Высокоэффективная мембранная хроматография тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.20 ВАК РФ

ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ТЕННИКОВА Татьяна Борисовна

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ МЕМБРАННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ: ФОРМИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ПОРОВОГО ПРОСТРАНСТВА ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ МЕЖФАЗОВОГО РАЗДМЕНИД^ВЙ^Ш^

Ь в Л/

ДИССЕРТАЦр/ ^ на сонс'кащ доктора х] ¡мическиг наук (02.00.20 -: сроматография)

Санкт-Петербург 1998

Оглавление

стр.

Глава 1. Введение 5

Глава 2. Аналитический обзор

2.1. Биосепарация - основной этап биотехнологии: новые разделительные

фазы и методы 8

2.1.1. Усовершенствование технологии производства хромато-

графических сорбентов 11

2.1.2. Привлечение мембранной техники к решению хроматографи-ческих задач 12

2.1.3. Введение в практику непрерывных разделительных слоев 16

2.2. Использование "аффинности" (биологической комплементарности) в down-stream процессах

2.2.1. Сорбенты для биоспецифических (аффинных) межфазовых разделений биологических субстанций 18

2.2.2. Аффинные лиганды 21

2.2.2.1. Лиганды высокой специфичности. 22

2.2.2.2. Общеспецифические аффинные лиганды

2.3. Иммобилизованные ферменты и ферментная технология 25

2.4. Краткий обзор существующих теоретических моделей интеракцион-ных типов хроматографических разделений

2.4.1. Градиентная и изократическая адсорбционная хроматография 29

2.4.2. Перфузионная хроматография и другие виды хроматографических разделений с улучшенным массопереносом 30

2.4.3. Стехиометрическая модель удерживания 33 2.4.. 4. Теоретическая модель существования

"рабочего слоя сорбента " 35

2.5. Сорбентные материалы на основе макропористого сополимера 2,3 -эпокси-пропилметакрилата (глицидилметакрилата) и этиленгликольдиметакрила-та (этилендиметакрилата) (ГМА-ЭДМА) 36

Литература 38

Глава 3. Основная часть

3.1. Макропористые полимеры на основе сшитого этилендиметакрилатом глицидилметакрилата (ГМА-ЭДМА)

3.1.1. Тонкое конструирование порового пространства на примере синтеза полимерных макропористых ГМА-ЭДМА сорбентов для эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ) различных классов макромолекуляр-ных веществ 46

3.1.2. Формирование топографии адсорбционной поверхности ГМА-ЭДМА сорбентов 66

3.1.3. Монолитные ГМА-ЭДА макропористые слои контролируемой морфологии и топографии 1Ъ

3.2. "Одноактный" десорбционный процесс и "многоактная" адсорбция -десорбция в хроматографических разделениях 92

3.3. Принципы разделения белков в мембранной хроматографии

3.3.1. Особенности белков как макромолекулярных объектов транспортного сепарационного процесса 95

3.3.2. Статистическое описание процесса одноактной десорбции 97

3.3.3. Чем определяются параметры пика в десорбционной хроматографии ? 102

3.3.4. Чем определяется разрешение пиков (эффективность разделения) в мембранной хроматографии? 107

3.3.5. Внутрипоровая гидродинамика - важный параметр

оптимизации разделения в мембранной хроматографии

3.5. Практическое применение ГМА-ЭДМА макропористых стационарных фаз с контролируемым поровым пространством для различных видов процессов, связанных с межфазовым распределением биополимеров, но отличающихся от классического динамического разделения (хроматографии)

3.5.1. Образование аффинных (биоспецифических) комплексов

3.5.1.1. Выделение рецепторных белков стрептококков

3.5.1.2. Комбинаторная хроматография: использование нескольких дисков различной функциональности в одном акте биосепарации

139

123

3.5.1.3. Использование синтетических пептидов в качестве

биоспецифических лигандов. Эффективные иммуносорбенты. 140

3.5.1.4. Практическое построение in vitro моделей биологических взаимодействий

148

3.5.2. Проточные реакторы непрерывного действия на основе иммобилизованных ферментов.

149

Литература

157

Выводы

162

Общий лист библиографии

165

Приложения

176

Глава 1. Введение.

Хорошо известно, что все биологические функции в живых организмах осуществляются путем взимодействия активных фрагментов и направленного транспорта (массойереноса) как самих этих фрагментов, так и продуктов их взаимодействия. Очень часто взаимодействие биомолекул происходит на границе раздела физических фаз, когда один комплемент локализован (например, мембранные рецепторные белки), а другой находится в потоке биологической жидкости. Образование комплементарных пар с выполнением определенной функции, т.е. процессы межфазового функционального распределения биологических молекул, могут быть смоделированы in vitro. Этот экспериментальный путь чрезвычайно заманчив и сулит массу интересных и, возможно, неожиданных результатов, которые позволили бы вычленить какое-то одно биологическое событие из массы одновременно происходящих in vivo. Понятно, что данные эксперименты требуют повышенного внимания к той "стационарной фазе", на которой строится подобная модель. Для адекватного описания исследуемых взаимодействий и перенесения научных выводов на реальные биологические процессы необходимо свести к минимуму (или приблизить к естественному) влияние данной искусственной поддерживающей среды, используемой для пространственной локализации (иммобилизации) одного из активных компонентов, на кинетику и термодинамику образования биологических пар. Идеальная стационарная фаза не должна провоцировать неспецифических взаимодействий между биологическим веществом и собственной поверхностью, обеспечивая при этом равную доступность к активным поверхностным лиган-дам и осуществляя функцию незатрудненного транспорта как аффинанта (т.е. подвижного биологического комплемента, находящегося в жидкой фазе), так и продукта.

Следует здесь же отметить, что выделение и очистка белков, наравне с упомянутыми выше исследованиями их взаимодействий в растворе и в локализованном состоянии, имеет также чрезвычайно важное значение как для

решения фундаментальных задач теоретической биологии, так и для осуществления сугубо практических планов, связанных, в первую очередь, с созданием лекарственных препаратов на их основе. Основной и важнейшей задачей в производстве биологически активных веществ медицинского назначения, среди которых самая высокая доля приходится на белки и пептиды, является именно разработка стадии их выделения и тонкой очистки, т.е. создание высокоэффективных и высокопроизводительных сепарационных методов.

Крайне популярным методом разделения веществ, основанного на их квазиравновесном распределении между двумя фазами, является жидкостная хроматография (ЖХ). Поскольку в данном методе межфазовое распределение вещества также является основным условием функционирования слоя как разделительной матрицы, хроматографический процесс может служить прекрасным инструментом тестирования пористых стационарных сред, предназначенных для более тонких с биологической точки зрения, но менее чувствительных к физико-химическим параметрам методов моделирования взаимодействий комплементарных биологических пар. Высокоэффективное хроматографичес-кое разделение веществ с использованием или в отстутствие каких-либо адсорбционных взаимодействий, будучи сложным динамическим процессом, является уникальным средством проверки транспортных свойств специально создаваемых носителей. Более слабые, чем биологически направленные взаимодействия (а именно, ионные, гидрофобные) позволяют судить не только о морфологии, но и о топографии внутренней поверхности подобных фаз. Другими словами, искусственная модель межфазового распределения, "идеально" работающая в хроматографии, обязательно будет выполнять свои функции и в биологических модельных исследованиях. Следует также иметь в виду, что все виды хроматографии, безусловно, занимают главенствующее место в биотехнологической идеологии. Именно здесь находит место увязка идей эффективного масстранспорта (интеракционные виды ВЭЖХ) и биологической компле-ментарности (аффинная хроматография).

Обе обсуждаемые выше актуальные научные проблемы в данной диссертационной работе принципиально объединены в один пакет. Очевидно, что создание макропористых носителей для хроматографии белков (т.е. наиболее сложного динамического процесса, основанного на межфазовом распределении вещества), максимально приближенных к "идеальным" с точки зрения их химии и морфологии, откроет дорогу к постановке и решению более тонких, биологических задач, связанных с исследованием и практическим использованием упомянутой природной особенности биологических веществ.

Глава 2. Аналитический обзор.

2.1. Биосепарация - основной этап биотехнологии: новые разделительные фазы и методы.

Мощное развитие молекулярной и клеточной биологии в последнюю четверть века привело к созданию новых технологий производства сложных и имеющих огромное практическое значение биологических объектов. В первую очередь, подобные продукты направлены на использование в здравоохранении, т.е. предназначены для современной диагностики, профилактики и лечения заболеваний. Уже давно стало очевидным, что наиболее важной и, в то же время, наиболее дорогостоящей стадией в такого рода производствах является выделение и очистка целевой субстанции в условиях непрерывного биотехнологического процесса (downstream processing). Затраты на данном этапе составляют более 50% от общей стоимости производственного цикла. Для этих целей наиболее широко используются такие методы как осаждение, ультрафильтрация и жидкостная хроматография, однако только последняя может гарантировать степень очистки продукта до безопасного терапевтического уровня.

Обычно требуется несколько хроматографических стадий для доведения степени очистки производимой биологической субстанции до требуемого стандарта. Ускорение данных шагов в общем биологическом цикле, а также сокращение их числа безусловно приводило бы к уменьшению затрат и, соответственно, к уменьшению стоимости конечного продукта. Следовательно, только параллельное развитие молекулярной биологии и сепарационных методов, среди которых, безусловно, лидирует жидкостная хроматография, может привести к созданию самых эффективных производств сложных биологических объектов.

Как правило, жидкостная хроматография представляет собой достаточно медленный процесс, в результате которого имеет место ощутимая деградация биологического продукта. Классическая препаративная и аналитическая

жидкостная хроматография являются к тому же довольно дорогими методами в силу высокой стоимости всех необходимых аксессуаров.

По современному определению [1], хроматографический сепарационный процесс происходит в условиях динамического квазиравновесного распределения вещества между подвижной (жидкой) и неподвижной (твердой) фазой. При этом разделяемые биологические молекулы взаимодействуют с поверхностью неподвижной, как правило, пористой фазы по механизму адсорбции ("положительное" взаимодействие) или эксклюзии ("отрицательное" взаимодействие или исключение из пор малого размера). Молекула попадает внутрь порового пространства сорбента за счет собственной диффузионной подвижности. Различного рода диффузионные ограничения резко замедляют процесс биосепарации, поскольку при увеличении скорости потока жидкой фазы на обычных упакованных сорбентом колонках наблюдается уменьшение разрешения разделяемых зон вследствие увеличения их хроматографического размывания [2]. Модификация подобных разделительных сред, направленная именно на возможность увеличения скорости хроматографического разделения, должна предполагать следующие задачи:

- оперативное проведение on-line анализов производимых биологических субстанций [3];

- снижение производительных затрат [2];

- уменьшение потерь вследствие деградации биологического продукта [2];

- увеличение скорости масштабированных процессов.

В поисках ответа на перечисленные выше требования за относительно короткий период времени, а именно, в последние десять лет, было разработано и выпущено на рынок множество новых хроматографических стационарных фаз [3-11]. Все представленные новейшие носители для динамических сепара-ционных процессов теоретически предназначаются именно для процессов препаративного выделения биологических продуктов из сложных смесей, процессов быстрого и качественного текущего контроля накопления необходимого

продукта в биотехнологических реакторах, а также для эффективного скоростного анализа конечной биологической субстанции, полученной в полном технологическом цикле.

Эффективное выделение ценных лабильных биологических молекул (в большинстве случаев, это белки) требует применения быстрого и надежного разделительного процесса, проводимого в мягких условиях. Несмотря на то, что каждый биотехнологический процесс должен иметь четкий регламент, а готовый продукт отвечать заложенным стандартам, в производстве биологически активных веществ крайне необходимо осуществлять контроль на каждой стадии [12]. Кроме того, стоимость производства является чрезвычайно важным фактором, который регулирует в значительной степени деятельность исследователей, предлагающих все новые и новые разделительные среды для обсуждаемых процессов.

Современные стационарные фазы для хроматографических разделений биологических веществ должны отвечать следующим требованиям [3, 9, 13]:

- обеспечивать эффективный, желательно одностадийный, сепарационный процесс;

- обладать высокой "биосовместимостью", т.е. оптимизированными под биологические объекты физическими и химическими свойствами, включая морфологию и поверхностную топографию порового пространства;

- обладать высокой емкостью;

- обеспечивать высокую объемную проницаемость;

- демонстрировать низкие рабочие давления;

- одинаково эффективно позволять проведение как препаративных, так и аналитических разделительных операций;

- отвечать всем требованиям безопасности;

- быть удобными в обращении;

- обладать высокой стабильностью в широких пределах изменения физико-химических внешних условий, включая жесткие условия стерилизации и

регенерации;

- обеспечивать высокую воспроизводимость получаемых результатов.

Препаративные и аналитические хроматографическче колонки, упакованные традиционными пористыми частицами сорбента, отвечают лишь части выдвинутых требований. Медленная диффузия больших молекул внутрь поро-вого пространства подобных стационарных фаз обусловливает малую скорость межфазового массопереноса и, соответственно, низкую скорость сепара-ционного процесса в целом [14]. Для преодоления данного недостатка были предложены новые оригинальные подходы:

- Усовершенствование технологии получения частиц сорбентов

- Привлечение мембранной техники к решению хроматографических задач

- Введение в практику непрерывных разделительных слоев

2.1.1. Усовершенствование технологии производства хроматографических сорбентов.

С целью улучшения эффективности разделения в последние годы были разработаны новые типы мелкозернистых пористых сорбентов, а также новые методы биосепарации с их использованием:

(а) Предложены новые технологии получения частиц с улучшенными масс-транспортными свойствами, обеспечивающими ускоренный по сравнению с традиционными сорбентами межфазовый перенос вещества, а именно, производство микропелликулярных [3, 14-16] и гигапористых структур, представленных в перфузионных [4] и комбинированных гелевых {"gel in a shell") [5] сорбентах. В то время как микропелликулярные стационарные фазы (по сути, непористые частицы в гелевой оболочке) с чрезвычайно низкой емкостью используются только в аналитических целях, гигапористые сорбенты демонстрируют гораздо более высокую емкость и могут быть использованы как в аналитических, так и препаративных разделениях [3].

(б) Улучшение конфигурации адсорбционно-активных лигандов (как то их длина и форма), иммобилизованных на поверхности стационарных фаз, является другим, не менее важным подходом в повышении эффективности процесса разделения. Для этой цели было предложено множество новых типов лигандов, от так называемых "щупальцев" {"tentacle") [17] и тиофильных групп [18] до аминокислот, пептидов, металл-хелатных фрагментов, иммуноаффинных комплементов и многих других, обеспечивающих высочайшее сродство к определенным группам выделяемых биологических молекул. Очень информативные обзоры на эту тему представлены Boschetti [5] и Narayanan [19].

(в) Предложены другие оригинальные дизайны разделительных модулей и методов. В качестве примеров можно отметить радиальную хроматографию [20] и хроматографию протяженного слоя (expanded bed chromatography) [21].

2.1.2. Привлечение мембранной техники к решению хроматографичес-

ких задач.

Мембранная технология может соединять в себе премущества как мембранной фильтрации, так и жидкостной хроматографии с использованием фиксированных разделительных слоев. Ультрафильтрацио