Получение модифицированных силикатных ностителей и их применение в синтезе и хроматографии биополимеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

ЯСТРЕБОВ СЕРГЕЙ ИВАНОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ СИЛИКАТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СИНТЕЗЕ И ХРОМАТОГРАФИИ БИОПОЛИМЕРОВ

Специальность 02.00.10 - бкосрганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии Минмедпрома СССР

Научный руководитель: кандидат химических наук Офицеров В.И.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Загребельный D.H.

кандидат химических наук Горн В.В.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.Ы.М.Шемякина АН СССР

Защита состоится ."¿1" ис^Л 1991 г. в 9jzi на заседают Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР по адресу: 6300Э0, Новосибирск-90, проспект ак. Лаврентьева,8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР.

Автореферат разослан *JJ" 1ЭЭ1 года

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук О.С.Федорова

Актуальность проблемы. Исследования по разработка новых с-ффект*/.:-ных носителей для хроматографии и тв§рдсфазнсго синтеза биспсдзме-ров особенно интенсивно развиваются в течение двух последних десятилетий. Актуальность таких исследований обусловлена, с одной стороны, бурным прогрессом Сиоорганяческой химии, генной янженерии, молекулярной биологии, биотехнологии, с другой стороны - расширением сферы использования высокоочитенных биологически зктивж:: препаратов для новых диагностических и лечебно-профилактических средств. Bes это требует создания надёжных и эффективных методов синтеза и очистки олигонуклеотидов, получения з индивидуальном виде белков и пептидов из генно-инженерных продуцентов я друпсс источников. Особенно остро эта проблема встала в начале 80-х годоз. когда "существующие коммерческие сорбенты перестали полностью удовлетворять возросшим требованиям практики. Так, отсутствовали анио-нообменники, позволяющие эффективно производить выделение и очистку синтетических олигонуклеотидов протяженностью более 20-ти оснований, что стало актуальной задачей при совершенствовании твёрдо-фазного олигонуклеотидного синтеза. Использование ЗЗЖХ в практике аналитической и препаративной очистки разнообразных белков и пептидов сдерживалось недостаточно широким ассортиментом ионообменных стационарных фаз.

Разработка методов получения протяжЗнных олигонуклеотидов, наряду с развитием эффективных способов наращивания олигснуклео-твдной цепи и автоматизацией тзбрдофазного синтеза, требовала создания эффективных высоко&мких носителей, используемых з качестве матрицы-подложки, на которой ведётся синтез.

Целью настоящей работы явилось получение высокоёмких, еяеско-пористых носителей для твбрдофазлого синтеза олигонуклеотидов: разработка высоко5мких аЕИОнообмек:-:кх сорбентов для сазделэндл

:трсгякённ1;х слигонуклеотвдов; синтез новых акионооомекзых и катио-нсобменных носителей для БЗЕХ белков к пептидов.

Научная новизне и практическая значимость. Получены новые композиционные носители на основе кремнезёмов с полимерными покрытиями из ГШ, ПВС, Б-маннита ёмкостью 100-200 мкмоль/г и установлено, что они могут успешно использоваться для синтеза олигонуклеотидов фосфотриэфирным, фэсфитшм и фосфонатным методами. Б процессе разработки носителей для твёрдофазного синтеза исследована зависимость выхода целевых олигонуклеотидов от размера пор кремнезёмной матрицы, характера её модификации, нагруженности первым нуклеозкдом и способа его иммобилизации.

Ка основе отечественных широкопористых кремнезёмных матриц, модифицированных поперечно-сшитым кватернизованнкм ПЭИ, нолучены сильные анионооОменники для ВЭЖХ олигонуклеотидов и исследованы их свойства. Колонки с новыми сорбентами обладают высокой селективностью и разрешением, позволяющими разделять олигонуклеотида.длиной до 70-ти оснований. Высокая ёмкость сорбентов даёт возможность проводить на аналитических колонках полупрепаративную очистку синтетических олигонуклеотидов. Синтезированные анионообменники еысо-ко стабильны и выдерживают без снижения разрешения несколько сот разделений.

Исследовано влияние структуры ионогенного слоя сорбентов на ионообменную ёмкость-и гидрофобное неспецифическое связывание белков. Показано преимущество композиционных носителей перед сорбентами "цёточного" типа. Изучены свойства новых композиционных ионг-тсе, пр;: использовании модельных смесей белков, пептидов, оптимизированы условия ведения хроматографического процесса. Разработан новнй зффектиЕКЫй способ выделения иммуноглобулинов класса' й из сзьсротэк крова зшвотннх к человека хроматографией на спитезиро-

ванных анионообменниках, высокая ёмкость которых позволяет проводить очистку igG без предварительной подготовки исходной сыворотки.

Полученные в данной работе материалы были использованы в синтезе и очистке ряда олигонуклеотидов для генно-инженерных работ, проводимых во ВШИ МБ, НИБХ СОАН СССР, МГУ и других организациях. Разработзнные ионообменные сорбенты включены в каталог научно-технической продукции НПО "ВЕКТОР" и находят широкое применение для анализа и очистки белков различных классов, используемых в диагностических исследованиях.

Апробация работы. Основные результаты опубликованы в 9 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на семинаре "Автоматический синтез олигонуклеотидов" (Москва, 1986), на 10-й Конференции молодых учЗных "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1989), на Всесоюзной конференции "Проблемы использования целлюлозы и её производных в медицинской и микробиологической промышленности" (Ташкент, 1989), на конференции Вл.0 им. Менделеева "Молекулярная сорбция биологически активных веществ"(Пенза,1990), на научных конференциях ВНИИ МБ. Объём работы и структура диссертации. Диссертация изложена ка 125 страницах машинописного текста, включая IS рисунков, 12 таблиц и список цитируемой литературы (131 наименование); состоит из следующих разделов: взедение, обзор литературы, результаты и обсуждения, экспериментальная часть (материалы и методы), выводы.

Содержание работа.

Крешезвлше носители для синтеза олигсдезоксирибонунлэстгл-дов. Успехи, достигнутые в последнее время в твердофазном синтезе олигонуклеотидов, связаны в значительной степени с созданием эффективных носителей, используемых в качестве матрицы, на котспс!

.••.-дется синтез. В настоящее время для синтеза протяженных олигону-члестлдов наибольшее применение находят носители "щеточного" типа :.%р-змнеземы, модифицированные алкилсиланами) на основе силикагелей •л пористых стёкол с диаметром пор 50 нм и более. Для получения максимальных выходов на таких носителях, оптимальная ёмкость нук-лс-озида должна иметь величину 10-15 мкмоль/г силикатной матрицы. Однако использование низконагрукенного носителя, особенно в крупномасштабном синтезе, приводит к значительному увешчетт объема требуемого количества носителя и, как следствие, увеличению расхода промывочных растворителей и реагентов, продолжительности промывок и синтеза в целом. Уменьшить объём носителя, а значит и снизить другие затраты на синтез можно, повышая удельную нагрузку но' сителя по нуклеозиду. Однако увеличивать нагрузку без уменьшения размера пор на носителях "неточного" типа обычными методами нэвоз-.ложно.

Для получения ёмких широкопористых носителей с большой удельной нагрузкой по нуклеозиду нами был использован другой подход. Кремнезёмы с диаметром пор 100 нм и более модифицировали полимерными и полифункциональными реагентами с целью увеличения на поверхности носителей функциональных групп. В качестве таких реагентов были использованы полиэтиленимин (ПЭИ), поливиниловый спирт (ПВС), шестиатомный спирт - Б-маннит. Выбор был обусловлен известными из литературы данными о том, что ПЭИ и полиспирты хорошо сорбируются на поверхности кремнеземов за счёт образования водородных связей с силанольными группами, образуя равномерное покрытие поверхности. Адсорбированный слой полимера К модифицированным тагам образом носителям присоединяли Б'-О-диметокситритил нуклеозид-З'-О-сукцинат в присутствии ТР5С1 и Ме1т в безводном пиридине либо непосредственно, либо через спейсер, состоящий из 2-х

Таблица 1 .

Композиционные носители с низкой нагрузкой по нуклеозиду в синтезе олигонуклеотидов.

N п/п Носитель, Синтезированный

(емкость,мкмоль/р) олигонуклеотид

Срепнии выход на стадию в у.

Метод синтеза«

1. СРО-ПЭИ М5)

2. СРе-ПЭИ (120)

3. МПС-ПВА (103)

4. СРО-маннит (71)

скастсттт)

снастсттт)

СИТ) ,0 сНТ) 7

911 Н9 ч 5

фтэ ФТЭ '¡■а ■ра

Композиционные носители со спейсером.

5. СРО-ПВА (156) сКСАТСОТАСОССССТАТАОСТАСОТАСОСеС)

г.. с-го-маннит (62) ¡1 (ТТСАСАААССАСТТССА)

г. г:-г:о-ма»нит (102) О(АСТСТТТ)

< ФА, ФИ - ¡-осфотриэфирный, ФосФонатныи, фосфитный методы синтеза, соответственно

93 90

фи Ч'Й фтэ

octstkob аминокапроновой кислоты. Эффективность полученных нами носителей была продемонстрирована в синтезе фосфитным, фосфотри-эфирным, фосфонатным методами о лито де зок сириб онукл е о тадов 'длиной до 30 оснований (см. тейа.1). Средние выходы на стадию конденсации составили 90-9655, то есть не уступали таковым при использовании силикатных носителей "щеточного" типа.

СорОеиш для анионообменной хромжографии олигонуклесшдов. Одной из лимитирующих стадий процесса химического синтеза олигону-клеотидов является выделение и очистка целевых продуктов из реакционной смеси. С развитием твердофазного синтеза появилась необходимость в разделении сложных реакционных смесей, содержащих олиго-нуклеотиды длиной в несколько десятков оснований. Существовавшие до выполнения настоящей работы анионообменные сорбенты "неточного" типа, такие как XiCftrosorb NHg, Силасорб Амин, Fartisil sax и другие, позволяли проводить выделение олигснуклеотидов длиной до 2030 оснований. Однако, ёмкость этих сорбентов относительно низкая, а время жизни колонок сравнительно невелико. Высокая емкость и стабильность характерны для слабых анионообменнпков на основе си-ликагелей, модифицированных поперечносшитым ПЭИ, но разрешающая способность таких сорбентов несколько ниже, чем сильных анионооб-менников типа Partisii sax, ионогенные группы которых представляют собой четвертичные амины.

Задачей настоящего раздела работы было создание анионообмен-ного сорбента с высокой разрешающей способностью, позволяющего выделять из реакционных смэсей олигонуклеотида длиной более 20 оснований. С этой целью нами получены и исследованы композиционные сорбенты на основе силикагелей Kieselgei si-5CO и Силохрома С-80 ( ^р 50 нм) и ПЭИ. Кремнеземные матрицы обрабатывали спиртовым раствором ПЭИ (молекулярная масса 30-40 тыс.) и сорбированный слой

-э-

полимера сшивали 1,2-дабромэтзном иди днзпокеиднсД смс-лсй ЛТ-1. Содержание аминогрупп на сорбенте составило 1-1,5 г,коль/-. Ллл получения сильных знионосбменняков ПЭИ-сорбентн кзэтеркизоэалп cí-работкой 30« раствором йодистого метила в зцетозитрила. Степень кватернизации сорбентов составила около 50%.

Исследование свойств кзатернизовакяых иодисткм метилом сорбентов, названных Полисил СА, проводили в срззнении о яекватернизсвакными ПЗМ-сорбектсм и сильны?.! анионообменниксм

Та^ЛТЦ^ ".

Сравнение селективности и разрешения анионообменников.

N п/п Аниснообменник Селек: 'ИЗЯОСТ ъ,а1,п

а1 ,2 а, п ' Г ■ *1,2 R1,3 Н. 5

I. Полисил СА-1* 2,67 5.41 8,37 4,9 6,3 a Л

2. Полисил СА-2** 2,54 4,30 7,46 5,3 6,6 о , ' {

3. Силохром ПЗИ 1,83 . 1,53 3,33 1,3 0,9 2 ,3

4. Fartisil SAX 2,14 3,29 5,57 1,4 2,5 4 ,3

Скорость элюции 0,5 мл/мин. ' Скорость элюции 1,5 мл/юга. 1-4 - олигонуклеотиды длиной 10-14 оснований, соответственно.

РагНзИ 5АХ. На данных сорбентах проводили разделение смеси 4-х олигодезоксирибонуклеотпдсв длиной 10-14 основной, после чего по разделившимся пикам рассчитывали селективность а и разрешение я. Как видно из таблицы 2, наибольшими разрешением и селективность» обладают сорбенты на основе кватернизованного ПЗИ (Полисил СА-1, СА-2).

С целью оптимизации процесса разделения олигокуклестндоз г-:5 сорбентах Полисил СА провздвна сери:? ьчспериментов пс пзсгс-с:-:-? нескольких систем элюции, включаюпх:: различные соли

го чо ео Время эаюццц (мин)

Рис Л Выделение 70-членного дезоксирибонуклеотида из реакционной смеси (20 ОЕ25.4) на колонке 3,2x250 мм, II мкм; градиент концетра-ujgi 0,02 >- 0,1 Ы Na4P207> рН 6,0; ЗОЙ ацетонитрила; t 55°С, скорость потока 1,5 мл/мин; (а)- профиль элвдик; заштрихованная область- собранная фракция олигонуклеотида; (б)- элетрофорез в IOS ПААГ исходной реакционной смеси (I) и выделенного обессоленного

олигонуклеотида меченого различных концентрациях.

32-

Р-7-ДТР (2); образцы нанесены в 2-х

Sa4?,07, LiCX, :iaCl, LiCiQ4, LL,3Q4, Na2S04) И opraJB!"C-CK:e растворители (зцетонитрил, этиловый, метиловый, пропилоный спирты.. Лучшее разрешение олигонуклеотилов было получено в системах, содержащих фосфат калия и пирофосфат натрия. Было показано, что бавление полярного органического растворителя в элюируищую систему для разделения олигонуклеотилов на Полисил СА ослабляет или снижает вторичные неэлектрсстатические взаимодействия олигс-нуклеотидо ? сорбентом и, как правило, существенно улучшает разрешение гпл меньшем времени разделения. Лучшее разрешение обеспечивал элкент, содержащий ацетонитрил.

Элвция олигонуклеотилов градиентом концентрации фосфата ка-

s

лия в 30% ацетонитриле в сочетании с высокой разрешающей способностью Полисила СА позволяет выделять из реакционных смесей олиго-нуклеотиды длиной свыше 50-ти оснований. Использование при хроматографии на Полисилах СА градиента концентрации пирофосфатз натрия позволяет выделять олигонукл&отида из реакционных смесей длиной Д" 70 оснований. На рис.1 представлен профиль хроматографии ^аксго олигодезоксирибонуклеотида и электрофореграмма, показывавшая эго гомогенность. При этом время разделения олигонуклеотидов сокращается в 1,5 раза по сравнению с системой, содержащей фосфат калия.

Высокая ёмкость полученных ионообменников типа Полисил СА позволяет использовать их с высокой нагрузкой олигонуклеатядоз на колонку при сохранении хорошего разрешения. На рис. 2а представлена хроматограмма выделения из реакционной смеси 18-членного олиго-нуклеотида <kgatcacacatctttgcaa) после удаления всех загзга-т групп.. Суммарная нагрузка на колонку размером 3,2x250 мм (обь?:.; ~ мл) с Полисил СА-2 составила 270 0E254 смеси. Для сравнения к: рис. 26 приведена хроматограмма разделения этой же смеси на колсн-ке с сорбентом для ВЭЗЮС фирмы Ватман Partisil .sas, на которой н::~

Гас. 2. Полупрепаративное выделение олигодезоксарйЗощюеоткдов вз реаиисших авесеЯ: (а)- 270 CS,5jJ реакционное смеси й(Аал.01жтКАС-Ма) на колонке 3,2x250 мм с Погасал СА-2; (б)- то ее на колонке с lartisu SAX; (в)- 930 OSj^ реакционной смеси dtpAGAGTATTGACTTA) на колонке 4,6x250 мм с Полясил СА-2; рядом приведены профили об-расбнно-фззрвсВ рехроматогрв^и указанна продуктов на колонке 3,2x250 т с ысьгсеогч кр-18, 10 мкм, в градиента концентрации гцетонктргла, в С,05 М ацетате тризтилакмояия, рН 6,5. Условия акдоноосменноа хроматографа! си. рис. 2.

но, что разрекение значительно уступает разделении на Полизкле СА. Еде Солее высекая удельная нагрузка на сорбент была при счистке 14-членного олггонуклеотида (МрАСАСТАТТСАСТТА) на колонке 4,6x250 мм, на которую наносили около 930 ОЕо^ исходной реакционной смеси (см. рис. 2в). По данным обравённо-фазсвой хроматограф, выделенные олигонуклеотиды были практически гомогенны.

Следует отметить, что для сорбентов Полисил СА характерна высокая стабильность. На колонке проводили до нескольких сотен разделений, причём около трети полупрепаративных без значительного уменьпения разрешения. Для хранения колонок вполне пригоден элюент, з котором проводится разделение.

лнуснообяенная хрожтография белков на сорбекюх, лодифиццро-ванныг тюлаэшленшятал. Хорошие результаты, полученные нами при использовании ГШ с молекулярной массой 30-40 тысяч в синтезе сильных анионообменников для хроматографии олигснуклеотидов, побудили нас исследовать возможность применения аналогичных сорбентов для разделения белков.

Поскольку известно, что сорбенты с диаметром пор менее 30 ем недостаточно эффективны для разделения белков с массой 15-20 ккло-дальтон и более, для получения анионообменников были использованы Еирскопористые кремнезёмы: Армсорб Сил 30 (сиОр-30) или силохрсм С-120 (^р-30 нм и ), силохром С-80 (<5^-40-60 нм). Модификацию кремнезёмов ПЗИ проводили, обрабатывая носители последовательно ПЗИ, 1,2-дибромэтаном и йодистым метилом, как описано выше. Полученные сорбенты с размером частиц 10-20 мкм имели высокую ионообменную ёмкость: по пикриновой кислоте - 0,9-1,3 мгэкв/г, а по белкам (ЕВА, ЯЬ) - 120-150 КГ/Т.

Хроматогрефические характеристики Полисилов были исследованы на модельной смеси белков овальбумина и ингибитора трипсина из

сол. Повышение рН элюента с 5,35 до 8,5 улучшало разрешение этой пары белков, что, по-видимому, связано не только со свойствами саки белков (р1 4,7 для овальбумина и-4,5 для ингибитора), но и с неполной кватернизацией полиэтиленимина на сорбенте и наличием в пснсгенном слое азота с различной степенью замещения.

Было установлено, что изменение скорости потока элвента от 0,5 до 1,5 мл/мин на колонке 3,2x250 мм (V = 2 мл), при сохранении объёма элкентов, не оказывало значительного влияния на разрешение. Это позволяет уменьшить время хроматографии белков. без снижения качества их разделения.

Известно, что одним из распространённых методов очистки иммуноглобулинов класса а является анионообмеяная хроматография. Наиболее часто с этой целью применяются мягкие сорбенты, таз сие как ПЕАЕ-целлюлоза, -сефароза и др. Однако они не позволяют работать с высокими скоростями элюции, имеют невысокую емкость, а стадия регенерации их трудоемка и продолжительна по времени. Наш была проверена возмдкность использования сорбентов Полисил СА для выделения из сывороток крови ряда животных и человека. На рисг. 3 в качестве примера приведена хроматограмма разделения кроличьей сыворотки на Полисиле СА-500. Анализ собранных фракций показал, что пики, выходящие при нанесении образца и в начальном буфере, содержат практически чистый иммуноглобулин в, который хорошо отделяется от остальных сывороточных белков. Аналогично вели себя при хроматографии на полученных сорбентах з^в-из сыворотки морской свинки, лошади, барана и человека, причем выходы иммуноглобулинов, определённые иммунодиффузией, достигали 90-98%.

Важным этапом в выделении х^о является подготовка сыворотки для хроматографии. С этой целью для удаления балластных белков используют предварительное фракционирование сыворотки сульфатом ам

МгРО^т

А

О

I?

2 3 Ц 5 е 7 *

20 5(7

бремя элюиии шин)

Рте. 3. Разделение сыворотки крови кролика. Колонка - Полискл СА-5СГ, 3,2x250 мм, II мкм. Градиент концентрации 0,01 - 1,0 м К^РОд, рН 6,5. Скорость нанесения I мл/мин, хроматографии - 1,5 мл/мин; нанесено I мл сыворотки; (а)- профиль элвдии, (б)- электрофорез в 1% агарозе собранных фракций; 0- исходная сыворотка.

мония, полиэтилекгликолем, спиртами или другими осадителями, а затем диализ и иные методы удаления используемых реагентов. Как правило, эти методы продолжительны и при всех мерах предосторожности приводят к потере и частичной денатурации целевого продукта.

Высокая ёмкость полученных нами сорбентов позволила использовать упрощённый вариант подготовки сыворотки для хроматографии, заключающийся в простом разбавлении е§ еодой до удельной проводимости не более 0,05 мкСм/см (при этом сгаоротку кролика, например, разбавляли в 2 раза, человека - б 3-4 раза, лошади 5 5-10 раз). Разбавленную таким образом сыворотку наносили на колонку. Фракция,

соаерзказзя обычно выходалз в объёме, равном объёму разбавленной сыворотки, нанесенной .на колонку. Максимальная нагрузка вераз-бавдекной сыворотки составила I и 1,5 мл на грамм сорбента с диа-у-:-гром пор 50 и 30 нм, соответственно.

Получение, исследодакие свойств и использование кашонсоблен-Н1~св на, основа крэлнеэёлов в хидкосгглой ^олопогрсфт белков и в. Продолжением наших исследования по разработке сорбентов для очистки биополимеров стал синтез и изучение новых композицион-кых катионообменников.

Б качестве исходного материала для синтеза сорбентов были использована силохромы С-120 и С-80, а такке новый скликагель для БЭЖХ - Армсорб Скл-30 (йд^-ЗО нм). Полимерное покрытие получали, обрабатывая кремнезЗмы ПЭИ ~ 600 тыс.-1 млн. аналогично описанному зьпе. "При взаимодействии введ§нных таким образом в матрицу аминогрупп с янтарным ангидридом были синтезированы карбоксил- содержание катиснозСмекники. По аналогии с композиционными анионообменны-сорбентами такие катио^ообмзнники были названы - Полпсил К. ¿ля .сравнения с композиционными катионообменниками были синтезированы и проверены также носители "щёточного" типа на основе кремнеземе в, модифицированных силаном. В этом случае исходные кремнзг5.«ы предварительно обрабатывали 7- аминодропилтриэтоксиси-ланзм, а затем ацилировали янтарным ангидридом.

?зз:-:ция адапирования аминопропильных групп на поверхности сорбентов "шуточного" типа на основе аминопропил-кремнезЗмов про-х:г'практически количественно. В случае композиционных носителей до 50,? исходных аминогрупп не вступало в реакции ацилирования, что обусловлено, по-видимому, наличием третичных аминогрупп, имеа-г.пхсй з исходном .ПЭИ и образующихся при сшивке его дибромэтзном. Котиснсобменкад ёмкость по белку Шь) для сорбентов с диамет-

Аж ■ мСЩРО^]

ланка 4,6x250 мм. Градиент концентрации фосфата калия, рН 6,5; скорость потока I мл/мин; I- овальбумин, 2- рибонуклеаза, 3- цито-хром С, 4- ллзоцим.

-18: 'м пор 30 нм составила V5-I05 иг/г, тогда как для сорбентов с д.!:»>хрем лор 50 ш - 46-43 мг/г, что соответствует меньшей уделъ-тг г il поверхности матриц. Сорбенты на основе амикопропил-кремнезёмов ли высокое не специфическое связывание. Это, вероятно, можно объяснить доступностью всей относительно гидрофобной аминопропил-сумаяатной группировки и возможностью сорбции белков.за счёт яе-электростатического взаимодействия. Сорбенты Полисил К имеют на порядок меньшее неэлектростатическое связывание, по-видимому, за счёт; высокой гндрофильности сшитого слоя ГШ и его хорошей биосовместимости с белками.

Хромэтографические свойства сорбентов были исследованы на модельных смесях белков: ВЗА (р! 4,9) овальбумина (рТ 4,7), ингибитора трипсина из сои (pi 4,5), рибонуклэазы (pi 9,5), цитохрома С (pi 9,2) и лизоцима (pi 11,0). Как видно из рис.4, Полисил К дабт значительно лучшее разрзшение смеси белков, чем аминопропил-сукцинэтяый сорбент, несмотря на то, что по исходным характеристикам (дпжетр пор, удельная( поверхность ) и ионообменной ёмкости по белку'они практически одинаковы. Изменение рн оказывает определён кое- влияние на разрешение, которое достигает оптимальной величины для данной смеси при рН 6,5.

При хроматографии белки с изоэлектрической точкой ниже 6, такие как овальбумш, ингибитор трипсина из сои, BSA выходили с колонок в свободном объёме. Это. указывает'на то, что имеющиеся на ПЭл-сукцйяэтных композиционных , сорбентах неацилированные аминогруппы не участвуют в электростатическом взаимодействии с белками и не влияют на их удерживание в колонке.

Средний выход белков с колонки был высоким и составлял 9293%, что также подтверждает низкую неспецифическую сорбцию белков композиционными сорбентами и в динамическом режиме.

Рис. 5. Разделение пептидов. Колонка Полисил К-300,. 10 мкм, 3,2x250 мм. Скорость потока 1,5 мл/мин. Элюция: градиент концэнт-рации 0,01-0,3 М фосфата калия, рН 7,5 з 303 ацетонитриле; I -пептид дельта-сна №11"), 2 - нейропептид из моллюска (шс-амид), 3 - вещество Р, 4 - а-неоэндорфин (1-10), 5 - динорфин А (1-13).

Повкшение линейной скорости элюции в 4 раза (от 6 до 25 см/мин) снижало разрешение контрольных белков всего на 30%, что позволило уменьшить время хроматографии до 15 минут с сохранением хорошего разделения компонентов смеси. Эти данные- показывают потенциальные возможности проведения хроматографии на Полисил-К в высокоскоростном режиме элюцил при сохранении удовлетворительного качества разделения, что немаловажно при очистке лабильных белков.

Полученные сорбенты были использованы для хроматографии смеси кз 5 пептидов. Разделение проходило в порядке увеличения заряда (см. рис.5). При оптимизации условий хроматографии данных пептидов ка Полисиле К было найдено, что их разрешение значительно улучшается при добавлении в элкент ацетонитрила (до 25%). Поскольку полученные катионооо'менники являются слабыми, существенное влияние на разделение пептидов оказывает рН элюента. Наилучшее разрешение получали при рН 6,5-'/,5.

, ВЫВОДЫ.

1. Разработаны способы получения новых высокоемких композиционных носителей для синтеза олигонуклеотидов на основе широкопористых, кремнеземов, модифицированных поливиниловым спиртом, в-маннитом, полиэгилекиминсм. Показана перспективность их использования для твердофазного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов различными методами.

2. Разработан новый способ получения сильных анионообменников для высокоэффективной жидкостной хроматографии протяжённых олигонуклеотидов на основе широкопористых силохромов и кватернизованного полиэтиленимина. Показано, что такие сорбенты обладают высокой емкостью, селективностью, разрешением, позволяющими разделять на аналитических колонках полупрепаративные количества реакционных

смесей олигокуклеотидов длиной до 70 оснований.

3. Синтезированы новые композиционные анионообменники для разделения белков. Установлено, что сорбенты характеризуются высокой стабильностью, селективностью, ионообменной емкостью по белку при низкой неспецифической' сорбции. На синтезированных сорбентах разработана и практически реализована схема очистки иммуноглобулинов из сыворотки животных и человека, позволяющая без предварительных стадий подготовки сыворотки за один хроматографический цикл выделять чистые иммуноглобулины с высоким выходом.

4. Синтезированы новые композиционные катионообменные сорбенты и исследованы их свойства в сравнении с катионообменннками "щеточного" типа. Показано, что при одинаковой ионообменной емкости покрученные композиционные сорбенты обладают более высоким разрешением, значительно меньшим неспецифическим связыванием и могут быть с успехом использованы для высокоэффективной жидкостной хроматография белков и пептидов.

Основное содержание диссертации изложено в paócmaz:

1. Ястребов С.И. Способ получения сорбента для разделения олигону-клеотидов: A.c. No II53976 СССР //Б.И. 1985. Но 17. С. 28.

2. Ломакин А.И., Ястребов С.II., Попов С.Г. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов. I. Исследование носителей на основе силикагеля марки "Силохром". //Биоорган, химия. 1935. Т. II, но 7 С. 920-926.

3. Ломакин А.И., Ястребов С.И., Попов С.Г. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов. III. Исследование носителей на основе силикагелей марки "Силохром" и "Силипор". //Биоорган, хгсгия. 1936. Т. 12, lío 2. С. 213-219.

4. Ястребов С.И., Попов С.Г. Сильные аниоЕообменники на основе силикагеля и полнэтлленлмина для вь-сокоэффекгоЕноС хрсимсграфаг

олиго- и полинуклэотидов. //Бкоорган. химия. 1935. Т. 12, ко 5. С. 661-GS9.

5. Ястребов С.И., Горбунов Ю.А., Лбмакин А.И., Карпывез H.H., Попов С.Г. Способ получения носителей для твердофазного синтеза оли-гонуклеотидов: A.c." Но I439I0S СССР //Б.И. 1933. No 15. С.37.

6. Ястребов С.И., Ломакин А.И., Карпыаев H.H.,\Горбуков Ю.А. Носители на основе силикатных материалов для синтеза и выделения оли-гонуклеотидов. //V Всес. конф. по мет. получ. и анал. биохим. реактив.: Сборник тезисов. Рига. 1987. С. 67.

7. Ястребов С.И., Ломакин А.И., Горбунов Ю.А., Карпышев H.H. Силикатные широкопористые носители для синтеза олигонуклеотидов. //Еиооргак. химия. 1988. Т.14, No I. С. 119-120.

8. Ястребов С.И., Дедкова Л.М., Офицеров В.И. Хроматография белкой и фрагментов ДНК на ионообменных сорбентах из модифицированных кремнезёмов и целлюлозы. //Бсесоюзн. конф.""Проблемы использ. целлюлозы и еб произвол, в мед. и микробиол. пром-ти.: Сборник тезисов. Ташкент. 1989. С. 93.

9. Ястребов с.И., Офицеров В.И. Ионообменные кремнезёмные 'сорбенты для высокоэффективной хроматографии белков. //Конф. ВХО им. Менделеева " Молек. сорбция биол. актив, веществ": Сборник тезисоз. Пенза. 1990. С. 24.