Оптимизация условий жидкостной хроматографии при контроле качества некоторых лекарственных средств и субстанций. тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

Куликов Артем Юрійович Ф;

ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ КОНТРОЛІ ЯКОСТІ ДЕЯКИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ І СУБСТАНЦІЙ

02.00.02 - аналітична хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Харків —1997

Дисертацією є рукопис Роботу виконано на хімічному факультеті Харківського державного університету та в лабораторії хроматографії Державного наукового центру лікарських засобів (м. Харків)

НАУКОВІ КЕРІВНИКИ : - Доктор хімічних наук, за в. кафедрою хімічної метрології

Перьков Іван Григорович, |

Харківський державний університет

- Доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Левін Михайло Григорович,

Державний науковий центр лікарських засобів

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ : - Доктор хімічних наук, професор

Антонович Валерій Павлович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського НАН України (м. Одеса)

- Доктор хімічних наук, професор Мчедлов-Петросян Микола Отарович,

Харківський державний університет

ПРОВІДНА УСТАНОВА: • Українська фармацевтична академія (м. Харків)

Захист відбудеться “16“ травня 1997 р о 14 год. на засіданні спеціалізоваї вченої ради Д 02.02.14 при Харківському державному університеті (Україна, 310077, Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-80)

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківські державного університету

Автореферат розісланий “ «=* " ¿¿лї-ґ ¿'¿ллъСУ) 1997 Р-

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат хімічних наук, доцент

Л.О.Слета

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність дослідження. Сучасні тенденції в розвитку аналітичої хімії в'язані з переносом центру ваги з таких традиційних об’єктів аналізу, як корисні копа-іни, метали та сплави, на об’єкти, безпосередньо пов’язані зі здоров’ям людини та вколишнім середовищем, зокрема, лікарські засоби. Особливістю ринку лікарських собів в Україні в сучасних умовах є масове надходження препаратів імпортного ви-бництва і засобів, виготовлених нетрадиційними виробниками в Україні та країнах ^Д. Щоб забезпечити безпеку споживача, необхідний більш пильний контроль якості сарських субстанцій і готових лікарських засобів. Він включає визначення макро- і, обливо, мікрокомпонентів, а також виявлення продуктів їх розкладу при зберіганні.

Здебільшого діючий компонент і продукти його деградації, що різняться за фар-жологічною дією, мало відрізняються за хімічним складом — аж до різниці в одній ^нкціональній групі. Традиційні методи розділу та визначення не дозволяють виз-ічати такі схожі за складом речовини. Тому особливу актуальність набуває розробка ісокоселективних та експресних методик контролю якості лікарських субстанцій та го-вих лікарських засобів.

В наш час могутнім методом контролю якості лікарських засобів, особливо мбінованих, є високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), яка, фактично, переорюється на рутинний метод аналізу. Однак, як і будь-який інший метод, ВЕРХ сама і собі не може вирішити усі аналітичні проблеми і є дійсно потужним аналітичним зна-їдцям тількі в комплексі з іншими аналітичними методами. Крім того, по справжньому очим метод ВЕРХ є тільки в тому випадку, коли користувач озброєний методологією ішуку тих умов хроматографування, які дозволяють йому вирішувати конкретну іалітичну задачу.

Мета роботи. Метою даної роботи була розробка комплексу прийомів, спрямо-іних на оптимізацію умов хроматографічного визначення для рішення конкретних за-іч фармацевтичного аналізу, та розробка деяких принципів поєднання хроматографії ншими методами визначення при контролі якості лікарських засобів.

Виходячи з цієї мети нами були поставлені наступні задачі дослідження:

- розробка підходу до оптимального використання твердофазної екстракції (ТФЕ) методу пробопідготовки в комплексі з ВЕРХ та спектрофотометрією;

- розробка систематичного підходу до оптимізації рухомої фази для обернено-фа-вої ВЕРХ на основі ранжування типів компонентів рухомої фази;

- розробка експериментального способу вибору оптимальної рухомої фази для ірмально-фазової хроматографії;

- розробка методів контролю якості конкретних лікарських засобів (ін'єкції та таб-ітки “Реналган”, аерозоль “Інгаліпт”, деякі інфузійні лікарські засоби та субстанції).

Роботу виконано у відповідності з науково-дослідною тематикою кафедри лічної метрології “Метрологічне обгрунтування та розвиток методів дослідження зноваг у розчинах та аналізу багатокомпонентних систем", затвердженою Президією Н України (№ держреєстрації 76091605, 81077488,10.87.0004409).

Наукова новизна полягяє в тому, що:

- запропоновано концепцію раціонального поєднання ТФЕ з різними за селектив ністю кінцевими аналітичними операціями;

-досліджена оптимізація ВЕРХ-визначення мікрокомпонентів за такими парамет рами як температура колонки, тип нерухомої фази та склад рухомої фази;

- формалізований вибір складу рухомої фази для дослідження оптимальної се лективності в аналізі складних лікарських об’єктів;

- запропонована схема експресного пошуку складу рухомої фази з використання! радіальної хроматографії;

- виявлено і далі пояснення аномальній залежності утримання алкилсульфонаті від температури в режимі хроматографування на сильному аніонообміннику з гідрофоб ною функцією.

Практична значимість роботи. На основі проведених досліджень розроблени ряд методик контролю якості лікарських препаратів та інших об'єктів, частину з яки внесено до наступних нормативно-технічних документів, затверджених Фармакопейниі комітетом МОЗ України:

ТФС 42У-33-143-95 “Пітофенону гідрохлорид” (Розділ “Сторонні домішки")

ТФС 42У-33-144-95 “Фенпіверинію бромід" (Розділ “Сторонні домішки”)

ТФС 42У-9/33-145-95 “Таблетки "Реналган” (Розділ “Кількісне визначення")

ТФС 42У-20/33-222-96 “Ренальган для ін’єкций" (Розділ “Кількісне визначення”)

ФС 42У-10/37-48-96 "Аерозоль “Інгаліпт” (Розділ “Кількісне визначення”)

ТФС 42У-33-329-96 “Анальгін" (Розділ “Сторонні домішки”)

ТФС 42У-33-415-96 “Таблетки анальгіну 0,5 ґ (Розділ “Сторонні домішки”)

ТФС 42-1803-92 . “Розчин фторурацилу 5% для ін’єкций" Зміни № 1. (Розділ

“Сторонні доміши”)

ТФС 42У-105-211-96 “Розчин натрію хлориду ізотонічний 0.9% для ін’єкций (в пакетах)”. Контроль ефірів фталевої кислоти,що вимиваються з упаковки (*).

ТФС 42У-105-210-96 “Розчин глюкози 5% та 10% для ін’єкций (в пакетах)” Контроль ефірів фталевої кислоти, що вимиваються з упаковки (*).

* - дані дослідження ввійшли до обфунтування методів ТФЕ та викладені в поя нювальних записках до вказаних документів.

Проведені дослідження уточнюють уявлення про аналітичні можливості різні варіантів методів рідинної хроматографії як при пробопідготовці, так і в якості кінцев аналітичної операції. Крім того, дані дослідження є черговим кроком в оптимізації уме аналізу методом рідинної хроматографії.

На захист виносяться такі основні положення і результати:

- підхід до раціонального використання твердофазної екстракції в комплексі спектрофотометрією та високоефективною рідинною хроматографією;

- схема оптимального пошуку умов обернено-фазової хроматографії;

- схема експресного пошуку оптимального складу рухомої фази з використання радіальної тонкошарової хроматографії;

- трактовка аномальної залежності утримання алкилсульфонатів від температуї в режимі іонообмінної хроматографії;

- методики визначення мікро- та макрокомпонентів лікарських субстанцій лікарських форм, а також продуктів їх деградації.

Апробація та публикації роботи. Матеріали дисертації було апробовано на ауково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації - в медичну практику" Сарків, 1996) та конференціях молодих вчених ДНЦЛЗ.

За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті та 1 тези доповідей.

Особистий внесок автора полягає в отриманні наукових результатів, викладе-іх в дисертації, плануванні та проведенні експеріменту, одержанні та обробці хрома->грам, апробації прийомів пошуку оптимального складу рухомої фази.

Структура та об’єм роботи. Дисертація викладена на 140 сторінках, має 51 ри-жок, 19 таблиць і складається з вступу, огляду літератури, двох глав власних ек-іеріментальних сліджень, висновків та списку літератури, який складається із 140 най-енувань (в тому числі 100 іноземних).

ЗМІСТ РОБОТИ

Вибір оптимального поєднання пробопідготовки з кінцевою аналітичною операцією.

Чим більш вибіркова кінцева аналітична операція — вимірювання аналітичного ігналу, тім менше компонентів матриці доводиться відокремлювати або маскувати на 'адії пробопідготовки (П). Тому, при інших рівних умовах, при більш вибірковій кінцевій ■іалітичній операції менш громіздкою та трудомісткою буде П. Інструментальна хрома-іграфія, як кінцева аналітична операція, включає і П. Ця обставина постійно генерує змилкову думку про практично абсолютну універсальність хроматографічних методів, днак, по мірі розширення і ускладнення кола об'єктів аналізу стало очевидним, що шерсальність методу відносна, і переваги його використання реалізуються тільки у імплексі з іншими аналітичними методами. Так, методу ВЕРХ присутні обмеження, ¡в'язані з перенавантаженням за макрокомпонентом (МАК) при визначенні мікроком->нентів (МІК) та необоротним отруєнням сорбенту деякими компонентами проб.

Використання специфичної П дозволяє істотно розширити круг об’єктів аналізу як ія ВЕРХ, так і для інших аналітичних методів. Традиційні методи П засновані на рівно-іжному статичному розподілі компонентів між двома фазамі (звичайно це рідинно-динна екстракція). Вони дозволяють підготувати багатокомпонентну пробу для іалізу одного-двох компонентів. Це є обмеженням для таких принципово багатокомпо-жтних кінцевих аналітичних операцій як інструментальна хроматографія та багатох-ільова спектрофотометрія.

Простий та ефективний метод П — ТФЕ — полягає у відокремленні цільових ком-інентів проби шляхом їх сорбції з газової або рідинної фази на відносно малій кількісті ірбенту, який міститься у спеціальному картриджі (патроні).

За своєю хімічною природою метод ТФЕ є варіантом рідинної хроматографії і ба-ється на використанні неспецифічних або специфічних взаємодій компонентів проби нерухомою та рухомою фазами. Найбільш широко використовуються в ТФЕ нерухомі ази на основі силікагелю з прищепленими функціональними групами, що забез-ічують широкий спектр поєднання іонообмінних, гідрофільних і гідрофобних властиво-ей. Метод ТФЕ дозволяє не тільки концентрувати визначаємі компоненти проби, але виділяти їх в достатньо чистому вигляді, що дозволяє використовувати метод ТФЕ як

при відносно малоселективних кінецевих аналітичних операціях (спектрофотометр титриметрія), так і для вельми селективних (ВЕРХ, електрофорез).

Для ТФЕ немає простої схеми вибору оптимального сорбенту для вирішення кс кретної задачі. Це визначається усією схемою аналізу, тобто властивостями ві начаємої речовини, властивостями матриці та типом кінцевої аналітичної операції, і планується використовувати. Загальна схема аналізу багатокомпонентної суміші з і користанням ТФЕ включає: підготовку проби; підготовку картриджу з метою усуван можливих сторонніх домішок і насичення розчинником (активація); пропускання рай підготовленного зразка через активований картридж; промивку картриджу з метою уі вання компонентів, що заважають або перешкоджають проведенню подальшого ана зу; елюювання (витискання) цільового компоненту з картриджу придатним розчинникс доведення до необхідного об'єму та аналіз.

Розглянемо можливості ТФЕ на етапі П при аналізі методом ВЕРХ. Як уже гої рилося, обмеження ВЕРХ пов'язані з “перенавантаженням” по МАК при визначенні К у пробі. Це поширена ситуація при аналізі багатокомпонентних лікарських препарат кількість визначаемих М1К може бути на 3-5 порядки менше кількісні основного комі ненту (дійсно, мінімальні дози сильнодіючих лікарських субстанцій, що використовую ся, складають десятки мікрограмів, а маса допоміжних компонентів таблетки, капсу чи ампули складає грами). Таким об’єктом, зокрема, є ін’єкційний розчин “Ренальга який в 1 мл містить: анальгіну — 0.5 г, пітофенону гідрохлоріду (ПГХ) — 2 мг фенпіверинію бромиду (ФБ) — 0.02 мг (25000:100:1) (будову речовин представлено рис.1). Відомо, що ФБ і ПГХ, як більш сильнодіючі речовини, при передозуванні н< звичайно токсичні. Комплекс методів контролю якості повинен включати визначен складу лікарської форми в процесі зберігання, тобто визначення кількості ФБ та ПГ) присутності продуктів їх розкладу та продуктів розкладу МАК — анальгіну.

Для визначення ФБ найбільш придатним варіантом є обернено-фазова BEF хоча пряме використання ВЕРХ ускладнені як “перенавантаженням” зони анальг (рис.2), так і перекриванням піків МІК продуктами розкладу МАК, які з’являються в п| цесі зберігання препарату.

Звичайно припустимий ступінь розкладу діючого компоненту при збереганні п| тягом терміну придатності — 1-2%. Як відомо з літературних даних, анальгін деграду розчинах з втратою сульфогрупи і наступним утворенням близько двох десятків П| дуктів деградації (будова трьох основних представлена на рис.1). Як показують і складні розрахунки, кожний з продуктів розкладу анальгіну буде міститись у проб

сн3

н3с—с=с—R R = —N4*

Рис. 1 Фенпіверинію бромід (1), пітофенону гід-рохлорід (2), анальгін та продукти його розкладу (3): 4-аміноантипірин, амідопірин, антипірин.

—N(CH Ж

—н

З

ількісті, більшій ніж ФБ. Тоді метою П повинне бути максимальне вилучення як нальгіну, так і продуктів його деградації, що здійснюється за допомогою ТФЕ. Якщо інцева аналітична операція для селективного визначення М!К використовує відмінність їх гідрофобності, то селективність розділення на етапі П повинна засновуваться на ідмінності в кислотно-лужних властивостях компонентів, що розділяються.

*.! І

*.і

неї -

аюі . .І

аіоі

------:

І = 20 °С {= 50 °С і = 70 °С

’ис.2. Залежність селективності розділення анальгіну (1), ФБ (2) та ПГХ (3) від температу->и колонки (У при аналізі лікарського засобу “Реналган” методом обернено-фазової ВЕРХ (пряме введення проби). (4) - продукти деградації компонентів лікарського засобу.

ФБ існує в водних розчинах у вигляді досить гідрофобного катіону (четвертинний мін), і тому буде активно взаємодіяти з катіонообмінниками з гідрофобною функцією, нальгін має сульфогрулу (кислота); продукти його розкладу, в основному, нейтральної рироди. Отож, є два варіанти ТФЕ для відокремлення ФБ від анальгіну та продуктів эго деградації - аніонообмінна і катіонообмінна хроматографія. В першому варіанті вйокає перенавантаження картриджу за анальгіном (та ж проблема, що і в обернено-фа-звій ВЕРХ), і тому єдиним допустимим варіантом залишається катіонообмінна ТФЕ. ибір pH, іонної сили, витискувана та концентрації органічного модифікатора для ТФЕ зговорені в дисертації. Підбірання умов здійснювалося на штучних сумішах, які іітують склад препарату.

Після вибору оптимальних умов ТФЕ необхідно оптимізувати умови кінцевої налітичної операції - ВЕРХ. Зазначена П дозволяє відокремити більшу частину (до 3%) анальгіну, практично усі продукти його розкладу, що заважають визначенню ФБ. днак, невеликої частини анальгіну, що залишилась, вистачає, щоб виникнув “пере-авантаження”, яке істотно ускладнює проведення аналізу, і визначення ФБ доводиться юводити на “хвості” піку анальгіну. Для зниження перенавантаження в роботі викори-ано явище збільшення ємкості колонки при підвищенні температури, і обрана опти-альна температура термостату колонки - 50 °С (рис.2 та За). Подальше підвищення :мператури колонки може призвести до додаткового розкладу залишкової кількості іальгіну (рис. 2) і ускладнює інтерпретацію хр о мато грам. Для визначення ПГХ іеціальна П не потрібна, і тому його визначають прямим введенням проби при темпе-ітурі колонки 50 °С, де спостерігається мінімальна асиметрія для піку анальгіну (рис. >)■

концентрування та очистки з використанням прямим введенням проби; і = 50 °С. (А) -методу ТФЕ; і = 50 °С. анальгін.

Оскільки при визначенні ФБ в даній лікарській формі застосовується два варіан хроматографії, тест придатності хроматографічної системи при проведенні даного ви начення має включати перевірку як стадії П (придатність системи для ТФЕ - повно відокремлювання анальгіну та метрологічні властивості картриджів), так і стадії кінцев аналітичної операції (придатність системи для ВЕРХ - ступінь розділення та асиметр піків, ефективність колонки).

З використанням ТФЕ можливо не тільки визначати МІК, але і значно поліпши визначення МАК. Даний підхід в дисертації продемонстрований на прикладі визначені діючих компонентів аерозолю "Інгаліпт”. Як кінцева аналітична операція використ вується багатохвильова спектрофотометрія, яка сама по собі може давати завищє результати у зв’язку з неконтрольованим світлопоглинанням допоміжних компонент препарату. На основі ТФЕ нами запропонована методика П, яка дозволяє відокреми компоненти матриці, що заважають кінцевій аналітичній операції.

Розглянуті в дисертації приклади, а також узагальнення багатьох літературні даних, дозволяють сформулювати такі закономірності раціонального поєднання ТФЕ кінцевими аналітичними операціями:

• Якщо кінцевою аналітичною операцією є високоселективний метод ВЕРХ, то р жими ВЕРХ і ТФЕ повинні бути взаємодоповнюючими. В протилежному випадку ка тридж ТФЕ буде фати лише роль малоефективної лредколонки. Так, якщо компонен визначають в обернено-фазовому режимі ВЕРХ, то ТФЕ належить проводити в іон обмінному варіанті (нормально-фазовий варіант звичайно ускладнений у зв’язку із сп цифічною природою об’єктів * високополярні речовини). Навпаки, при використан іонообмінної ВЕРХ як кінцевої аналітичної операції, ТФЕ належить вибирати в оберн но-фазовому варіанті.

• Якщо ж кінцева аналітична операція не має високої селективності (наприкла спектрофотометрія), то для ТФЕ слід вибирати найбільш селективну, виходячи з прир ди об'єкту (для лікарських препаратів, в основному, обернено-фазова ТФЕ).

Температура колонки як параметр при оптимізації умов визначення мікрокомпонентів.

При підвищенні температури колонки утримання для всіх компонентів стає мен-им. Це в загальному випадку приводить до зменшення селективності, що є ана-згічним підвищенню долі активного компоненту в бінарній рухомій фазі (РФ). Тому двищення температури можна скомпенсувати зменшенням вмісту активних композитів в РФ.

На перший погляд може видатись, що зниження температури колонки може бути ляхом вирішення ряду аналітичних. Однак, підвищення температури колонки приво-лть до прискорення процесів встановлення рівноваг і до розширення діапазону нійності, тобто до підвищення допустимого навантаження на колонку. Це особливо нно у винахідках, коли доводиться визначати МІК в присутності МАК, пере-авантаження за яким приводить до перекривання піків МІК піками МАК, і, як результат, збить аналіз неможливим. В загальному випадку, підвищення температури колонки на 3-30 °С приводить до збільшення допустимого навантаження на колонку в десятки азів.

Прикладом впливу температури колонки на селективність розділу МІК є розділ змпонентів препарату “Реналган” (рис.2). Підвищення температури, яке спочатку

іачно покращує визначення, призводить до того, що анальгін (термолабільна речови-а) починає розкладатись усередині колонки в процесі хроматографування. Це приво-ить до того, що піки продуктів розкладення анальгіну починають перекриватися з ками визначаємих речовин і виходять разом, що значно погіршує інтерпретацію хро-атограм (рис.2.). Для наведенного прикладу оптимальною температурою аналізу є змпература 50 °С.

Оптимізация якісного складу рухомої фази.

РФ для рідинної хроматографії є основним важелем контролю хроматографічно-

і процесу. В загальному випадку в рідинній хроматографії РФ складається з наступних )мпонентів (деякі з них, природньо, можуть бути відсутніми), і які ми пропонуємо ран-увати так:

1:1-й компонент — розріджувач. Передбачається, що він має практично нульову полюючу силу; 2-й — ІМ-й компонент — розчинники (звичайно органічний), мають дея-і фіксовану елюлюючу силу.

II : Компоненти, що відповідають за фіксоване значення рН, буферність та іонну

ілу.

III : Іон-парні компоненти, що відповідають за вторинні взаємодії за типом намічної модіфікації поверхні сорбенту або утворення іоних пар в об’ємі РФ.

IV: Компоненти, що відповідають за селективні специфічні взємодії типу утворенії комплексів (наприклад, іони міді, коли присутні оптично активні амінокислоти для ззділення оптичних ізомерів; краун-ефіри для розділення лужних та лужноземельних етапів).

До складу РФ також можуть входити допоміжні компоненти, призначені для зв’я-гаання небажаних сумішей в РФ (наприклад, ЕДТА для зв’язування іонів важких ме-

талів). Вибір необхідних компонентів РФ повинен засновуватись на врахуванні природ сорбатів і сорбенту (колонки), що використовується.

Розглянемо регулювання утримування і форму хроматографічного піку на прі кладах з використанням обернено-фазової хроматографії у випадку розділу двох низі комолекулярних сорбатів складної будови, які відрізняються за однією функціональної групою. Пропонується наступна схема вирішення даної задачі:

1. Змінення елюлюючої сили РФ. Об'ємна частка органічного розчинника в Р< покроково змінюється: 80%,, 40%, 20%, 15%, 10%, 5%. Об’ємну частку органічног розчинника в обернено-фазовій хроматографії бажано обірати не більше 80% тому, щ при цьому в процесі хроматографування починають грати значну роль нормально-фг зові взаємодії, що ускладнює подальше регулювання складу РФ. Об’ємна частк розчинника менш 5% також не бажана, бо приводить до функціональної нестійкості РФ до невідтворюваності термінів утримання.

2. Введення сольового фону. Сольовий фон 0.1-1 моль/л при фіксованом рН=5 (середина рекомендованого інтервалу pH). Для утворення сольового фону викс ристовуються сульфати, фосфати або ацетати лужних металів.

3. Змінення pH рухомої фази. pH змінюють в інтервалі 2-8 при сольовому фоі

0.1 моль/л. При pH менш ніж 2 починається помітний гідроліз ефірного зв’язку і відщег люється хімічно прищеплений модифікатор стаціонарної фази; при pH більш ніж починається помітне розчинення силікагельної матриці стаціонарної фази.

4. Введення іон-парного компоненту. Триетилундециламоній - 5 ммоль/л аб октилсульфонат - 5 ммоль/л; сольовий фон — 0.1 моль/л; pH = 5. Якщо при концеї трацїї 5 ммоль/л зазначених іон-парних реагентів покращення ситуації не досягаєтьа то спроби використати іон-парні компоненти слід залишити і шукати більш специфічі агенти.

5. Введення специфічних агентів. Вибираються виходячи з специфіки пари, щ підлягає розділу.

6. Змінення температури колонки та остаточне тонке регулювання. Після оі римання достатньої селективності на одному із зазначених кроків проводиться ог тимізація форми піків (зменшення асиметрії та підвищення ефективності за піком) шл; хом змінення температури, остаточного змінення pH, концентрації сольового фону т; інколи, введенням в склад РФ гідрофобної іонної пари.

Зазначена схема дозволяє з мінімальними витратами сил і засобів раціональн вибирати деякий якісний склад РФ для обернено-фазової ВЕРХ. Отриманий склад Р< можливо далі поліпшувати, вносити кількісні зміни. Наприклад, якщо використання трі етилундециламонію дозволяє розділити пару, однак приводить до асиметрії піків, т замінєння його на катіоний іон-парний реагент з більш коротким алкільним радикалої звичайно приводить до покращення асиметрії. Слід підкреслити, що як тестовий катіок ний іон-парний реагент нами обраний асиметричний триетилундециламоній, а не стаь дартний тетрабутил- або тетраетиламоній. Це пов’язано з тим, що в катіоні тетрг бутиламонію заряд настільки закритий довгими бутильними радикалами, що в деяки випадках він просто не взаємодіє з аніонними частками. Катіон тетраетиламонію ма дуже малу гідрофобність и тому слабо утворює іонну пару з гідрофобними аніонами.

НзО

¡котинамид(РР)

О

ЫН,

со

КС

н,с

Н,-сА^Амн,

тиаминхлоридіВ,)

СНтЬ'Нг рибофлавин(Вл) ОІЇ

•сн?ш СН,?^?^СН,ОН

сн2снрн

НС,]

пиридоксин (В6)

Ні!

Н31

0111 ОІ

мхи

аОСс^

К = Н урацил

р фторурацил

/іс.4 Будова речовин, розділ яких був досліджений методом обернено-фазової ВЕРХ при

оптимізації складу РФ.

Вплив органічного модіфікатору РФ на утримання сорбату, селективність і форму оматографічного піку досить детально вивчений і є ряд рівнянь залежності фактору зимання від складу РФ (рівняння Снайдера, Яронеца, Сочевінського та ін.).

Вплив pH РФ на селективність має складний характер і залежить від будови мо-кул речовин, що розділяються, і сорбенту, що використовується, (для різних марок рбенту С18 селективність в однакових умовах може бути різною). Так, для урацилу і орурацилу (рис.4) при зменшенні pH РФ спостерігається зростання фактору розділу (рис.5). Для рибоксину та гуанозину (рис.4) залежність фактору розділу від pH РФ має подібний характер (рис.6). Для розділення рибоксину і гуанозину, згідно з наступним эком запропонованої схеми, необхідно вводити іон-парний реагент — катіонний або іонний (рис.7). Ефективним виявляється аніонний реагент (рис. 76).

,2 -і ¡2 - ¡2

pH = 6,8; Я = 0,52; pH = 5,0; Я = 0,97; pH = 3,5; И =1,55

Рис.5 Вплив pH РФ на розділ пари урацил (1) - фторурацил (2)

И />

(і 2

52

яг.

2-а г.» ю

рН = 2,5 Я = 0,74 рН = 1,5 Я = 0,55

Рис.6. Вплив рН РФ на розділ пари рибоксин (1) — гуанозин (2).

Якщо попередні кроки не приводять до значного покращення селективності, то у іад РФ вводять специфічні модифікатори (краун-ефіри, циклодекстрини, іони пе-кідних металів і т.л.).

Відзначимо, що із досягненням придатної селективності при використанні іон-пар них реагентів часто виникає асиметрія піків. Це пов’язана з дифузією іонних пар вгли стаціонарної фази. В цьому випадку для досягнення придатної асиметрії хромате графічного піку пропонується використовувати в складі РФ міцну гідрофобну іонну пар) яка утворюється шляхом додавання до вже використуємого іон-парного реагенту гідре фобного іон-парного реагенту протилежного заряду. Більш стійка гідрофобна пара дк фундуює в глибокі шари стаціонарної фази, не допускаючі туди іонні пари сорбатів. Ц значно поліпшує форму піку (приклад цього - розділення водорозчинних вітамині (рис.4) на оберненій фазі при одному іон-парному реагенті та при сильній іонній па[

при рН=2.5 на розділ пари рибоксин (1) -гуанозин (2).

натрію при рН=2.5 на розділ пари рибоксин (1) - гуанозин (2).

Рис. 8. Розділ водорозчинних вітамінів на оберненій фазі: РФ с рН=2.5 з одним іон-пар-ним реагентом (рисунок зліва) та сильною гідрофобною іонною парою тетрабутипамоній-

октилсульфонат (рисунок зправа).

Прискоренна схема пошуку оптимального складу елюенту.

Основною проблемою в хроматографії є швидкий підбір РФ, придатної для даь ного розділення. Для експериментального пошуку складу РФ нами використована ТІШ котра дає можливість для проведення більшого об’єму експерименту в відносно маі терміни і з дуже невеликою витратою матеріалів. На одній стандартній ТШХ-пластині протягом однієї-двох годин можливо провести до півсотні випробобувань хромате графічних систем, експериментально здійснити практично усі доступні варіанти РФ.

Нами розроблений алгоритм пошуку складу РФ на основі радіальної хромате графії. Методологічною базою алгоритму оптимізації є праці В.П.Георгієвського т

О.І.Гризодуба з теорії нормально-фазової ТШХ. Основні положення теорії полягають наступному:

1)Якщо є ряд бінарних РФ (1,2), (1,3),...(1,ІЧ) з яких (1,2) демонструє максимальн розділення за даною парою сорбатів, то будь-яка РФ типу (1,2,3...) буде демонструват гірше розділення, ніж (1,2). Це положення дозволяє вивести з експерименту дослідже’

потрійних і четвертних фаз, що дозволяє розглядати близько 10 простих бінарних 53, замість сотень більш складних.

2) Якщо розділення двох сорбатів в бінарній РФ (1,2) не спостерігається при будь-зму Яр з оптимального діапазону (0.3-0.6), то воно не буде спостерігатися в усьому тазоні Яр. Це положення дозволяє робити висновки про придатність бінарної РФ ли-

і за одним складом, яким практично завжди може бути склад з 50% (у/у) активного мпоненту.

Алгоритм включає розділ ТШХ-пластини на квадрати 2x2 см; компактне нанесен-проби, розчиненної у легколетючому розчиннику в центр одного з квадратів (діаметр ями близько 2 мм); хроматографування з використовуванням розчинників в ряду зро-ання елюлюючої сили (одержання радіальної хроматограми діаметром 2 см); оцінка ,ержаних хроматограм за допомогою УФ-світла або іншим зручним способом і вибір тивного компоненту та розріджувача (якісний склад); коректування кількісного складу > та перенесення одержаних результатів на лінійну ТШХ або нормально-фазову :РХ.

Рис.9 Радіальні хроматограми анальгіну та потенційних домішок в процесі вибору складу рухомої фази: 1 - гексан, бензол; 2 - хлороформ; 3 - ефір, ацетон; 4 - етилацетат, бутилацетат; 5 - бутанол; 6 -ізопропанол; 7 - пропанол; 8 - етанол; 9 - метанол; 10 - оцтова кислота, вода.

Э (§) (О) (0) ©

1 2 3 4 5

© © 0 0) 0

4 Н М

Рис. 10. Лінійна та ВЕРХ хроматограми домішок в субстанції анальгіну.

А - анальгін; М - амідопірин; Н - антипірин; 4 - 4-аміноантипірин.

Приклад вибору РФ для визначення домішок в субстанції анальгіну представле-ій на рілс.9. 3 рисунка видно, як впливають на розділення анальгіну та потенційних імішок різні розчинники, які звичайно застосовують для розділення речовин в нор-ально-фазовій хроматографії. Як показано в дисертації, оптимальне розділення іальгіну та потенційних домішок забезпечує РФ складу: метанол (активний компонент) 5ензол (розбавних). На рис. 10 зображена лінійна та ВЕРХ хроматограми домішок в бстанції анальгіну, отримані при використанні елюенту, якісний и кількісний склад яко-був вибраний за допомогою розробленої схеми.

Практично даний підхід можно без особливого ускладнення використовувати при борі оптимального складу елюенту для нормально-фазової ВЕРХ, з кінцевим корек-

туванням обраного складу. Дана схема придатна і для оптимізації складу РФ для обер нено-фазової хроматографії. Однак в даному випадку є ряд труднощів, зокрема — пога на змочуваність ТШХ-пластинок для обернено-фазової хроматографії.

Особливості хроматографичної поведінки алкилсульфонатів при зміні температури колонки.

Оскількі алкилсульфонати - важливі іон-парні реагенти, які широко використову ються в хроматографії (в тому числі в нашій роботі), ми провели деякі додатков дослідження їх сорбції на різних сорбентах. При цьому ми зустрілися з цікавим явищев (рис.11): при хроматографуванні алкилсульфонатів з використанням іонообмінногі варіанту ВЕРХ при підвищенні температури колонки термін утримання коротколан цюгових алкилсульфонатів, як чекали, збільшувався, тоді як для довголанцюгових вії зменшувався, що суперечить рівнянню Мартіна. Дане явище пояснюється таким чином алкилсульфонати взаємодіють із сорбентом за двома механізмами взаімодії - іона обмінного і гідрофобного. Іонообмінний механізм призводить до перенавантаження з; ленгмюрівським типом; утримання за цим механізмом зменшується, і термін утриманн: зменьшується в цілому. При цьому форма піку не дає повної уяви про форму ізотерм; сорбції за іонообмінним механізмом, бо хроматографічний процес є суперпозиціє* двох сорбційних процесів - іонообмінного та процесу, пов'язаного з гідрофобної взаємодією. При збільшенні довжини алкильного радикалу алкилсульфонату зраста частка вкладу гідрофобних взємодій та зменшується внесок іонного обміну в загальн утримання. По мірі підвищення температури зменшується перенавантаження за іоне обмінним механізмам внаслідок підвищення швидкості обміну. Утримання за цим мехг нізмом збільшується. Для не перенавантаженого гідрофобного механизму утриманн зменшується. Суперпозиція цих двох явищ призводить до того, що для алкилсульфс натів з короткимі алшіьниміи радикалами відбувається ріст утримання при підвищені температури, бо переважае іонообмінний механізм, а для алкилсульфонатів з довгим алкильнимі ланцюгами навпаки - утримання зменшується, бо переважає гідрофобни механізм.

Рис.11. Залежність утримання алкилсульфонатів від температури колонки в режимі іонообмінної хроматографії

Термін утримання, хв.

Температура колонки, гр.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Запропонована та практично перевірена концепція раціонального поєднання рдофазної екстракції з різними за селективністю кінцевими аналітичними оленями, такими як спектрофотометрія и високоефективна рідинна хроматографія;

2. Запропонована та практично перевірена емпірична схема пошуку оптимальних )в для високоефективної рідинної хроматографії, яка використовується як для кон-лю мікрокомпонєнтів у присутності макрокомпонентів, так і для розділу близьких за ютивостями сорбатів.

3. Запропонована та практична перевірена схема експресного пошуку складу ру-лої фази для нормально-фазової рідинної хроматографії з використанням радіальної )матографії.

4. Виявлена та далі поясненна аномальній залежность утримання алкилсульфо-гів від температури у режимі хроматографування на сильному аніонообміннику малої ності з гідрофобною функцією.

5. Розвинені підходи були впроваджені в методиках контролю якості ряду лікарсь-с препаратів: визначення мінорних компонентів (фенпіверинію бромиду та питофено-гідрохлориду) в таблетках та ін’єкціях “Реналган", визначення складу норсульфазо--натрію та стрептоциду розчинного в аерозолі “Інгаліпт”, визначення слідових забруд-нь в інфузійних лікарських препаратах, визначення сторонніх домішок в субстанції та злетках анальгіну. Розроблені методики увійшли до 10 затверджених офіційних нор-ітивно-аналітичних документів.

Основний зміст дисертації викладений в таких роботах:

1. Левин М.Г., Гризодуб А.И., Леонтьев Д.А., Асмолова H.H., Куликов А.Ю., Геор-звский В.П. Стандартизация хроматографического анализа лекарственних средств, юбщение 2. Некоторые вопросы применения теста “Проверка пригодности хромато-афической системы" при контроле качества лекарственных средств. // Харьков, Фар-жом, 1996, N1/2, с. 16-26

2. Асмолова H.H., Куликов А.Ю., Левин М.Г., Гризодуб А.И.,Георгиевский В.П. зименение метода твердофазной экстракции в контроле качества лекарственных іепаратов. Сообщение 1. Применение ТФЭ в анализе аэрозоля “Ингалипт” //Харьков, армаком, 1996, № 4/5, с. 20-24

3. Куликов А.Ю., Асмолова H.H., Левин М.Г., Гризодуб А.И., Леонтьев Д.А., інченко A.A., Георгиевский В.П. Применение метода твердофазной экстракции в кон-юле качества лекарственных препаратов. Сообщение 2. Применение ТФЭ в сочета-іи с высокоэффективной жидкостной хроматографией в анализе комбинированных гкарственных средств, содержащих минорный компонент. //Харьков, Фармаком, 1996,

2 7, с. 22-29.

4. Куликов А.Ю., Левин М.Г., Гризодуб А.И., Георгиевский В.П. Применение мето-

3 твердофазной экстракции в анализе лекарственных средств. I Тез. доп. на наук.-закт. конф. “Досягнення сучасної фармації - в медичну практику”, Харків, 1996, с.58.

Куликов А.Ю. Оптимизация условий жидкостной хроматографии пр контроле качества некоторых лекарственных средств и субстанций.

Диссертация — рукопись на соискание ученой степени кандидат химических наук по специальности 02.00.02 — аналитическая хими: Харьковский государственный университет, Харьков, 1997.

В диссертационной работе предложена концепция рациональної объединения твердофазной экстракции с различными по селективносі конечными аналитическими операциями; исследована оптимизацк ВЭЖХ-определения микрокомпонентов по таким параметрам как темпі ратура колонки, тип стационарной фазы и состав подвижной фазы; фо| мализирован выбор состава подвижной фазы для достижения оптималі ной селективности при анализе сложных объектов лекарственной хими предложена схема экспрессного поиска состава подвижной фазы с и пользованием радиальной хроматографии; обнаружена и объяснен аномальная зависимость удерживания алкилсульфонатов от температ ры в режиме хроматографирования на сильном ионообменнике с гидр фобной функцией.

Полученные данные вошли в виде методик в 10 нормативи аналитических документов.

Kulikov Ar. Ur. Optimization of liquid chromatodraphy conditions quality control of some drug products and drug substations.

The manuscript rights is submitted for a Candidate Degree in Chemic Science by speciality 02.00.02 — analytical chemistry, Kharkov Sta University, Kharkov, 1997.

In the dissertation the conception of the efficient combination of soli phase extraction and various with respect to selectivity finite analytic operations has been suggested; the HPLC procedured for determing micr components have been optimazed with respect to such parameters as tl column temperature, stationary phase type and mobile phase compositio the choice of the mobile phase composition has been formalized from tl angle of optimal selectivity in analyzing involved objects of drug chemistry; schem for the express choice of the mobile phase composition with the u; of radial chromatography has been suggested; the anomalous dependence the retention of alkylsulphanates on the temperature in the cases of tl strong ion-exchanger with hydrophobic function has been noted ai explained.

The results obtained nave been included in the form of procedures in 10 regulatory-analytical documents.

Ключеві слова: елюент, ВЕРХ, TUJX, оптимізація, рухома фаза, ст ціонарна фаза, іон-парний реагент, селективність, контроль якос лікарських засобів, спектрофотометрія, багаьокомпонентна сумії аналіз.