmuir 1997,13, 4644-4651

28. M. Velez, S. Mukhopadhyay, I. Muzikante, G. Matisova, S. Vieira Langmuir 1997,13, 870-872

29. Z.F. Liu, K. Hashimoto, A. Fuj'ishima Nature 1990,347, 658-660

30. H.Z. Yu, Y.Q. Wang, J.Z. Cheng, J.W. Zhao, S.M. Cai, H. Inokuchi, A. Fujishima, Z.F. Liu Langmuir 1996,12, 2843-2848

31. C.P. Collier, G. Mattersteig, E.W. Wong, Y. Luo, K. Beverly, J. Sampaio, F.M. Raymo, J.F. Stoddart, J.R. Heath Science 2000,289, 1172-1175

32. C.P. Collier, E.W. Wong, M. Belohradsky, F.M. Raymo, J.F. Stoddart, P.J. Kuekes, R.S. Williams, J.R. Heath Science 1999,285, 391-394

33. E.W. Wong, C.P. Collier, M. Belohradsky, F.M. Raymo, J.F. Stoddart, J.R. Heath J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 5831-5840

34. N.C. Seeman Acc. Chem. Res. 1997, 30, 357-363

35. R.D. Piner, J. Zhu, F. Xu, S. Hong, C.A. Mirkin Science 1999,283, 661-663

36. P.F. Barbara, D.M. Adams, D.B. O'Connor Ann. Rev. Mater. Sci. 1999,29, 433-469

37. S. Kawata, Y. Kawata Chem. Rev. 2000,100, 1777-1788

38. O.A. Matthews, A.N. Shipway, J.F. Stoddart Prog. Polym. Sci. 1998,23, 1 -56

39. A.K. Cheetham, G. Ferey, T. Loiseau Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999,38, 3268-3292

40. A.N. Shipway, M. Lahav, I. Willner ЛЛ. Mater. 2000,12, 993-998

41. A.G. Sykes, Chem. Soc. Rev. 1985,14,283-321

42. J.N. Onuchic, D.N. Beratan, J.J. Hopfield, J. Phys. Chem. 1986,90,3707-3721

43. A. Heller, Acc. Chem. Res. 1990,23,128-134

44. A.L*. Ghindilis, P. Atanasov, E. Wilkins, Electroanalysis 1997, P, 661 -674

45. W. Schuhmann, Biosens. Bioelectron. 1995,10, 181-193

46. И.В. Березин, B.A. Богдановская, С.Д. Варфоломеев, M.P. Тарасевич, А.И. Ярополов Доклады Академии Наук СССР 1978,240,615-618

47. А.И. Ярополов, В. Маловик, С.Д. Варфоломеев, И.В. Березин, Доклады Академии Наук СССР 1979,249, 1399-1401

48. J. Zhao, R. Henkens, J. Stonehuerner, J.P. O'Daly, A.L. Crumbliss, J. Electroanal. Chem. 1992,327, 109-119

49. P.N. Bartlett, P. Tebbutt, R.C. Whitaker, Prog. Reaction Kinetics 1991,16,55-155

50. G. Davis, в кн.: "Biosensors: Fundamentals and Applications", (Ed. by A.P.F. Turner, I. Karube, G.S. Wilson), OUP, Oxford, 1987, p. 247

51. R.S. Nicholson, I. Shain, Anal. Chem. 1965,37, 178-190

52. И.А. Александровский, JI.B. Бежикина, И.В. Родионов, Биохимия 1981, 46, 708-716

53. J. Mahenc, H. Aussaresses, C.R. Hebd. Seances. Acad. Sci. Ser. С 1979,289, 357-359

54. A.L. Crumbliss, H.A.O. Hill, D.J. Page, J. Electroanal. Chem., 1986,206, Ъ21-ЪЪ1

55. I. Taniguchi, S. Miyamoto, S. Tomimura, F.M. Hawkridge, J. Electroanal. Chem., 1988, 240, 333-339

56. B.A. Feinberg, M.D. Ryan, в кн.: "Topics in Bioelectrochemistry and Bioenergetics", (Ed. by G. Milazzo), Vol. 4, Wiley, 1981, p. 225

57. A.D. Ryabov, E.M. Tyapochkin, S.D. Varfolomeev, A. Karyakin, Bioelectrochem. Bioenerg. 1990,24,257-262

58. A.D. Ryabov, A. Amon, R.K. Gorbatova, E.S. Ryabova, B.B. Gnedenko, J. Phys. Chem. 1995, 99,14072-14077

59. I. Willner, A. Riklin, B. Shoham, D. Rivenzon, E. Katz, Adv. Mater. 1993,5,912-915

60. B. Shoham, Y. Migron, A. Riklin, I. Willner, B. Tartakovsky, Biosens. Bioelectron. 1995, 10, 341-352

61. P. Pantano, Т.Н. Morton, W.G. Kuhr, J. Am. Chem. Soc. 1991, 7/5, 1832-1833

62. C. Bourdillon, C. Demaille, J. Gueris, J. Moiroux, J.-M. Saveant, J. Am. Chem. Soc. 1993,115, 12264-12269

63. A. Riklin, I. Willner, Anal. Chem. 1995, 67,4118-4126

64. N.C. Foulds, C.R. Lowe, J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1 1986,82,1259-1264

65. C. Iwakura, Y. Kajiya, H. Yoneyama, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988, 1019-1020

66. S.-I. Yabuki, H. Shinohara, M. Aizawa, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1989, 945-946

67. P. Janda, J. Weber, J. Electroanal. Chem. 1991,300,119-127

68. Y. Kajiya, H. Sugai, C. Iwakura, H. Yoneyama, Anal. Chem. 1991, 63,49-54

69. J. Li, S.N. Tan, H.L. Ge, Anal. Chim. Acta 1996, 335, 137-145

70. J. Li, S.N. Tan, J.T. Oh, J. Electroanal. Chem. 1998,448,69-77

71. J. Li, L.S. Chia, N.K. Goh, S.N. Tan, H. Ge, Sens. Actuators В 1997,40, 135-141

72. J. Li, L.S. Chia, N.K. Goh, S.N. Tan, Anal. Chim. Acta 1998,362,203-211

73. V.J. Razumas, A.V. Gudavicius, J.J. Kulys, J. Electroanal. Chem. 1986,198,81-87

74. F. Patolsky, G. Tao, E. Katz, I. Willner, J. Electroanal. Chem. 1998,454, 9-13

75. A. Narvaez, E. Dominguez, I. Katakis, E. Katz, K.T. Ranjit, I. Ben-Dov, I. Willner, J. Electroanal. Chem. 1997,430,217-233

76. Y. Degani, A. Heller, J. Phys. Chem. 1987, 91, 1285-1289

77. I. Willner, E. Katz, Angew. Chem., Int. Ed. 2000,39,1180-1218

78. W. Schuhmann, T.J. Ohara, H.-L. Schmidt, A. Heller, J. Am. Chem. Soc. 1991,113, 1394-1397

79. A. Badia, R. Carlini, A. Fernandez, F. Battaglini, S.R. Mikkelsen, A.M. English, J. Am. Chem. Soc. 1993,115, 7053-7060

80. I. Willner, N. Lapidot, A. Riklin, R. Kasher, E. Zahavy, E. Katz, J. Am. Chem. Soc. 1994,116, 1428-1441

81. S. Kuwabata, T. Okamoto, Y. Kajiya, H. Yoneyama, Anal Chem. 1995, 67, 1684-1690

82. A. Walcarius, Electroanalysis 1998,10, 1217-1235

83. K. Kalcher, J.-M. Kauffmann, J. Wang, I. Svancara, K. Vytras, C. Neuhold, Z. Yang, Electroanalysis 1995, 7,5-224 84. S. Cosnier, Biosens. Bioelectron. 1999,14,443-456

84. H. Mao, P.G. Pickup, J. Electroanal. Chem. 1989,265, 127-142

85. W. Schuhmann, Mikrochim. Acta 1995,121,1-29

86. M.G. Loughram, J.M. Hall, A.P.F. Turner, Electroanalysis 1996,8, 870-875

87. S. Cosnier, C. Innocent, Y. Jouanneau, Anal. Chem. 1994, 66,3198-3201

88. N. Gajovic, K. HabermUller, A. Warsinke, W. Schuhmann, F.W. Scheller, Electroanalysis 1999,11, 1377-1383

89. S. Cosnier, J.-L. Decout, M. Fontecave, C. Frier, C. Innocent, Electroanalysis 1998, 10, 521525

90. T. Parpaleix, J.M. Laval, M. Maida, C. Bourdillon, Anal. Chem. 1992, 64,641-646

91. A. Heller, J. Phys. Chem. 1992,96,3579-3587

92. B.A. Gregg, A. Heller, J. Phys. Chem. 1991, 95,5970-5975

93. P. Audebert, C. Demaille, C. Sanchez, Chem. Mater., 1993,5,911 -913

94. T.-M. Park, E.I. Iwuoha, M.R. Smith, B.D. MacCraith, Anal. Commun. 1996,33,271-273

95. T.-M. Park, E.I. Iwuoha, M.R. Smith, R. Freaney, A.J. McShane, Talanta 1997, 44, 973-978

96. S. Bharathi, O. Lev, Anal. Commun. 1998, 35,29-31

97. B. Griindig, C. Krabisch, Anal. Chim. Acta 1989,222, 75-81

98. T. Ikeda, Bull. Electrochem. 1992, 8,145-159

99. P.D. Hale, L.I. Boguslavsky, H.I. Karan, H.S. Lee, Y. Okamoto, T.A. Skotheim, Anal. Chim. Acta 1991,248, 155-161

100. I. Rosen-Margalit, A. Bettelheim, J. Rishpon, Anal. Chim. Acta 1993,281,327-333

101. J. Wang, X. Zhang, M. Prakash, Anal. Chim. Acta 1999,395, 11-16

102. P.D. Hale, L.F. Liu, T.A. Skotheim, Electroanalysis 1991,3,751-756

103. L.I. Boguslavsky, P.D. Hale, L. Geng, T.A. Skotheim, H.-S. Lee, Solid State Ionics 1993, 60, 189-197

104. M. Smolander, G. Marko-Varga, L. Gorton, Anal. Chim. Acta 1995,303,233-240

105. E. Katz, A. Riklin, V. Heleg-Shabtai, I. Willner, A.F. Buckmann, Anal, Chim. Acta 1999, 385, 45-58

106. E. Katz, D.D. Schlereth, H.-L. Schmidt, A.J.J. Olsthoom, J. Electroanal. Chem. 1994, 368, 165-171

107. Z. Samec, P.J. Elving, J. Electroanal. Chem. 1983,144,217-225

108. R.W. Coughlin, M. Aizawa, B.F. Alexander, M. Charles, Biotechnol. Bioeng. 1975, 77, 515526

109. Z. Samec, P.J. Elving, J. Electroanal. Chem. 1983,144,217-234

110. H. Jaegfeldt, T. Kuwana, G. Johansson, J. Am. Chem. Soc. 1983,705, 1805-1814

111. L.L. Miller, J.R. Valentine, J. Am. Chem. Soc. 1988,110, 3982-3989

112. C. Degrand, L.L. Miller, J. Am. Chem. Soc. 1980,102,5728-5732

113. I. Willner, A. Riklin, Anal. Chem. 1994, 66, 1535-1539

114. M.J. Lobo, A.J. Miranda, P. Tunon, Electroanalysis 1997,9, 191-202

115. G.T.R. Palmore, H. Bertschy, S.H. Bergens, G.M. Whitesides, J. Electroanal. Chem. 1998, 443,155-161

116. P.J. Elving, W.T. Bresnahan, J. Moiroux, Z. Samec, Bioelectrochem. Bioenerg. 1982, 9, 365378

117. K.S.V. Santhanam, P.J. Elving, J. Am. Chem. Soc. 1973,95, 5482-5490

118. S.H. Baik, C. Kang, I.C. Jeon, S.E. Yun, Biotechnol. Techniq. 1999,13, 1-5

119. R. Ruppert, S. Herrmann, E. Steckhan, Tetrahedron Lett. 1987,28, 6583-6586

120. E. Hofer, E. Steckhan, B. Ramos, W.R. Heineman, J. Electroanal Chem. 1996, 402,115-122

121. S. Chardonnoblat, S. Cosnier, A. Deronzier,N. Vlachopoulos, J. Electroanal. Chem. 1993, 352, 213-228

122. A.L. de Lacey, M.T. Bes, C. Gomez-Moreno, V.M. Fernandez, J. Electroanal. Chem. 1995, 390, 69-76

123. H. Simon, J. Bader, H. Gunter, S. Neumann, J. Thanos, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1985, 24, 539-553

124. K. Nishiyama, H. Ishida, I. Taniguchi, J. Electroanal. Chem. 1994,373,255-258

125. P. Gros, C. Zaborosch, H.G. Schlegel, A. Bergel, J. Electroanal Chem. 1996, 405,189-195

126. J. Cantet, A. Bergel, M. Comtat, J.L. Sens, J. Mol. Catal. 1992, 73,371-380

127. M. Maurice, J. Souppe, New J. Chem. 1990,14,301-304

128. J. Hendle, A.F. Biickmann, W. Aehle, D. Schomburg, R.D. Schmid, Eur. J. Biochem. 1993, 213,947-956

129. P. Zappelli, A. Rossodivita, G. Prosperi, R. Pappa, L. Re, Eur. J. Biochem. 1976, 62,211-215

130. J. Wang, J. Pharm. Biomed. Anal 1999,19,47-53

131. M.E. Collison, M.E. Meyerhoff, Anal Chem. 1990,62,425A

132. A.S. Bassi, D.Q. Tang, E. Lee, J.X. Zhu, M.A. Bergougnou, Food Technol. Biotechnol 1996, 34,9-22

133. C. Nistor, J. Emneus, Waste Management 1999,19,147-170

134. D. Ivnitski, I. Abdel-Hamid, P. Atanasov, E. Wilkins, Biosens. Bioelectron. 1999,14,599-624

135. A. Fassouane, J.M. Laval, J. Moiroux, C. Bourdillon, Biotechnol. Bioeng. 1990,35, 935-939

136. S. Kuwabata, R. Tsuda, K. Nishida, H. Yoneyama, Chem. Lett. 1993, 1631-1634

137. K. Takayama, К. Капо, T. Ikeda, Chem. Lett. 1996,1009-1010

138. G. Tayhas, R. Palmore, G.M. Whitesides, ACS Symposium Series No. 566, Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Chapter 14, pp. 271-290,1994

139. K. Haupt, K. Mosbach Chem. Rev. 2000,100,2495-2504

140. G. Wulff, Angew. Chem. Int. Ed. Engl 1995,34, 1812-1832

141. J.U. Klein, M.J. Whitecombe, F. Mulholland, E.N. Vulfson, Angew. Chem. Int. Ed. Engl 1999, 38,2057-2060

142. M. Kato, H. Nishide, E. Tsushida, T. Sasaki, J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 1981,19, 18031809

143. S. Dai, Y. Shin, C.E. Barnes, L.M. Toth, Chem. Mater. 1997,9,2521-2525

144. A. Aherne, C. Alexander, M.J. Payne, N. Perez, E.N. Vulfson, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8771-8772

145. S.M. D'Souza, C. Alexander, S.W. Carr, A.M. Waller, M.J. Whitcombe, E.N. Vulfson, Nature (London) 1999,398,312-316

146. M. Kempe, M. Glad, K. Mosbach, J. Mol Recogn. 1995,8,35-41

147. C. Lubke, M. Liibke, M.J. Whitcombe, E.N. Vulfson, Macromolecules 2000,33, 5098-5105

148. S. Mallik, R.D. Johnson, F.H. Arnold, J. Am. Chem. Soc. №4,116, 8902-8911

149. T.L. Panasyuk, V.M. Mirsky, S.A. Piletsky and O.S. Wolfbeis, Anal Chem. 1999, 71, 46094613

150. S.A. Piletsky, E.V. Piletska, B. Chen, K. Karim, D. Weston, G. Barrett, P. Lowe and A.P.F. Turner, Anal Chem. 2000, 72,4381-4385

151. C. Malitesta, I. Losito and P.G. Zambonin, Anal Chem. 1999, 71, 1366-1370

152. H. Peng, С. Liang, A. Zhou, Y. Zhang, Q. Xie and S. Yao, Anal. Chim. Acta 2000, 423, 221228

153. F.L. Dickert, M. Tortschanoff, W.E. Bulst and G. Fischerauer, Anal. Chem. 1999, 71, 45594563

154. B. Deore, Z. Chen and T. Nagaoka, Anal. Chem. 2000, 72,3989-3994

155. M. Glad, O. Norrlow, B. Sellergren, N. Siegbahn and K. Mosbach, J. Chromatogr. 1985, 347, 11-23

156. D.Y. Sasaki and T.M. Alam, Chem. Mater. 2000,12, 1400-1407

157. S.S. Iqbal, M.F. Lulka, J.P. Chambers, R.G. Thompson and J.J. Valdes, Mater. Sci. Eng., С 2000,7,77-81

158. S.W. Lee, I. Ichinose and T. Kunitake, Langmuir 1998,14,2857-2863 % 161. L. Ye, R. Weiss, K. Mosbach, Macromolecules 2000, 33, 8239-8245

159. I. Surugiu, L. Ye, E. Yilmaz, A. Dzgoev, B. Danielsson, K. Mosbach, K. Haupt, Analyst 2000, 125, 13-16

160. N. Perez, M.J. Whitcombe, E.N. Vulfson, Macromolecules 2001,34, 830-836

161. E. Yilmaz, K. Haupt, K. Mosbach, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2000,39,2115-2118

162. Y. Xia, G.M. Whitesides, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1998,37, 550-575

163. M. Yan, A. Kapua, Polym. Prepr. 2000, 41,264

164. A.G. Mayes, L.I. Andersson, K. Mosbach, Anal. Biochem. 1994,222,483-488

165. B. Sellergren, K.J. Shea, J. Chromatogr., A 1995, 690,29-39

166. K.G.I. Nilsson, J. Lindell, O. Norrlow, B. Sellergren, J. Chromatogr., A 1994, 680, 57-61

167. V. Pichon, M. Bouzige, C. Miege, M.-C. Hennion, Trends Anal. Chem. 1999,18,219-235

168. D. Kriz, C. Berggren-Kriz, L.I. Andersson, K. Mosbach, Anal. Chem. 1994, 66, 2636-2639

169. A. Dzgoev, K. Haupt, Chirality, 1999,11,465-469

170. D.W. Armstrong, J.M. Schneiderheinze, Y.S. Hwang, B. Sellergren, Anal. Chem. 1998, 70, 3717-3719

171. T. Porstmann, S.T. Kiessig, J. Immunol. Methods 1992,150, 5-21

172. G. Vlatakis, L.I. Andersson, R. Muller, K. Mosbach, Nature (London) 1993,361,645-647

173. L. Andersson, C.F. Mandenius, K. Mosbach, Tetrahedron Lett. 1988,29,5437-5440

174. L.I. Andersson, A. Miyabayashi, D.J. O'Shannessy, K. Mosbach, J. Chromatogr. 1990, 516, 323-331

175. S.A. Piletsky, Y.P. Parhometz, N.V. Lavryk, T.L. Panasyuk, A.V. El'skaya, Sens. Actuators, В 1994,18-19,629-631

176. E. Hedborg, F. Winquist, I. Lundstrom, L.I. Andersson, K. Mosbach, Sens. Actuators, A 1993, 36-38,796-799

177. M. Lahav, A.B. Kharitonov, O. Katz, T. Kunitake and I. Willner, Anal. Chem. 2001, 73, 720723

178. F.L. Dickert, P. Forth, P. Lieberzeit, M. Tortschanoff, Fresenius' J. Anal. Chem. 1998, 360, 759-762

179. D. Kriz, M. Kempe, K. Mosbach, Sens. Actuators В 1996,33,178-181

180. J.L. Suarez-Rodriguez, M.E. Di'az-Garcfa, Anal. Chim. Acta 2000, 405, 61-16

181. D. Kriz, K. Mosbach, Anal. Chim. Acta 1995,300,71-75

182. Y. Liao, W. Wang, B. Wang, Bioorg. Chem. 1999,27,461-416

183. O. Ramstrom, L. Ye, M. Krook, K. Mosbach, Anal. Commun. 1998,35,9-11

184. P.T. Vallano, V.T. Remcho, J. Chromatogr. A, 2000,888,23-34

185. R.W. Wood, "On a remarkable case of uneven distribution of light in a diffraction grating spectrum", Phil. Magm. 1902,4,396-402

186. E. Kretschmann, H. Raether, "Radiative decay of non-radiative surface plasmons excited by light", Z Naturforsch. 1968,23A, 2135-2136

187. A. Otto, "Excitation of surface plasma waves in silver by the method of frustrated total reflection", Z Physik. 1968, 216, 398^10

188. H. Raether, в кн.: "Surface plasmons on smooth and rough surfaces and on gratings", Springer-Verlag, Berlin, 1988192. в кн.: "Electromagnetic surface modes", (Ed. by A.D. Boardman), John Wiley and Sons, 1982

189. M.A. Ordal, L.L. Long, R.J. Bell, S.E. Bell, R.R. Bell, R.W. Alexander, J. Ward, C.A. Ward, "Optical properties of metals Al, Co, Cu, Au, Fe, Pb, Ni, Pd, Pt, Ag, Ti, and W in the infrared and far infrared", AppL Opt. 1983,11, 1099-1119

190. M. Zayats, O.A. Raitman, V.I. Chegel, A.B. Kharitonov, I. Willner, Anal Chem. 2002, 74, 4763-4773

191. S. Sasaki, R. Nagata, B. Hock, I. Karube,Anal. Chim. Acta 1998,368,71-76

192. A.G. Frutos, R.M. Corn, Anal. Chem. News&Feat. 1998, July, 449-455ч 197. P.Y. Tsoi, J. Yang, Y. Sun, S. Sui, M. Yang, Langmuir 2000,16,6590-65964 198. H. Sota, Y. Hasegawa, M. Iwakura, Anal Chem. 1998, 70,2019-2024

193. J. O'Donnell, C.L. Honeybourne, J. Phys.: Condens. Matter 1991, J, S337-S346

194. T.T. Ehler, J.W. Walker, J. Jurchen, Y. Shen, K. Morris, B.P. Sullivan, L.J. Noe, J. Electroanal. Chem. 2000,480,94-100

195. M.A. Cooper, D.H. Williams, Y.R. Cho, Chem. Commun. 1997, 1625-1626

196. J.M. Brockman, A.G. Frutos, R.M. Corn, J. Am. Chem. Soc. 1999,121, 8044-8051

197. S. Koide, Y. Iwasaki, T. Horiuchi, O. Niwa, E. Tamiya, K. Yokoyama, Chem. Commun. 2000, 741-742

198. R. Georgiadis, K.A. Peterlinz, J.R. Rahn, A.W. Peterson, J.H. Grassi, Langmuir, 2000, 16, 6759-6762

199. B. Liedberg, C. Nylander, I. LundstrOm, Biosens. Bioelectron. 1995,10, i-ix

200. R.L. Rich, D.G. Myszka, Anal. Biotech. 2000,11, 54-61

201. X. Kang, G. Cheng, S. Dong, Electrochem. Commun. 2001,3,489-493

202. C.E.H.Berger, J Greve, Sens. Actuators В 2000, 63,103-108

203. J. Homola, S.S. Yee, G. Gauglitz, Sens. Actuators В 1999,54,3-15

204. A. Kugimiya, T. Takeuchi, Biosens. Bioelectron. 2001,16, 1059-1062

205. S. Nishimura, T. Yoshidome, M. Higo, Anal Sci. 2001,17, il697-il700

206. E. Katz, A. Riklin, V. Heleg-Shabtai, I. Willner, A.F. Biickmann, Anal Chim. Acta 1999, 385, 45-58

207. A.F Biickmann, V. Wray, A. Stocker, в кн.: "Methods in Enzyhmology: Vitamins and Coenzymes" (Ed. by D. B. McCormick), Academic Press: Orlando, Fl, 1997; Vol. 280, Part 1, p.360

208. A.F Biickmann, V. Wray, Biotech. Appl. Biochem. 1992,15, 303-310

209. P. Dokter, J. Frank, J.A. Duine, Biochem. J. 1986,239, 163-164

210. S. Kitano, Y. Koyama, K. Kataoka, T. Okano, Y. Sakurai, J. Controlled Release 1992, 19, 161170

211. M. Annaka, T. Tanaka, Nature, 1992,355,430-432

212. M.P. Тарасевнч, С.Б. Орлов, Е.И. Школьников и др. в кн.: "Электрохимия полимеров", М.: Наука, 1990

213. G.V. Beketov, Y.M. Shirshov, O.V. Shynkarenko, V.I. Chegel, Sens. Actuators В 1998, 48, 432-438

214. A. Yamazawa, X.G. Liang, H. Asanuma, M. Komiyama, Angew. Chem. Int. Ed. Engl 2000, 39, 2356-2357

215. E.M. Genies, C. Tsintavis, J. Electroanal. Chem. 1985,195, 109-128

216. R. Nyffenegger, E. Ammann, H. Siegenthaler, R. Kotz, O. Haas, Electrochim. Acta 1995, 40, 1411-1415

217. E. Zahavy, S. Rubin, I. Willner, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 1753-1755

218. M. Gomez-Lopez, J.A. Preece, J.F. Stoddart, Nanotechnology 1996, 7,183-192

219. M. Irie, Adv. Polym. Sci. 1993,110,49-65

220. I. Willner, S. Rubin, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996,35,367-385

221. A.N. Shipway, I. Willner, Acc. Chem. Res. 2001,19,421-432

222. P.N. Bartlett, J.H. Wang, E.N.K. Wallace, Chem. Commun. 1996,359-360

223. R. Hirsch, E. Katz, I. Willner, J. Am. Chem. Soc. 2000,122,12053-12054

224. E. Katz, M. Lion-Dagan, I. Willner, J. Electroanal. Chem. 1996,408,107-112

225. I. Willner, E. Katz, B. Willner, R. Blonder, V. Heleg-Shabtai, A.F. Biickmann, Biosens. Bioelectron. 1997,12,337-356

226. I. Willner, Acc. Chem. Res. 1997,30,347-356

227. M. Lahav, C. Durkan, R. Gabai, E. Katz, I. Willner, M.E. Welland, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001,40,4095-4097

228. D. Ellis, M. Eckhoff, V.D. Neff,./. Phys. Chem. 1981,85,1225-1231

229. R.J.'Mortimer, D.R. Rossiensky, J. Electroanal. Chem. 1983,151, 133-147 , 236. Q. Chi, S. Dong, Anal. Chim. Acta 1995,310,429-436

230. C.B. Brennan, L. Sun, S.G. Weber, Sensors Actuators В 2001, 72, 1-10

231. W.E. Buschmann, J.S. Miller, Inorg. Chem. Comm. 1998,1, 174-176

232. P.N. Bartlett, J.H. Wang, J. Chem. Soc., Farad. Trans. 1996,92,4137-4143

233. D. Mo, Y.Y. Lin, J.H. Tan, Z.X. Yu, G.Z. Zhou, K.C. Gong, G.P. Zhang, X.-F. He, Thin Solid Films 1993,234,468-470

234. N.P. Bartlett, P.R. ВШп,Апа1. Chem. 1993, 66,1118-1119

235. D.A. Buttry, M.D. Ward, Chem. Rev. 1992,92, 1355-1379

236. C.Y. Yang, P. Smith, A.J. Heeger, Y. Cao, J.E. Osterholm, Polymer 1994, 35,1142-1147

237. H.J. Hecht, H.M. Kalisz, J. Hendle, R.D. Schmid, D. Schomburg, J. Mol. Biol. 1993, 229, 153172

238. C.P. Andrieux, J.J. Saveant, J. Electroanal. Chem. 1978,93,163-168

239. A. Bardea, E. Katz, A.F. Biickmann, I. Willner, J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 9114-9119

240. R.D. Eichner, Methods Enzymol., 1982,89, 359-362

241. Y.-T. Long, H.-Y. Chen, J. Electroanal Chem. 1997,440,239-242

242. N.M. Brunkan, M.R. Gagne, J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 6217-6225

243. W. Wang, S.H. Gao, B.H. Wang, Org. Lett. 1999,1,1209-1212

244. I. Ichinose, T. Kikuchi, S.-W. Lee, T. Kunitake, Chem. Lett. 2002,104-105

245. T.D. James, K.R.A.S. Sandanayake, S. Shinkai, Nature 1995,374, 345-347

246. T.D. James, K. Murata, T. Harada, K. Ueda, S. Shinkai, Chem. Lett. 1994,273-274

247. R. Gabai, N. Sallacan, V. Chegel, T. Bourenko, E. Katz, I. Willner, J. Phys. Chem. В 2001, 105, 8196-8202

248. N. Sallacan, M. Zayats, T. Bourenko, A.B. Kharitonov, I. Willner, Anal. Chem. 2002, 74, 702712

249. G. Wulff, J. Gimpel, Macromol. Chem. 1982,183,2469-2477

250. G. Wulff, J. Haarer, Macromol. Chem. 1991,192, 1329-1338

251. W. Knoll, Annu. Rev. Phys. Chem. 1998,49, 569-638