Получение модифицированных силикатных носителей и их применение в синтезе и хроматографии биополимеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

ЯСТРЕБОВ СЕРГЕЙ ИВАНОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ СИЛИКАТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СИНТЕЗЕ И ХРОМАТОГРАФИИ БИОПОЛИМЕРОВ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия, гения природных и физиологически активных взществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1991

Работа выполнена ео Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии Минмедпрома СССР

Научный руководитель: кандидат химических наук Офицеров В.И.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук ЗагреОельныЙ С.Н.

кандидат химических наук Горн В.В.

Ведущая организация: Институт биоорганической наш им.М.М.Шемякина АН СССР

Защита состоится . -М-^-Зх 2991 г. в 3_ На заседании Специализированного совета К CX33.52.0I в Новосибирском институте биооргашгческой химии СО АН СССР по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект ак. Лаврентьева,8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук О.С.Федорова

¡¿¿¿'■'.11': I

АктуаНкость проблемы- Исследования по разработка новых з^вкг/л-ных носителей для хроматографии и твЗрдсфазнсгэ синтеза Зиспсл:»!-:--роз особенно интенсивно развиваются в течение двух последних десятилетий. Актуальность таких исследований обусловлена, с одной стороны, бурным прогрессом биоорганической химии, гэнной инженерии, молекулярной биологии, биотехнологии, с другой стороны - расширением сферы использования внсокоочкаенных биологически активна?, препаратов для новых диагностических и лечебно-профилактических средств. ВсЗ это требует создания нэдЭжнпх а эффективных методов синтеза и очистки олигснуклзотадов, получения в индивидуальном виде белков и пептидов из генно-инженерных продуцентов и других источников. Особенно остро эта проблема встала в начале 80-х годоз, когда"существующие коммерческие сорбенты перестали полностью удовлетворять возросшим требованиям практики. Так, отсутствовали энио-нообменники, позволяющие эффективно производить выделение я очистку синтетических олигонуклеотидов протяженностью более 20-ти оснований, что стало актуальной задачей при совершенствовании твЗрдо-фазного олигонуклеотидного синтеза. Использование ВЭЖХ в практике аналитической и препаративной' очистки разнообразных белков и пептидов сдерживалось недостаточно широким ассортиментом ионообменных стационарных фаз.

Разработка методов получения протяхЗнных олигонуклеотидоз, наряду с развитием эффективных способов наравдшания олигснуклео-гидной цепи и автоматизацией твёрдофазнсго синтеза, требовала создания эффективных внсокобмких носителей, используемых в качеств? иатриш-подлокки, на которой ведётся синтез.

Целью настоящей работа явилось получение зысокоёмких, пжрско-тористых носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидсв; разработка высокобмких ашонообмешшх сорбентов для разделение

:тротяжЁнш;х олигонуклеотвдоБ; синтез нсеых акионообменных Е катио-•:сгсменша носителей для ВЗЕХ белков г. пептидов.

Научная новизна и практическая значимость. Получены новые композиционные носители на основе кремнеземов с полимерными покрытиями из ГШ, ПЗС, Гьманкита ёмкостьк 100-200 мкмоль/г и установлено, что они могут успешно использоваться для синтеза олигонук-деоТидсв фосфотриэфиркам, фосфатным и фосфонатным методами. Б процессе разработки носителей для твйрдофазного синтеза исследована зависимость выхода целевых олигонуклеотидов от размера пор кремнезёмной матрица, характера её модификации, нагрукенности первым нуклэозкдом и способа его иммобилизации.

Ка основе отечественных широкопористых кремнезёмных матриц, модифицированных поперечно-сшитым кватернизованным ПЭИ, получены сильные анионооОменники для ВЭ20С олигонуклеотидов и исследованы их свойства. Колонки с новыми сорбентами обладают высокой селективностью и разрешением, позволяющими разделять олигонуклеотиды.длиной до 70-ти оснований. Высокая емкость сорбентов дабт возможность проводить на аналитических колонках полупрепаративную очистку синтетических олигонуклеотидов. Синтезированные анионообменники высоко стабильны и выдерживают без снижения разрешения несколько сот разделений.

Исследовано влияние структуры ионогенного слоя сорбентов не ионообменную Емкость и гидрофобное неспецифическое связывание бел-кое. Показано преимущество композиционных носителей перед сорбентами "щёточного" типа. Изучены свойства новых композиционных иони-тоб, при использовании модельных смесей белков, пептидов, оптимизированы условия ведения хроматографовского процесса. Рвзработаг новый эффективный способ выделения иммуноглобулинов класса с иг сывороток крови гивотных и человека хроматографией на синтезиро-

ванных аниснообменникях, высокая Змкость которых позволяет проре дить очистку без предварительной подготовки исходной сыворотки.

Полученные в данной работе материалы были использованы в синтезе и очистке ряда олигонуклеотидов для генно-инженерных работ, проводимых во ВНИИ МБ, НИБХ СОАН СССР, МГУ и других организациях. Разработанные ионообменные сорбенты включены в каталог научно-технической продукции НПО "ВЕКТОР" и находят широкое применение для анализа и очистки белков различных классов, используемых з диагностических исследованиях.

Апробация работа. Основные результаты опубликованы в 9 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на семинаре "Автоматический синтез олигонуклеотидов" (Москва, 1986), на 10-й Конференции молодых учЗннх "Синтез и исследование биологически акцизных соединений" (Рига, 1989), на Всесоюзной конференции "Проблемы использования целлюлозы и её производных в медицинской и микробиологической промышленности" (Ташкент, 1989), на конференции В'лО им. Менделеева "Молекулярная сорбция биологически • активных веществ"(Пенза,1990), на научных конференциях ВНИИ МБ. Объём работы н структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включая 16 рисунков, 12 таблиц п список цитируемой литературы (131 наименование); состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, результаты л обсуждения, экспериментальная часть (материалы и методы), выводы.

Содержание работы.

Кремнезёмные носители для синтеза олигодезаксирибануклэски-доб. Успехи, достигнутые в последнее время в твердофазном синтезе олигонуклеотидов, связаны в значительной степени с созданием эффективных носителей, используемых в качестве матрицы, на которой

.-•.-лется синтез. В настоящее время для синтеза протяженных олигону-•-'.леотвдов наибольшее применение находят носители "щеточного" типа ::<ремкезекы, модифицированные алкилсиланами) на основе силикагелей и пористых стёкол с диаметром пор 50 нм и более. Для получения максимальных выходов на таких носителях, оптимальная ёмкость нук-лоозида должна иметь величину 10-15 мкмоль/г силикатной матрицы. Однако использование низконагруженного носителя, особенно в крупномасштабном синтезе, приводит к значительному увеличению объбма требуемого количества носителя и, как следствие, увеличению расхода промывочных растворителей и реагентов, продолжительности промн-вск и синтеза в целом. Уменьшить объём носителя, а значит и снизить другие затраты на синтез можно, повышая удельную нагрузку носителя по нуклеозиду. Однако увеличивать нагрузку без уменьшения размера пор на носителях "щёточного" типа обычными методами невоз-.ложно.

Для получения ёмких пшрокопористых носителей с большой удельной нагрузкой по нуклеозвду нами был использован другой подход. Кремнезёмы с диаметром пор 100 нм и более модифицировали полимерными и полифункциональными реагентами с целью увеличения на поверхности носителей функциональных груш. В качестве таких реагентов были использованы полиэтиленимин (ПЭИ), поливиниловый спирт (ПВО), шестиатомный спирт - Б-маннит. Выбор был обусловлен известными из литературы данными о том, что ПЭИ и полиспирты хорошо сорбируются на поверхности кремнеземов за счёт образования водородных связей с силанольными группами, образуя равномерное покрытие поверхности. Адсорбированный слой полимера К модифицированным таким образом носителям присоединяли б'-О-диметокситритил нуклесзид-3*-0-сукцинаг в присутствии ТРБС1 и Ме1т в безводном ш-рвдп:е либо непосредственно, либо через спейсер, состоящий из 2-х

Таблица 1.

Композиционные носители с низкой нагрузкой по нуклеозиду в синтезе олигоиуклеотидоо.

N п/п Носитель, Синтезированный

(емкость,мкмоль/г) олигонуклеотид

Средним выход на стацию в У.

Метод

синтеза«

1. СРО-ПЭИ (45)

2. срс-пэи <)го)

3. МПС-ПВА (103) а. СРО-маннит (71)

СКАСТСТТТ) а<астсттт) с!(Т),0 (3(Т) 7

90 Ь9

ФТЭ <П'Э

ч\Л

Композиционные носители со спейсером.

5. СРС-ПВА (156) -СНСАТССТАСОССССТАТАССТАССТАСССОС)

(., с-го-маннит (82) С1 (ТТСАСАААССАСТТССА)

7. С-ДО-маннит (102) сКАСТСТТТ)

93 90

ФИ ФИ

отэ

< (М'О, ФА, ФИ - фосфг/гриэфирш™. фосфонатный. Фос битный методы синтеза, соответственно.

остзгков шинокапроновой кислоты. Эффективность полученных нами носителей была продемонстрирована в синтезе фосфатным, фоефотри-эфирным, фосфонатным методами олигодезоксирибонуклеотидов 'длиной до 30 оснований (см. табл.1). Средние выхода на стадию конденсации составили ЭО-Э65Е, то есть не уступали таковым при использовании силикатных носителей "щеточного" типа.

Сорбенты, для схнионооОяекной хроматографии олигонуклеотидсв. Одной из лимитирующих стадий процесса химического синтеза олагону-клеотидов является выделение л очистка целевых продуктов из реакционной смеси. С развитием твердофазного синтеза появилась необходимость в разделении сложных реакционных смесей, содержащих олиго-нуклеотиды длиной в несколько десятков оснований. Существовавшие до выполнения настоящей работы анионообменкые сорбенты "щеточного" типа, такие как LiCjrrosorb МН2, Силасорб Амин, Fartisil sax и другие, позволяли проводить выделение олигонуклеотидов длиной до 2030 оснований. Однако, ёмкость'этих сорбентов относительно низкая, а время кизни колонок сравнительно невелико. Высокая ёмкость и стабильность характерны для слабых анионообменников на основе си-ликагелей, модифицированных поперечносшитым ПЭИ, ко разрешающая способность таких сорбентов несколько ниже, чем сильных анионообменников типа Partisil sax, ионогенные группы которых представляю1 собой четвертичные амины.

Задачей настоящего раздела работы было создание анионообыен-ного сорбента с высокой разрешающей способностью, позволяющего выделять из реакционных смесей олигонуклеогздьг длиной более 20 оснований. С этой целью наш получены и исследованы композиционны« сорбента на основе силикагелей Kieseigel Si-5C0 и Силохрома С-80 cUj. 50 нм) и ПЭИ. Кремнеземные матрицы обрабатывали спиртовым раствором ПЭИ (молекулярная масса 30-40 тыс.) и сорбированный ело;

-Э-

го.талера ссивали 1,2-дибромэтзном или дпэпок глдг-гсй смслсЛ !оде разни« аминогрупп на сорбенте составило I - 1,5 мл:сль,'г. 2г..~ голучекия сильных анионосбменнкков ПЗИ-сорбентн квзтернизсзчлп ¡аботхой 302 растзорсм йодистого метила в адатсяятрхгэ. Зтепе:-:; гзатернпзацпи сорбентов составила около 5С%.

Исследование свойств кватернизовакных йодистым метилом сорбентов, названных Полисил СА, проводил! в сравнении с :екватернязсвашшма ПЗИ-сорбентсм и сильным анионоосменнкксм

Сравнение селективности я разрешения знпеноебыгппикоз.

/п Аниснообмекник Седея ;тизность, ■а1 ¿азрес ,г.

а1,2 а1 ,3 ■ н1,г ,3 о , ■

. Полисил СА-1* 2,67 5,41 8,37 4,9 п а, 3 э. 1

. Полисил СА-2** 2,54 4,30 7,46 5,3 5, 6 9 Т 1

. Силохром ПЭИ 1,83 1,53 3,33 1,3 0, 9 2, з

. Рат^вИ ЗАХ 2,14 3,29 5,57 1,4 2, ,5 4, 3

Скорость элинии 0,5 мл/мин. " Скорость элвции 1,5 мл/мин. -4 - олигонухлеотиды длиной 10-14 оснований, соответственно.

аг41зИ БАХ. На данных сорбентах проводили разделение смеси 4-х лигодэзоксирибонунлеотидсв длиной 10-14 основной, посла чего пэ азделлвшимся пикам рассчитывали селективность а и рззрешэнпе я. ак видно из таблица 2, наибольшими разрешением и селективностью Зладают сорбенты на основе кватернизеванного ПЗИ (Полисил СА-1, А-2).

С целью оптимизации процесса разделения олигонухлестндоз "л зрбентах Полисил СА провэдена сери:; ьжягеримэнтов по пгогс-рхе зскольких систем элюции, вклвчашл различные солх (хгитс.,

Время элюццц (мин)

РисЛ Выделение 70-членного дезоксирибонуклеотида из реакционной смеси (20 ОЕ^) ка колонке 3,2x250 мм, II мхм; градиент концегра-шш 0,02 - 0,1 М Иа4?207, рН 6,0; 30% ацетоштрила; % 55°С, скорость потока 1,5 ил/мин; (а)- профиль злиции; заштрихованная область- собранная фракция олкгонуклеотида; (б)- злетрофорез в 102 ПААГ исходной реакцродвдй смеси (I) и выделенного обессоленного олигонуклеотвда меченного 32Р-7~АТР (2); образцы нанесены в 2-2 различных концентрациях.

Ма4?о07, ЫС1, :iaGl, LiCl04, 1,1,80^ На.,50д) 'л органические растворители (ацетснитрш, этиловый, метиловый, пропило вый спирты . Лучшее разнесение олигонуклеотидов было получено s системах, с - -деркзших фосфат калия и пирофосфат натрия. Выло показано,, что бавление полярного органического растворителя в элюирующую систеу; для разделения олигонуклеотидов на Полисил GA ослабляет или снпмэ-ет вторичные неэлектрсстатические взаимодействия олигонуклеотпла . сорбентом и, как правило, существенно улучшает разрешение гср:: меньшем времени разделения. Лучшее разрешение обеспечивал элкект, содержащий ацетонитрил.

Элюция олигонуклеотидов градиентом концентрации Фосфата калия в 30% ацетонитриле в сочетании с высокой разрешающей способностью Полисила СА позволяет выделять из реакционных смесей слиго-нуклеотиды длиной свыше 50-ти оснований. Использование при хроматографии на Полисклах СА градиента концентрации пирофосфата натрия позволяет выделять олигонуклеотидн из реакционных смесей длиной до 70 оснований. На рис.1 представлен профиль хроматографии "экого олкгодезоксирибонуклеотида и электрофореграмма, показывающая его гомогенность. При этом время разделения олигонуклеотидоз сокращается в 1,5 раза по сравнений с системой, содержащей фосфат калия.

Высокая ёмкость полученных ионообмеиников типа Полисил СА позволяет использовать их с высокой нагрузкой олигонуклеотидов ко колонку при сохранении хорошего разрешения. На рис. 2а представлена хроматограмма выделения из реакционной смеси 18-членного слнгс-нуклеотида d (gatcacacatctîtgcaa ) после удаления всех задтткыт: групп. Суммарная нагрузка на колонку размером 3,2x250 m (обь?м Z мл) с Полисил СА-2 составила 270 0Е254 смеси. Для сравнения рис. 26 приведена хроматограмма разделения этой же смеси на коленке с сорбентом для ВЭЖХ фирмы Ватман ïartisil .SAX, на которой в::;

М.КНоК^

0,С5

0,15

- 0,10

0,05

^ 12

5 "

3,2 -

го ш

0 10 20 ' 30 KZH о

Гао.2. ИодуЕрепаратИБВое выделение олигодезоксирибощклеотвдовЕЗ реационннх оесей: (а)- 270 OEj^ реакционной смеси еЦАСАОТАТгсАС-тта) на колонке 3,21250 ш с Погасил СА-2; (б)- то же на холонхе г Far-tis.il SAX; №)- 930 .OEgM реакционной смеси d(pAGAGTATIGACTTA) на колоске 4,6x260 им с Зйлисш САг2; рядом Ергведена профгли об-ргцбнно-фззрвой рехроматогрг^зги указавши продуктов на колонке 3,2x250 мм с xiChrosorb бр-18, IQ мкм, в градкю'е концентрации ааетонятргла, в 0,05 М ацетате триэтчлагаояия, pH 6,5. Условия гнионооСмепноЯ хроматографа! см. рис. 2.

но, что разрешение значительно уступает разделению на Подлеплю СА. Еще Солее высокая удельная нагрузка на сорбент была пр;: очистке 14-членного слигокуклеотида сКрасасга^тзастга) на коленке 4,6х25С мм, на которую наносили около 930 исходной реакционней eve-

"еи (см. рис. 2в). По данным обрещ'нно-фззовой хроматографии, выделенные олигонуклеотиды были практически гомогенны.

Следует отметить, что для сорбентов Полисил СА характерна высокая стабильность. На колонке проводили до нескольких сотен разделений, причем около трети полупрепзративных без значительного уменьшения разрешения. Для хранения колонок вполне пригоден элюект, в котором проводится разделение.

Ационосбяеняся хроматография белков на сорбенпах, модифициро-данкых полизтилетшжол. Хорошие результаты, полученные нами при использовании ПЭИ с молекулярной массой 30-40 тысяч в синтезе сильных анионообменников для хроматографии олигонуклеотидов, побудили нас исследовать возможность применения аналогичных сорбентов для разделения белков.

Поскольку известно, что сорбенты с диаметром пор менее 30 км недостаточно эффективны для разделения белков с массой 15-20 кяло-дальтон и более, для получения анионообменников оыля использованы шкрскопористые кремнезёмы: Армсорб Сил 30 (а^^-ЗО) или силохром C-I20 (d^ -30 ям и ), силохром С-80 (<3^-40-60 нм). Модификацию кремнеземов ПЭИ проводили, обрабатывая носители последовательно ПЗИ, 1,2-дибромэтаном и йодистым метилом, как описано выше. Полученные сорбенты с размером частиц 10-20 мкм имели высокую ионообменную ёмкость: по пикриновой кислоте - 0,9-1,3 мгэкв/г, а по белкам (BSA, НЪ) - 120-150 мг/г.

Хроматогрзфические характеристики Полисилов были исследованы на " модельной смеси белков овальбушяа и ингибитора трипсина из

сои. Поьызэклз рН элюента с 5,35 до 8,5 улучшало разревение этой пары белков, что..по-видимому, связано ка только со свойствами самих белков (р1 4,7 для овальбумина и' 4,5 для ингибитора), но и с неполной кватернизащюй полизтиленимина на сорбенте и наличием в ноесгэнном слое азота с различной степенью замещения.

Было установлено, что изменение скорости потока элюента от 0,5 до 1,5 мл/мин на колонке 3,2x250 мм (V = 2 мл), при сохранении сбсёма элкентов, не оказывало значительного влияния на разрешение. Зто позволяет уменьшить время хроматографии белков без снижения качества их разделения.

Известно, что одним из распространённых методов очистки иммуноглобулинов класса в является аниснообменная хроматография. Наиболее часто с зтой целью применяются мягкие сорбенты, та 1зге как ВЕАЗ-целлюлоза, -сефароза и др. Однако они не позволяют работать с высокими скоростями -элюции, имеют невысокую емкость, а стадия регенерации их трудоемка и продолжительна по времени. Наш была проверена возможность использования сорбентов Полисил СА для выделения кз сывороток крови ряда швстных и человека. На рис. 3 в качестве примера приведена хроматограмма разделения кроличьей сыворотки на Полисиле СА-500. Анализ собранных фракций показал, что пики, выходящие при нанесении образца и в начальном буфере, содержат практически чистый иммуноглобулин в, который хорошо отделяется от остальных сывороточных белков. Аналогично вели себя при хроматографии на полученных сорбентах из сыворотки морской свинки, лозади, барана и человека, причем выходы иммуноглобулинов, опрэде-л5нккз иммунодиффузией, достигали 90-9855.

Важшм этапом в выделении '§0 является подготовка сыворотки для хроматографы. С этой целью для удаления балластных белков ис-псльзувт предварительное фракционирование сыворотки сульфатом ам

✓1

0,2

0,1 Ао

С)

2 3 4 5 6

0 а

¡Г"!

е»

2й, $й бремя злюиии {мин)

Ту,с. 3. Разделение сыворотки крови кролика. Колонка - Полискл СА-5С.С, 3,2x250 км, II мкм. Градиент концентрации 0,01 - 1,0 м кн^о^, рН 6,5. Скорость нанесения I мл/мин, хроматографии -1,5 мл/мин; нанесено I мл сыворотки; (а)- профиль элюцни, (<?>- электрофорез в 1% агарозе собранных фракций; 0- исходная сыворотка.

мония, полиэтилекгликолем, спиртами или другими осадителями, а затем диализ и иные методы удаления используемых реагентов. Как правило , эти методы продолжительны и при Есех мерах предосторокност;.г приводят к потере и частичной денатурации целевого продукта.

Высокая емкость полученных нами сорбентов позволила использовать упроцёняый вариант подготовки сыворотки для хроматографии, заключающийся в простом разбавлении её водой до удельной проводимости не более 0,С5 мкСм/см (при этом счворотку кроязка, например, разбавляли в 2 раза, человека - в 3-4 раза, лошади в 8-10 раз). Разбавленную таким образом сыворотку наносили на колонку. Срскция,

О

-Г6-

содэрнздая обычно ваходилз в объёме, равном объёму разбавленной сыворотки, нанесенной на колонку. Максимальная нагрузка нераз-бгвлгнной сыворотки составила I и 1,5 мл на грамм сорбента с диаметром пор 50 и 30 нм, соответственно.

Получение, последоЗокче свойств к использование наъионооблэн-ч'.ксс на основе крелнезёлод 6 хиЗкоягмоО. трсжхюграфги белков к г.епг^Зоо. Продолжением накос исследований по разработке сорбентов для очистки биополимеров стал синтез и изучение новых композиционных катконообменников.

В качестве исходного материала для синтеза сорбентов были использованы силохромы С-120 и С-80, а такке новый силикагехъ для ВЭЖХ - Армсорб Скл-30 (с^ -30 нм). Полимерное сокрытие получали, обрабатывая кремнезёмы ПЭЙ - 600 тыс.-Г млн. аналогично описанному вы"'?. Пси взаимодействии введённых таким образом в матрицу аминогрупп с янтарным ангидридом были синтезированы карбоксил- содержание катпснозбменнпкн. По аналогии с композиционными анионообменны-сорбентами такие катио£осбменники были названы - Полисил К.

Для сравнения с композиционными катионообменникзми были синтезированы и проверены т-акне носители "цёточного" типа на основе кремнезгУсз, модифицированных силаном. В этом случае исходные кремнесёмг предварительно обрабатывали 7- аминопропилтриэтоксиси-лан;м, а затем ациляроваля янтарным .ангидридом.

Реакция актирования амишпропидьных групп на поверхности сорбентов "даточного" типа на основе аминопропил-кремнезёмов про-ходола практически количественно. В случае композиционных носителей до 50% исходных аминогрупп не вступало в реакцию ацилирования, что обусловлено, по-видимому, наличием третичных аминогрупп, имею-г.пхсл з исходном ПЭИ и образующихся при свивке его дибром&таном.

Кэтиснообмэякая ёмкость по белку (нъ) для сорбентов с диамет-

А&0 -М[КН2РО^

лонка 4,6x250 мм. Градиент концентрации (фосфата калия, рН 6,5; скорость потока I мл/мин; I- овгльбумин, 2- рийонуклеаза, 3- шгто-хром С, 4- лизоцим.

-16: -;/ ггоо зо км гогтавила 75-105 кг/т. тогда как для сорбентов с д.::>:«трск пор 50 ел - 46-48 мг/г, что соответствует меньшей удель-поверхности матриц. Сорбента на основе ам:;копропил-кремнезсыов высокое но специфическое связывание. Это, вероятно, мокко объяснить доступностью всей относительно гидрофобной аминопропил-сукиинагЕой группировки и возможностью сорбции белков за счёт ле-электростатаческого взаимодействия. Сорбенты Полисил К имеют на порядок меньшее неэлектростатическое связывание, по-видимому, за счёт высокой гидрофильности сшитого слоя ГШ и его хороией биосовместимости с белками.

Хромзтографические свойства сорбентов были исследованы на модельных смесях белков: BSA Ср! 4,9) овальбумина (рХ 4,7), ингибитора трипсина из сои (pi 4,5), рибонуклеазы (pi 9,5), цитохрома С (pi 9,2) и лизоцша (pI II.O). Как видно из рис.4, Полисил К да5т значительно лучшее разрешение смеси белков, чем аминопропил-суиппштяый сорбент, несмотря на то, что по исходным характеристикам (диаметр пор, удельная^ поверхность) и ионообменной ёмкости по бедку они практически одинаковы. Изменение рН оказывает определ8н нее влияние на разрешение, которое достигает оптимальной величины для данной смеси при рН 6,5.

При хроматографии белки с изоэлектричэской точкой ниже 6, такие как овальбумин, ингибитор трипсина из сои, ВЗА выходили с колонок в свободном объёме. Это указывает на то, что тлеющиеся на ПЭй-сукцанатных композиционных сорбентах неацилированные аминогруппы но участвуют в электростатическом взаимодействии с белками и не влияют на их удерживание в колонке.

Средний, выход белков с колонки был высоким и составлял 92-93S, что также подтверждает низкую неспецифическую сорбцию белков композиционными сорбентами и в динамическом режиме.

Рис. 5. Разделение пептидов. Колонка Полисил К-300, 10 мкм, 3,2x250 мм. Скорость потока 1,5 мл/мин. Элюция: градиент концентрации 0,01-0,3 М фосфата калия, рН 7,5 в 30« ацетонитриле; I -пептид дельта-сна (Б51Г), 2 - нейропептид из моллюска (ивс-амид), 3 - вещество Р, 4 - а-нэоэддорфин (1-Ю), 5 - динорфии А (1-13).

Повышение линейной скорости злощш в 4 раза (от в до 25 см/мин) снижало разрешение контрольных белков всего на 30%, что позволило уменьшить время хроматографии до 15 минут с сохранением хорошего разделения компонентов смеси. Эти данные показывают потенциальные возможности проведения хроматографии на Полисил-К в высокоскоростном рекимз элюции при сохранении удовлетворительного качества разделения, что немаловажно при очистке лабильных белков.

Полученные сорбенты были использованы для хроматографии смеси из 5 пептидов. Разделение проходило в порядке увеличения заряда (см. рис.5). При оптимизации условий хроматографии данных пептидов на Полисиле К было найдено, что их разрешение значительно улучшается при добавлении в элюент ацэтонитрила (до 25%). Поскольку полученные катионообыенники являются слабыми, существенное влияние на разделение пептидов оказывает рН элвента. Наилучшее разрешение получали при рК 6,5-7,5.

, ВЫВОДИ.

1. Разработаны способы получения новых высокоемких композиционны? носителей для синтеза олигонуклеотидов на основе широкопористых, кремнеземов, модифицированных поливиниловым спиртом, в-ыаннитом, нолиэтилениминсм. Показана перспективность их использования дш твердофазного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов различными методам.

2. Разработан новый способ получения сильных анионообменников дл; высокоэффективной жидкостной хроматографии протяжённых олигонуклеотидов на основе широкопористых силохромов и кватернизованног« иолиэтиленимина. Показано, что такие сорбенты обладают высокой емкостью, селективностью, разрешением, позволяющими разделять н: аналитических колош-эх полупрепаративные количества реакционны

смесей олигсяундеотвдов длиной до 70 оснований.

3. Синтезированы новые композиционные анисноэСменники для разделения белков. Установлено, что сорбенты характеризуются высокой стабильность», селективностью, ионообменной емкость-« по белку при низкой не специфической сорбция. На синтезированных сорбентах разработана и практически реализована схема очистки иммуноглобулинов из сыворотки кивотннх и человека, позволяющая без предварительных стадий подготовки сыворотки за один хромагогрэфический цикл выделять чистые иммуноглобулин с высоким еыходом.

4. Синтезированы новые композиционные катионообмекные сорбенты и исследованы их свойства в сравнении с катионообменниками "щеточного" типа. Показано, что при одинаковой ионообменной емкости порученные композиционные сорбенты обладают более высоким разрешением, значительно меньшим неспецифическим связыванием и могут быть с успехом использованы для высокоэффективной жидкостной хроматографии белков а пептидов.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Ястребов С.И. Способ получения сорбента для разделения олигону-клеотидов: A.c. No II53976 СССР //Б.И. 1985. Но 17. С. 28.

2. Ломакин А.И., Ястребов С.И., Попов С.Г. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов. I. Исследование носителей на основе силикагеля марки "Силохром". //Блооргзв. химия. 1985. Т. II, Ко 7 С. 920-926.

3. Ломакин А.И., Ястребов С.И., Попов С.Г. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов. III. Исследование носителей на основе силикагелей марки "Силохром" и "Силшгор". //Биоорган, химия. I93S. Т. 12, Но 2. С. 213-219.

4. Ястребов С.И., Попов С.Г. Сильные ашгонообменники на основе си-ликагеля и полиэтиленимина для. высокоэффективной хроматографии

олиго- и лоллнуклеотвдов. //Биэорган. химия. 1985. T. 12, iîo 5. С. 66I-GS3.

5. Ястребов С.П., Горбунов ¡O.A., Лбмакин А.И., Каршиев H.H., Попов С.Г. Способ получения носителей: для твердофазного синтеза оли-гонуклеотацов: А.с': No I439I08 СССР //Б.И. 193-3; Но 15. С.37.

6. Ястребов С.И., Ломакин А.И., Каршлев H.H., Горбунов Ю.А. Носители ка основе силикатных материалов для синтеза и выделения олигонуклеотидов. //V Есес, конф. по мет. получ. и акал, биохлм. реактив.: Сборник тезиссв. Рига. I9S7. С. 67.

7. Ястребов С.К., Ломакин А.И., Горбунов Ю.А., Карпышев H.H. Силикатные широкопористыэ носители для синтеза олигонуклеотидов. //Биоорган. ХИМИЯ. 1988. Т.14, Но I. С. II9-I20.

8. Ястребов С .И., Дедковэ Л.М., Офицеров В.И. Хроматография белков и фрагментов ЛНХ на ионообменных сорбентах из модифицированных кремказЗмов и целлюлозы. //Бсесоюзн. конф. "Проблемы использ. целлюлозы и ей произвол, в мед. и микробиол. пром-ти.: Сборшпс тезисов. Ташкент. 1989. С. 93.

9. Ястребов С.И., Офицероз В.И. Ионообменные кремнезёмные 'сорбенты для высокоэффективной хроматографии белков. //Конф. ВХО им. Менделеева " Молек. сорбция биол. актив, веществ": Сборник тезисов. Пенза. 1990. С. 24.