Пространственная структура комплексов и механизм каталитического действия фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 548.737

УРУСОВА ДАРЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА КОМПЛЕКСОВ И МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА 8А1САИ-СИНТАЗЫ БАССНАКОМУСЕБ СЕ11ЕУШАЕ

Специальность 01.04.18 - кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте кристаллографии имени A.B. Шубникова Российской академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Мелик-Адамян Вильям Рафаилович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Лунин Владимир Юрьевич (Институт математических проблем биологии РАН)

доктор химических наук Демидкина Татьяна Викторовна (Институт молекулярной биологии РАН)

Ведущая организация: Институт белка РАН, г. Пущино

Защита диссертации состоится <<4~Ь> октября 2006 г. в «11час.00 мин» на заседании Диссертационного совета Д002.114.01 в Институте кристаллографии имени A.B. Шубникова PAII по адресу: 119333 Москва, Ленинский проспект, 59

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии имени A.B. Шубникова РАН

Автореферат разослан «/(£» сентября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Работа посвящена структурно-функциональному исследованию методами рентгеновской кристаллографии белков малоизученного фермента SAICAR-синтазы. Фермент участвует в многоступенчатом синтезе пуриновых нуклеотидов, играющих важнейшую роль в синтезе нуклеиновых кислот и других метаболических реакциях в живых организмах. Изучение структуры и действия ферментов, регулирующих ступени биосинтеза, может быть использовано для создания антисептических и противоопухолевых лекарств. В связи с этим получение отсутствовавшей информации о расположении субстратов в активном центре фермента, а также об изменениях структуры активного центра при связывании субстратов для создания структурной основы механизма действия фермента являлось актуальной задачей. Также не была ясна причина ингибирующего действия высокой концентрации ионов магния, необходимых для протекания реакции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в определении методами рентгеноструктур-ного анализа пространственной структуры б-ти комплексов фермента SAICAR-синтазы и предложении структурного механизма его каталитического действия.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые определены пространственные структуры комплексов фермента SAICAR-синтазы с аспарагиновой кислотой, с аденозинтрифосфатом, с аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой, тройного комплекса с ATP, AICAR и янтарной кислотой, а также с продуктом реакции, SAICAR. Пространственная структура комплексов с аспарагиновой кислотой и тройного комплекса определены с разрешением lA. Данные высокого разрешения позволили впервые определить места и характер связывания всех субстратов в активном центре фермента. Сравнительный анализ структур исследованных комплексов выявил существование «открытой» и «закрытой» форм молекулы фермента, и позволил предложить стереохимическй механизм действия фермента.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Создана структурная основа для понимания механизма действия одного из важнейших ферментов биосинтеза пуриновых нуклеотидов, которая может быть использована для разработки лекарственных препаратов, регулирующих деление клеток. Координаты атомов и соответствующие структурные факторы исследованных комплексов помещены в международную базу данных белковых структур (Protein Data Bank).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 работ. Список работ приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Она изложена на 120 страницах, содержит 36 рисунков и 11 таблиц.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Определенные методами рентгеноструктурного анализа пространственные структуры 6-ти комплексов фермента 8А1САЯ-синтазы.

2. Мес^а и характер связывания субстратов в активном центре фремента.

3. Конформационные изменения молекулы вАГСАК-синтазы при связывании субстратов.

4. Предполагаемый механизм каталитического действия 8А1САЛ-синтазы.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Участие в сборе и обработке дифракционных данных от кристаллов комплексов с помощью синхротронного излучения, за исключением комплекса с БА1САЯ. Проведение всех расчетов, связанных с решением и уточнением пространственной структуры представленных в работе комплексов 8А1СА11-синтазы. Анализ атомных моделей комплексов с целью определения мест и способов связывания субстратов в молекуле фермента, выявления конформационных изменений в молекуле белка и структурной основы механизма каталитического действия фермента БАГСАИ-синтазы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на 19-ой Европейской кристаллографической конференции (Нанси, Франция, август 2000), ■ Третьей национальной конференции по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2001) (Москва, май 2001), Молодёжном конкурсе научных работ ИКР АН (октябрь 2001), Четвертой национальной конференции РСНЭ-2003 (Москва, ноябрь 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, июнь 2004), Пятой национальной конференции РСНЭ-2005 (Москва, 2005).

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Введение, Во введении на основании анализа роли 8А1САЛ-синтазы в метаболизме клетки как фермента пуринового биосинтеза и необходимости изучения ее фермент-субстратных комплексов обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи и сформулирована цель работы.

Глава 1, Фермент вАГСАК-синтаза - участник биосинтеза пуриновых нук-леотидов (по литературным данным).

Глава посвящена обзору литературных данных по синтезу пуриновых оснований: описанию последовательности включения атомов в пуриновое кольцо и их источников, промежуточных соединений и ферментных систем, катализи-

рующих химические реакции пуринового биосинтеза. Описаны известные биохимические свойства и пространственная структура нативной SAICAR-синтазы. Рассмотрены особенности SAICAR-синтазы среди других АТР-зависимых ферментов пуринового биосинтеза, приведено сравнение способа связывания АТР в SAICAR-синтазе с АТР-зависимыми белками из других семейств.

Биосинтез пуриновых нуклеотидов осуществляется за 11 этапов в большинстве микроорганизмов, последовательно превращающих 5-фосфорибозил-1-пирофосфат в инозинмонофосфат (IMP), который за два следующих шага преобразуется либо в аденозинмонофосфат (AMP), либо в гуанозинмонофосфат (GMP). Исследуемый фермент SAICAR-синтаза дрожжей Saccharomyces cerevisiae катализирует восьмую стадию биосинтеза пуриновых нуклеотидов, обеспечивая синтез 5'-фосфорибозил-4-(ЪГ-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазола (SAICAR) из 5'-фосфорибозил-5аминоимидазолкарбоксилата (CAIR) и аспарагиновой кислоты в присутствии аденозинтрифосфата и ионов Mg. Реакция сопровождается гидролизом АТР до ADP и неорганического фосфата (Рис. 1а).

Рис. 1. а) Схема каталитической реакции SAICAR-синтазы; б) аналоги субстратов 5'-фосфорибозил-5-амино-4-имидазолкарбоксамид (AICAR) и янтарная кислота (SUC)

SAICAR-синтаза дрожжей

Saccharomyces cerevisiae — мономерный белок с молекулярной массой 36 кДа. Ее аминокислотная последовательность содержит 306 остатков [1]. Препараты фермента SAICAR-синтазы были предоставлены Биологическим

институтом Санкт-Петербургского Университета, где было проведено выделение и исследование ее биохимических свойств [2], а также определены оптимальные условия функционирования и субстратная специфичность фермента [2], [3]. Структура нативного фермента была решена с разрешением 1.9 Â [4]. Было установлено, что молекула SAICAR-синтазы имеет глобулярную форму с общими размерами примерно 70 х 60 х 40 Â3. Сворачиваясь в пространстве, полипептидная цепь образует три домена. В центре молекулы имеется глубокая полость с размерами приблизительно 15xl5x30Â3 (Рис. 2), достаточными для того, чтобы вместить одновременно молекулы субстратов CAIR АТР и ASP.

Рис. 2. Третичная структура и пространственное расположение элементов вторичной структуры ЙА1САК-синтаты. Три домена показаны разными цветами и обозначены буквами А, В и С соответственно; БА и 5В- сульфат-ионы.

Структурное сравнение 8А1САЯ-синтазы с различными нуклеотид-связывающими белками выявило, что ее домен А топологически очень близок малому домену циклической АМР-зависимой протеинкиназы, а домен В проявляет большое сходство с карбок-

си-концевым доменом глютатион синтетазы (GSHa3bi)[5] и D-alanine:D-alanine лигазы (DD лигазы)[6]

Кристаллы комплексов SAICAR-синтазы, использованные в работе, были выращены А.И. Гребенко в Институте кристаллографии РАН методом диффузии паров в висячей капле и достигали размеров 1.0 — 1.5 мм. Кристаллы комплексов (SS+ATP)-II и (SS+SAICAR) получены вымачиванием кристаллов нативной SAICAR-синтазы в растворах, содержащих 2.25-2.26 М сульфата аммония в 0.5 М Tris-HCl буфере, pH 7.5, 0.04 М аспарагиновой кислоты и добавленные субстраты. Кристаллы остальных комплексов получены сокристаллизацией с субстратами из растворов, содержащих белок в концентрации 24-30 мг/мл, 1 М сульфата аммония, 0.04 М аспарагиновой кислоты в 0.5 М Tris-HCl буфере, pH 7.5. Осаждающий раствор содержал 2.25-2.26 М сульфата аммония в 0.5 М Tris-HCl буфере, pH 7.5. Кристаллизация проводилась при комнатной температуре. Кристаллы всех комплексов SAICAR-синтазы принадлежат к пространственной группе симметрии P2i2,2|, содержат одну молекулу в независимой части ячейки и имеют сходные параметры элементарной ячейки (табл. 1).

Глава 2. Рентгеноструктурное исследование комплексов SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae.

Интенсивности дифракционных отражений от кристалллов исследуемых комплексов были измерены с помощью синхротронного излучения в Европейской лаборатории молекулярной биологии (г. Гамбург) на накопительном кольце DORIS (4.5 ГэВ) на станциях BW7A, BW7B, XII, Х31 с использованием детектора MAR Research Imaging Plate. Дифракционные данные от кристаллов (SS+ATP)-I и (SS+SAICAR) были получены при комнатной температуре до разрешения 2.05 А и 2.00 А соответственно, а от кристаллов остальных комплексов - при 100К до разрешения 1.4 А - 1.0 А. Раствор, в котором выдерживали кри-

сталлы перед низкотемпературной съемкой, содержал 30 % (от насыщения) глюкозы, 2.5 М сульфата аммония, 0.04 М аспарагиновой кислоты, 0.01 М М^СЬ и 0.05 М Тпб-НО буфера, рН 7.5. Обработка экспериментальных данных была выполнена с помощью программ ОЕК^О/БСЛЬЕРЛСК. Статистические характеристики экспериментальных данных представлены в табл. 1.

Таблица 1. Статистические характеристики экспериментальных данных, полученных от кристаллов комплексов 8А1СА11-синтазы.

Комплексы (58+ (88+ (8Э+ (88+А1С+ (88+АТР+ (8Б+

АЭР) АТР)-1 АТР)-П эис) АЮ+ЭиС) БАЮАЯ)

Параметры ячейки 61.02, 69.77, 61.48, 61.03, 60.68, 60.85,

а, Ь, с (А) 62.50, 74.19, 63.05, 62.83, 61.85, 62.75,

78.27 76.00 79.82 78.60 76.89 77.70

Разрешение (А) 24.0-1.05 13.82-2.05 24.74-1.4 48.80-1.30 48.2-1.00 24.4-2.00

Число измеренных

рефлексов 131992 25206 59439 75822 150732 20692

Повторяемость 4 4 4 6 4 4

Полнота набора,

(%) 94.4 98.5 ' 97.0 97.2 96.4 99.9

Полнота набора в

последн. слое, (%) 94.0 98.5 97.4 86.8 93.2 98.7

1/о в последн. слое 3.0 3.6 6.7 2.75 4.0 7.7

ЯусрО) (%) 4.7 7.0 8.5 3.3 3.5 3.7

Определение и уточнение структур комплексов БАЮАК-синтазы. Так как

кристаллы комплексов (БЗ+АБР), (88+АТР)-П, (ЗБ+АГС+БиС) и (БЗ+ЗАЮАЯ) оказались изоморфны кристаллам нативного фермента, в качестве стартовой модели для уточнения их пространственных структур были использованы координаты атомов нативной ЭАГСАК-синтазы, определенные при разрешении 1.9 А [4]. Кристаллы (88+АТР)-1 и (88+АТР+А1САЕ.+8иС) не изоморфны кристаллам нативного фермента, поэтому структуры этих комплексов были решены методом молекулярного замещения с использованием программ АМОЯЕ и МОЫШР. Уточнение моделей проводилось программой КЕЕМАС в сочетании с программой А1УРЛуА11Р, моделирующей структуру растворителя, после каждого цикла уточнения. Дополнительно, молекулы растворителя добавлялись и удалялись вручную при визуальном контроле модели на графической станции, особенно в случаях альтернативных положений молекул воды. Для комплексов (ЗБ+АБР) и (88+АТР+А1СА11+8иС) на промежуточных этапах уточнения была использована программа 8НЕЬХ97. Для расчета К^-фактора использовались 5% рефлексов. Уточнение сопровождалось корректировкой моделей на графической стан-

ции с помощью программы О в соответствии с разностными синтезами электронной плотности. Разностные синтезы были рассчитаны с коэффициентами (2Fo - Fe, фс) и (Fo — Fe, <рс), где Fo, Fe - экспериментальные и рассчитанные модули структурных амплитуд, <рс — фазы структурных амплитуд, рассчитанные по атомной модели. Были смоделированы двойные положения для боковых цепей нескольких остатков и для субстрата аспарагиновой кислоты в комплексе (SS+ASP). Координаты атомов всех субстратов были определены по разностным синтезам электронной плотности, рассчитанным с коэффициентами (Fo - Fe, <pc) после первых циклов уточнения, а затем включены в последующее уточнение моделей, как и ацетилированный N-концевой остаток Ser2. Так как для комплексов (SS+ASP) и (SS+ATP+AICAR+SUC) дифракционные данные были собраны до разрешения 1 Á, для них в последних циклах уточнения был учтен вклад водородных атомов, помещенных в позиции, соответствующие идеальной геометрии, и применено анизотропное уточнение индивидуальных температурных факторов. Результаты уточнения моделей комплексов SAICAR-синтазы приведены в табл.2

Описание и анализ атомных моделей комплексов SAICAR-синтазы. Достоверность уточненных моделей комплексов фермента подтверждают их статистические характеристики, приведенные в табл. 2, а также тот факт, что всем атомам полипептидной цепи на картах электронной плотности (2Fo-Fc) соответствуют отчетливые пики с уровнем выше 1а, за двумя исключениями. Первое исключение составляет N-концевой остаток Metí, что может быть результатом посттрансляционной модификации и последующего ацетилирования Ser2. Ацетилированный Ser2 хорошо определен в электронной плотности и был включен во все окончательные модели. Второе исключение составляют остатки из подвижной («невидимой») петли 164-170, выходящей во внешний раствор. В разных комплексах разное количество остатков из невидимой петли определено в электронной плотности. Вследствие использования избыточных концентраций ли-гандов при получении комплексов, помимо основных мест связывания в активном центре белковой молекулы были обнаружены дополнительные молекулы лигандов на периферии молекулы фермента, имеющие более низкий уровень разностной электронной плотности. Общие количества молекул лигандов, а также сульфат-ионов и молекул воды, найденных в структурах комплексов, даны в табл. 2. Геометрический анализ, проведенный с помощью программы PROCHECK [7] показал, что все геометрические параметры моделей находятся в пределах, ожидаемых для данного разрешения. Значения конформационных уг-

лов для всех остатков попадают в области разрешенных значений на карте Рама-чандрана [8].

Структура комплекса (ЗЗ+АБР). Анализ разностных синтезов электронной плотности показал, что молекула субстрата аспарагиновой кислоты (аспартата) связана в междоменной полости с петлей 39-45, принадлежащей первому домену, и с остатками из первой спирали (остатки 260-270) третьего домена (рис. 3, место А). Субстрат связан с белком водородными связями, формируемыми его карбоксильными группами с кислородом СЮ 8ег40, атомами азота основной цепи А1а41, Тут42 и А5р43, а также гуанидином А^264 (рис. 4). В исследуемом комплексе молекула субстрата имеет два альтернативных положения с половинной заселенностью. Как видно из рисунка 4, оба положения характеризуются одинаковыми водородными связями карбоксильных групп с белком и с этой точки зрения являются равнозначными. Разностный синтез электронной плотности выявил на периферии белковой молекулы два сгущения, которые мы также описали как молекулы аспарагиновой кислоты (рис.3, места А', А"). Их связывание с белком не специфично, и являясь, вероятнее всего, следствием избыточной концентрации аспарагиновой кислоты при кристаллизации, не играет значительной роли в ферментативной реакции.

Структуры комплексов (SS+ATP)-I, (SS+ATP)-II.

В настоящей работе предствалены два комплекса SAICAR-синтазы с АТР, (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II, различные как способом получения, так и содержанием магния с целью изучения зависимости активности фермента от концентрации магния в растворе [2].

Рис. 3. Стерео изображение молекулы SAICAR-синтазы со

схематичным обозначением мест связыва-

ния субстратов: А — ASP, В-АТР, С -CAIR, D - дополнительной молекулы АТР, А', А", А"' -

дополнительных мо-

лекул ASP/SUC

—-У I

S«40 V^ /

Рис. 4. Место связывания аспарагиновой кислоты в комплексе (ЗЭ+АЗР). Уточненная модель наложена на

ASP

разностную электронную плотность на уровне За, вычисленную с коэффициентами (Ро-Рс) и фазами структурных амплитуд, рассчитанными по белковой модели без молекулы аспарагиновой кислоты (Омит-синтез). Водородные

связи молекулы аспарагиновой кислоты с атомами соседних остатков показаны пунктирными линиями. Альтернативные положения ASP обозначены как (А) и (В).

Анализ карт разностной электронной плотности в исследованных комплексах показал, что в молекуле SAICAR-синтазы есть два места связывания молекулы АТР, на рис. 3 обозначенные как В и

D. Молекула АТР в основном месте связывания (В) в исследуемых комплексах расположена в междоменной полости SAICAR-синтазы и вытянута вдоль центральной полости молекулы. При этом адениновое основание АТР и рибозное кольцо в двух комплексах расположены одинаково. Адениновое основание, находящееся в анти-конформации по отношению к рибозному кольцу, располагается в гидрофобном кармане, образованном Leul 14 и Val232 с одной стороны междоменной полости и Leu31 и РЬеЗЗ с другой, а специфичность его связывания достигается за счет образования водородных связей N(1) ... N (His 112), N(6) ... О (Hisl 10) и N(7) ... N (Asp233) ( рис. 5а и б). Положение рибозного кольца АТР, находящегося в Сз-эндо-конформации, стабилизируется водородными связями 0(2') ... 0(Е2) (Glu219) в обоих комплексах, а также 0(2')... N(Z) (Lysl64) и О(З') ... N(Z) (Lysl64) в комплексе (SS+ATP)-I. В то же время расположение фосфатных групп молекулы АТР в двух комплексах существенно отличается. В комплексе (SS+ATP)-I положение [3-фосфата АТР соответствует положению иона сульфата SAI в нативной структуре SAICAR-синтазы [4], (рис. 2, SA). Кон-формация аминокислотных остатков Lysl9, Val20 и Arg21, образующих поворот полипептидной цепи в фосфат связывающей петле, такова, что аминогруппы этих остатков направлены в одну сторону, и между атомом OIB р-фосфата и атомами азота основной цепи этих остатков образуются три водородные связи (рис. 5а). Относительно высокие температурные факторы атомов фосфатных групп и соответствующая им бедная разностная электронная плотность свидетельствуют об их подвижности в этом комплексе, которая может быть существенна при взаимодействии с другими субстратами фермента.

Комплексы (SS+ASP) (SS+ATP)-I (SS+ATP)-II (SS+AIC+SUC) (SS+ADP+AIC+SUC) (SS+SAICAR)

Rcryst, % / 13.7/ 16.6/ 15.1/ 18.1/ 11.6/ 14.8/

число рефлексов 125306 23868 53449 69138 146103 19632

Rta %/ 16.2/ 20.6/ 19.4/ 21.3/ 13.1/ 22.2/

число рефлексов 6644 1025 5989 3693 4546 1060

Число атомов белка 3596 2978 2776 2616 3600 2895

Число молекул растворителя 727 273 526 465 684 446

Число сульфат-ионов 7 2 2 3 2 2

Число молекул АТР - 1 - - -

Число молекул ADP - - - - 2 . -

Число молекул AMP - 2 1 - 1 -

Число молекул AICAR - - - 2 2 -

Число молекул SAICAR - - - - - 1

Число молекул ASP 3 - - - - 2

Число молекул SUC - - - 2 2 -

Среднеквадратичные отклонения

от идеальных значений:

межатомных длин связей, А 0.021 0.012 0.017 0.015 0.025 0.022

межатомных углов связей, ° 2.0 1.48 1.86 2.16 2.0 1.9

межатомных лланарных утлов," 6.6 5.96 2.25 2.55 6.6 6.4

DPI - показатель точности, (À) 0.03 0.16 0.07 0.06 0.02 0.18

<В> -фактор для основной цепи,

А2 13.6 21.7 17.3 18.1 8.3 16.3

<В> -фактор для боковой цепи,

А2 16.1 30.5 22.0 24.5 10.2 19.6

<В> -фактор для молекул воды,

А2 30.6 46.2 36.7 31.8 21.8 31.6

И

В то же время электронную плотность более высокого уровня на р-фосфате по сравнению с остальными фосфатами можно объяснить возможной примесью к

Рис. 5. Разностная электронная плотность (омит-синтез) в основном месте связывания АТР: а) в комплексе (SS+ATP)-!; б) в комплексе (SS+ATP)-II. Изолинии соответствуют уровню За. Водородные связи молекулы АТР с атомами соседних остатков молекулы белка показаны пунктирными линиями. (Упомянутый в тексте Val232 не показан, так как находится над плоскостью рисунка.)

АТР молекул AMP и ионов сульфата на месте Р-фосфата АТР. В (SS+ATP)-II фосфатные группы расположены иначе, и им соответствует более высокий уровень электронной плотности на разностных синтезах. При этом два атома азота гуанидина Arg21 образуют водородные связи с двумя атомами кислорода, (3-фосфат не образует водородных связей с атомами белка, а у-фосфат образует одну водородную связь 0(3G) ... N (Lys 19) (рис. 56). Эти отличия вызваны присоединением к фосфатным группам АТР в комплексе (SS+ATP)-II иона магния, образующего координационные связи с атомами кислорода всех трех фосфатных групп. Наличие ионов магния в комплексе (SS+ATP)-II вызвано тем, что при получении этого комплекса содержание магния в растворе было в 4 раза выше, чем при получении (SS+ATP)-I. Можно предположить, что присоединение ионов магния к фосфатным группам АТР понижает их подвижность и затрудняет реакцию. Такое предположение согласуется с результатами биохимических исследований SAICAR-синтазы, показавшими, что концентрация ионов Mg2+ более 30 мМ приводит к понижению ферментативной активности [2]. Как уже отмеча-

а)

лось, кроме основного места связывания, было выявлено дополнительное место связывания молекулы АТР, расположенное в небольшой полости аминоконцево-го домена SAICAR-синтазы (место D на рис.3). При этом с ферментом контактируют атомы аденинового основания АТР, а фосфатные группы направлены в сторону окружающего молекулу фермента раствора. Пуриновое основание в этом месте фиксируется водородными связями с атомами основной цепи аминокислотных остатков Val77 и Leu 108. Атомные температурные факторы и разностные синтезы электронной плотности свидетельствуют об увеличивающейся подвижности атомов АТР по мере приближения к фосфатным группам, причем наибольшей подвижностью отличаются выступающие в раствор ß и у-фосфатные группы АТР, которые по этой причине в уточнении не участвовали. Функциональная роль второго места связывания АТР в молекуле SAICAR-синтазы пока остается неясной, однако не исключено, что это место может играть регуляторную роль при работе фермента.

Структура комплекса (SS+AICAR+SUC). Целью исследования данного комплекса было определение места присоединения к ферменту субстратов CAIR и аспарагиновой кислоты. Однако вместо природных субстратов для приготовления фермент-субстратного комплекса были использованы 5'-фосфорибозил-5-амино-4-имидазолкарбоксамид (AICAR), более устойчивый аналог CAIR, и аналог аспарагиновой кислоты, янтарная кислота (рис. 16). Единственное различие AICAR и CAIR, нуклеотидов с недостроенным адениновым основанием, состоит в замене ОН-группы карбоксилата в CAIR на NH2-rpyiniy в AICAR. Чтобы предотвратить взаимное отталкивание аминогрупп AICAR и аспарагиновой кислоты, мы заменили ее на янтарную кислоту, отличающуюся от аспарагиновой кислоты отсутствием аминогруппы.

Было установлено, что в молекуле SAICAR-синтазы есть два места связывания AICAR. Одно из них расположено в активном центре фермента, при этом положение фосфатной группы AICAR совпадает с местом связывания второго из сульфат-ионов в структуре нативного фермента [4] (рис. 2, SB), другое находится на периферии белковой молекулы и совпадает с дополнительным местом связывания АТР в комплексах с АТР (рис. 3, места С и D). Разностная электронная плотность, соответствующая молекуле AICAR в активном центре фермента, достаточно полно представлена только для фосфатной группы и рибозного кольца (Рис. 6). Группе атомов недостроенного аденинового основания соответствуют бедная электронная плотность и относительно высокие значения температурного фактора, что говорит о ее возможной подвижности. Поэтому коорди-

наты атомов аденинового основания не использовались при уточнении модели, тогда как атомы фосфатной группы и рибозного кольца в последних циклах уточнения были включены в модель вместе с атомами белка.

Рис.6. Разностная электронная плотность и модель молекул AICAR и SUC в активном центре фермента. Изолинии соответствуют омит-синтезу на уровне За. Положение недостроенного аденинового основания, не обеспеченного полной электронной плотностью, предположительно определено по расположению рибозного кольца. Пунктирными линиями показаны serm водородные связи с аминокислотными

остатками SAICAR-синтазы (Arg242 не изображен, чтобы не загромождать рисунок).

В уточненной модели атомы кислорода фосфатной группы AICAR фиксированы водородными связями с аминокислотными остатками фермента Argl22, Serl28 и Arg242, а рибозное кольцо образует водородную связь 0(2')...0(D2)Asp215 (Рис.6). Анализ разностной электронной плотности позволил определить, что молекула янтарной кислоты в (SS+AICAR+SUC) располагается напротив молекулы AICAR, в месте связывания аспарагиновой кислоты в комплексе (SS+ASP) (Рис.3, место А). Положение молекулы янтарной кислоты фиксируется водородными связями с аминокислотными остатками Ser40 и Arg264 (Рис.6). «Побочная» молекула янтарной кислоты была обнаружена в месте А"'на рис. 3.

Структура комплекса (SS+ADP+AICAR+SUC) Анализ карт электронной плотности выявил, что место связывания АТР в активном центре молекулы белка в комплексе (SS+ADP+AICAR+SUC) то же, что и в комплексах с АТР. Однако вместо молекулы АТР мы обнаружили в этом месте молекулу ADP, связанную с белком тем же способом. Ион Mg координирован атомами кислорода фосфатов ADP и 4-мя молекулами воды (рис. 7). Фосфатная группа AICAR занимает то же положение, что и у AICAR в комплексе (SS+AICAR+SUC), но, в отличие от последнего, все атомы сахарного кольца и пуриновой группы прекрасно определены на карте электронной плотности, и видно, что пуриновая группа направлена на АТР. Атомы кислорода фосфатной группы AICAR формируют водородные связи с Argl22, Serl28 и Arg242,

isllO

Рис. 7. Место связывания ADP в активном центре SAICAR-синтазы в комплексе

(SS+ADP+AICAR+SUC). Уточненная модель наложена на разностную электронную плотность, соответствующую омит-синтезу на уровне За. Водородные связи молекулы ADP с атомами соседних остатков показаны пунктирными линиями, рибозное кольцо — с остатками Asp215 и Arg264, и незавершенное пуриновое основание AICAR - Aspl71 и Asp239 (рис. 8). В этом комплексе в месте связывания

дополнительной молекулы АТР была обнаружена электронная плотность, которую мы интерпретировали как смесь молекул AMP и AICAR с неполными заселенностями.

Агр171

Argm'

Serrn

02А '-Оц AtpîIS \ L^ _

НЮ vO> Г

Рис. 8. Место связывания AICAR в молекуле SAICAR-синтазы в комплексе

(SS+ADP+AICAR+SUC). Уточненная модель наложена на разностную электронную плотность, соответствующую омит-синтезу на уровне За. Водородные связи молекулы AICAR с атомами соседних остатков показаны пунктирными линиями.

В месте связывания аспартата, где мы ожидали увидеть янтарную кислоту, мы обнаружили "разностную электронную плотность в четыре раза более низкого Аг»ш

уровня, чем в основном месте связывания

ADP и AICAR, которую мы описали молекулой ADP с низкой заселенностью. Связывание ADP в этом месте явилось следствием чрезмерной концентрации АТР при кристаллизации. Не увидев молекулы янтарной кислоты в активном центре, мы обнаружили две побочные молекулы SUC в местах А' и А'" (рис. 3). Конформационные изменения в молекуле SAICAR-синтазы. Сравнение структур различных комплексов выявило, что (SS+ASP), (SS+ATP)-I, (SS+ATP)-II, (SS+AIC+SUC) и (SS+SAICAR) имеют структуру нативного белка, в то время как структура комплекса (SS+ADP+AIC+SUC) отличается более близким распо-

ложением третьего домена к первому и второму доменам. Структура комплекса

(SS+ADP+AIC+SUC) была названа «закрытой» структурой в отличие от «открытой» структуры нативного фермента. Наложение «открытой» и «закрытой» структур показано на рис.9. Рис. 9. Сравнение «открытой» и «закрытой» конформа-ций молекулы SAlCAR-синтазы. Комплекс (SS+ASP) показан голубым цветом, комплекс (SS+ADP+AIC+SUC) - фиолетовым. Сравнить с рис. 2.

Анализ выявил, что наиболее значительные подвижки (на 4-6 А) испытывают Са-атомы спирали аС1 (остатки 260-270) и аспартат связывающей петли между РА4 и РА5 (остатки 39-45) (на 2-4 А). Обозначения элементов вторичной структуры приведены на рис. 2. Отклонение положений Са-атомов показано на рис. 10. Примечательно, что на участках, испытывающих наибольший сдвиг, расположены остатки 40-42 и 264, участвующие в связывании ASP и AICAR. Рис. 10. Среднеквадратичное отклонение положений Са атомов (SS+ADP+AIC+SUC) от (SS+ASP).ct-Спирали и р-слои изображены как красные и желтые прямоугольники в соответствии с [4].

Структура комплекса (88+ 8А1СА11) Место присоединения продукта БАГСАЯ в полости активного центра молекулы белка занимает, или точнее, объединяет, места связывания аналогов субстратов А1САЯ и янтарной кислоты в активном центре (рис. 3, места А и С).Фосфатная группа и рибоз-ное кольцо молекулы ЭАГСАЯ находятся примерно в том же положении, что и у молекулы А1САЯ, а сукцинат-подобная часть молекулы ЭАЮАЯ располагается в месте связывания янтарной кислоты в комплексе (58+А1С+8иС) и образуют анало-гичные связи с белком. Большинство атомов молекулы 8А1СЛК, за ис-клю-чением атома азота N6, хорошо определены в электронной плотности (Рис. 11). Связи, образованные остатками белка с фосфатной группой молекулы 5А1САЯ, соответствуют также связям с фосфатной группой А1САК в комплексе (88+АОР+А1С+8иС). Атомы кислорода фосфатной группы БАГСАЯ формируют

Ч ■ I ■ I

ZD 40 60 80 100 120 140 160 ISO 200 220 240 260 2S0 300

JUUU I __

Residue Number

Asp239 f

Рис. 11. Место связывания SAICAR в молекуле SAICAR-синтазы в комплексе

(SS+SAICAR). Уточненная модель наложена на разностную

электронную плотность, соответствующую омит-синтезу на уровне 2.5а. Водородные связи молекулы SAICAR с атомами сосед-

/*

SerU8

них остатков показаны пунктирными линиями.

водородные связи с Argl22, Serl28 и Arg242, рибозное кольцо связано с Asp215, а карбоксильные группы SAICAR - с Ser40, Tyr42, Asp43 и Arg264. Недостроенное пуриновое основание образует контакт с Asp239 (Рис. 11). Очевидно, что аминокислотные остатки, обеспечивающие связывание субстратов в белковой молекуле, их правильную ориентацию и распределение зарядов, отвечают и за связывание продукта реакции. Большинство этих остатков строго консервативно среди известных SAICAR-синтаз. Две дополнительные молекулы аспарагиновой кислоты были обнаружены в местах А' и А" (рис. 3), как в комплексе (SS+ASP), что естественно, учитывая условия получения комплекса (SS+SAICAR).

Глава 3. Сравнение пространственной структуры SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae с пространственными структурами SAICAR-синтаз Thermatoga maritima и E.coli

Во время подготовки к печати данной диссертации были опубликованы статьи о структурных исследованиях SAICAR-синтаз Thermatoga maritima (tSS)

[9] и E.coli (e§S) [10], для которой были исследованы структуры двух комплексов с ADP и ADP+CAIR. В этих работах авторы провели подробные сравнения определенных ими структур со структурой SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae (ySS). Оказалось, что оба фермента, tSS и eSS, являются димерами, состоящими из двух идентичных мономеров, структуры мономеров которых схожи со структурой ySS. Основные структурные различия - это дополнительные участки полипептидной цепи в ySS, которые можно рассматривать как вставки в структуру tSS и eSS, а также ход полипептидной цепи в третьем домене tSS [9],

[10]. В диссертации приведено сравнение мест связывания субстратов, обнаруженных в ySS, с потенциальными местами связывания субстратов в tSS и L-аспартата в eSS, и на основании сравнения со структурами исследованных ком-

плексов ySS высказано предположение о необходимости конформационных изменений в структурах tSS и eSS для осуществления ферментативной реакции. Сравнение с SAICAR-синтазой Thermatoga maritima

Места связывания АТР. Совмещение структур комплекса (SS+ADP+AIC+SUC) и мономера tSS подтверждает аналогию АТР-связывающих остатков в обоих белках. В tSS также присутствует фосфат-связывающая петля и, как отмечено в [9], строго консервативный Glu 172, аналогичный Glu 219 в ySS, образующий связь с АТР.

Места связывания AICAR/CAIR. Все остатки, связывающие AICAR в комплексе (SS+ADP+AIC+SUC), присутствуют в аминокислотной последовательности tSS и являются консервативными. Они занимают эквивалентные положения после пространственного совмещения структур, за исключением остатков Arg 193, Lys203 и Arg207, соответствующих остаткам Arg242, Lys260 и Arg264 в ySS. Эти остатки оказываются удаленными от активного центра (на 20 Â для Arg207) благодаря отличию в ходе полипептидной цепи в третьем домене от ySS. Объяснением такой необычной укладки цепи, как предполагается в работе [10], может служить термофильность SAICAR-синтазы Thermatoga maritima, которая при высоких температурах, усиливающих гидрофобные и слабые электростатические взаимодействия, приобретает укладку цепи, близкую к ySS и eSS, но утрачивает ее при низких температурах. Возможно, однако, что упомянутые остатки занимают соответствующие позиции после конформационных изменений, претерпеваемых ферментом при связывании субстратов. Однако на данный момент нет никакой информации о фермент-субстратных комплексах SAICAR-синтазы Thermatoga maritima.

Места связывания ASP. Остатки, обеспечивающие связывание ASP в комплексе ySS (SS+ASP), - петля Ser40-Asp43 и Arg 264. К сожалению, в структурной модели tSS утрачены остатки, соответствующие остаткам 41-43 в ySS. После совмещения структур обеих моделей только Thr26 в tSS присутствует в позиции, эквивалентной Ser40 в ySS. Как было отмечено выше, Arg207 в tSS, находящий-~ ся по аминокислотной последовательности в соответствии с Arg264 in ySS, расположен далеко от него в пространстве. Сравнение с SAICAR-синтазой E.coli

Места связывания АТР. В комплексе (SS+ADP+AICAR+SUC) ADP связан в той же манере, что и в комплексах eSS с небольшой разницей в числе водородных связей с молекулой белка [10].

Места связывания AICAR/CAIR. Несмотря на структурные различия между молекулами AICAR и CAIR, остатки,' обеспечивающие их связывание в обоих белках, строго консервативны. Все они расположены в эквивалентных положениях. Однако имеется несколько отличий между (SS+ADP+ AICAR+ SUC) и комплексом eSS с ADP+CAIR. Атомы CAIR 08 и N3 входят в координационные сферы двух ионов магния, тогда как возле AICAR не найдено ионов магния. Взаимодействие с ионами магния может быть причиной наблюдаемого небольшого сдвига атомов карбоксильной группы CAIR при Сб по отношению к эквивалентным атомам AICAR и вследствие этого, разрыва водородной связи атома N5 CAIR с атомом кислорода карбонильной группы Asp 196, тогда как атом N5 AICAR связан с карбонильным кислородом Asp239 в ySS.

Места связывания ASP. Несмотря на то, что место связывания L-аспартата в комплексах eSS не было обнаружено [10], наложение аспартат-связывающей петли в ySS на соответствующие остатки eSS позволяет предполагать, что связывание этого субстрата аналогично в обоих ферментах. Остаткам, образующим водородные связи в ySS с одной из карбоксильных групп аспартата, Ser40 (боковая цепь), А1а41и Asp43 (азот основной цепи), в eSS соответствуют Ser33 (боковая цепь), А1а34 и Asp36 (азот основной цепи). Остаткам, взаимодействующим с другой карбоксильной группой в ySS, Туг42 (азот основной цепи) и Arg264 (боковая цепь), соответствуют в eSS Gly35 (азот основной цепи) и Agr215 (боковая цепь).

Конформационные изменения. В [10] авторами не было замечено конформаци-онных изменений в активном центре фермента при сравнении комплексов eSS с ADP и с ADP + CAIR. Однако при наложении структур комплексов наблюдается сдвиг участка цепи 32-39, соответствующего аспартат-связывающей петле в ySS, аналогичный сдвигу, отличающему «открытую» и «закрытую» конформации ySS. В отличие от SAICAR-синтазы S.cerevisiae здесь конформационные подвижки не затрагивают спирали третьего домена а5 и аб. Тем не менее, правомерно говорить о возникновении информационных изменений в молекуле SAICAR-синтазы E.coli при связывании субстратов ADP и CAIR, вызывающих движение аспартат-связывающего участка, которое приводит к сужению активного центра и взаимному сближению трех субстратов. Сравнение наблюдаемых кон-формационных изменений в молекулах обеих SAICAR-синтаз подтверждает наши выводы об их важности как обеспечивающих конформацию активного центра фермента, необходимую для осуществления каталитической реакции.

Глава 4. Механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы Sac-charomyces cerevisiae

На основании полученных данных о местах присоединения и характере связывания субстратов в молекуле SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae и конформационных изменениях в активном центре фермента, сопровождающих связывание субстратов, а также простейшего моделирования (рис. 12), нами предложена модель каталитического действия фермента SAICAR-синтазы. Две модели механизма реакции, предлагаемые для SAICAR-синтазы E.coli [10], включают образование промежуточного, которым в одном случае является фосфорилированный CAIR, а в другом случае диоксианион как

Рис. 12. Модель взаимного расположения субстратов в активном центре SAICAR-синтазы. Молекула AICAR и окружающие остатки активного центра взяты из комплекса (SS+ADP+AICAR+SUC). Положение ас-парагиновой кислоты смоделировано после специального наложения структур (SS+ASP) и (SS+ADP+AICAR+SUC) по остаткам 39-45 и 260-270, испытывающим наибольшее смещение при изменении конформации белковой молекулы, у- фосфат ADP смоделирован после наложения структур комплексов (SS+ADP+AICAR+SUC) и (SS+ATP)-II по окружению молекулы ADP и АТР соответственно, результат реакции между CAIR и L-аспартатом с последующим фосфорилированием АТР. Однако нет никакой фактической информации об образовании промежуточных продуктов в ходе реакции SAICAR-синтазы, как отмечено в [10]. Проведенные кинетические исследования также не дали доказательств существования связанного фосфорилированного промежуточного продукта в активном центре SAICAR-синтазы [11].

Более вероятным представляется механизм реакции, схожий с механизмом Бьюкенена, предложенным им для фосфорибозилглицинамид-синтетазы [12], при котором электрофильное действие у-фосфата АТР на карбоксильную группу CAIR достигается не за счет образования ковалентной ангидридной связи, но вследствие взаимодействия парциальных зарядов, возникающих при сближении реагирующих групп. Этот электрофильный эффект делает карбоксильную группу CAIR более восприимчивой к нуклеофильной атаке со стороны аминогруппы ASP. Таким образом, амидная связь может образоваться без ангидридного про-

G]n2G]

межуточного продукта при вовлечении всех трех субстратов в образование переходного комплекса.

Присоединение субстратов начинается в «открытой» конформации белковой молекулы, как в комплексе (SS+ASP), где ASP связан с остатками 4043 из аспартат-связывагащей петли и Arg264. Связывание АТР и С AIR приводит молекулу белка в «закрытую» форму, как в комплексе (SS+ADP+AICAR+SUC), где Arg264 сдвигается на 5.8À, чтобы образовать водородную связь с атомом 02* гидроксильной группы рибозного кольца AICAR, в то же время сохраняя связи с карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Новое положение Arg264 фиксировано образующейся системой водородных связей, включающей Arg264, GIn261 и Arg242. Lys 19 NZ, сохраняя контакт с ATP, одновременно может формировать водородную связь с карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Чтобы обеспечить эти новые взаимодействия, домен С (две С-концевые а-спирали) и аспартат-связывающая петля из домена А (остатки 3945) испытывают сдвиг как жесткое тело по отношению к домену В и остальной части домена А. Водороднавя связь Ser40 О - Lys260 NZ способствует этому движению. В результате активный центр, находящийся между доменами, становится значительно уже. Более того, в «закрытой» конформации водородная связь Hisl70 ND1 - Asp43 OD1 может фиксировать «невидимую» петлю, которая защищает активный центр во время реакции. После каталитической реакции молекула фермента снова возвращается к «открытой» форме со связанным продуктом, как было обнаружено в комплексе (SS+SAICAR).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с субстратом аспарагиновой кислотой с разрешением 1.0 Â. Определены место и характер связывания молекулы аспарагиновой кислоты в активном центре фермента.

2. Определены и уточнены пространственные структуры двух комплексов фермента SAICAR-синтазы с аденозинтрифосфатом с разрешением 1.4 и 2.05 À. На основании сравнения связывания молекулы АТР в активном центре фермента получено рентгеноструктурное подтверждение установленной биохимическими исследованиями зависимости конформации фосфатных групп АТР от концентрации ионов магния.

3. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой с

разрешением 1.3 Ä. Определены место и характер связывания молекулы янтарной кислоты и частично молекулы AI CAR в активном центре фермента.

4. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой с разрешением 1.0 Ä. Определены место и характер связывания молекул АТР и AICAR в активном центре фермента. Молекулы янтарной кислоты обнаружены в побочных местах связывания.

5. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с продуктом ферментативной реакции SAICAR с разрешением 2.0 Ä. Определено место и характер связывания молекулы SAICAR в активном центре фермента.

6. В результате сравнения структур полученных комплексов выявлены кон-формационные изменения белковой молекулы, сопровождающие реакцию.

7. На основании анализа пространственной структуры активного центра полученных комплексов, а также выявленных конформационных изменений предложен возможный механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы.

8. Координаты и соответствующие структурные факторы исследованных комплексов размещены в банке данных белковых структур Protein Data Bank с идентификационным номерами lOBD, lOBG, 2CNQ, 2CNU и 2CNV. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Arrtonyuk S.V., Levdikov VM, Baiynin V.V., Grebenko AI, Urusova D.V., Popov AN., Meiik-Adamyan W.R. and Lamzin V.S. The structure of SAICAR syntfiase-substrate complexes at 1A resolution. (2000). ECM-19posters abstracts, special issue, p. 243.

2. Ангонюк СВ., Гребенка АЛ, Левдиков В Л!, Урусова ДВ, Мелик-Адамян BP, Ламзин B.C., Вильсон КС. Решгеноструктурное исследование комплексов SAICAR-сишазы с аде-нозш прифосфатом. Кристаллография, 2001, т.46, № 4, сс.687-691.

3. Антонюк СБ, Гребенко АИ, Левдиков ВМ, Урусова ДВ, Мелик-Адамян BP, Ламзин B.C., Вильсон КС Решгеностругаурное исследование комплексов фермента SAICAR-синтазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с аденозишрифосфаюм. Тезисы докладов РСНЭ-2001, с.27.

4. Урусова ДВ, Антонюк CJ3, Гребенко АИ, Ламзин B.C., Мелик-Адамян BP. Рентгеносг-руюурное исследование комплекса фермента SAICAR-ситазы с аналогами субстратов. Кристаллография, 2003, т.48, № 5, сс. 821-825.

5. Урусова ДВ, Ангонюк СБ, Гребенко АЛ, Ламзин B.C., Мелик-Адамян BP. Регагеност-руюурное исследование комплекса фермента SAICAR-сингазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с аналогами субстратов. Тезисы докладов РСНЭ-2003, с.65.

6. Урусова ДВ., Ангонюк СВ., Гребенко АЛ, Мелик-Адамян BP., Ламзин B.C. Решгспост-руктурное исследование комплексов фермента SAICAR-синтазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов. Тезисы докладов Ш-ro Съезда биофизиков России, 2004, т.1, с.115.

7. Урусова ДВ., Анюнюк СВ, Гребенко АИ, Мелик-Адамян BP., Ламзин B.C. Пространственная структура комплексов и механизм каталитической акшвносга фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces serevisiae. Тезисы докладов РСНЭ-2005, с.70.

8. Урусова ДВ., Левдиков ВМ, Ангонюк СВ., Гребенко АИ, Ламзин B.C., Мелик-Адамян BP. Рентгеносфуктурное исследование комплекса фермента SAICAR-синтазы с продуктом реакции. Кристаллография, 2006, т.51, № 5, сс. 878-881.

СПИСОК ВДТИРУШОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Мясников, А.Н., Плавник, Ю.А., Саснаускас, К.В., Гедмипене, Г.К., Янулайтис, A.A., Смирнов, М.Н., Нуклеотидная последовательность гена ADE1 дрожжей Saccharomyccs cerevisiae. Биоорганическая химия, 1986. 12(4): р. 555-558.

2. Ostanin, K.V., et al., Isolation and properties of phosphoribosyl-aminoimidazole-succinocarboxyamide-synthestase from Saccharomyces ccrevisiae yeasts. Biokhimiia, 1989. 54(8): p. 1265-73.

3. Alenin, V.V., et al., Substrate specificity of Phosphoribosyl-aminoimidazole-succinocarboxamide-synthetase (SAICAR-synthetase) of the yeast Saccharomyces cerevisiac. Biokhimiya (USSR), 1992. 57(6): p. 845-855.

4. Levdikov, V.M., et al., The structure of SAICAR synthase: an enzyme in the de novo pathway of purine nucleotide biosynthesis. Structure, 1998. 6(3): p. 363-76.

5. Yamaguchi, H., at al., & Katsube, Y., Three-dimentional structure of the glutathione synthetase from Escherichia coli В at 2.0 A resolution. J. Mol. Biol., 1993. 229: p. 1083-1100.

6. Fan, C., Moews, P.C., Walsh, C.T. & Knox, J.R., Vancomycin resistance: structure of D-alanine: D-alanine ligase at 2.5 a resolution. Science, 1994. 266: p. 439-443.

and the location of errors in these models. Acta Cry st., 1991.A47:p. 110-119.

7. Laskowski, R.A., et al., PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst.,. 1993. 26: p. 283-291.

8. Ramachandran, G.N., C. Ramakrishnan, and V. Sasisekharan, Stereochemistry of polypeptide chain conformations. J. Mol. Biol., 1963. 7: p. 95-99.

9. Zhang, R., et al., Structure of SAICAR synthase from Thermotoga maritima at 2.2 angstroms reveals an unusual covalent dimer. Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2006. 62(Pt 4): p. 335-9.

10. Ginder, N.D., et al., Nucleotide Complexes of Escherichia coli Phospboribosylaminoimida-zole Succinocarboxamide Synthetase. J Biol Chem, 2006. 281(30): p. 20680-8.

11. Nelson, S.W., et al., Mechanism of action of Escherichia coli phosphoribosylaminoimida-zolesuccinocarboxamide synthetase. Biochemistry, 2005. 44(2): p. 766-74.

12. Hartman, S.C. and J.M. Buchanan, Biosynthesis of the purines. XXII. 2-Amino-N-ribosylacetamide-5'-phosphate kinosynthase. J Biol Chem, 1958. 233(2): p. 456-61.

к исполнению 14/09/2006 Исполнено 15/09/2006

Заказ № 627 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56

www.autoreferat.ru

Оглавление

Список употребляемых в диссертации сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Литературный обзор.

1 1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов . 8 1.2 SAICAR-синтаза Saccharomyces cerevisiae . 12 1 2 1 Биохимические свойства фермента SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae . . 14 1 2 2 Пространственная структура SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae.

1 2 3 Сравнение структуры SAICAR-синтазы с другими АТР-зависимыми ферментами цикла биосинтеза пуриновых нуклеотидов

Глава 2 Рентгеноструктурное исследование комплексов SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae.

2.1 Получение и очистка фермента.

2 2 Исследование комплекса (SS+ASP).

2 2 1. Получение кристаллов.

2.2.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2.2 3. Определение и уточнение структуры комплекса (SS+ASP) 26 2 2 4 Анализ качества модели . . 29 2 2 5 Структура комплекса (SS+ASP) . 29 2 3 Исследование комплексов с аденозинтрифосфатом, (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II

2 3 1 Получение кристаллов комплексов с аденозинтрифосфатом

2.3 2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений 35 2 3 3 Определение структуры комплексов с АТР

2 3.4 Анализ качества моделей.

2.3.5 Структуры комплексов (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II

2.4. Исследование комплекса с AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC).

2.4.1. Получение кристаллов комплексов с AICAR и янтарной кислотой

2.4.2. Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2.4 3 Определение структуры комплекса (SS+AIC+SUC)

2.4 4 Анализ качества модели

2 4 5 Структура комплекса (SS+AIC+SUC).

2.5. Исследование комплекса с аденозинтрифосфатом, AICAR и янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC).

2 5.1 Получение кристаллов комплекса (SS+ADP+AIC+SUC).

2.5 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений. 56 2 5 3 Определение структуры комплекса (SS+ADP+AIC+SUC).

2.5.4 Анализ качества модели.

2.5.5. Структура комплекса (SS+ADP+AIC+SUC).

2.6. Исследование комплекса с SAICAR (SS+SAICAR) . . 78 2 6.1. Получение кристаллов комплексов с SAICAR.

2.6 2 Измерение интенсивностей дифракционных отражений

2 6 3. Определение структуры фермент-субстратного комплекса

2 6 4. Анализ качества модели.

2 6 5. Структура комплекса (SS+ SAICAR).

Глава 3 Сравнение пространственной структуры SAICAR-синтазы Saccharomyces cerevisiae с пространственными структурами SAICAR-синтаз Thermatoga maritima и Е coll.

3.1. Сравнение с SAICAR-синтазой Thermatoga maritima.

3.2. Сравнение с SAICAR-синтазой Е coli.

Глава 4 Механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы

4.1. Предлагаемые модели механизмы каталитической реакции

SAICAR-синтазы.

4 2. Каталитический механизм SAICAR-синтазы Saccharomyces serevisiae.

Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - важнейшие участники клеточного метаболизма как в низших, так и в высших живых организмах. Помимо того, что они являются мономерными единицами нуклеиновых кислот и играют ключевую роль в репликации ДНК и энергетическом обмене клетки, они также выполняют функции регуляторов, сигнальных молекул и кофакторов ферментов. В связи с этим изучение структуры и действия ферментов, участвующих в их биосинтезе, может быть использовано для создания антисептических и противоопухолевых лекарств на основе специфических ингибиторов пуринового биосинтеза de novo [1]-[9]. Синтез de novo пуриновых и пиримидиновых мононуклеотидов в клетках осуществляется в ходе цепочки превращений из низкомолекулярных азотистых предшественников и является в значительной степени инвариантным процессом для известных биологических организмов [10]. Цикл пуринового биосинтеза осуществляется за 10 ступеней в высших организмах и за 11 ступеней (включая дополнительную промежуточную ступень) в большинстве микроорганизмов [11], последовательно превращающих 5-фосфорибозил-1-пирофосфат в инозинмонофосфат (IMP), который за два следующих шага преобразуется либо в аденозинмонофосфат (AMP), либо в гуанозинмонофосфат (GMP). Стремительное развитие в последние годы методов рентгеновской кристаллографии позволило значительно увеличить количество расшифрованных белковых структур. Однако, несмотря на то, что в настоящее время известны пространственные структуры всех ферментов, осуществляющих 11 этапов синтеза de novo IMP, пространственные структуры комплексов ферментов с лигандами (субстратами, ингибиторами или продуктами), дающие информацию, необходимую для понимания механизма их каталитического действия, определены только для пяти из них [12]. Более того, ни для одного из 6-ти ферментов этого цикла, использующих в качестве субстратов АТР, мононуклеотид и малую молекулу, не исследован комплекс, содержащий все три субстрата одновременно, а также отсутствуют экспериментальные данные для определения положения малой молекулы. Данная работа, выполненная с использованием методов рентгеноструктурного анализа, восполняет эти пробелы в отношении SAICAR-синтазы, фермента, катализирующего восьмую ступень биосинтеза пуриновых нуклеотидов. В ней представлены пространственные структуры 6-ти комплексов SAICAR-синтазы с лигандами:

• аспарагиновой кислотой (SS+ASP);

• аденозинтрифосфатом (SS+ATP)-I и (SS+ATP)-II;

• аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой (SS+AIC+SUC);

• аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой (SS+ADP+AIC+SUC);

• продуктом реакции SAICAR (SS+SAICAR).

Два из представленных комплексов, тройной комплекс и комплекс с аспарагиновой кислотой, исследованы при разрешении lA. Высокое разрешение позволило не только впервые определить положение малой молекулы - аспарагиновой кислоты, но также получить наиболее полную информацию о структуре фермента, подвижности боковых групп и основной цепи аминокислотных остатков белка и, наконец, обнаружить конформационные изменения активного центра молекулы фермента, сопровождающие реакцию. Данные, полученные из структур комплексов, о расположении и характере связывания субстратов и продуктов в белковой молекуле, а также о конформационных изменениях ее активного центра позволили предложить механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы и могут быть полезны для понимания каталитического механизма других ферментов, осуществляющих синтез амидной связи.

В связи с вышесказанным ОСНОВНЫМИ ПОЛОЖЕНИЯМИ, ВЫНОСИМЫМИ НА ЗАЩИТУ, являются:

1. Определенные методами рентгеноструктурного анализа пространственные структуры 6-ти комплексов фермента SAICAR-синтазы;

2. места и характер связывания субстратов в активном центре фремента;

3. конформационные изменения молекулы SAICAR-синтазы при связывании субстратов;

4. предполагаемый механизм каталитического действия SAICAR-синтазы.

Основные результаты и выводы

1. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с субстратом аспарагиновои кислотои с разрешением 1.0 А. Определены место и характер связывания молекулы аспарагиновой кислоты в активном центре фермента.

2. Определены и уточнены пространственные структуры двух комплексов фермента SAICAR-синтазы с аденозинтрифосфатом с разрешением 1.4 и 2.05 А. На основании сравнения связывания молекулы АТР в активном центре фермента получено рентгеноструктурное подтверждение установленной биохимическими исследованиями зависимости конформации фосфатных групп АТР от концентрации ионов магния.

3. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой с разрешением 1.3 А. Определены место и характер связывания молекулы янтарной кислоты и частично молекулы AICAR в активном центре фермента.

4. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с аденозинтрифосфатом и аналогами субстратов AICAR и янтарной кислотой с разрешением 1.0 А. Определены место и характер связывания молекул АТР и AICAR в активном центре фермента. Молекулы янтарной кислоты обнаружены в побочных местах связывания.

5. Определена и уточнена пространственная структура комплекса фермента SAICAR-синтазы с продуктом ферментативной реакции SAICAR с разрешением 2. о А.

Определено место и характер связывания молекулы SAICAR в активном центре фермента.

6. В результате сравнения структур полученных комплексов выявлены конформационные изменения белковой молекулы, сопровождающие реакцию.

7. На основании анализа пространственной структуры активного центра полученных комплексов, а также выявленных конформационных изменений предложен возможный механизм каталитической реакции SAICAR-синтазы.

8. Координаты и соответствующие структурные факторы исследованных комплексов размещены в банке данных белковых структур Protein Data Bank с идентификационным номерами 10BD, 10BG, 2CNQ, 2CNU и 2CNV.

Автор выражает глубокую благодарность

B.Р. Мелик-Адамяну за руководство диссертационной работой, обсуждение результатов и поддержку;

A.И. Гребенко за предоставление превосходных кристаллов, позволивших собрать экспериментальные данные высокого разрешения, и дружеское участие;

C.В. Антонюк за помощь в получении и обработке данных и участие в обсуждении результатов;

B.C. Ламзину за предоставление возможности использовать оборудование и компьютеры EMBL для выполнения работы;

И.П. Курановой за ценные советы по ходу работы и благожелательное отношение; всем сотрудникам Лаборатории белковой кристаллографии за моральную поддержку и интерес, проявленный к работе.

1. Bal, J. and Pieniazek, N.J. Detection of 5-amino-4-imidazole-N-succinocarboxamide ribotide and hypoxanthine accumulation. A simple method for identification of some purine auxotrophs. J Chromatogr, 1979. 169: p. 474-6.

2. Wadman, S.K., et al. Detection of inherited adenylosuccinase deficiency by two dimensional thin layer chromatography of urinary imidazoles. Adv Exp Med.Bio}, 1986. 195 Pt A: p. 21-5.

3. Van den Bergh, F., et al. Functional studies in fibroblasts of adenylosuccinase-deficient children. J Inherit Metab Dis, 1993. 16(2): p. 425-34.

4. Van den Bergh, F., et al. Adenylosuccinase activity and succinylpurine production in fibroblasts of adenylosuccinase-deficient children. Adv Exp Med Biol, 1991. 309B: p. 277-80.

5. Mathews, C.K.V.H., K.E. Biochemistry, 1996(Menlo Park, CA, USA: Benjamin/Cummings).

6. Kappock, T.J., Ealick, S.E. and Stubbe, J. Modular evolution of the purine biosynthetic pathway. Curr Opin Chem Biol, 2000. 4(5): p. 567-72.

7. Bernstein, F.C., Tasumi, M. The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J. Mol. Biol., 1977. 112: p. 535-542.

8. Березов T.T., Коровкин, Б.Ф. Биологическая химия. 1998, Москва: Медицина.

9. Miller, R.W. and Buchanan, J.M. Biosynthesis of the purines: XXVII. N-(5-amino-l-ribosyl-4-imidazolylcarbonyl)-L-aspartic acid 5'-phosphate kinosynthetase. J. Biol. Chem., 1962. 237: p. 458-490.

10. Hartman, S.C. and Buchanan, J.M. Biosynthesis of the purines.

11. XXII. 2-Amino-N-ribosylacetamide-5'-phosphate kinosynthase. J Biol Chem, 1958. 233(2): p. 456-61.

12. Kornberg, A., Lieberman, I., Simms, E.S. Enzymatic synthesis of purine nucleotides. J Biol Chem., 1955. 215(l)(Jul;): p. 417-27.

13. Mathews, I.I., Kappock, T.J., Stubbe, J.A. and Ealick, S.E. Crystal structure of Escherichia coli PurE, an unusual mutase in the purine biosynthetic pathway. Structure, 1999. 7(11): p. 1395-1406.

14. Lukens, L.N. and Buchanan, J.M. Biosynthesis of the purines.

15. XXIII. The enzymatic synthesis of N-(5-amino-l-ribosyl-4-imidazolylcarbonyl)-L-aspartic acid 5'-phosphate. J Biol Chem, 1959. 234(7): p. 1791-8.

16. Ostanin, K.V., et al. Isolation and properties of phosphoribosyl-succinocarboxamide-aminoimidazole synthetase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biokhimiya (USSR), 1989. 54: p. 12651273.

17. Bairoch, A. SwissProt Protein Sequence Databank User Manual. 1990, EMBL Data Library: Heidelberg, FRG.

18. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res., 1997. 25: p. 3389-3402.

19. Alenin, V.V., et al. Substrate specificity of Phosphoribosyl-aminoimidazole-succinocarboxamide-synthetase (SAICAR-synthetase) of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biokhimiya (USSR), 1992. 57(6): p. 845-855.

20. ISIS/DRAW, http://www.liv.ac.uk/ctichem/isis.html, 1994.

21. Myasnikov, A.N., et al. The Saccharomyces cerevisiae ADE1 gene: structure, overexpression and possible regulation by general amino acid control. Gene, 1991. 109(1): p. 143-7.

22. Аленин B.B., Домкин, В.Д. Синтез аналогов 5-амино-4-карбокси-1 -(5'-фосфо-Ь-0-рибофуранозил)имидазола (КАИР). ЖОХ, 1974. 45(6).

23. Tyagi, А.К., et al. Determinants of the toxicity of L-alanosine to various organs of the mouse. Toxicology, 1981. 21(1): p. 59-69.

24. Grebenko, A.I., et al. Crystallization and preliminary X-rayinvestigation of phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamidesynthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol.,1992. 228: p. 298-299.е^енко

25. Левдиков B.M., Г.А.И., Барынин B.B., и др. Пространственная структура SAICAR-синтазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae с разрешением 1.9 А. Кристаллография., 1996. 41(2): р. 293.

26. Levdikov, V.M., et al. The structure of SAICAR synthase: an enzyme in the de novo pathway of purine nucleotide biosynthesis. Structure, 1998. 6(3): p. 363-76.

27. Delano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. http://ww.pvmol.org, 2002.

28. Schulz, G.E. Binding of nucleotides to proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 1992. 2: p. 61-67

29. Rossman, M.G., Moras, D. & Olsen, K.W. Chemical and biological evolution of a nucleotide-binding protein. J. Mol.Biol., 1974. 250: p. 194-199.

30. Rossman, M.G., Lilijas, A., Branden, C.-I. & Banaszak, L.J. Evolutionary and structural relationships among dehydrogenases In The Enzymes, 1975. 1 lA(3rd edition): p. 61-102.

31. Flaherty, K.M., DeLuka-Flaherty, C. & McKay, D.B. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature, 1990. 346: p. 623-628.

32. Flaherty, K.M., McKay, D.B, Kabsch, W. & Holmes, K.S. Similarity of the tree-demensional structure of actin and the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Proc. Natl. Acad.Sci, 1991. 88(USA): p. 5041-5045.

33. Kabsch, W, Mannherz, H.G., Suck, D, Pai, E.F. & Holmes, K.C. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature, 1990. 347(37-44).

34. Matsuda, K, Mizugichi, K, Nishioka, T, Kato, H, Go, N. & Oda, J. Crystal structure of glutathione synthetase at optimal pH: domain architecture and structural similarity with other proteins. Protein Eng., 1996. 9: p. 1083-1092.

35. Waldrop, G.L, Rayment I. & Holden H.M. Three-dimentional structure of the biotin carboxylase subunit of acetyl-CoA carboxylase. Biochemistry, 1994. 33: p. 10249-10256.

36. Artymiuk, P.J., Poirrette, A.R., Raice, D.W. & Willett, P. Biotin carboxylase comes into the fold. Nat. Struct. Biol., 1995. 3: p. 128132.

37. Fan, C., Moews, P.C., Walsh, C.T. & Knox, J.R. Vancomycin resistance: structure of D-alanine: D-alanine ligase at 2.5 a resolution. Science, 1994. 266: p. 439-443.

38. Hubbard, T.J.P., Murzin, A.G., Brenner, S.E. & Chothia, C. SCOP: a structural classification of proteins database. Nucl. acids Res., 1997. 25: p. 236-239.

39. Knighton, D.R., et al., & Sowadski, J.M. Crystal structure of the catalitic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Science, 1991. 253: p. 407-414.

40. Wang, W., Kappock, T.J., Stubbe, J., Ealick, S.E. X-ray crystal structure of glycinamide ribonucleotide synthatase from Escherichia coli. Biochemistry, 1998. 37: p. 15647-15662.

41. Thoden, J.B., Kappock, T.J., Stubbe, J., Holden, H.M. Three-dimentional structure of N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase: a member of ATP grasp protein superfamily. Biochemistry, 1999. 38(15480-15492).

42. Thoden, J.B., Firestine, S., Nixon, A., Benkovic, S.J. and Holden, H.M. Molecular structure of Escherichia coli PurT-encoded glycinamide ribonucleotide transformylase. Biochemistry, 2000. 39: p. 8791-8802.

43. Hoi, W.G.J., van Duijnen, P.T. & Berendsen, H.J.C. The a-helix dipole and the properties of proteins. Nature, 1978. 273(8 June): p. 443-446.

44. Davies, D.R., & Segal, D.M. Protein crystallization: micro techniques involving vapour diffusion. Methods in Enzymology, 1971. 22: p. 266-269.

45. Popov, A.N. and Bourenkov., G.P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. , 2003. 59: p. 1145-53.

46. Otwinowski, Z. and Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode., in Methods in Enzymology. 1997. p. 307-326.

47. Murshudov, G.N., Vagin, A.A. and Dodson, E.J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr., 1997. D53: p. 240-255.

48. Lamzin, V.S. and Wilson, K.S. Automated refinement of protein models. Acta Crystallogr., 1993. D49: p. 129-147.

49. Jones, T.A., et al. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. ActaCryst., 1991. A47: p. 110-119.

50. Jones, T.A. and Kjeldgaard, M. Electron-density map interpretation. MethEnzymol, 1997. 277: p. 173-208

51. Sheldrick, G.M. Program for the solution of crystal structures. University of Groningen,Germany, 1997.

52. Cruickshank, D.W.J. Remarks about structure precision. Acta Crystal., D, 1999. 55: p. 583-601.

53. Laskowski, R.A., et al. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst.,. 1993. 26: p. 283-291.

54. Ramachandran, G.N, Ramakrishnan, C. and Sasisekharan, V. Stereochemistry of polypeptide chain conformations. J. Mol. Biol, 1963. 7: p. 95-99.

55. Vagin, A.A. and Teplyakov A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst, 1997. 30: p. 1022-1025.

56. Collaborative Computational Project, The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst, 1994. D50: p. 760-763.

57. Jones, T.A. A graphics model building and refinement system for macromolecules. J. Appl. Cryst, 1978. 11: p. 268-272.

58. Esnouf, R.M. Further additions to MolScript version 1.4, including reading and contouring of electron-density maps. Acta Crystallography 1999. D55: p. 938-940.

59. Martz, E. Protein Explorer, http://proteinexplorer.org, 2005.

60. Zhang, R, et al. Structure of SAICAR synthase from Thermotoga maritima at 2.2 angstroms reveals an unusual covalent dimer. Acta Crystallograph.SectJ7 Struct JBioLCryst.Commun, 2006. 62(Pt 4): p. 335-9.

61. Ginder, N.D, et al. Nucleotide Complexes of Escherichia coli Phosphoribosylaminoimidazole Succinocarboxamide Synthetase. J. BioUChem, 2006. 281(30): p. 20680-8.

62. Antonyuk, S.V, et al. X-ray diffraction study of the complexes of SAICAR synthase with Adenosinetriphosphate. Crystallography Reports, 2001. 46(4): p. 620-625.

63. Nelson, S.W, et al. Mechanism of action of Escherichia coli phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthetase. Biochemistry, 2005. 44(2): p. 766-74.

64. Fromm, H.J. On the equilibrium and mechanism of adenylosuccinate synthetase. Biochem. Biophys. Acta, 1958. 29: p. 255-262.

65. Honzatko, R.B., Stayton, M.M. nd Fromm, H.J. Adenylosuccinate synthetase: recent developments. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 1999. 73: p. 57-102.

66. Honzatko, R.B.a.F, H.J. Structure function studies of adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys, 1999. 370: p. 1-8.

67. Poland, B.W, Silva, M.M, Serra, M.A, Cho, Y, Kim, K.H, Harris, E.M.S. and Honzatko, R.B. Crystal structure of adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli. J. Biol. Chem, 1993. 268(december 5): p. 25334-25342.

68. Markham, G.D. and Reed, G.H. J. Biol. Chem, 1978.253: pp.61846189.