Выделение и идентификация феромона восточно-луговой совки Mythimna separata и феромона большой вощинной огневки Galleria mellonella тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 632. 936, 2: 595. 782

ВЕНДИЛО Наталия Владимировна

Выделение и идентификация феромона восточно-луговой совки Mythimna separata и феромона большой вощинной огневки Gallería mellonella.

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д. х. н. К. В. ЛЕБЕДЕВА

Москва 1999

Оглавление.

Стр.

Введение. 7

1. Литературный обзор. 9

1.1. Способы выделения феромонов. 9

1.1.1. Выделение феромона из воздуха. 10

1.1.2. Выделение феромона из экстракта. 12

1.1.3. Другие способы выделения феромонов. 15

1.2. Методы идентификации феромонов совок и огневок. 15

1.2.1. Микрохимическое определение функциональной группы. 16

1.2.2. Хроматографические методы анализа феромонов. 17

1.2.3. Спектральные методы анализа феромонов. 21

1.3. Изучение феромонов огневок подсемейства Galleriinae и вощинной огневки Gallería melloriella (Lepidoptera: Piralidae, Galleriinae). 25

1.4. Изучение феромонов совок подсемейства Hadeninae и восточно- луговой совки Mythimna separata (Lepidoptera: Noctuidae, Hadeninae). 29

1.5. Применение феромонов совок и огневок. 35

2. Экспериментальная часть. 38 2.1. Методика эксперимента. 38

2.1.1. Выделение и идентификация феромона восточно-

луговой совки. 38

2.1.1.1. Разведение биоматериала. 38

2.1.1.2. Сбор летучих компонентов феромона из воздуха над живыми самками. 38

2.1.1.3. Сбор летучих компонентов феромона с желез самок. 40

2.1.1.4. Масс-спектрометрический анализ. 40

2.1.1.5. ЭАГ - тестирование. 41

2.1.1.6. Полевые испытания. 41

2.1.1.7. Изучение зависимости характера масс-спектра от положения двойной связи в мононепредельных компонентах феромонов. 42

2.1.2. Выделение и идентификация феромона большой

вощинной огневки. 42

2.1.2.1. Разведение биоматериала. 42

2.1.2.2. Сбор компонентов феромона из воздуха над живыми самцами. 43

2.1.2.3. Масс-спектрометрический анализ. 43

2.1.2.4. Биотестирование компонентов феромона. 44

2.1.2.5. Полевые испытания. 45 2.2. Результаты работы и их обсуждение. 46

2.2.1. Изучение феромона восточно-луговой совки. 46

2.2.1.1. Масс-спектрическая идентификация феромона восточно-луговой совки. 46

2.2.1.2. Определение положения двойной связи в мононепредельных компонентах феромонов по отношениям интенсивностей фрагментов в их масс-спектрах. 62

2.2.1.3. Лабораторное биотестирование компонентов феромона. 65

2.2.1.4. Полевые испытания феромона восточно-

луговой совки. 67

2.2.2. Изучение феромона большой вощинной огневки. 71

2.2.2.1. Масс-спектрометрическая идентификация феромона большой вощинной огневки. 71

2.2.2.2. Изучение состава феромона самцов вощинной огневки, обитающих в разных географических районах России. 79

2.2.2.3. Изучение зависимости состава и соотношения компонентов феромона от питания насекомых у

вощинной огневки шести географических

популяций. 80

2.2.2.4. Биотестирование компонентов феромона вощинной огневки. 85

2.2.2.5. Полевые испытания. 90 Заключение. 92 Выводы. 94 Литература. 96

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

DA, DDA, TDA, HDA, ODA - деканолацетат, додеканолацетат,

тетрадеканолацетат, гексадеканолацетат, октадеканолацетат

СбА1_, C7AL, CeAL, CgAL, C10AL, CuAL - гексаналь, гептаналь, октаналь,

нонаналь, деканаль, ундеканаль

DDAL, TDAL, HDAL, ODAL - додеканаль, тетрадеканаль, гексадеканаль,

октадеканаль

DOL, DDOL, TDOL, HDOL, ODOL - деканол, додеканол, тетрадеканол,

гексадеканол, октадеканол

CsON, C10ON, CigON - октанон-2, деканон-2, 6,10,14-триметил-

пентадеканон-2

Z5 и Е7 - цис- и транс- изомеры, цифра указывает положение двойной

связи

Z9T11HDDA - Z-9, Е-11 -гексадекадиенилацетат

Ci5, С17, С19 - углеводороды пентадекан, гептадекан, нонадекан

Me - метил-

Et - этил-

m/z - отношение массы иона к его заряду

[М]+* , М+' - молекулярный ион, образующийся при удалении одного электрона из молекулы

[ ] + - положительный четно-электронный ион, образующийся при разрыве одной или большего числа связей

[ ] - положительный нечетно-электронный ион, образующийся при разрыве одной или большего числа связей

а - альфа-расщепление; К - Са - У+' ; разрыв связи у атома углерода, смежного с атомом, несущим непарный электрон

I - индуктивная инициация реакции путем удаления электрона и изменением местоположения заряда

гН - перегруппировка, включающая переход атома водорода ИПС - искусственная питательная среда мВ - милливольт эВ - электронвольт

Введение.

Актуальность проблемы. К числу химических средств защиты растений, способных уменьшить вредную нагрузку на окружающую среду от их применения, без сомнения можно отнести феромоны - биологически активные вещества, продуцируемые насекомыми и выделяемые в окружающую среду для внутривидового общения. Феромоны широко используются в интегрированных системах защиты растений в странах с развитым сельским хозяйством и в качестве средства надзора и прогноза за популяцией вредителей, и как средство борьбы, особенно дезориентацией, что снижает объемы инсектицидных обработок или позволяет обойтись без них. Однако успешное применение феромонов зависит от правильности идентификации всех компонентов феромонной смеси, от точно найденного природного соотношения между этими компонентами, от знания биологии насекомого и роли каждого компонента феромона в механизме коммуникации данного вида, учитывая при этом не только видовую специфичность феромонной смеси, но и специфичность географической популяции вида. Если добавить к сказанному то, что насекомые выделяют феромон в нанограммовых количествах, и то, что букет феромона составляют вещества, стабильные настолько, насколько это необходимо насекомому, то задача выделения и идентификации феромонов представляется довольно сложной.

Цель работы. Целью данной работы является установление строения и природных соотношений основных и минорных компонентов феромона большой вощинной огневки, вредителя пчеловодства и восточно-луговой совки, вредителя сельско-хозяйственных культур для дальнейшего их практического применения в качестве средств для надзора и борьбы с этими вредителями.

Научная новизна. Впервые идентифицирован состав и соотношение компонентов полового феромона восточно-луговой совки, обитающей на Дальнем Востоке, в Японии и Китае и вредящей посевам зерновых культур. По результатам идентификации и широких полевых испытаний предложена оптимальная смесь из компонентов феромона восточно-луговой совки для

мониторинга и борьбы с этим вредителем. Подобран оптимальный материал диспенсера. Изучена возможность определения положения двойной связи мононепредельных компонентов феромонов по отношениям интенсивностей диагностических фрагментов в их масс-спектрах.

Впервые найден состав и соотношение компонентов феромонов шести популяций большой вощинной огневки, обитающих в разных географических районах, вредящих пчелиным сотам в ульях и сотохранилищах. По результатам идентификации полового феромона двух генераций вощинной огневки, разводимых на природном (вощина) и искусственном (отруби) корме показано, что необходимо учитывать возможное влияние на состав феромона диеты насекомых, разводимых в лабораторных условиях.

Практическая значимость. Полученные результаты позволяют использовать идентифицированные феромоны в качестве препаратов для надзора за вредителями. Знание компонентов половых феромонов этих видов насекомых дает возможность изучить хемокоммуникационные связи особей, механизмы популяционного поведения как в естественных условиях, так и в условиях борьбы методом отлова или дезориентации. Изучение влияния диеты насекомого на состав его феромона доказало важность учета этого влияния при разведении и изучении насекомых в искусственных условиях. Предлагаемый подход к определению положения двойных связей мононепредельных ацетатов, спиртов и альдегидов по характеру масс-спектра неизвестного соединения облегчает предварительную идентификацию изучаемых феромонов.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме по феромонам (Болгария, София, 1994 г.); на Международной конференции "Поиск и применение БАВ для защиты растений" (Санкт-Петербург, 1998 г.) был сделан доклад; по материалам диссертации опубликованы 1 обзор, 7 статей, тезисы 2 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 стр. машинописного текста, включает 7 схем, 19 таблиц, 13 рисунков, состоит из введения, литературного обзора на тему " Выделение и идентификация феромонов совок и огневок ", методики эксперимента и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы.

1. Литературный обзор.

Выделение, идентификация и применение феромонов насекомых, относящихся к семействам РугаИйае (огневки) и Мо&шс1ае (совки) отряда Lepidoptera.

Задача выделения и идентификации феромонов отряда чешуекрылых {1ерШор1ега) сводится к выделению и идентификации основных и минорных компонентов, представляющих собой геометрические, позиционные изомеры или родственные соединения, различающиеся функциональными группами, длиной углеродной цепи, степенью и положением двойных связей. Так как специфичность действия феромонной смеси обусловлена присутствием минорных компонентов, количество которых составляет несколько процентов от основного компонента, то понятно, что выделение и идентификация минорных компонентов феромона представляет задачу на два порядка более трудную, чем идентификация основных компонентов. Но даже верно идентифицированные все компоненты феромона не дадут в полевых условиях специфичного привлечения, если не будет точно соблюдено их природное соотношение, определение которого, в свою очередь, является сложнейшей задачей в процессе выделения и идентификации феромонов. При этом необходимо учитывать зависимость состава феромона от географического обитания популяции, так как способ изоляции видов с помощью соотношения минорных компонентов существует не только у таксономически удаленных видов, но и у одного и того же вида, обитающего в разных климатических районах.

1.1. Способы выделения феромонов насекомых.

Способ выделения феромона должен гарантировать извлечение всех его компонентов в соотношении, максимально приближенном к природному, с минимальным количеством примесей и потерь феромона. Для этого необходимо выбирать самый короткий путь от источника феромона до последней ступени его идентификации. Чтобы избежать улетучивания или разложения феромона, все операции необходимо проводить в среде инертного газа в условиях невысоких температур. Чтобы не вносить

дополнительно усложняющих идентификацию примесей, необходимо тщательно чистить все реагенты и растворители, с которыми приходится оперировать.

Все описанные способы выделения компонентов феромона можно условно подразделить на три группы: а) выделение летучих веществ из воздуха над живыми особями в момент их активности или над препарированными железами; б) экстракция органическими растворителями целого насекомого или отдельных его частей (длительный контакт растворителя с железой) и смыв компонентов феромона с поверхности феромонной железы (короткий контакт растворителя с железой); с) другие, менее популярные способы выделения феромонов [1].

1.1.1. Выделение феромона из воздуха.

Сбор феромона из воздуха над живыми насекомыми, основанный на свойстве летучести всех феромонов, представляется наиболее эффективным методом, так как позволяет сохранить природное соотношение компонентов феромонной смеси и избежать внесения в экстракт тяжелолетучих примесей, а значит и не требует дополнительной очистки. Несмотря на большие требования к очистке воздуха и адсорбентов, этот метод становится сейчас наиболее популярным, медленно отодвигая на второе место экстракцию феромонных желез растворителем.

Суть метода заключается в пропускании воздуха над живыми насекомыми, находящимися в позе зова (испускающими феромон), с последующим сбором его в ловушку и десорбцией компонентов феромона для дальнейшей идентификации. На достижение оптимальных результатов этим методом влияют скорость воздуха, форма и размеры камеры для насекомых, выбор адсорбента и продолжительность сбора [2]. Воздух, используемый для сбора, предварительно очищают, пропуская его через молекулярные сита [3] или через адсорбент, например порапак О [3] или активированный уголь [4]. Скорость воздуха должна быть достаточной для отрыва молекул феромона от поверхности железы и предотвращения адсорбции компонентов феромона телом бабочки и стенками камеры, но в то же время не дающей проскока через адсорбент [5]. При выборе скорости необходимо учитывать и природу ожидаемых компонентов феромона, и

поведение насекомого, и выбранный адсорбент, поэтому этот вопрос решается каждым исследователем заново, например для выделения феромона огневки Achroia Innotata obscurevittella [4] через коническую колбу с насекомыми объемом 500 мл пропускали очищенный воздух со скоростью 200 мл/мин., а сбор феромона рисовой огневки Corcyra cephaloníca [6] проводили, помещая 20-30 самок в колбу объемом Зли обдувая ее воздухом со скоростью 1 л/мин. Проскок феромона может также зависеть и от продолжительности сбора, что в свою очередь влияет на определение соотношения компонентов феромона.

Для сбора воздуха, содержащего летучие компоненты феромона, используют полимеры: порапак Q - сополимер этилвинил- и дивинилбензолов и тенакс - полимер 2,6-фенил-п-фениленоксида [7, 8], древесный уголь [9], стеклянные фильтры [10], ловушки полые или заполненные стеклянными шариками, подвергаемые охлаждению [11]. Адсорбенты тщательно очищают: моют пентаном, метанолом и сушат 24 ч в токе азота при 150° [12] или прокаливают в стеклянной колонке хроматографа 24 ч при 200° в токе азота, затем обрабатывают пентаном или гексаном в аппарате Сокслета 24 ч, сушат в потоке азота 4 ч при 100° [2]. Десорбцию, как правило, проводят подходящим растворителем: пентаном, гексаном, метанолом, хлористым метиленом. Эффективность сбора на порапак Q на 10 - 20% ниже сбора в ловушку, охлаждаемую жидким азотом. Однако наибольшей популярностью для сбора феромонов пользуется порапак Q, преимуществом которого является возможность длительного сбора выделяемых насекомыми веществ, даже несмотря на недостатки - трудоемкость очистки и многочасовая экстракция летучих веществ. Так, летучие 30 самок рисовой огневки С. cephaloníca собирали на порапак Q (2,5 г) непрерывно при естественных условиях в течение 1 месяца, дважды в неделю экстрагируя адсорбент 25 мл хлористого метилена и заменяя умерших бабочек новыми [6]. Пригодным адсорбентом является и активированный уголь, обладающий большой адсорбционной емкостью, что позволяет работать с малыми объемами, а значит и десорбцию проводить 50 - 100 мкл растворителя. Так, 3 - 5 мг угля между металлическими сетками 325 меш в виде дисков (d =2,7 мм, h =0,7 мм, или d =3,6 мм, h =1,5 мм) оказалось достаточно, чтобы регенерировать 57 - 86% из

0,5 мкг веществ, являющихся компонентами феромонов различных насекомых, внесенных в ток воздуха (2,5 л/мин.) на металлической пластинке [9].

Количество феромона, которое удается собрать, зависит и от его содержания в самке и от выбранной техники сбора. Например, при пропускании воздуха через камеру (30 см х 6,5 см) с 50 самками огневки СЬгузо1еисЫа &рШга, сборе летучих веществ на порапак О и их вымывании хлористым метиленом, удается извлечь только 0,5 нг/особь за 1200ч [3].

Метод, предложенный Бейкером [13], представляет модификацию сбора летучих компонентов феромона и заключается в сборе феромона на стеклянную вату (250 мг) из потока очищенного углем и профильтрованного через стекловату азота, обдувающего выпяченный в отверстие стеклянной трубки яйцеклад. Применение этого метода выделения летучих при изучении щетинистой совки ¡-аап/роНа гетдега позволило найти оба компонента феромона этого вредителя - гЭТЭА и г9Е12ТР0А [14]. Таким образом, метод обдува выпяченной (или отсеченной) железы прост в исполнении, пригоден для двигающихся (затрудняющих эксперимент) во время выделения феромона насекомых не требует трудоемкой работы по очистке адсорбента, не дает потерь из-за адсорбции феромона телом насекомого и разложения лабильных компонентов феромона, однако он не пригоден при анализе испарений больших количеств веществ из-за проскока. Так, при загрузке 9 мкг со стекловаты смыто только 11% легколетучего деканола [13].

1.1.2. Выделение феромона из экстракта.

Метод экстракции заключается в вымачивании в органическом растворителе целого насекомого или отдельных его частей. При этом можно извлечь гораздо большее количество феромона, чем при сборе его из воздуха, но вместе с тем и большее количество балластных веществ, от которых приходится избавляться разными методами очистки: вымораживанием, перегонкой, перегонкой с паром, разделением экстракта на кислую, щелочную и нейтральную фракции, �