Синтез полианилинсодержащих сорбентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот и белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. Полианилин как модификатор поверхности при получении композиционного сорбента.

1.1. Формы полианилина и их взаимопревращение.

1.2. Исследование механизма полимеризации анилина.

1.2.1. Химическая полимеризация анилина.

1.2.2. Электрохимическая полимеризация анилина.

1.3. Влияние условий полимеризации на структуру полианилина.

1.4. Влияние условий протонирования полианилинового основания на свойства и структуру образующейся эмеральдиновой соли.

1.5. Изменение структуры полианилина при воздействии абсорбированной воды.

1.6. Образование тонких пленок полианилина на различных твердых носителях.

1.7. Дисперсии полианилина.

Глава 2. Композиционные полимерсодержащие сорбенты для выделения и очистки биополимеров.

2.1. Особенности хроматографии биополимеров.

2.2. Преимущества использования композиционных полимерсодер-жащих сорбентов.

2.3. Пористые стекла как основа для получения композиционных сорбентов.

2.4. Способы получения композиционных сорбентов.

Глава 3. Хроматографические методы разделения биополимеров.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Исходные вещества, реагенты, материалы.

Аппаратура.!.

Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Получение полианилинсодержащих сорбентов на основе различных носителей.

1.1. Определение оптимального состава реакционной смеси при полимеризации анилина в отсутствии носителей.".

1.2. Влияние поверхности носителей на полимеризацию анилина, выбор носителя для получения композиционного сорбента.

1.3. Выбор оптимальных условий для получения полианилинсодержащего сорбента на основе объемно-пористого кремнезема.

Глава 2. Изучение свойств полученного полианилинсодержащего сорбента, полученного на основе объемно-пористого кремнезема.

2.1. Структурные характеристики полианилинсодержащего сорбента на основе объемно-пористого кремнезема.

2.2. Изучение сорбционных свойств полианилинсодержащего сорбента на основе объемно-пористого кремнезема.

Глава 3. Применение полианилинсодержащего сорбента на основе объемно-пористого кремнезема для выделения нуклеиновых кислот.

Глава 4. Применение полианилинсодержащего сорбента на основе кремнезема для высокоэффективной жидкостной хроматографии белков.

ВЫВОДЫ.

Современные исследования в области генной инженерии, клонирования, биотехнологии и клинической диагностики невозможны без использования чистых концентрированных препаратов нуклеиновых кислот и белков. Применяемые для этих целей сорбционные материалы не всегда в полной мере отвечают предъявляемым к ним требованиям: достаточной механической прочностью, высокой сорбционной емкостью и в то же время селективностью в процессах разделения смесей биополимеров. Например, неорганические сорбенты - кремнеземы - характеризуются значительной неспецифической и нередко необратимой сорбцией разделяемых компонентов, их гидролитическая стабильность довольно низкая. Органические сорбенты - полимеры - не обладают необходимой механической прочностью, кроме того, степень набухания полимерного геля изменяется при смене элюента.

Для преодоления этих недостатков были созданы композиционные материалы на основе кремнезема, поверхность которого модифицирована полимерами и олигомерами. Такие материалы объединяют в себе механические свойства неорганического носителя с уникальными сорбционными свойствами иммобилизованных на его поверхности полимерных фаз. Использование фторсодержащих полимеров в качестве модификаторов кремнеземных носителей позволило получить ряд композиционных сорбентов, характеризующихся высокой хемостойкостью, гидролитической стабильностью и уникальными сорбционными свойствами. В тоже время технологические трудности, возникающие при получении фторполимерсодержащих композиционных сорбентов, стимулируют поиск новых полимеров для модификации кремнезема.

В последние годы большое внимание уделяется получению и исследованию свойств так называемых smart-полимеров (стимул-чувствительных), которые при незначительном изменении условий окружающей среды (рН, температура, ионная сила) существенно изменяют свои свойства. Использование таких полимеров в качестве полимерных модификаторов кремнеземов позволит направленно и обратимо изменять свойства поверхности.

В качестве такого полимерного модификатора предложено использовать полианилин, имеющий сорбционно-активные центры в макромолекулах и способный обратимо изменять свою структуру при изменении рН среды. Применение полианилина в качестве полимерного модификатора кремнезема позволит решить актуальную задачу получения композиционных полимерсодержащих сорбентов с комплексом особых свойств, позволяющих разделять сложные смеси биополимеров.

Работа является частью структурно-функциональных исследований новых сорбентов, проводимых в лаборатории «Полимеры для биологии» института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Цель работы состоит в получение новых по-лианилинсодержащих сорбентов на основе пористых носителей для разделения сложных смесей биополимеров.

Литературный обзор посвящен рассмотрению работ, в которых изучаются свойства полианилина, позволяющие использовать его в качестве полимерного модификатора при получении композиционных сорбентов. Объясняются возможные механизмы полимеризации анилина, влияние условий проведения полимеризации и условий допирования на структуру и свойства получаемого полимера. Обзор публикаций позволяет оценить преимущества по-лимерсодержащих модифицированных сорбентов для выделения и очистки биополимеров.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучена окислительная полимеризация анилина в присутствии носителей с различной кислотностью поверхности.

2. Показано, что гетерофазная полимеризиация анилина в водной среде в присутствии носителей носит авто каталитический характер. Показано, что с увеличением кислотности поверхности носителя полианилин образуется преимущественно на поверхности носителя.

3. Подобрано оптимальное соотношение компонентов реакционной системы (моно-мер:допант:окислитель) и продолжительность полимеризации, при которых вся поверхность объемно-пористого кремнезема покрывается пленкой полианилина.

4. Получен гидрофильный полианилинсодержащий сорбент на основе объемно-пористого кремнезема с сорбционными центрами ионно-обменного типа, обеспечивающими высокую селективность полученного сорбента при разделении сложных смесей биополимеров.

5. Показано, что полианилинсодержащий сорбент на основе объемно-пористого кремнезема селективен к парам: нуклеиновая кислота-белок, ДНК-РНК. Предложены эффективные методики использования полученного сорбента для выделения чистых концентрированных препаратов ДНК в одну стадию из лизатов бактериальных и растительных клеток, из плазмы крови человека, из цельной крови животных.

6. Показано, что полианилинсодержащий сорбент на основе объемно-пористого кремнезема эффективен при разделении смесей белков в градиенте рН без добавления солей и в отсутствие органического компонента в составе подвижной фазы, а также при проведении обращенно-фазового варианта хроматографии.

81

1.Валу J. etal. Method for enhancing polyaniline conductivity US Patents, 176,851; 1/1993,252/500.

2. Akheel A. Syed & Maravattikal K. Dinesan. Polyaniline: reaction stoichiometry and use as an ion-exchange polymer and acid/base indicator. Synthetic Metals, 36 (1990) 209-215.

3. B. Vinset & J. Waterson. Colloidal dispersions of electrically-conducting, spherical polyaniline particles. J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1990) 683-684.

4. В.Я.Кабанов. Радиационная химия «умных» полимеров. Химия высоких энергий, том 34, №4 (2000) 243-252.

5. J. Libert & J. L. Bredas. Self-trapping of positive polarons upon evolution from leucoemer-aldineto pernigraniline: A theoretical study. Synthetic, Metals 69 (1995) 121-122.

6. K. Kaneto, M. Kaneko, Y. Min & Alan G. Mac Diarmid, "Artificial muskul": Electrochemical actuators using polianilin films, Synthetic Metals 71 (1995) 2211-2212.

7. Кобрянский B.M., Арнаутов С.А., Мотякин M.B., Изучение механизма реакции конденсации анилина на примере получения водорастворимого полимера. Высокомолекулярные соединения. Серия А, 1995, т.37, №1, с.35-38.

8. Е. Т. Kang, К. G. Neoh, К. L. Tan. Protonation and deprotonation of polyaniline films and powders revisited. Synthetic Metals 68 (1995) 141-144.

9. Я. JI. Коган, У.И. Кнерельман, И. Г. Шунина, JI. С. Фокеева, Я. И. Эстрин. (ТМНОгШб и другие промотирующие агенты химической полимеризации анилина. Изв. АН. Серия хим., N8 (1994) 1500-1502.

10. Hasic М. Physical-chemical properties and katalic properties of polyaniline, protonated 12-MPA, 1994.

11. Y. Wei, X. Tang, Y. Sun. A study of the Mechanism of aniline polymerization. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, Vol. 27, (1989) 2385-2396.

12. S. Wu, F. Zeng & J. Shen. Diffusion-controlled deposition of polyaniline onto poly (methylmethacrylate) substrates. Polym. Int., 47 (1998) 335-339.

13. Y-B. Shim, M-A. Won and S-M. Park. Electrochemistry of conductive polymers. J.Electrochem. Soc., Vol. 137, No. 2, February 1990, 538-543.

14. N. Gospodinova, P. Mokreva & L. Terlemezyan. Concomitant processes in the redox switching of polyaniline. Polym. Int., 47 (1996) 79-84.

15. Ya. L. Kogan, G.I.Davidova, E.I.Knerelman, G.V.Gedrovich, L.S. Fokyeva, L.V.Emelina & V. I. Savchenco. Kinetic peculiarities of chemical aniline polimerization. Synthetic Metals, 41-43 (1991) 887-890.

16. Ljerka Duic, Zoran Mandic & Spomenka Kovac, Polimer-Dimer distribution in the electrochemical synthesis of polyaniline, Electrochemica Acta, Vol. 40, Nol 1 (1995) 1681-1688.

17. F. Wang, J. Tang, L. Wang & Z. Mo. Study on the crystallinity of polyaniline. Mol. Crist. Liq. Crist, Vol 160 (1988) 175-184.

18. K. G. Neoh, M. Y. Pun, E. T. Kang, K. L. Tan. Polyaniline treated with organic acid: doping characteristics and stability. Synthetik Metals 73 (1995) 209-215.

19. E.S. Matveeva, R. Diaz Calleja, V. P. Parkhutik. Thermogravimetric and calometric studies of water absorbed in polyaniline. Synthetic Metals, 72 (1995) 105-110.

20. Jamshid K. Avlyanov, Jack Y. Josefowicz, Alan G. MacDiarmid. Atomic force microscopy surface morphology studies of "in situ" deposited polyaniline thin films. Synthetic Metals 73 (1995) 205-208.

21. Y.F. Nicolau and A.Ermolieff. XPS characterization of polyaniline filled n+-type porous silicon. Synthetic Metals 71 (1995) 2073-2074.

22. N. Gospodinova, P. Mokreva, L.Terlemezyan. Stable Aqueous Dispersion of Polyaniline. J. of the Chemical Society 13 (1992) 923-924.

23. Ya. L. Kogan, L.S. Fokeyeva, V.L. Savchenco. Viskosimetric Inoestigation of Polyaniline Solutions (abstract). Synthetic Metals, 1990, №37, p.75.

24. Y.Z. Wang, J. Joo, C.-H. Hsu, A.J. Epstein. Charge transport of camphor sulfonic acid-doped polyaniline and poly(o-toluidine) fibers: role of processing. Synthetic Metals 68 (1995) 207-211.

25. Noriyuki Kuramoto, Eugene M. Genies. Miccellar chemical pjlymerization of aniline. Synthetic Metals 68 (1995) 191-194.

26. Шервуд Т., Пигфорд P., Уилки Ч. Массопередача. М., Химия, 1982, с.52-53.

27. Рудобашта С.Б. Массоперенос в системах с твердой фазой. М, Химия, 1980, с.42-43.32.0стерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985, с.44-47.

28. Лисичкин Г.В. (ред.) Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. М, Химия, 1986, с. 12-16.

29. Rubinstein М., Stein S., Udenfriend S. Isolation and characterization of the opioid peptides from rat pituitary p-Endorphin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p.4969-4972.

30. Servis L., Pettel N.M. Purification of ribonuclease Ti on porous glass affinity adsorbents. J. Chromagr., 1974, v.97, p.33-38.

31. Ходж П., Шеррингтон Д. (ред) Реакции на полимерных подложках в органическом синтезе. М., Мир, 1983, с.42-45.

32. Eltekov Y.A., Kiselev A.V., Khokhlova T.D., Nikitin Yn.S. Reversed-pass liquid chromatography of isomeric alkylbenzenes. Chromatografia, 1973, v.6, p 187-189.

33. Айлер P. Химия кремнезема. M., Мир, 1982, т.1, с.65-94.

34. Chang S.H., Gooding К.М., Regneis F.E. High-performance exlusion chromatography of proteins. J.Chromatogr., 1976, v. 125, p. 103-114.

35. Иванов A.E., Сабуров B.B., Зубов В.П. Модификация минеральных носителей оли-гомерами и полимерами-путь для синтеза сорбентов для хроматографии биополимеров., ЖХВО Д.И. Менделеева, 1989, т.34(3), с.368-377.

36. Ivanov А.Е., Saburov V.V., Zubov V.V. Polymer-coated adsorbents for separation of bio-polimers. Advances in Polymer Science. ,1992, v. 104,135-175.

37. Kataev A.D., Resnicova O.A., Kapustin D.V., Zubov V.P. Polytrifluorostyrenecoated silica as a packing for column liquid chromatography. J. Chromatogr., A., 1994, v.660, p. 131-136.

38. Saje Lidija M., Jovanoic Zoran R., Jovanoic GoranN., Vunjak-Novakovic Gordana, Pesic Radojca D., Vucovic Dragoljub V. Fluidodinamika hromatografs ke kolone sa magnetno stabili-sanim fluidizovanim slojem. Hem. Ind. 1993, v. 47, №4-6, c.62-68.

39. Flow-through capacitor: Пат. 5192432 США, МКИ5В 01 D 15/08/Andelman M./ -#792902; заявл. 15.11.91; опубл. 09.03.93.

40. Лурье А.А. Хроматографические материалы. Справочник, М., Химия, 1978, с.440.

41. Cuatrecasas P., Anbensen С.В. Affinity chromatography. Ann. Rev. Biochem., 1971, v.40, p.259-278.

42. Fleer G.J., Lyklema J.Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, v.368, p.741-746.

43. Douglas J.F., How does sourface roughness affect polymer-sourface enteraction. Macro-molecules, 1989, v.22, p.3708-3716.

44. Д.В. Капустин, В.В. Сабуров, JI.JI. Завада, Г.Б.Барсамян, В.П. Зубов, Композиционные фторполимерсодержащие сорбенты для выделения и очистки биополимеров. Биоорганическая химия, М., 1997, №11.

45. В.В. Сабуров, Муйдинов М.Р., Катаев АД, Туркин С.И., В.П. Зубов, (1990). 5-ый Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. 20-22ноября 1990 г., Рига, с.207.

46. В.В. Сабуров, Муйдинов М.Р., Гурьянов С.А., Катаев АД, Туркин С.И., В.П. Зубов, Перфторполимерсодержащие кремнеземные сорбенты и их применение в обращенно-фазовой хроматографи биологически-активных веществ. Ж. физ. хим., 1991, т.65; 10, с.2692-2698.

47. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А. и др. Аналитическая хроматография. Москва, Наука, 1994, с.254.

48. Herfman Е., Chromotography, Part A: Fundamentals and techniques. New York, Elsevier Scientific Publishing company, 1983, p.335.

49. Б.А.Руденко, Г.И. Руденко. Высокоэффективные хроматографические процессы, том 2: Процессы с конденсированными подвижными фазами. Москва, Наука, 2003, с.286.

50. Jansen J.-C., Ryden L., et al., Protein purification. Cambridge, VCH Publishers, Inc, 1989, p.502.

51. Я.Кольман, К.-Г.Рём. Наглядная биохимия. Москва, «Мир», 2000, с.469.

52. Энгельгард X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях М., Мир, 1980, с.23-25.

53. Органикум. Практикум по органической химии. 1ч., Мир, М.,1979, с.128.

54. Darling Т., Albert J., Russel P., Albert D.M., Reid T.W. Rapid purification of an RNA-timus virus and proteins by high-performance sterec exlusin chromatography on porous glass columns. J. Chromatogr., 1977, v.131, p.383-390.

55. Jeffrey D. Cohen, Raymond F. Tietz. Stable solution of polianiline and shaped articles therefrom. US Patent №5135682, 1992, 252-500.

56. E. Pigois-Landureau, Y.F. Nicolau, M. Delamar. XPS study of layer-by- layer deposited poly-pyrrole thin films. Synthetic Metals 72 (1995) 111-119.

57. Eli Ruckenstein, Yue Sun. Polyaniline-containing electrical conductive composite prepared by two inverted emulsion pathways. Synthetic Metals 74 (1995) 107-113.

58. A. Q. Zhang, C. Q. Cui, Jim Y. Lee. Electrochemical degradation of polyaniline in HCIO4 and H2SO4. Synthetic Metals 72 (1995) 217-223.

59. Giulio Boara, Massimo Sparpaglione. Synthesis of polyanilines with high electrical conductivity. Synthetic Metals 72 (1995) 135-140.

60. J. Prokes, I. Krivka, J. Stejskal. Control of electrical properties of polyaniline. Polym. Int., 43 (1997) 117-125.

61. R. Baum. Conductive polyaniline made enzymatically, C&EN, 19 (1993) 36-37.

62. G.A. Planes, M.C. Miras, C. Barbero. Strong effects of counterions on the electrochemistry of poly (N-methylaniline) thin films. Polymer International. 51 (2002) 429-433.

63. C.Zhu, C.Wang, L.Yang, C.Bai, F.Wang. Dopant dimension influence on polyaniline film structure. Applied Physics A 68, (1999) 435-438.

64. T.Lippert, F.Raimondi, J.Wambach, J.Wei, A.Wokaun. Surface modification and structuring of electrical conducting and isolating polyaniline films. Applied Physics A 69 (Suppl), (1999) 291-293.

65. L.Duic, Z.Mandict and S.Kovac. Polymer-dimer distribution in the electrochemical synthesis of polyaniline. Electrochimica Acta, Vol. 40, No. 11, (1995) 1681-1688.

66. E.A.Ponzio, R.Echevarria, G.M.Morales and S.Barbero. Removal of N-methylpyrrolidone hydrogen-bonded to polyaniline free-standing films by protonation-deprotonation cycles or thermal heating. Polymer International. 50(2001) 1180-1185.

67. Грег С., Синг Кю Адсорбция, удельная поверхность, пористость. М., Мир, 1984, с. 186-203.

68. Чизмарджев Ю.А., Макрокинетика процессов в пористых средах. М., Наука, 1971, с.54, 362.

69. Альбер Сассон. Биотехнология: свершения и надежды. М., Мир, 1987, с.29-33.

70. Краткий справочник физико-химических величин. М., Химия, 1972, с. 108-109.

71. Иванчев С.С. Радикальная полимеризация. Ленинград, Химия, Ленинградское отделение, 1985, с.217-239.

72. Маниатис Д. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984, с.387-412.

73. Дрейпер Дж., Скотг Р., Армитилж Ф., Дьюри Г., Джекоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.:Мир, 1991,с.238.

74. Гловер Д. (ред). Клонирование ДНК. Методы. М.:Мир, 1988, с.361.

75. Qiagen. Product Guide. 1988, p. 14.

76. David G.L., Dibner M.D., Battey J.F. Basic methods in molecular biology. New York:Elsevier, 1986, p.42-50.

77. Leadon S.A., Cerutty P.A. Anal. Biochem. 1982. V.120, p.282-288.

78. Bowtelld D.L. Anal. Biochem. 1987. V.162, p.463-465.

79. Civlla T.A., Sklar R.M., Hauser S.L. Anal. Biochem. 1988. V.174, p.485-488.

80. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. Nucl. Acids Res. 1988. V.16, p.1215.

81. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York, 1989, p.9,12.

82. Дж. Гиллет. Фотофизика и фотохимия полимеров. Введение в изучение фотопроцессов в макромолекулах. :Пер. с англ., М., Мир, 1988, с.248-249.

83. Saiki R.K., Gelfand D.H., Erlich Н.А. at al. Polymeraze chain reaction (1988) Science, 239,487.