Получение, структура и магнитные свойства железосодержащих наночастиц, синтезируемых бактериями тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

Ладыгина Валентина Петровна

Получение, структура и магнитные свойства железосодержащих наночастиц, синтезируемых бактериями

01.04.07 — физика конденсированного состояния 03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

4847831

2 6 МАЙ 2011

Красноярск - 2011

4847831

Работа выполнена в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского Научного Центра СО РАН, г. Красноярск

Научные руководители: доктор физико-математических наук,

профессор, Гуревич Юрий Леонидович

кандидат физико-математических наук, доцент, Столяр Сергей Викторович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

ведущий научный сотрудник, Егранов Александр Васильевич Институт Геохимии СО РАН, г.Иркутск

доктор физико-математических наук, профессор, Барцев Сергей Игоревич Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО «Сибирский

федеральный университет», г. Красноярск

Защита диссертации состоится «20» июня 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.04 при Иркутском государственном университете по адресу: 664003, г. Иркутск, бульвар Гагарина, 20

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета

Автореферат разослан « » Я£йЛ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук, доцент

Б.В. Мангазеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Интенсивный поиск новых способов синтеза наночастиц в настоящее время обусловлен уникальными физическими характеристиками, присущими данным объектам, а, следовательно, широким спектром их возможного применения [1]. Существующие технологии синтеза наночастиц в подавляющем большинстве основаны па физических и физико-химических методах обработки исходных материалов (реагентов и веществ)- Для получения наночастиц успешно используют такие методы, как ультрафиолетовое облучение, аэрозольные технологии, литография, лазерная абляция, методы фотохимического восстановления, ультразвуковые методы. Отрицательная сторона использования этих методов - высокая стоимость и использование опасных химических веществ и пенолярных растворителей, что ограничивает их применение, например, в клинической области.

Известны способы синтеза наночастиц золота, серебра, золото-серебряных сплавов, селена, теллура, платины, палладия, диоксида кремния, титана, циркония и т.д. с использованием биологических объектов: микроорганизмов, растительных экстрактов и ферментов, структур подобных ДНК, вирусов, водорослей, грибов, дрожжей и т.д. \2\. Преимущества микроорганизмов как потенциальных источников получения наночастиц заключаются в возможности управляемою наращивания их биомассы, а также получения напокристаллитов с заданными свойствами.

Огромное внимание уделяется биологическому синтезу железосодержащих наночастиц, что обусловлено биологической совместимостью данных объектов и возможностью управления внешним магнитным полем. Эти преимущества позволяют рассматривать железосодержащие наночастицы в качестве кандидатов при клиническом использовании для доставки лекарственных препаратов в соответствующие мишени. Известны четыре соединения железа, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Это магнетит 1'ез04, маггемит - у-¥е203, пирротин ]7е1„хЯч. (0<х<0,2) и ферригидрит 5Ре20з*91120. До сих пор большее внимание привлекал магнетит, в частности образующийся в магнитотактных (п^пс1о1ах1з) бактериях [3]. Однако культивировать магнитотактные бактерии очень сложно, что 01рапичиваст возможности использования биогенного магнетита. Источников выделения биогенного ферригидрита намного больше - 'ткани животных и человека, растения и микроорганизмы, поэтому он более доступен для исследований и использования в прикладных целях [4].

В данной работе предложен метод синтеза железосодержащих наночастиц путем биоминерализации железа металл-редунирующими микроорганизмами. Использована бактериальная культура, выделенная из сапропеля озера Боровое (Красноярский край).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработать способ биогенного синтеза наноразмсриых частиц для биомедицииского примеиения.

ЗАДАЧИ

1. Разработать опытную лабораторную биотехнологию получения биомассы бактерий-продуцентов железосодержащих напочастиц.

2. Исследовать структуру и физические свойства полученных паночастиц с целью идентификации синтезированного минерала. Установить влияние условий культивирования бактерий на физические свойства паночастиц.

3. Выявить перспективные методы обработки получаемого бактериального наиокристаллического материала и возможные области практического применения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Разработана опытная биотехнология получения наиочастиц ферригидрита с размерами частиц 2-5 пт.

Выявлены методом мсссбауэровской спектроскопии четыре позиции трехвалентного железа в исследуемом бактериальном ферригидрите, квадрупольные расщепления которых занимают вполне определенные неперекрывающиеся диапазоны значений, а именно, С|8{Г"е3+(1)}=0.43-

0.67.м/с, (2Б{Ре3+(2)}=0.83-1.07мм/с, 08{Ре3+(3)}=1.22-1.52мм/с и д8{Ре3+(4)}=1.59-1.93мм/с.

Выявлены изменения структуры паночастиц в процессе культивирования микроорганизмов в зависимости от продолжительности, освещенности и т.д.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Преимущества практического использования биосинтезированных наночастиц заключается в следующем:

1. Крайне малая дисперсия размеров и физических свойств частиц.

2. Уникальная сорбционная способность.

3. Возможность создавать направленное перемещение частиц внешним магнитным полем.

4. Отсутствие выраженного токсического влияния па биоткани.

ОСНОВНЫЕ ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Наиочастицы, образующиеся в результате культивирования микроорганизмов Klebsiella oxytoca, являются ферригидритом РегОз'пНгО,

4

размеры этих частиц 2-5 nm. В процессе культивирования в кристаллохимической структуре ферригидрита происходят процессы упорядочения лигандов.

2. Ферригидрит представляет собой чередующиеся пустые, сдвоенные и одиночные слои ионов трехвалентного железа, находящихся в кислородных (или ОН) октаэдрах. В наночастицах ферригидрита микроорганизмов Klebsiella oxytoca обнаружены четыре неэквивалентные позиции ионов железа, различающиеся по величине квадрунольного расщепления. Позиции Fei и Fe2 с относительно малой степенью искажения локальной симметрии, QS(Fel) ~ 0.55 мм/с и QS(Fc2) ~ 1 мм/с обусловлены ионами железа, находящимися в сдвоенных и в одиночных слоях железа. Позиции Fe3 и 1'е4 с большой степенью искажения, QS(Fc3) ~ 1.5 мм/с и QS(Fe4) ~ 1.8 мм/с являются дефектными для структуры ферригидрита, поскольку образуются при выходе ионов железа в слои пустых октаэдров.

3. В наночастицах ферришдрита сосуществуют аптиферромагнитпый порядок и эффективный магнитный момент, обусловленный декомпенсацией спинов в магнитных подрешетках наночастицы. Наличие эффективного магнитного момента у данных наночастиц позволяет управлять их движением магнитным полем.

АПРОБАЦИЯ РАБО ТЫ Результаты, изложенные в диссертации, докладывались па конференциях различного уровня: XX международная школа-семинар «Новые магнитные материалы микроэлектроники», 12-16 июня 2006г., Москва; 18 - Менделеевский съезд но общей и прикладной химии.-23-28 сентября, 2007, Москва; II Всероссийская конференция по наноматериалам, IV Международный семинар «Наноструктурпые материалы-2007 Белорусь-Россия», 13-16 марта, 2007, Новосибирск; Moscow International Symposium on Magnetism (MISM 2008), Moscow, Russia, 2008; Актуальные вопросы оториноларингологии, Москва, 11-12 сентября 2008г.; Первой международной конференции «Наноструктурпые материалы - 2008: Беларусь-Россия-Украина», 2008г., Минск, Беларусь; IV Euro-Asian Symposium "Trends in MAGncti/m": Nanospintronics. liASTMAG-2010, Ekaterinburg; 12-th International Conference on magnetic fluids, August 1-5, 2010, Sendai, Japan.

СТРУКТУРА И ОБ'ЬНМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Содержание работы изложено на 107 страницах машинописного текста, включая 42 рисунка, 14 таблиц и списка литературы из 60 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, определены цель и задачи исследований.

Первая глава НАНОЧАСТИНЫ: МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙС ТВА, ПРИМЕНЕНИЕ. ОБЗОР.

В первой главе дается определение наноструктурироваппого материала (наночастиц) и рассмотрены некоторые способы их получения, в основе которых лежат физико-химические методы. Второй параграф посвящен обсуждению особенностей свойств наночастиц биогенного происхождения. Рассматриваются виды минералов, синтезируемые микроорганизмами. В третьем пара1рафе изложены результаты исследований магнитных наночастиц биологического происхождения. Подробно рассматривается функциональная роль белка ферритина и механизм синтеза ферригидрита па молекулярном уровне, фотохимическая активность ферритина. В четвертом параграфе описываются опыт применения наночастиц в медицине. В заключение главы ставятся задачи исследования.

Вторая глава ПОЛУЧЕНИЕ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ НАНОЧАСТИЦ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ.

Используемые микроорганизмы были выделены из сапропеля озера Боровое (Красноярского края). Озеро характеризуе тся отсутствием процессов сульфатредукции и наличием денитрификации и железовосстаиовлепия. Отобранный в озере сапропель пропускали через магнитный сепаратор. Выделенная таким образом культура рассевалась па агаризованную среду Lovley [5]. Идентификация выделенной культуры до вида были выполнены в ФГУ ВГНКИ (г. Москва) лабораторией молекулярной диагностики отдела бактериологии. Во втором пара1рафс описаны используемые экспериментальные методики культивирования и учета микроорганизмов, а также методики определения структуры (рентгеновская дифракция, просвечивающая электронная микроскопия, малоугловое рентгеновское рассеяние) синтезируемых наночастиц и методики изучения физических свойств (метод мессбауэровской спектроскопии, метод ферромагнитного резонанса). В третьем параграфе описан технологический режим наращивания биомассы бактерий-продуцентов (.Klebsiella oxyloca). Бактерии выращивали в периодическом режиме без аэрации и перемешивания па минерально-солевой среде, содержащей необходимые для их роста N, Р, К, Mg, S. В качестве источника углерода и энергии испытаны глюкоза, бензойная кислота, цитрат железа и калия. При культивировании па среде с глюкозой бактерии имели максимальную удельную скорость роста 0,144 ч", на среде с цитратом калия 0,08 ч"1, бензойной кислоты - 0,06 ч"1 в аэробных и 0,02 ч'1 в микроаэрофильных условиях роста. Энергетически наиболее приемлемым для синтеза биомассы Klebsiella oxyloca из проверенных

субстратов оказался цитрат калия, а для накопления ферригидрита - цитрат железа.

Синтез наночастиц и одностадийном процессе культилироиания происходил в период от 7 до 30 суток, т.е. в период активного размножения и в стационарной фазе культуры бактерий. Синтезированные ианочастицы сохранялись в культуре покоящихся клеток до 90 суток. Синтез происходит также в двухстадийпом процессе наращивания биомассы бактерий и накопления наночастиц. Суть его в том, что на первой стадии бактерии выращиваются на минеральной среде с цитратом калия в качестве источника углерода и энергии. Титр клеток на этой стадии выше на 1-2 порядка, чем при одностадийном культивировании.

Механизм синтеза наночастиц бактериальной культурой до сих пор до конца не выяснен, поэтому микроорганизмы наращивались на питательных средах, содержащих различные формы железа. Проведено исследование динамики роста бактериальной культуры и изменения структуры наночастиц, при культивировании микроорганизмов в среде, содержащей различные формы железа (Fe2+ океанат и Fe3+ вдпрат). Микроорганизмы культуры Klebsiella oxyloca были высеяны на среду Lovlcy на оксалатс Г'с2+, который использовался в качестве хелатора, следующего состава (в г/л): NallC03 -2.5; СаС12-Н20 - 0.1; KCl - 0.1; NH4C1 - 1.5; NalljPCVIIjO - 0.6; соль мора (FeS04*(NH4)2S04'6H20) - 0.4; щавелевая кислота (Н2С2О4) - 0.22; дрожжевой экстракт 0.05 г/л (концентрация цитрата Fe2+ - 0,57г/л), а также па среде, содержащей Fe3+ цитрат.. Культивирование бактерий Klebsiella oxytoca осуществлялось в различных условиях освещенности, включая культивирование в полной темноте. Отбор проб производился через 3-28 дней после засева микроорганизмов в питательную среду.

В результате, были получены кривые зависимости изменения сухого веса бактерий, выращенных па Рс2+оксалате и на Fc3+ цитрате, от времени при различных условиях освещенности, т.е. была прослежена динамика выпадения бактериального осадка с течением времени и прослежено влияние режима культивирования па рост бактериальной культуры. Полученные кривые представлены на рисунках 1 и 2.

0.2 0.15 0,1 0,05

—♦—постоянное освещение "НИ • день-ночь - А- темнота

Рис.1 - Зависимость сухого веса бактерий от времени в условиях различной освещенности при культивировании на Г'е2+ оксалатс

• постоянное освещение * день-ночь - ^ темнота

Рис. 2 - Зависимость сухого веса бактерий от времени в условиях различной освещенности при культивировании на Т'е3+ цитрате

Биомасса наращивалась в периодическом режиме культивирования бактерий при восстановлении железа и в микроаэрофильных условиях. Получены положительные результаты наращивания биомассы бактерий в модифицированном технологическом режиме культивирования бак терий при концентрации клеток в культуре на порядок больше. Была прослежена динамика численности бактериальной культуры в средах различного состава. Посев проводился на среду Lovely в четырех модификациях - на оксалатс железа, на оксалате железа и цитрате калия, на цитрате железа, на цитрате железа и цитрате калия. Для получения колоний, был произведен посев последовательных разведений па агаризованпую питательную среду мясопептонный агар (МПА) в.чашки Петри. Подсчет выросших колоний производился в течение 7 дней, результаты представлены на рисунке 3.

350 300

250 ^ 200

$ 150 100

50

0

Рис. 3 - Численность выросших колоний при изменении состава питательной

среды

Третья глава. ИЗУЧЕНИИ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРЫ И ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НЛНОЧЛСТИЦ СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ КЬЕВБШЕЕЛ ОХУТОСЛ. В третьей главе представлены результаты исследований кристаллической структуры и свойств, железосодержащих папочастиц, образующихся в результате жизнедеятельности микроорганизмов. На основе сопоставления полученных экспериментальных результатов и литературных данных делается предположение о том, что изучаемые объекты являются напочастицами ферригидрита ГсзОз-ЫЬО.

На рис.4 (а) приведен снимок бактерии культуры, выращенной в течение 15 дней. На рис. 4 (б) представлена картина электронной дифракции кристаллических образований, находящихся внутри бактериальной клетки. Данная электронограмма свидетельствует- о поликристалличпости твердотельных образований. Однако регистрируемые утолщения на кольцах (смотри рис. 4(6)) указывают- па текстурированпость данных образований. Дисперсия азимутальной составляющей рефлексов указывает на то, что образовавшаяся частица состоит из когерентно ориентированных блоков. Расшифровка элсктроно)раммы свидетельствует о кубической симметрии кристаллических образований. Регистрировались следующие отражения: (222), (400), (440), (444), постоянная решетки а-8.39А.

Рис. 4 - (а) - Снимок бактерии культуры выращенной в течении 15 дней (увеличение 30000), (б) - картина микродифракции кристаллических образований, находящихся внутри бактериальной клетки

Рентгенограммы молодых культур (время выращивания менее одного месяца) характеризовались размытым гало в интервале углов ЗО<20<4() градусов. Для 90-дневной выращенной культуры обнаружены два отражения с межплоскостными расстояниями ф=2.525А и с12=2.21А, рис. 5. Из сопоставления этой рентгенограммы с рентгенограммами цитрата 1,'е3+ и высушенного осадка без предварительного центрифугирования следует, что наблюдаемые отражения характеризуют частицы, образовавшиеся в результате жизнедеятельности бактерий. В таблице 1 представлены данные межплоскостных расстояний железосодержащих веществ, которые могут образоваться в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Отмстим, что регистрируемые параметры с1 исследуемых нами паночастиц, исключают такие соединения, как а-РеО(ОН), (З-РеО(ОН).

Рис. 6 - Распределение по размерам, полученное методом малоуглового рентгеновского рассеяния

90 дней

С корость, м м /с

Рис. 7 - Мессбауэровские спектры высушенной культуры железосодержащих бактерий, выращенных в течение 15 и 90 дней

Таблица 1 - Результаты структурных исследований магнитных наиочастш\

Исследуемые наночастицы Fe507(0H)-4H30 (JCPDS 29-0712) Iron Oxide Hydroxide Hydrate P a=5.08A, C-9.4A, y-Fe, O, (JCPDS 04-0755) Iron Oxide a=8.35A ct-Fe,03 (JCPDS 13-0534) Iron Oxide R3c a=5.4228A, S-FeO(OH) (JCPDS 13-0087) feroxyhite P312 a=2.941 A, c=4.49A

Дифрак ция элеетро нов d, А Рентген d, А Int. hkl d, A Int. hkl d, A Int. hkl d, A Int. % hkl

2.42 2.525 2.50 100 110 2.95 34 220 3.66 25 110 4.61 20

2.21 2.21 2.21 80 200 2.78 19 300 2.69 100 120 2.54 100 100

1.48 1.96 80 113 2.52 100 [311 2.51 50 T io 2.25 100 002

1.21 1.72 50 114 2.32 6 320 2.28 2 222 1.68 100 102

1.51 70 115 2.23 <1 321 2.20 30 120 1.47 100 110

1.48 To 106 2.08 Г24 400 2.07 2 020 1.27 20 200

На рис.6 приведено распределение наночастиц по размерам, полученное методом малоуглового рентгеновского рассеяния.

Мессбауэровские спектры, высушенной культуры, представляли собой суперпозицию нескольких квадрупольных дуплетов, обусловленных неэквивалентными состояниями ионов Ре в исследуемом материале. 11а рис. 7 показаны спектры ЯГР культуры выращенной в течение 15 и 90 дней, которые свидетельствуют о парамагнитном состоянии железосодержащих частиц. Параметры этих спектров, представленные в таблице 2, указывают на трехвалентное состояние ионов 1-е. Здесь же приведены литературные данные мессбауэровских параметров наночастиц у-Ре20з, а-РсгОз, минерала Ре203-пН20 и ферритина.

Исследуемые нами ианочастицы, образующиеся в результате жизнедеятельности бактерий, характеризуются кристаллической структурой кубической симметрии. Параметр решетки а близок к соответствующему параметру магнетита РезО.1 (а=8.39А) и маггемита у-Ре20з (а=8.35.А), также характеризующихся кубической симметрией. Химической формуле ферригидрита РегОз'пНгО (ион Ре 3+ находится в октаэдрическом окружении

лигандов) может соответствовать несколько кристаллических образований [13], включая аморфный ферригидрит [14], что обусловлено различной последовательностью расположения слоев лигандов (кислорода и ОН групп). Различают два предельных случая кристаллических структур ферригидрита. 2иЬ - магнетитоподобная стрктура со следующей последовательностью расположения кислородных слоев, (включая ОН и ГЬО): ЛВСАВС .... -характеризуется кубической симметрией с постоянной а=8.4Л. Другой предельный случай- 61Л;Ь структура, в которой плоскости лигандов (О, ОН, Н20) располагаются в последовательности ЛВЛВЛВ... (рис.8а) или АВЛС -двойная гексагональная упаковка (рис.86). В данном случае кристаллическая структура характеризуется гексагональной элементарной ячейкой с параметрами а=5.08Л, с=9.4Л. Существование промежуточных структур между 21Л-Ъ и 61Л7Ь следует рассматривать как структуры с "дефектами упаковки" в расположении плоскостей лигандов (О, 011, Н20).

Таблица 2 - Мессбауэровские параметры высушенной культуры при __ _______________ ______________комнатной температуре

вещество размер, А I.S. Q.S. W S ссылка

15-дневная <100 0.40 0.53 0.37 0. 43

высушенная 0.39 0.93 0.39 0.40

культура 0.39 1.41 0.29 0.1

0.40 1.80 0.28 0.07

90-дневная <100 0.36 0.56 0.37 0.43

высушенная 0.37 0.95 0.37 0.41

культура 0.37 0.95 0.26 0.1

0.38 1.72 0.23 0.03

минерал 0.35 0.61 0.4 0.648 [6]

Ре203пН20 0.35 1.07 0.38 0.362

ферритин 70 0.366 0.375 0.20 [7]

Ре203 пН20 0.372 0.552 0.24

0.364 0.784 0.38

0.357 1.071 0.14

0.361 1.389 0.4

Ре304 35 0.34 0.85 0.9 1 [8]

а-ре203 50 0.39 0.79 0.64 [9]

1.38 0.39

а-Ре203 <100 0.32 0.98 1 [10]

180 0.38 0.44 I

у-Ре203 100 0.26 0.9 1 [И]

х-РеА <80 0.37 0.9 1 [П]

р-Ре2Ог, <560 0.29 0.6 1 [12]

1Б - изомерный химический сдвиг относительно ссРе, ± 0.01 мм/с ОБ - квадрунольное расщепление, ± 0.02 мм/с

- ширина линии поглощения на полувысоте, ± 0.02 мм/с 8 - долевая заселенность позиции, ± 0.03

Рис. 8 - Схематичное представление Ре-О-Ре связей и фазе АВАВА(а) и в фазе АВАСА(б) по обозначению [15]. Мелкие кружки - лигаиды 0, ОН; крупные кружки - Ре3т

Сопоставление параметров ЯГР исследуемых наночастиц с мессбауэровскими параметрами частиц 1'е304, у-Ре20з, минерала ферригидрита Ре203-пН20, ферригидрита, заключенного в белковую оболочку (ферритина), (смотри таблицу 2) позволяет предположить о том, что исследуемое нами вещество является ферригидритом. Необходимо отметить, что исследования выполненные методом электронной микроскопии указывают на формирование в молодых культурах ферригидрита с магнетитоподобной кристаллической структурой - 2ЬРЬ. В процессе культивирования, по - видимому, происходит увеличение размеров частиц ферригидрита, а следовательно идут процессы упорядочения лигандов. Наблюдаемые рентгеновские отражения полученные на высушенной 90-дневной культуре с1|2=2,525А и сЬ=2.21 А, согласуются с литературными данными о кристаллической структуре ферригидрита, однако указывают на то, что последовательность в расположении слоев лигандов иная чем АВСАВС, которая характеризует последовательность слоев лигандов ферригидрита (2Ы<Ъ) молодых культур.

Р(0 в )

V ,°м м/с " ° <3 8,М м /с '

Рис.9 - Мессбауэровские спектры высушенной биомассы в зависимости от продолжительности культивирования бактерий и соответствующие им функции распределения вероятности квадрупольного расщепления.

Второй параграф посвящен изучению особенностей структуры наночастиц ферригидрита методом мессбауэровской спектроскопии в зависимости от продолжительности культивирования микроорганизмов. Мессбауэровские спектры, измеренные при комнатной температуре, показаны на рис. 9 и представляют собой суперпозицию нескольких квадрупольных дублетов, обусловленных неэквивалентными состояниями или позициями железа в исследуемом материале. Спектры приведены в зависимости от возраста культуры. На этом же рисунке для сравнения приведен спектр свежеприготовленной среды Ьоу1еу, а также функции распределения вероятности квадрупольных расщеплений, соответствующие экспериментальным спектрам.

Таблица 3 - Мессбауэровские параметры бак терий в зависимости от

продолжительности культивирования

Ре 1 РеЗ Ре4

то Б \У Б [Э ОБ 8 1Э Ов \У Б

Среда 0.41 0.40 0.35 0.65 0.42 0.69 0.39 0.35

7 ДН 0.40 0.54 0.34 0.25 0.39 0.98 0.38 0.21 0.40 1.50 0.34 0.27 0.39 1.82 0.34 0.27

12 дн 0.38 0.59 0.31 0.07 0.41 1.06 0.34 0.08 0.39 1.52 0.33 0.40 0.39 1.85 0.37 0.45

15 дн 0.38 0.55 0.33 0.19 0.38 1.00 0.39 0.21 0.40 1.53 0.36 0.30 0.40 1.84 0.3 8 0.30 "6.40 1.80 0.28 0.07

19 дн 0.40 0.53 0.37 0.43 0.39 0.93 0.39 0.40 0.39 1.41 0.29 0.10

30 дн 0.40 0.52 0.35 0.48 0.39 0.89 0.34 0.37 0.39 1.31 0.34 0.15

90 дн 0.36 0.56 0.37 0.43 0.37 0.95 0.37 0.44 0.37 1.34 0.26 0.10 0.38 1.72 0.23 0.03

18 - изомерный химический сдвиг относительно а1;е, ± 0.01 мм/с <38 — квадрупольное расщепление, ± 0.02 мм/с

- ширина линии поглощения на полувысотс, ± 0.02 мм/с 8 - долевая заселенность позиции, ± 0.03

л

Результаты расшифровки сведены в таблице 3, где приведены позиции, имеющие заселенность более 2%. В образцах обнаружены четыре неэквивалентные позиции. Мессбауэровские параметры свидетельствуют о том, что все они имеют окгаэдрическую координацию и заняты ионами 1х3+. Эти позиции можно разделить на две группы: позиции 1x1 и 1x2 с относительно малой степенью искажения локальной симметрии, (^(Ре!) ~ 0.55 мм/с и 08(1x2) - 1 мм/с, и позиции 1x3 и 1x4 с большой пеиеныо искажения, (38(1x3) ~ 1.5 мм/с и (^8(Ре4) - 1.8 мм/с. Видно, что позиции внутри одной группы имеют равную заселешюсгь вне зависимости от возраста культуры. В то же время, в зависимости от- возраста культуры происходит перераспределение засоленностей позиций групп. Отмстим, что в ферритине, выделенном из печени человека, также регистрировались равные заселенности позиций 1x1 и 1x2 [16].

На основе результатов нейтронографических исследований [17] идеализированную структуру ферригидрита можно построить, используя в качестве строительного элемента структурный элемент, изображенный па рис.10. В этом элементе, обозначим его как А, присутствуют два координационных октаэдра, связанных общей гранью. Одна октаэдрическая позиция свободна, другая занята железом. Вторым структурным элементом выступает элемент Л, который представляет собой инвертированный элемент А, т.е. элемент А, повернутый на 180° вокруг оси Г110/. Идеализированная решетка ферригидрита состоит из бесконечных двумерных слоев элементов А и Ä. При объединении слоев вдоль с-оси в последовательности AAA... (или ААА...)получаем слои железа, разделенные слоями пустых октаэдров. При объединении слоев в последовательности AÄAÄ... получаем сдвоегшыс слои железа, разделенные сдвоенными слоями пустых октаэдров. Па рис.11 схематично показана идеализированная структура бактериальною ферригидрита с последовательностью слоев AAÄAAÄÄÄ..., дающая представление о формировании неэквивалентных позиций железа. Запятые железом октаэдры сдвоенных слоев связаны ребрами как в слое, 'так и между слоями, образуя относительно слабо искаженные позиции Fe(l). Запятые железом октаэдры одиночных, слоев связаны между собой ребрами только

Рис. 10 - Структурный элемент А ферригидрита

внутри двумерного слоя, образуя искаженные позиции Г'с(2). При формировании ферригидрита с последовательностью слоев ДАЛлАЛ... заселенности этих позиций соотносятся как 2:1, что обычно наблюдается в ферригидритах минерального и животного происхождения [18-191 и в бактериях с длительным временем культивирования. Отсюда следует, что «молодые» бактерии навязывают специфическое «упорядочение» слоев в ферригидрите с последовательностью ЛАААЛААА..., изображенной па рис.11, при которой соотношение заселеиностей позиций Ре(1) и 1;е(2)

Рис. 11 - Схематичное представление идеализированной структуры бактериального ферригидрита

Теперь обсудим происхождение позиций Ре(3) и Ре(4) с сильным локальным искажением. При выходе катиона железа из занятого слоя в пустой, он оказывается в октаэдре, связанным гранью с запятым октаэдром соседнего слоя. Известно, например, из структуры гематита [1'|, что при формировании пары гранью связанных октаэдров катионы железа стремятся оттолкнуться друг от друга, смещаясь из центров октаэдров. В результате такого смещения локальная симметрия на катионах резко понижается, приводя к большому наблюдаемому квадрупольиому расщеплению. Бели катион железа, вышедший в свободный слой ферригидрита, образует пару с железом Ре(1) из сдвоенного слоя, то получаем пару катионов 1:е(3) с относительно мальм локальным искажением. Бели вышедший в свободный слой катион образует пару с железом Ре(2) одиночного слоя, то получаем два

катиона Fe(4) с локальной симметрией, аналогичной симметрии в массивном гематите, с сильным искажением. Поскольку в бактериальном фсрригидрите заселенности железом сдвоенных и одиночных слоев одинаковы, то и вероятность связавшихся с Fc(l) и Fe(2) мигрирующих катионов одинакова, т.е. одинаковы заселенности позиций Fe(3) и Fe(4).

Четвертая глава. ВОЗМОЖНЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧЛСТИЦ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ KLEBSIELLA OXYTOCA. В первом параграфе продемонстрированы магнитные свойства наночастиц ферригидрита, обоснована возможность управления этими объектами неоднородным магнитным полем [20,21].

Во-втором параграфе описаны экспериментальные результаты но изучению проникающей способности магнитных наночастиц в ткани. Использовалась удаленная слизистая оболочка носа, хрящевая и костная ткань перегородки носа, /(ля управляемой доставки наночастиц в ткани использовали внешнее магнитное ноле с помощью аппарата для низкочастотной магпитотерании «Полюс-101» (ГОСТ Р 50267.0-92), который обеспечивал непрерывный режим работы одного индуктора, с градиентом магнитного поля 4-6 мТл/мм и величиной магнитной индукции 10,14-19,56 мТл. Масса исследуемых магнитных наночастиц составляла 0,125 г. Магнитные частицы добавляли в 1 мл 0,9% раствора NaCl. Весь материал был равнозначно разделен на три серии (по 20 экспериментов в каждом).

В серии 1 кусочки хрящевой и костной ткани помещались в колбу с диспергированными в физиологическом растворе наночастицами на 20 минут, после чего промывались в физиологическом растворе и отправлялись на гистологическое исследование. В серии 2 и 3 кусочки хрящевой и костной ткани погружались в колбу с диспергированными наночастицами и выдерживались в магнитом поле, созданном аппаратом «Полюс-101» в течение 20 и 40 минут соответственно, после чего промывались в физиологическом растворе и отправлялись на гистологическое исследование. Для обнаружения наночастиц в тканях при гистологическом исследовании использовалась реакция Псрлса.

Как видно на рис. 12, в серии 1 наночастицы не проникают в хрящевую ткань, а располагаются по краю хряща.

Таким образом, на основании полученных данных выявлено, что магнитное воздействие на железосодержащие нановещсства в течение 20 минут приводит к проникновению наночастиц в толщу хрящевой и костной тканей.

Рис. 12 - (а) - Гистологическая картина хрящевой ткани (серия 1). Реакция Перлса Х100; (б) - Гистологическая картина хрящевой ткани (серия 2).

Наличие железосодержащих наночастиц в толще хряща. Реакция Перлса

XI00

В качестве цитотоксического теста использовалось определение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при воздействии на них наночастицами. При изучении бактерицидных свойств наночастиц ассоциированных с антибиотиком использовали нолусинтетический пенициллин широкого спектра действия - ампициллин в дозе 250мг (на 5 мл физ. раствора). Исследование антибактериальной и бактерицидной активности магнитных наночастиц с ампициллином проводилось на бактериях S.aureus и E.coli. Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемые наночастицы не являются цитотоксичными, а комплекс наночастица-антибиотик является стабильным и обладает бактерицидными свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты, полученные в диссертации, могут быть сформулированы следующим образом.

1. Установлено, что исследуемые иапочастипы, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов Klebsiella oxytoca, состоят из ферригидрита. Размер частиц 2-5 nm.

2. Определен состав питательной среды и технологические параметры, обеспечивающие образование ферригидрита бактериями. Исследована динамика роста бактериальной культуры и изменения структуры нанокристаллов при культивировании микроорганизмов в среде, содержащей различные ионы железа, а также при различных режимах освещения.

3. Показана возможность управлять данными биосинтезированпыми наночастицами внешним магнитным полем.

4. Исследуемые магнитные наночастицы не обладают цитотоксическим действием и не уменьшают активность пейтрофилов.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Суздалев И.П. Нанотехнология: физико-химия нанокластсров, наноструктур и наноматериалов.М., изд. КомКнига, серия «Синергетика: от прошлого к будущему», 2006, 592с.

2. Kannan В. N., Natarajan S. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. // Advances in Colloid and Interface Science 156 (2010) 1-13.

3. Верховцева H.B. Образование бактериями магнетита и машитотаксис // Успехи микробиологии. 1992. Вып.25. М. Наука. Стр. 51-79.

4. Никандров В.В. Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность // Успехи биологической химии. 2000. '1'. 40. С. 357-396.

5. Lovley D.R., Philips E.J.P. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 1472-1480.

6. Manson L. W., David G. A., Thomas J. W., Lawrence P. A. A Mossbauer investigation of iron-rich terrestrial hydrothermal vent systems: Lessons for Mars exploration. // Journal of geophysical research. 1999. V. 104. № E4, P. 8489-8507.

7. Oshtrakh I., Milder O.B., Semionkin V.A., Prokopcnko P.G., Livshits A.B., Kozlov A.A., Pikulev A.I. An analysis of quadrupole splitting of the Mossbauer spectra of ferritin and iron-dextran complexes in relation to the iron corc microstructural variations. // Z. Naturforsch. 2002. V. 57 a. P. 566-574.

8. Ahorony S.M., Litt M.H. Superparamagnetism and exchange anisotropy in microparticles of magnetite embcdet in an ineil carbonaceous matrix. // J. Appl. Phys. 1971. V. 42. № 1. P. 352-356.

9. Kundig W., Audo K.J., Lindguist R.H., Constabaris G. Mossbaucr studies of ultrafine particles ofNiO and a-Fe203 Czechosl. J. Phys. 1967. V.17. № 5. P. 467-473.

10. Kundig W., Bommel H., Constabaris G., Lindguist R.I1. Some properties of supported small a-Fe203 particles determined with the Mossbaucr effect. // Phis. Rev. 1966. V. 242, № 2,327-333.

11. Кругшянский Ю.Ф., Суздалев И.П. Магнитные свойства ультрамалых частиц окиси железа // ЖЭТФ. 1973. Т. 65. Вып. 4. №10. С.1715-1724.

12. Возшок И.О., Дубинин В.Н., Разумов О.II. Магнитная структура ультрамалых частиц (M-eO(OIl). // ФТТ. 1977. 'Г. 19. Вып. 11. С. 32223228.

13. Powder Diffraction File, JCPDS International Center for Diffraction Dale, Swarthmore, PA, USA . Inorganic, card number. 29-0712 (Fe507(0H)-4II20), 04-0755 (y-Fe203), 13-0534 (a-Fc203), 13-0087 (5-FeO(OH) ).

14. Griinberg K., Wawer C., Tebo B.M., Schiller D. A large gene clustcr encoding several magnetosome proteins is concervcd in different species of magnetotactic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 45734582).

15. Jansen E., Kyek A., Schafer W., Schwertmann U. The structure of six-line ferrihydrite// Appl. Phys. 2002. V.A74 (Suppl.). P. S1004-S1006.

16. Oshtrakh M.I., Milder O.B., Semionkin V.A, Malakheeva L. I, Prokopenko P.G. Analysis of iron storage proteins in chicken liver and spleen tissues in comparison with human liver ferritin by Mossbauer spectroscopy // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2006. V.269. № 3. P. 671677.

17. Jansen E., Kyek A., Schafer W„ Schwertmann U.//Appl. Phys., 2002,v.A 74 [Suppl.j, SI004.

18. Murad E.// JMMM, 1988, v.74, p.153.

19. Oshtrakh M.I. //Spectrochimica Acta, 2004. Part A 60. P. 217.

20. Райхер IO.JI., Степанов В.И., Столяр C.B, Ладыгина В .П. и др. Магнитные свойства биоминеральных папочастиц, продуцируемых бактериями Klebsiella oxytoca// ФТТ. - 2010. Т. 52. - Вып. 2. - С. 277-284.

21. Столяр С.В, Багоков О.А., Ладыгина B.1L, Исхакон Р.С., Ищепко Л.А., Яковчук В.Ю., Добрсцов К.Г., Позняков А.И., Никсшш 0.1;. Мессбауэровское исследование температурных превращений в бактериальном ферригидрите // Ф'ГТ.- 2011 - Т. 53. - Вып. 1. - С. 97-101.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

РАБОТАХ

1. Столяр С.В., Баюков О.А., Гуревич Ю.Л., Денисова Е.А., Исхаков Р.С., Ладыгина В.П., Пузырь А.П., Пустошилов П.П., Битехтипа М.А. Железосодержащие наночастицы, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов // РГеоргаиические материалы .- 2006.-том 42, № 7.- С. 1-6;

2. Столяр С.В., Баюков О.А., Гуревич Ю.Л., Денисова Е.А., Исхаков Р.С., Ладыгина В.П., Пузырь ГШ., Пустошилов ПЛ., Чеканова Л.А., Битехтипа М.А., Магнитные свойства суперпарамапштпых наночастиц 1'е20зТ120, синтезированных бактериями // Материаловедение,- 2006.- №7.- С. 34-39;

3. Столяр С.В., Баюков О.А., Гуревич Ю.Л., Ладыгина В.П., Исхаков Р.С., Пустошилов П.П. Мессбауэровские исследования бактериального ферригидрита// Неорганические материалы.-2007,- Т. 43, № 6,- С. 1-4;

4. Столяр С.В., Баюков О.А., Гуревич Ю.Л., Исхаков Р.С., Ладыгииа В.П. Мессбауэровские исследования железопродуцирующих бактерий Klebsiella oxytoca// Известия РАН Серия физическая.- 2007.- Т. 71, № 9.-С. 1310-1314.

5. Добрецов К.Г., Афонькии В.Ю., Столяр С.В., Ладыгина В.П., Сипкин А.В., Лопатин А.С. Изучение цитотоксичности магнитных железосодержащих иаиочастиц // Вестник оториноларингологии . - 2008, - №

5.-С. 20-21.

6. Добрецов К.Г., Афонькии В.Ю., Столяр С.В., Ладыгина В.П., Сипкип А.В., Пуртов К.В., Баюков О.А., Лопатин А.С. Изучение свойств магнитных наночастиц в оториноларингологии (экспериментальное исследование) // Медицинский научно-практический журнал Российская оториноларингология. - 2009г. - Т. 40. - №3. - С. 51-56.

7. Добрецов К.Г., Афонькин В.Ю., Кириченко А.К., Ладыгииа В.П., Столяр С.В., Баюков О.А., Сипкин А.В. Способ введения магнитных наночастиц в ткани с помощью градиента магнитного поля в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2009г. - №6. - С. 693695.

8. Патент на изобретение № 2381030. 2010. Способ введения магнитных наночастиц для проведения местной терапии при заболеваниях организма в эксперименте. Добрецов К.Г., Афонькин В.Ю., Столяр С.В., Ладыгина В.П., Сипкин А.В.

Заказ № //ш Тираж /ОО экз.

Отпечатано ООО «Новые компьютерные технологии» 660049 г. Красноярск, ул. К. Маркса, 62; офис 120; тел.: (391)226-31-31,226-31-11.

ВВЕДЕНИЕ.:.

ГЛАВА 1. НАНОЧАСТИЦЫ: МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ. ОБЗОР.

1.1 Наноструктурированные материалы.

1.2 Свойства наночастиц.

1.3 Наночастицы биологического происхождения.

1.4 Применения наночастиц в медицине.

ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ НАНОЧАСТИЦ,

СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ.

2.1 Идентификация используемых микроорганизмов.

2.2 Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов.

2.3 Метод магнитной сепарации.

2.4 Метод рентгеновской дифракции.

2.5 Метод просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

2.6 Метод малоуглового рентгеновского рассеяния.

2.7 Метод ферромагнитного резонанса.

2.8 Метод мессбауэровской (гамма резонансной) спектроскопии.

2.9 Культивирование Klebsiella oxytoca.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРЫ И ФИЗИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ НАНОЧАСТИЦ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ KLEBSIELLA OXYTOCA.

3.1 Кристаллическая структура и ферригидрита, образуемого бактериями Klebsiella oxytoca, зависимость структуры от времени бактериального синтеза.

3.1.1 Прямые структурные и магнитные методы исследования.

3.1.2 Исследование ферригидрита методом Мессбауэровской спектроскопии.

3.2 Особенности кристаллической структуры ферригидрита, синтезированного бактериями.

ГЛАВА 4. ВОЗМОЖНЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ,

СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ KLEBSIELLA OXYTOCA.

4.1 Магнитные свойства наночастиц ферригидрита.

4.2 Определение проникающей способности магнитных наночастиц в биоткани под действием магнитного внешнего поля.

4.3 Изучение цитотоксичности магнитных наночастиц.

4.4 Изучение эффективности комплекса наночастица/антибиотик.

Интенсивный поиск новых способов синтеза наночастиц в настоящее время обусловлен уникальными физическими характеристиками, присущими данным объектам, а, следовательно, широким спектром их возможного применения [1]. Существующие технологии синтеза наночастиц в подавляющем большинстве основаны на физических и физико-химических методах обработки исходных материалов (реагентов и веществ). Для получения наночастиц успешно используют такие методы, как ультрафиолетовое облучение, аэрозольные технологии, литография, лазерная абляция, методы фотохимического восстановления, ультразвуковые методы. Отрицательная сторона использования этих методов — высокая стоимость и использование опасных химических веществ и неполярных растворителей, что ограничивает их применение, например, в клинической области.

Известны способы синтеза наночастиц золота, серебра, золото-серебряных сплавов, селена, теллура, платины, палладия, диоксида кремния, титана, циркония и т.д. с использованием биологических объектов: микроорганизмов, растительных экстрактов и ферментов, структур подобных ДНК, вирусов, водорослей, грибов, дрожжей и т.д. [2]. Преимущества микроорганизмов как потенциальных источников получения наночастиц заключаются в возможности управляемого наращивания их биомассы, а также получения нанокристаллитов с заданными свойствами.

Огромное внимание уделяется биологическому синтезу железосодержащих наночастиц, что обусловлено биологической совместимостью данных объектов и возможностью управления внешним магнитным полем. Эти преимущества позволяют рассматривать железосодержащие наночастицы в качестве кандидатов при клиническом использовании для доставки лекарственных препаратов в соответствующие мишени. Известны четыре соединения железа, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Э го магнетит БезО.}, маггемит — у-Ре20з, пирротин Ре|.х8х (0<х<0,2) и ферригидрит 5Ре203*9Н20. До сих пор большее внимание привлекал магнетит, в частности образующийся в магнитотактных (п^пеим^э) бактериях [3]. Однако культивировать магнитотактные бактерии очень сложно, что ограничивает возможности использования биогенного магнетита. Источников выделения биогенного ферригидрита намного больше - ткани животных и человека, растения и микроорганизмы, поэтому он более доступен для исследований и использования в прикладных целях [4].

В данной работе предложен метод синтеза железосодержащих наночастиц путем биоминерализации железа металл-редуцирующими микроорганизмами. Использована бактериальная культура, выделенная из сапропеля озера Боровое (Красноярский край).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработать способ биогенного синтеза наноразмерпых частиц для биомедицинского применения.

ЗАДАЧИ

1. Разработать опытную лабораторную биотехнологию получения биомассы бактерий-продуцентов железосодержащих наночастиц.

2. Исследовать структуру и физические свойства полученных наночастиц с целыо идентификации синтезированного минерала. Установить влияние условий культивирования бактерий на физические свойства наночастиц.

3. Выявить перспективные методы обработки получаемого бактериального нанокристаллического материала и возможные области практического применения.

Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Содержание работы изложено на 107 страницах машинописного текста, включая 42 рисунка, 14 таблиц и списка литературы из 60 наименований.

Основные результаты, полученные в диссертации, могут быть сформулированы следующим образом.

1. Установлено, что исследуемые наночастицы, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов Klebsiella oxytoca, состоят из ферригидрита. Размер частиц 2—5 nm.

2. Определен состав питательной среды и технологические параметры, обеспечивающие образование ферригидрита бактериями. Исследована динамика роста бактериальной культуры и изменения структуры нанокристаллов при культивировании микроорганизмов в среде, содержащей различные ионы железа, а также при различных режимах освещения.

3. Показана возможность управлять данными биосиитезированными наночастицами внешним магнитным полем. f

4. Исследуемые магнитные наночастицы не обладают цитотоксическим действием и не уменьшают активность нейтрофилов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Суздалев И. Л., Суздалев П. И. Нанокластеры и нанокластериые системы. Организация, взаимодействие, свойства // Успехи химии. — 2001. — Т. 70.-№3.-С. 203-240.

2. Kannan Badri Narayanan, Natarajan Sakthivel. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. // Advances in Colloid and Interface Science 156 (2010) 1-13.

3. Верховцева H.B. Образование бактериями магнетита и магнитотаксис // Успехи микробиологии. 1992. Вып.25. М. Наука. Стр. 51-79

4. Никандров В.В. Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность // Успехи биологической химии. 2000. Т. 40. С. 357-396

5. Губин С.П., Кокшаров Ю.А., Хомутов Г.Б., Юрков Г.Ю. Магнитные наночастицы: методы получения, строение и свойства // Успехи химии. 2005. №74(6). С.549-569.

6. Наноструктурные материалы/ под ред. Р. Ханник, А Хилл; перевод с английского А.А. Шустикова под редакцией Н.И. Бауровой. М.; Техносфера, 2009.-287с.

7. Суздалев И.П. Нанотехнология: физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. М.: КомКнига, 2006. 592 с.

8. Арискин Е.В. Реагирующие на магнитное поле включения в клетках прокариот//Микробиология. 2003. Т.72. №3. С.293-300.

9. Биогенный магнетит и магниторецепция: Новое о биомагнетизме // Под ред. Д. Киршвинка и др. М.: Мир. 1989. Т.1. 352 с.

10. Верховцева Н.В. Образование бактериями магнетита и магнитотаксис // Успехи микробиологии. 1992. Т. 25. С. 51-79.

11. Верховцева Н.В. Трансформация соединений железа гетеротрофными бактериями // Микробиология. 1995. Т. 64. № 4. С. 473-478.

12. Bazylinski D.A., Frankel R.B. Magnetosome formation in prokaryotes // Nature Rev. 2004. v. 2 P. 217-230.

13. Lovley D.R., Philips E.J.P. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese // Appl. Environ. Microbiol., 1988, v.54. P. 1472-1480

14. Ванштейн М.Б., Сузина Р.У., Кудряшова Н.Е., Арискина Е.В., Сорокин В.В. К разнообразию магпитотактных бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. С. 807-814.

15. Слободкин А.И., Ерощев-Шак В.А., Кострикина Н.А., Лаврушин В.Ю., Дайняк Л.Г., Заварзин Г.А. Образование магнетита термофильными анаэробными микроорганизмами//ДАН. Т. 345. № 5. С. 694-697.

16. Chistyakova NL, Rusakov VS, Zavarzina DG, Slobodkin AI, Gorohova TV. // M?ssbauer study of magnetite formation by iron- and sulfate- reducing bacteria // Hyperfine interactions, V. 156, Issue: 1-4, 2004. P. 411-415.

17. Vainshtein M, Suzina N, Kudryashova E, Ariskina E. New magnet-sensitive structures in bacterial and archaeal cells // Biol Cell. 2002 v. 94. N 1. P.29-35.

18. Ivo Safarak, Mirka Safarnkov6. Magnetic nanoparticles and biosciences // Monatshefte fbr Chemie. 2002. V.133. P.737-759.

19. Lovley, D.R., and E.J.P. Phillips. 1987. Competitive mechanisms for inhibition of sulfate reduction and methane production in the zone of ferric iron reduction in sediments. Appl. Environ. Microbiol. 53: 2636-2641.

20. E. Murad. Clays and clay minerals: What can Mossbauer spectroscopy do to help understand them? Hyperf. Interact., V.l 17, P.39-79 (1998).

21. Мецлер Д. Биохимия. Т.З. Москва. Издательство "Мир". 1980.С. 488.

22. Cavallo S., Mei G., Stefanini S., Rosato N., Finazzi-Agro A., Chiancone E. // Protein/ Sci. 1998. V.7. P.427-432.

23. Никандров В.В. Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность // Успехи биологической химии. Т.40. 2000. С.357-396.

24. Чухров Ф.В., Звягин Б.Б., Горшков А.И., Ермилова Л.П., Балашова В.В. О ферригидрите. // Изв. АН СССР, сер.геол. 1973. №4, С.23-34.

25. Jansen E., Kyek A., Schafer W., Schwertmann U. The structure of six-line ferrihydrite // Appl. Phys. 2002. V.A74 (Suppl.). P.S1004-S1006.

26. Wade M.L., Agresti D.G., Wdowick T.J. A Mossbauer investigation of iron-rich terrestrial hydrothermal vent systems: Lessons for Mars exploration // J. Geoph. Research. 1999. V.104. P.8489-8507.

27. Stevens J.G., Khasanov A.M., Grasette White M.S. Ferrihydrite Modification by Boron Doping//Hyperf. Interact. 2003. V.151/152. P.283-290.

28. Murad E. The Mossbauer spectrum of "well"-crystallized ferrihydrite // JMMM. 1988.V.74. P.153-157.

29. King GC, Choi SH, Chu S-H, Kim J-W, Park Y, Lillehei P, Watt GD, Davis R, Harb JN. Development of a bio-nanobattery for distributed power storage systems // Proceedings of the SPIE. 2004. V. 5389, pp. 461-467.

30. B.A. Олейников, A.B. Суханова, И.Р. Набиев. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине// Российские нанотехнологи. Т. 2. №1-2. 2007

31. Tartaj P., Morales М.Р., Veintemillas-Verdaguer S., Gonzalez-Carreno Т., Serna C.J. The preparation'of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J. Phys. D: Appl. Phys. 2003. V. 36. P. 182-197.

32. Goodwin S, Peterson C, Hoh С and Bittner С 1999 J. Magn.

33. Magn. Mater. 194 132Awschalom D.D. Smyth J.F. Grinstein G. DiVincenzo D.P. Loss D. Macroscopic Quantum Tunneling in Magnetic Proteins // Phis. Rev. Lett. 1992. V. 68. № 20. P. 3092-3095.

34. Bou-Abdallah F., Lewin A.C. Le Brun N.E., Moore G.R., Chasteen N.D. Iron Detoxification Properties of Escherichia coli Bacterioferritin // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, No. 40, Issue of October 4, pp. 37064-37069.

35. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф.Герхардта и др. T.l. М. Мир.1983. С. 536.

36. Практикум по микробиологии. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И 1995, с 173.

37. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Н.С.Егорова. М., изд-во МГУ, 1983, с. 224. 28.

38. Ю.Л. Райхер, В.И. Степанов, С.В. Столяр, В.П. Ладыгина, Д.А. Балаев, Л.А. Ищенко, М. Балашою. Магнитостатические свойства наночастиц ферригидрита, продуцируемого Klebsiella oxytoca //ФТТ. 2010. №2.

39. Manson L. W. David G. A. Thomas J. W. Lawrence P. A. A Mossbauer investigation of iron-rich terrestrial hydro thermal vent systems: Lessons for Mars exploration. // Journal of geophysical research. 1999. V. 104. № E4, P. 8489-8507.

40. Ahorony S.M. Litt M.H. Superparamagnetism and Exchange Anisotropy in Microparticles of Magnetite Embedet in an Inert Carbonaceous Matrix. // J. Appl. Phys. 1971. V. 42. № 1. P. 352-356 .

41. Kundig W. Audo K.J. Lindguist R.H. Constabaris G. Mossbauer studies of ultrafine particles ofNiO and a-Fe203. Czechosl. J. Phys. 1967. V.17. № 5. P. 467-473.

42. Kundig W. Bommel PI. Constabaris G. Lindguist R.H. Some properties of supported small a-Fe203 particles determined with the M6ssbauer Effect. // Phis. Rev. 1966. V. 142, №2, 327-333.

43. Крупнянский Ю.Ф. Суздалев И.П. Магнитные свойства ультрамалых частиц окиси железа//ЖЭТФ. 1973. Т. 65. Вып. 4. №10. С. 1715-1724.

44. Возшок П.О. Дубинин В.Н. Разумов О.Н. Магнитная структура ультрамалых частиц p-FeO(OH). // ФТТ. 1977. Т. 19. Вып. 11. С. 3222-3228.

45. Jansen E., Kyek A., Schafer W., Schwertmann U. The structure of six-line ferrihydrite//Appl. Phys. 2002. V.A74 (Suppl.). P. S1004-S1006.

46. Oshtrakh M.I. Study of the relationship of small variations of the molecular structure and iron state in iron containing proteins by Mossbauer spectroscopy: biomedical approach // Spectrochimica Acta. 2004. Part A 60. P. 217-234.

47. C.B. Столяр, О.А. Баюков, Ю.Л. Гуревич, Е.А. Денисова, Р.С. Исхаков,

48. B.П. Ладыгина, А.П. Пузырь, П.П. Пустошилов, М.А. Битехтина. Железосодержащие наночастицы, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Неорганические материалы, т.42, №7, с. 1-6 (2006).

49. Jansen Е., Kyek A., Schafer W., Schwertmann U.//Appl. Phys., 2002,v.A 74 Suppl., S1004.

50. Murad EM JMMM, 1988, v.74, p. 153.

51. Oshtrakh M.I. //Spectrochimica Acta, 2004. Part A 60. P. 217.

52. Райхер Ю.Л., Степанов В.И., Столяр C.B, Ладыгина В.П. и др. Магнитные свойства биоминеральных наночастиц, продуцируемых бактериями Klebsiella oxytoca // ФТТ. 2010. Т. 52. - Вып. 2. - С. 277-284.

53. Столяр С.В, Баюков О.А., Ладыгина В.П., Исхаков Р.С., Ищенко Л.А., Яковчук В.Ю., Добрецов К.Г., Позняков А.И., Пиксина О.Е. Мессбауэровское исследование температурных превращений в бактериальном ферригидрите // ФТТ,-2011 Т. 53.-Вып. 1.-С. 97-101.

54. Добрецов К.Г.,-Афонькин В.Ю., Кириченко А.К., Ладыгина В.П., Столяр

55. C.В., Баюков О.А., Сипкин А.В. Способ введения магнитных наночастиц в ткани с помощью градиента магнитного поля в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2009г. - №6. - С. 693-695.

56. Патент на изобретение № 2381030. 2010. Способ введения магнитных наночастиц для проведения местной терапии при заболеваниях организма в эксперименте. Добрецов К.Г., Афонькин В.Ю., Столяр С.В., Ладыгина В.П., Сипкин А.В.