Пептидные производные 5-О-микаминозилтилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля

Шишкина, Анна Владимировна

Пептидные производные 5-О-микаминозилтилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Шишкина, Анна Владимировна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Пептидные производные 5-О-микаминозилтилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля»

Автореферат диссертации на тему "Пептидные производные 5-О-микаминозилтилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Шишкина Анна Владимировна

ПЕПТИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 5-О-МИКАМИНОЗИЛТИЛОНОЛИДА КАК ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РИБОСОМНОГО ТУННЕЛЯ: ДИЗАЙН, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

1 о ДЕК 2009

Москва-2009

003487798

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук, профессор,

академик РАН

Богданов Алексей Алексеевич

доктор химических наук Коршунова Галина Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Олсуфьева Евгения Николаевна

кандидат биологических наук, профессор Крашенинников Игорь Александрович

Ведущая организация: Государственное учреждение научно-

исследовательского института фармакологии имени В.В. Закусова Российской академии медицинских наук

Защита состоится 22 декабря 2009 года в 17 часов на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 199991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 ноября 2009 года.

Учёный секретарь Совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосомы представляют собой молекулярные машины, которые синтезируют все белки живой клетки, транслируя хранящуюся в геноме генетическую информацию. В ходе трансляции синтезируемая на рибосоме полипептидная цепь перемешается по рибосомному туннелю (РТ) от места образования очередной пептидной связи (пептидилгрансферазного центра, ПТЦ) к месту выхода из рибосомы, где начинается процесс "фолдинга" белка. РТ изучается уже почти десять лет с применением разнообразных физических, химических и молекулярно-биологических методов. В частности, установлено, что его стенки "выложены" преимущественно нуклеотидными остатками рРНК, и что взаимодействие растущей полипептидной цепи с ними в некоторых случаях является важным элементом процесса регуляции трансляции. В то же время, такие важные вопросы, как конформация полипептидной цепи в РТ, механизмы ее перемещения по туннелю и взаимодействия с рРНК остаются без ответа. Недавно в нашей лаборатории было предложено попытаться дать ответ на эти вопросы с помощью пептидных производных макролидных антибиотиков.

Действительно, одна из особенностей РТ состоит в том, что вблизи ПТЦ в нем расположен сайт специфического связывания антибиотиков-макролидов. Макролиды представляют собой семейство природных и полусинтетических антибиотиков, которые содержат характерное макроциклическое лактонное кольцо, замещенное одним или более углеводными остатками. К этому семейству относятся антибиотики тилозинового ряда, содержащие 16-членный лактонный цикл - тилонолид. Макролиды широко применяются на практике для лечения заболеваний, вызываемых грамм-положительными бактериями. Фармакологическое действие макролидов основывается на их связывании с рибосомой и блокировании перемещения полипептидной цепи белка в рибосомном туннеле. Поэтому макролидные антибиотики интересны как удобные инструменты для исследования функционирования рибосомного туннеля. С другой стороны, изучение комплексов рибосомных субъединиц с макролидами (а также с многочисленными антибиотиками других классов) важно для понимания молекулярных механизмов антибиотической активности, для выяснения причин устойчивости микроорганизмов к антибиотикам и для рационального конструирования на основе этих знаний новых антибактериальных средств.

Объектом настоящего исследования является макролидный антибиотик тилозинового ряда 5-О-микаминозилтилонолид (ОМТ), который, по сравнению с самим тилозином, лишен двух углеводных остатков - мицинозы и микарозы и содержит лишь один углеводный остаток - аминосахар микаминозу. Пространственное расположение

тилозина в РТ было определено методом рентгеноструктурного анализа (РСА). Исходя из этой структуры и некоторых биохимических данных, можно заключить, что ОМТ, подобно тилозину, связывается с рибосомой вблизи ПТЦ таким образом, что лактонное кольцо антибиотика перекрывает большую часть отверстия РТ. При этом остаток микаминозы направлен в сторону ПТЦ, а первичная гидроксильная группа в положении С23 лактонного кольца ориентирована в сторону выхода из туннеля. Важно подчеркнуть, что ОМТ, как и другие антибиотики тилозинового ряда, связывается с РТ не только специфично, но и чрезвычайно прочно.

Цель работы. Целью работы являлось осуществление дизайна и синтеза пептидных производных ОМТ по гидроксильной группе в положении С23 и изучение их биологических свойств. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Осуществить дизайн пептидных производных ОМТ как потенциальных инструментов для изучения функционирования РТ.

2) Получить 5-О-микаминозилтилонолид из тилозина.

3) Разработать метод синтеза аминокислотных и пептидных производных ОМТ по положению С23.

4) Осуществить синтез N-защищенных коротких пептидов, содержащих остатки фенилаланина и триптофана.

5) Синтезировать феиилаланин- и триптофан-содержащие пептидные производные ОМТ по положению С23.

6) Изучить биологические свойства синтезированных соединений, а именно: а) специфичность связывания с рибосомой, б) способность ингибировать биосинтез белка в системе in vitro, в) антибактериальную активность.

Научная новизна и практическая значимость исследования.

Осуществлен целенаправленный дизайн оригинальных пептидных производных ОМТ - потенциальных инструментов для изучения регуляторного района рибосомного туннеля. Синтезирован ряд защищенных коротких пептидов, содержащих гидрофобные аминокислотные остатки. Впервые разработан метод синтеза и получены не описанные ранее аминокислотные и пептидные производные макролидного антибиотика ОМТ по положению С23. Впервые получены фенилаланин- и триптофан-содержащие производные ОМТ по положению С23. В случае соединений, содержащих триптофан, его остаток находится на различном расстоянии от лактонного кольца макролида, что достигается использованием в качестве линкеров глицина, р-апанина, у-аминомасляиой 11

5-амнновалернановой кислот. Методами химической модификации 23S рРНК и конкурентного вытеснения радиоактивно меченого эритромицина показано, что фенилалашш- и трнптофан-содержащнс производные ОМТ связываются с рибосомой в сайте связывания макролидных антибиотиков. Показано, что пептидные производные ОМТ по ннгибирующей активности значительно превосходят ОМТ в системе транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка (GFP). проявляют активность, несколько превышающую таковую для ОМТ в системе трансляции мРНК люциферазы светлячков. В тестах на антибиотическую активность против некоторых штаммов стафилококков обнаружено, что триптофан-содержащие производные ОМТ обладают сравнимой с ОМТ и тилозином антибактериальной активностью. Таким образом, показана принципиальная возможность использования 23-О-пептндид-ОМТ производных в качестве инструментов для изучения взаимодействия растущего пептида с РТ.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано две статьи и шесть тезисов докладов. Результаты работы докладывались на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоноеов-2006" (Москва,

2006 г.), 29-м Европейском пептидном симпозиуме 29-EPS (Гданьск, 2006 г.), III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007 г.). Международной конференции молодых ученых по фундаментальным паукам "Ломоноеов-2007" (Москва,

2007 г.), 30-м Европейском пептидном симпозиуме 30-EPS (Хельсинки, 2008 г.), Международной научной конференции по биоорганнческой химии, биотехнологии и биоианотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009 г.).

Структура и объем паботм.

Диссертация изложена на 93 страницах и содержит следующие разделы: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы, список литературы (86 ссылок). Материал иллюстрирован 20 рисунками, 8 схемами и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ПОСТАНОВКА 'ЗАДАЧИ И ДИЗАЙН ПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОМТ

Как уже отмечалось, взаимодействие растущего пептида с нуклеотидными остатками 23S рРНК, из которых построены стенки РТ, лежит в основе регуляции экспрессии некоторых генов на уровне трансляции. На расстоянии 25-30 Ä от ПТЦ в РТ была обнаружена область, в которой такие специфические взаимодействия, по-видимому, реализуются с участием боковых ароматических остатков полипептидной цепи. В частности, показано, что основным регулятором биосинтеза триптофаназы, отвечающей за катаболизм триптофана, является остаток Тгр12 в последовательности т.н. лидерного пептида ТпаС. Анализ пространственной структуры 50S субчастицы рибосомы и ее комплекса с тилозином показывает, что регуляторный район РТ и сайт связывания макролидов в нем сильно перекрываются. Этот анализ также показывает, что в случае ОМТ, благодаря удачной пространственной ориентации его С23-гидроксильной группы и отсутствию углеводного заместителя в этом положении, открывается возможность сканировать потенциальный регуляторнон район РТ с помощью пептидных производных этого макролида. При этом сам антибиотик будет выполнять роль "якоря", достаточно жестко закрепленного в РТ. Пример подобного компьютерного моделирования триптофан-содержащих производных ОМТ в рибосомном туннеле показан на рисунке 1.

Рис. 1. Компьютерное моделирование расположения 23-0-(B0C-Trp-yAbu)-0MT в РТ в двух проекциях (А и В) (по данным А.В.Головина). В качестве линкера между ОМТ и Tip выступает у-аминомасляная кислота. Для простоты остаток сахара в ОМТ не показан. Нуклеотидные остатки А752 и U2609 участвуют в формировании регуляторного района РТ по данным сайт-направленного мутагенеза 23S рРНК.

Компьютерное моделирование показало, что в полости туннеля между гидроксилыюй группой при С'23 ОМТ м нуклеотидными остатками 23 S рРНК, входящими

в состав регуляторного района РТ, можно разместить пептиды ограниченной длины, в частности днпептнды с ^концевым триптофаном, в которых С-концсвой остаток варьируется от глицина до З-аминовалернановой кислоты. Для того, чтобы соответствовать ориентации растущей полнпептндной цепи в РТ, все пептиды должны быть связаны споим С-концом с ОН-группон в положении С'23 0\1Т. Их Ы-концы должны быть аиилнрованы, поскольку остаток метионпна на N-кoнцe синтезируемого бактериальными рибосомами белка формнлнрован.

2. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКА 5-О-МИКАМИНОЗИЛТИЛОНОЛИДА

Согласно поставленной задаче, на первом этапе синтетической части работы необходимо было получить исходный для всех последующих соединений антибиотик ОМТ (I) из продажного препарата тилознна. В патентной литературе описано два варианта получения ОМТ путем кислотного гидролиза тилозина - с применением водных растворов серной и трпфторуксуснон кислот. Мы обнаружили плохую воспроизводимость этих методик и образование большого количества побочных продуктов, поэтому варьировали время и температуру реакции, однако избежать подобных проблем не удалось. В конечном счете, остановились на методике с использованием серной кислоты (рН 2) при кипячении е обратным холодильником в течение трех суток (Схема 1).

.о

Десмикозин

17 сн-

5-О-Микаминозилтилонолид (I)

Схема 1. Получение ОМТ.

Основные трудности возникли на стадии выделения чистого препарата. Мы воспользовались комбинацией двух методик очистки продукта из патентной литературы, несколько их видоизменив: проводили экстракцию хлороформом из реакционного раствора промежуточно образующегося десмикозина (Схема 1) и ОМТ, соответственно при значениях pH 4.5 и 8.0, а не 6.0 и 9.0, как было предложено в одном из патентов. Окончательную очистку целевого вещества проводили согласно другому патенту методом колоночной хроматографии на силикагеле, но вместо описанной авторами хроматографпчеекой системы, мы подобрали наиболее эффективный элюент, содержащий хлороформ и метанол, насыщенный газообразным аммиаком, в соотношении 15:2. Препарат антибиотика ОМТ, индивидуальный по ТСХ и ВЭЖХ, был получен с выходом 50%. Поскольку данное вещество являлось исходным для всей последующей работы, его строение было подтверждено с помощью методов масс-спектромегрии и ЯМР-спектроскопии.

3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА СИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТНЫХ И ПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОМТ ПО ПОЛОЖЕНИЮ С23

В структуре макролпдного антибиотика ОМТ присутствуют 4 гидроксильные группы - в положениях 3, 23, 2' и 4' (Схема 1). Из литературных данных известно, что гидрокенльная группа в положении 3 обладает низкой реакционной способностью. Хотя вторичные гидроксильные группы являются в общем случае менее активными, чем первичные, в случае микаминозы 2'- и 4'-гидроксильные группы, вследствие присутствия электроотрицательных атомов в углеводном остатке, в некоторых реакциях проявляют повышенную реакционную способность. Поэтому для получения производных по С23 гидрокенльной группе представлялось логичным предварительное блокирование ОН-групп микаминозы. Была выбрана схема, включающая предварительное ацетилнрованпе 2'- и 4'-гидроксильных групп микаминозы уксусным ангидридом в хлористом метилене (с образованием ди-О-ацетпл-ОМТ (II)) и последующее ацилнрование антибиотика по положению С23 (Схема 2).

Для получения пептидных производных ОМТ по положению С23 принципиально возможны две стратегии синтеза. Первая предполагает ацилнрование первичной спиртовой группы антибиотика активированным производным аминокислоты с дальнейшим ступенчатым наращиванием пептидной цепи. Вторая стратегия заключается в конъюгации заранее синтезированного пептида с указанной спиртовой группой макролида.

В соответствии с первым подходом, ди-О-ацегил-ОМТ (II) вводили в реакцию с защищенной аминокислотой в присутствии активирующей системы реагентов

ОСС/'ОМАР*. В результате, как показано на схеме 2, были получены следующие аминокислотные производные ОМТ: 23-0-(В0с-С1у)-2',4'-Дп-0-Ас-0МТ (III), 23-0-(Вос-рА1а)-2',4'-ди-0-Ас-С)МТ (IV), 23-0-(Вос-1..у5+(Рогт))-2',4'-ди-0-Ас-ОМТ (V).

III: Р=5ос-С!у-IV:

V; Р(=Бос-1уз(Рсхт}-IX: В=Бос-А1аА!а-X: П=Бос-(3!уРго)3-

VI: П-Е.х С1у-VII: Р=Вос-|1Л1а-VIII: Р=Вос-1у5!РстЬ XI: И=Вос-А1аА1а-XII: Р=Вос-|С1/Рго;|,-

Схема 2. Обшая схема получения аминокислотных и пептидных производных ОМТ.

В ходе очистки промежуточных соединений, в частности, методом колоночной хроматографии на силикагеле в системах, содержащих метанол, была обнаружена нестабильность ацетильных защитных групп. Соединения III-V содержали примеси моно-и бис-дезацетилировашшх соединений п поэтому были охарактеризованы только методом масс-спектро.метрии. Далее было проведено исчерпывающее удаление ацетильных групп при выдерживании в течение 18 часов в метаноле при 45°С и получены аминокислотные производные ОМТ (\I-VHI) (Схема 2), которые далее использовались нами для изучения возможности ступенчатого наращивания пептидной цепи. С этой целью был проведен поиск оптимальных условий удаления Вос-группы с производных антибиотика. Поскольку стандартный метод удаления Вос-группы трифторуксуснои кислотой в нашем случае привел к сильному осмоленпю и большому количеству побочных продуктов, мы

ОСС - дицнклогексилкарбодиимид, ОМАР - 4-диметпламинопиридин

Если особо не указано, здесь и далее, все используемые оптически активные аминокислоты относятся к Ь-ряду.

попользовали другие реагенты, варьировали температуру, растворители и время протекания реакции. Однако ни в одном из случаев нам не удалось получить продукт с хорошим выходом. Кроме того, реакция конденсации со следующей аминокислотой проходила также с низким выходом. Поэтому стратегия ступенчатого удлинения цепи оказалась для нас неприемлемой.

Другой подход, как уже указывалось, заключался в присоединении к С23 гидроксилу синтезированных заранее пептидов со свободной карбоксильной группой. Используя разработанный нами метод присоединения аминокислоты к антибиотику и имея в распоряжении пептиды, ранее синтезированные в нашей лаборатории (Вос-А1а-А1а-ОН и Вос-(С1у-Рго)з-ОН), мы показали возможность конъюгации их с антибиотиком с образованием как диацетильных (IX, X), так п дезацетнлнрованных пептидных производных (Х1-ХН) (Схема 2). Позднее для производных ОМТ был разработан метод селективного ацилирования С23 первичной спиртовой группы антибиотика ОМТ защищенными аминокислотами со свободной карбоксильной группой в присутствии ОСС и каталитических количеств ОМАР при пониженной температуре. Несмотря на то, что гидроксильные группы микампнозы являются активными, понижение температуры реакции и объемность заместителей способствует прохождению реакции преимущественно по положению С23 антибиотика. Этим путем были получены соединения VI и VII (Схема 2). Характеристики ОМТ, ди-О-ацетил-ОМТ и полученных аминокислотных и пептидных производных представлены в таблице 1.

Таблица 1.

ОМТ и его производные Шифр И/ МБ

и я Гиен о вычислено

1 ОМТ 1 0.40" 598.2 [М+ Н]+ 597.4

2 2',4-ди-О-Ас-ОМТ II 0.48" 682.7 [М+ НГ 681.4

3 23-О-(В0с-С1у)-2',4'-ди-О-Ас-ОМТ III 0.59" 839.6 [М+Н]+ 838.4

4 23-0-(В0с-РА1а)-2',4'-ди-0-Ас-0МТ IV 0.58" 853.7 [Д/+Н]+ 852.5

5 23-0-(Вос^у5(Рогт))-2'.4'-ди-0-Ас-ОМТ V 0.60" 938.8. [Л/+НГ 937.5

6 23-0-(Вос-С1у)-ОМТ VI 0.35" 755.5 [М+Щ* 754.4

7 23-О-(В0с-РА1а)-ОМТ VII 0.37" 769.6 [Л/+Н]+ 768.4

8 23-0-(Вос1.у5(Рогт))-ОМТ VIII 0.41" 854.5 [А/+Н]+ 853.5

9 23-О-(В0С-А1а-А1а)-2',4'-ди-О-Ас-ОМТ IX 0.63" 925.8 [М+Н1+ 924.5

10 23-0-(Вос-(0!у-Рго)з )-2',4'-ди-0-Ас-0МТ X 0.83" 1266.8 [Л/+ЫаГ 1243.6

и 23-0-( Вое-А1а-А 1а)-ОМТ XI 0.40" 840.4 [Л/+Н]+ 839.5

12 23-О-(В0с-(О1у-Рго)3)-ОМТ XII 0.64" 1160.7 [Л/+Н]+ 1159.6

* хлороформ-метанол-вода, 65:25:4, "хлороформ-этилаиетат-мстанол, 6:3:1

4. СИНТЕЗ ^ЗАЩИЩЕННЫХ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОСТАТКИ ФЕНИЛАЛАНИНА И ТРИПТОФАНА

Ирм выборе пептидов для синтеза производных ОМТ, которые могуг служить потенциальными зондами для изучения регуляторного района РТ, мы руководствовались результатами компьютерного моделирования (см. раздел 1). Эти пептиды должны были содержать объемные гидрофобные аминокислотные остатки, в частности остатки фенилаланнна и триптофана, которые, по литературным данным, могуг образовывать специфические контакты с РТ в этой области. Наибольший интерес для пас представлял остаток триптофана, который способен к двум типам взаимодействий с гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот: образованию водородных связей и стэкинг-взанмодействням. Как указывалось выше, остаток триптофана в данном случае важен еще и потому, что он вовлечен в процесс регуляции экспрессии трнптофаназы.

Синтез фенилаланин- и триптофан-содержащих пептидов был осуществлен стандартными методами пептидного синтеза в растворе. Например, дилептид Вос-РЬе-С1у-ОН (XIII) был получен конденсацией п-иитрофенилового эфира Вос-фенилаланина и глицина, а Вос-А1а-А1а-РЬе-ОН (XIV) - с использованием реагентов ОСС и НОВ(. Триптофан-содержащпе днпептиды были синтезированы согласно схеме 3. Вначале были получены гндрохлориды этиловых офнров глицина (XV), р-аланина (XVI), у-ампномасляноп кислоты (XVII) и 8-ампновалериановоп кислоты (XVIII), которые затем вводили в реакцию образования пептидной связи е Вос-триптофаном. В качестве активирующего агента использовали ВОР, в качестве основания - 01РЕА. Так были синтезированы этиловые эфиры дипептидов Вос-Тгр-О1у-ОЕ1 (XIX), Вос-Тгр-рА1а-ОЕ1 (XX), Вос-Тгр-уАЬи-ОЕ1 (XXI). Вос-Тгр-5Аре-ОЕ1 (XXII), которые были омылены в водно-спиртовом растворе щелочи. Таким образом были получены триптофан-содержащне днпептиды со свободной карбоксильной группой: Вос-Тгр-(31у-ОН (п=1, XXIII), Вос-Тф-рА1а-ОН (п = 2, XXIV), Вос-Тгр-уАЬи-ОН (п = 3, XXV), Вос-Тгр-8Аре-ОН (п =4, XXVI) (Схема 3).

V. он ЕЮНабс.

—(4 80С|!

ВОР, 01РЕА, ОМЯ

О ,-СН3

V 0> Воо-Тгр-ОН

НС|.Н2Ы—$

XV: п = 1, XVI: п = 2, XVII: п = 3, XVIII: п = 4

Ж ^(СИг^О. .сн,

NN ^ ^ О

ЫаОНад

ЕЮН

XIX: п = 1, XX: п = 2, XXI: п = 3, XXII: п = 4

Н3С

»Л Г I

йН ^(СН2)П ОН

- ж ^ о

XXIII: п = 1, XXIV: п = 2, XXV: п = 3, XXVI: п = 4

Схема 3. Общая схема синтеза триптофан-содержащих дипептидов.

Структура синтезированных пептидов подтверждена методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрического анализа. Необходимо заметить, что в условиях масс-спектрометрии (ЬС/МЭ-анализ в элюенте, содержащем 0.1% ТРА) происходит удаление Вос-защитной группировки и наблюдаются сигналы, соответствующие массовому числу пептида за вычетом массы Вос-группы (М-Вос+Н) (Таблица 2).

Таблица 1

Пептид Шифр Я/ МБ

Найдено вычислено

1 Вос-РЬе-С1у-ОН XIII 0.30* 323.5 [М+НГ 322.2

2 Вос-А1а-А1а-РЬе-ОН XIV 0.26* 408.6 [М+ Н]+ 407.5

3 Вос-Тгр-С1у-ОЕ1 XIX 0.51* 290.1 [Л/-Вос+Н]+ 389.2 (М), 289.1 (М-Вос)

4 Вос-Тгр-|ЗА1а-ОЕ1 XX 0.60* 304.2 [М-Вос+Н]+ 403.2 (М), 303.2 (М-Вос)

5 Вос-Тгр-уАЬи-СЖ XXI 0.90** 318.2 [Л/-Вос+Н]+ 417.2 (М), 317.2 (М-Вос)

6 Вос-Тгр-8Аре-ОЕ1 XXII 0.48* 332.2 [А/-Вое+Н]+ 431.2 (М), 331.2 (М-Вос)

7 Вос-Тгр-ау-ОН XXIII 0.40** 262.1 [М-Вос+Н]+ 361.2 (М), 261.1 (М-Вос)

8 Вос-Тгр-рА1а-ОН XXIV 0.21* 276.2 [М-Вос+Н]+ 375.2 (М), 275.1 (М-Вос)

9 Вос-Тгр-уАЬи-ОН XXV 0.23* 290.2 [М-Вос+Н]+ 389.2 (М), 303.2 (М-Вос)

10 Вос-Тгр-5Аре-ОН XXVI 0.22* 304.2 [М-Вос+Н]+ 403.2 (М), 303.2 (М-Вос)

*бешол-ацетон-укс. кислота, 100:50:2, "хлороформ-метанол-вода, 65:25:4

5. СИНТЕЗ ФЕНИЛАЛАНИН- И ТРИПТОФАП-СОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОМТ ПО ПОЛОЖЕНИЮ С23

Основываясь на предварительных результатах, изложенных в разделе 3, синтез фенилаланнн-содержащих производных ОМТ по положению С23 был осуществлен селективным ацилированием первичного гидроксила антибиотика, исходя из полученных нами ранее пептидов Вос-Р11е-С1у-ОН (XIII) и Вос-А1а-А1а-Р11е-ОН (XIV) и имеющегося в распоряжении трипептида Рогт-Ме1-Ьеи-Р11е-ОН. Конденсацию пептидов с антибиотиком проводили в присутствии БСС и минимальных количеств йМАР в хлористом метилене при температуре -10 - -5°С. Соединения: 23-0-(Вос-РЬе-С1у)-ОМТ (XXVII), 23-0-(Вос-А1а-А1а-РЬе)-ОМТ (XXVIII), 23-0-(Рогш-Ме(-1еи-РЬе)-ОМТ (XXIX) были получены с выходами 40-60 % после очистки методом колоночной хроматографии на силикагеле.

По разработанной нами схеме для фенилаланнн-содержащих производных ОМТ были синтезированы производные ОМТ, в которых остаток триптофана соединен с молекулой антибиотика с помощью линкеров различной длины - глицина, Р-аланина, у-аминомасляной и 5-аминовалериановой кислот - 23-0-(Вос-Тгр-С1у)-ОМТ (XXX), 23-0-(Вос-Тгр-ДА1а)-ОМТ (XXXI), 23-0-(Вос-Тгр-уАЬи)-ОМТ(ХХХН), 23-0-(Вос-Тгр-5Аре)-0МТ (XXXIII) (Схема 4). Поскольку в качестве линкеров были использованы остатки оптически неактивных аминокислот, условия проведения конденсации не были столь строго контролируемыми, как в случае фенилаланнн-содержащих производных

ОМТ.

ЛСН2*1 ОН

XXIII: п = 1

XXIV: п 3 2

XXV: л = 3

XXVI: п = 4

ОМТ

ОСС, ОМАР СНгС1,

■5 • 0°С

XXX: п = 1 XXXI: п = 2 XXXII: п = 3 XXXIII: п = 4

Схема 4. Получение триптофан-содержащих производных ОМТ.

Все триптофан-содержащие производные ОМТ были очищены методом колоночной .\po\iaioi рафии на сшшкагеле в системах, содержащих хлороформ, метанол, этилацетат и воду в разных соотношениях, и подтверждены методами масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии. Значения хроматографичеекой подвижности, выходы на стадии конъюгации и масс-епектрометрнчеекие данные для фенилалашш- и трнптофан-содержащих производных ОМТ приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Пептидные производные ОМТ Шифр ЦТ мв

найдено вычислено

1 23-0-( Вое- РКе-С 1у)-0МТ XXVII 0.68* 902.6 ¡А/-ИГ 901.5

2 23-0-(Вос-А1а-А1а-Р11е)-ОМТ XXVIII 0.66* 988.1 [М+ НГ 986.5

3 23-0-(Рогт-МеМ_еи-Р11е)-ОМТ XXIX 0.65* 1017.6 ¡А/Ч1Г 1016.5

4 23-0-(Вос-Тгр-С1у)-ОМТ XXX 0.66* 941.7 \М+Щ 940.5

5 23-0-(Вос-Тф-РА1а)-ОМТ XXXI 0.78* 955.6 [Л/+НГ 954.5

6 23-0-(Вос-Тгр-уАЬи)-ОМТ XXXII 0.65** 969.8 ¡ЛЫ1| 968.5

7 23-О-(В0С-Тгр-ЙАре)-ОМТ XXXIII 0.68** 983.7 |АН1|' 982.6

* хлороформ-мстаноп-вода. (>5.25.4, ** хлороформ-мстанол-ж>,та-.>тилаиетат, 20:6:1 -.0.3

Пептидные производные ОМТ, содержащие гидрофобные аминокислотные остатки, обладают сравнительно низкой растворимостью в воде. Для преодоления этой проблемы было решено модифицировать С20 альдегидную группу ОМТ триптофан-содержащих производных антибиотика остатком пролпна. Модификация заключалась в носскшовигс.п.ном амшшровапип альдегидной группы антибиотика вторичными аминами в присутствии ппанборогидрида натрия. Вначале для отработки метода, согласно схеме 5. был модифицирован исходный антибиотик ОМТ. В качестве замещенных аминов в этом случае использовали /-- и О-пролнн и их метиловые эфиры. Так были получены продин-содержащие производные ОМТ (ХХХ1У-ХХХ\'Н). Далее аналогичную модификацию проводили с триптофан-содержащпми производными ОМТ (XXX, п= 1, и XXXII, п = 3) с использованием ¿-пролпна, в результате чего получили соединения XXXVIII (п = 1) и XXXIX (п = 3) (Схема 5).

Все пролин-содержащие производные ОМТ представлены в таблице 4.

Jk''

! f-

^XJLjvz&zr

NaBH,(C"N)

II CH- ! '^■Ki-'-yl

yJx:^

XXXIV, XXXV: R=H XXXVI, XXXVII R=CHj

"Vi

H,r Ü-—JH

v-< T

H-A-Pro-OH

"Xj

NaBH,(CN)

о CB / '

HC c. (l

J о f -OH

он XXXVIII: n = 1 XXXIX: n = 3

Схема 5. Обшля схема получения пролнн-содержащих производных ОМТ. Таблица 4.

Пептидные производные ОМТ Шифр Выход % W (хлороформ: мегсшо.-i: вола: эшлацегаг 20 (' i :ti 3) MS

найдено вычне лено

1 20-(/.-РгоОП)-ОМТ XXXIV 92 0.44 697.6 [A-/+11J' 696.4

2 2(Ч»-РгоОН)-ОМТ XXXV 90 0.44 697.6 IU-НГ 696.4

3 20-(/,-РгоОМе)-ОМТ XXXVI 87 0.61 711.6 [А/+Н]' 710.4

4 20-(/)-РгоОМе)-ОМТ XXXVII 85 0.61 711.6 [Д/+Н]* 710.4

5 20-(/--PioOH )-23-0-( Boc-Trp-GIy)-OMT XXXVIII 66 0.71 1041.1 [Д/+Н]" 1039.6

б 20-(/.-РгоО11)-23-О-(13ос-Тгр-уЛЬи)-ОМТ XXXIX 70 0.73 1069.3 [Л/+Н]' 1067.6

б. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ O.YIT ПО ПОЛОЖЕНИЮ С23

rtj Изучение евтывиния ОМТ и его производных с рибосомой

Основной задачей этого раздела работы было выяснить, способны ли полученные нами пептидные производные ОМТ специфически связываться с "макролндным" сайтом рибосомного туннеля.

Наиболее надежным подходом к изучению связывания лмгандов с рибосомами является метод т.н. "фугпринтипга". В этом случае комплексы исследуемых соединений с рибосомой обрабатывают реагентами, модифицирующими рРИК. например, с помошыо диметилсульфата осуществляют метилирование рРПК по остаткам адепина. Те

гетероциклические основания, которые находятся в контакте с лпгандом, не подвергаются модификации, т.е. они "защищены" от метилирования. Идентифицируя защищенные нуклеотидные остатки в изолированной молекуле рРНК, можно определить область связывания лиганда с рибосомой. Так, например, все исследованные на сегодня макролиды, а также антибиотики некоторых других групп, сайты связывания которых в РТ перекрываются с макролидным сайтом, защищают от метилирования в молекуле 23S рРНК два соседних основания - А2058 и А2059.

Изучение связывания производных ОМТ с рибосомой методом "фушршгшига" мы проводили на 70S рибосомах Е. coli. Комплексы феннлаланнн- п триптофан-содержащих производных ОМТ с рибосомами обрабатывали дпметилсульфатом. Выделенные модифицированные 23S рРНК связывали с меченым згР по 5'-концу олнгонукдеотидным прапмером, комплементарным к интересующему участку рРНК. Затем проводили удлинение праймера обратной транскрипцией, и полученные одноцепочечные ДНК анализировали с помощью гель-электрофореза в условиях секвестрования РНК. В совместной работе с A.C. Манькнным (Центр фармацевтической биотехнологии Университета штата Иллинойс, Чикаго, США) было показано, что фенилаланин-содержащие производные ОМТ защищают от метилирования основания А2058 и А2059 23S рРНК, как это видно из рисунка 2А. Аналогичные результаты были получены в нашей лаборатории для триптофан-содержаших производных ОМТ; на рисунке 2В приведен радиоавтограф полпакрпламп,много геля, на котором видна "защита" от метилирования дпметилсульфатом тех же оснований А2058 и А2059. Эти данные говорят о связывании фешшалаиин- и триптофан-содержащих производных ОМТ в сайте макролидных антибиотиков рибосомного туннеля.

ь _

L. ?

А Г Го UÜCA ' 1

А В

Рис 2. Свяыванне феннлаланнн- (А) и триптофан- (В) содержащих производных ОМТ с рибосомами К.coli.

Другим способом изучения связывания макролндных антибиотиков с рибосомой, позволяющим определить количественные параметры комплскеообразования, является метод вытеснения из рибосомы радиоактивно меченого антибиотика той же группы. Метод основан на конкуренции между антибиотиками за сайт связывания в рпбосомном туннеле. В нашем случае, в качестве меченого макролида использовался [|4С'|-эритромицин. Вначале получали комплекс [ыС]-эритромнцина с бактериальными рибосомами; далее его титровали растворами исследуемых пептидных производных ОМТ, концентрация которых в растворе возрастала. Образовавшиеся комплексы отделяли и измеряли уровень их радиоактивности, который был пропорционален количеству оставшегося в комплексе с рибосомой эритромицина. Из этих данных получали кривые зависимости количества связанного с рибосомой эритромицина от концентрации конкурирующих с ним за связывание производных ОМТ.

В совместной работе с Д. Вилсоном (Генетический центр Мюнхенского университета, Мюнхен, Германия) этим методом было исследовано связывание феннлаланнн-содержащнх производных ОМТ (XXVIГ-XXIX) с 70.5 рибосомами О. гасИос!игат (Рис. 3). Было показано, что все исследованные производные, включая исходный ОМТ, вытесняют эритромицин из комплексов с рибосомой, что подтверждает связывание этих соединений в макролидном сайте рибосомного туннеля. Из данных этих экспериментов были рассчитаны константы диссоциации для ОМТ и его фенилаланин содержащих производных. Для соединений I, XXVIII и XXIX они составляют, соответственно, 3.0±0.3, 15.4±1.5, 1().7±1.1 нМ. Из этих данных следует, что пептидные производные ОМТ, содержащие остатки фешшалапина, образуют прочные комплексы с рибосомой, однако, константы диссоциации этих комплексов в 3-5 ра.1 выше, чем у ОМ 1.

юо о

Рис. 3 Конкурентное вытеснение производными ОМТ радиоактивно меченого 'эритромицина из комплекса с рибосомой.

б) Исследование пнгибирующей активности производных ОМТ в системе транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка (СП').

В совместной работе с Д. Вилсоном была изучена способность фенилаланин-содержащих производных ОМТ пнгибнровать биосинтез СРР в бееклеточнон системе транскрипции-трансляции. Уровень синтеза СРР определяли измерением интенсивности флуоресценции при 520 нм (длина волны возбуждающего света 488 нм) клеточного лизата, который содержал нлазмиду с геном С5РР и все необходимые компоненты для его транскрипции и трансляции мРНК ОРР. На графике (Рис. 4) представлено изменение уровня флуоресценции, а, следовательно, и уровня трансляции ОРР при увеличении концентрации ОМТ и его производных в клеточном лизате. Было показано, что несмотря на высокое сродство к рибосоме (см. предыдущий раздел), ОМТ сам по себе синтез зеленого флуоресцирующего белка практически не ннгибирует (Рис. 4).

0,0 0,5 1,0 1.5 2.0

С, цмоль

Рис. 4. Тестирование производных ОМТ в беснлеточиоГ) системе трансляции-транскрипции СРР.

Отсутствие прямой корреляции между связыванием антибиотика и его ингнбнрующеО активностью, скорее всего, объясняется тем, что ОМТ вытесняется из рибоеомного туннеля растущим пептидом. Однако, связывание с ОМТ фенилаланин--содержащих пептидов значительно увеличивает его пнгибирующую активность. На первый взгляд, этот результат выглядит пародоксальным, поскольку пептидные производные ОМТ вытесняют эритромицин из РТ менее эффективно, чем немодифнцированпый антибиотик. В связи с этим следует заметить, что из литературных данных известно, что связывание макролндов с РТ происходит в две стадии. На первой (медленной) стадии с макролндпым сайтом связывается углеводный остаток, непосредственно присоединенный к лактонному кольцу. Можно, думать, что именно на этой стадии ОМТ вытесняет эритромицин из РТ. Можно также предположить, что

пептидные остатки в какой-то степени препятствуют ооразованшо продуктивного комплекса на этой стадии. 11а второй стадии (быстрой) происходит конформациоипая перестройка комплекса, и все компоненты антибиотика занимают в РТ свои места. При этом боковые группы пептидных остатков образуют дополнительные контакты с рибосомным туннелем, в результате чего их способность пнгпбиропагь трансляцию становится выше, чем у исходного антибиотика.

В тон же бесклеточной системе транскрипции-трансляции ОРР были протестированы пролнп-содержащпс производные ОМТ. Было показано, что по сравнению с ОМТ они обладают существенно более высокой ингпбирующей активностью (Рис. 5). Это результат был вполне ожидаем, поскольку В. Карпенко в нашей лаборатории было показано, что присоединение аминокислотных и пептидных остатком по положению С20 приводит к образованию новых контактов антибиотиков тилозинового ряда с РТ. Дальнейшее изучение пролин-содержашнх производных ОМТ нам представляется перспективным.

омт (I)

20-(|_-РгоОН)-ОШ (XXXIV) 20-(О-РгоОН)-ОМТ (XXXV) 20-(1-РгоОМе)-ОМТ (XXXVI) 20-№-РгоОМе)-ОМТ (XXXVII)

Рис. 5. Тестирование активности пролин-содержащнх производных ОМТ в бесклеточной системе трансляции-трамскрипцпп СИР.

в) Исследование ингпбирующей активности производных ОМТ в системе трансляции мРНКлюцифераш светлячков

Известно, что ОМТ достаточно активно подавляет трансляцию мРНК люцпферазы светлячков в системе ¡и уИго (Д. Вилсон, личное сообщение). В этой системе были протестированы триптофан-содержащие производные ОМТ ХХХ-ХХХШ, а так же 23-0-(Вос-РЬе-С1у)-ОМТ (XXVII). На графиках, представленных на рисунке б, показано падение уровня люминесценции при увеличении концентрации антибиотиков. Установлено, что ОМТ и его производные хорошо ннгибируют биосинтез люцпферазы.

при этом наибольшей ннгибируюшей активностью обладает производное 23-0-(Всс-Тгр-С)1у)-0МТ (XXX) (Рис. 6).

3 в

V 23-(Boc-Trp.¡Wa)-OMT (XXXS)

0 23-(Вос-Тгр-5Аре)-ОМТ (XXXIII)

О 23-(Boe-Trp-yAbu)-OMT (XXXII)

A 23-(Boc-Trp-G!y)-OMT (XXX)

* 23-(Boc-Phe-Gly)-OMT (XXVII)

• ОМТ (I)

0,1

С, ||МОПЬ

Рис. 6. Ингибированпе трансляции мРНК люциферзчы светлячков триптофан-содержащими

производными ОМТ в бесклеточнин системе.

Компьютерное моделирование показало, что остаток триптофана в соединении XXX, по-видимому, связан водородной связью с 04 урацила U2609 23S рРНК, который >час1ьус1 в формировании peí уляторной области Р'Г.

Отметим также, что тестирование антибиотической активности трнптофан-содержаших производных ОМТ на стандартном наборе стафилококковых штаммов показало, что они обладают сравнимой с ОМТ антибиотической активностью.

Суммируя все эти данные, можно заключить, что полученные нами пептидные производные ОМТ по положению С23 проявляют в различных тестах активность либо сравнимую с исходным антибиотиком, либо более высокую. Это может свидетельствовать об образовании дополнительных контактов между ароматическими аминокислотными остатками фенплаланина и триптофана и гетероциклическими основаниями в рибосомном туннеле. Следовательно, эти соединения могуг быть использованы как зонды для изучения механизма функционирования регуляторного центра рнбосомного туннеля.

выводы

1. С помощью компьютерного моделирования на основе пептидных производных 5-О-микаминозилтнлонолида осуществлен дизайн потенциальных зондов, которые могут быть использованы, как инструменты для изучения регуляторного района рибосомного туннеля.

2. Разработан метод синтеза аминокислотных и пептидных производных по положению С23 5-О-микаминозилтилонолида.

3. Осуществлен синтез серии новых конъюгатов 5-О-мпкаминозилтилополнда по положению С23 с пептидами, в том числе содержащими остатки фенилаланина и триптофана.

4. Полученные фенилаланин- и триптофан-содержащие производные 5-О-микаминозилтнлонолида специфически связываются с рибосомным туннелем в макролидном сайте и, таким образом, могут быть использованы, как инструменты для исследования функционирования рибосомного туннеля.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Федорова Н.В., Кузнецова И.В., Шишкина А.В.. Богданов А.А.. Пептидные производные макролидов, родственных тилозину. Биоорганическап химия. 2007. Т. 33. № 2. С. 235-244.

Sumbatyan N.V., Tashlitsky V.N., Shishkina A.V.. Korshunova G.A. Design and synthesls of peptide - macrolide conjugates. In: Peptides - 2006, Proceedings of 29th European Peptide Symposium, Gdansk, Poland. 03.09.-08.09. 2006. http://www.29eps.eom/docs/0173.doc.

Шишкина A.B.. Коршунова Г.А. Пептидные производные макронидного антибиотика 5-0 микаминозилтичонолида. Материалы международная конференция молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006". Химия. Т. 2. С. 61.

Богданов А.А., Сумбатян Н.В., Шишкина А.В.. Карпенко В.В., Коршунова Г.А. Пептидные производные антибиотиков-макролидов: новые инструменты для изучения механизмарегуляг/ии трансляции. III Российский симпозиум "Белки и пептиды", Пущино-2007. Тезисы докладов. С. 54.

Шишкина А.В.. Столяренко В.Ю. Синтез триптофан-содержащих зондов для исследования рибосомного туннеля. Материалы докладов международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2007". Химия. lnip://loiiionosov-iTisu.ni/arcbive/Lomonosov 2007/23/'Chemistrv/sliishl<ina av.doc.pdt'.

Сумбатян H.В., Федорова H.В., Шишкина А.В.. Карпенко В.В., Коршунова Г.А. Пептидные производные макролидных антибиотиков. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 117.

Shishkina A.. Sumbatyan N., Korshunova G., Bogdanov A. Peptide-macrolide conjugales as novel instruments for protein biosynihesis study. 30th European Peptide Symposium, Helsinki, 31.08.-05.09. 2008. Journal of Peptide Science. Supplément to V. 14(8). P. 113.

Богданов A.A., Сумбатян H.В., Шишкина A.В.. Карпенко В.В., Коршунова Г.А. Роль рибосомного туннеля в регуляции трансляции: структурные аспекты. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г. Сборник тезисов. Т. КС. 10.

Заказ № 113-аЛ 1/09 Подписано в печать 18.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. л.л. I

^г-^ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

О*/.; www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Шишкина, Анна Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Растущий пептид в рибосомном туннеле (Обзор литературы).

1.1. Строение и функционирование рибосомы.

1.1.1. Морфология бактериальной рибосомы.

1.1.2. Функционирование рибосомы.

1.2. Рибосомный туннель.

Сайт связывания макролидных антибиотиков.

1.3. Взаимодействия растущих пептидов со стенками рибосомного туннеля.

1.3.1. Экспрессия генов cat и clmA.

1.3.2. Регуляция экспрессии гена secA.

1.3.3. Регуляция трансляции белка YbeL.

1.3.4. Триптофаназный оперон. Механизм регуляции экспрессии.

Глава 2. Обсуждение результатов.

2.1. Дизайн пептидных производных ОМТ как инструментов для изучения функционирования РТ.

2.2. Получение антибиотика 5-О-микаминозилтилонолида.

2.3. Разработка метода синтеза аминокислотных и пептидных производных ОМТ по положению С23.

2.4. Синтез N-защищенных пептидов, содержащих остатки фенилаланина и триптофана.

2.5. Синтез фенилаланин- и триптофан-содержащих пептидных производных ОМТ по положению С23.

2.6. Изучение биологической активности пептидных производных ОМТ по положению

2.6.1. Изучение связывания ОМТ и его производных с рибосомой.

2.6.2. Исследование ингибирующей активности производных ОМТ в системе транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка GFP.

2.6.3. Исследование ингибирующей активности производных ОМТ в системе трансляции мРНК люциферазы светлячков.

2.6.4. Изучение антибиотической активности триптофан-содержащих производных ОМТ.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Исходные вещества и очистка растворителей.

3.1.1. Исходные вещества.

3.1.2. Абсолютирование растворителей.

3.2. Вспомогательные методы.

3.2.1. Хроматография в тонком слое.

3.2.2. Препаративная тонкослойная хроматография.

3.2.3. Колоночная хроматография.

3.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

3.2.5. Гидролиз пептидов и аминокислотный анализ.

3.2.6. Масс-спектрометрия.

3.2.7. ЯМР-спектроскопия.

3.3. Методики получения веществ.

3.4. Методики биологических испытаний.

3.4.1. Буферы и растворы.

3.4.2. Выделение рибосом Е. coli.

3.4.3. Химический пробинг.

3.4.4. Конкурентное вытеснение радиоактивно меченого [14С]-эритромицина.

3.4.5. Система транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка GFP.

3.4.6. Система трансляции мРНК люциферазы светлячков.

Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Пептидные производные 5-О-микаминозилтилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля"

Рибосомы представляют собой молекулярные машины, которые синтезируют все белки живой клетки, транслируя хранящуюся в геноме генетическую информацию. В ходе процесса трансляции синтезируемая на рибосоме полипептидная цепь белковой молекулы перемещается по рибосомному туннелю (РТ) от места образования очередной пептидной связи (пептидилтрансферазного центра, ПТЦ) к месту выхода из рибосомы, где начинается процесс "фолдинга" белка. РТ изучается уже почти десять лет с применением разнообразных физических, химических и молекулярно-биологических методов. В частности, установлено, что его стенки "выложены" преимущественно нуклеотидными остатками рРНК. В ходе синтеза белка в РТ находится сегмент полипептида длиной 25-30 аминокислотных остатков [1,2]. Известно несколько особых случаев, когда взаимодействие определенного аминокислотного остатка вновь синтезируемого пептида со специфическим участком РТ приводит к остановке белкового синтеза. Это явление лежит в основе регуляции экспрессии ряда генов на уровне трансляции [3]. В то же время, такие ключевые вопросы, как конформация полипептидной цепи в РТ, механизмы ее перемещения по туннелю и взаимодействия с рРНК остаются без ответа. Недавно в нашей лаборатории было предложено попытаться дать ответ на эти вопросы с помощью пептидных производных макролидных антибиотиков [4].

Целью настоящей работы является дизайн, синтез и изучение биологической активности пептидных производных антибиотика-макролида тилозинового ряда 5-О-микаминозилтилонолида (ОМТ) с целью получения нового потенциального инструмента для исследования рибосомного туннеля.

Литературный обзор посвящен изучению поведения растущего пептида в РТ и его взаимодействий со стенками туннеля.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

Выводы

1. С помощью компьютерного моделирования на основе пептидных производных 5-О-микаминозилтилонолида осуществлен дизайн потенциальных зондов, которые могут быть использованы как инструменты для изучения регуляторного района рибосомного туннеля.

3. Осуществлен синтез серии новых конъюгатов 5-О-микаминозилтилонолида по положению С23 с пептидами, в том числе содержащими остатки фенилаланина и триптофана.

4. Полученные фенилаланин- и триптофан-содержащие производные 5-О-микаминозилтилонолида специфически связываются с рибосомным туннелем в макролидном сайте и, таким образом, могут быть использованы как инструменты для исследования функционирования рибосомного туннеля.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Шишкина, Анна Владимировна, Москва

1. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science (2000) 289, 920-930.

2. Богданов A.A. О некоторых структурных аспектах пептидилтрансферазной реакции. Мол. Биол. (2003) 37, 511-515.

3. Tenson Т., Ehrenberg М. Regulatory nascent peptides in the ribosomal tunnel. Cell (2002) 108, 591-594.

4. Сумбатян H.B., Коршунова Г.А., Богданов A.A. Пептидные производные ингибиторов синтеза белка антибиотиков тилозина и десмикозина. Биохимия (2003) 68, 1436-1438.

5. Lake J.A. Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes. J. Mol. Biol. (1976) 105, 131-159.

6. Stoffler G., Stoffler-Meilicke, M. Immunoelectron microscopy of ribosomes. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. (1984) 13, 303-330.

7. Frank J. Image analysis of single macromolecules. Electron. Microsc. Rev. (1989) 2, 53-74.

8. Stark H., Mueller F., Orlova E.V., Schatz M., Dube P., Erdemir Т., Zemlin F., Brimacombe R., van Heel M. The 70S Escherichia coli ribosome at 23 A resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure (1995) 3, 815-821.

9. Bernstein F.C., Koetzle T.F., Williams G.J., Meyer E.F.J., Brice M.D., Rodgers J.R., Kennard O., Shimanouchi Т., Tasumi M. The Protein Data Bank: a computerbased archival file for macromolecular structures. J. Mol. Biol. (1977) 112, 535-542.

10. Trakhanov S., Yusupov M., Shirokov V., Garber M., Mitschler A., Ruff M., Thierry J.C., Moras D. Preliminary X-ray investigation of 70 S ribosome crystals from Thermus thermophilic. J. Mol. Biol (1989) 209, 327-328.

11. Yusupov M., Garber M.B., Vasiliev V.D., Spirin A.S. Thermus thermophilics ribosomes for crystallographic studies. Biochimie (1991) 73, 887-897.

12. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science (2000) 289, 905-920.

13. Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janell D., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution. Cell (2000) 102, 615-623.

14. Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H., Noller H.F. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science (2001)292, 883-896.

15. Shatsky I., Evstafieva A.G., Bystrova T.F., Bogdanov A.A., Vasiliev V.D. Topography of RNA in the ribosome: location of the З'-end of 5S RNA on the central protuberance of the 50S subunit. FEBS Lett. (1980) 121, 97-100.

16. Bernabeu C., Lake J.A. Nascent polypeptide chains emerge from the exit domain of the large ribosomal subunit: immune mapping of the nascent chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 3111-3115.

17. Bernabeu C., Tobin E.M., Fowler A., Zabin I., Lake J.A. Nascent polypeptide chains exit the ribosome in the same relative position in both eucaryotes and procaryotes. J. Cell. Biol. (1983) 96, 1471-1474.

18. Milligan R.A., Unwin P.N. Location of exit channel for nascent protein in 80S ribosome. Nature (1986) 319, 693-695.

19. Yonath A., Leonard K.R., Wittmann H.G. A tunnel in the large ribosomal subunit revealed by three-dimensional image reconstruction. Science (1987) 236, 813816.

20. Stark H., Orlova E.V., Rinke-Appel J., Junke N., Mueller F., Rodnina M., Wintermeyer W., Brimacombe R., van Heel M. Arrangement of tRNAs in pre- and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy. Cell1997) 88, 19-28.

21. Stark H., Rodnina M.V., Rinke-Appel J., Brimacombe R., Wintermeyer W., Van-Heel M. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature (1997) 389, 403-406.

22. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Li Y.H., Leith A., Nierhaus K.H., Frank J. Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science (1996) 271, 1000-1002.

23. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Frank J. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95, 6134-6138.

24. Schmeing T.M., Ramakrishnan V. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature (2009) 461, 1234-1242.

25. Samaha R.R., Green R., Noller H.F. A base pair between tRNA and 23S rRNA in the peptidyl transferase centre of the ribosome. Nature (1995) 377, 309-314.

26. Green R., Switzer C., Noller H.F. Ribosome-catalyzed peptide-bond formation with an A-site substrate covalently linked to 23 S ribosomal RNA. Science1998) 280,286-289.

27. Hansen J.L., Schmeing T.M., Moore, P.B., Steitz, A.T. Structural insight into peptide bond formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99, 11670-11675.

28. Green R., Noller H.F. Ribosomes and translation. Annu. Rev. Biochem. (1997) 66, 679-716.

29. Moore P.B.; Steitz T.A. The structural basis of large ribosomal subunit function. Annu. Rev. Biochem. (2003) 72, 813-850.

30. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M., Frank J. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell (2003) 114, 123-134.

31. Ogle J.M., Brodersen D.E., Clemons W.M., Tany M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V. Recognition of cognate transferRNA by the 3OS ribosomal subunit. Science (2001) 292, 897-902.

32. Ogle J.M., Murphy F.V., Tarry M.J., Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell (2002) 111, 721732.

33. Sievers A., Beringer M., Rodnina M. V., Wolfenden R. The ribosome as an entropy trap. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101, 7897-7901.

34. Schmeing T.M., Huang K. S., Strobel S. A., Steitz, T. A. An induced-fit mechanism to promote peptide bond formation and exclude hydrolysis of peptidyl-tRNA. Nature (2005) 438, 520-524.

35. Jenni S., Ban N. The chemistry of protein synthesis and voyage through the ribosomal tunnel. Cur. Opin. Struct. Biol. (2003) 13, 212-219.

36. Polacek N., Gaynor M., Yassin A., Mankin A. S. Ribosomal peptidyl transferase can withstand mutations at the putative catalytic nucleotide. Nature (2001) 411, 498-501.

37. Maguire B.A., Beniaminov A. D., Ramu H., Mankin A. S.} Zimmermann R. A. A protein component at the heart of an RNA machine: the importance of protein L27 for the function of the bacterial ribosome. Mol. Cell (2005) 20, 427-435.

38. Moore V.G., Atchison R. E., Thomas G., Moran M., Noller H. F. Identification of a ribosomal protein essential for peptidyl transferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) 72, 844-848.

39. Trobro S., Aqvist J. Role of ribosomal protein L27 in peptidyl transfer. Biochemistry (2008) 47, 4898-4906.

40. Voorhees R.M., Weixlbaumer A., Loakes D., Kelley A. C., Ramakrishnan, V. Insights into substrate stabilization from snapshots of the peptidyl transferase center of the intact 70S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. (2009) 16, 528-533.

41. Moore P.B. The ribosome at atomic resolution. Biochemistry (2001) 40 32433250.

42. Voss N.R., Gerstein M., Steitz T.A., Moore P.B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. (2006) 360, 893-906.

43. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata R.K., Agrawal R.K. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature (1995) 376, 441-444.

44. Pool M.R., Stumm J., Fulga T.A., Sinning I., Dobberstein B. Distinct modes of signal recognition particle interaction with the ribosome. Science (2002) 297, 13451348.

45. Keenan R.J., Freymann D.M., Stroud R.M., Walter P. The signal recognition particle. Annu. Rev. Biochem. (2001) 70, 755-775.

46. Gong F., Yanofsky C. Instruction of translating ribosome by nascent peptide. Science (2002)297, 1864-1867.

47. Frank J., Agrawal R.K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature (2000) 406, 318-322.

48. Gabasvili I.S., Gregory S.T., Valle M., Grassucci R., Worbs M., Wahl M.C., Dahlberg A.E., Frank J. The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol. Cell (2001) 8, 181-188.

49. Hansen J.L., Ban N., Nissen P., Moore P.B., Steitz T.A. The structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit. Mol. Cell (2002) 10, 117-126.

50. Auerbach Т., Bashan A., Yonath A. Ribosomal antibiotics: structural basis for resistance, synergism and selectivity. Trends Biotech. (2004) 22, 570-576.

51. Streitz Т. On the structural basis of peptide-bond formation and antibiotic resistance from atomic structures of the large ribosomal subunit. FEBS Lett. (2005) 579, 955-958.

52. Poulsen S.M., Kofoed C., Veater B. Inhibition of the ribosomal peptidyl transferase reaction by the mycarose moiety of the antibiotics carbomycin, spiramycin and tylosin. J. Mol. Biol. (2000) 304, 471-481.

53. Mankin A. Macrolide myths. Cur. Opin. Microbiol. (2008) 11, 414-421.

54. Nakatogawa H., Ito K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell (2002) 108, 629-636.

55. Vazquez-Laslop N., Thum C., Mankin, A.S. Molecular mechanism of drug-dependent ribosome stalling. Mol. Cell (2008) 30, 190-202.

56. Ramu H., Mankin A., Vazquez-Laslop N. Programmed drug-dependent ribosome stalling. Mol. Microbiol. (2009) 71, 811-824.

57. Lovett P.S. Nascent peptide regulation of translation. J. Bacteriol. (1994) 176, 6415-6417.

58. Lovett P.S., Rogers E.J. Ribosome regulation by the nascent peptide. Microbiol. Rev. (1996) 60, 366-385.

59. Gu Z., Harrod R., Rogers E.J., Lovett P.S. Anti-peptidyltransferase leader peptides of attenuation-regulated chloramphenicol-resistance genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 5612-5616.

60. Rogers E.J., Lovett P.S. The cis-effect of a nascent peptide on its translating ribosome: influence of the cat-86 leader peptide on translation termination at leader codon 6. Mol. Microbiol. (1994) 12, 181-186.

61. Nakatogawa H., Ito К. Intraribosomal regulation of expression and fate of proteins. ChemBioChem (2004) 5, 48-51.

62. Muto H., Nakatogawa H., Ito K. Genetically encoded but nonpolypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell (2006) 22, 545-552.

63. Woolhead C.A., Johnson A.E., Bernstein H.D. Translation arrest requires two-way communication between a nascent polypeptide and the ribosome. Mol. Cell (2006) 22, 587-598.

64. Suhonara Т., Abo Т., Inada Т., Aiba H. The C-terminal amino acid sequence of nascent peptide is a major determinant of SsrA tagging at all three stop codons. RNA (2002) 8, 1416-1427.

65. Roche E.D., Sauer R.T. Identification of endogenous SsrA-tagged proteins reveals tagging at positions corresponding to stop codons. J. Biol. Chem. (2001) 276, 28509-28515.

66. Wang D., Ding X., Rather P.N. Indole can act as an extracellular signal in Escherichia coli. J. Bacteriol. (2001) 183, 4210-4216.

67. Ren D., Bedzyk L.A., Ye R.W., Thomas S.M., Wood Т.К. Stationary-phase quorum-sensing signals affect autoinducer-2 and gene expression in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 2038-2043.

68. Hirakawa H., Inazumi Y., Masaki Т., Hirata Т., Yamaguchi A. Indole induces the expression of multidrug exporter genes in Escherichia coli. Mol. Microbiol. (2005) 55, 1113-1126.

69. Kazarinoff M.N., Snell E.E. Essential arginine residues in triptophanase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1977) 252, 7598-7602.

70. Gollnick P., Yanofsky C. tRNATrp translation of leader peptide codon 12 and other factors that regulate expression of the tryptophanase operon. J. Bacteriol. (1990) 172,3100-3107.

71. Gong F., Yanofsky C. Reproducing tna operon regulation in vitro in an S-30 system. Tryptophan induction inhibits cleavage of TnaC peptidyl-tRNA. J. Biol. Chem. (2001)276, 1974-1983.

72. Yanofsky C. RNA-based regulation of genes of tryptophan synthesis and degradation, in bacteria. RNA (2007) 13, 1141-1154.

73. Gong F., Ito K., Nakamura Y., Yanofsky C. The mechanism of tryptophan induction of tryptophanase operon expression: tryptophan inhibits release factor-mediated cleavage of TnaC-peptidyl-tRNA(Pro). Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98, 8997-9001.

74. Gong M., Cruz-Vera L.R., Yanofsky, C. RRF and RF3 action promotes TnaC-peptidyl-tRNA dropoff and relieves ribosome stalling during tryptophan induction of tna operon expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. (2007) 189, 3147-3155.

75. Cruz-Vera L.R., Rajagopal S., Squires C., Yanofsky C. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell (2005) 19, 333-343.

76. Cruz-Vera L.R., New A., Squires C., Yanofsky, C. Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center. J. Bacteriol. (2007) 189, 3140-3146.

77. Mankin A.S. Nascent peptide in the l3irth canal' of the ribosome. Trends Biochem. Sci. (2006)31, 11-13.

78. Gong M., Gong F., Yanofsky, C. Overexpression of tnaC of Escherichia coli inhibits growth by depleting tRNA2Pro availability. J. Bacteriol. (2006) 188, 1892-1898.

79. Omura S. Macrolide antibiotics: chemistry, biology and practice. Academic Press: Orlando, FL (2002).

80. Karahalios P., Kalpaxis D.L., Fu H., Katz L., Wilson D.N., Dinos G.P. On the mechanism of action of 9-O-arylalkyloxime derivatives of 5-O-mycaminosyltylonolide, a new class of 16-membered macrolide antibiotics. Mol. Pharmacol (2006) 70, 1271-1280.

81. Gaynor M., Mankin A.S. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr. Top. Med. Chem. (2003) 3, 949-961.

82. Yusupova G., Jenner L., Rees В., Moras D., Yusupov M. Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome. Nature (2006) 444, 391-394.

83. Brodersen J.E., Clemons W.M.Jr., Carter A.P., Morgan-Warren R.J., Wimberley B.T., Ramakrishnan V. The structural basis for the action of the antibiotics tertacyclin, pactpmycin and hygromycin В on 30S ribosomal subunit. Cell (2000) 103, 1143-1154.

84. Wilson D.N., Harms J., Nierhaus K.H., Schluenzen F., Fucini P. Species-specific antibiotic-ribosome interactions: implications for drug development. Biol Chem. (2005)386, 1239-1252.

85. Morin R., Gorman M. O-Mycaminosiltylonolide and process for the preparation thereof (1969). US Patent № 3459853.

86. Kirst H., Toth J. С-23-Modified derivatives of OMT (1984). GB Patent № 2123828.

87. Jian Т., Phanly Т., Busuyek M„ Hou Y., Or Y., Qiu Y., Vo N. 23-0-Substituted 5-O-mycaminosyltylonolide derivatives (2003). US Patent № 6753415B2.

88. Fujivvara Т., Watanabe H., Hirano Т., Sakakibara H. 23-0-Acyl-23-demycinosyldesmycosin derivatives (1983). GB Patent № 2116170 A.

89. Sheehan J.C., Hess G.P. A new method of forming peptide bonds. J. Am. Chem. Soc. (1955) 77, 1067-1068.

90. Wang S.S., Tam J.P., Wang B.S.H., Merrifield R.B. Enchancement of peptide-coupling reactions by 4-dimethylaminopyridine. Int. J. Protein Res. (1981) 18, 459-467.

91. Atherton E., Benoiton N.L., Brown E., Sheppard R.C.,Williams B.J. Racemization of activated, urethane-protected amino-acids by /?-dimethylaminopyridine. Significance in solid-phase peptide synthesis. J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1981) 7, 336-337.

92. Xu S., Held I., Kempf В., Mayr H., Steglich W., Zipse H. The DMAP-catalized acetylation of alcohols a mechanistic study (DMAP = 4-(dimethylamino)pyridine). Chem. Eur. J. (2005) 11, 4751-4757.

93. Kirst H.A., Toth J.E. Method of preparing 23-monoesters of OMT and DMT (1984). US Patent № 4487923.

94. Wunsch E. Houben-Weyl on peptides and peptidomimetics. Thieme: Shtuttgart-New York (1974); Vol. 15/1.

95. Guttman S., Pless J., Boissonas R.A. Nouvelle synthese de la bradykinine. Helv. Chim. acta (1962) 45, 170-177

96. Anderson G.W., McGregor A.C. f-Butyloxycarbonylamino acids and their use in peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. (1957) 79, 6180-6183.

97. Konig W., Geiger R. Eine neue Methode zur Synthese von Peptiden: Aktivierung der Carboxylgruppe mit Dicyclohexylcarbodiimid unter Zusatz von 1-Hydroxy-benzotriazolen. Chem. Ber. (1970) 103, 788-798.

98. Carpino L.A., El-Faham A. Effect of tertiary bases on O-benzotriazolyluronium salt-induced peptide segment coupling. J. Org. Chem. (1994) 59, 695-698.

99. Brenner M., Huber W. Herstellung von a-Aminosaureestern durch Alkoholyse der Methyl ester. Helv. Chim. acta (1953) 36.

100. Castro В., Dormoy J.R., Evin G., Selve C. Reactifs de couplage peptidique I (l)-l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytrisdimethylamino phosphonium (B.O.P.). Tetrahedron Lett. (1975) 16, 1219-1222.

101. Stern S., Moazed D., Noller H.F. Structural analysis of RNA using chemical and enzymatic probing monitored by primer extension. Methods Enzymol. (1988) 164, 481-489.

102. Petropoulos A.D., Kouvela E.C., Dinos G.P., Kalpaxis D.L. Stepwise binding of tylosin and erythromycin to Escherichia coli ribosomes, characterized by kinetic and footprinting analysis. J. Biol. Chem. (2008) 283, 4756-4765.

103. ГордонА., Форд P. Спутник Хгтика. Физико-химические свойства, методики, библиография. Мир: Москва (1976).

104. Титце JL, Айхер Т. Препаративная органическая химия. Реакции и синтез в практикуме органической химии и научно-исследовательской лаборатории. Мир: Москва (1999).

105. Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet. (1973)7, 267-287.

106. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system. J. Biol. Chem. (2000) 275, 16597-16601.

107. Svetlov M.S., Kommer A., Kolb V.A., Spirin, A.S. Effective cotranslational folding of firefly luciferase without chaperones of the Hsp70 family. Protein Science (2006) 15, 242-247.