Полиэлектролитные комплексы хитозана с сополимерами малеиновой кислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Краюхина, Мария Александровна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2010 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.06 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Полиэлектролитные комплексы хитозана с сополимерами малеиновой кислоты»
 
Автореферат диссертации на тему "Полиэлектролитные комплексы хитозана с сополимерами малеиновой кислоты"

004667867

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ им. А.Н.НЕСМЕЯНОВА РАН

Краюхина Мария Александровна

На правах рукописи

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ХИТОЗАНА С СОПОЛИМЕРАМИ МАЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения 03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2010

004607867

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Самойлова Надежда Аркадьевна

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Варламов Валерий Петрович Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

доктор химических наук, профессор Коршак Юрий Васильевич

РХТУ им. Д.И.Менделеева, г. Москва

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.ВЛомоносова

Защита диссертации состоится «22» апреля 2010 г. в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.250.02 в Институте элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЭОС РАН

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д;00.250.02 кандидат химических наук

А.Ю. Рабкина

Актуальность темы. Интерполиэлектролитные комплексы (ПЭК), образуемые при взаимодействии противоположно заряженных полиэлектролитов, вызывают большой интерес исследователей, который обусловлен обширной областью их научного и практического применения. В связи с этим в последние годы успешно развиваются работы, касающиеся исследований закономерностей процессов, приводящих к образованию ПЭК, строения и свойств получаемых ПЭК, а также возможности моделирования требуемых физико-химических, биомедицинских и технологических характеристик ПЭК.

К настоящему времени, помимо большой группы ПЭК на основе полимеров синтетического происхождения, описаны ПЭК биополимеров - белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, а также смешанные ПЭК с участием как синтетических полиэлектролитов, так и полиэлектролитов природного происхождения. Особое внимание привлекают ПЭК с участием биополимеров, в частности, хитозана. Хитозан - биосовместимый, биодеградируемый, низкотоксичный полиаминосаха-рид, получаемый в промышленных масштабах дезацетилированием природного биополимера хитина. Молекула хитозана содержит в каждом моносахаридном звене функциональные группы, которые могут участвовать в образовании как ковалентных связей, так и нековалентных - водородных и ионных связей. Наличие ионогенных групп позволяет ему легко вступать в реакции ком-плексообразования с противоположно заряженными полиэлектролитами. ПЭК на основе хитозана применяются в научных исследованиях, в пищевой и нефтехимической промышленности, в биотехнологии и медицине.

Несмотря на широкий спектр изученных ПЭК хитозана, сведения об исследовании ПЭК хитозана с синтетическими полианионами - сополимерами дикарбоновой (малеиновой) кислоты, не были обнаружены. Сополимеры малеиновой кислоты, характеризующиеся регулярным строением макромолекулярной цепи, применяются в различных отраслях промышленности и биотехнологии. Такие сополимеры (в форме сополимеров малеинового ангидрида) коммерчески доступны или могут быть синтезированы в условиях радикальной сополимеризации.

Представлялось интересным выстроить модель стехиометрического ПЭК с учетом особенностей строения макромолекул полисахарида и сополимеров дикарбоновой кислоты. Влияние изменения природы сомономера малеиновой кислоты в полианионе, а также условий комплексооб-разования должны в значительной степени отражаться на составе и свойствах получаемых ПЭК. Кроме того, часть функциональных групп полимеров, не вовлеченных в интерполиэлектролитное взаимодействие, может быть легко модифицирована введением различных лигандов. Все это в совокупности должно расширить сферу возможного практического применения ПЭК.

Таким образом, получение новых ПЭК хитозана и исследование их свойств является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы явилось изучение условий комплексообразования, свойств и возможностей практического применения в биотехнологии и

медицине ПЭК хитозана с сополимерами дикарбоновой кислоты, отличающимися регулярной структурой макромолекулярной цепи: сополимерами малеиновой кислоты с Н-винилпирролидоном, стиролом или этиленом.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1) исследовать физико-химические закономерности образования ПЭК;

2) оценить влияние различных факторов на комплексообразование;

3) получить различные по составу ПЭК хитозана с выбранными анионными полимерами и изучить свойства полученных комплексных соединений;

4) исследовать возможность синтеза на основе ПЭК сшитых матриц, пригодных для получения аффинных сорбентов;

5) для контактирующих с кровью инородных поверхностей синтезировать биоспецифические покрытия на основе ПЭК, обладающие свойствами биосовместимости и тромборезистентности;

6) подтвердить эффективность полученных биоспецифических покрытий.

Научная новнзна. В настоящей работе впервые рассмотрено получение новых ПЭК хитозана с анионными полимерами, несущими остатки бифункциональной кислоты - сополимерами малеиновой кислоты с Л'-винилпирролидоном, стиролом или этиленом. Исследованы процесс образования ПЭК и влияние различных факторов на полиэлектролитное взаимодействие, условия получения ПЭК различного состава и свойств, а также показана перспективность использования ПЭК с целью синтеза на их основе сорбентов для биоспецифической хроматографии и биосовместимых эффективных тромборезистентных покрытий для контактирующих с кровью изделий медицинского назначения.

На основании данных расчета расстояний между реагирующими группами, с учетом кон-формационных особенностей взаимодействующих полимеров представлена структура стехиомет-рических интерполиэлектролитных комплексов. Выявлены условия формирования ПЭК различного состава и свойств в зависимости от природы сомономера малеиновой кислоты и условий проведения интерполиэлектролитного взаимодействия при изменении степеней ионизации реагирующих групп, концентрации и соотношения полиэлектролитов.

В отсутствие органических растворителей и конденсирующих средств получен водонабу-хающий сшитый хитин - эффективный аффинный сорбент для выделения применяемого в биохимии и медицине лектина зародышей пшеницы. Разработан оригинальный способ получения аффинного сорбента путем ковалентной сшивки хитозана сополимером дикарбоновой кислоты в ПЭК с последующим избирательным ацетилированием аминогрупп хитозана.

Были получены новые гемосовместимые аутоселективные гидрофильные биоспецифические тромборезистентные полиэлектролитные покрытия для медицинских материалов, контактирующих с кровью, базирующиеся на использовании предложенных поликомплексов. Наружный слой покрытий содержал специфический в отношении эндогенного зимогена крови - плазминоге-на, лиганд, что позволило осуществить запуск механизма тромболизиса на модифицированной по-

верхности с помощью присущих организму, а не внесенных извне тромболитических факторов. В качестве альтернативы гидрофилизации (предокисления) гидрофобных модифицируемых поверхностей для улучшения адгезии полимерных покрытий предложено в состав полиэлектролитов вводить гидрофобные "якорные" группы.

Практическая значимость работы. Получен водонабухающий сферически гранулированный сшитый хитин на основе исследованных ПЭК, который предложено использовать в качестве аффинного сорбента лектина зародышей пшеницы. Специфическая сорбционная емкость таких сорбентов превышала в 6-7 раз емкость известных сорбентов на основе хитозана. При этом существенным преимуществом данных сорбентов на основе ПЭК является чрезвычайная простота их получения, которая не требует использования органических растворителей и конденсирующих агентов, а также возможность их многократного применения после регенерации. Предложенные ПЭК могут быть использованы для аффинной хроматографии разнообразных биологически активных соединений, благодаря наличию в составе ПЭК остатков малеиновой кислоты, которые легко переводятся в реакционноспособные ангидридные группы, в дальнейшем могущие реагировать (в мягких условиях) с амино- и оксисодержащими лигандами. Кроме того, на основе ПЭК возможно получение ионообменных смол, разнообразных соединений включения, как то депонированных лекарственных средств, клеточных культур и т.п.

Разработанные полиэлектролитные гемосовместимые устойчивые в физиологических средах покрытия с биоспецифическими свойствами показали возможность повышения гидрофильно-сти полиолефиновых материалов и придания им тромборезистентных свойств. Эксперименты в условиях in vitro и ex vivo, проведенные на химическом факультете МГУ им. М.В.Ломоносова и в НЦССХ им. А.Н.Бакулева показали способность предлагаемых покрытий на основе ПЭК аффинно сорбировать плазминоген, а также достоверно снижать степень тромбогенности модифицированных поверхностей.

Проведенные исследования позволяют получать ПЭК заданных свойств и требуемого состава, варьируя условия комплексообразования, а также используя предмодификацию полиэлектролитов.

Апробация работы. Основные результаты и отдельные положения работы представлены на следующих конференциях: VIII Всеросс. симпозиуме по жидкостной хроматографии и электрофорезу (Москва, 2001); VI Международной конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 2001); 7 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2001); 1 -ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002); 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003); 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS 2003 "100 years of chromatography" (Moscow, 2003); 7-ой Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2003); Седьмой Международной конференции «Со-

временные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург-Репино, 2003); III конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2004); International Conference Dedicated to 50lh Anniversary of A.N.Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds Russian Academy of Sciences "Modern trends in organoelement and polymer chemistry" (Moscow, 2004); 1-ой Международной научно-практической конференции "Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике ("Р&М-2005")" (Санкт-Петербург, 2005); X Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2006); VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Казань, 2006), IX Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Ставрополь, 2008), Втором международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech'09» (Москва, 2009).

Работа получила премию П.П. Шорыгина в 2005 г., докладывалась на 50-ом конкурсе научно-исследовательских работ ИНЭОС РАН в 2005 г. (III премия), молодежном конкурсе ИНЭОС РАН (2006 г.) и на Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech'09» в 2009 г. (I премия).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, из которых 11 статей и 17 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части описания методов исследования и использованных материалов, изложения и обсуждения результатов исследования, выводов и списка литературы, включающего 190 ссылок. Работа изложена на 153 страницах, содержит 35 рисунков и 15 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы и сформулированы цели и задачи исследования.

В первой главе (Литературный обзор) систематизированы литературные данные по формированию полиэлектролитных комплексов применительно к полимерному катиону - хитозану, по-лиаминосахариду природного происхождения. Рассмотрены полиэлектролитные комплексы хитозана с биополиэлектролитами, модифицированными биогенными полиэлектролитами, а также синтетическими полианионами. Обсуждены основные аспекты медицинского и биотехнологического использования поликомплексов хитозана.

Во второй главе (Экспериментальная часть) определены объекты и методы исследования. Объектами исследования являются: хитозан (450 kDa, степень дезацетшшрования 76.6%), амфи-фильный хитозан - (Л^-(2(3)-додец-2-енил)сукциноилхитозан, сополимеры малеиновой кислоты с N-вишшшрролидоном (ВПМК, 40 kDa), стиролом (СМК, 50 kDa), этиленом (ЭМК, 25 kDa), модифицированные производные ВПМК - моноамиды (п-нитроаншшд, а- и Е-лизинамиды), а также

полиэлектролитные комплексы, аффинные сорбенты и покрытия на основе хитозана и сополимеров малеиновой кислоты.

В работе применяли следующие методы исследования: хроматография (ТСХ и жидкостная хроматография), UV-VIS спектрофотометрия, ЯМР, атомная силовая микроскопия (АСМ), ИК-Фурье спектроскопия, ИК-спектроскопия многократного нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО), рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС), метод контактного угла, а также методы оценки in vitro и ex vivo гемосовместимости, биоспецифических и тромборези-стентных свойств покрытий, полученных на основе изучаемых веществ.

Результаты и их обсуждение

Исследование процесса комплексообразования

Как известно, природный полиаминосахарид хитозан (рК 6.5) не растворяется в нейтральных и щелочных средах, поэтому образование полиэлектролитных комплексов (ПЭК) на его основе целесообразно исследовать при рН<6. Очевидно, что в данных условиях процесс комплексообразования представляет собой нейтрализацию части заряда полианиона (слабой поликислоты -сополимера ВПМК, СМК или ЭМК) поликатионом (слабым поли основанием - ХЗ) й протекает согласно следующей схеме (рис. 1):

coa соон I I —сн—сн—R—

сн;

¿о'

ноос соо

ноос соо

-СН—СН—R—

--СН—СН—R-

R= -CHj—CH-

—сн-

сн-

-CHj-СН;

Рисунок 1. Схема образования полиэлектролитных комплексов хитозана с сополимерами малеиновой кислоты

На первом этапе данной работы была выявлена роль стерического соответствия реагирующих групп макромолекул для «идеальных» полимерных цепей полиэлектролитов с учетом межатомных расстояний, считая изгиб цепи, аналогичным таковому в полиэтилене. Согласно расчету, макромолекулы реагирующих полиэлектролитов могут связываться в стехиометрический комплекс. При этом, учитывая пространственную структуру молекул взаимодействующих полимеров, каждая вторая протонированная аминогруппа хитозана может связываться с ионизированной карбоксильной группой каждого второго звена сополимера малеиновой кислоты.

Исходя из расчета степеней ионизаций функциональных групп полиэлектролитов, в интервале рН 4-6, где аминогруппы хитозана практически полностью протонированы, во взаимодействии может участвовать только одна карбоксильная группа остатка малеиновой кислоты (с меньшим значением рК), степень ионизации которой при данных значениях рН составляет 50-90%, а вторая карбоксильная группа практически не ионизирована.

Закономерности комплексообразования в системе ХЗ—сополимер малеиновой кислоты, влияние условий среды (рН, ионной силы, температуры), природы полиэлектролитов на характер комплексообразования в данной работе исследовали при помощи различных физико-химических методов. В условиях низких концентраций реагирующих полиэлекгролитов (10^ М) особенности связывания жесткоцепного поликатиона с гибкоцепными поликислотами изучались спектрофото-метрически методом вытеснения хитозаном низкомолекулярного катионного красителя (метиле-нового голубого, МГ) из его комплексов с сополимерами (СП).

Полученные экспериментальные данные по изучению процесса комплексообразования ХЗ с СП были представлены в наиболее часто используемых в научной практике графических интерпретациях: в координатах Скэтчарда <р/Са = /(ср) и Хилла Ы ^ = /[1 $(С„)] (где <р - доля

связанных звеньев ХЗ сополимерами малеиновой кислоты (степень насыщения), С„ - концентрация ХЗ). При этом было сделано допущение, что процесс комплексообразования между указанными парами полиэлектролитов протекает по механизму моноядерной ассоциации. Изотермы насыщения, полученные в координатах Скэтчарда, имели «сигмоидальную» форму с наличием восходящей ветви в области низких концентраций связанного лиганда (хитозана), характерную для кооперативного связывания, и косвенно указывали на сложный характер взаимодействия полимеров, имеющих, по-видимому, несколько сайтов связывания, различающихся по типу взаимодействия. Представление процессов связывания ХЗ с сополимерами малеиновой кислоты в логарифмических координатах (рис. 2) уравнения Хилла ( 1я = л ■ ) + ^(ЛГ ) ) позволило оценить

I1 -9)

кооперативность взаимодействия полимеров, а также рассчитать величины кажущихся констант связывания (Ка, табл. 1).

• впмк-хз (а) 1д(<?/1-<р> (б)

Рисунок 2. Изотермы связывания в координатах уравнения Хилла для системы хитозан-сополимер малеиновой кислоты (при рН 5 и температурах 20°С (а) и 70°С (б))

Как можно видеть из данных табл. 1 значение коэффициента кооперативности (коэффициента Хилла, п) для всех ПЭК было заметно больше единицы, что свидетельствовало о положительной кооперативности процесса комплексообразования.

Таблица 1. Параметры связывания хитозана с синтетическими полианионами

ПЭК Коэффициент Хилла, п Константа связывания, /¡VI О"4, М"1

20°С 70°С 20°С 70°С

ВПМК-ХЗ 2.8 1.6 2.77 2.13

ЭМК-ХЗ 2.1 2.5 0.85 0.98

смк-хз 1.9 1.4 1.03 1.10

ВПМК-ГА 1.1 - 0.03 -

Для выявления специфики полимер-полимерного взаимодействия был поставлен модельный опыт, в котором в качестве противоиона к синтетической поликислоте (ВПМК) использовали углевод - глюкозамин (ГА), являющийся мономерной единицей хитозана. В данном случае параметр кооперативности, описывающий процесс комплексообразования, имел значение, близкое к единице (п=1.1), что указывало на отсутствие кооперативности при связывании низкомолекулярного углевода. Кроме того, величина кажущейся константы связывания комплекса ВПМК-ГА, по сравнению с ПЭК ВПМК-ХЗ, снизилась почти на два порядка (табл. 1).

Очевидно, что конформация полимеров в водных растворах, определяемая зарядом и гидрофильно-гидрофобным балансом макромолекул, оказывает влияние на стерическую доступность центров связывания сополимеров с молекулами хитозана. В ряду сополимеров ВПМК, ЭМК, СМК гидрофобностъ макромолекул возрастает за счет включения в цепь более гидрофобного звена. При связывании сополимера ВПМК с полиаминосахаридом возможно дополнительное участие амид-ных групп в образовании сложной сетки водородных связей при внутри- и межмолекулярных контактах. Учитывая перечисленные выше факты, можно объяснить более высокие значения коэффи-

циента кооперативное™ (2.8) и константы связывания (2.7710 М") при комплексообразовании ХЗ с ВПМК при 20°С, по сравнению с остальными сополимерами, а также изменение этих параметров после термической обработки (70°С), исключившей процессы связывания полимеров с участием иных, помимо кулоновских, взаимодействий (табл. 1).

На характере взаимодействия полиэлектролитов может отражаться изменение ионной силы и рН. В связи с этим определенный интерес представляет исследование образования ПЭК в водных растворах низкомолекулярных солей при различных рН и хаотропного агента - мочевины.

В буферных системах (0.05 М) при значениях рН 4-6 смешение растворов сополимеров с растворами хитозана при концентрациях (Ю-3 М), на порядок превышающих их значения в эксперименте с красителем, сопровождалось помутнением системы с последующим разделением на две фазы: концентрированную (образование нерастворимого комплекса) и разбавленную.

0,6 0,5 0,4 X 0,3 0,2 0,1 0,0

2 2,5 3 3,5 р, моль/моль

(в)

-рн=4 -рн=5 -рн=6

1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 р, моль/моль

Рисунок 3. Зависимость мутности (т) систем от мольного соотношения звеньев реагирукши компонентов (р) (СП/ХЗ) при различных знач ниях рН в условиях турбидиметрического ти рования растворами хитозана растворов соп лимеров малеиновой кислоты с: (я) - 1 винилпирролидоном, (б) - этиленом, (в) - стир лом (1=20°С, концентрация полимеров = 10'3М)

1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 р, моль/моль

Как можно видеть на рис. 3, для комплексов ВПМК-ХЗ и ЭМК-ХЗ величина мутности в зависимости от мольного соотношения (р) звеньев, содержащих малеиновую кислоту, к остаткам глюкозамина имела экстремальный характер и зависела от природы полианиона. Максимальное значение мутности (максимум образования нерастворимого комплекса) наблюдалось при мольных соотношениях: р=0.8-И,0 (моль СП/моль ХЗ) - для ПЭК сополимера Л'-винилпирролидона и малеиновой кислоты с хитозаном (ВПМК-ХЗ); р=0.5н-0.7 - для ПЭК сополимера этилена и малеино-

вой кислоты с хитозаном (ЭМК-ХЗ); р<0.25 - для ПЭК сополимера стирола и малеиновой кислоты с хитозаном (СМК-ХЗ), и зависело от значений рН. С уменьшением рН, вследствие протони-рования карбоксильных групп сополимеров и гидрофобизации их макромолекул, степень электростатического связывания с ХЗ снижалась, а величина мутности незначительно возрастала в результате образования нерастворимых комплексов за счет действия некулоновских сил и ассоциации макромолекул СП, что особенно наглядно прослеживалось для поликомплексов неэквимоляр-ного состава с избыточным содержанием поликислоты.

Положение экстремума на кривых зависимости мутности от мольного соотношения звеньев также зависело от температуры растворов реагирующих полиэлектролитов (рис. 4).

р р

Рисунок 4. Зависимость относительной мутности (0/0т„) системы от мольного соотношения полимеров (р) при 20 (/), 70°С (2) и после остывания прогретых образцов (5) в условиях титрования (рН 4) раствором хитозана раствора сополимера малеиновой кислоты с А'-винилпирролидоном (а) и этиленом (б)

Как можно видеть на рис. 4 для более гидрофильного сополимера ВПМК взаимодействие с ХЗ при 70°С приводило к смещению экстремума в область мольных соотношений р < 1. Это обстоятельство свидетельствовало о разрыве слабых межмолекулярных связей в СП вследствие термического воздействия. Кроме того, положение максимума мутности на кривой титрования не изменилось после охлаждения растворов полимеров и их выдерживания в течение недели при 20° С (рис. 4 а, кривые 2 и 3). Явление гистерезиса (рис. 4 а, кривая 3) после снятия температурного воздействия в случае комплексообразования с участием гидрофильных полимеров согласуется с общепринятыми представлениями о влиянии гидрофильно-гидрофобного баланса макромолекул полимеров на релаксацию системы - в водных растворах более гидрофобные полимеры быстрее возвращаются к исходному конформационному состоянию макромолекулярных клубков. Это наглядно прослеживалось при комплексообразовании ХЗ с сополимером ЭМК: скорость релаксации данной системы после термического воздействия значительно превышала таковую для комплекса сополимера ВПМК с хитозаном. На комплекс сополимера стирола (наиболее гидрофобного сомоно-мера малеиновой кислоты) с ХЗ температура не оказывала видимого влияния. Таким образом,

увеличение температуры выше 65°С в большей степени влияло на состав и свойства ПЭК хитозана с наиболее гидрофильным из сополимеров малеиновой кислоты - ВПМК.

Влияние гидрофобизации макромолекулы (т.е. увеличение вклада сил некулоновской природы во взаимодействие) также можно было проследить при связывании макромолекул сополимера ВПМК с более гидрофобными макромолекулами амфифильного хитозана (АХЗ) с различной степенью гидрофобного замещения аминогрупп на алкиламидные остатки. С увеличением мольной доли гидрофобных групп и соответствующим уменьшением доли катионных групп в макромолекуле АХЗ максимум преципитации (при рН 4) смещался в сторону образования нерастворимых ПЭК с большим содержанием полисахарида.

Как известно, степень диссоциации поликислот уменьшается по мере снижения рН. При этом рост ионной силы раствора, также как и снижение величины рН, приводит к уменьшению эффективного заряда макромолекулярной цепи, уменьшению ее гидрофильности и, как следствие, к снижению электростатического связывания поликислоты с полиоснованием. Было отмечено, что в водных бессолевых системах, а также в присутствии в системе низкомолекулярных солей и хао-тропных агентов (мочевины), при концентрациях полиэлектролитов порядка 10"3М и выше при исходных мольных соотношениях СП к ХЗ от 0.25 до 10.0 моль/моль в системе происходило фазовое расслоение и образование ПЭК разного состава.

Таким образом, полученные нами данные позволяют утверждать, что природа взаимодействующих соединений определяет образование устойчивых нерастворимых интерполимерных комплексов за счет действия, в основном, кулоновских сил связывания, а также существенный вклад в образование комплексов вносят силы некулоновской природы. Взаимодействие в исследуемой системе полиэлектролитов носит кооперативный характер и зависит от степени ионизации и строения макромолекул. Эти параметры определяют конформацию и гибкость полимерной цепи, степень гидрофобности (гидрофильно-гидрофобный баланс, который может измениться под действием внешних условий - рН, температуры, состава растворителя) и, как следствие, доступность связывающих центров на полимерной матрице.

Получение и характеристика нерастворимых ПЭК

На основе данных турбидиметрии были выявлены условия образования нерастворимых полиэлектролитных комплексов (НПЭК), которые в дальнейшем предполагалось использовать для получения сорбентов различного назначения. При взаимодействии противоположно заряженных полимеров при рН 4-5, концентрациях порядка 10"2 - 10"3 М и соотношениях полимеров р 0.5+5.0 (мольСП/мольХЗ) выделяли НПЭК с выходом до 70-90% (табл. 2). Максимальный выход НПЭК наблюдали в случае взаимодействия хитозана с сополимером ВПМК при р=1. Наличие образовавшихся ионных связей в выделенных НПЭК было подтверждено данными ИК-спектроскопии: в случае ПЭК появляются новые полосы поглощения - в области 1520-1507 см"1 (симметричные деформационные колебания ЫН+з)_ сильные полосы поглощения при 1567-1551 см"1 (симметрич-

ные валентные колебания СОСГ) и полоса поглощения при 1408-1392 см'1 (асимметричные валентные колебания карбоксилат-аниона).

Таблица 2. Выход и состав НПЭК (г) в зависимости от исходного молярного соотношения полиэлектролитов (р), начальных концентраций и природы сополимеров (при 20°С)

Исходная концентрация раствора ХЗ,М р=[СП]/[ХЗ], моль/моль Выход НПЭК, % мае. Содержание ХЗ в НПЭК (z), % мол.

ВПМК-ХЗ СМК-ХЗ ЭМК-ХЗ ВПМК-ХЗ СМК-ХЗ ЭМК-ХЗ

I 0.1 0.5 1 5 53.6 (63.5)* 74.1 (98.9)* 12.5 (68.9)* 37.7 40.7 12.6 45.3 66.6 14.8 76.9 (87.0)* 73.3 (59.2)* 81.1 (44.1)' 53.0 86.4 87.4 68.1 58.3 78.5

0.5 59.7 70.1 59.9 83.3 61.0 60.0

II 0.01 1 88.8 91.0 92.0 64.0 48.7 55.5

5 30.1 42.9 30.9 70.5 42.2 64.3

- при 70 С

Состав выделенных нерастворимых ПЭК серии I отличался большим содержанием хитозана в комплексе во всем диапазоне мольных соотношений исходных компонентов (табл. 2). Снижение концентрации исходных полимеров на порядок (табл. 2, серия II) приводило к увеличению выхода НПЭК (вследствие снижения вязкости растворов полиэлектролитов), при этом возрастала доля полианионного сополимера в выделенном поликомплексе при р > 1, а при р < 1 - увеличивалась доля хитозана.

С целью изучения влияния температуры на выход и состав нерастворимых ПЭК был поставлен эксперимент, в котором получали нерастворимый поликомплекс на основе ХЗ и сополимера ВПМК при 70°С (табл. 2, серия I). Исходя из полученных данных, можно сказать, что повышение температуры выше 65°, вызывающее дезинтеграцию макромолекулярных ассоциатов и информационные изменения гибкоцепных молекул (в данном случае сополимеров), приводило к росту выхода нерастворимых ПЭК и изменению их состава в сторону увеличения содержания поликислоты для р > 1, а для р < 1 наблюдали повышение содержания полисахарида в поликомплексе (табл. 2).

Таким образом, в условиях рН-статирования на величину выхода НПЭК и их состав оказывали влияние соотношение макромолекулярных компонентов системы, исходная концентрация и температура растворов полимеров. Снижение концентрации исходных полимеров на порядок (серия II), а также повышение температуры смешения приводили к увеличению выхода и изменению состава НПЭК.

Сорбенты для ионообменной и аффинной хроматографии

Для получения сорбентов-анионитов нерастворимые ПЭК с нескомпенсированным положительным зарядом (обогащенные хитозаном), переводили в ковалентно сшитые "жестким" высушиванием в вакууме в присутствии водоотнимающего агента (Р2О5). При этом в ИК-спектрах воз-

растала интенсивность амидных полос 1669-1639 (амид I) и 1570-1557 (амид II). Сферически гранулированные аниониты, содержащие от 58.3 до 86.4 %мол. хитозана обладали обменной емкостью 3.1-4.2 мгэкв/г, набухали в водных средах в широком диапазоне рН.

С целью получения аффинных сорбентов для выделения и очистки лектина зародышей пшеницы (Wheat Germ Agglutinin, WGA), специфичного к олигомерам Л'-ацетил-О-глюкозамина (D-GlcNAc), использовали нестехиометрические обогащенные хитозаном НПЭК, представляющие собой кековалентно сшитый цепями сополимера хитозан (ионно сшитый хитозан, ИСХ). Полученный ИСХ подвергали избирательному Л'-ацетилированию (рис. 5) с последующим «жестким» высушиванием. В результате (по данным ИК-спектроскопии) происходило образование амидных (в том числе, ацетамидных) связей, и ионная сшивка переходила в ковалентную. Таким образом, в результате несложной модификации, из НПЭК получали ковалентно сшитый хитин (КСХТ).

CH2OH NHj CH2OH NHj

NH^OOC

-¿Н— CH(COOH)— R-

СН3

to

R=

исх

1.1

2 (СН3С0)20

Cr

СН3

I™

— сн,— сн-

-СН2—CHj—

i„-

:hjOH

■СН(СООН)—R-

¿0 I

СНз

H2OH

Рисунок 5. Схема получения аффинного сорбента \\Ч}А - ковалентно сшитого хитина (КСХТ) из ионно сшитого хитозана (ИСХ)

На основе ИСХ (НПЭК) и КСХТ была получена, в частности, сферически гранулированная форма сорбента с размером частиц 0.03-0.10 мм. Полученные сорбенты исследовали на специфическую сорбцию \\Ч}А. Как можно видеть из данных табл. 3, емкость по УУвА в случае ИСХ ВПМК-ХЗ возрастала в 2.5 раза по сравнению с нативным хитозаном, а в случае КСХТ - в 4-7 раз. При этом значения емкости сорбентов по остаткам С-ИсКАс в КСХТ были примерно одного порядка. Такие сорбенты, в отличие от нативных форм хитозана и хитина, набухают в водных средах при нейтральных рН, устойчивы в органических растворителях и в водной среде в широком диапазоне рН.

Существенным преимуществом данных сорбентов является тот факт, что технология их получения чрезвычайно проста и не требует использования конденсирующих средств и органических растворителей.

Таблица 3. Сорбция WGA с помощью ПЭК хитозана и сшитого хитина

* - 0.1 M фосфатный буфер, рН=7.0, 0.2М NaCl; ** - сорбция WGA из "сырого" WGA

Еще один интересный аспект использования ПЭК - создание на их основе гемосовместимых аффинных покрытий, предназначенных для модификации контактирующих с кровью медицинских изделий с целью придания им повышенных тромборезистентных свойств. Для этого нами были разработаны аутоселективные тромборезистентные аффинные покрытия на основе ПЭК, где в качестве полианиона выступал модифицированный сополимер малеиновой кислоты, несущий связанный по а-аминогруппе ¿-лизин (остаток L-лизина со свободной е -аминогруппой, E-Lys) -специфический лиганд к эндогенному профибринолитику крови плазминогену.

Принцип действия аффинного покрытия отображен на следующей схеме (рис. 6): плазминоген крови аффинно связывается со специфическим лигандом, который ковалентно присоединен к носителю, затем, под действием циркулирующих в крови эндогенных активаторов плазмино-гена тканевого или урокиназного типа, превращается в плазмин - фермент, специфически лизирующий фибрин сгустка и, тем самым, обеспечивающий тромборезистент-ность поверхности.

Для синтеза аффинных сорбентов плазминогена в качестве матрицы использовали нетоксичный сополимер yV-винилпирролидона с малеиновым ангидридом (ВПМА). Введение аффинного лиганда осуществляли в 2-х вариантах (рис. 7). Первый (I серия) - синтез с незащищенным лизином в мягких условиях в отсутствии токсических активаторов в водных средах в условиях, при которых происходит преимущественная посадка лизина через а-аминогруппу. В результате такой модификации получали аффинный полимер АП-I, который содержал в своем составе как остатки E-Lys (специфического лиганда), так и остатки е -аминосвязанного L-лизина (остатки L-лизина со свободной а -аминогруппой, a-Lys). С целью получения аффинного полимера АП-И, содержащего

Сорбент Набухаемость*, мл/г Содержание £>-GlcNAc в сорбенте, ммоль/г Сорбция WGA, мг/г

ХЗ 1 1.4 0.6

ВПМК-ХЗ 10 1.0 1.5

ВПМК-ХТ 13 3.3 2.2

ВПМК-ХТ^,ан 14 3.3 3.4

впмк-хтфа„ 14 3.3 4.1**

СМК-ХТ 22 3.9 2.3

ЭМК-ХТ 14 2.6 3.5

Рисунок 6. Модель взаимодействия плазминогена со специфическим лигандом на полимерной матрице-носителе

только искомые группировки Е-ЬуБ, мы разработали второй вариант синтеза (II серия) с использованием Л^-трет-бутилоксикарбонильной защитной группы.

О

I I

—СН-СН-ОЪ-СН-СН-СН-СНг-СН—......

II II

със с=о о=с с=о

II II

он он он ж

I

сн-соон (СИЛ >1

'•Ж;

АП-1

Рисунок 7. Схема синтеза аффинных сорбентов плазминогена

Структура полученных аффинных полимеров была подтверждена спектрами ЯМР. Данные по исследованию содержания аффинного лиганда, полученные с помощью методов ТСХ и ЯМР, в образцах двух серий опытов представлены в табл. 4.

Таблица 4. Содержание специфического лиганда в образцах аффинных полимеров

Образцы Аффинный Условия синтеза: моль- Количество г-Ьуэ Соотношение

полимер ное отношение реаген- (специфического гг-Ьуа/а-Ьув

тов ВПМА/Ьуз (рН) лиганда), % мол.

1 АП-1 1/1 (7) 16.8±3.8 1.8±0.2

2 АП-И 1/0.1 (7) 4.6±0.3 ■ -

3 АП-Н 1/0.1 (9) 6.9±0.1 -

4 АП-И 1/0.1 (10) 7.0±3.5 -

5 АП-П 1/1.0(9) 11.6±1.3 -

□и

СН-СН-СНг-СН-СН-СН—

I I

о=с с=о

I I он ж

«ЗУ4

13 ж.

I I

о=с с=о

он он

—СН-СН-СН] 0=£ ¿=0 ¿н ¿н

¿Н-СН-СН-СЛг- сн—

¿н

I

ж ¿И-

ооон

(СНЛ ЫН

с-о-схстиз

ь

=0

С^О

—СН-СН-СНг-СН-СН-СН-СНг-СН—

0=£ ¿=0 С^ с=о ¿Н ¿Н ОН М)

АП-Н

(СНЛ с|

Как можно заметить, в образцах II серии достигается меньшая степень замещения полимера остатками лизина со свободной е-аминогруппой, чем в I серии. Кроме того, этот метод оказался существенно более дорогим и трудоемким, хотя и позволял получать искомый аффинный полимер без примеси побочного е-аминосвязанного лизина.

В качестве модельных поверхностей для иммобилизации аффинных покрытий использовали, в основном, полиэтилен и полистирол (ПЭ/ПС), относящиеся к наиболее гидрофобным и сложным для модификации полимерам.

Спадфягашй

липищк птазминагщу

Рисунок 8. Схема формирования аффинного покрытия на полимесных поверхностях

Перед нанесением биоспецифического слоя на поверхность модифицируемого материала (рис. 8) проводили либо окисление подложки для улучшения адгезии гидрофильного биоспецифического полимера к гидрофобной поверхности (ПЭ/ПС), либо предмодификацию с использованием промежуточных слоев амфи-фильного хитозана (АХЗ), содержащего в

своем составе гидрофобный лиганд - додеценилсукциноильный остаток, или полиамфолита белковой природы - сывороточного альбумина человека (ЧСА); ^модифицированный хитозан в качестве альтернативного варианта наносили на предварительно активированную окислением поверхность ПЭ/ПС. Использование промежуточного слоя из ХЗ или ЧСА приводило к более полному закрытию тромбогенной поверхности, прочному сцеплению с подложкой, нейтрализации избыточного отрицательного заряда аффинного полимерного слоя и способствовало экспонированию на поверхности материала биоспецифического лиганда. Такие покрытия из двух слоев полиэлектролитов - бислойные покрытия (БП), а также мультислойные полиэлектролитные покрытия (МП) были устойчивы в физиологических средах и, по данным гематологических тестов, не вызывали гемолиза эритроцитов.

С целью получения данных о строении и свойствах поверхности модифицированных материалов использовались следующие методы исследования: метод измерения углов смачивания, ИК-спектроскопия многократного нарушенного полного внутреннего отражения (ИК-МНПВО), рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС), атомная силовая микроскопия (АСМ).

В спектрах ИК-МНПВО для образцов ПЭ, окисленного (ОПЭ) и ПЭ, модифицированного защитными полимерами, идентифицировали характеристические полосы поглощения использованных полимеров. В качестве примера на рис. 9 представлен обзорный спектр ИК-МНПВО для ПЭ, а также для модифицированного амфифильным хитозаном ПЭ и ПЭ, модифицированного полиэлектролитным комплексом АХЗ с ВПМК.

WavanuiibwY (cm"1)

Рисунок 9. Обзорный спектр МНПВО пленок ПЭ, ^модифицированных и модифицированных полимерами: 1 - ПЭ, 2 - ПЭ-АХЗ, 3 - ПЭ-АХЗ-ВПМК

Полосы поглощения: харгисгерные для Сахаров при 1149см'1 (асимметричные вале!гтные колеб; ния С—О-С), 1087см"1 (скелетные валентные кож бания и симметричные валентные колебания связ С-О гнароксилов); полоса амцда I при 1658 см (валентные колебания С=0), 1587 см'1 (плоски деформационные колебания N-H в аминах), поле са при 1554 см'1 - деформационные колебани N-H амидов и асимметричные валешпые колеб: ния СОСГ, в области v=3400-3200 см"1 - валентные колебания О-Н, N-H, к этой области относят и валеюпые колебания NH,', vc4J= 17]], 1655 см'1 vc-n. N-H, соо*=1580-1550 см'1, vM=1153-1038 см'1; спектре 3 усиливаются интенсивности полос п< глощения амида I и амида 11(1658, 1544 см'1).

Результаты измерений краевых углов смачивания показали возрастание гидрофильности модифицированных поверхностей по сравнению с контрольными (угол смачивания уменьшался с 86 до 57°). Данные РФЭС количественно подтвердили сорбцию полимеров на поверхности пленок. В табл. 5 приведены результаты элементного анализа исследуемых поверхностей, полученные методом РФЭС.

Таблица 5. Атомный состав поверхности пленок ПЭ до и после модификации

Образец Элементный состав поверхности, %

С О N

ГПЭ 86.40 13.54 0

ГПЭ-ВПМК 83.00 15.31 1.69

ГПЭ-ХЗ 66.99 27.68 5.30

гпэ-хз-впмк 77.72 19.72 2.56

ПЭ—ЧСА 87.22 9.6 3.18

ПЭ-ЧСА-ВПМК 80.17 14.06 5.77

Топография поверхности модифицированных пленок была изучена методом АСМ. На рис.10 представлены изображения полиэтиленовых поверхностей, покрытых различными полимерами, использованными в качестве внутренних (промежуточных) слоев - ЧСА (А) и ХЗ (Б), а также изображения БП: ЧСА-ВПМК (В) и ХЗ-ВПМК (Г). Частицы ЧСА имели неправильную, несферическую форму и высоту 20±5 нм, а высота сферических частиц ХЗ (рис. 10Б) составляла в среднем 35±5 нм; в том и другом случае полимеры равномерно покрывали поверхность ПЭ. Лишь на некоторых изображениях удалось обнаружить непокрытые полимером участки поверхности размером 100-200 нм.

Морфология поверхностей БП (рис. 10 (В, Г)) заметно отличалась от таковой для ПЭ, модифицированного только ЧСА или ХЗ. При этом обнаруживали каплевидные структуры размером от 50 до 500 нм (рис. 10В) и от 50 до 200 нм (рис. ЮГ). Существенных отличий в изображениях БП и МП не обнаруживали, в последнем случае не были выявлены непокрытые участки поверхности ПЭ.

Рисунок 10.

Топография поверхности пленок ПЭ, модифицированных ЧСА (А), ХЗ (Б), ЧСА-ВПМК (В), ХЗ-ВПМК (Г) со шкалами соответствия цвета и высоты (справа)

Таким образом, основываясь на данных РФЭС и АСМ, мы установили, что содержание сополимера ВПМК, моделирующего аффинный внешний слой, в покрытиях, представляющих собой полиэлектролитный комплекс (БП или МП), за счет более полной модификации поверхности было более высоким, чем в покрытиях, состоящих только из ВПМК. Кроме того, полученные нанораз-мерные покрытия имели различную морфологию.

Исследование адсорбции плазмнногена на аффинных поверхностях

Полученные БП и МП были исследованы in vitro с использованием раствора плазминогена-стандарта и цитратной донорской плазмы для оценки специфической сорбции плазминогена. Бислойное покрытие (БП). Из приведенных данных (табл. 6) видно, что количество адсорбированного плазминогена зависело от условий нанесения полиэлектролитных слоев. Наибольшая сорбция плазминогена на БП (табл. 6 а) достигалась при формировании аффинного слоя при рН 5, как на промежуточном слое ХЗ, так и на альбумине. Такой результат согласуется с данными по исследованию образования полиэлектролитных комплексов, которые показали, что в диапазоне рН 4-6 степень ионизации полиэлектролитов оптимальна для их взаимодействия, вследствие чего в этой области происходит наиболее полное связывание ионогенных групп макромолекул друг с другом. В данном случае, по-видимому, наружный аффинный слой сорбировался в такой конфор-мации, при которой специфический лиганд стерически более доступен для лизин-связывающих участков молекулы плазминогена, расположенных на кринглах его тяжелой цепи.

Таблица 6. Количество адсорбированного плазминогена на модифицированных поверхностях

Тип проме- Тип наружно-жуточного го специфиче-

Содержание специфического ли-ганда в АП, %мол

Количество Содержание Количество

адсорбиро- специфике- рН сорбции адсорбирован-

ванного на- ского ли- наружного но го плазми-

ружного слоя, ганда, слоя ногена,

мкг/см2 нмоль/см2, пмоль/см2

.) бислойное покрытие

5.0 2.09±0.05

2.0±0.3 1.83±0.55 7.0 1.29±0.03

АП-1 18.4 11.0 0.86±007

0.01 ±0.005 0.09±0.02 5.0 7.0 1.30±0.0б 1.26±0.04

ХЗ 5.0 2.50±0.05

2.0±0.3 0.77±0.23 7.0 1.71±0.08

АП-И 8.3 11.0 0.94±0.07

0.01±0.005 0.04 ±0.02 5.0 7.0 1.39±0.06 1.22М.03

контроль1 0 2.0±0.3 0.01±0.005 0 5.0 0.64±0.05 0.49±0.06

5.0 5.08±0.03

2.0±0.3 1.83±0.55 7.0 5.1Ш.07

АП-1 18.4 11.0 4.06+0.06

0.01±0.005 0.09±0.02 5.0 7.0 6.82±0.05 5.75±0.05

ЧСА 5.0 6.45±0.06

2.0±0.3 0.77±0.23 7.0 5.75±0.08

АП-П 8.3 11.0 5.33+0.03

0.01±0.005 0.04 ±0.02 5.0 7.0 5.98±0.04 4.83±0.05

контроль 1 0 2.0±0.3 0.01±0.005 0 5.0 3.06±0.03 3.49±0.03

б) мультислойное покрытие

АП-1 18.4 7.4±0.7 6.8±0.6 5.0 1.61 ±0.05

без пооме контроль 1 0 7.4±0.7 0 5.0 0.20±0.02

жуточного 8.3 7.4±0.7 2.8±0.3 5.0 11.51+0.08

слоя АП "" 1.2±0.3 0.5±0.1 5.0 0.68М.03

контроль 1 0 7.4±0.7 1.2±0.3 0 5.0 0.20+0.02

АП-1 Y4 18.4 7.4±0.7 6.8±0.6 5.0 11.03+0.06

1.2±0.3 1.1±0.3 5.0 23.5010.08

контроль 1 0 7.4±0.7 1.2±0.3 0 5.0 3.62±0.05

АП-1 ЧСА 18.4 7.4±0.7 6.8±0.6 5.0 11.22+Ю.06

1.2±0.3 1.1±0.3 5.0 27.82Ю.05

контроль 1 0 7.4±0.7 1.2±0.3 0 5.0 4.12±0.03

' - в качестве контрольных использовали поверхности, модифицированные полимером, не содержащим аффинных лигандов (ВПМК)

В случае формирования наружного слоя из АП-Н по сравнению с АП-1, несмотря на меньшее

количество специфического лиганда, достигалась лучшая адсорбция плазминогена. То есть, поли-

мер, содержащий только активную форму лиганда - e-Lys, был более эффективен, чем содержащий в своем составе и неактивный лиганд a-Lys. Однако, с точки зрения дешевизны и технологи-

ческой простоты синтеза, более предпочтителен для практического использования аффинный полимер I типа. Следует отметить, что БП с промежуточным слоем альбумина оказалось более эффективным, чем с промежуточным слоем хитозана, как при большем (2.0±0.3 мкг/см2), так и при меньшем (0.01±0.005 мкг/см2) содержании аффинного полимера на поверхности, что, по-видимому, связано с различной топографией слоев. Площадь контактной поверхности для БП с промежуточным слоем альбумина, по-видимому, превышает таковую для БП с хитозаном. По нашему мнению, структура поверхности с промежуточным слоем хитозана, по-видимому, соответствует типу dilute nonoverlapping «mushrooms», описанному в литературе, в результате активные сайты адсорбированного АП доступны лишь на выступающих наружных частях "mushrooms". Этот фактор (помимо меньшей площади контакта), по-видимому, также влияет на более низкую сорбцию плазминогена на этих образцах БП в сравнении с образцами БП с промежуточным слоем ЧСА.

Мулыпислойное покрытие (МП). Для МП, полученных многократным нанесением полиэлектролитных слоев рассчитывали количество неактивного профермента плазминогена, сорбированного из донорской плазмы. Эффективность биоспецифических покрытий на основе мультислойных ПЭК возрастала, по сравнению с вышеописанными БП, а также многократно нанесенным на подложку АП без промежуточных слоев хитозана или альбумина (табл. 6 а,б). Данный эффект, по-видимому, можно объяснить более полным покрытием исходной подложки полимерами. Кроме того, возможно, что аффинный лиганд конформационно более доступен на поверхностях, модифицированных полиэлектролитным комплексом, чем на подложках, модифицированных только АП. В результате, заметная адсорбция плазминогена отмечена даже в случае покрытий с наружным слоем менее активного АП-I в составе мультиполиэлектролитного комплекса, по сравнению с тем же покрытием, но нанесенным непосредственно на подложку (табл.6 б): количество адсорбированного плазминогена на МП на порядок превышало количество плазминогена, адсорбированного на покрытиях без промежуточных слоев.

Исследование тромборезистентных свойств покрытий

Тромборезистентные свойства биоспецифических бислойных покрытий изучали с использованием экспресс-метода с помощью специального устройства, через которое проводили перфузию донорской крови (in vitro) или крови экспериментального животного (ex vivo). В качестве контрольных материалов использовали немодифицированный (исходный) полиэтилен (ПЭ), полиэтилен, модифицированный альбумином (ПЭ-ЧСА) и полиэтилен, модифицированный комплексом альбумин-гепарин (ПЭ-ЧСА-ГП). В качестве опытных исследовали образцы с покрытиями БП1 (2.0±0.3 мкг/см2 полимера АП-I, 0.77±0.23 нмоль/см2 специфического лиганда) и БП2 (0.01±0.05 мкг/см2 полимера АП-I, 0.09±0.02 нмоль/см2 специфического лиганда). Динамика пристеночного тромбообразования (зависимость адсорбции тромботических масс на поверхности материалов от времени экспозиции с кровью) представлена на рис. 11.

Эксперименты in vitro (рис. 11a) показали, что образцы полиэтилена, модифицированного ГП и БП, при взаимодействии с кровью проявляли повышенную тромборезистентность: количество осевших тромботических масс на поверхности материалов за время экспозиции с кровью 60-180 минут составило около 25 и 70 мкг/см2 для БП1,2 и ГП, соответственно, в то время как на контрольных ПЭ поверхностях количество адсорбированных масс было значительно больше - от 100 до 125 мкг/см2.

Рисунок 11. Динамика пристеночного тромбообразования на поверхностях, модифицированных покрытиями с аффинными полимерами в опытах in vitro с донорской кровью (а) и ex vivo с кровью экспериментального животного (б) при экстракорпоральном подключении образцов к кровотоку (в эксперименте исследовали опытные образцы полиэтилена, модифицированные покрытиями с аффинным полимером АП-1 (содержание аффинного лиганда в полимере 18.4 %мол.): БП1 (содержание специфического лиганда на поверхности материала 0.77±0.23 нмоль/см2); БП2 (содержание специфического лиганда на поверхности материала 0 09:0 02 нмоль/см2).

Время контакта с кровью, мин

В системе ex vivo (рис. 11 б) за время перфузии крови относительное количество массы пристеночного тромба на образцах с БП составило 10-50% от контроля. Количество тромботических масс на поверхности этих материалов при максимальном времени контакта с кровью находилось в пределах 200-250 мкг/см2; степень тромборезистентности этих образцов была несколько ниже, чем образцов с иммобилизованным гепарином. Тем не менее, покрытия ПЭ-ЧСА-БП1,2, также как и покрытия ПЭ-ЧСА-ГП, были значительно менее тромбогенны, чем контрольные образцы ПЭ-ЧСА, на которых при максимальном времени экспозиции с кровью адсорбировалось около 400 мкг/см2 тромботических масс. В экспериментах in vitro и ex vivo было показано, что и покрытие БП1, и покрытие БП2 эффективно снижали тромбогенность ПЭ, несмотря на меньшее содер-

жание (почти на порядок) аффинного лиганда на поверхности БП2 (по сравнению с БП1). Такой результат совпадал с данными по сорбции плазминогена in vitro.

Таким образом, предложенные БП и МП на основе интерполиэлектролитных комплексов с биоспецифическими свойствами показали возможность повышения тромборезистентности полио-лефиновых материалов (in vitro и ex vivo). Есть основание предполагать, что разработанные нами покрытия, нанесенные на имплантаты, будут способствовать снижению степени тромбогенности контактирующих с кровью изделий (in vivo), используемых в кардиохирургической практике.

Следует отметить, что технология получения полиэлектролитных покрытий достаточно проста и недорога; в синтезе не использовались токсичные вещества и потенциально опасные физические методы воздействия, т.е. процесс получения защитных покрытий можно отнести к, так называемой, "зеленой химии".

Предложенный в данной работе принцип модификации поверхности имеет еще ряд достоинств. Данный подход позволяет достаточно легко получать, к примеру, антимикробные полиэлектролитные покрытия, а также комбинировать указанное свойство с тромборезистентностью. С этой целью в состав наружного слоя покрытия можно, например, вводить биологически активные вещества с антибиотическими свойствами - ангидридные группы исходного сополимера малеино-вого ангидрида с Л'-винилпирролидоном в мягких условиях в отсутствие конденсирующих агентов могут реагировать с амино- или оксигруппами лекарственных веществ. Возможен также вариант с включением в состав полиэлектролитного покрытия наночастиц серебра (известного антисептика). Получены предварительные данные о синтезе стабилизированных наночастиц серебра с использованием ВПМК.

Выводы

1. Впервые исследован процесс комплексообразования хитозана с сополимерами дикарбоновой (малеиновой) кислоты: Л'-винилпирролидоном, стиролом или этиленом. Рассчитана теоретическая модель стехиометрического связывания полиэлектролитов.

2. На основе анализа изотерм связывания противоположно заряженных полиэлектролитов с использованием координат Скэтчарда и Хилла выявлен кооперативный характер интерполиэлек-тролитного взаимодействия - рассчитанные значения параметра Хилла составляли 1.4-2.8. Показано, что значения кажущихся констант связывания варьировались в пределах (1-3)-104 л/моль в зависимости от природы сомономера малеиновой кислоты в поликислоте и температуры процесса комплексообразования.

3. Установлено влияние параметров среды и отличия в строении макромолекул различных сополимеров малеиновой кислоты на вклад сил некулоновской природы (водородных связей и гидрофобных взаимодействий) в процесс полиэлектролитного комплексообразования сополимеров с хитозаном.

4. Методами колориметрии и турбидиметрии выявлено влияние pH, ионной силы, температуры, наличия в системе хаотропных агентов, концентрации и соотношения взаимодействующих полиэлектролитов на состав и свойства образующихся полиэлектролитных комплексов.

5. Определены условия получения нерастворимых полиэлектролитных комплексов требуемого состава, обладающих необходимым набором свойств (разной степенью гидрофильности, устойчивостью в широком диапазоне pH и ионной силы), позволяющих использовать их в качестве матрицы для создания сорбентов и носителей различного назначения.

6. На основе полиэлектролитных комплексов с содержанием хитозана 70-80 %мол. получен сферически гранулированный гидрофильный аффинный сорбент - сшитый водонабухающий хитин, содержащий остатки специфического лиганда - А-ацетил-О-глюкозамина, для сорбции лектина зародышей пшеницы. Применение полученного сорбента позволяло выделять гомогенный агглютинин с выходом до 4.1 мг/г сорбента.

7. Предложены новые аутоселективные тромборезистентные би- и мультислойные наноразмер-ные покрытия для контактирующих с кровью медицинских материалов на основе интерполи-электролитных комплексов, с внешним биоспецифическим слоем из сополимера N-винилпирролидона и малеиновой кислоты, содержащего аффинный лиганд к эндогенному зи-могену фибринолиза - плазминогену. С целью улучшения адгезии полиэлектролитных покрытий к защищаемым поверхностям был предложен способ предварительной гидрофилизации поверхности или альтернативный способ - гидрофобизация контактирующих с поверхностью компонентов поликомплекса. Показано, что полученные покрытия обладали гемосовместимо-стью и тромборезистентностью.

8. Методами атомной силовой микроскопии, ИК-спектроскопии многократного нарушенного полного внутреннего отражения, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии, а также контактного угла было установлено наличие на защищаемой поверхности гидрофильного нано-размерного полиэлектролитного покрытия и определен его состав. Показано, что многослойное нанесение полимерных слоев способствовало более полному покрытию защищаемой поверхности.

9. Эффективность предложенных гидрофильных тромборезистентных покрытий была продемонстрирована в системах in vitro и ex vivo. Было установлено, что наибольшими плазминовой активностью и антитромбогенными свойствами обладало покрытие с внешним контактным слоем аффинного полимера, полученного с использованием временной защиты е-аминогруппы специфического лиганда.

10. Предложенный принцип создания тромборезистентных материалов позволил осуществлять саморегуляцию тромборезистентных свойств поверхностей, контактирующих с кровью, без участия экзогенных тромболитиков, антиагрегантов, антикоагулянтов и т.д.

Совместные исследования. Плазминовый тест выполнен в группе биохимии фибринолиза (рук. с.н.с., к.х.н. Айсина Р.Б.) кафедры энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, гематологические тесты и эксперименты с животными проводили совместно с лабораторией химии и технологии материалов для сердечно-сосудистой хирургии (рук. профессор, д.б.н. Новикова С.П.) НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Самойлова Н.А., Краюхина М.А., Ямсков И.А. Сорбция лектина зародышей пшеницы полиэлектролитными комплексами хитозана // Прикл. биохимия и микробиол. - 2002. - Т.38. № 4. -С.447-451

2. Самойлова Н.А., Краюхина М.А., Ямсков И.А. Новые ионообменные и аффинные сорбенты на основе полиэлектролитных комплексов хитозана // Журн. физ. химии. - 2002. - Т.76. №9. -С.1660-1665

3. Краюхина М.А., Самойлова Н.А., Новикова С.П., Соколов М.В., Васильев Н.В., Ямсков И.А. Аутоселективные тромборезистентные бислойные покрытия для изделий, контактирующих с кровью // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. - 2003. - Т.4. №9. - С.75-81

4. Samojlova N.A., Krayukhina M.A., Yamskov I.A. Use of the afïinity chromatography principle in creating new thromboresistant materials // J. Chromatogr., B. - 2004. - V. 800. № 1-2. - P. 263-269

5. Samoilova N.A., Krayukhina M.A., Novikova S.P., Babushkina T.A., Volkov I.O., Komarova L.I., Moukhametova L.I., Aisina R.B., Obraztsova E.A., Yaminsky I.V., Yamskov I.A. Polyelectrolyte thromboresistant affinity coatings for modification of devices contacting blood // J. Biomed. Mater. Res. - 2007. - V.82A. №3. - P. 589-598

6. Краюхина M.A., Козыбакова C.A., Самойлова H.A., Бабак В.Г., Караева С.З., Ямсков И.А. Амфифильные сополимеры малеиновой кислоты: синтез и исследование свойств // Журнал прикладной химии,-2007.-Т.80. №7.-С. 1175-1180

7. Tikhonov V.E., Stepnova Е.А., Babak V.G., Krayukhina M.A., Berezin B.B., Yamskov LA. Am-phiphilic N-[2(3)-(dodec-2'-en-r-yl)succinoyl]chitosan: Synthesis and properties // Reactive & Functional Polymers. - 2008. - V.68. - P. 436-445

8. Самойлова H.A, Краюхина M.A., Новикова С.П., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Ямсков И.А.. Биоспецифические свойства лизин-содержащих полизлектролигных покрытий для изделий, контактирующих с кровью // Биомед. химия. - 2008. - Т.54. №5. - С. 577-587

9. Краюхина М.А., Самойлова Н.А., Ямсков И.А. Полиэлектролитные комплексы хитозана: формирование, свойства и применение // Успехи химии. - 2008. -Т.П. №9. - С.854-869

10. Самойлова Н.А, Краюхина М.А., Волков И.О., Образцова Е.А., Комарова Л.И., Яминский И.В., Ямсков И.А. Поверхностные свойства биоспецифических покрытий на основе полиэлектролитных комплексов сополимеров малеиновой кислоты. // Высокомолек. соед. А. -2009. -Т.51. №2. - С. 241-249

11. Краюхина М.А., Самойлова Н.А, Ерофеев А.С., Ямсков И.А. Комплексообразование хитозана с сополимерами малеиновой кислоты // Высокомолек. соед. А. - 2010. - Т. 52. №3. -С.394-402

12. Краюхина М.А., Гнатюк Н.Г., Самойлова Н.А., Ямсков И.А. Полиэлектролитные комплексы хитозана в сорбции лектина зародышей пшеницы. Тез. докл. VIII Всеросс. симпозиума по жидкостной хроматографии и электрофорезу. - М.: 2001, с.90

13. Самойлова Н.А., Краюхина М.А., Гнатюк Н.Г., Ямсков И.А. Новые полиэлектролитные комплексы хитозана. Тез. докл. VI международной конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана". - М.: Изд-во ВНИРО. 2001, с.320-323

14. Самойлова Н.А., Новикова С.П., Краюхина М.А., Шарова Ю.А., Шаноян С.А., Ямсков И.А. Полимерные комплексы, содержащие специфический лиганд к плазминогену, для модификации изделий, контактирующих с кровью. Тез. докл. 7 Всероссийского съезда сердечнососудистых хирургов, т.2, №6. - М.: Изд-во НЦССХ им. А.Н.Бакулева. 2001, с.252

15. Самойлова Н.А., Новикова С.П., Краюхина М.А., Васильев Н.В., Ямсков И.А. Аутоселективные полиэлектролитные комплексы на основе хитозана. Тез. докл. 1-го международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития», ч.1. - М.: ЗАО "ПИК" "Максима", РХГУ ИМ.Д.И. Менделеева. 2002, с.76

16. Самойлова H.A., Краюхина M. А.,.Ямсков И.А Количественная тонкослойная хроматография в анализе модифицированных полимеров. Тез. докл. международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии», - Краснодар: 2002, с.222-223

17. Краюхина М.А., Самойлова H.A., Новикова С.П., Ямсков И.А. Новое тромборезистентное аутоселективное покрытие. Тез. докл. 7-ой Пушинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино. 2003 г., с. 110

18. Samoilova N.A., Krayukhina MA., Novikova S.P., Yamskov I.A.The use of the affinity chromatography principle in creating new thromboresistant materials. Abstract of the 3"1 Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS 2003 "100 years of chromatography". - Moscow. 2003, p. 159

19. Краюхина M.A., Самойлова H.A., Новикова С.П., Ямсков И.А. Тромборезистентное аутоселективное покрытие для имплантатов. Тез. докл. 7-ой Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева. - М.: Изд-во НЦССХ им. А.Н.Бакулева. 2003, с. 207

20. Самойлова H.A., Краюхина М.А., Тихонов В.Е., Ямсков И.А. Новые полиэлектролитные комплексы хитозана для получения тромборезистентных покрытий. Тез. докл. 7-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». -Санкт-Петербург-Репино: Изд-во ВНИРО. 2003, с. 193-195

21. Краюхина М.А. Новые тромборезистентные материалы для эндопротезов. Тез. докл. II конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". - М. 2004, с. 465-466

22. Samoilova N.A., Babak V.G., Novikova S P., Babushkina T.A., Krayukhina M.A., Yamskov I.A. Novel polyelectrolyte complexes of chitosan and copolymers of dicarbonic acid. Abstract of the International Conference "Modern trends in organoelement and polymer chemistry". - Moscow. 2004, p. P81

23. Краюхина M.A., Самойлова H.A., Новикова С.П., Козыбакова С.А., Ямсков И.А. Новые аспекты биомедицинского использования сополимеров малеинового ангидрида. Сборник трудов 1-ой Международной научно-практической конференции "Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике ("Р&М-2005")". - Санкт-Петербург. 2005, с. 141144

24. Краюхина М.А., Самойлова H.A., Новикова С.П., Мухаметова Л.И., Ямсков И.А. Полиэлектролитные гемосовместимые аффинные сэндвич-покрытия для модификации изделий, применяемых в кардиохирургической практике. Тез. докл. Х-ой Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, т.7, №3. - М.: Изд-во НЦССХ им. А.Н.Бакулева. 2006г., с. 228

25. Самойлова H.A., Краюхина М.А., Комарова Л.И., Волков И.О., Ямсков И.А. Инструментальные методы исследования поверхности тромборезистентных покрытий на основе хитозана. Тез. докл. VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". - Казань:. - М.: Изд-во ВНИРО. 2006, с.241-243

26. Самойлова H.A., Краюхина М.А., Новикова С.П., Мухаметова Л.И., Ямсков И.А. Некоторые биотехнологические и медицинские аспекты использования новых полиэлектролитных комплексов хитозана. Тез. докл. IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. - Пущино. 2006, с. 227

27. Краюхина М.А., Самойлова H.A., Ямсков И.А. Комплексообразование хитозана с сополимерами малеиновой кислоты. Тез. докл. IX междунар. конф."Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". - М.: Изд-во ВНИРО, 2008. - с. 27-29

28. Краюхина М.А., Лосева C.B. Мультислойные наноразмерные биополимерные покрытия для усовершенствования функциональных свойств контактирующих с кровью медицинских изделий. Тез. докл. 2 междунар. конкурса научных работ молодых ученых в области нанотех-нологий «Rusnanotech'09», - M., 2009. -с.625-626

Подписано в печать:

17.03.2010

Заказ № 3545 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Краюхина, Мария Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Общие положения.

1.2. Полиэлектролитные комплексы хитозана.

1.2.1. Структура и свойства хитозана.

1.2.2. Полиэлектролитные комплексы хитозана с биополиэлектролитами и модифицированными природными полианионами.

1.2.2.1. Полиэлектролитные комплексы хитозана с полисахаридами.

1.2.2.2. Полиэлектролитные комплексы хитозана с ДНК.

1.2.2.3. Полиэлектролитные комплексы хитозана с белками.

1.2.3. Полиэлектролитные комплексы хитозана с синтетическими полианионами.

 
Введение диссертация по химии, на тему "Полиэлектролитные комплексы хитозана с сополимерами малеиновой кислоты"

Актуальность темы. Интерполиэлектролитные комплексы (ПЭК), образуемые при взаимодействии противоположно заряженных полиэлектролитов, вызывают большой интерес исследователей, который обусловлен обширной областью их научного и практического применения. В связи с этим в последние годы успешно развиваются работы, касающиеся исследований химических и физико-химических закономерностей процессов, приводящих к образованию ПЭК, строения и свойств получаемых ПЭК, а также возможности моделирования требуемых физико-химических, биомедицинских и технологических свойств ПЭК.

К настоящему времени, помимо большой группы ПЭК на основе полимеров синтетического происхождения, описаны ПЭК биополимеров - белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, а также смешанные ПЭК с участием как синтетических полиэлектролитов, так и полиэлектролитов природного происхождения. Особое внимание привлекают ПЭК на основе биополимеров, что связано, в первую очередь, с такими свойствами этих соединений, как биодеградируемость, биосовместимость, низкая токсичность; кроме того, имеет значение доступность и воспроизводимость природного сырья. Перечисленные достоинства позволяют эффективно использовать подобные ПЭК в качестве экологически и физиологически безопасных биоспецифических сорбентов, пленок, мембран, биосовместимых покрытий, носителей генетической информации и лекарственных веществ для адресной доставки к клеточным мишеням и т. д.

Еще один интересный аспект использования ПЭК - изучение закономерностей образования и свойств молекулярных структур живых природных конструкций. Как известно, взаимодействие противоположно заряженных полиэлектролитов в термодинамическом аспекте аналогично взаимодействию комплементарных биополиэлектролитов, ответственных за самосборку и реорганизацию биологических структур. Таким образом, полиэлектролитные комплексы и реакции, протекающие между ними, могут служить простыми моделями в исследовании биологических систем и закономерностей реакций, происходящих в живых организмах.

Одним из перспективных природных поли электролитов является хитозан (частично дезацетилированный хитин) - биосовместимый, низкотоксичный полиаминосахарид, получаемый в промышленных масштабах из природного биополимера хитина. Хитозан подвержен биодеструкции под действием как специфических, так и неспецифических ферментов; обладает рядом ценных для медикобиологического применения свойств: иммуномодулирующим, адъювантным, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, противовоспалительным, липотропным, антихолестерическим, гемостатическим действием.

Молекула хитозана, представляющая собой полимер D-глюкозамина, содержит в каждом моносахарид ном звене функциональные группы, которые могут участвовать в образовании как ковалентных связей, так и нековалентных - водородных и ионных связей. Наличие ионогенных групп позволяет ему легко вступать в реакции комплексообразования с противоположно заряженными полиэлектролитами.

ПЭК на основе хитозана применяются в научных исследованиях, в пищевой и нефтехимической промышленности, в биотехнологии и медицине в качестве аффинных и ионообменных сорбентов, пленок, первапорациотшых мембран, матриц-носителей клеток и биологически активных веществ, форм для направленного и пролонгированного транспорта лекарственных препаратов и т.д.

На сегодняшний день имеется достаточно большое количество работ, посвященных изучению строения и свойств растворимых и нерастворимых ПЭК хитозана с:

- синтетическими гибкоцепными полианионами (полиакриловой, полиметакриловой и т.д.) и жесткоцепными полисахаридами (карбоксиметилдестраном. карбоксиметилцеллюлозой, карбоксиметилхитином, декстрансульфагом и т.д.); природными полианионами (гепарином, гликозаминогликанами, полиуроновыми кислотами).

Несмотря на широкий спектр изученных ПЭК хитозана, сведения об исследовании ПЭК хитозана с синтетическими полианионами, содержащими остатки дикарбоновой (мапеиновой) кислоты, не были обнаружены Тем не менее, ПЭК подобного состава представляют большой интерес с научной и практической точек зрения. Сополимеры малеиновой кислоты, характеризующиеся регулярным строением макромолекулярной цепи, применяются в различных отраслях промышленности и биотехнологии. Такие сополимеры (в форме сополимеров малеинового ангидрида) коммерчески доступны или могут быть синтезированы в условиях радикальной сополимеризации.

Представлялось интересным выстроить модель стехиометрического ПЭК с учетом особенностей строения макромолекул полисахарида и сополимеров дикарбоновой кислоты. Влияние изменения природы сомономера малеиновой кислоты в полианионе, а также условий комплексообразования должны в значительной степени отражаться на составе и свойствах получаемых ПЭК. Кроме того, часть функциональных групп полимеров, не вовлеченных в интерлолиэлектролитное взаимодействие, может быть легко модифицирована введением различных лигандов. Все это в совокупности должно расширить сферу возможного практического применения ГТЭК.

Таким образом, получение новых ПЭК хитозана и исследование их свойств является актуальным, представляет научный интерес и имеет практическое значение.

Цель п задачи исследования. Целью данной диссертационной работы явилось изучение условий комплексообразования, свойств и возможностей практического применения в биотехнологии и медицине ПЭК хитозана с сополимерами дикарбоновой кислоты, отличающихся регулярной структурой макромолекулярной цепи: сополимерами малеиновой кислоты с N-винилпирролидоном, стиролом или этиленом.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

Научная новизна. В настоящей работе впервые рассмотрено получение новых ПЭК хитозана с анионными полимерами, содержащими остатки дикарбоновой кислоты, -сополимерами малеиновой кислоты со стиролом, этиленом или ./V-винилпирролидоном. Исследованы условия получения, физико-химические свойства и показана перспективность использования ПЭК в качестве сорбентов для аффинной хроматографии и эффективных тромборезистентных покрытий для контактирующих с кровью изделий медицинского назначения.

На основании данных расчета расстояний между реагирующими группами и с учетом конформационных особенностей взаимодействующих полимеров представлена структура стехиометрических интерполиэлектролитных комплексов. Выявлены условия формирования ПЭК различного состава и свойств в зависимости от природы сомономера малеиновой

7)

О 2) 3)

4)

5)

6) изучить физико-химические закономерности образования ПЭК; оценить влияние различных факторов на комплексообразование; получить различные по составу ПЭК хитозана с выбранными анионными полимерами и изучить свойства полученных комплексных соединений; выбрать ПЭК с требуемыми свойствами для получения на его основе биоспецифических сорбентов; подтвердить эффективность полученных сорбентов на основе ПЭК, для контактирующих с кровью инородных поверхностей получить на основе ПЭК биоспецифические покрытия, обладающие свойствами биосовместимости и тромборезистентности; подтвердить эффективность полученных биоспецифических покрытий. кислоты и условий проведения интерполиэлектролитного взаимодействия при изменении степеней ионизации реагирующих групп, концентрации и соотношения полиэлектролитов. На основании вышеприведенных исследований были получены ПЭК требуемых состава и свойств.

В отсутствие органических растворителей и конденсирующих агентов получен водонабухающий сшитый хитин - эффективный аффинный сорбент для выделения применяемого в биохимии и медицине лектина зародышей пшеницы. Был разработан оригинальный способ получения аффинного сорбента путем ковалентной сшивки хитозана сополимером дикарбоновой кислоты в ПЭК с последующим избирательным ацетилированием аминогрупп хитозана.

Были получены новые аутоселективные гидрофильные биоспецифические тромборезистентные полиэлектролитные покрытия для медицинских материалов, контактирующих с кровью, базирующиеся на использовании предложенных поликомплексов. Наружный слой покрытий содержал специфический, в отношении эндогенного зимогена крови - плазминогена, лиганд.

Для получения биоспецифического слоя разработаны несколько вариантов модификации анионного полимера. Использование в составе полиэлектролитных покрытий модифицированного полиэлектролита, несущего специфический к плазминогену лиганд, позволило осуществить запуск механизма тромболизиса на модифицированной поверхности с помощью присущих организму, а не внесенных извне тромболитических факторов. Сцепление ПЭК с защищаемой гидрофобной поверхностью осуществлялось либо предмодификацией поверхности, либо введением в состав поликомплекса гидрофобных "якорных" групп.

Практическая значимость работы. Разработанные на основе исследованных ПЭК сферически гранулированные регенерируемые аффинные сорбенты лектина зародышей пшеницы показали эффективность их использования для выделения и очистки агглютинина. Специфическая сорбционная емкость таких сорбентов превышала в 6-7 раз емкость известных сорбентов на основе хитозана. При этом существенным преимуществом данных сорбентов на основе ПЭК является чрезвычайная простота их получения, которая не требует использования органических растворителей и конденсирующих агентов. Предложенные ПЭК могут быть использованы для аффинной хроматографии других разнообразных биологически активных соединений, благодаря наличию в составе ПЭК остатков малеиновой кислоты, которые легко переводятся в реакционноспособные ангидридные группы, в дальнейшем, могущие реагировать (в мягких условиях) с амино- и оксисодержащими лигандами. Кроме того, на основе ПЭК возможно получение ионообменных смол.

Разработанные полиэлектролитные покрытия с биоспецифическими свойствами показали возможность повышения гидрофильности полиолефиновых и полистирольных магериалов и придания им свойств тромборезистентности. Эксперименты в условиях in vitro и ex vixo, проведенные на химфаке МГУ и в НЦССХ им. А.Н.Бакулева показали способность предлагаемых покрытий на основе ПЭК аффинно сорбировать плазминоген, а также достоверно снижать степень тромбогенносги модифицированных поверхностей. Существует возможность получения тромборезистентных гидрофильных полиэлектролитных покрытий с антимикробными свойствами в результате введения в ПЭК антимикробных или бактерицидных препаратов посредством их сорбции или ковапентного связывания.

Проведенные исследования позволяют получать ПЭК требуемого состава и заданных свойств, варьируя условия комплексообразования.

Апробация работы. Основные результаты и отдельные положения работы представлены на следующих конференциях: Международной конференции молодых ученых "Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии" (Москва-Тверь, 2001); VIII Всеросс. симпозиуме по жидкостной хроматографии и электрофорезу (Москва, 2001); VI Международной конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 2001), 7 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2001); 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002); 7-ой Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003); 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS 2003 "100 years of chromatography" (Moscow, 2003); 7-ой Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2003); Седьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург-Репино, 2003); III конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2004); International Conference Dedicated to 50(h Anniversary of A.N.Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds Russian Academy of Sciences "Modern trends in organoelement and polymer chemistry" (Moscow, 2004); 1-ой Международной научно-практической конференции "Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике ("Р&М-2005")" (Санкт-Петербург, 2005); X Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2006); VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Казань, 2006), IX Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Ставрополь, 2008), Втором международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech"09» (Москва, 2009).

Работа получила премию П.П. Шорыгина в 2005г, на 50-ом конкурсе научно-исследовательских работ ИНЭОС РАН (2005 г.) получила III премию и в 2009 г. получена I премия на Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech,09».

 
Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследован процесс комплексообразования хитозана с сополимерами дикарбоновой (малеиновой) кислоты, отличающимися регулярной структурой макромолекулярной цепи: jV-винилпирролидоном, стиролом или этиленом. Рассчитана теоретическая модель стехиометрического связывания полиэлектролитов.

2. На основе анализа изотерм связывания противоположно заряженных полиэлектролитов с использованием координат Скэтчарда, Хилла и Бьеррума выявлен кооперативный характер интерполиэлектролитного взаимодействия - рассчитанные значения параметра Хилла составляли 1.4-2.8. Показано, что значения кажущихся констант связывания варьировались в пределах (1—3)-104 л/моль в зависимости от природы сомономера малеиновой кислоты в поликислоте и температуры процесса комплексообразования.

3. Установлено влияние параметров среды и отличия в строении макромолекул различных сополимеров малеиновой кислоты на вклад сил некулоновской природы (водородных связей и гидрофобных взаимодействий) в процесс полиэлектролитного комплексообразования сополимеров с хитозаном.

4. Методами колориметрии и турбидиметрии выявлено влияние рН, ионной силы, температуры, наличия в системе хаотропных агентов, концентрации и соотношения взаимодействующих полиэлектролитов на состав и свойства образующихся полиэлектролитных комплексов.

5. Определены условия получения нерастворимых полиэлектролитных комплексов требуемого состава, обладающих необходимым набором свойств (разной степенью гидрофильности, устойчивостью в широком диапазоне рН и ионной силы), позволяющих использовать их в качестве матрицы для создания сорбентов и носителей различного назначения.

6. На основе полиэлектролитных комплексов с содержанием хитозана 70-80 %мол. получен сферически гранулированный гидрофильный аффинный сорбент - сшитый водонабухающий хитин, содержащий остатки специфического лиганда - тУ-ацетил-£>-глюкозамина, для сорбции лектина зародышей пшеницы. Применение полученного сорбента позволяло выделять гомогенный агглютинин с выходом до 4.1мг/г сорбента.

7. Предложены новые аутоселективные тромборезистентные би- и мультислойные наноразмерные покрытия для контактирующих с кровью медицинских материалов на основе интерполиэлектролитных комплексов, с внешним биоспецифическим слоем из сополимера Л^-винилпирролидона и малеиновой кислоты, содержащего аффинный лиганд к эндогенному зимогену фибринолиза - плазминогену. С целью улучшения адгезии полиэлектролитных покрытий к защищаемым поверхностям был предложен способ предварительной гидрофилизации поверхности или альтернативный способ -гидрофобизация контактирующих с поверхностью компонентов поликомплекса. Показано, что полученные покрытия обладали гемосовместимостью и тромборезистентностью.

8. Методами атомной силовой микроскопии, ИК-спектроскопии многократного нарушенного полного внутреннего отражения, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии, а также контактного угла было установлено наличие на защищаемой поверхности гидрофильного наноразмерного полиэлектролитного покрытия и определен его состав. Показано, что многослойное нанесение полимерных слоев способствовало более полному покрытию защищаемой поверхности.

9. Эффективность предложенных гидрофильных тромборезистентных покрытий была продемонстрирована в экспериментах in vitro и ex vivo. Было установлено, что наибольшими плазминовой активностью и антитромбогенными свойствами обладало покрытие с внешним контактным слоем аффинного полимера, полученного с использованием временной защиты е-аминогруппы специфического лиганда.

10. Предложенный принцип создания тромборезистентных материалов позволил осуществлять саморегуляцию тромборезистентных свойств поверхностей, контактирующих с кровью, без участия экзогенных тромболитиков, антиагрегантов, антикоагулянтов и т.д.

Совместные исследования

Спектры ИК, ИК-МНПВО выполнены в лаборатории молекулярной спектроскопии (рук. профессор, д.х.н. Локшин Б В ), ЯМР спектроскопия - в лаборатории ядерного магнитного резонанса (рук. д.х.н. Перегудов АС), РФЭС - в лаборатории структурных исследований полимеров (рук. профессор, д.ф-м.н. Перцпн А И.) ИНЭОС РАН; АСМ - в группе зондовой микроскопии (рук. профессор, д. ф-м. н Яминский И.В.) кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, плазминовый гесг проводили в группе биохимии фибринолиза (рук. с.н с , к х.н. Айсина Р.Б.) кафедры энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, гематологические тесты и эксперименты с животными - в лаборатории химии и технологии материалов для сердечнососудистой хирургии (рук. профессор, дон Новикова С.П.) НЦССХ им А Н. Бакулева РАМН

Автор выражает благодарность за неоценимую помощь в работе над диссертацией заведующей лабораторией химии и технологии материалов для сердечно-сосудистой хирургии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН профессору Новиковой СП и ее научному коллективу, сотрудникам ИНЭОС РАН с н с , к х.н. Курской Е.А., н.с Клеменковой З.С., в.н.с., д х н Комаровой Л.И., в.н.с., д.х.н. Бабушкиной Т.А., с.н.с., к.ф-м.н. Наумкину А.В., н.с., к.х н Волкову И О.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Краюхина, Мария Александровна, Москва

1. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A., Sukhishvili S.A. Interaction of polyions with cell-mimetic species: Physico-chemical and biomedical aspects // J. Control. Release. 1996. - V. 39. №2-3.-P. 173-189

2. Yaroslavov A.A., Yaroslavova E.G., Rakhnyanskaya A.A., Menger F.M., Kabanov V.A. Modulation of interaction of polycations with negative unilamellar lipid vesicles // Colloids Surf. B: Biointerfaces. 1999. - V. 16. № 1-4. - P. 29-43

3. Чупятов A.M., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Кинетика реакций между противоположно заряженными линейными и сетчатыми полиэлектролитами // Высокомолек. соед,- 1994.-Т. 36 (А). С. 212-217

4. Kabanov V.A., Zezin А.В., Rogacheva V.B., Prevish V.A. Activc transport of linear polyions in oppositely charged swollen polyelectrolyte networks // Macromol. Chem. 1989. -V. 190. - P. 2211-2216

5. Карпушкин E.A., Кечекьян А.С., Зезин А.Б., Пнтериолиэлектролитная реакция между частицами противоположно заряженных микрогслей // Высокомолек. соед. 2006. -Т.48 (В). №11. С. 2053-2057

6. Kalsin A.M., Kowalczyk B.,Smoukov S.K., Klajn R., Grzybowski B.A., Ionic-like behavior of oppositely charged nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 2006. - V. 128. - P. 1504615047

7. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов (обзор) // Высокомолек. соед. 1994. -Т.36. №2. - с. 183-197

8. Зезин А Б, Рогачева В.Б. Полиэлектролитные комплексы. В кн.: Успехи химии и физики полимеров. М.: Химия, 1973. - с.3-30

9. Кабанов В.А. Полиэлектролитные комплексы в растворе и в конденсированной фазе // Успехи химии. 2005. - Т.74. №1. -С.5-23

10. Kabanov A.V., Vinogradov S.V., Suzdaltseva Yu.G., Alakhov V.Yu. Water-Soluble Block Polycations as Carriers for Oligonucleotide Delivery // Bioconjugate Chem. 1995. - V.6. №6. - P.639-643

11. Harada A., Kataoka K. Formation of Polyion Complex Micelles in an Aqueous Milieu from a Pair of Oppositely-Charged Block Copolymers with Poly(ethylene glycol) Segments // Macromoleeules. 1995. - V.28. - P. 5294-5299

12. Kabanov A.V., Bronich Т.К., Kabanov V.A., Yu K., Eisenberg A. Soluble Stoichiometric Complexes from Poly(N-ethyl-4-vinylpyridinium) Cations and Poly(ethylene oxide)-block-polymethacrylate Anions // Macromolecules. 1996. - V.29. №21. - P. 6797-6802

13. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова. М.: - Наука, 2002. - 368 с.

14. Sorlier P., Denuziere A., Viton С., Domard A. Relation between the Degree of Acetylation and the Electrostatic Properties of Chitin and Chitosan // Biomaeromolecules. 2001. -V. 2. № 3. - P. 765-772

15. Самойлова H.A., Березин Б.Б., Ямсков И.А. Новые хитиновые сорбенты для выделения лектина зародышей пшеницы // Прикл. биохимия и микробиол. 1997. - Т.ЗЗ. № 2.-С. 147-151

16. Coelho Т.С., Laus R., Mangrich A.S., Favere V.T., Laranjeira M.C.M. Effect of heparin coating on epichlorohydrin cross-linked chitosan microspheres on the adsorption of copper (II) ions // React. Funct. Polym. 2007. - V. 67. № 5. - P. 468-475

17. Wang C., Ye S., Dai L., Liu X., Tong Z. Enhanced Resistance of Polyelectrolyte Multilayer Microcapsules to Pepsin Erosion and Release Properties of Encapsulated Indomethaein // Biomacromolecules. 2007. - V.8. №5. - P. 1739 -1744

18. Fukuda H., Kikuchi Y. Polyelectrolyte Complexes of Chitosan with Sodium Carboxymethyldextran // Bull. Chem. Soc. Japan. 1978. - V.51. №4. - P. 1142-1144

19. Fukuda H. Polyelectrolyte Complexes of Chitosan with Sodium Carboxymethylcellulose // Bull. Chem. Soc. Japan. 1980. - V.53. №4. - P.837-840

20. Zhu A.P., Ming Z., Jian S. Blood compatibility of chitosan/heparin complex surface modified ePTFE vascular graft // Appl. Surf. Sci. 2005. - V.241. - P. 485^92

21. Vila A., Sanchez A., Janes K., Behrens I., Kissel Т., Vila Jato J.L., Alonso M.J. Low molecular weight chitosan nanoparticles as new carriers for nasal vaccine delivery in mice // Eur. J. Pharm.Biopharm -2004. -V.57. №1. P. 123-131

22. Singla A.K., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects-an update // J. Pharm. Pharmacol. 2001. - V. 53. № 8. - P. 1047-1067

23. Ilium L., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M„ Fisher A.N., Davis S.S. Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev. -2001. V.51. № 1-3. - P. 81-96

24. Suh J.-K. F., Matthew H.W.T. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review // Biomaterials. 2000. - V.21. №24. -P.2589-2598

25. Gutowska A., Jeong B.M., Jasionowski M, Injectable Gels For Tissue Engineering, Invited paper // Anat. Rec. -2001. V. 263. №4. - P. 342-349

26. Mao J.S., Zhao L.G., Yin Y.J., Yao K.D. Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds // Biomaterials. 2003. - V.24. №6. - P. 1067-1074

27. Borchard G. Chitosans for gene delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. - V.52. № 2.-P. 145-150

28. Erbacher P., Zou S., Bettinger Т., Steffan A.-M., Remy J.-S. Chitosan-Based Vector/DNA Complexes for Gene Delivery: Biophysical Characteristics and Transfection Ability // Pharm. Res. 1998. - V. 15. № 9. - P. 1332-1339

29. Okamoto H., Nishida S., Todo H., Sakakura Yu., Iida K., Danjo K. Pulmonary gene delivery by chitosan-pDNA complex powder prepared by a supercritical carbon dioxide process // J. Pharm. Sci. 2003. - V.92. № 2. - P.37-380

30. Thanou M., Florea В. I., Geldof M., Junginger H. E., Borchard G. Quaternized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines // Biomaterials. 2002. -V. 23. № I.-P. 153-159

31. Кочетков H.K., Бочков А.Ф., Дмитриев В.А. и др. Химия углеводов. М.: Химия, 1967.-671 с.

32. Chatelet С , Damour О , Domard A Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films // Biomaterials -2001 -V 22 №3 -P 261-268

33. Shinoda K, Nakajima A Complex formation of the hyaluronic acid or chondroitin sulfate with glycol chitosan // Bull Chem Res, Kyoto Umv 1975 -V 53 -P 400-408

34. Shinoda К , Nakajima A Complex formation of the heparin or sulfated cellulose with glycol chitosan Bull Chem Res , Kyoto Umv 1975 - V 53 -P 392-399

35. Denuziere A, Ferrier D , Domard A Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes Physico-chemical aspects//Carbohydr Polym -1996 -V 29 -P 317-323

36. Rusu-Balaita L, Desbrieres J, Rinaudo M Formation of a biocompatible polyelectrolyte complex chitosan-hyaluronan complex stability // Polymer Bull 2003 — V 50 -P 91-98

37. Hirano S , Mizutani С, Yamaguchi R, Miura A Formation о the polyelectrolyte complexes of some acidic glycosaminoglycans with partially N-acylated chitosans Communication to the Editor//Biopolym 1978 -V 17 -P 805-810

38. Denuziere A , Ferrier D , Damour О , Domard A Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-h) aluronate complexes biological properties // Biomaterials 1998 - V 19 - P 12751285

39. Kim SJ, Yoon SG, Lee KB, Park YD, Kim SI Electrical sensitive behavior of a polyelectrolyte complex composed of chitosan/hyaluronic acid // Solid State Ionics 2003 -V 164 №3-4 -P 199-204

40. Sundararajan V Madihally, Howard WT Matthew Porous chitosan scaffolds for tissue engineering//Biomaterials -1999 -V20 -P 1133-1142

41. Shahabeddm L, Damour O, Berthod F, Rousselle P, Saintigny G, Collombcl С Reconstructed skin from co-cultured human keratinocytes and fibroblasts on a chitosane cross-linked col lagen-GAG matrix //J Mater Sci-Mater Med 1991 -V2 - P 222-226

42. Kratz G, Back M, Arnander C, Larm О Immobilised Heparin Accelerates the Healing of Human Wounds In Vivo // Scand J Plast Reconst Surg Hand Surg 1998 V 32 №4 -P381-385

43. Mitsumata T, Suemitsu Y, Fujii K, Fujii T, Taniguchi T, Koyam K. pH-response of chitosan, к-carrageenan, carboxymelhyl cellulose sodium salt complex hydrogels // Polymer. -2003. V.44. №23. - P.7103-7111

44. Шумилина E.B., Щипунов Ю.А. Гели хитозана с каррагинанами // Коллоид, журнал. 2002. - Т.64. №3. - С. 413-420

45. Beaumont M.D., Knorr D. Effects of immobilizing agents and procedures on viability of cultured celery (Apiumgraveolens) cells // Biotechnol. Lett. 1987. -V. 9. №6. - P.377-382

46. Sakiyama Т., Chu C.-H., Fujii Т., Yano T. Preparation of a polyelectrolyte complex gel from chitosan and к-carrageenan and its pH-sensitive swelling // J. Appl. Polym. Sci. 1993. -V.50. Ш1.-Р.2021-2025

47. Sakiyama Т., Takata H., Kikuchi M., Nakanishi K. Polyelectrolyte complex gel with high pH-sensitivity prepared from dextran sulfate and chitosan // J. Appl. Polym. Sci. 1999. -V.73. №11,- P.2227-2233

48. Hugerth A., Caramletham N. Sundelof L.O. The effect of charge density and conformation on the polyelectrolyte complex formation between carrageenan and chitosan // Carbohydr. Polym. 1997. - V.34. №3. - P. 149-156

49. Berth G., Voigt A., Dautzenberg 11., Donath E., Mohwald H. Polyelectrolyte Complexes and Layer-by-Layer Capsules from Chitosan/Chitosan Sulfate // Biomacromolecules. -2002. V. 3. № 3. - P. 579 -590

50. Yan X.L., Khor E., Lim L.Y. Chitosan-alginate films prepared with chitosans of different molecular weights // J. Biomed. Mater. Research (Appl. Biomater.). 2001. - V. 58. № 4. -P. 358-365

51. Yan X.L., Khor E., Lim L.Y. Chitosan-alginate PEC films prepared from chitosan of different molecular weights. In: Advan. Chitin Sci., Vol.4 / Eds. M.G.Peter, A.Domard and R.A.A.Muzzarelli. University of Potsdam, 2000. - p.473-478

52. Mitrevej A., Sinchaipanid N., Rungvejhavuttivittaya Yu, Kositchaiyong V. Multiunit Controlled-Release Diclofenac Sodium Capsules Using Complex of Chitosan with Sodium Alginate or Pectin // Pharm. Develop. Technol. 2001. - V 6 № 3. - P. 385 - 392

53. Kim Т.Н., Park Y.H., Kim K.J., Cho C.S. Release of albumin from chitosan-coated pectin beads in vitro // Int. J. Pharm. 2003. - V. 250. №2. - P. 371-383

54. Gonzales-Rodriguez M.L., Holgado M.A., Sanches-Lafuente C., Rabasco A.M., Fini A. Alginate/chitosan particulate systems for sodium diclofenac release // Int. J. Pharm. 2002. - V. 232. - P.225—234

55. Lee K.Y., Park W.H., Ha W.S. Polyelectrolyte complexes of sodium alginate with chitosan or its derivatives for microcapsules // J. Appl. Polym. Sci. 1997. - V.63. №4. - P.425432

56. Mi F.-L , Sung H.-W., Shyu S.-S. Drug release from chitosan-alginate complex beads reinforced by a naturally occurring cross-linking agent // Carbohydr. Polym. 2002. - V. 48. №1. -P. 61-72

57. Meshali M.M., Gab K.E. Effect of interpolymer complex formation of chitosan with pectin or acacia on the release behaviour of chlorpromazine HC1 // Int. J. Pharm. 1993. - V.89. №3,-P. 177-81

58. Rashidova S. Sh., Milusheva R. Yu., Semenova L. N., Mukhamedjanova M. Yu., Voropaeva N. L., Vasilyeva S., Faizieva R., Ruban I.N. Characteristics of Interactions in the Pectin-Chitosan System // Chromatographia. 2004. - V.59. - P. 779-782

59. Ofori-Kwakye K., Fell J.Т., Kipo S.L. Effects of pH of medium and molecular weight on polyelectrolyte complex formation between pectin and chitosan // J. Sci. Technol. (Ghana). -2006. V.26. №2. - P.66-73

60. Yao K.D., Liu J., Cheng G.X., Lu X.D., Tu H.-L , Silva J.A.L. Swelling behavior of pectin/chitosan complex films // J. Appl. Polym. Sci. 1996. - V. 60. №2. - P.279-283

61. Bernabe P., Peniche С., Argiielles-Monal W. Swelling behavior of chitosan/pectin polyelectrolyte complex membranes. Effect of thermal cross-linking // Polym. Bull. 2005. - V. 55. №5. - P. 367-375

62. Hoagland P.D., Parris N. Chitosan/Pectin Laminated Films // J. Agric. Food Chem. -1996. V.44. №7. - P. 1915 -1919

63. Maciel J.S., Silva D.A., Haroldo C.B. Paula R C.M. Chitosan/carboxymethyl cashew gum polyelectrolyte complex: synthesis and thermal stability // Eur. Polym. J. 2005. - V. 41. - P. 2726-2733

64. Kikuchi Y., Fukuda H. Polyelectrolyte complexes of sodium dextran sulfate with chitosan // Makromol. Chem. 1974 - V. 175. - P. 3593-3597

65. Fukuda H., Kikuchi Y Polyelectrolyte complexes of sodium dextran sulfate with chitosan // Makromol. Chem. 1977. - V. 178. - P. 2895-2899

66. Гамзазаде А.И Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов. Дис. . докт хим. наук. Москва, 2005. 363 с.

67. Агеев Е.П, Вихорева Г А , Гальбрайх JI С , Матушкина Н.Н., Чайка Е.М., Яминский И.В Получение и свойства пленок хитозана и пленок полиэлектролитных комплексов хитозана и карбоксиметилхитина // Высокомолек соед 1998. - Т.40 (А). №7. -С. 1198-1204

68. Агеев Е.П, Котова C.JL, Скорикова Е.Е., Зезин А Б Первапорационныемембраны на основе полиэлектролитных комплексов хитозана и полиакриловой кислоты // Высокомолек. соед 1996. - Т 38 (А) №2. - С. 323-329

69. Скорикова Е.Е., Калюжная Р.И., Вихорева Г.А., Гальбрайх JI.C., Котова C.JL, Агеев Е.П., Зезин А.Б., Кабанов В А Свойства интерполиэлектролитных комплексов хитозана и полиакриловой кислоты // Высокомолек. соед. 1996. - Т.38 (А). №1. - С. 61-65

70. Srinivasan R., Kamalam R. Polyelectrolyte complexes of glycol chitosan with some polysaccharides. 1. Mixing ratio and dielectric properties // Biopolymers 1982. - V.21. - P. 251263

71. Srinivasan R, Kamalam R. Polyelecliolyte complexes of glycol chitosan with somepolysaccharides. 2. Electrical conductivite // Biopolymers 1982. - V.21. - P. 265-275

72. Arguelles-Monal W., Garciga M., Peniche-Covas C. Study of the stoichiometric polyelectrolyte complex between chitosan and carboxymethyl cellulose // Polym. Bull. 1990 -V.23. №3. - P.307-313

73. Arguelles-Monal W, Hechavarria O.L., Rodrigues L , Peniche-Covas C. Swelling of membranes from the polyelectrolyte complex between chitosan and carboxymethyl cellulose // Polym. Bull. 1993 -V31 №4 -P 471—478

74. Arguellles-Monal W., Cabiera G., Peniche C., Rinaudo M. Conductimetric study ofthe interpolyelectrolyte reaction between chitosan and polygalacturonic acid // Polymer. 2000. -V.41.-P 2373-2378

75. Kara F , Demirel G., Ttimtiirk H. Immobilization of urease by using chitosan-alginatcand poly(acrylamide-co-acrylic acid)/kappa-carrageenan supports // Bioprocess Biosyst. Eng -2006,- V.29. -P 207-211

76. Yamaguchi R, Arai J., Hirano S., Ito T. Incorporation of glycoamylase into somepolyelectrolyte complexes // Agric Biol Chem 1978. - V.42. №6. - P. 1297-1299

77. Книрель Ю. А., в кн Прогресс химии углеводов. М.: Наука, 1985 - с 54-76

78. Brandenburg К., Andra J., Muller М., Koch M.H.J., Garidel P. Physicochemical properties of bacterial glycopolymers in relation to bioactivity // Carbohydr. Res. 2003 - V. 338. -P. 2477-2489

79. Davidova V.N., Yermak I.M., Gorbach V I., Solovieva T.F. The effect of temperature on the interaction of Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide with chitosan // Membr. Cell. Biol.- 1999,-V. 13. №1 -P 49-58

80. Давыдова В PI, Набережных Г.А., Ермак И М , Горбач В.И., Соловьева Т.Ф. Определение констант связывания липополисахаридов различной структуры с хитозаном // Биохимия. 2006. - Т.71. №3 - С 417-425

81. Ермак И.М, Реунов А.В., Лапшина JI.A., Давыдова В.Н., Соловьева Т.Ф. Электронно-микроскопическое исследование комплексов ЛПС грамотрицательных бактерий с природным полимером хитозаном // Биологические мембраны. 2005. - Т. 22. № 2. - С. 117-122

82. Torchilin VP Recent approaches to intiacellular delivei) of drugs and DNA and organelle targeting // Ann Rev Biomed Eng 2006 - V 8 - P 343-375

83. Кабанов А В , Кабанов В А Интерполиэлектролитные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетического материала в клстк\ (обзор) // Высокомолек соед 1994 -Т36 №2 - С 198-211

84. Евдокимов Ю М Нуклеиновые кислот ы и \и гозан в кн Хитин и хитозан / Под ред К Г Скрябина, Г А Вихоревой, В П Варламова М На>ка, 2002 -с 178-199

85. Yang F , Cui X , Yang X Interaction of low-molecular-weight chitosan with mimic membrane studied b\ electrochemical methods and surface plasmon resonance // Biophys Chem2002 V 99 № 1 P 99-106

86. Ishu T , Okahata Y , Sato T Mechanism of cell transfection with plasmid/chitosan complexes//Biochim Biophys Acta -2001 -V 1514 №1 -P 51-64

87. Masotti A Bordi Г , Ortaggi G, Marino F , Palocci С A novel method to obtain chitosan/DNA nanospheres and a study of their release properties // Nanotechnology 20081. V 19 -055302

88. La\ertu M, Methot S Tran-Khanh N, Buschmann MD High efficiency gene transfer using chitosan/DNA nanoparticles with specific combinations of molecular weight and degree of deacetylation// Biomaterials -2006 -V 27 №27 -P 4815-4824

89. Sato T , Ishu T , Okahata Y In vitro gene delivery mediated by chitosan Effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency // Biomaterials 20011. V 22 №15 -P 2075-2080

90. Liu W G , Zhang X , Sun S J , Sun G J , Yao К D , Liang D С , Guo G, Zhang J Y N-Alkylated Chitosan as a Potential Nonviral Vector for Gene Transfection // Bioconjug Chem2003 -V 14 №4 -P 782-789

91. Gao S , Chen J , Xu X, Ding Z , Yang Y -H , Hua Z , Zhang J Galactosylated low molecular weight chitosan as DNA carrier for hepatocyte-targeting // Int J Pharm 20031. V 255 №1-2 -P 57-68

92. Салянов В И, Ильина А В , Варламов В П, Евдокимов Ю М Влияние интеркаляторов на свойства жидкокристаллических дисперсий комплекса НК-хитозан // Мол биол -2002-Т 36 №4 С 699-705

93. Yevdokimov Yu М, Salyanov VI Liquid crystalline dispersions of complexes formed by chitosan with double-stranded nucleic acids // Liquid Crystals 2003 - V 30 № 9 - P 1057-1074

94. Воробьев Е.А., Нечипуренко Ю.Д., Салянов В.И., Евдокимов Ю.М. Описание связывания хитозана с ДНК при разных ионных силах в рамках теории ионной конденсации и теории адсорбции // Биофизика. 2007. - Т. 52. № 4. - С. 636-642

95. Kruif К., Weinbreck F., Vries R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Lecture notes, NIZO food research BV, Ede Van 't Hoff Laboratory The Netherlands: Utrecht University. Wageningen University, 2004. - 77 p.

96. Travel M.N., Domard A. Relation between the physico-chcmical characteristics of collagen and its interactions with chitosan. Part I // Biomaterials. 1993. - V. 14. №12. - P. 930938

97. Travel M.N., Domard A. Collagen and its interaction with chitosan. II. Influence of the physicochemical characteristics of collagen // Biomaterials. 1995. - V. 16. №11. - P. 865-871

98. Braudo E. E., Plashchina I. G., Schwenke K. D. Plant protein interactions with polysaccharides and their influence on legume protein functionality A Review. // Nahrung/Food. -2001. V. 45. № 6. - P 382-384

99. Shen F., Cui Y.L., Yang L.F., Yao K.D., Dong X.H., Jia W.Y., Shi H.D. A study on the fabrication of porous chitosan/gelatin network scaffold for tissue engineering // Polym. Int. -2000. V. 49. № 12. - P. 1596-1599

100. Mao J.S., Zhao L.G., Yin Y.J., Yao K.D. Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds // Biomaterials. 2003. - V.24. - P. 1067-1074

101. Zhang L., Ao Q., Wang A., Lu G., Kong L., Gong Y., Zhao N., Zhang X. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. // J. Biomed. Mater. Res. A. -2006. V.77. №2. - P.277-84

102. Tanabe Т., Okitsu N., Tachibana A., Yamauchi K. Preparation and characterization of keratin-chitosan composite film // Biomaterials. 2002. - V.23. - P. 817-825

103. Qaqish R.B., Amiji M.M. Synthesis of a fluorescent chitosan derivative and its application for the study of chitosan-mucin interaction // Carbohydr. Polym. 1999. - V.38. - P.99-107

104. Beeley J.G. Glycoprotein and proteoglycan techniques. (Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology; v. 16. / Eds. RH.Burdon, P.H.van Knippenberg. Amsterdam - New-York - Oxford: Elsevier, 1985. - p. 16-18

105. Perez-Gramatges A., Argelles-Monal W., Peniche-Covas C. Thermodynamics of complex formation of polyacrylic acid with poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) and chitosan. // Polym. Bull. 1996,- V.37.- P. 127-134

106. Budd P.M., Ricardo N., Jafar J.J., Stephenson В., Hughes R. Zeolite/Polyelectrolyte Multilayer Pervaporation Membranes for Enhanced Reaction Yield // Ind. Eng. Chem. Res. 2004. -V.43. №8.-P. 1863-1867

107. Peniche C., Elvira C., San Roman J. Interpolymer complexes of chitosan and polymethacrylic derivatives of salicylic acid: preparation, characterization and modification by thermal treatment // Polymer. 1998. - V.39. - P. 6549-6554

108. Betigeri S.S., Neau S.H. Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads // Biomaterials. 2002. - V.23. №17. - P. 3627-3636

109. Alsarraa I.A., Betigeria S.S., Zhanga H., Evansb B.A., Neau S.H. Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Biomaterials. -2002. V.23. № 17. - P. 3637-3644

110. Yoshizawa Т., Shin-ya Y., Hong K.J., Kajiuchi T. pH- and temperature-sensitive permeation through polyelectrolyte complex films composed of chitosan and polyalkyleneoxide-maleic acid copolymer // J. Membr. Sci. 2004. - V. 241. №2. - P. 347-354

111. Chavasit V., Kienzle-Sterzer C., Torres J.A. Formation and characterization of an insoluble polyelectrolyte complex: chitosan-polyacrylic acid // Polym. Bull. 1988. - V. 19. -P.223-230

112. Скорикова E.E., Вихорева Г.А., Калюжная Р.И., Зезин А.Б., Гальбрайх JT.C., Кабанов В.А. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана // Высокомолек.соед. -1988.-Т.30 (А). №1.-С. 44-49

113. Wang Н., Li W., Lu Yu., Wang Zh, Zhong W. Studies on chitosan and poly(acrylic acid) interpolymer complex. II. Solution behaviors of the mixture of water-soluble chitosan and poly(acrylic acid)//J. Appl. Polym. Sci. 1996. - V. 61. -P.2221-2224

114. Crescenzi V., Paradossi G., Desideri P , Dentini M., Cavalieri F., Honici E., Lisi R. New hydrogels based on carbohydrate and on carbohydrate-synthetic polymer networks // Polym. Gels Networks. 1997. - V.5 - P. 225-239

115. Staikos G., Tsitsilmns C. Viscometric investigation of the poly(acrylic acid)-polyacrylamide interpolymer association // J. Appl. Polym. Sci. 1991. - V 42. № 3. - P.867-872

116. Torrado S.;Prada P.;de la Torre P.M.;Torrado S. Chitosan-poly(aerylic) acid polyionic complex: in vivo study to demonstrate prolonged gastric retention // Biomaterials 2004 - V. 25. № 5. - P 917-923

117. Hoffmann H., Kastner U, Donges R., Ehrel R. Gels from modified hydroxyethyl celluiose and ionic surfactants // Polym. Gels Networks. 1996 - V.4 - P. 509-526

118. Kobayashi K., Tsuchida A., Usui T, Akaike T. A new type of artificial glycoconjugate polymer: a convenient synthesis and its interaction with lectins // Macromolecules. 1997. - V.30. - P.2016-2020

119. Cerrai P., Guerra G.D. Tricoli M., Maltinti S., Barbani N, Petarca L. Polyelectrolyte complexes obtained by radical polymerization in the presence of chitosan. // Macromol. chem. phys. 1996. - V. 197. - P. 3567-3579

120. Beiger J., Reist M., Mayer J.M, Felt O., Gurny R. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications // Eur J Pharm.Biopharm. 2004. - V.57. - P. 35-52

121. Ильина A.B., Варламов В.П., Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана (обзор) // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. - Т.41. №1. -С.9-16

122. Conix A., Smets G. Ring Opening in Lactam Polymers // J. Polymer Sci. 1955. - V. 15. №79.-P. 221-229

123. Fehervarl F., Azorl M., Foldes-Berezsnich Т., Tudos F. Analysis of the role of complex in the alternating copolymerization of N-vinvlpyrrolidone and maleic anhydride // Polym. Bull. 1987. - V. 18. - P. 225-232

124. Смирнов А.И. Чередующаяся сополимернзация простых виниловых эфиров с производными малеиновой кислоты: Автореф. дис. . канд. хим. наук. М., МГУ, 1979. 20 с

125. Березин Б.Б., Самойлова Н.А., Тихонов В.Е., Ямсков И.А. Хроматографические методы выделения лектина из зародышей пшеницы // Прикл. биохимия и микробиол. 1993. -Т. 29. №. 4.-С. 632-638

126. Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. Dynamic surface tension and dilational viscoelasticity of adsorption layers of a hydrophobically modified chitosan // Colloids Surf. A -2005 V. 255. № (1-3). - P. 119-130

127. Chaplin M.F. Monosaccharides. In: Carbohydrate analysis: a practical approach / Eds. M.F.Chaplin, J.F.Kennedy. Oxford Washington DC. IRL PRESS, 1986. - p. 4-5

128. Шеллард Э. Количественная хроматография на бумаге и в тонком слое. М.: Мир, 1971,- 192 с.

129. Lookhart G.L., Jones B.L., Cooper D.B., Hall S.B. A method for hydrolyzing and determining the amino acid compositions of picomole quantities of proteins in less than 3 hours // J. Biochem. Biophys. Methods. 1982. V. 7. № 1. - P. 15-23

130. Шалкаускас M., Вашкялис А. Химическая модификация пластмасс. JI.: Химия, 1985.- 144 с.

131. Доброва Н.Б., Новикова С.П., Устройство для исследования тромборезистентных свойств материалов. Авт свид-во № 1799, 1996, РФ

132. Тенфорд Ч. Физическая химия полимеров. Пер. с англ./ Под ред. Слонимского Г.Л. М.: Химия - 1965. - 772 с.

133. Rios Н., Gargallo R., Radic D. Properties of polyelectrolytes: Maleic acid-vinylpyrrolidone copolymers—2. Potentiometric behaviour in dilute solution // Eur. Polym. J. -1985. V.21. №12. - P. 1045-1049

134. Мищенко В.Ф., Зубов В.А., Евдокимов В.А. Синтез и свойства гидролизованных полимеров малеинового ангидрида // Высокомолек. соед. 1983. - Т.25 (А). №9. - С. 19341937

135. Варфоломеев С.Д., Гуревич К Г. Биокинетика. Практический курс. М.: Фаир-Пресс, 1999.-720с.

136. Варфоломеев С Д., Зайцев С.В Кинетические методы в биохимических исследованиях. — М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1982 345с.

137. Неппер Д. Стабилизация коллоидных дисперсий полимерами: Пер. с англ. М.: Мир, 1986. - 488 с

138. Вайнерман Е.С., Гринберг В.Я., Толстогузов В.Б. Применение методатурбидиметрии для исследования комплексной коацервации в системе желатина-альгинат натрия вода // Изв. АН СССР, Сер. хим. 1973 - Т. 1 - С. 198-199

139. Казицына JLA , Куплетская Н.Б. Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии: Учеб. пособие для вузов. М.: Высшая школа, 1971. - 246 с.

140. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Высшая школа, 1981. - 156 с.

141. Goldstein I.J., Poretz R.D in: The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / Eds. Liener I.E., Sharon N., Goldstein I.J. N. Y.: Academic Press, 1986. -P. 103-115

142. Bloch R., Burger M.M. Purification of wheat germ agglutinin using affinity chromatography on chitin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. - V. 58. № 1. - P. 13-19.

143. Borrebaeck C., Mattiasson B. Lectin-carbohydrate interactions studied by a competitive enzyme inhibition assay // Anal. Biochem. 1980. - V. 107. № 2. - P. 446-456

144. Lis H , Sharon N. in. The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / Eds Liener I.E., Sharon N., Goldstein I.J. N. Y.: Academic Press, 1986. - P. 294353

145. Березин Б.Б., Лахтин В.М., Геворкян Р.Г., Ямсков И.А., Даванков В.А. Хроматографические методы получения лектинов на сорбентах на основе сферона // Уч. зап. Тартусского ун-та. 1989. № 869. С. 101-105

146. Биосовместимость / Под ред. В.И.Севастьянова М.: ИЦ ВНИИгеосистем, 1999. -368 с.

147. Биополимеры / Под ред. Ю.Иманиси М.: Мир, 1988 - 544с.

148. Штильман М.И. Полимеры Медико-биологического назначения. М.: Академкнига, 2006. - 400 с.

149. Платэ Н.А., Валуев Л.И. Проблемы создания биоспецифических синтетических материалов для контакта с биологическими средами // ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1985. -Т. 30. №4 -С. 402-410

150. Новикова С П Пути повышения тромборезистентности биоматериалов. В кн.: Биологические протезы артерий / Под ред Л.С.Барбараш, А.С Криковцов, И.Ю.Журавлева. -Кемерово: Кемеровский полиграфкомбинат, 1996.-С 151-171

151. Chupa J.M., Foster А М , Sumner S R, Madihally S.V., Matthew H.W.T. Vascular cell responses to polysaccharide materials: in vitro and in vivo evaluations //Biomaterials - 2000 -V. 21. №22.-P. 2315-2322

152. Boura С , Menu P., Payan E, Picart C., Voegel J.C , Muller S., Stoltz J.F. Endothelial cells grown on thin polyelectrolyte mutlilayered films:an evaluation of a new versatile surface modification // Biomaterials. 2003. - V.24. - P. 3521-3530

153. Werner C., Konig U., Augsburg A., Arnhold C., Korber H., Zimmermann R.,

154. Jacobasch ll.-J. Electrokinetic surface characterization of biomedical polymers — a survey // Colloids Surf. A. Physicochemical and Engineering Aspects. 1999. - V. 159. № 2-3. - P. 519-529

155. Кудинов С.А., Мацуй СП, Бабенко ИМ, Лопато С.В., Самойлова Н.А., Андреев С.М., Рогожин С.В., Давидович Ю А, Терехов Н Т., Лобунец К А., Лопата А.К., Способ получения плазминогена Авт свид-во № 1069222 - 1983, СССР

156. McClung W.G., Clapper D.L., Ни S.-P., Brash J L. Lysine-derivatized polyurethane as a clot lysing surface: conversion of adsorbed plasminogen to plasmin and clot lysis in vitro // Biomaterials. 2001. - V. 22. - P. 1919-1924

157. Титова Е.Ф., Белавцева E.M., Гамзазаде А.И., Скляр A.M., Павлова С.А., Рогожин С.В. Изучение структурообразования хитозана в растворах методом электронной микроскопии // Acta Polymerica. 1986. - V. 37. № 2. - P. 121-124

158. Surface and interfacial aspects of biomedical polymers / Ed. J.D.Andrade. N.Y.: London: Plenum Press - 1985 - vol.2. - 347 p.

159. Rudee M.L., Price T.M. The initial stages of adsorption of plasma derived proteins onartificial surfaces in a controlled flow environment // J Biomed Mater. Res. 1985. - V. 19. - P. 57-66.f?

160. Новикова С.П. в кн.: Биопротезы клапанов сердца. Проблемы и перспективы / Под ред. Л.С.Барбараш, Н.А.Барбараш, И.ГО.Журавлева. Кемерово: Кемеровский полиграфкомбинат. - 1995 - с.266-288

161. Unsworth L.D., Tun Z., Sheardown П., Brash J.L. Chemisorption of thiolated poly(ethylene oxide) to gold: surface chain densities measured by ellipsometry and neutron reflectometry // J. Colloid Interface Sci. 2005 - V.281.-P.112-12!

162. Севастьянов В.И., Беломестная З.М., Дубовия Т.И., Петров М.В. О предварительной оценке тромборезистентности полимерных материалов // Высокомолек. соед,- 1981. Т.23. №8. - С. 1864-1867

163. Сборник методических рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью / Под.ред. Добровой НБ., Носковой Т.П., Новиковой С П. Москва, 1990. - 70с.

164. Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания. М.: Медицина. - 1975. - 488 с.

165. McClung W.G., Clapper D.L., Ни S.-P., Brash J.L. Adsorption of plasminogen from human plasma to lysine-containing surfaces. // J. Biomed. Mater. Res. 2000. - V. 49. - P. 409414

166. Warkentin P.H., Johansen K, Brash J.L., Lundstrom 1. Selective plasminogen binding: Cysteinyl-Iysine-dextran protein interactions.// J. Colloid Interface Sci. 1998. - V. 199. - P. 131139