Первичная структура полиэдрина бакуловирусов отряда Lepidoptera тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРАШИ 1НСТИТУТ БЮ0РГАН1ЧН01 Х1М11 ТА НАФТОХШН

Р Г Б ОД

1 7 ОКТ 1994 На правах рукопису

ПАЛЬЧИК1ВСЬКА Лариса Гнагапя

ПЕРВИННА СТРУКТУРА ПОЛ1ЕДРИНУ БАКУЛОВ1РУС!В РЯДУ ЬЕРШОРТЕМ

02.00.10 - бшорпшпгпа х1мЬг, ходя природиих та фЬюлоггчно акгивннх речошга

Автореферат дисертацп на эдобуття науюового ступеия кандидата хшгших наук

Ктв-1994

Дисертац1ев е рукопис

Робота виконана в лайораторП xlMl1 ölmca 1нституту молекулярно <Иолог11 1 генетики HAH Укра1ни

Науковий кер1вник:

Доктор <51олог1чних наук, Козлов Е. А.

кандидат <31олог1чних наук, Лев1т1на Т. Л.

0ф1ц1йн1 опоиенти s

доктор х1м1чних наук, професор Серебряний С.Б. кандидат х1м1чних наук, Гудкова Л.В.

Пров1дна установа:

Кя1вський ун1верситет 1м. Тараса Шевченка

Захист в1д<3удеться "JJ " 1994 г.

на эас1данн1 спец1ал1зовано! вчено! ради Д.016.65.01 в 1к$титут! <31оорган1чно1 х1м11 та нафтох1м11 HAH УкраХни ( 253094, м. Kuli вул. Мурмансыса, 1 ).

3 дисертац1ев иохна ознайошггись в 01бл1отец1 1нститут] 01оорган1чно1 xluil та нафтох1м11 HAH Укра1ни. .

Автореферат роз!сланий frlf" Jfa&SüJ}1994 г.

Вчений секретар

спеШал1эовано1 вчено! ради Д.Ы. №Д0РЯ1

I

загальма характеристика роботи

Актуальн1с.ть проблем». Протягом остаин1х рок1в 1нхероо до ба!сулов1рус1в, а зокрема до в!рус!в ядерного пол!едролу (ВЯЛ), зумовлений використанням !х як висоиоефеитивиих ега-лог!чно чистих 1нсектицид1г!. На ба.з1 ВЯЛ зконструновано вектор, який вастосовують у б1отехналог!! для синтезу пакливих у народному господарств! та медицин! б1лк!в 1 пептид!в.

Характерна особлив 1сть ВЯЛ полагав в то;/у, що зиасл!док шфекцп в ядрах кл!тини виникають кристалоподЮн! 01лиов1 утвореннп - т!ла включения (ТВ). Б!лок ТВ (пол!едрин) при кристал!зацП включав в себе ДНК-в!,ищуюч1 в1р1они та ядерну РНК. В1д особливостей будови, ф1зикох1м1чних властиас-стей 1 (Цосинтезу пол1едрину залежать утил!тари1 властивост1 !нсек-тицадЦв (ТВ) 1 вектора (0акулов1русн). Виходячи з цього, знания первинно! структури пол!едрин!а дозволить досл!дити взагмозв'язок П з фушидяыи.01дка. Осповна фуикц!я пол!ед-ршив - захист в!р1он1в в1д навколишнього серэдовица при передач! !нфекц!"1 через утворення пол!едр1в. Оа'Лльки моле-кули пол!едрину в процео! утворення пол!едр1в взаемод!ють» м!к собою, а також з РНК пол!едр!в та з мембранами в!р!ои!в, пол!едрин може бути зикористаний як модельний 01шл для вив-чення б!лок-0!лкових, 0! лок- нукле! нових та б! лок- мембр&чних взавыод1й, що б центральною проблемою молокулярко! б!олог!Х та б!оорган!чгю'1 х!мП. :Лодиф!кац!я д1лянок шШедрииу, в!д-пов1дальних за перел1чен! взавмодП, дозволить гм1гаовати ц1-леопрямовано властивост! 1нсективдд!в 1 вектора.

Знания первинно! отруктури под!едрин!в ВЯЛ ряду предо-тавник!в р!зних загсов комах, гоограф!чних 1золят!в 1 шта-

uiii дозволить вияснити фЬюгенеткинг i еволюцппи взаеыовад-

носинн цих 61лк1в.

Ступiнь досдгдженост! тематики. Пр1ор1тет досд1джешш первинно? структури пол!едрин1в методами Gíjikobo'í xímí'í налегать jaöopaTopií xímíí были. IMBir HAH Укра'нш, яшо керуе док.б.и. Е.А.Козлов. Дана робота аавершуе цикл досл1дкень по встановленню первинно! структури пол1едрин1в та эв'язку i'i а функц1онадьнлми особливостями цього бока.

Мота та задаШ досапдження. Метою дано! роботи було ви-ведення загально! формули пол1едрин1в ВЯЛ Lepidoptera i ви-явленпн Ix ф1логеиетичних взаемов1дносин. Пор1внюичи загаль-ну формулу в в1домими öiJii'vOüiiMit мотивами анайти на Hivi функ-ц!онально вахлив! сайта, в1дпов1дальн1 за б1Лок-б1лков1, 6i-лок-нуклепюв1, б1лок-мембранн! взаемодп та inuii бшлог1чн1 властиьост!.

В задач1 даного досл1дження входило: 1. Визначення пов-ho'í ам1нокислотно'1 посл!довност1 пол1едрин1в вял Mamestra brassicae (Mb) i Malacosotna neustria (Mn) 1 уточнения nep-винних структур пол!едрин1в Bombyx morí (Вш), Parthetria dispar (Pd), Agrotls segetum (As) i Galleria mellonella (Gm). 2. Проведения структурно-функц!овального awaniay доо-л1дкених иами та 1наими авторами амиюкислотннх посл1довнос-тей пол1едрин1в, пор1вншчи '¡к з в1домими б1лковнми мотивами i виявлення, таким чином, фуниц1онапьно вамливих сайт i в i ф1догекетичних вэг£ыов1дносин пол!едрин1в ВЯЛ.

Наукова новиана роботи. Вперше встановлено повну aui-

нокислотну г;осл1дов1псть пол!едрин1в ВЯЛ Мп 1 МЬ. Уточнена первинна структура пол!едрин1в ВЯЛ Аб, От, Рс1, Вт 1 выведено загальну формулу пол1едрину, Виявлено фушаЦонально вгшшв! саити пол1пептидного ланцюга пол!едрину 1 запропоиовано г1-потетичну модель структурно-функц1онально'1 орган 1зацП пол1-пептидкого ланцюга пол1едрину. З'ясовано еволющши та ф!ло-генетичн! взаемов1дносини пол!едрину.

Практична ц1нШсть роботи. Роароблений. нами метод пептидного картування моде Оути вшсористаний в прачтичн1й 61л-ков1й х1мП для доойдження б!лк1в середнього розм1ру. Пода-н1 рекомендацП по модиф!кувалют фунюЦоналыга ва.пливих сай-т!в, як! кожуть бути використован! у науково-досшдних 1нс-титутах для подальших фундаментальна 1 прикладных досл!д-жень по перев!рц1 г1потеаи структурно-функц1окальнох орган1-аад!1 пол1пептидного ланцога пол1едрину та удосконаленню 1и-сектицид1в 1 вектора, який эастосовуеться у 01отехнологП на баз! ВЯЛ. 0триман1 результат« модуть викладатися в учбових закладах.

Апробац1я матер1ал!в дисертацИ. Результати роботи до-пов1далися на VII 1 VIII Всесоюзних симпоэ!умах по х!«П б1лк!в 1 пептид!в (Тапл1н, 1987; ТбШс1, 1990) та на конфэ-ренц1'1 " Новейшие методы в биотехнологии. " РАН (Москва; 1994).

По матер1апах дисертацП опубл1ковано Б статей, список яких наведено в к1нц1 автореферату.

Стуктура та обсяг роботи. Дисертац1я викладена на

OTopiHKax машинописного тексту i складавться is вступу, or-дяду л!тератури, uaTepianiB i метод!в, результат!» та Ix 06-говорэння, ■ заключения, висновк!в i списку цитовано! л!тера-тури. Огляд л^ератури мхстить дан! щодо б!олог!чних, ф!зи-1СО-х!>йчних та структурою? особливостей ам!нокислотних пос-л!довностей пол1едрину. Список л!тератури нал1чув дне-рэл. Дисертац1я включав В таблиць та ¿в, рисунк!в.

Конкратиий особистий вносок дисертанта. Експериыентальна частика роботи виконана дисертантом особисто.

Методолог1я, ыетоди доел! дакания.

Препарат пол!едрияу ВШ Ып одержували розчииенням пол!-едр1в у 0,1н. NaOH (Bertold,1В47 ), !на! пол1едрини були люб'яаио иадан! сп1вроб!тниками лабораторП xiMi'i б!лка IMBir HAH yiipa'iüij. У роботi використовували в1дновлення -S-S- ав'-яаку д1т!отрейтолом та алк1луваиня 1одоцтовою кислотой (Серебрянки, Кавсан, 1958), модиф!кувашш б1лка за завивками л1-сину малв'1новим анг1дридом (Butler,Hartley, 1972), фермента-тивне рогщеплоння С1лк1в трипсином, х!мотрипсиноа, термол1зи-ком 1 розбавленао соляною кислотою.

Сум1ш1 пептид1в розд1ляли а використанняы методiв гель-ф1дьтрування, виооковольтного електрофорезу (в/в) i хроматограф!'i на папер!. Нами було розроблено прискорений метод С" Препаративне пэптидне картування") виэначення пер-винно! отруктури високогомолог!чних б!лк1в а молекулярной масою 20 ООО - 30 ООО. Для досл1дження ам1нокислотно! noaai-довност! 01лк1в та пептид!в застосовувались метод Едмана в сполучтш! а дансилюванням (Гусак та 1н., 1979 ) 1 карбокси-

пептидааа А 1 В (Пугачева, 1971). Лтпокмалотшш склад виа-начали за допомогою аиал1затора аминокислот ААА 331, ЧССР.

РЕЗУЛЬТАТ!! Д0СЛ1ДЖЕННЯ I IX ОБГОВОРЕННЯ

Для з'ясування первинно'! структури пол!едрин1в ВЯЛ ми аастосували традицГйяий п!дх1д, розроблений в наш!и лабора-. тор 11 для б1дк!в ТВ бакулов!рус!в, - досл!дження т!льки триптнчних пептид1в а причини високого ступеня гомолог11 б1лк1в ТВ.

Досл1дження первинно"! структури нового пол!едрину ВЯЛ Мл та з'ясування 1 уточнения повно! ам1нокислотно! посл1дов-ност1 ран1ше вивчених в наш!й лаборатор!! пол!едрин!в ВЯЛ Аз, Оп, Рс1 1 Вт вимагало розробки р1зно! методолог!! для розд!лення триптичиого г!дрол1зату пол!едрин!в, через те що у випадку нового б1лка необх1дно було одержувати во! пепти-ди, а для б!лка, у якого в т!й чи !нш1й м!р1 з'ясовано ам!-нокислотну посл1довн1сть, - т1льки деяких зазначених пепти-д1в. Для цього ми розробили дв1 стратег!! з'ясування первинно! структури пол!едрин!в.

По перппй традиц1йн!й стратеги триптичний г1дрол1зат попередньо розд!ляли гель-ф!льтруванням, а дал! матер!ал ус!х фракц!й роэд!ляли р!зними комб1нац!ями в/в електрсфоре-зу 1 хроматограф! на папер! у двох електрол!тах ! двох системах роачинник!в. У вс!х одержаних фракц1ях визначали ам!-нокиолотний склад та Н-к1нцев! залишки. По друг!й стратег!!, як!й ми дали назву "метод препаративного пептидного карту-вання", триптичний г!дрол1зат розд!ляли препаративним в/в

с,; и.мцш

» *а а « т па на

Л* ура'циа

електрофорезом 'Лльки в одному електрол1т! 1 хроматогрувал]

в одн1й систем! розчинник1в. Необх1дн1 пептиди досл!джувал

п!сля проявления хроматограм н!нг1дрином.

При обох отратег1ях повна ам1нокислотна посл1довн!ст:

встановлхсалась шляхом пор!вняння будови вивчених пептид11

досл!джуваного б!лка з в!домою первинною структурою еталон-

ного полхедрину ВЯЛ Вт (Козлов та !к., 1978).

Первиннна структура пол!едрину ВЯЛ Мл ран!ше не досл1д-

жувадзсь. Ми ьстановили '1

по перппй стратег!'!. Н

Рис.1 представлено резуль

тати розд^лення гельф!ль

труванням розчинного трип

тичного г!дрол!зату в!днов

леного та карбоксиметиль

Рис. I Роздхлення розчинних трип-0Е&К0Г0 (Вкм) пол!едрину. тичких пепти^хв полхедрину ВЯЛ

/5 Уа Шон9* сефадексом Гт25 дал! !з матер1алу семи п! (2,5 тЮОсм). Швидкхсть елюци

ЗОыл/г, об'ем фракцй - 5 мл. було в1д!брано 48 гомо

генних пэптид1в (Т) ! вивчено 1х будову. Пептид Т28 додатко субфрагментувався х!мотрипсином (С1ч). М-к1нцевий залишок Ме був визначений п1сля обробки б!лка 0,1н КаОН. Схема реконс трукц!'1 пол!пептидного ланцюга > введена на рис.2. Стр!лкам --> на рис.2 1 дал! позначено число 1роведених С£ад1й дегра дац!'1 за Едмагюм. Стр!лками <— позначена посл1довн!сть за лишк1в, встаиовлена д!ега карбоксипептидази А 1 В.

Первинка структура под!едрину ВЯЛ ЫЬ. Дей пол!едрин Су вибраний нами для в!дпрацювання метода препаративного карту :>ання по друг1й методиц! Еизначоння пераинно! структури, че рез то, що дбик! Фрагмента цього б!лка частково досл!джув£

[ись в наши лабораторП (Kozlov et al., 1986), а повна ам1-юкислотна поелiдовн!сть була виведена з нуклеотидно! для .ншого штама ВЯЛ Mb (Cameron,1989). Методом пептидного кар-'уваня було в1д1брано 31 пептид. Схема реконструкцП пол1-1ептидного ланцюга наведена на рис.3. Пептиди Т18 i Til ¡убфрагментувались термол!аином (Th) 1 Ch в1дпов1дно.

Метод препаративного пептидного картування може бути гспшно аастосований для з'ясування первинно! структури ви-:окогомолог1чних б!лк1в середнього розм1ру (м.м. - 30 ООО).

Первинна структура пол1едрину ВЯЛ As. Часткова ам1но-мслотна посл1довн1сть великих фрагмент1в пол1пептидного [анцюга була встановлена в наш1й лабораторП ран!ше (Гусак, .985). Для одержания недостатн1х пептид1в i розкриття дужок !КМ-пол1едрин розщеплювали Т i г1дрол1аат роздхляли методом |репаративного картування. Таким чином вид!лено 25 необх!д-[их гомологiчних пептидiв. Пептиди Т8 i Т16 субфрагментували !h i Th в1дпоп1дко i субфрагменти розд1ляли в/в електрофоре-юм. На рис.4 наведена повна ам1нокислотна посл1довн!сть, на 1к1й позначено hobí одержанi нами пептиди.

Первинна структура пол!едрину ВЯЛ Sn. Часттоза aviKO-мслотна посл!довн1сть була встановлена в наши лабораторП >ан1ше (Гусак, 1981). Для розкриття дужок з триптичного г1д-кшзату немодиф!кованого б1лка методом препаративного пеп-•идного картування було видыено 10 необх1дних пептидов, [ептид Т9 субфрагментували Ch, а пептид Т18 1 Т23 - Th. 3 :1мотриптичного г!дрол1зату 01лка методом картування буз ви-;1лений один пептид ,с;о м1стить в соб! тр1птофан (Ch22).

Bel досл1джен1 нами пептиди позначен! на рис.5.

Первинна структура пол!едрину ВЯЛ Pd. Повна амiнокислот-

на посл1доен1СТь цього пол1едрину була встаьовлена в naaiii ¿абораторП (JleaiTiHa, 1981), а такок виведена з нуклеотидно! naojiiflOBHOCTi гена пол1одрину 1ншого iatuiary ВЯЛ. Mi« данный двох лаборатор!й були розходкешш. Для встановлення !стини ми вдруге методом пептидного картування а триптичного г1дрол!за-ту немодифхковакого бшса видыили необх1дШ пептиди.. Пептиди Т18 субфрагментували Th, а нероэчшшу фракц!ю триптичного г1дрол1зату розщеплювали Ch i Th. 3 х1мотриптичного г1дрол1-аату бока пептидним картуваннкм вид!дяли необххдний пептид, що м1стить триптофан (Ch22). На б1лку, обробленому С,1н. NbOH, було проведено 5 стад1й деградацП ва Едманом. Одержанi результат« представлен! на рис.6.

Первинка структура пол!едрину ВЯЛ Вт. Повна атнокис-лотна посл1довн!сть його була встановлена в наш!й лаборато-рП (Козлов, 1078), a п1ан!ше виведена а нуклеотидно! посл!-довност1 гена пол1едрину inmoro 1золяту ВЯЛ (Iatrou,1985). М1ж цими даними мали м1сце роэхсдаення. Для перев1рки is триптичного 1 х!мотриптичного г1дрол1зат1в немодиф!кованого б1лка, методом пептидного картування вид!ляли в!дпов1дно пептиди Тб i Т26 1 2 пептида, як1 м!стять триптофан - Chl2 1 Ch 23. Пептид Chl2 1 Т26 субфрагментували в1дпов1дно Т 1 Th. 3 нероэчинного матер!алу триптичного г1дрол1зату пол1едрину, модкф!кованого мале'1новим анг1дридом вид1ляли пептид Тш11, який субфрагментували посл1довно Ch 1 частковим кислотним г!дрол!зом (А). Одержан! результата приведен! на рис.7.

10 20 ^-Тхг-КиУЛ^^.З^Г-ТтТ-*.!!-^-^

—--■- ----¡гЕ^Ё^Тту- ? 1,4 -1- ~

50 40 Т}1-| '

--:-1-тс——»Т7 *- та ■ .1 гг-г;-~1а-----— |— — "Чц—

60 70

во " 90

. Т1» -Ч—-■=-—— Т1Г.-;---»па 1

= -н^ 116--1

"0 120

150 1»0 ' 150

-120 -Т21 —I — _--- ~ *г2 --,--■■-'----^ П} ■=

1С0 ' 122 ~ тггг-1 1?0

----1-тг*_________=->-~--1г>-нгм

1 Т2«' I

МО 190 200

— —„■* - , ¡ТГГ.-Г-. Г7Г. Т2?' ' 'Г271' ■ ' ~

210 • 220 '-

•гр-С1и-»«п-ГИ«-1уг-1(г»-Рго-1«и-ии-Туг-11е-01т .11Г-А1>р-5«г-11«-Оги.01а-01и-;1и.11.-ии-ии-01и-У«1-

— . --————-тгз__

— тгф1—-»¿тз^-^:-тд^^- ! —I

• тгз-1-

--^ггэ ----1--^----—;-1н

;га1Ю->=т,з4—I

Рис.2 Реконструкьця пол¿пептидного ланцюга полхедрииу• ВЯЗ Мп

10 20 ■ '

,-II -Г" ~*-Т2~* -~ -н^-1»-Н;-

«О

ГХ Й*—_,—---'-.■сГ^-1—-----13---тэ-

60 70

—_' —> —■ — — —•— —~_щ ■ и?-1—-

ео - '90

■Т1?, ~* п» ——-.Г* -II? 716---"7-

110

^------—- , — — -— —таа>г=- -.

150 • 1»0 _ . . . _ '______»?.

ип-АГ5-Сув _

-тго —I Г", • " ; тг1-

—->—«•—«•—--.г:—и«-

170

__Т22_- --

180 ИЗ"

12«-1-?г*

Т-гТ"-1 гоо

I--- — — ■— —' =-1~* —• --— ---

— гТ —ПГ ~ тз; I Ц. "Г —__—___-

-тнсъг ■

250 - - 2й0 — —¡зесэазя-—■ —* ~ —^рг- —» •=г.т?2-—----

Рис.3 Реконструкцхя пол гпептидного ланцюга пол!едрину ВЯЛ Мь

—— lo ' го

^ I ' • I ' (en

t¡l?-S»r-Vil-Il«-tja-l,a-il, -Г/í-trí-I.j,-OU-Kl.-L.»-H.-l!lu-Hl«-l.u-í,r«-«l\l-Olu-lr.J¡bl-I.«'J-í«p.píi-

-ij —h i-------—" is-1------^=17 i---

60 70

reu-À^-T^-Phe-Uet-VU-Alâ-oiu-Aep-Pro-Phe-Ltu-ClT-Pro-ûlj-Lyi-AMJÏUi-tji-Leu-Thr-Uu-Phf-lys-iU-

- TSChI -i^'S. hi I--- =~ï8Cni —<

*~5j TS : Ç3 ' ' 100

110 J20 í—n-^m.----1 HG--I :--r —--SJSS.

I>0 I«o . .150

160 ' 170 --Jtji--.—I---кг .

— «¡'—i —■--" ~--

140

s-WJ-J. Ci-íi er-u 1J-TJ я • r-î^. «-Cla-

im 190 гоо

: 125'-

210 220

250 2U) —-

ß « г - * V- -L« и-île-Ljl-V »1-Lj Ь;-!"!',■ -Al э-А » p-11 ( .ftro-Leu-ïjT-fler-Oly-Pri-AXâ-ljrr . . ти--f I ■'-i—~ " ГЦ i

Рис.4 Повна ампюкислотна посл1Д0вн1сть псШедрину ВЯП As

, to , ■ го

50 40 50

Val-Ila-Lya-Ain-AU-I-ya-Are-Lja-Lje-lUa-Leu-Gln-Olu-: la-Glu-IU-ûlu-Glu-Lya-Aaa-Leu-Aap-Val-Uu-Aep-

------:, те* -1 "—" ~*"

eo 70

- í r- ' Г? 'гукг —.'

60 90 too

Aaa-Yal-I.yil-Pro-Aap-Thr-U«t-tja-Lôu-ï«l.V»l-»ao-Irp-Lya-01y-ty«-01u-rh«-î>T-''ri-01u-ïht-Trp-Thr-Arg-

НО . ISO

r)ie-U«t-01u-A«n-3er-nn-Pto-Ila-V«l-Aan-Aap-01n-Clu-Val-ll«t-Aap-Val-Pha.t.«u-Val-Ala-Aai>-l«u-I,ya-íre-

I-— TI4 - . "■'•■ -—-___

i— - иетпг ' i . ■ ■ ■

IÎ0 140 • 150

_ 119 ■ ... I r «=-r- —: Ch22--Г , , i .

160 - 170

Val-Ila-Ari-Ilt-Val-Olu-Pro-Sar-ïrp-Val-Oly-Sar-Aan-Àaa-'Slu-tyr-ArB-Ila-etr-Ua-Ala-tya-byi-ily-Oly«

i тгз ,-■■' i ' _ " '

■-—-S2Mht *-I

ISO !90 • 200

. T2«>"-1--ta7-:

2X0 гго

Aao-rí<-Tyí-tya-?r<i.IU-Yal.-Tyr.Il«-5ly-thr-iap-thr^«r-01u-01u-5lu-aiu-I«B-'Ilt-l«u-ai«-V«l-e«r-l«\>.

г:о 240

Val-PM-bve-Val-Lja-Olu-Pbt-JUa-rro-lap-ila-tre-bau-Fha-thr-OlyPro-ILla.tyr

Рис.5 Ловна ащнокитслотна послгхдовтсть' пстлгедрину ВЯП ¿т.

50 fcO

■------— и-.

£0 70

в0 90 100

110 I»

Г33"^1^" " Tioira '

IÎ-Э I i»o 15,3

160 I?0

Hit-C lv-V»l-U»-*re-Il*-Y«l-Glu-Thr-etr-T7r-Val «я-С1л-Рго-А»п-31и-Ттг-1гв-11«-0»г-1.«д-41»-1гГЛ-1г?»

---180 190 KO

'"""■■ ' тго -- r^rr¡}|„

ÎIO ЗЛ

Trp-lip-Aea-Phf-T7T-I-7i-Pro-Zl»-Val-r7r-y«l-01y.-Thr-Thr-Al»-3er-Clu-Glu-31j-01u-Il»-tfu.Itu-ülu**el-

■ ToIChZThí ■

2Ï0

a.p-t«4-»H-rht-l7«-Il.-L7»-Clu.rh»-»l«-r»í-»»p-Alt-Pi<i-Uu-n:«-51a-0l7-Pr»-».ll.-TjT

Вис.6 Повна ам1нокислотна послтдовшсть пол{едрину ВЯП Pd

i 10 ( ' 20 , ■ Pro-Jleû-T7r^»r-tjT-ABa-Prc-Tlir-Ili-Ol7^.r5-Ihr-T7r-T»l-TjT-Aep*'liû»Ii7»-Tjï-T7r-X7f-iiB-I.tu»OÎ7»Cl7*

JO «О 50

'■**•"' *"* "-*—"—~ смг

i--скхггх -=-1

m то

iin-T;T-ïtt-7.1-il.-01u-A.j-Pro-n,-Liu-<!l7-Pro-tll7-l7«-!.io-OU-l7i-Uu-ItU'-i>u-Pti»-l7«-01o-Til-*r£-

M !со

1X0

" ™ >.—.—— ..;

1 JO IM

thr.lr»-Pro-»io-lrj-Cj>-l7í-l7»-ni«-L«u-Al 01a-Kit-U»-l«u-*rí-Itp-Hp«Olu-»«p-T7r-T«l-fx«-HU-OlM

|ГТ~ ~~ r*S ChSi — '

• 160 • 170

Ta-Il.-Arj-Ili-ï.t-Olu-rro-O.r-TjT-ïtl-Ol?-»««-»" -A»n-eiu-T»r-Arj-Ilt-»«í-l»u-"»-t.r<-ll«-<>lJ-I«r-

IÖO I^3

гю гм

........* i--:----S^=n«iicmA» —<

2 jo sw

Yil-rh.-Lyi-Il.-I.yi-Olu-Pht-ll.-Pro-lip-ll.-rro-I'm-Ph.-Thr-OlT-Prp-ll.-T.r

- MI---

Рис.7 Повна амхнокислотна побяхдоэш'сть' полхедрину БЯП Вт

- 12 -

Еволюцпший аспект первиннсц структури пол!едрину. Ниж-чб приведено пор!вняння первинно'] структури пол1едрин1в шести досл!джених нами ВЯЛ. 10- 20

мь м У т К У г* о У N Р®

Мп М У т Я У У N Р Т

(Зт р N - У V ¿1 Р Т

Вш р н - У Б У N Р т

Аз м к к р У 5 У N Р т

М и к N р У N У 5 р|а

БРТУУУОЛКУУ □ ¡?ТУУУОМКУУ

ОРТУУУБЫ к[7]у

0

I вк Т УУУОНКУУ

Ьер1с1ор1ега

Ы

30

К Н Ь в 5 V 1 К N а|~М~1 К к К Н К N Ь 6

К N Ь Б К N Ь Б

V I К N А К Р К К

У[3[1]Р[3- БЙТУ УУПИКУУ 40 50

Е Е кТ]ь И Р Ь В й У Е Е

N А А

I Е Н Е Е Н Е

(ПОРЮ

V I ККАКЙККНЬ^ Л|] КИАКРККНЬ I ЕНЕК

К N I в 5 V I К N А К й кИн I I Е н[Г|к

Е Н Е I Е Е К N Ь Р Е Е К Е Е К

К N Ь 60У I К0А К К0Гн Ь0Е Н Е I Е Е[]ГБ I о[Й]ь Б И У

I О Ь О

Ь Б Р Ь Б

Т Р

К N I СПУ I К N А[1К

ЗНОбеЦГЗОО. вПу

■ 60 70 80

ЬУАЕОРГЬБРБКМЦКЬТЬРКЕ I КНУКРОТМКЬ

ЬУАЕОРРЬСРбКИОКЬТЬРКЕ I ({ЫУКРОТМКЬ ЬУЛЕОРГЬСРБКМЦКЬТЬРКЕIРИУКРОТМКЬ

УАНВРР1ЕРВККЦК1Т1РКЕ УАЕОРГЬбРбКИЦКЬИРКЕ

ЙНУКР0ТМК1 КИУКРГТМКЬ

Г V А Е О Р Р| У]Б Р0КИК11ЬРКЕ 1КИУКР01МК1

[. V А Е П Р Р[1па Р а К М а К I Т I. Р К Е I й N У К Р о т и к ь

í

- 13 -

90 100 ' 110

vvnwsgkeflretwtrfmedsfp i vndqevmd ¡T[ v nwsgkeflretwtrfmedsfpi vndqevmd

v v n w0g к e f0r etwtrfmedsfp i vndqevmd jTjv nwsgkeflretwtr f[T¡E dsfpivndqevmd

vvnwsgkeflretwtrfmedsfp i vndqevmd vvnwsgkeflretwtrfmedsfp i vndqevmd

a A A

V V QW QG К E FC3? ETWTRFMEDSFP1 VNDQEVMD

120 v f l v v0l v

TJn

l Q I v f l v a n L V AN

v

i f

i y

e a

t i

130

rptrpnrc r p t

f]k f f rip

l l l V * a

к] Р N R С PTRPNRCYKF P T R P N R С Y K_F PTRPNRCY [R [F RPTRPNRCYKF

* A A

VI~~1U-]N MRPTRPNRCYKF

160

EPSYVGSNNEY EPSYVGSNNEY EPS wjv G S NN E Y

140

L A Q H A L R L A Q H A L R

150

D P D Y V P

D|S]D Y V P LAQHAL RWDPDYVP L A Q H A L R W D|Ë]D Y V P LAQHAL R|c]D P D Y V P V|A Q H A L R W D|e g]Y V P

laqhal rj idi-[y v p

170 160

H E V I R I V H E V I R I V H[D]V I R I V 'm

R0S L A К R G G G С P

H E V I R I

H E V I R I V

H E V I R I V

A

H E V I R I V

Y A jC

E P S Y V g

E P E

M|N N

D Y V G

Jt^s Y V|n

V G

E Y NEY NEY

N Q P

A

EÜZZIVLZTJN E Y

R I S L@K R G

R I SLAKRGGGCP IM

R I S L A K@G G G С P I M

R I S L A К R S G G С P I M

R 1 SLAKRGGGCP ¡¡R|

A A

R I S litjk r Bj [p P Ip

m

- и -

ISO 200 .

nlhseytnsfeefinrv1wen

H l 11 S E Y I N S F E

h|seytksfe

hseytnsfe

rijs e yjnin s f e h l и sqy t[t|s f е

210

f y к pj_v y |v}g t l

F I N R V I W E-N F Y К P

F I F

t

¥]R V IWEN

F I

PL

Y I G T D

s|v i wInIn

11 Lt-lyl—Is F EDF 4—iv

220 230

WriN

saeeee i llevslvfk 1 hefa SAEEEEillevslvfkikefapdapl l e v s l v f k@k e f a

E E E E

L i

TjS

e e e e i l^[e vslvfk 1 kef a saeeee i ll e[tjs 1.[l]f k[vJk E f a

[Fs|f. eeejllevslvfkikefa

tfi * тк Л -Л тк 74 А

f—j£ eeeillevslvfkikefa

F У К Р i v У 1 6 I D NRV1WENFYKPIVYIBTD R V I W E N F Y [RÜ]M| V Y I G T D F Y К P I V Y |VJG Т[Т

А A A

F Y KtHUV yiGI[ 240

P D A P L! YI NJG PAY yjTGPAJ PDAPLFTGPAY PDAPLFTGPAY G P A V

PD0PL

y S 0

G P A Y

p D a p l f

A

p dqp l fog pay

Для максимального ступени гомолог!"! у деяких ам!нокис-лотних поол!довностях припущен! делоц!! ( - ). Вар1абельн! аалишки ам1нокисло? взят! в рамки. Положения, в яких в1дОува-ються гомолог!чн! аам!ни в трупах позначен! з!рочкою. Для ви-яонення ф1логенетичних вэаемов!дносин пол1едрин1в у груп! ВЯЛ ми залучили, кр1м наших даних, ам1нокислотн1 посл!довноот1 ще 8-ми пол!едрин!в, виЕвдених а нуклеотидних поол1довностей в1дпол!д1!их ген!в 4-х БЯП загону Lepidopteгa ! одного ВЯЛ -Нушпор1ега. Серед ВЯЛ, як! пор!вшгаоться, е представники двох загон!и комач, двох втам1в одн!е! комахи ! по два !золяти ВЙП

|трьох (сомах. Для кожно! парк пол1едрин1в ми п!дрдхували число в1дпов!дностей (1дентичн1 та гомолог1чн1 аалишки ) 1 "ступ!иь спор!дненоот!" (Ноой,1973) (X числа в1дпов!дноотей в1д катального числа ам1нокиолотних залшшив пол!едрин!п, як! пор! вливались). 3 одержаних реаультат!в можна зробити чотнри основннх висновки: 1. Пол!едрини ВЯЛ загону 1.ер1йор1ега належать до групи еисокогомолог1чних б!лк1в а! "ступеней спор1д-неност1" в д1апазоШ 85-100Х. 2. Дивергенц1я первшших структур поя!едрин!в ВЯЛ серед загону Ьер1с1ор1ега вначно нижча ди-вергенцП первинних структур загон1в Lo>pidopteгa• I Ну;лепор1ега ("ступ!нь спор1дненост!" БЗ-Б7Х (загш Lepidoptera - с амий молодий заг1н комах). 3. Дквергеш.Ця по-л!едрину проходить двоиа пзралельнши шляхами, заледнкми Шд хазя'Ша 1 в!руса. 4. ВЯЛ по р1зному реагують на природшш а1д01р у процес1-дивсргенцП в залежност! в!д д1лянок пол!-пептидного лпяцюга пол!едрину. У пол!пептидному ланцвгу чггко вид!ляеться намб1льш вар!абельна дхляшса 1-53 ("ступ1нь спо-р!дненост!" 70-98%) ! константна 53-123 ("ступИгь спор!дне-ност!" 92-100X).

Високий отуп!нь консервативнсот! пол!едрину ВЯЛ Lepidopteгa дозволив випнсати так звану "загадьну формулу" ц1е! групи <51лк1в (¿£р1'с6. Загадьна формула складавтьоя з '.'смислово! посл1довност1", яка м1стить в ссб! !дентичн! ! гомолог!чн! заливки 1 " не суттвв1" д1лянки, як1 Шотять в соб! вар1абельн1 залишки! "Не сутт8в1" д!дянки взят! в по-рожн! рамки на загальн1й формул!. " Суттева поол!довн!сть вм!щув 78Х залишк!в ам1нокиаяот, а "не суттвв!" д!дянки -22Х. На загальн1й формул! очевидний р1знии отуп1нь реакцП пол!едрина на природний э!дб!р в вар1аСельн1й 1 конотантн1й

д!ляиках: вар1айельна д1лянка м1стить в соб! 60% "суттево'1 посл1довност1", а константна д!лянка - 901.

Структурно-функщональний аспект первинно! структури пол!едрину (г1потеаа). По величин! "суттевоЧ посл1довност!" аагалыю1 формули можна судити про важливЮть майже всього пол1пептидного ланцюга для фушоЦювання пол1едрина.

Очевидна 1 загальио в1дома одна функция пол1едрину -черев б!лок-б!лкову взаемод1ю молекул пол1едрину утворення суперв1р1окансида (эахисна,структурна функц1я). Ран1ше в на-шй лабораторп були експерименташга визначен1 д1лянки по-л!пеитидного Данцига, в!дпов1дальн1 за б1лок-б1лков1 вваемо-дП (К!б1рев,1976; Ког1оу,1986). Ми спробуваяи вивести мотив одн1б! а цих делянок. Цей мотиь приведений на рис.8. В1н на 7ИХ складавться а аалишк!в - носив сигнатури б!лок-б1лкових ввавмод!й.

Кр1м б!лок-б1лкових вэаемод1й в1дом1 1нш1 - б1лок-нук-ле'1нов1 1 б1лок-мембранн1 ваабмодП. Це воображено у ран!ше висунупй г1потез! структурно-функционально! оргшизаци по-л!пептидного ланцюга пол1едрину, аг1дно в якою пол1едрин мае мультифункц!ональн1 власивост1 (Когоу еЬ а1.1986). Поглиб-лиючи цю г1потезу, ми спробували локал1аувати на пол1пептид-ному ланцюгу пол!едрина мотиви, як1 в1дпов1дають за перел1-чен! нище взавыодП 1 властивост1. Результати цих доол1джень приведен! на рис. 9-11. Таким чином, нами були визначен! кр1м мотива I Ппотетичн! мотиви, в!дпов!дальн1 ва вэамод!ю пол!едрину з РНК псиаедр!в (мотив II), ядерну локал!зац!ю (мотив III), ав'язування нуклеотида (мотив IV), ваабмод!ю а мембраною в!р!он1в (мотив V) ! кл!тинною мембраною (мотив VII), фосфорилювання (мотив VII).

- 17 -

Ми такок пор1внялн аЛнокислотну поол!довн1сть в!дпов1-далыюго за б1лок-б1лиову взасмод!ю фрагмента 121-189 г.ол!ед-рину з ам!нокислотною поол1довн1отю N-KlnneBO'i частини 1-85 фактора некрозу пухлини лмдиня. Таким чином у пол1рдрин1 були знайден1 2 д!лянки, гомолог1чШ на 50£ 1 60Z (рис.12.a i 12.6 в1дпов1дно) э д1лянками фактора некрозу пухлини люднни. Щка-во п1дкреслить, гдо д!лянка "а" пол!едрину (рис. 12.а) включая мотив VII i пильно примикае до мотиву VI (рис.13). На рис.13 приведено гШотетичну моделт> структурно-функц1онально1 орга-н!зацП пол!пе^птидного ланцага пол!едрш1у ВШ, на як1й лска-л1зовша мотиви I-VII. Зг1дно з запропонованою г!потовою мох-на рекомендувати модиф1кац!ю методом генно! !нженерП певних эалмвк!в в анаадепих нями пол!едринових мотивах. Зд!йснить це можна, аастосовуючи вектор, сконструйований в налгому иютиту-Ti на баз! ВЯЛ Мп. Щ досл!дження в фундаментом для розробки 1 одержання hobíthíx б!отехнолог1й.

К - V,Ь,I,А - залишки г!дрофобних ам1нокислот /> /)

а —. -С" . -ОН - донори-акцептори он т12 водневих зв'язк1в

Рис. 8 . Мотив д1лянки пол1едрину, в1дпов1дальний за 61 лок-<51лкову взаемод!ю.

к

£1« —уXу ф»

Ь 27

0. СХх|ХуХу\Т)? пол. К^АКЙ^Н

12 о т, 22

пол.

IV

а. УХ6СХ0К|—Х40_150—-ВХХО—Х40-60—-Ы^ХБ

56 - ко юл. \гх6схо;а;—х21-------ггл^о—х4Э------щр

Рисл 9 . Б1лков1 мотив:: (а,й), в1дпов1дальн1 за й1лок-нукле!нов1 взаеыод11 1 спор1днен1 посл1дов-ност1 пол1едрину (пол.). А - ьзаеиод1я э РНК, Б - сигнал ядерно! локал1зацИ, В - эв'язу-ванкя нуклеотида.

В

a. F/Y-V/I/L/A-G —

Г - Ь/Y -0 (61-63) ПОЛ. Y/W- V -О (161-163) Y - V/I -О (210-212)

И

а, a—XQ_4—а~х5_1 j—a—х1 _5—а

0. а-------%-21------а~/м

133 р 151 ПОЛ. С-Хб-----Н----Х3---^----Xg—н

Рис..ю ■ Б1лков1 мотиви (a,d), в1дпов1дальн1 за <51 лок-и&идранну взаемод1ю, 1 спср1днек1 посл1дс»ност1 пол1едрииу (пол, ). А - фактор эйер1гання структурно! ц!лгстност1, вэаемод1я э фосфол1п1дниш агрегатами. Б - транслокац1я через мембрану, а - с ado Н. _

V!

a. S->Р->Х->|

Г->р-,н-»к (126-129)

пол. Т«-Р«-(128-126)

Р->Т-»8 (127-129)

Рис. II . Пстоновий мотив (а), в1дпов1дальний за фосфо-ршшвання, 1 спор!днен1 посл1довност1 пол1едри-ну (пол.).

133 а. пол. С

TN? Y 1

R IIP - RTF -- К - L N А - Y Ъ

S S 5, R T Р S D _К Р * - Н Y ъ

121 17

ö. пол.

MJF

174

6i>

к о О 0 с р --- I Н N I - 11 S

к G Q о 0 р S Т N V L - L Т н т

184

79

Рис, 12- Д1ЛЯНКИ пол1едрину, 1 спор1днен1 аы1нокислотн1 посл1довност1 фактору некрозу пухлини лвдиии (TNF).

Рис.13 Ппотегггчна модель отруктурно-функц1онапвно1 ор-raHisaqi'i пол1 пептидного ланцюга пол!едрину ВЯЛ. Фрагмента в1дпов1дальн1 за 61лок-61лков1, 61-лок-нукле'!нов1 та б!лок-мембранн! взазмодП позначен! Ш.Ш.О - в1дпов1дно.Рамками позначен! м!сця розташування мотивiв I-VII. Стр!лки показу-ють центри роащеплеккя пол1пептидного ланщзга про-теааов пол1едр1в.

вшгавки

1. Традиц!йними методами з'ясовано повну ам!нок1;слотиу . посл1довн!сть пол!едрину ВЯЛ Мп.

2. Розробленим нами методом препаративного пептидного картувашш з'ясовано ам1нокислотн1 лосл!довност1 пол!едрин1з ВЯЛ М. brassicae i A. seg-etim та уточнено посл1довност1 пozi-едрин!в ВЯЛ Q. mellonella, Р. dispar, В. morí.

3. Встановлено ф!логенетичн1 взаЕмов1д»саеннп чотиряад-цяти пол!едрин1в ВЯЛ комах, вм!щуящцх 9 вид i а загону Lepidoptera (8 ВЯЛ чотирьох видiв представлен! ш1сттю 1золя-тами та двома штамачи) i один вид загону Hymenoptera. Виваде-но смислову посл1довн!сть пол1едрину ВЯЛ Lepidoptera.

4. У смислов1й посл1довност! пол!едрину ВЯЛ визначили б!лков! мотиви, як! в!д!грають важливу роль у б1лок-б!лкозих, б!лок-нукле1Нових, б!лок-м9мбранних взаемод1ях, а тахоя в1д-пов1дальн! за ядерну лс1сал!зац1ю пол!едрнну, зп'пвування нук-леотида 1 фосфорилювання. Висунуто г1потезу про зв'язок цих 1:отив1в з в1домими та передбаченими ф!аико-х!м!чними 1 б1оло-Пчними властивстями пол!едрину.

Б. Подан! рекомендац11 по направлен1й модиф!кац11 визна-чених ам!нокислотних залишк!в в мотивах пол1едрину i aanpono-новано подальш1 напрямки фундаментальних 1 прикладних досл1д-день по удосконалешпо вектора та б1отехнолог1й на баэ1 ВЯЛ 0акулов1рус1в.

СПИСОК ОПУШИКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАДЬ ПО TEMI ДИСЕРТАЦ11

*

1. Козлов Э.А., Левитина Т.Л., Гусак Н.М., Роднил Н.В., Атепалихина С.А., Пальчиковская Л.И. Выяснение полной аминокислотной последовательности полиэдрина ВЯП озимой совки (Agrotis segGtum) и уточнение первичной структуры полиэдринов ВЯП тутового (Bombix mori), непарного (Porthetria dispar) шелкопрядов и большой вощинной моли (Galleria mellonella) // Биополимеры и клетка. 1991. - t7,N1. - С. - 75-82.

2. Kozlov Е.А., Rodnin N.V., Levitína T.L., Gusak N.M., Rodomsky N.F., Palchikovskaya L.J. The Amino Acid Sequence Determination of a Granulin and Polyhedrin from Two Baculoviruses Infecting Agrotis segetum // Virilogy 1992. t.189.- P.320-323.

3. Пальчиковская Л.И., Левитина Т.Л., Бобровская М.Т., Овандер М.Н., Кацман М.С., Козлов Э.А. Ускоренный метод определения первичной структуры высокогомологичных белков. Полная аминокислотная последовательность полиэдрина вируса ядерного пслиэдроэа (ВЯП) капустной совки, Mamestra brassicae // Биополимеры и клетка. 1993. - T9.N4. - С.44-50.

4. Пальчиковская Л.И., Бобровская М.Т., Роднин Н.В., Левитина Т.Л., Козлов Э.а. Триптические пептиды полиэдрина вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) кольчатого шелкопряда Malaco-soma neustria // Биополимеры и клетка.-1993. т9,N4.-С.29-34.

5. Козлов S.A., Роднин Н.В., Пальчиковская Л.И., Левитина Т.Л., Бобровская М.Т., Радомский Н.Ф. Первичная структура полиэдрина вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria // Биоорганическая химия.-1994.-T20.N5, - С.543-545.

Падьчиковская Л.К. Первичная структура полиэдркиа баку-ловирусов отряда Lepidoptera.

Диссертация на соискание ученой степени ¡кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биооргашческая химия; химия природных и физиологически активных веществ, Институт биоорганической химки и нефтехимии ПАН Украины, Киев, 1994.

Завдаются б научных работ, в которых опубликованы полные аминокислотные последовательности полиэдринов 6-ти ВЯЛ н предлояен ускоренный иетод определения первичной структуры белков средней величины. В диссертации выяснены филогенетический взаимоотношения полиэдринов ВЯЛ отряда Lepidoptera и Hymenoptera и предложена гипотева структурно-функциональных вваимоотношений полиэдринов.

Palchlkovskaya L.. I, The Prlciary stricture of the poly-hedrln baculovlruses Lepidoptera.

Dissertation has been presented for the reclevelng the degree of the Candidate of Science (Chemistry). Speciality 13 02.00.10.- Bloorganlc Chemistry, Chemistry of Natural and Physiologically Active Substances, Institute of Bloorganio-Chemistry and Petrochemistry of Natinal Academy of Sciences of Ukraine, Kiev 1994.

5 scientific works containing completo amino acid sequences of 6 NPV polyhedrins and a new accelerate determination method of middle size proteins primary structure are defenced. Phllogenetlo relations of Lepidoptera and Hynoptera N VP polyhedrins as well as hypothesis of their stractural-functlons have been suggested too.

ilKwon í cuoRa:

nermvui,-OIäkm, no;iio/¡n!üi, ßMlH0{Gic.s0Ti?a noc« J/ionnlCTb.