Полимерные плёнки на основе поли(D,L-лактида) для культивирования клеток кожи тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукипис и

0м/

ШВЕД Юлия Александровна

ПОЛИМЕРНЫЕ ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ ПОЛИр,Ь-ЛАКТИДА) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК КОЖИ

02 00 06 - Высокомолекулярные соединения 03 00 25 - Гистология, цитологич, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2007

003071323

Работа выполнена на кафедре химии высокомолекулярных соединений химическ ого факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в Отделе клеточных культур Института Цитологии РАН

Научные руководители доктор химических наук, профессор

Бнлибпн Александр Юрьевич доктор биологических наук, профессор Пинаев Георгий Петрович

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Власов Геннадий Петрович доктор биологических наук, профессор Харазова Алла Давыдовна

Ведущая оргавшзация Институт бнооргаиической химии

им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

Защита состоится "31" мая 2007 г в 15 часоь на заседании диссертационною совета Д 212 232 28 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора химических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199004, Санкт-Петербург, Средний пр , д 41/43

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Iосуииверситета (Санкт-Петербург, Университетская наб , д 7/9)

Автореферат разослтн " " апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совет? .* / /А Ф Хлебников/

Общая характеристика работы

Актуальность пуобчечы Разработка технологий лечения поврежденных органов и тканей путем введения в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток является перспективным направлением современной регенеративной медицины Восстановление целостности поврежденной ткани требует создания нормального микроокружения для культивируемых и трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и восстановлению с их помощью структур поврежденной ткани В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса Эти белки и в частности коллаген, используют при культивировании клеток и при создании клеточных продуктов для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента При переносе клеточных пластов из культуральных сосудов на раны возникают, однако, проблемы нарушения их пространственной организации и функциональньк свойств Они связаны, прежде всего, с неизбежным частичеым повреждением клеток в результате их ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют, что приводит к недостаточной механической прочности клеточных ассоциаций и утере поверхностных рецепторов

В настоящее время сформировалась новзя междисциплинарная область науки -тканевая инженерия, которая включает в себя как принципы и методы инженерии, химии, физики, так и клеточной биологии В основе тканевой инженерии лежит культивирование клеток на биорезорбируемых полимерных матрицах, реализующееся в формировании интегрированных клеточных систем в форме ткани или органа, которые могут быть использованы для пересадки пациенту взамен поврежденных или утраченных Использование полимеров позволяет обеспечить сохранение исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клетки при создании клеточных продуктов и их трансплантации В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, а именно, нетоксичность, цито- и биосовместимость, простота изготовления полимерных изделий и их достаточная механическая прочность, а также способность полимера резорбировать в процессе восстановлении структуры ткани Размножение и рост клеток на полимерных матрицах с разной пространственной организацией может способствовать формированию структурной основы дифференцирующихся тканей

Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности поврежденных кожных покровов, возникающих в результате ожогов, трофических язв и повреждений другого рода Для этой цели выращенный m vitro клеточный пласт эпителиальных клеток - кератиноцитов должен быть перенесен на пораженный участок кожи Не смотря на большой спектр матриц на основе биодеградируемых синтетических полимеров, предназначенных для культивирования различных типов клеток, для кератиноцитов, обладающих повышенной чувствительностью к субстрату, предложенные матрицы по своему составу и свойствам не подходят для этой цели В тоже время трансплантация клеток кожи уже в настоящее время имеет клиническое применение и поэтому разработка подобных матриц является важной задачей не только с точки зрения фундаментальных исследований взаимодействия клеток с полимером, но и представляет насущный практический интерес использования полученных композиций в клинике

Культивирование кератиноцитов на полимерных матрицах с последующей трансплантацией сформировавшегося клеточного пласта вместе с такой матрицей в

организм даст возможность исключить процедуру обработки клеток, выращиваемых по известным технологиям, прошолитическими ферментами и ускорить процесс заживления ран

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в рамках темы «Полимерные пленки на основе поли(0,Ь-лактида) для культивирования клеток кожи человека» при поддержке гранта Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической сфере (договор № 45/06 от 24 мая 2006) и в Институте цитологии РАН

1(е.и,и> диссертационной работы является изучение возможности формирования биодеградируемых полимерных пленок на основе поли(0,Ь-лактвда), предназначенных для культивирования и трансплантации эпителиальных клеток кожи

Эта цель достигалась решением следующих задач

1 Отработка оптимальных условии синтеза поли(В,Ь-лакгида) как основного полимера дня формирования пленок

2 Отработка методики формирования полимерных пленок на основе поли(В,Ь-лзктида) различной толщины

3 Исследование скорости деградации пленок в условиях культивирования клеток и в ор1 анизме

4 Формирование полилакгидных пленок с нанесенным на их поверхность коллагеном в разных формах (молекулярной и фибриллярной)

5 Формирование структурированных пленок на основе смеси поли(В,Ь-лактида) и пол иэт4 шенгл иколя

6 Формирование пленок с повышенной основностью и гидрофильностью поверхности

7 Исследование адгезии и пролиферации фибробластов и кератиноцитов на модифицированных пленках

Критерием Качества модифицированной поверхности по отношению к культивируемым клеткам служило количество прикрепившихся клеток за единицу времени и степень их «распластывания» - чем более благоприятна поверхность по отношению к клетке, тем больше поверхность контакта клетки с поверхность

Научная починки Впервые для формирования многослойного пласта кератиноцитов были использованы пленки на основе аморфного поли(В,Ь-лактида), прикрепленные к поверхности покровного стекла Такой способ позволяет отделить пленку со сформированным клеточным пластом от подложки и перенести его на рану даже при толщине пленки 5 мкм

Показано, что решающим фактором, влияющим на прикрепление и распластывание кератиноцитов при модификации полилактидной матрицы коллагеном, является структура белка Фибриллярная структура коллагена способствует пролиферации кератиноцитов Впервые разработаны условия, при которых фибриллизация коллагена осуществляется в момент нанесения коллагена в молекулярной форме на поверхность полилактидной пленки, что позволяет достичь равномерного распределения фибрилл коллагена на поверхности

Впервые для модификации полимерной матрицы был использован лизин Показано, что такая обработка способствует распластыванию кератиноцитов

Практическая ценность Сформированный клеточный продукт, который состоит из выращенного на биодеградируемои полилактидной матрице многослойного пласта кератиноцитов, может быть использован для трансплантации на поврежденный участок кожно! о покрова

Предложенные методы модификации поверхности полилактидной матрицы, предназначенной для культивирования кератиноцитов, могут быть использованы и для других полимеров медико-биологического назначения В частности разработанные

методы модификации могут быть применены в процессе разработки трехмерных пористых полимерных матриц Такие матрицы позволят создать в искусственных условиях для культивирования клеток микроокружение, максимально приближенное к условиям их размножения в организме

Поюусепия, выносимые на защиту;

1. Отработка условий синтеза поли(0,Ь~лактида) на цинк-содержащих катализаторах с молекулярной массой 150000, который может быть использован для формирования пленок После инкубирования пленок в питательной среде в течение 3 недель они остаются достаточно прочными и могут быть использованы для трансплантации многослойного пласта кератиноцитов

2 Формирование тонких пленок, на основе поли(0,Ь-лактида), позволяющие проводить прижизненное наблюдение за поведением клеток

3 Предложенные способы модификации различными структурными формами коллагена позволяют улучшить свойства поверхности полилактидной пленки Структура коллагена и равномерность его распределения на поверхности оказывают влияние на поведение кератиноцитов

4. Отработка способов получения гидрофилизованных пленок полнлактида с пористой морфологией поверхности смешением полипактида с полиэтиленгликолем и его последующим вымыванием

5. Обработка полилактидных пленок лизином увеличивает количество адгезированных клеток и степень их распластанности

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 2 статьи Результаты исследования представлены на J научной сессии >пцл (^..dHKi-iieiepoypr. 2/, zs нояоря,

2004), международном симпозиуме «Сгволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», (Санкт-Петербург, 25-27 октября 2004 г), С-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 1-3 февраля 2005 г), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г), 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005 г), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005), European Polymer Congiess (Moscow, June 27-29,

2005), International conferencc "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (Jerevan Republic Armenia July 12-14, 2005), International bymposium"Biomaterials" (Hamburg October 1- 4, 2006), Meждvнapoднaя конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург 17-19 октября, 2006)

Структура и объем работы Работа изюжена на 163 страницах и включает список литературы, который содержит 207 наименовании

Во введении обоснована актуальность проблемы использования биодеградируемых полимеров для культивирования клеток и с формулированы основные цели Первая глава содержит обзор современных представлений о различных классах полимеров, используемых для медико-биологических целей Описаны различные подходы по созданию полимерных матриц, предназначенных для кульгивироьания клеток, а также подробно изложены методы модификации полимерных матриц Рассмотрено строение кожи и возможные способы восстановления ее повреждений Во второй главе описаны

основные объекты и методы исследования Третья глава содержит экспериментальные результаты В четвертой главе проведено обсуждение результатов и отражены основные выводы работы Работа заканчивается списком цитируемой литературы

Содержание работы

1. Синтез по1и(РХ-1актида)

Поскольку полимерная пленка, предназначенная для культивирования и трансплантации кератиноцитов, должна резорбяровать в течение 1 месяца, то для формирования пленок был использован аморфный поли(В,Ь-лактид) По предварительно оптимизированной известной методике на основе циклического димера молочной кислоты - лактида в присутствии катализатора - лактата цинка был синтезирован полиф.Ь-лактид) с молекулярной массой 150000

2. Формирование пошюктндных п.и'нок и исстедование скорости их деградации в условиях культивировании меток

Полилактидные пленки были получены методом полива из раствора в хлористом метилене После испарения растворителя пленки отделялись от фторопластовой подложки В зависимости от концентрации полилактида, толщина полученных пленок составила 20, 30, 50 и 100 мкм

Одним из требовании, предъявляемых к полилактидным пленкам, предназначенным дня культивирования кератиношпов и последующей их трансплантации на рану, является их достаточная прочность после формирования клеточного пласта (3 недели) Поэтому полученные пленки, толщиной 20 и 100 мкм, выдерживали в течение месяца в питательной среде в присутствии и отсутствии сыворотки, а также в чистом фосфатном буфере Скорость деградации полилактидных пленок оценивали по убыли массы пленок после каждых 10 дней инкубирования В качестве контроля были выбраны пленки, инкубированные в водной среде

Наименьшая убыль массы пленок наблюдается в питательной среде Вероятно, это связано с частичной сорбцией компонентов питательной среды на поверхность полилактиднои пленки

В течение 3 недель, все пленки сохраняли необходимую для переноса клеточных пластов прочность, а по истечении 1 месяца становились хрупкими и ломкими

Ьыло отмечено, что даже после 1 суток выдерживания пленок в любой жидкой среде они становились мутными и рельефными Так как для проведения прижизненного наблюдения под инвертированным микроскопом, за процессами прикрепления, распластывания и размножения клеток на исследуемой поверхности, необходимым свойством пленок является их прозрачность, использование таких пленок для этой цели было невозможным В процессе исследования также было отмечено, что чем толще пленка, тем быстрее она мутнеет Поэтому возникла необходимость получения тонких не мутнеющих полилактидных пленок

Тонкие пленки, толщиной 5 мкм, были получены при нанесении раствора на покровное стекло, прикрепленное к вращающейся подложке со скоростью 3000 об/мин Путем подбора концентрации и объема раствора удалось получить тонкие, не мутнеющие

в жидкой среде и не деформирующиеся в течение 3 недель полилактидные пленки Дальнейшие исследования проводили на пленках полученных таким способом и прикрепленных к покровному стеклу

3, Оценка скорости деградации пленки и токсичности обра п'емых продуктов

ю vivo

Для исследования возможного токсического влияния продуктов деградации ноли(0,Ь-лактида) на окружающие ткани, пленки толщиной 20 мкм, после предварительной стерилизации, трансплантировали под кожу крысам По истечении 1, 2 и 3 недель содержания полилактидных пленок в организме проводили гистологические исследования блоптатов Присутствие поли(П,Ь-лактида) в тканях наблюдали поспе 1 и 2 недель После 3 недель пленка полностью резорбировала в организме, причем патогенного влияния продуктов деградации пслилактида на окружающие ткапи не обнаружено

Пленка толщиной 5 мкм, также трансплантированная под кожу крысам, полностью резорбировала уже после 1 недели

4 Выдечение. ку ¡ьтипирппание и ашчт состояния клеток конец

Нормальные кератиноциты и фибробласты человека бытш получены из кожи здоровых взрослых доноров, подвергшихся косметической операции Выделение кератиноцитов проводили путем последова гельной ферментативной обработки фрагментов ткани раствором диспазы для отделения эпидермиса от дермы и коллагеназой для выделения базальных кератиноцитов Фибробласты были получены путем спонтанной миграции клеток из целых фрагментов кожи в процессе культивирования

Фибробластоы культивировали в среде DMEM (LHilbecco Modified Fagle Medium), a кератиноциты в смеси сред DMbM и И2 (3 1) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скога в С02 - инкубаторе при температуре 37"С Питательную среду меняли каждые 3 дня

Влияние поверхности на процесс взаимодействия клеток с подложкой оценивали по степени адгезии и распластывания клеток на субстрате с помощью инвертированного микроскопа и методом сканирующей электронной микроскопии Морфологию и поведение распластанных клеток анализировали, наблюдая за характером пространственной организации окрашенного Родамин-фаллоидином структур актинового цитоскелета, методом лазерной конфокальной иммуннофлуоресцентной микроскопии

5 В тяние усювий получении по чи черных пленок па свойства поверхности

В качестве субстрата, предназначенного для нанесения раствора поли(0,Ь-лактида), были использованы покровные стекла с гидрофильной (необработанной) и гидрофобной (силиконизированнои) поверхностью Равномерное распределение полилактида на обоих типах стекол наблюдали при использовании хлористого метилена в качестве растворителя При нанесении раствора полилактида в более полярном, хорошо удерживающем воду растворителе - ацетоне на гидрофобную поверхность стекла, полимер распределялся неравномерно, а при нанесении на гидрофильную - равномерно Гидрофильность поверхности пленок определяли по значениям угла смачивания, измеренного с помощью метода пласгинок Вильгельми Наименьшим углом смачивания,

7

т.е. наиболее гидрофильной поверхностью, обладали пленки, полученные, из ацетона на необработанном стекле. Значения углов смачивания для пленок т хлористого метилена были несколько выше (таблица).

Та&шцл Значения угяов смачивания

Образцы Угол омачивания 0

Покровное слекло f>2±4'J

Гнщрофобизиро ванное покровное стекло [ 04±4°

Покровное стекло, покрытое Ш1 из раствора в ацетоне 78±4°

Гидрофобизированное покровное стекло, покрытое ПЛ и! раствора д ;нк'к:;:е SK±4"

Покровное стекло, покрытое ПЛ из раствори в хлористом метилене 84Ы"

Гидрофоби л!рованнов покровное стекло. покрьп"ОС ПЛ из рае! вора в хлористом метилене 82±4"

Следующий этап работы состоял к исследовании влияния условий формирования плёнок из поли(Г)Х-лактида) на адгезию и пролиферацию клеток. В качестве контрольной поверхности использовали покровные стекла. Несмотря на то, что разрабатываемая г юл ила к гид пая плёнка, предназначалась для культивирования кератиноцитов, первоначально было проведено исследование поведения па поверхности подилактидион плёнки фибробластов - клеток кожи, менее требовательных к условиям культивирован ля, в частности, к свойствам субстрата.

При культивировании фибробластов на полимерных матрицах, полученных из разных раствори гелей, токсического влияния ни полимера, ни растворителей па жизнеспособность клеток обнаружено не было.

Различия в способности фибробластов прикрепляться к исследованным субстратам соответствовал« значениям степени гидрофилъности поверхности пшшлактидных плёнок, определенным по углу Смачивания. Количество фибробластов адгезировавших к полилактидной плёнке, полученной из раствора в ацетоне, было выше, но незначительно, сравнительно с количеством клеток, прикрепленных к полимерным плёнкам, полученным из раствора в хлористом метилене (рис.1 >.

Рис. I. Зависимость прикрепления фибробластов к полимерной пдёйке от способа её получения через 20, 40и:ш Шиин.

К контроль (гидрофильное покровное стекло?, А-Фл - плёнка и) ПЛ. полу чинная из раствора в .щегоне на гидрофильном стекле, А-Фб - пленка и^ Щ1, полученная m i раствора в пистоне на гидрофобном стекле; Х-Фл - плёнка ш ПЛ. полученная из раствора в хлористом метилене ни гидрофильном tie tie; Х-Фб л ленка Hi Г1Л. полученная нт раствора в хлористом метилене на гидрофобном стекле.

При нанесении кератиноцитов - клеток, более требовательных к субстрату, по сравнению с фибробластами, на поверхность полилактидных пленок оказалось, что они не адгезировали к пленкам, полученных как из раствора в хлористом метилене, так и в ацетоне Таким образом, незначительное повышение гидрофильности пленок, за счет использования ацетона в качестве растворителя, явилось недостаточным для адгезии кератиноцитов к поверхности полимерной матрицы Из этих результатов следовала необходимость проведения дальнейшей модификации поверхности полилактидной пленки

В последующих исследованиях были использованы пленки, полученные из хлористого метилена Такой выбор был обусловлен следующими соображениями трудностью контролировать содержание воды в пленках, полученных из растворов полимера в ацетоне, более равномерное распределение полимера в пленках из хлористого метилена и сравнительно низкая температура кипения хлористого метилена, позволяющая полностью удалить растворитель из пленки

6 Модификация поясрхпоспш поттктидичи пленки копагепом

Для повышения биосовместимосги поверхности полилактидных пленок их модифицировали коллагеном I типа Являясь основным белком внеклето шого матрикса, коллаген часто используется для этой цели при культивировании клеток

Колла1ен получали путем кислой экстракции из сухожилий крысиных хвостов Выделенный таким образом коллаген в молекулярной форме наносили общепринятым способом на поверхность полилактидной пленки из 0 1 м раствора уксусной кислогы Количественное содержание коллагена в растворе определяли методом Лоури

Для того чтобы установить максимальное количество коллагена, способного распределиться на исследуемой поверхности, были проведены теоретические расчеты количественного содержания коллагена на единице площади поверхности при условии ее полного покрытия коллагеном Молекула коллагена представляет собой жесткий стержень, поэтому число возможных конформаций молекулы и расположение на поверхности ограничено (рис 2)

К —л^* Рис. 2 Мокты котчгена на п югкой поверхности

Исходя из предположения, что молечула взаимодействует с поверхностью по всей своей длине, была рассчитана сорбциоьная емкость, которая составила 0 13 мкг/см2 Экспериментально полученная первоначально величина сорбционной емкости полилактидной пленки после инкубирования ее в растворе коллагена с концентрацией О 02 мг/мл составила всего лишь 0 08 мкг/см~ (рис 3), из чего следовало, что на практике коллаген не покрывает всей поверхности пленки

О-

00

/У

/ Г* ------ ИК1ГДКТК4Й Л Л

// т П( ГнДц*Пи1* ¡С вЛ

гонт * М (С-П 1

Рис. 3 .1 Осорбция кол :ассн,1 но полимерные матрицы;

-■—гюсл* гиролиаз (С-0.4&М) й - прчлс гндррлии ¡С О ,и)

а - раствор коллагена с концентрацией 0.02 иг/мл; раствор коллагена

концентрацией 0 05 мг'мл.

Действительно, нанесение кол ля гена способствовало увеличению количества ажезированных клеток, и степени их раепластанносш. При этом, однако, клетки располагаются на поверхности пленки неравномерно.

Очевидно, что такое прикрепление кератиноцитов к поверхности может зависеть от равномерности распределения коллагена на поверхности. С целью получения равномерно покрытых коллагеном поверхностей полилактидной пленки было проверено несколько способов нанесения коллагена.

Для увеличения сорбционной ёмкости поверхности полилактидной матрицы были использованы два подхода, которые заключались в проведении предварительной» щелочного гидролиза поверхности пленки и в увеличении концентрации наносимою раствора белка. От первого подхода пришлось отказать'.;«. Несмотря на то, что за счёт электростатических взаимодействий количество сорбированного коллагена на полилактидной поверхности действительно увеличивается, даже кратковременная обработка щелочным раствором низкой концентрации приводило к частичному гидролизу полимера, и соответственно к ухудшению механических свойств полилактидной матрицы. Другой подход, который заключался в увеличении концентрации наносимого раствора коллагена, позволил получить величину сорбционной ёмкости, даже превышающую теоретически рассчитанную, которая составила 0,4 мкг/см Для того, чтобы обеспечить максимальное покрытие поверхности, модификацию полилактидной плёнки проводили в дальнейшем путём нанесения раствора коллагена с большей концентрацией равной 0,1мт.'мл. Для исследования влияния модификации плёнок кол лаге новым покрытием на них в течение I недели культивировали кератиноциты. Морфология клеток на исследуемых субстратах была охарактеризована электронной микроскопии (рис.4).

Рис.4 Сканирующая электронпая микрискнтт керами ноиитов кожи человека после I недели культивирования.

а, б - ксратикОДВты на

полимере; в, г - кератиноциты на полимере, покрытом коллагеном.

В отличие от общепринятого способа нанесения коллагена на поверхность, а именно, выдерживания плёнок в растворе коллагена с концентрацией 0.1 мг/мл в течение 30 млн с последующей промывкой раствором фосфатного буфера (способ I), но втором случае на поверхность плёнки равномерно накосился фиксированный объём раствора коллагена с концентрацией 0.1 мг/мл и плёнки высушивали при комнатной температуре в течение ! суток - способ 2, 1Ï обоих случаях исследуемая поверхности была покрыта коллагеном в молекулярной форме. Второй способ позволяет получить более равномерным распределением коллагена на поверхности. Трёхкратное нанесение раствора коллагена способом t, чередующееся промыванием раствором фосфатного буфера, также способствует равномерному распределению коллагена на поверхности полилактидноЙ плёнки - способ 3,

Поскольку в организме коллаген находится в фибриллярной форме, целесообразно было модифицировать поверхность, предназначенную для культивирования клеток, фибриллярным коллагеном. Увеличение концентрации раствора коллагена до 2 мг/мл, а также переведение его в нейтральную среду, способствует формированию фибрилл. Нейтрализацию кислоты проводили путём добавления раствора гидрофосфата натрия и наносили раствор коллагена на поверхность полимера. После этого плёнки с нанесённым коллагеном выдерживали в атмосфере аммиака В этом случае фибр ил л образован не коллагена завершается уже непосредственно на поверхности плёнки. Такой способ позволил получить равномерное распределение коллагенов ых фибрилл на поверхности -способ 4.

Структуру нанесённого коллагена и его распределение на поверхности полилактидноЙ плёнки оценивали методом иммуннофлуоресцентной микроскопии после окраски препаратов специфическими антителами на коллаген (рис.5) и с помощью метода

Рйс.6 Атомно-сшювая микроскопия коллагенового покрытия.

а -- фибриллярный коллаген; 6- трёхкратное нансссние раствора

коллагена.

При культивировании кератиноцитов было показано, что структура коллаген оказывает влияние на распределение клеток на поверхности При модификации пленк молекулярным коллагеном выявляются одиночные клетки разной степей распластанности и обладающие хорошо развитым цитоскелетом, характерным дл дифференцированных кератиноцитов На поверхности же, модифицирование) фибриллярным коллагеном вдоль фибрилл располагаются вытянутые цепочки округлы клеток Цитоскелет в них распределяется циркулярными тяжами на периферии по клеточной мембраной Такое распределение цитоскелета характерно в большей степен для стволовых и транзиторных клеток Дифференцированные же кератиноцит! прикрепляются к фибриллярному коллагену в значительно меньшей степени И полученных данных следует, что покрытие пленки фибриллярным коллагеном в больше мере способствует размножению и росту популяции базальных кератиноцитов

7 Формирование пористых пленок па основе смеси погилактида и по чиэпшленгчико т

Для свободною доступа питательных веществ к клеткам и отвода продукте метаболизма матрица, предназначенная для культивирования клеток, должна быт пористой Размер пор для свободной циркуляции жидкой среды должен составлять мене 10 мкм Для формирования таких пленок в данной работе был использован мето/ основанный на фазовом разделении двух несовместимых полимеров с последующи! удалением одного из них селективным растворением

Образцы синтезированного поли(0,Ь-лактида) с молекулярной массой 15000С смешивали с полиэтиленгликолем (ПЭГ), с молекулярной массой 6000 и 15000 I качестве растворителя был использован хлористый метилен

Содержание ПЭГ в смеси составляло 10 и 30% Для контроля скорости растворени. ПЭГ и выхода его из смеси первоначально был использован метод, основанный н измерении массы пленки до и после выдерживания в воде Этот способ являете общепринятым при исследовании таких систем, как кристаллический поли(ЬХ лактид)/ПЭГ Однако при использовании синтезированного нами аморфного поли(Г),Ь-лактида) оказалось, что относительная потеря массы пленок до и после инкубации в вод. превышает первоначально введенное количество ПЭГ Поэтому параллельно измерении относительной потерн массы проводили независимое определение количественной содержания вышедшего из смеси и растворенного в воде ПЭГ Способность ПЭ1 образовывать окрашенные комплексы с иодом и хлоридом бария позволила провесп фотоколориметрнческое определение количества растворенного в воде ПЭГ Оказалось, что значения относительной потери массы пленки, превышают количество ПЭГ, растворенного в воде (рис 7)

Рис. 7. Зависимость убьин массы от времени выдерживания плёнок в воде.

—Ш— . убыль массы плёнки после вэвепшваяия (ПЛ/ ПЭГ' (6000)); -«- - фотометрическое определение ПЭГ в растворе (ПЛ/ ПЛ (6000)); - убыль массы пленки после взвешивания (ПЛ/ ПЭГ (15ШЮ)); —»— фотометрическое определение ПЭГ в рисгворе (ПЛ/ ПЭГ (15000)). а- 10 % ПЭГ.б -30% ПЭГ

Полученные результаты объясняются способностью смеси аморфного полн(П,1_,-яактида) и ПЭГ образовывать двухфазную систему. Причём каждая фаза содержит минорное содержание второго компонента. 13 процессе растворения ПЭГ в воде, вместе с ним в водную среду уходит частично растворённый в нём поли(0,Ь-лак-гид). Оставшаяся фаза поли(0,Ь-лактид) содержит минорное содержание ПЭГ, что было подтверждено данными ПМР-спектроскоп и и.

В процессе проведённых экспериментов было показано, что чем больше молекулярная масса ПЭГ, тем меньше его уходит из матрицы. Размер и распределение нор на поверхности исследуемых матриц исследовали с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (рис.8). При использовании ПЭГ с молекулярной массой 6000 были получены плёнки с размером пор, не превышающих 5 мкм.

Рис. Я Сканирующая электронная микроскопия полимерных образцов.

а-ШбЫса на основе смеси ПЛ/ПЭГ(60СЮ)-11)%; б-Плйнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (600(1)- .10%: я-Плбнка на основе смеси ПЛ/ЛЗГ( 15000)-10%; г-Плбнка нп основе смеснПЛ/ЛЭГ( 15000)- 30%; д Боковой сре s образца б.

Для исследования отсутствия токсического влияния остаточного содержания ! 1ЭГ на клетки, на полученных матрицах культивировали кератинрциты* Несмотря на го, что клетки иа исследуемых матрицах не погибали, их пролиферативная активность на

полученных матрицах уступала контролю (покровное стекло, покрытое коллагеном). Поэтому была проведена дополнительная обработка поверхности раствором коллагена.

Взаимодействие с подложкой и рост кератиноцитов на пористых пленках, модифицированных коллагеном, были сопоставимы с контролем (рис. 9).

Рис. 9 Культивирование первичных керапшноцпюв человека в течение 9 дней по полимерных подлож ках, покрытых растворам коялагена.Снаблюдеиме т>6 световым микроскопом) а - Пленка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000)-[0%; б -- Плёнка на основе смеси 1ИИ1ЭГ (6000>-30%; в - Пленка на оейове смеси ПЛ/ПЭГ( 15000)-10% г-Плёнка на основе смесн ПЛ/ПЭГ (150001-30%

8. Введениеаминог^пп на поверхность полилактидной плёнки

Внесение чужеродного белка, в частности коллагена, в организм человека может I вызывать отрицательную иммунную реакцию. Поэтому в некоторых случаях целесообразно использовать и другие методы модификации поверхности полимерной матрицы.

Для этой цели нами впервые была проведена обработка поверхности полилактидной I плёнки раствором лизина. Взаимодействие лизина с поверхностью ПОЛИЛ актИДНОЙ плёнки может происходить за счёт физической сорбции, образования водородных связей | аминогрупп лизина со сложноэфирными группами полилактида, реакции аминолиза с разрывом сложноэф ирной связи полилактида. Одна аминогруппа лизина связывается с поверхностью, а вторая остаётся свободной, что обеспечивает слабый положительный заряд поверхности плёнки. Поскольку клетка имеет отрицательный заряд, то за счёт электростатического взаимодействия увеличивается количество прикрепившихся к1 модифицированной поверхности пол ила к гид ной плёнки клеток.

Содержание аминогрупп на поверхности полилактидной плёнки контролировали' нингидринввым методом. Для этих целей полилактидные плёнки после обработки раствором лизина при нагревании (55Г'С) гидролизовали в течение 24 часов при !20"С в! растворе 6М соляной кислоты в запаянных ампулах. Показано, что наибольшее количеств лизина связывается с поверх и остью полилактидной плёнки в присутствии метанола! {рис. 10).

Рис, 10 Обработка раствором лизина при нагревании.

■ - вода,

тш ф вода г ИЗОПрОПКЛОБЫЙ спирт "I: lj

вода; этиловый спирт - 1:1.

—Т— - вола: метиловый спирт = 1:1.

Степень распластанности кератиноцитов, нанесенных на модифицированную пленку коррелирует с количеством лизина на ее поверхности (рис. 11).

яшвяшшшшшшяяшяшш

1 (б)

1 (д)

Рис. 11 Организация ФОяиновойо цишоскелета кератиноцитов на модифицированных и

немодифиц ированном субстратах,

а - полилактид без обработки, обработка лизином; б - в воде, в -смеси вода : шо при пило вый спирт ~ LI, г - смеси вода : "лиловый спирт ~ 1! I. д - смеси вода : метиловый спирт-];!.

Таким образом, поставленные задачи были выполнены. Получена модифицированная полилактпдпая плёнка, способствующая прикреплению и размножению кератиноцитов, которая в дальнейшем после доказательства её эффективности при заживлений ран на лабораторных животных может быть использована в клинике для лечения повреждения кожного покрова.

ВЫВОДЫ

!■ Разработаны бнодеграднруемые полимерные плёнки на основе полилактида, позволяющие культивировать на них кератиноциты человека и получать многослойные пласты клеток для последующей трансплантации без предварительной ферментативной обработки.

2. [> и осо вместимость полученных пленок, способствующая прикреплению и росту клеток, достигнута путем модификации их поверхности коллагеном [ типа или лизином.

3. Установлено, что структура и распределение па поверхности коллагена, зависящие от условий его нанесения, определяют поведение нанесенных клеток. Наилучшее действие па распределение кератиноцитов по поверхности пленки, их рост, морфологию п Пространстве няую организацию цитоскелета оказывает коллаген, нанесенный в фибриллярной форме.

4 Для улучшения взаимодействия клеток с окружающей средой при культивирован после переноса пласта на рану разработаны пористые полилактидные пленки Формирование пористых пленок достигнуто путем смешивания полилактида полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ), и удалением последнего из готовой матрицы 5. Разработанные полилактидные пленки в условиях культуры, и в опьпах \ лабораторных животных продемонстрировали отсутствие токсичности удовлетворительную скорость резорбции, что свидетельствует о возможности и применения в технологиях клеточной заместительной терапии

Основное содержание работы изложено в счедующих пубшкациях-

Статьи опубликованы в журнале, рекомендованном ВАК

1 Швед Ю А , Кухарева Л В , Зорин И М , Соловьев А Ю , Блинова М И , Билиби А Ю , Пинаев Г П «Культивирование фибробластов кожи человека на полимерно полилактидной подложке» Цитология, 2006, т 48, № 2, с 161-168

2 Швед Ю А , Кухарева Л В , Зорин И М , Соловьев А Ю , Блинова М И , Билиби А Ю , Пинаев Г П Взаимодействие культивируемых клеток кожи с разным структурными формами коллагена, нанесенного на полилактидную матриц Цитология, 2007, т 49, № 1, с 32-39

3 Швед Ю А , Кухарева Л В , Зорина Н А , Зорин И М , Пинаев Г П , Билибин А Ю , Деградация полилактидных пленок в условиях кульивирования клеток оценк влияния компонентов среды// Труды 111 научной сессии УНЦХ СПбГУ Саню Петербург, 27-28 ноября, 2004, стр 351

4 Швед Ю А Зорин И М , Кухарева Л В .Блинова М И , Билибин А Ю Пинаев Г

11 1 ojpawv/i iva и ^.¡vi i iwjiил1 н,Ц1 i íji^ ujicnutv и ha í^vidi^ v* v wk. i piii ч

культивирования клеток человека // Симпозиум «Стволовые клетки, регенераци; клеточная терапия», С -Петербург, 25-27 октября 2004 г , стр 949

5 Швед Ю А , Кухарева Л В , Соловьев А Ю , Зорин И М , Пинаев Г П , Билиби А Ю Нанесение коллагена на поверхность полилактидных пленок Материалы С Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы наупг полимерах», 1 -3 февраля 2005 г , с 110

6 Швед Ю А , Кухарева Л В , Зорин И М Пинаев Г П , Билибин А Ю Сорбци коллагена на поверхности пористых пленок на основе смеси полилактида полиэтиленгликоля // Материалы XII Международной конференции студентог аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, 12-15 апреля 2005 г с 493-494

7 Швед Ю А , Кухарева Л В , Пинаев Г П , Билибин А Ю Влияние коллагеновог покрытия на поведение кожных фибробластов гг кератиноцитов человека н поверхности полилактида II Материалы 9-ой Международной школы-конференци молодых ученых «Биология - наука XXI века», 18-22 апреля 2005 г, Пущине с 176

8 Shved Ju А , Zorin I М , Makarov V I, Pinaev G P , Bihbin A Ju Keratmocytes an. fibroblast cultivation on polylactide-polyethylenglycol copolymer and blend films о skin European Polymer Congress, Moscow, June, 2005, с 4106

9 Shvcd JuA, Zonn IM, Pinacv GP, Bilibin A Ju Keratinocytes and fibroblasts cultivation on the degradable polylactide films for substitutive cell therapy of skin // International confcrence "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (доклад) Jerevan Republic Armenia July 12-14, 2005, p 17-22

10 Швед Ю А Разработка резорбируемой полимерной подложки для культивирования кератиноцитов человека // Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» 14-16 апреля 2005, Санкз-Петербург стр 137

11 Sved Yu А , Kukhareva L V , Zonn I M , Pinaev G P , Bilibin A Yu Enhance cell affinity to poly(d,l-lactide) films by treatment with fibrillar collagen "Biomaterials" 1- 4 Oct, 2006, Hamburg, p 93

12 Bilibin A Yu, Sved Yu A , Zonn IM, Pinaev GP Poly-D,L-Lactide Films for cell cultivation - influence of the surface modification on cell adhesion "Biomaterials" I - 4 Oct, 2006, Hamburg, p 8

13 Швед Ю A , Кухарева JI В , Блинова М И , Билибин А Ю , Пинаев Г П Влияние различных форм коллагеновых субстратов, прикрепленных к полимерной подложке, на рост клеток кожи в культуре» (доклад) // Международная конференция "Биология клетки в культуре" Санкт-Петербург, 17-19 октября, 2006

14 Shved J А , Blmova М I, Khureva L V , Pinacv G P ,Bilibin A Yu Development on polymer matrix for cultivation of skin cells British-Russian workshop m association with the European Commission "Stem cells policy, research, and innovations European Union - Russian Federation perspectives" Moscow, Marchl5, 2007, p 13

15 Швед Ю А, Пинаев Г П, Билибин А Ю Культивирование клеток кожи на полилактидных матрицах // IV Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва, 12-16 марта, 2007, с 53-54

ЛР 040815 от 22 05 97 Подписано к печати 24 04 07 Заказ 3169 Тираж 100 экз Объем 1 п л Отдел оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ с оригинал-макета заказчика 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр 26

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биоматериаловедение - междисциплинарный подход к изучению полимеров.

1.2. Полимеры медико-биологического назначения.

1.3. Тканевая инженерия.

1.3.1 Принципы и методы тканевой инженерии.

1.3.2 Основные требования, предъявляемые к полимерам в тканевой инженерии.

1.3.3 Синтетические биодеградируемые полимеры.

1.4. Строение кожи и способы лечения повреждений кожного покрова.

1.4.1 Строение кожного покрова.

1.4.2 Строение коллагена и его свойства.

1.4.3 Подготовка клеточного продукта для трансплантаций.

1.4.4 Формирование полимерных матриц для культивирования, клеток.

1.5 Взаимодействие клеток с полимерной поверхностью скаффолда.

1.6 Модификация полимерного субстрата.

1.6.1 Физические способы модификации.

1.6.2 Химические способы модификации полимерной поверхности.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Приготовление материалов и реагентов.

2.1.1 Синтез поли(0,Ь-лактида)

2.1.2 Формирование плёнок методом отлива из раствора.

2.1.3 Получение тонких полимерных плёнок.

2.1.4 Гидрофобизация покровных стёкол.

2.1.5 Получение пористых плёнок из смеси полилактида (ГШ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ).

2.1.6 Получение коллагена.

2.2. Модификация поверхности полилактидных пленок.

2.2.1 Нанесение коллагена на полимерный субстрат.

2.2.2 Аминолиз полилактидных плёнок.

2.3. Методы исследования поверхности.

2.3.1 Измерение гидрофильно-гидрофобных характеристик поверхности полимерной плёнки методом пластинок Вильгельми.

2.3.2 Оценка количества растворённого ПЭГ по потере массы.

2.3.3 Определение концентрации полиэтиленгликоля в водных растворах.

2.3.4 Определение оксипролина в коллагене.

2.3.5 Определение концентрации коллагена.

2.3.6 Выявление структуры коллагена.

2.3.7 Нингидриновый метод анализа.

2.3.8 Ядерный магнитный резонанс.

2.3.9 Сканирующая электронная микроскопия.

2.4. Выделение клеток кожи и анализ их поведения на исследуемых субстратах.

2.4.1 Выделение и культивирование первичных фибробластов.

2.4.2 Выделение и культивирование первичных кератиноцитов.59 2.4.3. Оценка состояния клеток на полимерных плёнках.

2.4.4 Адгезия фибробластов.

2.4.5 Анализ структуры актинового цитоскелета.

Глава 3. Результаты.

3.1. Синтез поли(Б,Ь-лактида).

3.2. Получение полимерных плёнок из полилактида разными способами.

3.2.1 Плёнки, полученные методом полива из раствора.

3.2.2 Полимерные плёнки, полученные на покровном стекле.

3.3. Влияние условий получения полимерных плёнок на взаимодействие фибробластов с полимерной поверхностью полилактидной плёнки.

3.4. Исследование деградации полилактидных матриц in vitro.

3.5. Исследование деградации полилактидных плёнок in vivo.

3.6. Модификация полилактидных плёнок.

3.6.1 Нанесение коллагена на поверхность полилактидных плёнок.

3.6.2 Влияние покрытия полимерных пленок коллагеном на поведение культивируемых кератиноцитов.

3.7. Формирование пористых плёнок на основе смеси полилактида и полиэтиленгликоля.

3.7.1 Исследование скорости растворения ПЭГ.

3.7.2 Культивирование кератиноцитов на плёнках на основе смеси ПЛ и ПЭГ.

3.7.3 Модификация коллагеном пористых плёнок и культивирование на них кератиноцитов.

3.8. Модификация полилактидных плёнок раствором лизина.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Список сокращений.

Разработка технологий лечения повреждённых органов и тканей методами заместительной клеточной терапии является перспективным направлением современной регенеративной медицины. В основе этого метода лечения лежит введение в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток, которые замещают утраченные. Для этой цели используют культивируемые клетки, которые выделяют из костного мозга и тканей самого пациента или здоровых доноров.

Актуальность работы. Восстановление целостности повреждённой ткани требует создания нормального микроокружения для трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и созданию нормальных структур тканей. В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса. Эти белки и в частности коллаген, используют, поэтому, при культивировании клеток и при создании клеточных композиций для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента. При переносе клеток из культуральных сосудов в раны возникают, однако, проблемы сохранения их пространственной организации и функциональных свойств. Они связаны, прежде всего, с недостаточной механической прочностью клеточных ассоциаций и с неизбежным повреждением клеток в результате ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют.

Размножение и рост клеток на полимерных матрицах, обладающих достаточной механической прочностью и имеющих определённую пространственную архитектуру, может способствовать формированию структурной основы дифференцирующихся тканей. Поэтому в последнее время приходят к заключению о том, что при создании клеточных продуктов и их трансплантации, необходимо использовать полимеры, для обеспечения сохранения исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клеток. В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, в том числе, биосовместимость и способность рассасываться в процессе восстановлении структуры ткани. Таким образом, в настоящее время сформировалась новая междисциплинарная область науки - тканевая инженерия, которая включает в себя принципы и методы инженерии, химии, физики и клеточной биологии. В основе тканевой инженерии лежит культивирование клеток на искусственных полимерных матрицах.

Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности повреждённых кожных покровов, возникающих в результате ожогов, трофических язв и другого рода повреждений. Культивирование кератиноцитов на полимерных матрицах и последующая трансплантация сформировавшегося клеточного пласта вместе с такой матрицей в организм позволяет исключить процедуру обработки клеток протеолитическими ферментами. Перенесённая в организм биодеградируемая полимерная матрица со временем рассасывается, а клетки способствуют восстановлению кожных покровов.

Целью диссертационной работы является изучение возможности формирования биодеградируемых полимерных плёнок из поли (D,L-лактида), предназначенных для культивирования и трансплантации эпителиальных клеток кожи.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Отработать условия синтеза поли(0,Ь-лактида) как основного полимера для формирования плёнок.

2. Отработать методику формирования полимерных плёнок различной толщины.

3. Сформировать полилактидные плёнки с нанесённым на их поверхность коллагеном в разных формах (молекулярной и фибриллярной).

4. Приготовить плёнки на основе смеси поли(0,Ь-лактида) и полиэтиленгликоля.

5. Модифицировать полилактидные плёнки для повышения основности и гидрофильности их поверхностей.

6. Исследовать адгезию и пролиферацию фибробластов и кератиноцитов на модифицированных плёнках.

7. Исследовать скорость деградации плёнок в условиях культивирования клеток и в организме.

Научная новизна работы. Впервые для формирования многослойного пласта кератиноцитов были использованы плёнки на основе аморфного поли(0,Ь-лактида), прикреплённые к поверхности покровного стекла. Такой способ позволяет отделить плёнку со сформированным клеточным пластом от подложки и перенести его на рану даже при толщине плёнки 5 мкм.

Показано, что решающим фактором, влияющим на прикрепление и распластывание кератиноцитов при модификации полилактидной матрицы коллагеном, является структура нанесенного белка. Фибриллярная структура коллагена способствует пролиферации кератиноцитов. Впервые разработаны условия, при которых фибриллообразование коллагена осуществляется в момент нанесения коллагена в молекулярной форме на поверхность полилактидной плёнки, что позволяет достичь равномерного распределения фибрилл коллагена на поверхности.

Впервые для модификации полимерной матрицы был использован лизин. Показано, что такая обработка способствует распластыванию кератиноцитов.

Практическая ценность. Сформированный клеточный продукт, который состоит из выращенного на биодеградируемой полилактидной матрице многослойного пласта кератиноцитов, может быть использован для трансплантации на повреждённый участок кожного покрова.

Предложенные методы модификации поверхности полилактидной матрицы, предназначенной для культивирования кератиноцитов, могут быть использованы и для других полимеров медико-биологического назначения. В частности разработанные методы модификации могут быть применены в процессе разработки трёхмерных пористых полимерных матриц. Такие матрицы позволят создать условия для формирования сложных клеточных композиций, максимально приближённых по их пространственной организации к условиям существования клеток в тканях организма.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ из них 2 статьи и 13 тезисов. Результаты исследования были представлены на 3 научной сессии УНЦХ (Санкт-Петербург, 1-4 октября,

2004), международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», (Санкт-Петербург, 25-27 октября 2004 г.), С.-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 1-3 февраля 2005 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г.), 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005 г.), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 14-16 апреля,

2005), European Polymer Congress (Moscow, June 27-29, 2005), International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (Jerevan, Republic Armenia, July 12-14, 2005), International symposium"Biomaterials" (Hamburg October 1- 4, 2006), Международная конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург 17-19 октября,

2006), IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 12-16 марта, 2007), British-Russian workshop"Stem cells: policy, research, and innovations. European Union -Russian Federation perspectives" (Moscow, March 15, 2007).

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (207 ссылок). Работа изложена на 163 страницах текста.

Выводы

1. Разработаны биодеградируемые полимерные плёнки на основе полилактида, позволяющие культивировать на них кератиноциты человека и получать многослойные пласты клеток для последующей трансплантации без предварительной ферментативной обработки.

2. Биосовместимость полученных пленок, способствующая прикреплению и росту клеток, достигнута путем модификации их поверхности коллагеном I типа или лизином.

3. Установлено, что структура и распределение на поверхности коллагена, зависящие от условий его нанесения, определяют поведение нанесенных клеток. Наилучшее действие на распределение кератиноцитов по поверхности пленки, их рост, морфологию и пространственную организацию цитоскелета оказывает коллаген, нанесенный в фибриллярной форме.

4. Для улучшения взаимодействия клеток с окружающей средой при культивировании и после переноса пласта на рану разработаны пористые полилактидные пленки. Формирование пористых плёнок достигнуто путем смешивания полилактида с полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ), и удалением последнего из готовой матрицы.

5. Разработанные полилактидные пленки в условиях культуры, и в опытах на лабораторных животных продемонстрировали отсутствие токсичности и удовлетворительную скорость резорбции, что свидетельствует о возможности их применения в технологиях клеточной заместительной терапии.

1. Штильман М. И. Полимеры медико-биологического назначения // М.: Академкнига. 2006.400 с.

2. Brach del Prever Е.М., Costa L., Crova M., Dallera A., Gallinaro P., Camino G. Luda M.P. Unacceptable biodegradation of UHMWPE in vivo // Biomaterials. 1996. V.17. P.873-878.

3. Halpern B. D., Tong Y.-C. In: Encycl. of Polymer Sci. and Eng // Willey: New-York. 1986. V.9. P.486-508.

4. Макаров K.A., Штейнгард М.З. Сополимеры в стоматологии // М.: Медицина. 1982.247 с.

5. Вагнер Е.А. Углеродный материал нового поколения в эндопротезировании костей и суставов. Пермь: Изд-во Пермс. ун-та. 1993. 64 с.

6. Шапиро М.С. Цианакрилатные клеи в травмотологии и ортопедии // М.: Медицина. 1976. 102 с.

7. Искаков Р. М., Батырбеков Е. О., Сулейменов И. Э., Бектуров Е. А., Жубанов Б. А. Полимерные биоматериалы Алматы. 2005

8. Langer R., Vacanti J. P. Tissue engineering // Science. 1993. V. 260. P. 920-926.

9. Lanza R.P., Langer R., Chick W.L. Principles of Tissue Engineering // Academic Press: San Diero. 2004. p. 1020.

10. Amulya K. Saxena A. K., Benvenuto M., Marler J., Joseph P. Vacanti J. P. Skeletal Muscle Tissue Engineering Using Isolated Myoblasts on Synthetic Biodegradable Polymers: Preliminary Studies // Tissue Engineering1999. V. 5. №6. P.525-531.

11. Oakes B.W. Orthopaedic tissue engineering: from labora tory to the clinic // Med. J. Aust. 2004. V. 180. P. 35-38.

12. Neumann Т., Hauschka S.D., Sanders J.E. Tissue engineering of skeletal muscle using polymer fiber arrays // Tissue Eng. 2003. V. 9. P. 995-1003.

13. Szycher M. Biostability of polyurethane elastomers // J. Biomater. Appl., 1988, V. 3. № 2. P.297-402

14. Ramos-e-Silva M., Ribeiro de Castro M. New Dressings, Including Tissue-Engineered Living Skin // Clinics in Dermatology. 2002. V. 20. P. 715-723.

15. Morrison G. Advances in the skin trade // Mechanical. Eng. 1999 V. 121. P. 40-43.

16. Belkas J.S., Munro C.A., Shoichet M.S., Johnston M., Midha R. Long-term in vivo biomechanical properties and biocompatibility of poly(2- hydroxyethyl methacrylate-co-methyl methacrylate) nerve conduits // Biomaterials. 2005. V. 26. P. 1741-1749.

17. Mooney D.J., Powell C., Piana J., Rutherford B. Engineering dental pulp-like tissue in vitro // Biotechnol. Prog. 1996. V. 12. P. 865-868.

18. Sittinger M., Lukanoff В., Burmester G.R., Dautzenberg H. Encapsulation of artificial tissues in polyelectrolyte complexes: preliminary studies // Biomaterials. 1996. V. 17. P. 1049-1051.

19. Sittinger M., Bujia J., Rotter N., Reitzel D., Minuth W.W., Burmester1. G.R.

20. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches withresorbable biomaterials and new cell culture techniques // Biomaterials. 1996. V.17. P. 237-242.

21. Adams J.C., Watt F.M. Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix // Development. 1993. V. 117. №4. P. 1183-1198.

22. Andrade J.D., Hlady V. Protein adsorption and materials biocom-patibility: a tutorial review and suggested hypotheses // Adv. Polym. Sci. 1986. V. 79. P. 1-63.

23. Buck, C., Horwitz A.F. Cell surface receptors for extracellular matrix molecules // Annu. Rev. Cell Biol. 1987. V. 3. P. 179-205.

24. Singer I.I., Kawka D.W., Scott S., Mumford R.A., Lark, M.W. The fibonectin cell attachment sequence Arg-Gly-Asp-Ser promotes folcal contact formation during early fibroblast attachment and spreading // J. Cell Biol. 1987. V. 104. P. 573-584.

25. Salgado A.J., Figueiredo J.E., Coutinho O.P., Reis R.L. Biological response to pre-mineralized starch based scaffolds for bone tissue engineering // J Mater Sci Mater Med. 2005. V. 16. P. 267-275.

26. Pashkuleva I., Marques A.P. Surface modification of starch based blends using potassium permanganate-nitric acid system and its effect on the adhesion and proliferation of osteoblast-like cells // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2005 V. 16. P. 8192.

27. Li Z., Zhang M. Chitosan-alginate as scaffolding material for cartilage tissue engineering // J. Biomed. Mater. Res. A. 2005 V. 75. P. 485-493.

28. Смирнова T.A., Юркштович Т.Д., Герасимович Г.Н., Капуцкий Ф.Н. Современные препараты на основе производных целлюлозы в клинической практике // Медицина. 1996. V. 5. С. 39-43.

29. Капуцкий В.Е., Адарченко А.А., Собенчук О.П., Красильников И.П. Изучение антимикробных свойств целлюлозы и других полимерных материалов, модифицированных хлоргексидином // Антибиотики и химиотерапия. 1991. №3.

30. Абаев Ю.К. Абаев, В.Е. Капуцкий, А.А. Адарченко Новый перевязочный материал для лечения гнойных ран // Здравоохранение. 1995. №11.

31. Живетин В. В., Осипов Б. П., Осипова Н. Н. Льняное сырье в изделиях медицинского и санитарно-гигиенического назначения // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И.Менделеева). 2002, т. XLVI, №2

32. Clyde G., Hardwick С. Extracellular Matrix Contraction by Choroidal Fibroblasts:Inhibition by Staurosporine // Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1994. V. 35. №2.

33. Clyde G. Extracellular matrix contraction by fibroblasts: Peptide promoters and second messengers // Cancer and Metastasis Reviews. V. 11.№1. P.45-54.

34. Ashammakhi N., Rokkanen P.) Absorbable polyglycolide devices in trauma and bone surgery // Biomaterials. 1997. V. 18. P. 3-9.

35. Behravesh E., Yasko A.W., Engle P.S., Mikos A.G. Synthetic biodegradable polymers for orthopaedic applications // Clin Orthop. 1999 V. 36. P. 118-185.

36. Bustman O., Partio E., Hirvensalo E., Rokannen P. Foreign-body reactions to polyglycolide screws // Acta. Orthop. Scand. 1992. V. 63. P. 173-176.

37. Reed A.M., Gilding D.K. Biodegradable polymers for use surgery-poly(glycolic)/polylactic acid) homeo and copolymers 2. In-vitro degradation // Polymer. 1981. V. 22. P. 494- 504.

38. Wong W. H., Mooney D. J. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering // Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds. Boston. 1997. P. 51-84.

39. Cima L.G., Vacanti, J.P., Vacanti, C., Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates // J. Biomech. Eng. 1991. V. 113. P. 143.

40. Peters M.C., Mooney D.J. Synthetic extracellular matrices for cell transplantation // Mater. Sci. 1997. V. 250. P. 43.

41. Evans G.R.D., Brandt K., Widmer S. In vivo evaluation of poly(L-lactic acid) porous conduits for peripheral nerve regeneration // Biomaterials 1999. V. 20. P. 1109-1115.

42. Li S.M., Garreau H., Vert M. Structure-property relationships in the case of the degradation of massive aliphatic poly-(a-hydroxy acids) in aqueous media. Part 1: poly-(DL-lactic acid) // J. Mater. Sci. 1990. V. 1. P. 123-130.

43. Middleton J.C., Tipton A J. Synthetic biodegradable polymers as medical devices // Med. Plastics Biomater. Mag. 1998. V. 3. P. 30-35.

44. Chujo. K., Kobayashi. H., Suzuki. J., Tokuhara S. Physical and chemical characteristics of polyglycolide // Makromol. Chem. 1967. V. 100. P. 267-270.

45. Vert M., Li S. M., Garreau H. Attempts to map the structure and degradation characteristics of aliphatic polyesters derived from lactic and glycolic acids // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1994. V. 6. P. 639 649.

46. Middleton J.C., Tipton A.J. Synthetic Biodegradable Polymers as Orthopedic Devices // Biomaterials. 2000. V. 21. P. 2335-2346.

47. Yui N., Dijkstra PJ., Feijen J. Stereo block copolymers of l- and D-lactides //MakromolChem. 1990. V. 191. P.481-^88.

48. Okihara Т., Tsuji M., Kawaguchi A., Katayama K.-I., Tsuji H., Hyon S.-H., Ikada Y. Crystal structure of stereocomplex of poly(L-lactide) and poly(D-lactide) // J Macromol Sci Phys. 1991. V. B30. P. 119-140.

49. Huang J., Lisowski M.S., Runt J., HallE.S., Ken R.T., BuehlerN., LinJ.S. Crystallization and Microstructure of Poly(L-lactide-co-meso-lactide) Copolymers // Macromolecules. 1998 V. 31. P. 2593-2599.

50. Kricheldorf H. R. Syntheses and application of polylactides // Chemosphere. 2001. V.43.P. 49-54.

51. Sodergard A., Stolt M. Properties of lactic acid based polymers and their, correlation with composition // Prog Polym Sci. 2002. V. 27. P. 1123-1163.

52. Nieuwenhuis J. Synthesis of Polylactides, Polyglycolides and their Copolymers // Clin. Mater. 1992. V. 10. P. 59-67.

53. Spassky N. Ring-opening polymerization // Rapra Rev Rep. 1995. V. 8 1. P.1.29

54. Penczec S., Duda A., Szymanski R., Biela T. What we have learned in general from cyclic esters polymerization // Macromol. Symp. 2000. V. 153. P. 1-15.

55. Nijenhuis A.J., Grijpma D.W. , Pennings A.J. Lewis acid catalyzed polymerization of L-lactide. Kinetics and mechanism of the bulk polymerization // Macromolecules. 1992. V. 25. P. 6419-6424.

56. Kricheldorf H.R., Krieiser-Saunders I., Boettcher C. Polylactones: 31. Sn(II)octoate-initiated polymerization of L-lactide: a mechanistic study // Polymer. 1995. V. 36. P. 1253-1259.

57. Dubois Ph., Jacobs C., Jerome R., Teyssie Ph. Macromolecular engineering of polylactones and polylactides. 4. Mechanism and kinetics of lactide homopolymerization by aluminum isopropoxide // Macromolecules. 1991. V. 24. P. 2266-2270.

58. Kricheldorf H.R., Serra A. Polylactones. 6: Influence of various metal salts on the. optical purity of poly(. L. -lactide) // Polym. Bull. 1985. V. 14. P. 497-502.

59. Chabot F., Vert M., Chapelle S. Configuration structures of lactic acid stereocopolymers as determined by 13C-1 H-NMRJ. // Polymer. 1983. V. 24. P. 5359.

60. Bero M., J Kasperczyk, Z J Jedlinski. Coordination polymerization of lactides //Makromol Chem. 1990. V. 191. P. P. 2287- 2296.

61. Schwach G., Coudane J., Engel R., Vert M. Influence of polymerization conditions on the hydrolytic degradation poly(D,L-lactide) polymerized in the presence of stannous octoate or zinc metal //Biomaterials. 2002. V. 23. P. 993-1002.

62. Karp J.M., Shoichet M.S., Davies J.E. Bone formation on two dimensional poly(D,L-lactide-co-glycolyde) (PLGA) films and three-dimensional PLGA tissue engineering scaffolds in vitro // J. Biomed Mater Res. 2003. V.64. №2. P. 388-396.

63. Zinn M., Witholt В. Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate // Adv. Drug. Delivery Rev. 2001. V. 53. P. 5-21.

64. Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of. polyhydroxyalkanoates: biological polyesters // Progr. Polymer Sci. 2000. V. 25. P. 1503 -1555.

65. Hayashi Т., Nakayama K., Studies on biodegradable poly (hexano-6-lactone) fibers // Pure Appl. Chem. 2002. V. 74. P. 869.

66. Билибин А.Ю., Зорин И.М. Деструкция полимеров, ее роль в природе и современных медицинских технологиях // Успехи химии. 2006. № 75. стр. 151165.

67. Пхакадзе Г.А. Биодеструктируемые полимеры. Киев: Наукова Думка. 1990.160 с.

68. Zdrahala R.J., Zdrahala I.J. Biomedical applications of polyurethanes: a review of past promises, present realities, and a vibrant future // J Biomater. Appl. 1999. V. 14. P. 67-90.

69. Хэм А., Кормак Д. Гистология. M.: Мир. 1983 .с. 191.

70. Михайлов И.Н. Структура и функции эпидермиса // М.: Медицина. 1979.

71. Kadler К. Е., Holmes D. F., Trotter J. A., Chapman J. A. Collagen fibril formation // Biochem. J. 1996 V. 316. P. 1-11.

72. Prockop D.J., Kivirikko K.I. Collagens: molecular biology, diseases, and potentials for therapy // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 403-434.

73. Veis A., George A. Fundamentals of interstitial collagen self-assembly // Extracellular Matrix Assembly and Function. Academic Press: San Diego. 1994. P. 15-45.

74. Nimni M.E., Harkness R.D. Molecular structures and functions of collagens // In: Nimni M.E. Collagen: V. I. Biochemistry. 1988. CRC Press. Boca Raton. P. 179.

75. Veiling Т., Risteli J., Wennerberg K., Mosher D. F., Johansson S. Polymerization of Type I and III Collagens Is Dependent On Fibronectin and Enhanced By Integrins alpha 11 beta 1 and alpha 2beta 1 // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 37377-37381.

76. White D. J., Puranen S., Johnson M. S., Heino J. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36. P. 1405-1410.

77. Takada Y., Hemler M. E. The primary structure of the VLA-2/collagen receptor alpha 2 subunit (platelet GPIa): homology to other integrins and the presence of a possible collagen-binding domain. // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 397-407.

78. Briesewitz R., Epstein M. R., Marcantonio E. E. Expression of native and truncated forms of the human integrin alpha 1 subunit // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.2989-2996.

79. Camper L., Hellman U., Lundgren-Akerlund E. Isolation, Cloning, and

80. Sequence Analysis of the Integrin Subunit 10, a 1-associated Collagen Binding Integrin Expressed on Chondrocytes // J. Biol. Chem. 1998 V. 273. P. 20383-20389.

81. Johnson T.M., Ratner D., Nelson B.R. Soft tissue reconstruction with skin grafting // J. Am. Acad. Dermatol. 1992. V. 27. P. 151-165.

82. Deschler D.G., Hayden R.E. Head and neck reconstruction // Neuroimag Clin N Am. 1996. V. 6. P. 505-514.

83. Branham G.H., Thomas J.R. Skin grafts // Otolaryngol. Clin. North. Am. 1990. V. V. 23. P. 889-897.

84. Freedlander E. New forms of skin grafting: from the laboratory to the clinic // HospMed. 1998. V.59. P. 484-487.

85. Pomahac В., Svensjo Т., Yao F., Brown H., Eriksson E. Tissue engineering of skin // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1998. V. 9. P. 333-344.

86. Фаллер Дж.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.:Изд-во Бином, 2003.

87. Б.Альбертис и др. "Молекулярная биология клетки". Т. 1, 2. Мир, 1994 г.

88. Bell Е., Ehrlich Н. P., Buttle D. Nakatsuji Т. Living tissue formed in vitro and accepted as a skin equivalent tissue of full thickness // Science. 1981. V. 211. P. 1052-1054

89. Robert M., Dusser I., Muriel M.P., Noel-Hudson M.S., Aubery M., Wepierre J. Barrier function of reconstructed epidermis at the airliquid interface: influence of dermal cells and extracellular components // Skin Pharmacol. 1997.V. 10. P.247-260.

90. Ellis D.L., Yannas I.V. Recent advances in tissue synthesis in vivo by use of collagen-glycosaminoglycan copolymers // Biomaterials. 1996. V. 17. P. 291-299.

91. Sefiton M.V., Woodhouse K.A. Tissue engineering // J. Cutan. Med. Surg. 1998. V. 3. P. 1-23.

92. Carver N., Leigh I.M. Keratinocyte grafts and skin equivalents // Int. J. Dermatol. 1991. V. 30. P.540-551.

93. Phillips T.J. Biologic skin substitutes // J. Dermatol. Surg. Oncol. 1993. V. 19. P. 794-800.

94. Zacchi V., Soranzo C., Cmrtivo R., Radice M., Brun P., Abatangelo G. In vitro engineering of human skin-like tissue // J. Biomed. Mater. Res. 1998. V. 40. P. 187-194.

95. Ueda M., Ebata K., Kaneda T. In vitro fabrication of bioartificial mucosa for reconstruction of oral mucosa: basic research and clinical application // Ann. Plast. Surg. 1991. V. 27. P. 540-549.

96. Moisted K. Treatment outcome in cleft lipand palate: issues and perspectives // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1999. V. 10. P. 225-239.

97. Wijdeveld M.G., Grupping E.M., Kuijpers-Jagtman A.M., Maltha J.C. Growth of the maxilla after soft tissue palatal surgery at different ages in beagle dogs:a longitudinal radiographic study // J. Oral. Maxillofac. Surg. 1988. V. 46. P. 204209.

98. Wijdeveld M.G., Maltha J.C., Grupping E.M., De Jonge J., Kuijpers-Jagtman A.M. A histological study of tissue response to simulated cleft palate surgery at different ages in beagle dogs //Arch. Oral. Biol. 1991. V. 36. P. 837-843.

99. Gogolewski S., Pennings A.J. Porous biomedical materials based on mixtures of polylactides and polyurethanes // Makromol. Chem. Rapid. Commun.1982. V.3.P. 839-845.

100. Gogolewski S., Pennings A.J. An artificial skin based on biodegradable mixtures of polylactides and polyurethanesfor full-thickness skin wound covering // Makromol. Chem. Rapid. Commun.1983. V. 4. P. 675-680

101. Dai N.T., Williamson M.R., Khammo N., Adams E,F., Coombes A,G., Composite cell support membranes based on collagen and polycaprolactone for tissue engineering of skin // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 4263-4271.

102. Saad В., Hirt T.D., Welti M., Uhlschmid G.K., Neuenschwander P., Suter U.W. Development of degradable polyesterurethanes for medical application: in vitro and in vivo evaluations // J. Biomed. Mater. Res. 1997. V. 36. P. 65-74.

103. Li S., Vert M. Biodegradation of aliphatic polyesters. In: Gilead GSD, editor. Biodegradable polymers, principles and application. London: Chapman and Hall. 2003. p 43-87

104. KimS-S., GwakS-J., Cha Yong Choi, KimB-S. Skin regeneration using keratinocytes and dermal fibroblasts cultured on biodegradable microspherical polymer scaffolds // Journal of biomedical materials research. 2005. V. 75B. №2. p. 369-377.

105. Garric X., MoIhs J.-P., Garreau H., Guilhou J.-J. Vert M. Human skin cell cultures onto PLA50 (PDLLA) bioresorbable polymers : Influence of chemical and morphological surface modifications // J. Biomed. Mat. Res. 2005. V. 72. P. 180-189.

106. Maruguchi Т., Maruguchi Y., Suzuki S., Matsuda K., Toda K., Isshiki N. An experimental study of novel bioartificial materials applied to glycotechnology for tissue engineering // Plast. Reconstr. Surg. 1994. V. 3. P. 93-98.

107. Hansbrough J.F., Morgan J., Greenleaf G., Parikh M., Nolte C., Wilkins L. Evaluation of Transplanted Tissue-Engineered Oral Mucosa Equivalents in Severe Combined Immunodeficient Mice //J. Burn. Care Rehabil. 1994. V. 4. P. 15-20.

108. Duvernoy V. A., Malm Т., Ramstrom J. A biodegradable patch used as a pericardial substitute after cardiac surgey: 6- and 24-month evaluation with CT // Thorac. Cardiovasc. Surg. 1995. V.43. №5. P. 271-274.

109. Shin H.-N., Fang J.-F., Chen J.-H. Reduction in experimental peridural adhesion with adhesion with the use of crosslinked hyaluronate /collagen membrane // J. Biomed. Mater. Res. 2004. V.71B. №2. P. 421-428

110. Viola J., Lai В., Grad O. Abt. Report on The Emergence of Tissue Engineering as a Research Fields //4.0 Development of the Fields. 1987.2002 -2003.

111. Hutmacher D.W. Polymeric scaffolds in tissue engineering, bone and cartilage // Biomaterials. 2000. V. 21. P. 2529-2543.

112. Hentze H.-P., Antonietti M. New polymers for molecular biotechnology // Reviews in Molecular Biotechnology. 2002. V. 90. P. 27-35.

113. Younes. H., Cohn D. Phase Separation in Poly(ethylene glycol)/Poly(lactic acid) Blends// Eur. Polym. Mater. 1988. V. 24. P. 765-773.

114. Nakane К., Hata Y., Morita K., Ogihara Т., Ogata N. Porous Poly(L-lactic acid)/Poly(ethylene glycol) Blend Films Journal of Applied Polymer // Science. 2004. V. 94. P. 965-970.

115. Hua Y., Hua Y.S., Topolkaraev V., Hiltnera A., Baera E. Aging of poly(lactide)/poly(ethylene glycol) blends // Polymer. 2003 V. 44. P. 5711-5720.

116. Martin O., Averous L. Poly(lactic acid): plasticization and properties of biodegradable multiphase systems // Polymer. 2001. V. 42. P. 6209 6215.

117. Ljungberg N., Wesslen B. The effects of plasticizers on the dynamic mechanical and thermal properties of poly(lactic acid) // J. Appl. Polym. Sci. 2002. V. 86. P. 1227- 1232.

118. Yang J.M, Chen H L, You J W, Hwang J C. Effect of P(/LA-co-ECL) on the compatibility and crystallization behavior of PCL/PLLA blends// Polym. J. 1997. V. 29. P. 657-668.

119. Nijenhuis A., Colstee E., Grijpma D.W., Pennings A.J. Synthesis of polylactides, polyglycolides and their copolymers // Polymer 1996. V. 37. P. 58495867.

120. Hu Y., Rogunova M., Topolkaraev V., Hiltner A., Baer E. Poly(lactide) with low stereoregularity//Polymer. V. 44. P. 5701-5710.

121. Groth Т., Altankov G., Kolsz K. Adhesion ofhuman peripheral blood lymphocytes is dependent on surface of wettabilty and protein preadsorption // Biomaterials. 1994. V. 15. P. 423^128.

122. Yang J., Bei J.Z., Wang S.G. Improving cell affinity of poly(d,llactide) film modified by anhydrous ammonia plasma treatment // Polym. Adv. Technol.2002. V. 13. P. 220-226.

123. Kishida A., Iwata H., Tamada Y., Ikada Y. Cell behaviour on polymer surfaces grafted with non-ionic and ionic monomers // Biomaterials. 1991. V. 12. P. 786-792.

124. Matsuzaka K., Walboomers F. Effect of microgrooved poly-l-lactic (PLA) surfaces on proliferation, cytoskeletal organization, and mineralized matrix formation of rat bone marrow cells // Clin. Oral Impl. Res. 2000. V. 11. P. 325-333.

125. Calvert J.W., Marra K.G., Cook L., Kumta P.N., DiMilla P.A., Weiss L.E. Investigation of Growth Factor Gradients and Polymer/Ceramic Composites for Tissue EngineeringApplications // J. Biomed. Mater. Res. 2000. V. 52. P. 279-285.

126. Lam M. Т., Sim S., Zhu X., Takayama S. The effect of continuous wavy micropatterns on silicone substrates on the alignment of skeletal muscle myoblasts and myotubes // Biomaterials. 2006. V. 27. P. 4340-4347.

127. Ji J., Zhu H., Shen J. // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 1859-1867.

128. Zoppi R.A., Contant S., Duek E.A.R., Marques F.R., Wada M.L.F., Nunes S.P. Porous poly(L-lactide) films obtained by immersion precipitation process: morphology, phase separation and culture of VERO cells // Polymer. 1999. V. 40. P. 3275-3289.

129. Khang G., Choee J.-H., Rhee J.M., Lee H.B. Interaction of different types of cells on physicochemically treated poly(L-lactide-coglycolide) surfaces // J. Appl. Polym. Sci. 2002. V. 85. P. 1253-1262.

130. Yang J., Bei J., Wang S. Design of high-speed data transmission system based on fiber channel // Polym. Adv. Technol. 2002. V. 13. P. 220-224.

131. Zhao K., Deng Y., Chen G.-Q. // Biochem. Eng. J. 2003. V. 16. P. 115

132. Werner C., Jacobasch H.-J. // Int. J. Artificial Organs. 1999. V. 22. P.160.

133. Bertrand P., Jonas, A., Laschewsky, Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation // Macromol. Rapid Commun. 2000,. V. 21. P. 319-348.

134. Ma Z.W., Gao C.Y., Ji J., Shen J.C. Protein immobilization on the surface of poly(l-lactic acid) films for improvement of cellular interactions // Eur Polym. J. 2002.V. 38. P. 2279.

135. Tetsuji Y., Yoshiyuki Т., Yoshiharu K. Surface modification of poly(l-lactic acid) film with bioactive materials by a novel direct alkaline treatment process // Jpn. J. Polym. Sci. Technol. 1998. V. 55. P. 328.

136. Suh H., Hwang Y.S., Lee J.E., Han C.D., Park J.C. Behavior of osteoblasts on a type I atelocollagen grafted ozone oxidized poly(l-lactic acid) membrane //Biomaterials. 2001. V. 22. P. 219.

137. Ma Z., Gao C., Ji J., Shen J. Synthesis of new polyimidosulfides // Eur. Polym. J. 2002. V. 38. P. 2279

138. Gugala Z., Gogolewski S. Protein adsorption, attachment, growth and activity of primary rat osteoblasts on polylactide membranes with defined surface characteristics // Biomaterials. 2004 V. 25. P. 2341-51.

139. Iler R. J. The colloid chemistry of silica and silicates: // Colloid Interface Sci. 1966. V. 21. P. 569-573.

140. Decher G., Hong, J.-D. // Ber. Bunsen-Ges. 1991. V. 95. P. 1430.

141. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites Science. 1997. V. 227. P. 1232-1237.

142. Lvov Y., Decher G., Mohwald H. Successive Deposition of Alternate Layers of Polyelectrolytes and a Charged Virus // Langmuir 1993. V. 9. P. 481-488.

143. Zhu H., Ji J., TanQ., Barbosa M. A., Shen J. Surface Engineering of Poly(DL-lactide) via Electrostatic Self-Assembly of Extracellular Matrix-like Molecules // Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 378-386.

144. Quirk R.A., Davies M.C., Tendler S.J.B., Shakeshen K.M. Surface engineering of poly(lactic acid) by entrapment of modifying species // Macromolecules. 2000 V. 33. P. 258-60.

145. Jacobson B.S, Branton D. Plasma membrane: rapid isolation and exposure of the cytoplasmic surface by use of positively charged beads // Science 1977. V. 195. P. 302-304.

146. Quirk R. A., Chan W. C., Davies M.C., Tendler S. J.B., ShakesheffK. M. Poly(L-lysine)-GRGDS as a biomimetic surface modifier for poly(lactic acid) // Biomaterials. 2001 V. 22. P. 865-872.

147. Ulbrich R., Golbik R., Schellenberger A. Protein, adsorption and leakage in carrier-enzyme systems//Biotechnol. Bioeng. 1991 V. 37. P. 280.

148. Scotchford C.A., Cascone M.G., Downes S., Giusti P. Osteoblast attachement to bioartificialpolymers//Biomaterials. 1998. V. 19. P. 1.

149. Hoffmann A.S. Biologically functional materials. In: Ratner BD, Hoffman AS, Schoen FJ, Lemons JE, editors // Biomaterials science: an introduction to materials in Medicine 1996. New York: Academic Press. 1996. p. 124-30.

150. Jin S., Gonsalves K.E. Synthesis of functionalized polylactide and it graft copolymers with polyethylene glycol) // Polymer. 1998. V. 39. P. 5155-5162.

151. Herold D.A., Keil K., Bruns D.E. Oxidation of polyethylene glycols by alcohol dehydrogenase //Biochem. Pharmacol. 1989. V. 38. P. 73-76.

152. Richter A.W., Akerblom E. Antibodies against polyethylene glycol produced in animals // Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. 1983. V. 70. P. 124.

153. Zalipsky S. Functionalizedpoly(ethyle ne glycol) for preparation of biological relevant conjugates // Bioconjugate. Chem. 1995. V. 6. P. 150-165.

154. Li J.T., Carlsson J., Lin J.N., Caldwell K.D. Chemical modification of surface active poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) triblock copolymers // Bioconjugate. Chem. 1996. V. 7. P. 592-599.

155. Otsuka H., Nagasaki Y., Kataoka K. Surface characterization of functionalizedpolylactid e through the coating with heterobifunctional poly(ethylene glycol)/polylactide block copolymers // Biomacromolecules. 2000. V. 1. P. 39-48.

156. Jeon S.I., Lee J.H., Andrade J.D., Degennes P.G. Protein-surface interactions in the presence of polyethylene oxide I. Simplified theory // J. Colloid. Interface. Sci. 1991. V. 142. P. 149-158.

157. Jeon S.I., Andrade J.D. Protein-surface interactions in the presence of polyethylene oxide II. Effect of protein size // J. Colloid. Interface. Sci. 1991. V. 142. P.159-166.

158. Gonsalves К. E., Jin S., Baraton M. Synthesis and surface characterization of functionalized polylactide copolymer microparticles // Biomaterials. 1998. V. 19. P. 1501-1505.

159. Barrera D., Zylstra E., Lansbury P., Langer R. Copolymerization and degradation of poly(lactide acid) // Macromolecules. 1995. V. 28. P. 425 -432

160. Tirrell M., Kokkoli E., Biesalski M. The role of surface science in bioengineered materials. // Surface Science. 2002. V. 500. P. 61 83.

161. Ray J.A., Doddi N., Regula D., Williams J.A., Melveger A. Polydioxanone (PDS), a novel monofilament synthetic absorbable suture Surg. Gynecol. & Obstet. 1981. V. 153. P. 497-507.

162. Yang J., Bei J.Z., Wang S.G. Improving cell affinity of poly(d,llactide) film modified by anhydrous ammonia plasma treatment // Polym. Adv. Technol. 2002. V. 13. P. 220-226.

163. Hollahan J.R., Stafford B.B., Falb R.D., Payne S.T. Attachment of amino groups to polymers surfaces by radiofrequency plasmas // J. Appl. Polym. Sci. 1969. V. 13. P. 807-816.

164. Inagaki N., Tasaka S., Miyazaki H. Sulfonic acid group-containing thin films prepared by plasma polymerization // J. Appl. Polym. Sci. 1989. V. 38. P. 1829— 1838.

165. Loh I. H. Plasma surface modification for biomedical applications // J. Polym. Preprint. 1993. V. 34. №1. P. 661-662.

166. Schwach G., Coudane J., Engel R., VertM. Ring opening polymerization of D,L-lactide in the presence of zinc metal and zinc lactate // Polymer international 1999. V. 46 P. 177-182

167. Strom C.S., Michalopoulos G. Collagen as a substrate for cell growth and differentiation //Methods Enzymology. 1982. V. 82. P. 544 555.

168. Mercier I., Lechaire J.P., Desmouliere A., Gaill F., Aumailley M. Interactions of human skin fibroblasts with monomeric or fibrillar collagens induce different organization of cytoskeleton //Exp. Cell Res. 1996. V. 225. P. 245- 256.

169. Rheinwald J.G. Serial cultivation of normal human epidermal keratinocytes // Methods in Cell Biology. 1980. V. 21. P. 229 -254.

170. Физическая химия: Учебник для вузов. М.: Химия. 2000. 320с.

171. SimsG. Е., SnapeT. J. A method for the estimation of polyethylene glycol in plasma protein fractions // Anal. Biochem. 1980. V. 107. P. 60-63.

172. Жеребцов H.A., Попова Т.Н., Артюхов В.Г. Биохимия: Учебник / Воронеж: Изд. Вор. гос. ун. 2002. 696 с.

173. Finley J. W., Friedman M. Chemical methods for available lysine // Cereal Sci. 1973. V. 50. P. 101-105.

174. Ying P., Yu Y., Jin G., Tao Z. Competitive protein adsorption studied with atomic force microscopy and imaging ellipsometry // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2003. V. 32. №1. P. 1-10.

175. Никитин В. H., Перский Е. Э.б Утевская JI. А. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновыз структур. Киев: Наукова думка. 1977. 279 стр.

176. Strom S. С., Michalopoulos G. Collagen as a substrate for cell growth and differentiation // Methods Enzymol. 1982. V. 82. P. 544-547.

177. Sato N. Phosphorelay-regulated degradation of the yeast Ssklp response regulator by the ubiquitin-proteasome system // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 66626671.

178. Aldwinckle T.J., Ahkong Q.F., Bangham A.D., Fisher D., Lucy J.A. Effects of poly(ethylene glycol) on liposomes and erythrocytes. Permeability changes and membrane fusion // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 689. P. 548-560.

179. Nakane K., Hata Y., Morita K., Ogihara Т., Ogata N. Porous poly(L-lactic acid)/poly(ethylene glycol) blend films // Journal of Applied Polymer Science. 1999. V. 94. №3. P. 965-970.

180. Привес M. Г., Лысенков H. К. Анатомия человека С-Пб: «Гиппократ», 1999. 704 с.

181. Papadopoulos G.K., Ouzounis С., Eliopoulos Е. RGD sequences in several receptor proteins: novel cell adhesion function of receptors? // Int. J. Biol. Macromol. 1998. V.22. P. 51-57.

182. Hong Y., Gao C.Y., Xie Y., Gong Y.H., Shen J.C. Collagen-coated polylactide microspheres as chondrocyte microcarriers // Biomaterials. 2005. V. 26. P. 6305-6313.

183. Kiss E.l, Vargha-Butler E.I. Novel method to characterize the hydrolytic decomposition of biopolymer surfaces // Colloids and Surfaces B. 1999. V. 15. №3. P. 181-193.

184. Garric X., MoIhs J.-P., Garreau H., Guilhou J.-J. Vert M. Human skin cell cultures onto PLA50 (PDLLA) bioresorbable polymers : Influence of chemical and morphological surface modifications // J. Biomed. Mat. Res. 2005. V. 72. P. 180189.

185. Han D. K., Hubbell J. A. Lactide-based poly(ethylene glycol) polymer networks for scaffolds in tissue engineering // Macromolecules. 1996. V. 29. P. 52335235.

186. Gan D., Lu S., Cao W. W. Formation of nanoporous poly(aryl amide ether) (PAAE) films by selective removal of poly(ethylene glycol) (PEG) from PEG/PAAE composite films // European Polymer Journal. 2004. V. 40.№11.P.2481-2486.

187. Wright K. A., Nadire К. В., Busto P., Tubo R., McPherson J. M., Wentworth В. M. Collagen and its use in the treatment of full-thickness burn injury // Burns. 1998. V. 24. P. 7-17.

188. Швед Ю.А., Кухарева JI.B., Зорин И.М., Соловьев А.Ю. , Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Культивирование фибробластов кожи человека на полимерной полилактидной подложке // Цитология. 2006. т.48. № 2. с.161-168.

189. Brady J.M., Cutright D.E., Miller R.A. Resorption rate, route, route of elimination, and ultrastructure of the implant site of polylactic acid in the abdominal wall of the rat // J. Biomed. Mater. Res. 1973. V. 7. P. 155-166.

190. Gopferich A. Mechanisms of polymer degradation and erosion // Biomaterials. 1996. V. 17. P. 103-114 .