Производные циклопропилэтилсодержащих аминов - модуляторы активности ферментов обмена этанола тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

КИСЛОВА Ольга Володимирівна

ПОХІДНІ ЦИКЛОПРОПІЛЕТИЛВМІСНИХ АМІНІВ -МОДУЛЯТОРИ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ ОБМІНУ ЕТАНОЛУ.

02.00.10-біоорганічна хімія, хімія природних та фізіологічно активних речовин

АВТОРЕФЕРАТ . дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

На правах рукопису

Киїб - 1ЭЭ4

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті органічної хімії НАН України.

Наукові керівники: доктор біологічних наук,

професор Г.О.Пхакадзе кандидат біологічних наук К.Г.Виноградова

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

професор В.К.Кібірєв доктор біологічних наук, процесор С.О.Костерін

Провідна організація - Київський університет їм.Тараса Шевченка

Захист відбудеться ЗО вересня 1994 р. на засіданні спеці« лізованої вченої ради Д 016.65.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (253660, Київ, вул, Мурманська,!).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інстит; біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (253660, Кі вул.Мурманська,1).

Автореферат розісланий "2£" 1994 |

Вчений секретар спеціалізованої пчгмкл роди

.М.Федор,

І Загальна характеристика роботи.

І Актуальність проблеми. Останнім часом велика уьлгп Іприділяється використанню специфічних інгіоїторів для [спрямованої регуляції ферментативної активності, ідо мас гіпчну [цінність для практичної медицини, в тому числі й для на[.ксл.>гії. Так, з інгібуванням активності ферментів основного шілху метаболізму етанолу - алкогольдегідрогенази (алкоголь:NaD+-okgh-доредуктаза; КФ 1.1.1.1., АДГ) та альдегіддегідг'огенчзи (альдегід: NAD+ - оксидоредуктаза; КФ 1.2.1.3. .АльДГ) - голсиїим чином пов'язаний біохімічний механізм дії антиалкогольних препаратів сенсибілізуючого типу [Brlen.Loomis,19Ь5; Vasiliou et al.,1986; Peachey,Annls,1985; Jornvall et al.,1987.19&І]. Ix незначний арсенал приводить до необхідності цілеспрямованого пошуку нових хімічних речовин аналогічної дії.

Відомо, що різноманітну біологічну активність, в тому числі й антиалкогольну, проявляють сполуки, в структурі яких є циклопропільний Фрагмент [Яновская и др.,1960; Walsh,1982; Магс-hner,Tottmar,l983;). Так, чутливість до етанолу підвищують структурні аналоги паргіліну, в яких пропаргільна група замінена на циклопропільний Фрагмент, а також К“-(І-гідроксицик-лопропіл)-Ь-глутамін (коприн), виділений із гриба Coprinus atramentarlus [Wiseman et al.,1980; Nagasawa et al.,1984].

Проте недоліками цих речовин, а також препаратів сенсибілізуючого типу, які вживаються в клінічній практиці (тетраетнлтіу-рамдисульфід (ТЕГД), ціанамід кальцію), є низька селективність, токсичність, необоротність взаємодії з Ферментами.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення впливу ряду циклопропілетилвчісних амінів та їх похідних на активність Ферментів етанолокислюючої системи - АДГ та АльДГ. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1) ідентифікувати Ферменти основного шляху метаболізму етанолу печінки щурів та розрахувати їх кінетичні характеристики;

2) дослідити дію похідних циклопропілетилвмісних амінів та деяких їх структурних Фрагментів - амідів бензойних кислот - на швидкість прямої та зворотної АДГ-реакцій та активність форм АльДГ в умовах In vitro;

3) на прикладі одного з виявлених в умовах in vitro ефективних інгібіторів АльДГ та його структурних Фрагментів (можливих метаболітів) еивчити вплив сполук на активність Ферментів обміну етанолу після внутрішньошлункового введення, а також на

добровільне вживання розчину етанолу щурами з І1-ою стадією хронічного алкоголізму:

4) використовуючи метод к-найближчих сусідів з оптимізацією ознакового простору за допомогою еволюційної стратегії [Теіко.19^41. розрахувати набір фізико-хімічних та топологічних параметрів для передбачення на основі структурної Формули циклопропілетилвмісної сполуки можливості інгібування активності АльДГ матриксу мітохондрій:

5) дослідити кінетику інгібування керментів метаболізму етанолу

виявленими елективними модуляторами. .

Наукова новизна роботи. В представленій роботі вперше досліджено вплив нових циклопропілетилвмісних сполук на ферменти етанолокислюючої системи. Виявлено ефективні Інгібітори активності різних Форм АльДГ. Вони відрізняються від відомих препаратів сенсибілізуючого типу по структурі та характеру взаємодії з Ферментом. На моделі експериментального хронічного алкоголізму показано, що внутрішньошлункове введення одного з ефективних інгібіторів АльДГ - ІМеніл-Н-(І-циклопропілетия)-аміду 2,5-дихлор-4-метилбензойноі кислоти - приводить до такого ж зниження добровільного вживання етанолу, як 1 ТЕТД. Проте оборотний характер взаємодії циклопропілетилвмісних амідів бензойних кислот з АльДГ має ряд переваг перед необоротною інактивацією Ферменту ТЕТД. Використовуючи один із методів сучасної теоретичної хімії, розраховано набір Фізико-хімічних параметрів, який дозволяє на основі структурної формули сполуки даного ряду передбачати можливість інгібування активності АльДГ матриксу мітохондрій, що відіграє провідну роль в окисленні ацетальдегіду при Фізіологічних умовах. Знайдено кількісну залежність між ефективністю інгібування активності цієї форми Ферменту та двома топологічними індексами.

Практична цінність роботи. Проведені дослідження дозволяють запропонувати найбільш ефективні інгібітори для подальшого їх вивчення як антиалкогольних препаратів. Інгібітори активності АДГ можуть застосовуватись як своєрідні антидоти при отруєннях токсичними спиртами, а також для підвищення рівня ендогенного етанолу, оскільки зниження цього показника обумовлює розвиток пристрасті до алкоголю. Виявлені інгібітори АльДГ можуть бути використані як речовини, що підвищують чутливість до етанолу та запропоновані для подальшого вивчення.

Ці сполуки можуть застосовуватись для з'ясування структур-

иих особливостей різних форм ферментів обміну етанолу, ІтоліморФізм яких зумовлює розвиток алкоголізму.

І Розрахований набір фізико-хімічних параметрів дає можливість вести спрямований синтез циклопропілетилвмісних сполук з антиалкогольними властивостями та передбачати ефективність ЇХ ДІЇ,

Апробація роботи. Результати досліджень доповідались на VI Українському біохімічному з'їзді (Київ,1992); XXVIII конференції молодих учених та спеціалістів Інституту органічної хімії НАН України (Київ,1992); IX конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ,1994).

Публікації. З теми дисертації опубліковано 5 робіт.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (3 розділи), опису методів досліджень (і розділ), викладу та обговорення одержаних резульгатів U розділ), заключения, висновків та списку використаної літератури, який включає 159 бібліографічних назви. Робота викладена на 141 сторінці машинописного тексту, ілюстрована 17 рисунками та 19 таблицями.

Результати досліджень та їх обговорення.

Об'єктом для здійснення скринінгу сполук з антиалкогольними властивостями були Ферменти основного шляху метаболізму етанолу, виділені з печінки щурів методом ДИфереНЦІЙНОГО центрифугування [Скоупс,і985]. Активність ферментів визначали на спектрофотометрі "Beckman DU-6” [Коноплицька,1937] та виражали в нмолях NADH/(Mr білку.хв).

Внаслідок проведених досліджень ідентифіковано наступні Ферменти: цитоплазматична АДГ, яка каталізує оборотний процес окислення етанолу, та мітохондріальні й мікросомальна форми АльДГ (табл.1). .

Дані таблиці свідчать, що АДГ з печінки щурів належить до класу 3 [Herrera et al.,1983; Lad.Leffert,1983], представленому групою катодних Форм, які зустрічаються, головним чином, у печінці, інгібуються піразолом та відіграють провідну роль в окисленні етанолу. Подальше перетворення ацетальдегіду при Фізіологічних умовах каталізується АльДГ мітохондріального матриксу, про що свідчить значно вища величина константи уявної специфічності V^/Kj, (Harrington et al.,1968¡ Tsutsumi et al., 1988]. ІЗ умовах хронічної алкогольної інтоксикації зростає

Таблиця 1.

Уявні кінетичні характеристики ферментів етанол-окислюючої системи печінки щурів (М*и,п=6).

\ „ нмоль ЫАБН .. /» нмоль НАШ ’шах'"в *мг оілку • хв • мкм

шах'мг білку • хв субстрат І кофактор

АЛКОГОЛЬЛЕГІДРОГЕНАЗА

Пряма реакція Зворотна реакція 10,00*2,39 18,00*4,87 <0,005 47,37*8,96 52,60*6,97 . 692,00*19,35

АЛЬДЕГІ ДДЕГІ ДРОГЕНАЗА

Матрикс мітохондрій Мембрана мітохондрій Мембрана мікросом 14,00И.08 16,70*1,16 13,40*0.90 1077*72 24*1 11*2 184*16 270*47 327*35

внесок мембранних форм мітохондрій і мікросом, , ЯКІ характеризуються значно нижчою спорідненню™ до ацетальдегіду [Aokl.Itoh.19e9; Островский и др.,1988]. •

Таким чином, описані вище Ферменти відповідають за метаболізм етанолу при фізіологічних умовах та при хронічній алкоголізації. Спрямована регуляція модуляторами активності АДГ та АльДГ має велике значення для наркологічної практики.

Як модулятори активності цих Ферментів у даній роботі досліджено ряд похідних циклопропілетилвмісних амінів. Вони синтезовані в відділі органічного та нафтохімічного синтезу ІБОНХ НАН України. Внаслідок проведених досліджень сполуки розділені на 4 групи залежно від структури та впливу на ферменти основного шляху метаболізму етанолу.

. • -До першої групи входять Н-заміщені-Н-(І-циклопропілетил)-

аміни та аміди пропіонової кислоти (рис.іА), які незначно впливали на швидкість прямої та зворотної АДГ-реакцій та на активність форм АльДГ. На цьому та наступних рисунках розташування стовпчиків зверху від горизонтальної осі відповідає активації, знизу - інгібуванню активності ферментів.

Наявність залишків . морфоліну та піперидину в структурі циклопропілетилвмісних амідів оцтової кислоти (рис.іБ)

У/»

нс-< і \р.

СН3 н

н

В

□

•сн2^>

НС-№

' чс-сн?я сн3 д 3

в

н

-сн2^>

Рио.1. Вплив циклопропілетилвмісних амінів, амідів пропіонової кислоти (А) та амідів 2-заміиеної оцтової кислоти (Б) на активність ферментів основного шляху метаболізму етанолу (на осі ординат указано процент активації (стовпчики вгору) або Інгібування (стовпчики вниз)): 1,2 - пряма та зворотна АДГ-реакції; З - АльДГ матриксу мітохондрій; 4,5 - мембранні АльДГ мітохондрій та мікросом.

6 І

приводить до зменшення швидкості зворотної АДГ-реакції, причому! більш виражене інгібування спостерігалось для К-(І-цикло-| пропілетил)амідів. Активність АльДГ матриксу мітохондрій інгібувалась до 50% піперидинзаміщеними амідами, тоді як морфолінзаміщеними - тільки до 35%.

Циклопропілетилвмісні аміди монозаміщених бензойних кислот (рис.2А), незважаючи на наявність двох об'ємних радикалів при омідному азоті, до 50% зменшували швидкість зворотної АДГ-реакції за винятком аміду о-метоксибензойної кислоти. Аміди о- та м-заміщених бензойних кислот сильніше інгібували активність АльДГ матриксу мітохондрій.

Елективними інгібіторами активності АльДГ є циклопропілетилвмісні аміди 2,4-дихлор-, 2,4-дихлор-5-метил- та 2,5-дихлор-4-метилбензойних кислот:

Вони інгібували активність усіх форм ферменту на 50-80* (рис.2Б). Ці аміди незначно зменшували швидкість прямої АДГ-реакції та активували зворотну.

Заміщення об’ємного ароматичного радикалу при амідному азоті на атом водню <рис.2Б) приводило до послаблення інгібуючої дії на всі форми АльДГ. Однак, ці сполуки зменшували швидкість зворотної АДГ-реакції. на 40-60%. .

Таким чином, серед розглянутих похідних циклопропілетил-вмісних амінів виявлено групу ефективних інгібіторів активності АльДГ матриксу мітохондрій та мембранних Форм мітохондрій та мікросом - Іі-заміщені-Н- (І-циклопропілетил)аміди 2,4-дихлор-,

2,4-дихлор-5-метил- та 2,5-дихлор-4-метилбензойних кислот. " Застосування методу к-найблйжчих сусідів з оптимізацією ознакового простору за допомогою еволюційної стратегії дозволило

ск3 у

V л 40-

чс-нг

-«о-

40<|

-€>

1 2 34 5

-СИ

2-Ш В

ШГ=¥

осн

-<2)-НН2 *

°ЇТТ? -ш*:

ТГЩГ

Г т

“В«Г?У1—

®ЗН1Г

•ф

V/»

нс-м

СНз С0Й'

н

в

Рис.2. Вплив циклопропілетилвмісних амідів монозаміщених бензойних кислот (А) та амідів 2,4-дихлор-5-метил-, 2,5-дихлор-4-ме-тилбензойних кислот (Б) на активність ферментів основного шляху метаболізму етанолу (на осі ординат указано процент активації (стовпчики вгору) або інгібування (стовпчики вниз)): 1,2 -

пряма та зворотна АДГ-реакцІї; 3 - АльДГ матриксу мітохондрій; 4,5 - мембранні АльДГ мітохондрій та мікросом.

8 . ■ «' . розрахувати наступний набір фізико - хімічних параметрів для передбачення можливості інгібування активності АльДГ матриксу мітохондрій новими сполуками цього класу на основі їх структурної Формули:

1) індекс шляхів молекулярного графу [Кинг,19071:

Ьї(С)=2<і'1р2...р}іі1)“1/2/М

суму розраховують по всім шляхам графу з довжиною Ь>1, - сту-

пені вершин вздовж шляху графу, N - кількість атомів, відмінних

від водню; . .

2) аналог першого індексу, котрий враховує тільки найкорочні шляхи;

3) сольватамійний топологічний індекс першого порядку, який

описує дисперсійні взаємодії в розчині: .

шха=(і/2в+1)і(г12і?.лк)/(р^2...рк)1/2 в - порядок індексу, суму розраховують по всім підграфам порядку

■ (у даному випадку парам атомів, з'єднаних хімічнім зв'язком), 21 - коефіцієнти, котрі характеризують розміри атомів (рівні номеру періоду), »і - ступені вершин;

4) функція дисиметріх (ЮП (Киг'в1п,1992], яка не враховує тип атому. Для розрахунку даного параметру необхідне гнання реальної геометри молекули (використовували метод МНЮ та програми Пакету МОРДО і

Б) молекулярний парахор (Р), розрахований по адитивній схемі [Вайсбергер,1950].

Імовірність передбачення окладає 83*. Це дозволить У подальшому вести спрямований синтез циклопролілетилвмісних сполук з антиалкогольними властивостями.

Автор висловлює подяку співробітникам відділу иедико-біологічних досліджень ІБОНХ НАН України, які надали допомогу в проведенні даних розрахунків.

, Можливість використання інгібіторів АльДГ як антиалкогольних препаратів сенсибілізуючого типу тісно пов'язана з їх токсичністю. Встановлено, що для амідів II та V величина перевищує 2000 мгЛсг. Для ТШ вона становить 1400 мг/кг [Кораблев,19?І). .

Скринінг нових Фармакологічних засобів з антиалкогольними властивостями передбачає вивчення впливу сполук на основні прояви алкоголізму. Ш, наявність у хімічної речовини

' . • 9

антиалкогольної активності можна ідентифікувати по зменшенню добровільного вживання 15%-ного розчину етанолу щурами з І1-ою стадією хронічного алкоголізму (Буров.19811. Середнє вживання етанолу Фіксували за тиждень до початку експерименту 1 з ним порівнювали рівні вживання етанолу на протязі двох тижнів внутріїньоолункового введення сполук (200 мг/кг, суспензія в 2,5Х-ному розчині крохмалю) та тижня після відміни (рис.З). При введенні мурам Н-Феніл-Н-(І-циклопропілетил)аміду 2.5-ди-хлор-4-метилбензойноі кислоти спостерігалось зниження вживання етанолу, як 1 під дією ТЕГГД ІКоноплицька,19921, хоча в динаміці процесу були деякі відмінності. Відсутність або об’ємного спільного радикалу, або залишку бензойної кислоти в структурі двох інних сполук приводила до того, що вони не впливали на вживання етанолу.

Щоб встановити важливість циклопропілетильного радикалу в структурі сполук для інгібування активності АльДГ, було вивчено дію незаміиених амідів описаних вище бензойних кислот на активність ферментів етанолокислюючої системи (рис.4). Вони на 60-60* зменшували швидкість зворотної. АДГ-реакцп, а

2.4-дихлор-5-метилбензамід - 1 прямої. На активність форм АльДГ ці сполуки не впливали.

Таким чином, наявність циклопропілетильного Фрагменту при «мідному азоті є необхідно» умовою для інгібування амідами

2.4-Дихлор-, 2,4-дихлор-5-ііетил- та 2,5-дихлор-4-метилбензойних кислот активності форм АльДГ. івидкість зворотної АДГ-реакцп значно інгібувалась незаміиеними амідами цих же бензойних кислот.

Активність Ферментів обміну етанолу визначали також після виутріиньшлункового введення тваринам гідрохлориду N-d-цикло-пропіаепиОаміну, М-Феніл-ІМ І-циклопропілетил)аміду 2,4-дихлор-Б-ивтилбензовиоІ кислоти (III) та 2,4-дихлор-б-метилбензаміду в дозі 200 мг/Кг у 2,БХ-ному розчині крохмалю (рис.б). Через 3 год після введення гідрохлориду швидкість прямої АДГ-реакцп, активності АльДГ матрмксу мітохондрії та мембранної Форми «ікрооом інгібувались до 2СШ, а швидкість зворотної АДГ-реакцп та активність мембранної АльДГ мітохондрій зростали до 10*. Після введення 2,4-дихлор-б-метилбензаміду швидкості прямої та зворотної АДГ-реакцій змеицгвелись на 401. Лід дією я-фєніл-Н-(І-циклооропілетил)аиіду 2,4-дихлор-6-нетилбензойної кислоти (III) спостерігалась активація зворотної АДГ-реакцп на 35*, а

Рис.З. Зниження в;;ивання етанолу (в процентах) щурами з 11-ою стадією хронічного алкоголізму після внутрішньсшлункового введення циклопропілетилвмісних сполук: 1,2 - на протязі першого та другого тижнів введення сполук, 3 - після відміни введення.

н= ■©« ^><1

СІ ¿1

Рис.4. Вплив амідів бензойних кислот на активність ферментів основного шляху метаболізму етанолу (на осі ординат указано процент активації (стовпчики вгору) або інгібування (стовпчики вниз)): 1,2 - пряма та зворотна АДГ-реакції; 3 - АльДГ матрик-,су мітохондрій; 4,5 - мембранні АльДГ мітохондрій та мікросом.

Рис.5. Зміна досліджуваними сполуками активності ферментів основного шляху метаболізму етанолу після . внутрішньошлункового введення на 3 год (1) та 18 год (2) (на осі ординат указано процент активації (стовпчики вгору) або інгібування (стовпчики вниз)): Ш И- пряма та зворотна АДГ-реакції;[3]- АльДГ матриксу мітохондрій;[Т) ,[5] - мембранні АльДГ мітохондрій та мікросом.

Рис.6. Залежність залишкової активності АльДГ матриксу мітохонд-рій [3], мембранних Форм мітохон-дрій [53 та мікросом [5] від часу пре інкубації з Л-феніл-Н-іІ-цик-лопропілетил)амідом 2,5-дихлор-4-метилбензойної кислоти.

І 1-І І ЗО Ілв.

активності Форм АльДГ інгібувались на 40*. Через 18 год після внутрішньошлункового введення інгібування активності всіх Ферментів даними сполуками проявлялось значно слабкіше, а активація зростала. Отже, отримані результати свідчать, но активність Ферментів основного шляху метаболізму етанолу через 3 год після, внутрішньошлункового введення розглянутих речовин змінювалась так само, як 1 в умовах In vitro.

Це дає підставу для проведення подальших досліджень з мето» з’ясування молекулярних механізмів інгібування, і в першу чергу встановлення характеру цього процесу та оцінки реакційної здатності циклопропілетилвмісних сполук четвертої групи I-VI та бензамідів.

У процесі преінкубацп різних форм АльДГ з амідами I—VI зниження активності спостерігалось на протязі 10-15 хв. У подальшому активність Ферментів або не змінювалась, або незначно підвищувалась, цо показано на прикладі М-феніл-ІІ-(І-циклопро-пілетил)аміду 2,5-дихлор-4-метилбензойн0і кислоти • (рис.6). Це дозволяє припустити, ко дані сполуки є оборотними інгібіторами активності АльДГ. Такий висновок підтверджується відновленням активності ферментів при проведенні експериментів по розведеним. Оборотний характер взаємодії інгібіторів з ферментом має певні Фізіологічні переваги перед необоротною інактивацією АльДГ відомими антиалкогольним препаратами, оскільки відновлення активності Ферменту в випадку оборотного інгібування відбувається без синтезу білка de novo. :

Критерієм оцінки ефективності інгібування амідами I-VI активності Форм АльДГ була величина [Igg] (концентрація сполук, яка приводить До зменшення активності ферменту на 50*) (табл.2).

Порівняння цих величин із значенням . ІІвд] для ТЕТД, отриманих при аналогічних умовах [Коноплицька,199Є], свідчить, що ефективність інгібування активності АльДГ матриксу мітохондрій новими сполуками і ТЕТД приблизно .однакова (за винятком амідів III та IV). Аміди І та IV-VI сильніше, ніж ТЕТД, інгібують активність мембранних Форм Ферменту.

Згідно з даним літератури [Кииг,19Є7], існує залежність між від'ємним логарифмом величини (Іеді та топологічними індексами, які відображають особливості молекулярної структури без урахування точного геометричного розташування атомів молекули в просторі. Для АльДГ матриксу мітохондрій знайдено Кількісну залежність між величинами -logll^! вищевказаних

. ; " ■ із • ■

. Таблиця 2.

Величини (Івд] для досліджуваних цшслопропілетилвмісних амідів бензойних кислот.

Шифр (IgQl.MKU

сполук АльДГ матриксу мітохондрій меморанна альдг мітохондрій мембранна альдг мікросом

ТЕГД* 60 . . 100 >100

І 51 69 56

II 63 >100 71

III 94 80 , 91 .

IV 71 . 69 <34

V 60 64 за

VI 58 70 48

Примітка.* - приведені величини отримані без врахування типу інгібування.

амідів та двома топологічнюди індексами - індексом форми 0-го порядку І íKler.1987] та загальним топологічним індексом т (Hall, Kler,1990]:

■ ■їо8Пб01-0.029і-0.035г+0.832.

Отримана кореляція дає змогу на основі структурної Формули сполук передбачати можливу ефективність їх дії.

Оборотними інгібіторами активності АДГ є й розглянуті аміди бензойних КИСЛОТ (величини IgQ становлять 35-45 мкм). .

З точки зору Ферментативної кінетики реакції окислення етанолу й ацетйльдегіду є двосубстратними. Для виявлених ефективних інгібіторів досліджено характер взаємодії з відповідними ферментами основного шляху метаболізму етанолу по відноменнн до кожного субстрату.

При варіюванні концентрації NADfTa насичуючих концентраціях ацетальдегіду встановлено, що інгібування АльДГ матриксу мітохондрій та мембранної ферми мікросом циклопропілетилвмісними амідами I-VI відповідало Феноменології конкурентного інгібування. Гіперболічна залежність наклонів прямих в координатах подвійних обернених величин від концентрації цих сполук свідчила про частковий характер розглянутого процесу.

Для мембранної АльДГ мітохондрій спостерігався перехід від бесконкурентного до пеевдоінпбування при підвищенні концентрації циклспроішетилвмісних амідів 2,4-дихлор- та

14 '

2.4-дихлор-5-метилбензойних кислот (І—IV) 1 до змішаного - для амідів 2,5-дихлор-4-метилбензойних кислот (V.VI).

При насиченій концентрації ЇШ)+ і варіюванні концентрації ацетальдегіду встановлено, що для амідів 2,5-дихлор-4-метил-бензойних кислот (V,VI) спостерігався частково безконкурентний характер інгібування з гіперболічною залежністю відрізків, які відсікаються на осі ординат у координатах подвійних обернених величин, від концентрації модуляторів. Характер взаємодії амідів

2.4-дихлор- та 2,4-дихлор-5-метилбензойних кислот (1-ІV) з АльДГ

матриксу мітохондрій змінювався від безконкурентного до змішаного. •

Для мембранних форм мітохондрій та мікросом характер взаємодії з усіма амідами відповідав феноменології конкурентного інгібування з уявними константами інгібування в мікромолярному діапазоні (табл.З).

■ ' ' Таблиця 3.

Уявні константи інгібування К1 циклопропілетил-вмісними амідами бензойних кислот мембранних форм АльДГ.

Члиифр сполук Ф0РМ£Г\ ферменту4^ І II III IV V VI

Kj, мкМ

мітохондрій 18 27 20 . 19 17 19

мікросом 16 23 зо 21 12 15

Кінетичні дослідження дають можливість припустити існування конформаційних відмінностей активних центрів форм АльДГ. Так, для мембранних форм АльДГ спостерігається структурна схожість ділянок адсорбції ацетальдегіду, що узгоджується з їх близькою субстратною специфічністю та подібністю кінетичних •характеристик. Відмінність характеру інгібування мембранної Форми мітохондрій по відношенню до першого субстрату реакції KAD+ від характеру інгібування АльДГ матриксу мітохондрій та мембранної, форми мікросом може свідчити про більш гідрофобний характер першої. "

Інгібування швидкості прямої АДГ-реакції 2,4-дихлор-5-ме-тилбензамідом при варіюванні концентрації етанолу мало змішаний характер з уявною Kj 35 мкіі, а при зміні концентрації MAD+ -

. 15

псевдоінгібування з уявною К1 8 мкМ. .

Інгібування швидкості зворотної АДГ-реакції 2,4-дихлор- та

2.4-дихлор-5-метилбензамідами при зміні концентрації ацеталь-дегіду відповідало псевдоінгібуванню з параболічною залежністю

/К£У° від концентрації сполук; а при зміні концентрації бензальдегіду - частково безконкурентному характеру з параболічною залежністю відрізків, які відсікаються на осі ординат у координатах подвійних обернених величин, від концентрації модуляторів.

При варіюванні концентрації НАИН спостерігався

безконкурентний характер інгібу-вання. Більш низькі величини уявних констант інгібування отримані з використанням ацетальдегіду як субстрату.

. Проведені дослідження показали, що наявність в ароматичному кільці бензамідів декількох замісників приводить до ускладнення характеру інгібування активності АДҐ у порівнянні з монозаміщеними бензамідами [Багша. Шогоп1сК,1972].

Таким чином, у результаті виконання роботи серед ряду цик-лопропілетилвмісних сполук виявлено ефективні інгібітори активності АльДГ: Н-заміщені-Н-(І-циклопропілетил)аміди 2,4-дихлор-,

2.4-дихлор-5-метил- та 2,5-дихлор-4-метилбензойних кислот. И-Феніл-їМ І-циклопропілетил)амід 2,5-дихлор-4-метилбензойної кислоти може бути запропонований для подальших досліджень як потенційний антиалкогольний препарат сенсибілізуючого типу. Перспективним є пошук нових сполук даного ряду з антиалкогольними властивостями, користуючись розрахованим набором Фізико-хімічних параметрів. Найдені модулятори активності можуть бути використані як Інструменти для вивчення тонких структурних особливостей різних Форм АльДГ.

Автор з великою вдячністю згадує поради, практичні зауваження, підтримку Ксенії Леонідівни Коноплицької, якої, на жаль, зараз вже нема серед нас.

висновки

1. (1-зам іщен і -Н-(І -циклопроп ілетил) an іди 2,4-дихлор-,

2.4-дихлор-5-метил- та 2,5-дихлор-4-нетилбензойних КИСЛОТ є ,

ефективними оборотними інгібіторами активності АльДГ ыатрикоу мітохондрій і мембранної Форми мікросом (величина Igg становить 40-90 мкМ) та мембранної Форми мітохондрій (величина Івд становить 70-100 мкМ). Показано, що наявність циклопро-пілетильного Фрагменту в їх структурі є необхідною умовою для інгібування активності АльДГ. .

2. Виявлено схожість характеру взаємодії наведених вище

сполук з АльДГ матриксу мітохондрій та мембранною Формою мікросом при варіюванні концентрації NAD* та з мембранними Формами мітохондрій та мікросом прч варіюванні концентрації ацетальдепду. ' .

3. Ефективними оборотними інгібіторами швидкості зворотної АДГ-реакції є 2,4-дихлор- та 2,4-дихлор-5-метилбензаміди (величини Ізд становлять 36 та 43 мкМ відповідно). Наявність циклопропілетильного Фрагменту при амідноиу азоті значно послаблює інгібування швидкості Прямої та зворотної АДГ-peакцій.

4. Встановлено, що активність Ферментів основного шляху метаболізму етанолу через 3 год після енутрішньоилункового введення пдрохлориду Н-(І-циклопропілетил)аміну, ІМеніл-N-(І-циклопропілетил)аміду 2,4-дихлор-5-метилбензойноі кислоти та

2.4-дихлор-5-метилбензаміду в дозі 200 мг/кг змінювалась так само, як і в умовах In vitro.

5. Показано, що внутрішньошлункове введення Н-феніл-N-(І-циклопропілетил)аміду 2,5-дихлор-4-метилбензойної кислоти в дозі 200 мг/кг приводило до зниження вживання етанолу' щурами з І1-ою стадією хронічного алкоголізму на 40% на протязі другого тижня введення сполуки та на 32* після відміни введення.

6. Знайдено набір фізико-хімічних, топологічних, а також враховуючих геометричну будову молекули параметрів, який дозволяє на основі структурної Формули сполуки передбачати можливість інгібування активності АльДГ матриксу мітохондрій.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Коноплицька К.ЛІ. Виноградова К.Г., Кислова О.В. Розділення та очищення ізоформ альдегіддегідрогенази печінки курів з використанням тетраетилтіурамдисульфіду як селективного реагенту // VI Укр. біохіи. з'їзд: Тези доп. - Київ, 1992. -■1.1, С. 113.

2. Кислова О.В., Виноградова Е.Г., ІКоноплицкая К-ЛІ. Щербина Ф.Ф. Ингибирование активности альдегиддегидрогеназы печени крыс циклопропилэтилсодержащими амидами бензойних кислот // Укр.биохим.журн. - 1993. - 65. Н 6. - С. 50-56.

3. ІКоноплицкая К.ЛІ. Кислова О.В., Виноградова Е.Г., Щербина Ф.Ф., Язловицкий A.B., Хринюк Н.М., Ральчук И.А. Влияние циклопропилэтилсодержащих аминов и амидов на изоферментные Формы альдегиддегидрогеназы печени крыс // Хим.-фарм. журн. - 1994. -28, N 1. - С. 7-10.

4. Кислова О.В., Виноградова Е.Г., Пхакадзе Г.А. Мембрано-

связанные Формы альдегиддегидрогеназы. Новый класс ингибиторов их активности // Докл. НАН Украины, сер. Б. - 1994. - --И 8. -

С. 57-60. ______

5. Кислова О.В., Виноградова Е.Г. .ІКоноплицкая KJII .Щерби-

на Ф.Ф., Язловицкий A.B., Хринюк Н.М., Ральчук И.А. Синтез и влияние на активность Ферментов обмена этанола циклопропилэтил-содержвщих аминов и амидов // Сб. "Физиологически активные вещества’'. - 1994. - вып. 26. - С. 36-42.

Подписано к печати./'.? Сб'Оіїґят М/л т„п A~>s> размножено гщ Мшстата Украины------------------